JP2021534231A - 血小板溶解物組成物およびその使用 - Google Patents

血小板溶解物組成物およびその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、生物学的標的に機械的支持体および/または薬剤を提供するための組成物、キット、および方法に関する。具体的には、組成物は、血小板溶解物、フィブリノゲン、およびトロンビンを含む。組成物は、創傷/損傷(例えば、角膜)の治療、および組織培養を含む他の用途に使用することができる。

Description

相互参照による組み込み
本出願は、2018年8月7日に出願されたオーストラリア仮出願第2018902870号からの優先権を主張し、その全内容は相互参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、一般に、生物学および医学の分野に関し、より具体的には、生物学的標的に機械的支持および/または薬剤を提供するための組成物および方法に関する。さらにより具体的には、本発明は、創傷/損傷の治療、および組織培養を含む他の用途に使用することができる組成物および方法に関する。
角膜は、瞳孔を通して光を屈折させ、感染、紫外線、および機械的外傷に対する物理的バリアとして機能する、前眼部表面の不可欠な構成成分である。さらに、角膜損傷はオーストラリアで最も一般的な眼の緊急症状であり、全症例の約75%は、角膜の異物または擦過傷の存在によるものである。これらの損傷だけでも、オーストラリア人に、年間1億5500万ドル余の費用がかかると推定されており、効果的に治療しない場合、感染や瘢痕化につながり、永続的な視覚障害をもたらす可能性がある。さらに、角膜疾患は、ほとんどの発展途上国で2番目に多い失明の原因であり、世界中で3,900万人の視覚障害者のうち推定12%が両側性角膜失明に苦しんでおり、さらに2,300万人が片側性角膜失明に苦しんでいる。
角膜欠損は、外傷および他の疾患プロセスから生じる可能性がある。軽度の場合、角膜は通常の創傷治癒経路を介して再生することができ、角膜の密な神経支配のために、角膜損傷は非常に痛い可能性がある。しかしながら、場合によっては、角膜の通常の創傷治癒メカニズムでは不十分な可能性がある。これは、角膜融解、角膜血管新生、透明性の喪失、感染、瘢痕化、および失明時までの視力低下をもたらす可能性のある非治癒欠損の形成につながる。
角膜の創傷治癒は、擦過傷、感染、または屈折矯正手術の後など、細胞補充と細胞喪失との均衡が崩れた場合に起こる。軽度の場合、角膜は、この不均衡を回復させるために生理学的プロセスを上方制御することができるが、より重症の場合、追加の治療が必要である。創傷治癒が効果的に起こらない場合、視覚障害、さらに角膜失明などの潜在的に有害な結果が生じる可能性がある。
現在の角膜損傷の医学的処置には、抗生物質、眼帯、縫合糸、および外科用接着剤が含まれ、これらは軽傷に役立つ可能性がある。しかしながら、それらは、痛みの軽減、感染、および/または瘢痕組織の発達を含む、より進行した創傷で生じる問題に適切に対処していない。感染症は重大な合併症を示し、入院が必要になる場合がある。これらの問題は、角膜の損傷のみに限定されるものではなく、他の体組織の創傷の場合にも同様に通用する。重度の角膜損傷で一般的な瘢痕化は、視覚リハビリテーションの唯一の選択肢である角膜移植で永久的な視力喪失につながる可能性がある。
角膜損傷を治療するための改良された組成物および方法が必要である。改良された組成物および方法はまた、他の組織の創傷の治療にも応用できる可能性がある。
本発明は、創傷(例えば、角膜創傷)を治療するための現在の組成物および/または方法に関連する問題のうちの少なくとも1つを軽減する。
血小板溶解物の機械的特性は水の特性と類似しているため、構造化形態で組織に適用することは困難である。例えば、(例えば、バイオプリンティングなどの技術に必要な)二次元または三次元の構造を生成するために、生の血小板溶解物を組織に層ごとに適用することは非常に困難であり、ほとんどの場合実行不可能である。本発明者らは、構造化形態での組織への適用を促進する機械的特性および構造的特性を有する血小板溶解物組成物を開発した。特に、本発明の組成物は、二次元または三次元のバイオプリンティング技術を使用して、血小板溶解物を組織(例えば、眼)に適用するために使用され得る。本組成物は、少なくとも血小板溶解物、フィブリノゲン、およびトロンビンを集合的に含む、最初は分離された構成成分から調製することができる。混合すると、分離された構成成分は固化し、血小板溶解物を含むゲル状の材料になる。凝固速度は、さまざまな組成構成成分のタイミングおよび/または量を変えることによって制御することができ、したがって、適用プロセスに柔軟性を提供する。限定されないが、本明細書に記載の組成物および方法は、一般に、生物学的標的(例えば、組織、膜、細胞)への薬剤(例えば、薬物および/または他の物質)の送達に有用であり、例えば、角膜組織の創傷(例えば、非治癒角膜潰瘍または擦過傷)を含む創傷の治療に適用される。
本発明は、少なくとも部分的に下記の実施形態に関する。
実施形態1.0.1〜20mg/mlのフィブリノゲン、2〜20U/mLのトロンビン、および1〜40%(v/v)の血小板溶解物を含む組成物。
実施形態2.イオン、イオン源、アミノ酸、フィブロネクチン、麻酔薬、抗生物質、増殖因子、組織因子XIII、基質タンパク質(例えば、コラーゲン)のうちのいずれか1つまたは複数をさらに含む、実施形態1に記載の組成物。
実施形態3.イオンが、カルシウムイオンを含み、および/または増殖因子が、ヒト上皮増殖因子(hEGF)を含む、実施形態1または実施形態2に記載の組成物。
実施形態4.組成物が、イオンおよびアミノ酸を含む培養培地を含む、実施形態1〜3のいずれか1つに記載の組成物。
実施形態5.イオンが、組成物に含まれるイオン性塩溶液の構成成分である、実施形態1〜4のいずれか1つに記載の組成物。
実施形態6.組成物が、細胞(例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞)をさらに含む、実施形態1〜5のいずれか1つに記載の組成物。
実施形態7.血小板溶解物が、ヒト血小板溶解物を含むか、またはそれからなる、実施形態1〜6のいずれか1つに記載の組成物。
実施形態8.血小板溶解物が、抗凝固剤(例えば、ヘパリン)を含まない、もしくは実質的に含まない、または10%(v/v)未満、9%(v/v)未満、8%(v/v)未満、7%(v/v)未満、6%(v/v)未満、5%(v/v)未満、4%(v/v)未満、3%(v/v)未満、2%(v/v)未満、1%(v/v)未満、0.5%(v/v)未満の抗凝固剤(例えば、ヘパリン)を含む、実施形態1〜7のいずれか1つに記載の組成物。
実施形態9.組成物が、
(i)0.1〜15mg/mlのフィブリノゲン、2〜15U/mLのトロンビン、および5〜40%(v/v)の血小板溶解物、または
(ii)0.1〜10mg/mlのフィブリノゲン、2〜10U/mLのトロンビン、および10〜35%(v/v)の血小板溶解物、または
(iii)0.2〜5mg/mlのフィブリノゲン、2〜8U/mLのトロンビン、および15〜30%(v/v)の血小板溶解物、または
(iv)0.2〜3mg/mlのフィブリノゲン、2〜4U/mLのトロンビン、および15〜25%(v/v)の血小板溶解物を含む、実施形態1〜8のいずれか1つに記載の組成物。
実施形態10.組成物が、
(i)1mg/ml未満(例えば、約0.2mg/ml)のフィブリノゲン、2〜20U/ml(例えば、約3U/ml、約5U/ml、約10U/ml)のトロンビン、および5〜40%(v/v)(例えば、約20〜30%(v/v))の血小板溶解物、または
(ii)1〜4mg/ml(例えば、約2mg/ml)のフィブリノゲン、5〜15U/ml(例えば、約7U/ml、約10U/ml、約12U/ml)のトロンビン、および10〜40%(v/v)(例えば、約15〜30%(v/v))の血小板溶解物、または
(iii)3〜8mg/ml(例えば、約5mg/ml)のフィブリノゲン、2〜15U/ml(例えば、約4U/ml、約8U/ml、約12U/ml)のトロンビン、および15〜30%(v/v)(例えば、約20〜25%(v/v))の血小板溶解物を含む、実施形態1〜8のいずれか1つに記載の組成物。
実施形態11.組成物が、
(i)約0.4mg/ml、約0.8mg/mlもしくは約1mg/mlのフィブリノゲン、および
約2U/ml、約10U/mlもしくは約20U/mlのトロンビン、および
約20%(v/v)、約25%(v/v)もしくは約30%(v/v)の血小板溶解物、または
(ii)約2mg/ml、約4mg/ml、もしくは約8mg/mlのフィブリノゲン、および
約2U/ml、約10U/mlもしくは約20U/mlのトロンビン、および
約10%、約15%(v/v)、もしくは約20%(v/v)の血小板溶解物、または
(iii)約5mg/ml、約10mg/ml、もしくは約15mg/mlのフィブリノゲン、および
約2U/ml、約10U/mlもしくは約20U/mlのトロンビン、および
約5%(v/v)、約15%(v/v)、もしくは約25%(v/v)の血小板溶解物を含む、実施形態1〜8のいずれか1つに記載の組成物。
実施形態12.組成物が、
(i)少なくとも、約0.4mg/mlのフィブリノゲン、約2ユニット/mLのトロンビン、および約20%(v/v)の血小板溶解物、または
(ii)少なくとも、約20%(v/v)の血小板溶解物、約4mg/mlのフィブリノゲン、および約10U/mLのトロンビンを含む、実施形態1〜8のいずれか1つに記載の組成物。
実施形態13.キット、パッケージ、またはデバイスであって、
−フィブリノゲンを含む第1の区画およびトロンビンを含む第2の区画であって、キット、パッケージ、またはデバイスが、フィブリノゲンおよびトロンビンをキット、パッケージまたはデバイスに装填中および装填後に、第1の区画のフィブリノゲンおよび第2の区画のトロンビンを分離できるように構成されている、第1の区画および第2の区画と、
−血小板溶解物と、
−第1の区画のフィブリノゲンと、第2の区画のトロンビン、そして血小板溶解物との混合を促進する手段と、を含む、キット、パッケージ、またはデバイス。
実施形態14.血小板溶解物が、キット、パッケージまたはデバイスの第3の区画に位置し、キット、パッケージまたはデバイスが、フィブリノゲン、トロンビンおよび血小板溶解物をキット、パッケージまたはデバイスに装填中および装填後に、第1の区画のフィブリノゲンおよび第2の区画のトロンビンから第3の区画の血小板溶解物を分離できるように構成されている、実施形態13に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
実施形態15.第1の区画が、フィブリノゲンおよび血小板溶解物を含み、第2の区画がトロンビンを含む、実施形態13に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
実施形態16.
−いずれかの当該区画が、イオン、イオン源、アミノ酸、フィブロネクチン、麻酔薬、抗生物質、増殖因子(例えば、hEGF)、組織因子XIII、基質タンパク質(例えば、コラーゲン)のうちのいずれか1つもしくは複数をさらに含むか、または
−キット、パッケージ、もしくはデバイスが、イオン、イオン源、アミノ酸、フィブロネクチン、麻酔薬、抗生物質、増殖因子(例えば、hEGF)、組織因子XIII、基質タンパク質(例えば、コラーゲン)のうちのいずれか1つもしくは複数を含む追加区画を含み、キット、パッケージ、もしくはデバイスが、キット、パッケージ、もしくはデバイスの装填中および装填後に、他の区画の内容物から追加区画の内容物を分離できるように構成されている、実施形態13〜15のいずれか1つに記載のキット、パッケージまたはデバイス。
実施形態17.
イオンが、カルシウムイオンであるか、または
イオン源が、イオン性塩であり、および/またはカルシウムイオンを含む、実施形態16に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
実施形態18.手段が、キット、パッケージまたはデバイスの外部でのフィブリノゲン、トロンビンおよび血小板溶解物の混合を促進するように構成されている、実施形態13〜17のいずれか1つに記載のキット、パッケージまたはデバイス。
実施形態19.
手段が、フィブリノゲンの流れとトロンビンの別個の流れとを集束点に向けることにより、当該混合を促進するように構成され、
当該流れのうちの少なくとも1つが、血小板溶解物を含む、実施形態13〜18のいずれか1つに記載のキット、パッケージまたはデバイス。
実施形態20.第1および第2の区画のいずれかもしくは両方、および/または第3の区画が細胞(例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞)を含む、実施形態13〜19のいずれか1つに記載のキット、パッケージまたはデバイス。
実施形態21.血小板溶解物が、ヒト血小板溶解物を含むか、またはそれからなる、実施形態13〜20のいずれか1つに記載のキット、パッケージまたはデバイス。
実施形態22.血小板溶解物が、抗凝固剤(例えば、ヘパリン)を含まない、もしくは実質的に含まない、または10%(v/v)未満、9%(v/v)未満、8%(v/v)未満、7%(v/v)未満、6%(v/v)未満、5%(v/v)未満、4%(v/v)未満、3%(v/v)未満、2%(v/v)未満、1%(v/v)未満、0.5%(v/v)未満の抗凝固剤(例えば、ヘパリン)を含む、実施形態13〜21のいずれか1つに記載のキット、パッケージまたはデバイス。
実施形態23.
(i)第1の区画が、0.1〜20mg/mlのフィブリノゲンを含み、第2の区画が、1〜40U/mlのトロンビンを含み、デバイスが、合計5〜40%(v/v)の血小板溶解物を含む、または
(ii)第1の区画が、0.1〜15mg/mlのフィブリノゲンを含み、第2の区画が、1〜30U/mlのトロンビンを含み、デバイスが、合計5〜40%(v/v)の血小板溶解物を含む、または
(iii)第1の区画が、0.1〜12mg/mlのフィブリノゲンを含み、第2の区画が、1〜25U/mlのトロンビンを含み、デバイスが、合計7〜14%(v/v)の血小板溶解物を含む、または
(iv)第1の区画が、0.5〜10mg/mlのフィブリノゲンを含み、第2の区画が、1〜10U/mlのトロンビンを含み、デバイスが、合計0.5〜20%(v/v)の血小板溶解物を含む、実施形態13〜22のいずれか1つに記載のキット、パッケージまたはデバイス。
実施形態24.
(i)第1の区画が、2mg/ml未満(例えば、約0.8mg/ml)のフィブリノゲンを含み、第2の区画が、0.5〜20U/ml(例えば、約1U/ml、約10U/ml、約20U/ml)のトロンビンを含み、デバイスが、合計5〜40%(v/v)(例えば、約20%(v/v))の血小板溶解物を含むか、または
(ii)第1の区画が、1〜16mg/ml(例えば、約8mg/ml)のフィブリノゲンを含み、第2の区画が、0.5〜20U/ml(例えば、約1U/ml、約10U/ml、約20U/ml)のトロンビンを含み、デバイスが、合計5〜40%(v/v)(例えば、約20%(v/v))の血小板溶解物を含むか、または
(iii)第1の区画が、5〜15mg/ml(例えば、約10mg/ml)を含み、第2の区画が、0.5〜20U/ml(例えば、約1U/ml、約10U/ml、約20U/ml)のトロンビンを含み、デバイスが、合計5〜40%(v/v)(例えば、約20%(v/v))の血小板溶解物を含む、実施形態13〜22のいずれか1つに記載のキット、パッケージまたはデバイス。
実施形態25.
(i)第1の区画が、0.8mg/mlのフィブリノゲンを含み、
第2の区画が、約2U/ml、約10U/mlもしくは約20U/mlのトロンビンを含み、
デバイスが、合計約20%(v/v)の血小板溶解物を含む、または
(ii)第1の区画が、約8mg/mlのフィブリノゲンを含み、
第2の区画が、約2U/ml、約10U/mlもしくは約20U/mlのトロンビンを含み、
デバイスが、合計約20%(v/v)の血小板溶解物を含む、または
(iii)第1の区画が、約20mg/mlのフィブリノゲンを含み、
第2の区画が、約2U/ml、約10U/mlもしくは約20U/mlのトロンビンを含み、
デバイスが、合計約10%(v/v)の血小板溶解物を含む、実施形態13〜22のいずれか1つに記載のキット、パッケージまたはデバイス。
実施形態26.トロンビン、フィブリノゲンおよび血小板溶解物の混合から生じる製剤が、
(i)少なくとも0.2mg/mlのフィブリノゲン、少なくとも1ユニット/mLのトロンビン、および約10%(v/v)の血小板溶解物、または
(ii)約20%(v/v)の血小板溶解物、約2mg/mLのフィブリノゲン、および約5U/mlのトロンビン、を含む、実施形態13〜22のいずれか1つに記載のキット、パッケージまたはデバイス。
実施形態27.第1の区画および第2の区画が、血小板溶解物を含まない、実施形態13〜26のいずれか1つに記載のキット、パッケージまたはデバイス。
実施形態28.第1の区画および第2の区画が、等体積、または1%未満、2%未満、3%未満、4%未満、5%未満、10%未満、15%未満、20%未満、25%未満異なる体積の液体製剤である、実施形態13〜27のいずれか1つに記載のキット、パッケージまたはデバイス。
実施形態29.組成物を調製する方法であって、
(i)
フィブリノゲンを含む第1の製剤およびトロンビンを含む第2の製剤を提供することであって、第1の製剤は、第2の製剤と接触していない、提供することと、
(ii)第1および第2の製剤を血小板溶解物とともに混合することにより組成物を提供することと、を含む、方法。
実施形態30.当該混合の前に、血小板溶解物が、フィブリノゲンを含む第1の製剤と組み合わされ、トロンビンを含む第2の製剤とは組み合わされない、実施形態29に記載の方法。
実施形態31.当該混合の前に、血小板溶解物が、トロンビンを含む第2の製剤と組み合わされない、実施形態29に記載の方法。
実施形態32.当該混合の前に、血小板溶解物が、フィブリノゲンを含む第1の製剤またはトロンビンを含む第2の製剤と組み合わされない、実施形態29に記載の方法。
実施形態33.方法が、イオン、イオン源、アミノ酸、フィブロネクチン、麻酔薬、抗生物質、増殖因子(例えば、hEGF)、組織因子XIII、基質タンパク質(例えば、コラーゲン)のうちのいずれか1つまたは複数を、当該第1および第2の製剤ならびに血小板溶解物と混合することをさらに含む、実施形態29〜32のいずれか1つに記載の方法。
実施形態34.
イオンが、カルシウムイオンであるか、または
イオン源が、イオン性塩であり、および/またはカルシウムイオンを含む、実施形態29〜33のいずれか1つに記載の方法。
実施形態35.細胞(例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞)を当該第1および第2の製剤と混合することをさらに含む、実施形態29〜34のいずれか1つに記載の方法。
実施形態36.血小板溶解物が、ヒト血小板溶解物を含むか、またはそれからなる、実施形態29〜35のいずれか1つに記載の方法。
実施形態37.血小板溶解物が、抗凝固剤(例えば、ヘパリン)を含まない、もしくは実質的に含まない、または10%(v/v)未満、9%(v/v)未満、8%(v/v)未満、7%(v/v)未満、6%(v/v)未満、5%(v/v)未満、4%(v/v)未満、3%(v/v)未満、2%(v/v)未満、1%(v/v)未満、0.5%(v/v)未満の抗凝固剤(例えば、ヘパリン)を含む、実施形態29〜36のいずれか1つに記載の方法。
実施形態38.
(i)第1の製剤が、0.1〜20mg/mlのフィブリノゲンを含み、第2の製剤が、1〜40U/mlのトロンビンを含み、第1および/または第2の製剤が、合計5〜40%(v/v)の血小板溶解物を含む、または
(ii)第1の製剤が、0.1〜15mg/mlのフィブリノゲンを含み、第2の製剤が、1〜30U/mlのトロンビンを含み、第1および/または第2の製剤が、合計5〜20%(v/v)の血小板溶解物を含む、または
(iii)第1の製剤が、0.1〜12mg/mlのフィブリノゲンを含み、第2の製剤が、1〜25U/mlのトロンビンを含み、第1および/または第2の製剤が、合計7〜14%(v/v)の血小板溶解物を含む、または
(iv)第1の製剤が、0.2〜10mg/mlのフィブリノゲンを含み、第2の製剤が、2〜20U/mlのトロンビンを含み、第1および/または第2の製剤が、合計8〜12%(v/v)の血小板溶解物を含む、実施形態29〜37のいずれか1つに記載の方法。
実施形態39.
(i)第1の製剤が、1mg/ml未満(例えば、約0.4mg/ml)のフィブリノゲンを含み、第2の製剤が、0.5〜20U/ml(例えば、約1U/ml、約10U/ml、約20U/ml)のトロンビンを含み、第1および/または第2の製剤が、合計5〜40%(v/v)(例えば、約20%(v/v))の血小板溶解物を含む、または
(ii)第1の製剤が、1〜8mg/ml(例えば、約4mg/ml)のフィブリノゲンを含み、第2の製剤が、0.5〜20U/ml(例えば、約1U/ml、約10U/ml、約20U/ml)のトロンビンを含み、第1および/または第2の製剤が、合計5〜40%(v/v)(例えば、約20%(v/v))の血小板溶解物を含む、または
(iii)第1の製剤が、5〜15mg/ml(例えば、約10mg/ml)を含み、第2の製剤が、0.5〜20U/ml(例えば、約1U/ml、約10U/ml、約20U/ml)のトロンビンを含み、第1および/または第2の製剤が、合計5〜40%(v/v)(例えば、約20%(v/v))の血小板溶解物を含む、実施形態29〜37のいずれか1つに記載の方法。
実施形態40.
(i)第1の製剤が、約0.4mg/mlのフィブリノゲンを含み、
第2の製剤が、約2U/ml、約10U/mlもしくは約20U/mlのトロンビンを含み、
第1および/または第2の製剤が、合計約10%(v/v)の血小板溶解物を含む、または
(ii)第1の製剤が、約4mg/mlのフィブリノゲンを含み、
第2の製剤が、約2U/ml、約10U/mlもしくは約20U/mlのトロンビンを含み、
第1および/または第2の製剤が、合計約20%(v/v)の血小板溶解物を含む、または
(iii)第1の製剤が、約10mg/mlのフィブリノゲンを含み、
第2の製剤が、約2U/ml、約10U/mlもしくは約20U/mlのトロンビンを含み、
第1および/または第2の製剤が、合計約10%(v/v)の血小板溶解物を含む、実施形態29〜37のいずれか1つに記載の方法。
実施形態41.組成物が、
(i)少なくとも0.2mg/mlのフィブリノゲン、少なくとも1ユニット/mLのトロンビン、および約20%(v/v)の血小板溶解物、または
(ii)約20%(v/v)の血小板溶解物、約2mg/mLのフィブリノゲン、および約5U/mLのトロンビン、を含む、実施形態29〜37のいずれか1つに記載の方法。
実施形態42.第1の製剤および第2の製剤が、等体積であるか、または1%未満、2%未満、3%未満、4%未満、5%未満、10%未満、15%未満、20%未満、25%未満異なる体積である、実施形態29〜41のいずれか1つに記載の方法。
実施形態43.第1および第2の製剤ならびに血小板溶解物の混合が、
フィブリノゲンを含む第1の流れ、トロンビンを含む第2の流れ、および任意選択で第3の流れを生成することであって、当該流れは当初互いに分離している、生成することと、
流れをともに組み合わせることと、を含み、
第1の流れ、第2の流れおよび/または第3の流れのうちのいずれか1つもしくは複数が、血小板溶解物を含む、実施形態29〜42のいずれか1つに記載の方法。
実施形態44.実施形態29〜43のいずれか1つに記載の方法により得られるまたは得ることができる組成物。
実施形態45.フィブリノゲン、トロンビンおよび血小板溶解物を含む製剤を対象の組織に適用するための、実施形態13〜28のいずれか1つに記載のキット、パッケージまたはデバイスの使用。
実施形態46.対象の組織を治療する方法であって、実施形態1〜12または実施形態44のいずれか1つに記載の組成物を組織に適用することを含む、方法。
実施形態47.対象の組織の治療に使用するための、実施形態1〜12または実施形態44のいずれか1つに記載の組成物。
実施形態48.対象の組織を治療するための薬剤の調製における、フィブリノゲンを含む第1の製剤、およびトロンビンを含む第2の製剤の使用であって、薬剤が、血小板溶解物をさらに含む、使用。
実施形態49.薬剤が、イオン、イオン源、アミノ酸、フィブロネクチン、麻酔薬、抗生物質、増殖因子(例えば、hEGF)、組織因子XIII、基質タンパク質(例えば、コラーゲン)のうちのいずれか1つまたは複数をさらに含む、実施形態48に記載の使用。
実施形態50.薬剤が、細胞(例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞)をさらに含む、実施形態48または実施形態49に記載の使用。
実施形態51.対象の組織の治療で同時使用するための、フィブリノゲンを含む第1の製剤、トロンビンを含む第2の製剤、および任意選択での第3の製剤であって、第1の製剤、第2の製剤および/または任意選択での第3の製剤のうちのいずれか1つもしくは複数が、血小板溶解物を含む、第1の製剤、第2の製剤、および任意選択での第3の製剤。
実施形態52.
第1の製剤、第2の製剤、および/または任意選択での第3の製剤のうちのいずれか1つもしくは複数が、イオン、イオン源、アミノ酸、フィブロネクチン、麻酔薬、抗生物質、増殖因子(例えば、hEGF)、組織因子XIII、基質タンパク質(例えば、コラーゲン)のうちのいずれか1つまたは複数を含む、実施形態51に記載の製剤。
実施形態53.
第1の製剤、第2の製剤、および/または任意選択での第3の製剤のうちのいずれか1つもしくは複数が、細胞(例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞)を含む、実施形態51または実施形態52に記載の製剤。
実施形態54.
イオンが、カルシウムイオンであるか、または
イオン源が、イオン性塩であり、および/またはカルシウムイオンを含む、実施形態49もしくは実施形態50に記載の使用、または実施形態52〜53に記載の製剤。
実施形態55.
血小板溶解物が、ヒト血小板溶解物を含むか、またはそれからなる、実施形態48〜50または実施形態54のいずれか1つに記載の使用、または実施形態51〜54のいずれか1つに記載の製剤。
実施形態56.
血小板溶解物が、抗凝固剤(例えば、ヘパリン)を含まない、もしくは実質的に含まない、または10%(v/v)未満、9%(v/v)未満、8%(v/v)未満、7%(v/v)未満、6%(v/v)未満、5%(v/v)未満、4%(v/v)未満、3%(v/v)未満、2%(v/v)未満、1%(v/v)未満、0.5%(v/v)未満の抗凝固剤(例えば、ヘパリン)を含む、実施形態48〜50、54または55のいずれか1つに記載の使用、または実施形態51〜55のいずれか1つに記載の製剤。
実施形態57.
(i)第1の製剤が、0.1〜20mg/mlのフィブリノゲンを含み、第2の製剤が、1〜40U/mlのトロンビンを含み、薬剤もしくは製剤が、合計5〜40%(v/v)の血小板溶解物を含む、または
(ii)第1の製剤が、0.1〜15mg/mlのフィブリノゲンを含み、第2の製剤が、1〜30U/mlのトロンビンを含み、薬剤もしくは製剤が、合計5〜15%(v/v)の血小板溶解物を含む、または
(iii)第1の製剤が、0.1〜12mg/mlのフィブリノゲンを含み、第2の製剤が、1〜25U/mlのトロンビンを含み、薬剤もしくは製剤が、合計7〜14%(v/v)の血小板溶解物を含む、または
(iv)第1の製剤が、0.2〜10mg/mlのフィブリノゲンを含み、第2の製剤が、2〜20U/mlのトロンビンを含み、薬剤もしくは製剤が、合計8〜12%(v/v)の血小板溶解物を含む、実施形態48〜50、または54〜56のいずれか1つに記載の使用、または実施形態51〜56のいずれか1つに記載の製剤。
実施形態58.
(i)第1の製剤が、1mg/ml未満(例えば、約0.4mg/ml)のフィブリノゲンを含み、第2の製剤が、0.5〜20U/ml(例えば、約1U/ml、約10U/ml、約20U/ml)のトロンビンを含み、薬剤もしくは製剤が、合計5〜40%(v/v)(例えば、約20%(v/v))の血小板溶解物を含む、または
(ii)第1の製剤が、1〜8mg/ml(例えば、約4mg/ml)のフィブリノゲンを含み、第2の製剤が、0.5〜20U/ml(例えば、約1U/ml、約10U/ml、約20U/ml)のトロンビンを含み、薬剤もしくは製剤が、合計5〜40%(v/v)(例えば、約20%(v/v))の血小板溶解物を含む、または
(iii)第1の製剤が、5〜15mg/ml(例えば、約10mg/ml)を含み、第2の製剤が、0.5〜20U/ml(例えば、約1U/ml、約10U/ml、約20U/ml)のトロンビンを含み、薬剤もしくは製剤が、合計5〜40%(v/v)(例えば、約20%(v/v))の血小板溶解物を含む、実施形態48〜50、または54〜56のいずれか1つに記載の使用、または実施形態51〜56のいずれか1つに記載の製剤。
実施形態59.
(i)第1の製剤が、約0.4mg/mlのフィブリノゲンを含み、
第2の製剤が、約2U/ml、約10U/mlもしくは約20U/mlのトロンビンを含み、
薬剤もしくは製剤が、合計約20%(v/v)の血小板溶解物を含むか、または
(ii)第1の製剤が、約4mg/mlのフィブリノゲンを含み、
第2の製剤が、約2U/ml、約10U/mlもしくは約20U/mlのトロンビンを含み、
薬剤もしくは製剤が、合計約20%(v/v)の血小板溶解物を含むか、または
(iii)第1の製剤が、約10mg/mlのフィブリノゲンを含み、
第2の製剤が、約2U/ml、約10U/mlもしくは約20U/mlのトロンビンを含み、
薬剤もしくは製剤が、合計約20%(v/v)の血小板溶解物を含む、実施形態48〜50、または54〜56のいずれか1つに記載の使用、または実施形態51〜56のいずれか1つに記載の製剤。
実施形態60.薬剤または製剤が、
(i)少なくとも0.2mg/mlのフィブリノゲン、少なくとも1ユニット/mLのトロンビン、および約10%(v/v)の血小板溶解物、または
(ii)約10%(v/v)の血小板溶解物、約2mg/mLのフィブリノゲン、および約5U/mlのトロンビン、を含む、実施形態48〜50、または54〜56のいずれか1つに記載の使用、または実施形態51〜56のいずれか1つに記載の製剤。
実施形態61.
第1の製剤および第2の製剤が、等体積であるか、または1%未満、2%未満、3%未満、4%未満、5%未満、10%未満、15%未満、20%未満、25%未満異なる体積である、実施形態48〜50、または54〜56のいずれか1つに記載の使用、または実施形態46〜51のいずれか1つに記載の製剤。
実施形態62.組織が、眼組織(例えば角膜組織)である、実施形態45、48〜50、または54〜61のいずれか1つに記載の使用、実施形態51〜61のいずれか1つに記載の製剤、または実施形態46に記載の方法、または実施形態47に記載の組成物。
実施形態63.組織が創傷を含むか、または創傷を含む眼組織(例えば、創傷を含む角膜組織)である、実施形態45、48〜50、または54〜61のいずれか1つに記載の使用、実施形態51〜61のいずれか1つに記載の製剤、または実施形態46に記載の方法、または実施形態47に記載の組成物。
実施形態64.製剤が、三次元(3D)バイオプリンティングを使用して対象の組織に適用される、実施形態45、または54〜62のいずれか1つに記載の使用。
実施形態65.三次元(3D)バイオプリンティングを使用して対象の組織を治療するための薬剤である、実施形態48〜50、または54〜62のいずれか1つに記載の使用。
実施形態66.組成物が、三次元(3D)バイオプリンティングを使用して組織に適用される、実施形態46に記載の方法。
実施形態67.当該組織の治療が、三次元(3D)バイオプリンティングを利用する、実施形態47に記載の組成物。
実施形態68.当該組織の治療が、三次元(3D)バイオプリンティングを利用する、実施形態51〜62のいずれか1つに記載の製剤。
定義
本出願で使用される場合、単数形の「a」、「an」、および「the」には、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の参照が含まれる。例えば、「構成成分」という用語は、複数の構成成分も含む。
本明細書で使用される場合、「含む(comprising)」という用語は「含む(including)」を意味する。「含む(comprising)」の単語の変化形、例えば、「comprise」および「comprises」は、相応に変化した意味を有する。したがって、例えば、構成成分「A」を「含む」組成物は、構成成分Aのみからなるか、1つまたは複数の追加構成成分(例えば、構成成分「B」および/または構成成分「C」)を含み得る。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ウシ、ウマ、ヒツジ、霊長類、鳥類およびげっ歯類の種を含む、経済的、社会的または研究的に重要な任意の動物を含む。したがって、「対象」は、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物などの哺乳動物であり得る。
本明細書で使用される場合、「組織」という用語は、組織の構成成分(複数可)である細胞および組織から形成された器官(複数可)の両方を包含すると理解される。
本明細書で使用される場合、「キット」という用語は、材料を送達するための任意の送達システムを指す。そのような送達システムには、反応試薬(例えば、適切な容器内の標識、参照試料、支持材料など)および/または支持材料(例えば、緩衝材、アッセイを実施するための取扱説明書)をある位置から別の位置に貯蔵、輸送、または送達することを可能にするシステムが含まれる。例えば、キットは、関連する反応試薬および/または支持材料を含む、箱などの1つまたは複数の収納容器を含み得る。「キット」という用語には、分割キットおよび複合キットの両方が含まれる。「分割キット」とは、それぞれがキット全構成成分のサブ部分を含む2つ以上の別個の容器を含む送達システムを指す。容器は、意図する受容者に一緒にまたは別々に配達され得る。それぞれがキット全構成成分のサブ部分を含む2つ以上の別個の容器を含む任意の送達システムは、「分割キット」という用語の意味に含まれる。「複合キット」とは、反応アッセイの全構成成分を単一容器に含む送達システムを指す(例えば、所望する構成成分のそれぞれを収容する単一の箱)。
本明細書で使用される場合、列挙された数値に関して使用される場合の「約」という用語は、列挙された数値および列挙された値のプラスマイナス10パーセント以内の数値を含む。
本明細書の先行技術文書のいかなる説明も、またはそれらの文書から導出された、もしくはそれらの文書に基づく本明細書の記述も、文書または導出された記述が関連技術の共通の一般的知識の一部であることを認めるものではない。
説明の目的で、本明細書で参照されるすべての文書は、別段明記しない限り、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ここで、本発明の好ましい実施形態は、添付の図を参照して、単に例として説明される。
(A)バイオインク1(B)バイオインク2(C)バイオインク3(D)バイオインク4(E)バイオインク5(F)バイオインク6(G)バイオインク7(H)バイオインク8(I)バイオインク9(表3を参照)について、34℃で10分間、1Hzの時間−掃引振動にわたる本発明の実施形態による組成物の貯蔵(G’)および損失(G”)係数を示す一連のグラフである。 バイオインク製剤1〜9(表3を参照)について、34℃の固定温度で、0.1秒-1から100秒-1のせん断速度ランプにわたってパスカル秒で測定された本発明の実施形態による組成物の粘度を示すグラフを提供する。 バイオインク製剤1〜9(表3を参照)について、可視スペクトル(400〜700nm)の波長にわたる本発明の実施形態による組成物の平均透過率を示すグラフを示す。 スライドガラスに接着された本発明バイオインク5(表3参照)の実施形態による組成物の画像である。 バイオインク1〜9(表3を参照)について、Incucyte Zoomにより測定したHCE−T細胞の経時的な平均コンフルエンス(各条件n=6)を示すグラフを提供する。 バイオインク5(表3)で培養および増殖させた初代ヒト角膜細胞を示す一連の画像を提供する。(A)は、角膜外植片から増殖している角膜上皮細胞を示す。(B)は、角膜実質細胞の増殖を示す。(C)は、角膜ニューロンの増殖を示す。(D)は、角膜内皮細胞の増殖を示す。 本発明バイオインク5(表3)の実施形態によるバイオインク製剤におけるSHSY−5Yの順調な増殖を示す画像を提供する。(A)は、インクでの細胞増殖を示す。(B)は、インクで十分なコンフルエントに達している細胞を示す。 本発明の一実施形態によるバイオインク製剤で培養された球状凝集体の画像を示す(AおよびB)。(C)は、球状凝集体から増殖した角膜実質細胞を示す。 2〜7日にわたる吸収による本発明バイオインク5(表3)の実施形態による組成物の吸収および分解の画像を提供する。 5%ヒト血小板溶解物(hPL)、5%ウシ胎児血清(FBS)およびDMEM単独におけるHCE−T細胞(各条件n=3)のスクラッチアッセイの結果を示す画像(A)およびグラフ(B)を提供する。創傷閉鎖は、DMEM単独の条件では観察されなかった。(A)は、0、5、および24時間での創傷閉鎖の再現を示す(上段0時間、中段5時間、下段24時間、左列5%hPL、中列5%FBS、右列DMEM単独)。(B)は、5%hPL条件(0.19±0.01μm/時間)および5%FBS条件(0.18±0.03)について、スクラッチ治癒が観察された速度±SEMを示す。5%FBSと5%hPLの間で治癒速度に有意差は見られなかった(p>0.05)。 以前は移植の使用に拒絶されていたエクスビボの潰瘍化したヒト角膜の再上皮化を示す画像を提供する。バイオインクは、1日目および4日目に適用され、7日目に固定、凍結切片化、H&E染色した。(A)は、初期の潰瘍を示し、潰瘍領域は赤で強調されている。(B)は、創傷清拭後の上皮のない表面のサイズを示す。(C)は、角膜の中央部分のH&E染色を示し、健康なヒト角膜に匹敵する厚さおよび形態(morphology)で完全な再上皮化を示す。(D)は、比較用に上皮除去された角膜の中央部分のH&E染色を示す。(i):上皮、(ii):間質、(iii):上皮がない、(iv):間質 死後のブタ角膜上での穿孔(直径1cm)の作成および順調な閉塞を示す画像を提供する。(A)は、穿孔の作成を示す。(B)は、漏出角膜を示す。(C)は、アプリケーターデバイスを用いたバイオインクの塗布を示す。(D)は、バイオインク塗布2分後の塞がれた穿孔を示す。 本発明バイオインクの層状プリントを示す画像を提供する。 Hoescht(青)染色またはヨウ化プロピジウム(赤)染色されたP18 HCET細胞を含む本発明のプリントされたバイオインクの画像を示す。AおよびB:押出し後2時間。CおよびD:押出し後72時間。 Hoescht(青)染色またはヨウ化プロピジウム(赤)染色されたP18 HCET細胞を含む本発明のプリントされたバイオインクの画像を示す。AおよびB:押出し後2時間。CおよびD:押出し後72時間。 本発明の実施形態によるプリントされたバイオインク組成物の透明度を示す。 浸漬試験後のスライドガラス上の本発明によるバイオインクの画像を示す。表5の通り、Aは組成物1を示し、Bは組成物2を示し、Cは組成物3を示し、Dは組成物4を示し、Eは組成物5を示し、Fは組成物6を示し、Eは組成物7を示す。 本発明のバイオインクで処理されたヒト角膜創傷(1.5mm)が漏出を防ぐことができる力のレベルを示すグラフである。A:1.63N、すなわち、112mmHg、B.1.33N、すなわち、105mmHG、C:−.71N、すなわち、56mmHG。 本発明のバイオインクが、バイオインクで塞がれた直径1.5mmの穿孔で耐えることができる平均破裂圧力(mmHg±SEM)を示すグラフである。 秒単位で経時的にパスカル秒(パスカル秒)で測定された1秒-1の固定せん断速度で、本発明のバイオインクの粘度±SEMを示すグラフである(n=3)。構成成分Bは、t=60秒で添加した。固化時間は、添加後に粘度がピークに達するまでにかかる時間として定義され、ピンクの点線で示されている。固化時間は、1秒-1の固定せん断速度で25秒と決定された。 (i)本発明のバイオインクを使用して処理された角膜上皮創傷を有するウサギの眼(列B)、および(ii)ヒストアクリルで処理された角膜上皮創傷を有する対照ウサギの眼(列A)において、経時的な創傷治癒の画像を提供する。対照ウサギおよび処理ウサギの両創傷治癒は、t=52時間で達成された。−(創傷作成前)、数字(創傷作成後の時間数)。 創傷治癒が達成されるまでの時間(t=52時間)にわたって測定された図20の対照ウサギの疼痛スコアを示すグラフである。追加の鎮痛剤が投与された時点を記録する。1:ケタミン(臨時追加の鎮痛剤)投与、2:メタドン(臨時追加の鎮痛剤)投与、3:ブプレノルフィン(IM)投与、4.メロキシカム投与。 創傷治癒が達成されるまでの時間(t=52時間)にわたって測定された図20のバイオインクで処理されたウサギの疼痛スコアを示すグラフである。追加の鎮痛剤が投与された時点を記録する。1:ブプレノルフィン(IM)投与、2:メロキシカム投与。 (i)本発明のバイオインクを使用して処理された角膜穿孔をそれぞれ有する2匹のウサギの眼(列AおよびB)ならびに(ii)ヒストアクリルで処理された角膜穿孔を有する対照ウサギの眼(列C)における経時的な創傷治癒の画像を提供する。角膜穿孔創傷の治癒が達成された場合にピンクの境界線で印をつける。二次性潰瘍の形成が治癒した場合に緑の境界線で印をつける。対照ウサギの角膜穿孔創傷治癒は、t=80時間で観察され、処理ウサギでは、それぞれt=28時間およびt=32時間であった。A:バイオインク処理ウサギ2、B:バイオインク処理ウサギ2、C:対照ウサギ。数字(創傷作成後の時間数)。 完全な創傷治癒が達成されるまでの時間(t=80時間)にわたって測定された、図23(列C)の対照ウサギの疼痛スコアを示すグラフである。追加の鎮痛剤が投与された時点を記録する。A:ブプレノルフィン(IM)投与、B:メロキシカム投与、C:ヒストアクリルオフ、D:二次潰瘍形成。 完全な創傷治癒が達成されるまでの時間(t=52時間)にわたって測定された図23(列A)のバイオインク処理ウサギの疼痛スコアを示すグラフである。追加の鎮痛剤が投与された時点を記録する。A:二次潰瘍形成、B:ブプレノルフィン(IM)投与、メロキシカム投与。 完全な創傷治癒が達成されるまでの時間(t=48時間)にわたって測定された、図23(列B)のバイオインク処理ウサギの疼痛スコアを示すグラフである。追加の鎮痛剤が投与された時点を記録する。A:二次潰瘍形成、B:ブプレノルフィン(IM)投与、メロキシカム投与。 (i)本発明のバイオインクを使用して処理された、改変角膜穿孔を有するウサギの眼(列A)および(ii)ヒストアクリルで処理された改変角膜穿孔を有する対照ウサギの眼(列B)における経時的な創傷治癒の画像を提供する。改変角膜穿孔創傷の治癒が達成された場合にピンクの境界線で印をつける。二次性潰瘍の形成が治癒した場合に緑の境界線で印をつける。対照ウサギにおける改変角膜穿孔の治癒は、t=48時間で観察され、処理ウサギではt=8時間であった。列A:バイオインク処理ウサギ2、列B:対照ウサギ。数字(創傷作成後の時間数)。 (i)完全な創傷治癒が達成されるまでにかかった時間(t=48時間)にわたって測定された図27(列B)の対照ウサギ(暗線)および(ii)完全な創傷治癒が達成されるまでにかかった時間(t=8時間)にわたって測定された図27(列A)のバイオインク処理ウサギ(明線)、についての疼痛スコアを示すグラフである。追加の鎮痛剤が投与された時点を記録する。バイオインク処理ウサギには、追加の鎮痛剤を投与しなかった。A:ブプレノルフィン(IM)投与、B:メタドン(臨時追加の鎮痛剤)投与、C:メロキシカム投与、D:ヒストアクリルオフおよび二次性潰瘍形成。 (A)摂氏−40度で凍結乾燥したバイオインク試料、(B)1チューブあたり50uLの水で透明な液体に再構成した(A)の凍結乾燥試料、(C)再構成後に形成された透明な接着性ゲル、についての画像を示す。
図1の凡例:
Figure 2021534231
図2の凡例:
Figure 2021534231
図3の凡例:
Figure 2021534231
図5の凡例:
Figure 2021534231
図28の凡例:
Figure 2021534231
本発明者らは、構造化形態での組織への適用を促進する機械的特性および構造的特性を有する血小板溶解物組成物を開発した。特に、本発明の組成物は、二次元または三次元のバイオプリンティング技術を使用して、血小板溶解物を組織(例えば、眼)に適用するために使用され得る。本組成物は、生物学的標的(例えば、器官、組織、細胞)に薬剤を送達する手段を提供する。角膜損傷の治療への適用に好適であるが、本明細書に記載の組成物は、例えば、構造的支持、生細胞、および創傷治癒のプロセスを促進する他の因子を提供することにより、創傷治癒の分野における多数の治療のためのプラットフォームを提供する。当技術分野では、眼表面の創傷などの創傷に対する効果的な血液由来の治療が必要とされている。本明細書に記載の組成物は、眼の治療の観点から、涙の代用物として作用するように眼の表面を潤滑するだけでなく、創傷治癒を促進する多様な増殖因子およびサイトカインの供給源も提供する血小板溶解物に基づいている。本明細書に記載の組成物は、インビボ組織を模倣し、細胞が増殖するための足場として機能し、および/または条件操作を通じて、細胞自体がそれらの周囲の基質を再生することを促進する、生体材料を利用することができる。眼組織への適用に対する適合性という観点から、本発明者らは、例えば、治療中の組織(例えば、角膜)の構造的完全性を具現化できる基質を作成することの困難に取り組む一方で、透明性を維持し、さらに多孔性で生体適合性があり、角膜細胞および必要な治癒促進増殖因子の浸潤、移動および/または増殖を可能にする。損傷組織(例えば、角膜などの眼組織)の構造的、機械的および物理的な要件を満たしながら、損傷組織の栄養必要量を提供することのバランスは、本発明が生まれたときに存在した問題であった。本発明は、多様な生物学的標的に薬剤を送達するための改善された組成物および方法を提供する。特定の用途に限定されることなく、本組成物は、創傷および他の形態の組織損傷を治療するために使用され得る。
生物剤の送達のための組成物
本発明は、組織および細胞などの生物学的標的への薬剤の送達に好適な組成物を提供する。
本組成物は、生物学的標的(例えば、組織、膜、細胞、器官)への適用時に構造的支持を提供し、生物学的標的への薬剤の送達を促進し、ならびに/または損傷組織、および/または生物学的標的内の細胞の再生を促進するために、基本足場材料を利用する。
足場を生成するために使用される特定の材料(複数可)に関して、特に制限はない。
例えば、足場はフィブリン足場であり得る。これらは、例えば、組成物中のフィブリノゲンおよびトロンビンの使用を介して生成され得る。当業者に知られているように、フィブリノゲンからフィブリンへの変換は、一般に3段階で起こる。トロンビンは、限定されたタンパク質分解である第1段階を触媒して、フィブリノゲンからフィブリノペプチド(FpAおよびFpB)を放出し、それによってフィブリンモノマーを提供し得る。第2段階では、フィブリンモノマーは非共有相互作用を介して中間ポリマーを形成し得る。第3段階では、中間ポリマーが凝集して三次元フィブリン基質を形成し得る。フィブリン形成および生物学的足場におけるその使用は、例えば、Ahmed et al.(Tissue Eng Part B Rev.2008 Jun;14(2):199−215)に記載されている。
本発明の組成物は、任意選択で、イオンおよび/またはイオン源をさらに含み得る。好適なイオンの非限定的な例には、カルシウムイオンが含まれる。好適なイオン源の非限定的な例には、カルシウム含有化合物(例えば、塩化カルシウム)が含まれる。
本発明の組成物は、血小板溶解物を含み得る。血小板溶解物は、例えば、哺乳動物の血小板溶解物(例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヤギ、マウス、ウサギ、ハムスター、またはイタチの血小板、またはそれらの任意の組み合わせを使用して生成される)であり得る。血小板溶解物を生成するために利用される血小板の供給源は、一般に、組成物が使用される特定の目的に依存するであろう。当業者に知られているように、血小板溶解物は、血小板を単離し、それらを溶解し、細胞残屑を除去することによって生成する。血小板溶解物の構成要素およびその用途は十分に分析されている(例えば、Burnouf et al.Biomaterials.2016 Jan;76:371−87を参照)。
本発明者らは、本発明の組成物についてフィブリノゲン、トロンビン、および血小板溶解物の最適な相対濃度を特定し、そのいくつかは、本出願の実施例および特許請求の範囲に記載されている。開示されたフィブリン、トロンビンおよび血小板溶解物の相対濃度は例示的なものにすぎないことが理解されよう。
本発明による組成物は、細胞を含み得る。細胞は、例えば、哺乳動物細胞(例えば、ヒト細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ウシ細胞、ブタ細胞、ウマ細胞、ヤギ細胞、ヤギ細胞、マウス細胞、ウサギ細胞、ハムスター細胞、イタチ細胞、またはこれらの任意の組み合わせ)であり得る。利用される細胞のタイプは、一般に、組成物が使用される特定の目的に依存するであろう。例えば、細胞は、本組成物が投与される組織と同じタイプであり得る(例えば、中枢および/または末梢の角膜上皮、眼球および/または瞼板の結膜上皮、瞼板結膜間質および/または眼瞼縁の細胞を含む眼表面細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、メルケル細胞、およびランゲルハンス細胞を含むがこれらに限定されない皮膚細胞、ならびにニューロンおよびグリア細胞を含むがこれらに限定されない神経組織細胞)。他の例には、上皮細胞、角膜実質細胞、神経細胞、および内皮細胞が含まれる。いくつかの実施形態において、細胞は、造血幹細胞、骨髄幹細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、皮膚幹細胞、筋肉幹細胞、脂肪幹細胞、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、細胞は神経細胞であり得る。
組成物の血小板溶解物および/または細胞は、自己由来であり得る(すなわち、組成物を受け取ることを意図した所与の対象に自己由来する、または(すなわち、ドナー由来)。
本発明の組成物は、必須および/または非必須アミノ酸を含み得る。好適な必須アミノ酸の非限定例には、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、バリン、システイン、チロシン、ヒスチジンおよびアルギニンが含まれる。
本発明の組成物は、フィブロネクチン、麻酔薬、抗生物質、増殖因子(例えば、ヒト上皮増殖因子(hEGF)、血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、上皮増殖因子、形質転換増殖因子(ベータを含む)、および結合組織増殖因子)、フィブリン安定化因子(例えば、組織因子XIII)、基質タンパク質(複数可)(例えば、コラーゲン、ラミニン、インテグリン)およびこれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない追加の構成成分(例えば、薬剤)を含み得る。
本発明の組成物は、水および/または培養培地(例えば、DMEM、DMEM/F−12、MEM、CnT−PR)を含む他の好適な成分を含み得る。培養培地は、例えば、グリシン、L−アラニン、L−アルギニン塩酸塩、L−アスパラギン−H2O、L−アスパラギン酸、L−システイン塩酸塩−H2O、L−シスチン2HCl、L−グルタミン酸、L−グルタミン、L−ヒスチジン塩酸塩−H2O、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リジン塩酸塩、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−プロリン、L−セリン、L−スレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン二ナトリウム塩二水和物、L−バリン、ビタミン、ビオチン、塩化コリン、D−パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミドピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、チアミン塩酸塩、ビタミンB12、i−イノシトール、無機塩、塩化カルシウム(CaCl2)(無水)、硫酸銅(CuSO4−5H2O)、硝酸鉄(Fe(NO33”9H2O)、硫酸鉄(FeSO4−7H2O)、塩化マグネシウム(無水)、硫酸マグネシウム(MgSO4)(無水)、塩化カリウム(KCl)、重炭酸ナトリウム(NaHCO3)、塩化ナトリウム(NaCl)、二塩基性リン酸ナトリウム(Na2HPO4)無水、一塩基性リン酸ナトリウム(NaH2PO4−、硫酸亜鉛(ZnSO4−7H2O)、他の構成成分、D−グルコース(デキストロース)、ヒポキサンチンNa、リノール酸、リポ酸、プトレシン2HCl、ピルビン酸ナトリウム、チミジン、またはこれらの任意の組み合わせのうちのいずれか1つ以上を含み得る。
いくつかの実施形態では、本組成物は、抗凝固剤を含まないか、または微量でのみ存在し得る抗凝固剤を実質的に含まない。これらの抗凝固剤の非限定例には、ヘパリン、ビタミンK拮抗薬(例えば、ワルファリン、クマリン)、リバーロキサバン、エドキサバン、アピキサバン、ダビガトランなどが含まれる。
組成物の非限定的な特性には、以下のうちの1つまたは複数が含まれる。
−非ニュートンせん断減粘流体の特性により、せん断速度が増加するにつれ、組成物の粘度が低下し得る。いくつかの実施形態では、組成物の粘度は、室温で0.01〜1000パスカル秒の範囲であり得る。
−光の透過率から生じる視力を妨げない、または実質的に妨げない、例えば400〜700nmの視覚色範囲で90%超の光学的透明度。
−プリント後の形状/構造を維持するまたは実質的に維持する能力を備えたプリンティング(例えば、バイオプリンティング/押出しプリンティング)への適合性。
−プリンティングプロセスの間、組成物内の細胞の生存率を維持しながらのプリンティングへの適合性。
−生細胞を含む場合または含まない場合の二次元または三次元の構造で提供される能力。
−細胞の増殖を維持および/または促進する能力(例えば、上皮細胞、角膜実質細胞、神経細胞、および内皮細胞などの初代ヒト細胞の拡大増殖を維持および/または促進する)。
−球状オルガノイドの形成を促進する能力。
−細胞による経時的な(例えば、2〜7日)分解能力。
−経時的(例えば、7日)な創傷治癒能力(例えば、角膜潰瘍)。
−経時的な(例えば、34℃で7日間)細胞生存率の維持。
−組織、器官、膜(例えば、哺乳動物およびヒトの組織、器官、膜)を含むさまざまな表面に付着する能力。
創傷治癒組成物の調製
本発明の組成物は、血小板溶解物(例えば、哺乳動物血小板溶解物、ヒト血小板溶解物)を含む。血小板溶解物は、任意の好適な方法によって調製することができる(例えば、凍結/解凍による溶解、例えば、Chou and Burnouf,ISBT Science Series,Vol 12,Issue 1,Feb 2017,pages 168−175を参照)。
さらに、本発明者らは、血小板溶解物の調製中(例えば、培養時)の抗凝固剤の使用が、本発明による組成物を形成する血小板溶解物の能力に影響を及ぼし得ることを観察した。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、利用される血小板溶解物は、調製方法の一部またはすべての段階で抗凝固剤(例えば、ヘパリン)なしで調製される。
一般に、本発明の組成物は、複数の異なる調製物を組み合わせることによって調製することができる。いくつかの実施形態において、トロンビンを含む調製物は、フィブリノゲンを含む調製物とは別に維持され、2つの調製物は、組成物の適用前または適用中に組み合わされる。
例えば、フィブリノゲンおよび血小板溶解物を含む第1の調製物を、トロンビンを含む第2の調製物と混合して、本発明の組成物を提供することができる。あるいは、フィブリノゲンを含む第1の調製物を、トロンビンおよび血小板溶解物を含む第2の調製物と混合して、本発明の組成物を提供することができる。追加の構成成分(例えば、イオン、イオン源、アミノ酸、細胞、抗生物質、増殖因子、フィブリン安定化因子、麻酔薬など)は、任意の好適な様式で、任意の好適な時間(例えば、混合段階の前)に組成物に組み込むことができる。いくつかの実施形態では、追加の構成成分(すなわち、フィブリノゲンおよびトロンビンに追加の構成成分)のいくつかまたはすべてを、トロンビンを含む調製物および/またはフィブリノゲンを含む調製物に含めることができる。他の実施形態では、追加の構成成分(すなわち、フィブリノゲンおよびトロンビンに追加の構成成分)のいくつかまたはすべては、トロンビンまたはフィブリノゲンを含むこれらの調製物とは別の1つまたは複数の調製物で提供することができる。さらに他の実施形態では、いくつかの追加の構成成分(すなわち、フィブリノゲンおよびトロンビンに追加の構成成分)は、トロンビンを含む調製物および/またはフィブリノゲンを含む調製物に含めることができ、いくつかの追加の構成成分(すなわち、フィブリノゲンおよびトロンビンに追加の構成成分)は、トロンビンまたはフィブリノゲンを含むこれらの製剤とは別の1つまたは複数の製剤に含めることができる。
いくつかの実施形態では、本組成物は、分離された構成成分の個々の流れを確立することによって調製することができる。これらの流れは、好適な期間、継続的な流れの状態で維持され、所与の点で互いに混合するように方向づけられることにより、生物学的標的上に沈着される混合構成成分のさらなる流れを提供する。あるいは、流れは、組成物が適用される生物学的標的の表面または表面上で互いに混合するように方向づけられ得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、使用するまで本発明の組成物を形成するために必要な異なる調製物の分離を容易にするデバイスおよび/またはキットを提供する。一般に、デバイスおよびキットは、少なくとも2つの物理的に分離された区画を含み、第1はトロンビンの調製物を含み、第2はフィブリノゲンの調製物を含む。いくつかの実施形態において、一方または両方の区画は、組成物を生成する際に使用される追加の構成成分(例えば、血小板溶解物、イオン、アミノ酸、細胞、抗生物質、増殖因子、フィブリン安定化因子、麻酔薬など)を含み得る。
デバイスおよびキットは、例えば、第1および第2の区画を分離するバリア(複数可)の除去によって、ならびに/または一方もしくは両方の区画のシールまたは壁に穴を開けることによってなど、2つの区画化された調製物の混合を促進する手段を提供する構成成分をさらに含み得る。当業者は、この目的のためにさまざまな準備を行うことができることを容易に理解するであろう。
追加的または代替的に、デバイスおよびキットは、デバイスまたはキットからの調製物の放出中または放出後に、2つの区画化された調製物の混合を確実にする方法で構成され得る。
いくつかの実施形態では、デバイスおよびキットは、組成物を生成する際に使用される追加の構成成分(例えば、血小板溶解物、イオン、アミノ酸、細胞、抗生物質、増殖因子、フィブリン安定化因子、麻酔薬など)を含む追加の区画を含み得る。デバイスまたはキットは、デバイスまたはキットの使用中に、これらの追加の構成成分を、互いにならびに/またはフィブリノゲンおよび/またはトロンビンの調製物(複数可)と混合することを促進するように構成され得る。
デバイスおよびキットは、デバイスまたはキットからの構成成分の放出の前、最中、または直後に、分離された構成成分の混合を促進し得る。
いくつかの実施形態では、デバイスおよびキットは、分離された構成成分の個々の流れを確立するための手段を提供し得る。これらの流れは、デバイスまたはキットの使用中に継続的な流れの状態で維持され、所与の点で互いに混合するように方向づけられ得る。混合点は、デバイスもしくはキット内、流れがデバイスもしくはキットを出る場所、またはデバイスもしくはキットの外部(例えば、組成物が適用されている生物学的標的の表面または表面の前)であり得る。いくつかの実施形態では、組成物はバイオインクであり、デバイスは三次元(3D)プリンター(例えば、押出しプリンター)である。
組成物の適用
本発明者らは、バイオプリンティングに非常に好適な特徴を有する標的の組織および細胞に薬剤を送達するための組成物を開発した。創傷治癒における治療適用でのそれらの使用に加えて、本発明の組成物は、薬剤(例えば、天然増殖因子、薬物、ナノ粒子、および/または細胞)の送達および/または個々の生物学的表面の固定、および/または組織培養法で必要である治療適用で使用され得る。
いくつかの実施形態では、本組成物は、創傷シーラントとして、および/または生物学的構造の固定剤として機能し得る。これらは、創傷に構造的および/または栄養的支持を提供し得る。追加的または代替的に、本組成物は、創傷領域に存在する組成物および/または細胞の構成成分として提供され得るものを含む、標的細胞タイプの増殖を促進し得る。
組成物を適用できる組織のタイプに関して制限はないが、本発明者らは、組成物が眼の創傷の治療において非常に効果的であることを実証した。
例えば、組成物は、角膜創傷の治療に有効であることが本明細書で実証されている。これらの実施形態において、本組成物は、角膜上皮細胞の増殖および/または移動を促進するために使用され得る。本組成物は、例えば、角膜上皮細胞の多方向増殖および/または層化を支持し、これは、細胞単層が形成されると、組成物を部分的または完全に生分解し得る。
したがって、本発明は、創傷を治療するための方法、およびそのような治療方法のために製造された薬剤を提供する。創傷は、例えば、中枢および/または末梢の角膜上皮、眼球および/または瞼板の結膜上皮、瞼板結膜間質、および/または眼瞼縁の組織を含む眼組織の中または周囲に位置し得る。
広く記載されている本発明の精神または範囲から逸脱することなく、具体的な実施形態に開示されているように、本発明に対して多数の変形および/または改変を行えることは、当業者に理解されるであろう。したがって、本実施形態は、すべての点で例示的であり、限定的ではないとみなされるべきである。
次に、本発明を具体的な実施例を参照して説明するが、これは決して限定的なものとして解釈されるべきではない。
実施例1:バイオインク組成物の調製および特性評価
−材料および方法
(i)血小板溶解物の調製
医薬品のヒト血小板溶解物は、オーストラリア赤十字血液サービスによって2つの方法で調製される。
1.アフェレーシス
a.血小板はアフェレーシスによって得られる。
b.血小板は摂氏4度で5日間保存される。
c.血小板溶解物の濃度はアフェレーシスプロセスのために高いが、含有する。
d.血小板溶解物は、複数の凍結融解サイクルによって調製され、各ラウンドで遠心分離およびopti−pressによる残屑除去を行い、次いで−80℃で保存される。
2.プール
a.血液バッグを吊し、インラインろ過により赤血球を分離する
b.血漿はバッグ内で回転させ、次に血漿はopti−pressによって30%の血漿/血小板濃度に分離される
c.バッグに残った血小板製品は、チューブ溶接機を通って閉鎖系にプールされる。
d.プールされた血小板は、摂氏4度で5日間保存される。
e.プールされた血小板ユニットは、2リットルのバッチにプールされる(50〜70の輸血)
f.プールされた血小板ユニットは次いで、遠心分離し、上清を除去し、約2×1011血小板の濃度を得る。
g.プールされた血小板ユニットは、複数の凍結融解サイクルによって調製され、遠心分離およびopti−pressによる残屑除去を行い、次いで−80℃で保存される。
注記:
●調製したすべてのhPLは、−80℃で最大12か月間安定であった。
●血漿濃度が30%未満と低いため、プールされた血小板はフィブリノゲンが減少しなかった。
●病原菌を除去するために、最終遠心分離および滅菌ろ過により閉鎖系で調製した。
●すべての血小板は、貯蔵段階前の収集後にガンマ照射され、病原体不活化技術は使用されなかった。
赤十字血液銀行(Red Cross blood bank)から受け取った溶解物を4℃で一晩解凍し、37℃の水浴に2時間入れた。その後、すぐに使用する場合は4°C、必要になるまで−80°Cで保存した。
(ii)バイオインクの調製
血小板溶解物、トロンビンおよびフィブリノゲンを含む医薬組成物(「バイオインク組成物」)が製造された。場合によっては、バイオインク組成物は、イオン(例えば、カルシウム)、薬学的に許容される必須アミノ酸(例えば、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、バリン、システイン、チロシン、ヒスチジンおよび/またはアルギニン)、フィブロネクチン、ヒト内皮増殖因子、組織因子XIII、麻酔薬、抗生物質、他の増殖因子(血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、上皮増殖因子、形質転換増殖因子(ベータを含む)および/または結合組織増殖因子)を含むがこれらに限定されない)、および/または他の成分/賦形剤(表1を参照)などの追加成分を含んでいた。
Figure 2021534231
組成物は、バイオインクの適用前に一緒に混合された2つの別々の溶液AおよびB(表2を参照)を最初に調製することによって製造された。混合は完全である必要はなく、バイオインクを形成するには部分的な混合で十分であった。
Figure 2021534231
−結果および考察
バイオインクは、溶液AおよびBを混合して、透明で無色のゲルを形成することで生成した。バイオインクの以下の特性が認められた。
−バイオインクは非ニュートンせん断減粘流体であり、それにより、せん断速度が増加するにつれ、その粘度が低下する。バイオインクの粘度は、室温で0.01〜1000パスカル秒の範囲である。
−バイオインクは光学的に透明であり、400〜700nmの視覚色範囲で90%を超える光の透過率により視覚を妨げない。
−バイオインクは、押出しプリンティングによってプリンティング適性を維持し、レオロジーにより測定されるように、一旦押出されるとその形状を保持できる。
−バイオインクは組織に付着することができる
−バイオインクは、二次的支持媒体なしで組織培養における細胞の増殖を維持および促進することができる。
−バイオインクは、上皮細胞、角膜実質細胞、神経細胞、内皮細胞などの初代ヒト細胞の拡大増殖を維持および促進することができる。
−バイオインクは、球状オルガノイドの形成を促進する。
−細胞は2〜7日の期間にわたってバイオインクを分解し、バイオインク基質を再吸収することができる。
−バイオインクは、7日の間にわたって角膜潰瘍などの創傷を治癒することができる。
−バイオインクは、34°Cで保存した場合、バイオインク内の細胞の生存率を最大7日間維持する。
−バイオインクは、第1の区画で細胞を懸濁することにより、3D細胞プリンティングを可能にする
−バイオインクは、細胞の増殖および治癒を促進する構造的サポート(足場)および栄養的サポートの両方を同時に提供する。
−バイオインクは複数の細胞型の増殖を促進する
バイオインクは、角膜内の複数の細胞タイプの増殖を促進することができ、複数の角膜層を通して施される創傷治癒治療として機能し、および/またはヒトの角膜外植片からのニューロンの伸長を促進する。角膜由来ではない神経細胞株であるSHSY5Yは、バイオインクでの培養に成功し、角膜以外に広がる適用を可能にする。
バイオインクは、細胞の球状凝集体を作成するために組織培養で使用することができる。凝集体は、既知の方法と比較してより簡単な方法で作成でき、酵素で組織を消化したり、マイクロウェルを使用したりする必要がなく、球状体を生成できる。
バイオインクは、用途が広くカスタマイズ可能であり、個々の患者のニーズに合わせて調整することができ、より多くの病状およびより多くの組織タイプに拡大し得る幅広い適用を包含する。自己血小板溶解物またはドナーからの溶解物は、患者にとって最も有益なものに応じて、バイオインクに含めることができる。抗生物質および麻酔薬/鎮痛薬の濃度および種類は、特定の感染症/疾患を標的とし、潜在患者のアレルギーに対応するようにカスタマイズできる。バイオインクにコラーゲンおよび他のタンパク質などの構成成分を使用する予備データ、ならびに異なる濃度のさまざまな因子についての予備データにより、さまざまな適用に向けてその機械的および栄養的プロファイルを改変および最適化することができた。
バイオインクは、眼の異常を高解像度で充填するために使用でき、液体であり、混合すると数分で温度に関係なく創傷部位で固化する。バイオインクは、異常を効率的に充填し、形状を保持して、創傷治癒を潜在的に加速し、および/または診療所で必要な時間を短縮することができる。バイオインクのせん断減粘特性は、押出しおよび液滴に基づくバイオプリンティングと適合性のある範囲で提供され得る。
バイオインクは実質的に透明で、角膜の創傷治癒および細胞増殖を促進することに加えて、視力を維持するのに有益な特徴である。
したがって、バイオインクは、例えば角膜細胞に構造的および栄養的サポートの両方を提供することができ、幅広い潜在適用を有し、好ましい物理的特性を有し、初代培養においてニューロンの増殖および球状凝集体を生成することが示されている。
実施例2:バイオインク製剤および例示的特徴の最適化
−材料および方法
(i)試薬および抗生物質
フェノールレッドを含まないダルベッコ改変イーグル培地/F12GlutaMax(商標)(DMEM/F12)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、TrypLE、ペニシリン/ストレプトマイシンは、Gibcoから購入した。ヒト血小板溶解物は赤十字血液銀行から入手した。ウシ胎児血清(FBS)は、Corning(米国)から購入した。ヒト上皮増殖因子(hEGF)、ペニシリン−ストレプトマイシン[(P−S)、10,000U/ml]は、Life technology(米国)から購入した。フィブリノゲンおよびトロンビンはMerck Milliporeから購入した。ヘマトキシリン&エオシンは、Sigma−Aldrich(米国)から購入した。
(ii)試料調達
移植に適さないヒト角膜は、地域保健地区の人体実験倫理委員会(HERC 14/275)からの同意と倫理承認を得て、ライオンズNSWアイバンクから提供された。すべての手順はヘルシンキ宣言に従った。
凍結したブタの目は、シドニー眼科病院の視力財団トレーニング研究所から入手した。
(iii)スクラッチアッセイ
SV40不死化ヒト角膜上皮細胞株(HEC−T、Rilka、日本)を解凍し、5%FBS培地(5%FBS、10ng/mL hEGF、5%P−S、DMEM/F12 glutmax)で80%コンフルエントになるまで培養した。次に、細胞を2つのT−75フラスコに継代し、80%コンフルエントになるまで、一方を5%FBS培地で培養し、他方を5%hPL培地(5%hPL、10ng/mL hEGF、5%P−S、DMEM/F12)で培養した。次に、5%FBSからのHCE−T細胞を6ウェルの24ウェルプレート(20,000細胞/ウェル)に播種し、完全にコンフルエントになるまで放置した。同様に、5%hPLのHCE−T細胞を、同じ密度で3つのウェルの同じ24ウェルプレートに播種し、完全にコンフルエントになるまで放置した。培地は2日ごとに交換した。5%FBSで培養した6つのウェルのうち3つを、スクラッチの1日前にDMEMと交換した。スクラッチ後、すべてのウェルを監視し、4倍の対物レンズを備えたOlympus DP70光学顕微鏡(Olympus、米国)を使用して2時間ごとに画像を撮った。すべての画像は、Image J(v1.51)によって分析された。創傷閉鎖率は、最初の5時間の5時間にわたる創傷サイズの減少として算出した。これはExcel(Microsoft)で算出され、Prism(GraphPad、米国)でグラフ化および統計的に分析された。
(iv)バイオインク製剤試験
バイオインクの調製
受け取ったhPLを4℃で一晩解凍した後、37℃の水浴で2時間インキュベーションした。その後、hPLはさらに使用するまで4℃で保存した。
フィブリノゲンを37°Cの滅菌水に溶解し、20mg/mLの濃度で1mLエッペンドルフチューブに分注した。これらは−20°Cで保存し、使用直前に37°Cで解凍した。
トロンビンをDMEM/F12に溶解し、20U/mLの濃度で1mLエッペンドルフチューブに分注した。これらは−20°Cで保存し、使用直前に37°Cで解凍した。
バイオインクは、2つの別々の構成成分を均等に混合することによって構成され、構成成分1はDMEM/F12にhPLおよびフィブリノゲンを含み、構成成分2はDMEM/F12にトロンビンを含む。さまざまな濃度のフィブリノゲン(0.2、2、および5mg/mL)およびトロンビン(1、5、10ユニット/mL)を試験した。すべてのバイオインクには、20%hPLの初期濃度が含まれていた(表1)。
Figure 2021534231
レオロジー
調製インクのレオロジー特性をAR−G2血流計(TA Instruments、米国)で調べた。すべての試験で2°/40mmのコーンプレート形状を使用した。時間掃引試験を実施して、1HZの一定周波数および1%のひずみでインクの粘稠度を決定した。角膜表面の温度を模倣するために、温度も34℃で一定に保った。各バイオインク(バイオインクあたりn=3)の貯蔵弾性率(G’)および損失弾性率(G”)を、10分超の時間の関数として測定した。Prism(GraphPad、米国)を使用して、データを作表し、グラフ化し、分析した。
せん断減粘は、押出しに基づくバイオプリンティングにとって理想的な特性であり、その結果、加えられたせん断応力に応じたインクの粘度も血流計で測定された。各バイオインク(バイオインクあたりn=3)について、34°Cの固定温度で0.1秒-1〜100秒-1のせん断速度ランプにわたる粘度を測定した。Prism(GraphPad、米国)を使用して、データを作表し、グラフ化し、分析した。
透明性
光の平均透過率は、可視スペクトル(400〜700nm)にわたって測定された。スライドガラス用に機械をゼロの設定にし、続いて試料をスライド上に配置し(試料あたりn=3)、平均透過率を測定した。スライドガラス上にインクで「角膜」と書くことにより、インクの透明度の視覚的表現を作成し、光の中で保持した。
細胞の適合性
上記のように調製されたバイオインクは、細胞適合性試験にも使用された。HCE−T細胞(継代数23)を96ウェルプレートに播種し(6000細胞/ウェル、各条件n=6)、Incucyte(商標)(ZOOM、Essen BioScience Inc)を使用して7日間にわたって2時間ごとにコンフルエンスを測定した。
その後のすべての実験は、バイオインク5の1つの製剤を使用して実施した(表3、予混合濃度:20%hPL、4mg/mlのフィブリノゲン、10U/mLのトロンビン、DEME/F12)。
角膜外植片の培養
角膜外植片は、ライオンズNSWアイバンクから入手した。角膜縁および中央領域は、8mmトレフィンを使用して分離された。次に、角膜縁領域を8つの等しいサイズの小片に切断し、可能な限り多くの強膜を除去し、6ウェルプレートの1つのウェルに配置し、中央領域を8つの等しいサイズの小片に切断して、6ウェルプレートの別のウェルに配置した。次に、外植片を2mLのバイオインク5で被覆した(表3)。
(v)エクスビボ創傷治癒試験
潰瘍化角膜の上皮(ライオンズNSWアイバンクから受け取った)を外科用スペードで除去し、PBSですすいだ。バイオインク5(表3)をすぐに創傷表面に塗布した。次に、角膜を器官培養培地の広口瓶で懸濁した。インクを4日目に再塗布した。7日目に、角膜を4%パラホルムアルデヒドで一晩固定し、PBSで2回すすぎ、30%スクロースに一晩置いた。次に、角膜を半分に切断し、OCT compound(Tissue−Tek、米国)に浸し、液体窒素で急速凍結し、切片作成まで−80℃で保存した。凍結角膜を、Leica CM3050 S cryostat(Leica Biosystems、ドイツ)を使用して、−20°Cで12μmの厚さの薄片にし、ポリリジンでコーティングしたスライド上に移し、乾燥し、−20°Cで保存した。Mayerのヘマトキシリンおよびエオシン染色では、スライドを95%エタノールに15秒間浸し、次に4%パラホルムアルデヒドに10回浸漬して浸した。次に、スライドを蒸留水で10回浸漬してすすぎ、ヘマトキシリンで30秒間懸濁した。次に、スライドをそれぞれ蒸留水で2回交換して10回浸漬した後、95%エタノールにさらに10回浸漬した。次に、スライドをエオシンで15秒間対比染色した後、95%エタノールで2回交換し、100%エタノールで2回交換して、それぞれ10回の浸漬で脱水した。次に、スライドをキシレンで2回交換してそれぞれ10回浸漬し、DPX(Sigma−Aldrich)で標本にした。Olympus DP70光学顕微鏡で切片を調べた。ヒトの提供角膜を陰性対照として使用し、その上皮を除去し、すぐに固定し、切片にし、同じプロトコルを使用して染色した。
(vi)エクスビボ穿孔試験
冷凍したブタ眼(n=3)の角膜を切除した後、Barronの人工前眼房に固定した。人工前眼房に接続された注射器を通して水を注入することにより、角膜を膨張させた。金属串(直径1cm)を使用して各角膜に穿孔を作成し、漏水を観察して、全層穿孔が作成したことを確認した。次に、バイオインク5(表3)を穿孔部位に適用し、2分間放置した。次に、角膜を再膨張させ、その後の漏水を観察した。
(vii)非角膜起源の細胞株の培養
SHSY−5Y細胞を解凍し、T−25フラスコ内のバイオインク5(表3)で培養した。細胞の形態およびコンフルエンスは、Olympus DP70によって観察された。細胞が80%のコンフルエンスに達したときに継代し、継代数を記録した。
カルシウムイオン溶液およびMEMでバイオインクを作成し、バイオインクのDMEM/F12構成成分と置き換える
塩化カルシウム溶液(200mg/mLの濃度)およびMEMを使用して、バイオインクのDMEM/F12構成成分と置き換え、最終産物のゲル化を観察した。
(viii)統計分析
すべての統計分析はPrism(GraphPad、米国)で実施した。T検定を使用して、2つの個別の条件を比較した。3つ以上の製剤を使用した場合、1つ−
−結果および考察
(i)スクラッチアッセイ
5%hPLおよび5%FBSで処理されたウェルは、それぞれ何割および何割で、24時間で完全に治癒した(図1)。有意差は観察されなかった(p>0.05)。創傷閉鎖は、24時間後にDMEM単独の条件では観察されなかった。
(ii)レオロジー
時間掃引実験は、貯蔵弾性率が損失弾性率よりも大きかったため(図2)、バイオインク製剤2〜9(表3)はゲル化できること、両弾性率が経時的に安定していたため、インクが一貫していたことを示した(図2)。経時的な粘度測定により、すべてのバイオインク製剤1〜9(表3)は、せん断速度が増加するにつれ、すべてのバイオインクの粘度が低下するため、非ニュートン流体およびせん断減粘挙動を示すことが実証された(図3)。
(iii)透明性
インクの全バリエーション(表3)は、可視スペクトル(図4)の波長で85%を超える透明度を示した。インクの透明度を直接評価することにより、インクを押出し、形状を保持できるようにインクのプリンティング適性が強化され、インクを通して建物が容易に見えるように透明度が強化された(図5)。
細胞の適合性
バイオインク製剤6および9(表3)を除いて、細胞のコンフルエンスは経時的に増加し、バイオインク製剤1−5および7−8が細胞増殖をサポートすることを示唆している(図6)。20U/mlのトロンビン濃度を4および10mg/mLのフィブリノゲンと事前に混合したインクで培養した細胞は、平均コンフルエンスの増加を示さなかった。さらに、平均コンフルエンス率もフィブリノゲン濃度が増加するにつれて低下した。角膜上皮細胞、角膜実質細胞、内皮細胞および神経細胞がバイオインクで増殖していることが観察された(図7)。細胞が外植片から移動し始めると、バイオインクの分解も観察された(図7a)。
(v)エクスビボ創傷治癒
脱上皮化角膜と比較して、バイオインクで処理された潰瘍性角膜では、複数の細胞層が観察された(図8)。これにより、バイオインクがエクスビボで潰瘍化したヒト角膜の完全な再上皮化を促進することができることが実証された。
(vi)穿孔試験
3つの穿孔角膜はすべて、2分の固化時間でインクを塗布することで完全な創傷閉塞を実証した(図9)。
(vii)他の細胞タイプとの適合性
SH−SY細胞はコンフルエントに達することができ、表3のバイオインクで試験した8継代(図10)にわたって正常に培養された。
−考察
透明で、プリンティング可能で、生体適合性があり、生分解性の血小板溶解物に基づくインクが、眼表面の創傷治癒のために開発された。5%hPLは、標準的な組織培養プロトコルで現在使用されているウシ胎児血清(FBS)と同等の速度で、角膜上皮細胞株の引っかき傷の治癒を促進した。血小板溶解物にフィブリノゲンおよびトロンビンを添加することにより、3Dフィブリン基質形成を誘導し、生体適合性、強度、プリンティング適性などの特性を操作することができた。
本発明者の知る限り、ヒト血小板溶解物は、独立したバイオプリンティング材料として使用されていない。これは、血小板溶解物単独では、それ自体でプリンティングするのに十分な強度の基質ではないためである。血小板溶解物がゲルを形成する能力は、その調製方法に依存する。組織培養では、血餅の形成を防ぐために、一般的にヘパリンが血小板溶解物に添加される。使用する血液生成物の凝固時間、遠心分離、および希釈は研究によって異なるが、これらのパラメーターは一般に血液生成物の有効性および特性に影響を及ぼすことが示されている。
2つの別々のチャンバー(第1は20%hPL、4mg/mlのフィブリノゲン、DMEM/F12を含む、の開発を通して、2つのチャンバーからの2つの成分を混合することにより、直接創傷部位で3D基質として固化する透明で粘着性のあるバイオプリント可能なインクを生成することができ、達成された。時間掃引レオロジー実験(図2)は、プリンティング可能なインクの最小要件がフィブリノゲン≧0.2mg/ml、トロンビン>1ユニット/mL、およびhPL 10%(すべての濃度は予混合段階を参照する)からなることを実証した。hPLは、その生物活性を保持するために方法のセクションで説明されているように調製する必要があり、ヘパリンはフィブリンメッシュの形成を防ぐためにhPLの調製では避ける必要がある。すべてのインク組成物は、可視スペクトルの波長にわたって高い透明性を示したため、この製品は眼科適用に理想的である(図4および5)。細胞適合性試験は、効果的な細胞コンフルエントを実現するために、インクが10U/mL以上(図6)のトロンビンを含めないことを実証した。
細胞適合性およびレオロジーデータの組み合わせにより、インク中のフィブリノゲンおよびトロンビンの有益な予混合濃度は、それぞれ4mg/mLと10U/mLであることが観察された(表3のバイオインク5)。これらの濃度は、その後のエクスビボ研究で使用され、バイオインクが、潰瘍化ヒト角膜の完全な再上皮化を促進し(図8)、直径1cmの完全な穿孔を閉塞する能力を有することを実証した(図12)。さらに、4つの細胞タイプすべてがバイオインクで増殖できることが示され(図7)、この製品は全層の眼内用途として機能し得る。これらすべての結果は、バイオインクが3Dプリント方式で角膜創傷治癒を治療するための特徴を有することを示す。
角膜で3Dプリンティングを使用するという概念は、主に全体または一部の構造を外部からバイオプリンティングすることに関連しているが、インビボでプリンティングできることは、さまざまなサイズで迅速な注意が必要な角膜創傷の治療に有益である。創傷を閉塞するために商業的に使用されるフィブリン接着剤は不透明であり、創傷を閉塞するようにのみ作用することが示されており、角膜細胞の移動を阻害するため、角膜細胞の増殖を促進しない。これは、自然な創傷治癒反応を妨げ、したがって全体的な創傷治癒を妨げる。生成されたバイオインクは、フィブリン接着剤が細胞の移動および増殖を可能にするという追加の利点を提供できる構造的サポートを組み込んでおり、角膜再生を強化するサプリメントを含めることもできる。
そのプリンティング適性に加えて、バイオインクは細胞の増殖および治癒を促進する構造的および栄養的サポートの両方を同時に提供する。さらに、バイオインク製品の性質は用途が広くカスタマイズ可能であり、個々の患者のニーズに合わせて調整することができ、より多くの病状およびより多くの組織タイプに拡大する幅広い適用を網羅できる可能性がある。自己血小板溶解物またはドナーからの溶解物は、患者にとって最も有益なものに応じて、バイオインクに含めることができる。抗生物質および麻酔薬/鎮痛薬の濃度および種類は、特定の感染症/疾患を標的とし、潜在患者のアレルギーに対応するようにカスタマイズできる。バイオインクは、半減期を延長し、創傷部位に直接薬物を正確に送達するための薬物送達ツールとしても使用できる。また、ナノ粒子などの他の物質を標的部位に送達するためにも使用できる。
球状細胞の形成は、3D培養の指標である(図11)。過去10年間で、角膜適用の三次元細胞凝集体の開発に関心が高まっている。三次元の細胞凝集体は、二次元の単層細胞培養よりも速い速度で組織の自己組織化を促進することが示されている。この細胞培養法は、単細胞初代培養と比較して特に有益であり、この構成がより多くの細胞間接着を促進するだけでなく、細胞をより若い子孫に戻すことができるため、これらの細胞はより強い前駆細胞の潜在性を有し、初代培養の同等物よりも速い速度で移動および増殖し、テロメラーゼ活性およびテロメア長が高くなっている。この細胞培養法は、角膜創傷治癒の適用に非常に有望である。バイオインクは、3D培養の代替基質に使用でき、球状細胞を得るためのより簡単な手段を示す。
最後に、組織培養の結果は、バイオインクがSHSY−5Y(非角膜由来の神経細胞株)をサポートする能力を有することを実証し(図10)、角膜よりも広く拡大されるこのインクの潜在的な将来の適用範囲を示している。
結論として、本発明者らは、バイオプリント可能な、生分解性で、透明な、創傷治癒を促進する特性を有するバイオインクを開発した。バイオインクはまた、球状細胞を生成するための3D培養用のツール、他の組織の創傷を治癒する能力、および疾患治療に対する効果的な薬物/物質担体として作用する能力などの追加の機能を有することも予想されている。
実施例3:層状のバイオインク製剤の三次元プリンティング
−方法
P18 HCET細胞をトリプシン処理し、1×106細胞/mLの最終濃度でバイオインクに懸濁させた。次に、バイオインクをペトリ皿に押出し、2分間放置した。次に、インクの別の層を頂部に直交して押出し、放置して固化させた。2本の線を光学顕微鏡で観察して、それらが依然区別できるか否かを決定した。
−結果
図13に示すように、バイオインクは個別の層でプリンティング可能である。
実施例4:プリントされたバイオインクにおける細胞の生存
−方法
P18 HCET細胞をトリプシン処理し、1×106細胞/mLの最終濃度でバイオインクに懸濁させた。次に、バイオインクをペトリ皿に押出し、2分間放置した。Hoeschtおよびヨウ化プロピジウム(PI)生死染色は、押出し後2時間および72時間で実施され、細胞生存率はimage Jを用いて算出した。ヘキスト染色(青)は全細胞核を染色する一方、PI染色(赤)は死細胞のみを染色する。
−結果
図14Aおよび14Bは、押出し後2時間の同じ領域でのHoeschtおよびヨウ化プロピジウム染色を示す。図14Cおよび14Dは、押出し後72時間の同じ領域でのHoeschtおよびヨウ化プロピジウム染色を示す。
Image J分析では、どちらの場合も細胞生存率が90%を超えると決定され、この製品が3Dプリント細胞の細胞担体として使用できることを意味する。
実施例5:バイオインクの形成におけるカルシウムイオンの役割
−方法
表3に示すように条件を試験した(各条件n=3)
Figure 2021534231
−結果
カルシウムイオンとは無関係に、hPLを含むすべての溶液で透明なゲルが得られた。不透明なゲルは、hPLを使用せず、カルシウムイオンが存在する条件で得られた。hPLもカルシウムイオンも存在しないと、透明な液体の上にフィブリン片が浮遊し、ゲルが形成されなかった。
hPLは、インクのゲル化および透明性に不可欠である(図15)。バイオインクはカルシウムイオンとは無関係に形成することができた。
実施例6:バイオインクへの構成成分の追加。
−方法
種々の構成成分をさまざまな濃度でバイオインクに添加し(表5)(製剤あたりn=3)、スライドガラス上に3滴として押出した。最初の液滴を1分間、2番目の液滴を2分間、3番目の液滴を5分間固化させた。これらの時点で、それらは「浸漬試験」にかけられることによって、水に浸漬し、次いで0.9%NaClですすいだ。最小固化時間は、ゲル化した液滴が「浸漬試験」後スライド上に残った最短の時点によって決定された。
Figure 2021534231
−結果
すべての組成物は、混合後5分以下で固化することができた(表6)。図16は、浸漬試験後のスライドガラス上のバイオインクの画像を示す。表5の通り、Aは組成物1を示し、Bは組成物2を示し、Cは組成物3を示し、Dは組成物4を示し、Eは組成物5を示し、Fは組成物6を示し、Eは組成物7を示す。
Figure 2021534231
実施例7:眼表面シーラントとしてのバイオインクの使用
−方法
この実施例の実験は、バイオインク5の1つの製剤(表3)、予混合濃度:20%hPL、4mg/mlのフィブリノゲン、10U/mLのトロンビン、DEME/F12を使用して実施された。直径約1.5mmの創傷は、Lions NSW Tissue Bankから入手したヒト角膜の中心に作成した。次に、角膜をハンナ人工前眼房(AAC)に入れた。バイオインク(n=3)を創傷に投与し、圧力を上げた。シーラントのない穿孔角膜が安定な漏出を示す圧力を測定し、システムに固有の基準圧として採用した。シーラントの不具合は、創傷の漏出が観察された場合であると決定され、破裂圧力は次のように算出し、
Figure 2021534231
mmHgで記録した。
−結果
結果(図17および18を参照)は、バイオインクが小さな角膜穿孔のシーラントとして、およびシアノアクリレート接着剤などの市販のシーラントの生体適合性代替品として使用できることを実証している。直径約1.5mmの穿孔では、バイオインクは91±27mmHgの平均圧力に耐えることができた。これは平均眼圧(10〜22mmHg)をはるかに上回っている。
実施例8:固化時間対固定せん断速度
−方法
この実施例の実験は、バイオインク5の1つの製剤(表3)、予混合濃度:20%hPL、4mg/mlのフィブリノゲン、10U/mLのトロンビン、DEME/F12)を使用して実施した。バイオインクの固化時間は、1秒-1の固定せん断速度で定量的に測定した。AR−G2血流計(TA Instruments、米国)でも、クエットカップおよびボブの粘度計の形状を使用して、バイオインクの1秒-1の固定せん断速度での粘度を測定した(n=3)。15mLの構成成分A(20%hPL、4mg/mL hPL、DMEM/F12)をこの形状に注ぎ、構成成分A単独の粘度を60秒間測定した。次に、ボブは5秒間回転を一時停止し、その間に15mLの構成成分B(10U/mLのトロンビン、DMEM/F12)を添加した。その後、ボブは回転を再開し、粘度をさらに180秒間測定した。Prism(GraphPad、米国)を使用して、データを作表し、グラフ化し、分析した。固化時間は、構成成分Bの添加後に安定した粘度に達するのにかかる時間であると確立され、決定された。
−結果
1秒-1の固定せん断速度で混合した場合、バイオインクは25秒で固化した(図19)。構成成分AおよびBがベンチトップで受動的に混合される場合、2〜5分で固化することが以前に測定されていた。これらの結果は、せん断速度が固化時間に影響を及ぼすことを実証しており、3Dプリンティングデバイスでバイオインクが押出される解像度が、バイオインクの固化速度に影響を及ぼすことを意味している。
実施例9:インビボ動物試験
−方法
この実施例の実験は、バイオインク5の1つの製剤(表3)、予混合濃度:20%hPL、4mg/mlのフィブリノゲン、10U/mLのトロンビン、DEME/F12を使用して実施された。
バイオインクがインビボ角膜上皮創傷モデルおよびインビボ角膜穿孔モデルにおいて創傷治癒を促進する/妨害しないか否かを決定し、それが創傷治癒プロセスに伴って経験する疼痛を軽減するか否かを確認するために実験を実施した。
対象:メスのニュージーランドアルビノ白ウサギ
上皮創傷(ウサギ1および2)
1.SOPであるAnaesthesia and Analgesia Rabbits(Hybrid Theatre)Procedures(SOP−ANA_04_LAS anaesthesia and analgesia_rabbits_20171130)およびLAS SOP#38 Handling and Restraint of Rabbitsを使用して、手術(procedure)用にウサギ対象を準備する。
2.手術前にウサギの背中にブプレノルフィンパッチを配置する。
3.眼周囲領域から毛皮を除去することにより眼瞼辺縁を準備する。獣医助手が獣医クリッパー(#40ブレード)を使用して完了する。
4.眼表面および眼周囲の皮膚表面領域を10%のポビドンヨード洗浄液を用いて準備する。
5.滅菌外科用ドレープをウサギの上に配置し、眼周囲領域を露出させる。
6.手術中のアクセスを維持するために小児用開瞼器を眼に配置する。
7.次に、角膜を滅菌生理食塩水で洗い流して、10%ポビドンヨード洗浄液を除去する。
8.角膜に外科用スピアを軽く当てて表面を乾かす。
9.5mmの滅菌角膜遮光体(スポンジ)を3滴(約150マイクロリットル)の30%エタノールを使用して準備する。次に、スポンジを角膜中央表面に20秒間配置して、下部の角膜層からの上皮細胞の弛緩を促進する。スポンジから残留液が漏出する可能性がないか、スポンジを観察するよう留意する。これは、余分な液体を吸収するために外科用スピアを使用することで改善できる(必要な場合)。
10.次に、外科用鉗子を使用して角膜遮光体/スポンジを取り外し、それを廃棄する。次に、外科用スピアを使用して、角膜上の残留エタノール液を吸収する。
11.中央5mmの領域にわたって外科用スピアを動かすことによって弛緩した上皮を除去する。外科用スピアの使用で上皮を除去できない場合、本研究者らは滅菌ホッケーの刃を使用して残りの細胞を丁寧に除去するであろう。
12.ウサギが研究ウサギとみなされる場合、中央5mmの異常部の上にバイオインクを配置する。露出した角膜表面への適切な接着を確実にするために、タイマーを120秒間開始する。
13.抗生物質の点眼薬を手術眼に入れ、開瞼器を取り外す。ウサギにメロキシカム0.5mg/kgを投与する。獣医の麻酔科医がメロキシカムを投与する。
14.本研究者らは、創傷およびその周辺領域を外部から検査して、術中合併症がないことを確認する。
15.手術が完了すると、ウサギを監視するために術後室に移す。個々の飼育室に戻す前に、Celluvisc人工涙滴を両眼に滴下する。抗生物質の点眼前および創傷が閉じるまで最長2覚醒時間ごとに、Celluviscを手術眼に入れる。その日の最終検査時にリフレッシュ防腐剤を含まないゲル潤滑剤を手術眼に入れ、一晩適用範囲を拡大する。これは、創傷が閉じるまで、または本研究者らの意見で、ウサギ対象がスリットランプ検査下で表面炎症を示している(例えば、結膜浮腫、乾燥または不規則な角膜表面)場合まで継続する。
16.HT複合疼痛スコアウサギの文書に従って、活動時間を通して2時間ごとに疼痛を採点する。
17.スリットランプ生体顕微鏡検査(最長7日)で示されるように創傷が治癒するまで、一般検査を1日4回行い、その後、創傷閉鎖後7日間は1日1回、安楽死まで平日1回行う。
角膜穿孔(ウサギ3、4および5)
1.SOPであるAnaesthesia and Analgesia Rabbits(Hybrid Theatre)Procedures(SOP−ANA_04_LAS anaesthesia and analgesia_rabbits_20171130)およびLAS SOP#38 Handling and Restraint of Rabbitsを使用して、手術用にウサギ対象を準備する。
2.手術前にウサギの背中にブプレノルフィンパッチを配置する。
3.眼周囲領域から毛皮を除去することにより眼瞼辺縁を準備する。獣医助手が獣医クリッパー(#40ブレード)を使用して完了する。
4.眼表面および眼周囲の皮膚表面領域を10%のポビドンヨード洗浄液を用いて準備する。
5.滅菌外科用ドレープをウサギの上に配置し、眼周囲領域を露出させる。
6.手術中のアクセスを維持するために小児用開瞼器を眼に配置する。
7.次に、角膜を滅菌生理食塩水で洗い流して、10%ポビドンヨード洗浄液を除去する。
8.角膜に外科用スピアを軽く当てて表面を乾かす。
9.ブレードを使用して、角膜の周辺領域に長さ約2mmの完全な穿孔を作成する。
10.ウサギが研究用ウサギとみなされる場合、バイオインクを穿孔上に配置する。露出した角膜表面への適切な接着を確実にするために、タイマーを120秒間開始する。
11.ウサギが対照ウサギとみなされる場合、市販のhistoacrylを穿孔上に配置する。
12.抗生物質の点眼薬を手術眼に入れ、開瞼器を取り外す。ウサギにメロキシカム0.5mg/kgを投与する。獣医の麻酔科医がメロキシカムを投与する。
13.本研究者らは、創傷およびその周辺領域を外部から検査して、術中合併症がないことを確認する。
14.手術が完了すると、ウサギを監視するために術後室に移す。個々の飼育室に戻す前に、Celluvisc人工涙滴を両眼に滴下する。抗生物質の点眼前および創傷が閉じるまで最長2覚醒時間ごとに、Celluviscを手術眼に入れる。その日の最終検査時にリフレッシュ防腐剤を含まないゲル潤滑剤を手術眼に入れ、一晩適用範囲を拡大する。これは、創傷が閉じるまで、または本研究者らの意見で、ウサギ対象がスリットランプ検査下で表面炎症を示している(例えば、結膜浮腫、乾燥または不規則な角膜表面)場合まで継続する。
15.HT複合疼痛スコアウサギの文書に従って、活動時間を通して2時間ごとに疼痛を採点する。
16.スリットランプ生体顕微鏡検査(最長7日)で示されるように創傷が治癒するまで、一般検査を1日4回行い、その後、創傷閉鎖後7日間は1日1回、安楽死まで平日1回行う。
改変角膜穿孔(ウサギ6および7)
1.SOPであるAnaesthesia and Analgesia Rabbits(Hybrid Theatre)Procedures(SOP−ANA_04_LAS anaesthesia and analgesia_rabbits_20171130)およびLAS SOP#38 Handling and Restraint of Rabbitsを使用して、手術用にウサギ対象を準備する。
2.手術前にウサギの背中にブプレノルフィンパッチを配置する。
3.眼周囲領域から毛皮を除去することにより眼瞼辺縁を準備する。獣医助手が獣医クリッパー(#40ブレード)を使用して完了する。
4.眼表面および眼周囲の皮膚表面領域を0.2%のポビドンヨード洗浄液を用いて準備する。
5.滅菌外科用ドレープをウサギの上に配置し、眼周囲領域を露出させる。
6.手術中のアクセスを維持するために小児用開瞼器を眼に配置する。
7.次に、角膜を滅菌生理食塩水で洗い流して、0.2%ポビドンヨード洗浄液を除去する。
8.角膜に外科用スピアを軽く当てて表面を乾かす。
9.ブレードを使用して、角膜の周辺領域に長さ約2mmの完全な穿孔を作成する。
10.ウサギが研究用ウサギとみなされる場合、バイオインクを穿孔上に配置する。露出した角膜表面への適切な接着を確実にするために、タイマーを120秒間開始する。
11.ウサギが対照ウサギとみなされる場合、市販のhistoacrylを穿孔上に配置する。
12.抗生物質の点眼薬を手術眼に入れ、開瞼器を取り外す。ウサギにメロキシカム0.5mg/kgを投与する。獣医の麻酔科医がメロキシカムを投与する。
13.本研究者らは、創傷およびその周辺領域を外部から検査して、術中合併症がないことを確認する。
14.手術が完了すると、ウサギを監視するために術後室に移す。個々の飼育室に戻す前に、Celluvisc人工涙滴を両眼に滴下する。抗生物質の点眼前および創傷が閉じるまで最長2覚醒時間ごとに、Celluviscを手術眼に入れる。その日の最終検査時にリフレッシュ防腐剤を含まないゲル潤滑剤を手術眼に入れ、一晩適用範囲を拡大する。これは、創傷が閉じるまで、または本研究者らの意見で、ウサギ対象がスリットランプ検査下で表面炎症を示している(例えば、結膜浮腫、乾燥または不規則な角膜表面)場合まで継続する。
15.HT複合疼痛スコアウサギの文書に従って、活動時間を通して2時間ごとに疼痛を採点する。
16.スリットランプ生体顕微鏡検査(最長7日)で示されるように創傷が治癒するまで、一般検査を1日4回行い、その後、創傷閉鎖後7日間は1日1回、安楽死まで平日1回行う。
−結果
各ウサギの概要
手術1日目、2018年8月20日
ウサギ1−ID#:233665が2018年7月11日に到着した(群1−2の1)。
30%エタノールによる創面切除術
Tx.−バイオインク
結果−中等度の結膜炎症、48時間後に創傷が治癒した。
ウサギ2−ID#:233666が2018年7月11日に到着した(群1−2の2)。
アルコールによる創面切除術
Tx.−対照(抗生物質の点眼剤単独)
結果−重度の結膜炎症および結膜浮腫、病変のサイズが2倍になり、最初は疼痛を管理するのが困難であったが、2日目には大幅に改善された。創傷は48時間後に治癒した。
手術2日目、2018年9月3日
ウサギ3−ID#:239686が2018年8月1日に到着した(群2−5の1)。
穿孔手術
Tx.−バイオインク
結果−中等度の結膜炎症および二次性潰瘍形成、32時間で穿孔が治癒し、52時間で二次性潰瘍が治癒した。
ウサギ4−ID#:239685が2018年8月1日に到着した(群2−5の2)。
穿孔手術
Tx.−バイオインク
結果−中等度の結膜炎症および二次性潰瘍形成、28時間で穿孔が治癒し、48時間で二次性潰瘍が治癒した。
ウサギ5−ID#:239684が2018年8月1日に到着した(群2−5の3)。
穿孔手術
Tx.−対照(シアノアクリレート接着剤)
結果−中等度の結膜炎症および結膜浮腫。ウサギは非常に落ち着かなかったが、適切な疼痛管理戦略が採用されているため、今はそれほど不快ではない。二次性潰瘍の形成は56時間で観察されたが、72時間で現在治癒している。穿孔創傷は80時間で治癒した。
手術3日目、2018年9月4日−5%から0.2%へのポビドンヨード濃度の減少および潤滑点眼剤の添加を行った。
ウサギ6−ID#:239687が2018年8月1日に到着した(群2−5の4)。
穿孔手術
Tx.−バイオインク
結果−8時間で治癒し、合併症はない。最初のブプレノルフィンパッチから追加の鎮痛は必要なかった。
ウサギ7−ID#:239688が2018年8月1日に到着した(群2−5の5)。
穿孔手術
Tx.−対照(シアノアクリレート接着剤)
結果−ウサギは当初、中等度の結膜炎およびシアノアクリレート接着剤の位置に関連しているように見える重症の結膜浮腫を伴う激しい痛みがあった。安楽死を検討したが、投与されたメタドンに反応したようであり、その夜摂食し始めた。今朝(2日目)の検査で、ウサギはうまく疼痛管理されたことでより穏やかに見えた−依然落ち着きはないが苦痛を感じてはいない。創傷は48時間で治癒し、今は穏やかである。
上皮欠損創傷モデル(ウサギ1および2)では、対照ウサギおよび処理ウサギが同時点で創傷治癒を達成した(図20)。処理ウサギは有意に少ない術後鎮痛剤を投与され、全体的な疼痛スコアは対照ウサギが経験したものよりも低かった(図21および22)。疼痛スコアは、過度のまばたき、眼瞼けいれん、眼を擦る、眼瞼けいれん、ならびに眼の流涙および擦りを含む指標の評価に基づいた。
角膜穿孔モデル(ウサギ3、4、および5)では、対照ウサギ(t=80時間)と比較して、処理ウサギ(t=28およびt=32時間)で創傷治癒が有意に速く起こった(図23)。全体として、処理ウサギは、対照ウサギ(図24)と比較して、術後鎮痛剤の投与も少なかった(図25および26)。
改変角膜穿孔モデル(ウサギ6および7)では、創傷治癒は、対照(t=48時間)と比較して、処理ウサギ(t=8時間)で有意に速く起こった(図27)。術後鎮痛剤は処理ウサギに投与されず、記録された疼痛スコアは、対照と比較して処理ウサギで有意に低かった(図28)。
バイオインクは生体適合性があり、角膜創傷の治癒を妨げない。これらの結果は、バイオインクが角膜損傷に伴う疼痛を軽減し、従来の治療選択肢と比較して、角膜穿孔の創傷治癒も加速する可能性があることを示唆している。
実施例10:バイオインクの凍結乾燥および再構成
−方法
●50uLのバイオインク構成成分AおよびBを準備した。
構成成分Aには、DMEM/F12に20%hPL、4mg/mLのフィブリノゲンが含まれ、構成成分BにはDMEM/F12に10U/mLのトロンビンが含まれていた。両構成成分の最終体積は50uLであった。混合すると、バイオインク5と同じ製剤が得られた(表3、予混合濃度:20%hPL、4mg/mlのフィブリノゲン、10U/mLのトロンビン、DEME/F12)。
●試料を−40度で凍結乾燥した(図29A)
●それぞれのチューブにつき50uLの水で数秒以内に再構成した(図29B)
●混合し、接着性の透明なゲルが形成された(図29C)
−結果
視覚的評価は、バイオインクが再構成後2分以内にまだ固化できることを示した。接着性(図29Cの先端に付着している)および透明であることが観察された。(図29C)。

Claims (68)

  1. 0.1〜20mg/mlのフィブリノゲン、2〜20U/mLのトロンビン、および1〜40%(v/v)の血小板溶解物を含む組成物。
  2. イオン、イオン源、アミノ酸、フィブロネクチン、麻酔薬、抗生物質、増殖因子、組織因子XIII、基質タンパク質(例えば、コラーゲン)のうちのいずれか1つまたは複数をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
  3. 前記イオンが、カルシウムイオンを含み、および/または前記増殖因子が、ヒト上皮増殖因子(hEGF)を含む、請求項1または請求項2に記載の組成物。
  4. 前記組成物が、前記イオンおよびアミノ酸を含む培養培地を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
  5. 前記イオンが、前記組成物に含まれるイオン性塩溶液の構成成分である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
  6. 前記組成物が、細胞(例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞)をさらに含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
  7. 前記血小板溶解物が、ヒト血小板溶解物を含む、またはヒト血小板溶解物からなる、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
  8. 前記血小板溶解物が、抗凝固剤(例えば、ヘパリン)を含まない、もしくは実質的に含まない、または10%(v/v)未満、9%(v/v)未満、8%(v/v)未満、7%(v/v)未満、6%(v/v)未満、5%(v/v)未満、4%(v/v)未満、3%(v/v)未満、2%(v/v)未満、1%(v/v)未満、0.5%(v/v)未満の抗凝固剤(例えば、ヘパリン)を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の組成物。
  9. 前記組成物が、
    (i)0.1〜15mg/mlのフィブリノゲン、2〜15U/mLのトロンビン、および5〜40%(v/v)の血小板溶解物、または
    (ii)0.1〜10mg/mlのフィブリノゲン、2〜10U/mLのトロンビン、および10〜35%(v/v)の血小板溶解物、または
    (iii)0.2〜5mg/mlのフィブリノゲン、2〜8U/mLのトロンビン、および15〜30%(v/v)の血小板溶解物、または
    (iv)0.2〜3mg/mlのフィブリノゲン、2〜4U/mLのトロンビン、および15〜25%(v/v)の血小板溶解物を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の組成物。
  10. 前記組成物が、
    (i)1mg/ml未満(例えば、約0.2mg/ml)のフィブリノゲン、2〜20U/ml(例えば、約3U/ml、約5U/ml、約10U/ml)のトロンビン、および5〜40%(v/v)(例えば、約20〜30%(v/v))の血小板溶解物、または
    (ii)1〜4mg/ml(例えば、約2mg/ml)のフィブリノゲン、5〜15U/ml(例えば、約7U/ml、約10U/ml、約12U/ml)のトロンビン、および10〜40%(v/v)(例えば、約15〜30%(v/v))の血小板溶解物、または
    (iii)3〜8mg/ml(例えば、約5mg/ml)のフィブリノゲン、2〜15U/ml(例えば、約4U/ml、約8U/ml、約12U/ml)のトロンビン、および15〜30%(v/v)(例えば、約20〜25%(v/v))の血小板溶解物を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の組成物。
  11. 前記組成物が、
    (i)約0.4mg/ml、約0.8mg/mlもしくは約1mg/mlのフィブリノゲン、および
    約2U/ml、約10U/mlもしくは約20U/mlのトロンビン、および
    約20%(v/v)、約25%(v/v)もしくは約30%(v/v)の血小板溶解物、または
    (ii)約2mg/ml、約4mg/ml、もしくは約8mg/mlのフィブリノゲン、および
    約2U/ml、約10U/mlもしくは約20U/mlのトロンビン、および
    約10%、約15%(v/v)、もしくは約20%(v/v)の血小板溶解物、または
    (iii)約5mg/ml、約10mg/ml、もしくは約15mg/mlのフィブリノゲン、および
    約2U/ml、約10U/mlもしくは約20U/mlのトロンビン、および
    約5%(v/v)、約15%(v/v)、もしくは約25%(v/v)の血小板溶解物を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の組成物。
  12. 前記組成物が、
    (i)少なくとも、約0.4mg/mlのフィブリノゲン、約2ユニット/mLのトロンビン、および約20%(v/v)の血小板溶解物、または
    (ii)少なくとも、約20%(v/v)の血小板溶解物、約4mg/mlのフィブリノゲン、および約10U/mLのトロンビンを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の組成物。
  13. キット、パッケージまたはデバイスであって、
    −フィブリノゲンを含む第1の区画およびトロンビンを含む第2の区画であって、前記キット、パッケージまたはデバイスが、前記フィブリノゲンおよびトロンビンの前記キット、パッケージまたはデバイスへの装填中および装填後に、前記第1の区画の前記フィブリノゲンおよび前記第2の区画の前記トロンビンを分離できるように構成されている、第1の区画および第2の区画と、
    −血小板溶解物と、
    −前記第1の区画の前記フィブリノゲンと前記第2の区画の前記トロンビン、および前記血小板溶解物との混合を促進する手段と、を含む、キット、パッケージまたはデバイス。
  14. 前記血小板溶解物が、前記キット、パッケージまたはデバイスの第3の区画に位置し、前記キット、パッケージまたはデバイスが、前記フィブリノゲン、トロンビンおよび血小板溶解物の前記キット、パッケージまたはデバイスへの装填中および装填後に、前記第1の区画の前記フィブリノゲンおよび前記第2の区画の前記トロンビンから前記第3の区画の前記血小板溶解物を分離できるように構成されている、請求項13に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
  15. 前記第1の区画が、前記フィブリノゲンおよび前記血小板溶解物を含み、前記第2の区画が前記トロンビンを含む、請求項13に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
  16. −いずれかの前記区画が、イオン、イオン源、アミノ酸、フィブロネクチン、麻酔薬、抗生物質、増殖因子(例えば、hEGF)、組織因子XIII、基質タンパク質(例えば、コラーゲン)のうちのいずれか1つもしくは複数をさらに含む、または
    −前記キット、パッケージまたはデバイスが、イオン、イオン源、アミノ酸、フィブロネクチン、麻酔薬、抗生物質、増殖因子(例えば、hEGF)、組織因子XIII、基質タンパク質(例えば、コラーゲン)のうちのいずれか1つもしくは複数を含む追加区画を含み、前記キット、パッケージまたはデバイスが、前記キット、パッケージまたはデバイスの装填中および装填後に、他の区画の内容物から前記追加区画の内容物を分離できるように構成されている、請求項13〜15のいずれか1項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
  17. 前記イオンが、カルシウムイオンである、または
    前記イオン源が、イオン性塩であり、および/またはカルシウムイオンを含む、請求項16に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
  18. 前記手段が、前記キット、パッケージまたはデバイスの外部での前記フィブリノゲン、トロンビンおよび血小板溶解物の混合を促進するように構成されている、請求項13〜17のいずれか1項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
  19. 前記手段が、前記フィブリノゲンの流れと前記トロンビンの別個の流れを集束点に向けることにより、前記混合を促進するように構成され、
    前記流れのうちの少なくとも1つが、前記血小板溶解物を含む、請求項13〜18のいずれか1項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
  20. 前記第1および第2の区画のいずれかもしくは両方、および/または第3の区画が細胞(例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞)を含む、請求項13〜19のいずれか1項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
  21. 前記血小板溶解物が、ヒト血小板溶解物を含む、またはヒト血小板溶解物からなる、請求項13〜20のいずれか1項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
  22. 前記血小板溶解物が、抗凝固剤(例えば、ヘパリン)を含まない、もしくは実質的に含まない、または10%(v/v)未満、9%(v/v)未満、8%(v/v)未満、7%(v/v)未満、6%(v/v)未満、5%(v/v)未満、4%(v/v)未満、3%(v/v)未満、2%(v/v)未満、1%(v/v)未満、0.5%(v/v)未満の抗凝固剤(例えば、ヘパリン)を含む、請求項13〜21のいずれか1項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
  23. (i)前記第1の区画が、0.1〜20mg/mlのフィブリノゲンを含み、前記第2の区画が、1〜40U/mlのトロンビンを含み、前記デバイスが、合計5〜40%(v/v)の血小板溶解物を含む、または
    (ii)前記第1の区画が、0.1〜15mg/mlのフィブリノゲンを含み、前記第2の区画が、1〜30U/mlのトロンビンを含み、前記デバイスが、合計5〜40%(v/v)の血小板溶解物を含む、または
    (iii)前記第1の区画が、0.1〜12mg/mlのフィブリノゲンを含み、前記第2の区画が、1〜25U/mlのトロンビンを含み、前記デバイスが、合計7〜14%(v/v)の血小板溶解物を含む、または
    (iv)前記第1の区画が、0.5〜10mg/mlのフィブリノゲンを含み、前記第2の区画が、1〜10U/mlのトロンビンを含み、前記デバイスが、合計0.5〜20%(v/v)の血小板溶解物を含む、請求項13〜22のいずれか1項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
  24. (i)前記第1の区画が、2mg/ml未満(例えば、約0.8mg/ml)のフィブリノゲンを含み、前記第2の区画が、0.5〜20U/ml(例えば、約1U/ml、約10U/ml、約20U/ml)のトロンビンを含み、前記デバイスが、合計5〜40%(v/v)(例えば、約20%(v/v))の血小板溶解物を含む、または
    (ii)前記第1の区画が、1〜16mg/ml(例えば、約8mg/ml)のフィブリノゲンを含み、前記第2の区画が、0.5〜20U/ml(例えば、約1U/ml、約10U/ml、約20U/ml)のトロンビンを含み、前記デバイスが、合計5〜40%(v/v)(例えば、約20%(v/v))の血小板溶解物を含む、または
    (iii)前記第1の区画が、5〜15mg/ml(例えば、約10mg/ml)を含み、前記第2の区画が、0.5〜20U/ml(例えば、約1U/ml、約10U/ml、約20U/ml)のトロンビンを含み、前記デバイスが、合計5〜40%(v/v)(例えば、約20%(v/v))の血小板溶解物を含む、請求項13〜22のいずれか1項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
  25. (i)前記第1の区画が、0.8mg/mlのフィブリノゲンを含み、
    前記第2の区画が、約2U/ml、約10U/mlもしくは約20U/mlのトロンビンを含み、
    前記デバイスが、合計約20%(v/v)の血小板溶解物を含む、または
    (ii)前記第1の区画が、約8mg/mlのフィブリノゲンを含み、
    前記第2の区画が、約2U/ml、約10U/mlもしくは約20U/mlのトロンビンを含み、
    前記デバイスが、合計約20%(v/v)の血小板溶解物を含む、または
    (iii)前記第1の区画が、約20mg/mlのフィブリノゲンを含み、
    前記第2の区画が、約2U/ml、約10U/mlもしくは約20U/mlのトロンビンを含み、
    前記デバイスが、合計約10%(v/v)の血小板溶解物を含む、請求項13〜22のいずれか1項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
  26. 前記トロンビン、フィブリノゲンおよび血小板溶解物の前記混合から生じる製剤が、
    (i)少なくとも0.2mg/mlのフィブリノゲン、少なくとも1ユニット/mLのトロンビン、および約10%(v/v)の血小板溶解物、または
    (ii)約20%(v/v)の血小板溶解物、約2mg/mLのフィブリノゲン、および約5U/mlのトロンビン、を含む、請求項13〜22のいずれか1項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
  27. 前記第1の区画および前記第2の区画が、前記血小板溶解物を含まない、請求項13〜26のいずれか1項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
  28. 前記第1の区画および前記第2の区画が、等体積、または1%未満、2%未満、3%未満、4%未満、5%未満、10%未満、15%未満、20%未満、25%未満異なる体積の液体製剤である、請求項13〜27のいずれか1項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
  29. 組成物を調製する方法であって、
    (i)
    フィブリノゲンを含む第1の製剤およびトロンビンを含む第2の製剤を提供することであって、前記第1の製剤が、前記第2の製剤と接触していない、提供することと、
    (ii)前記組成物を提供するために前記第1および第2の製剤を血小板溶解物と混合することと、を含む、方法。
  30. 前記混合の前に、前記血小板溶解物が、フィブリノゲンを含む前記第1の製剤と組み合わされ、トロンビンを含む前記第2の製剤とは組み合わされない、請求項29に記載の方法。
  31. 前記混合の前に、前記血小板溶解物が、トロンビンを含む前記第2の製剤と組み合わされない、請求項29に記載の方法。
  32. 前記混合の前に、前記血小板溶解物が、フィブリノゲンを含む前記第1の製剤またはトロンビンを含む前記第2の製剤と組み合わされない、請求項29に記載の方法。
  33. 前記方法が、イオン、イオン源、アミノ酸、フィブロネクチン、麻酔薬、抗生物質、増殖因子(例えば、hEGF)、組織因子XIII、基質タンパク質(例えば、コラーゲン)のうちのいずれか1つまたは複数を、前記第1および第2の製剤ならびに血小板溶解物と混合することをさらに含む、請求項29〜32のいずれか1項に記載の方法。
  34. 前記イオンが、カルシウムイオンである、または
    前記イオン源が、イオン性塩であり、および/またはカルシウムイオンを含む、請求項29〜33のいずれか1項に記載の方法。
  35. 細胞(例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞)を前記第1および第2の製剤と混合することをさらに含む、請求項29〜34のいずれか1項に記載の方法。
  36. 前記血小板溶解物が、ヒト血小板溶解物を含む、またはヒト血小板溶解物からなる、請求項29〜35のいずれか1項に記載の方法。
  37. 前記血小板溶解物が、抗凝固剤(例えば、ヘパリン)を含まない、もしくは実質的に含まない、または10%(v/v)未満、9%(v/v)未満、8%(v/v)未満、7%(v/v)未満、6%(v/v)未満、5%(v/v)未満、4%(v/v)未満、3%(v/v)未満、2%(v/v)未満、1%(v/v)未満、0.5%(v/v)未満の抗凝固剤(例えば、ヘパリン)を含む、請求項29〜36のいずれか1項に記載の方法。
  38. (i)前記第1の製剤が、0.1〜20mg/mlのフィブリノゲンを含み、前記第2の製剤が、1〜40U/mlのトロンビンを含み、前記第1および/もしくは第2の製剤が、合計5〜40%(v/v)の血小板溶解物を含む、または
    (ii)前記第1の製剤が、0.1〜15mg/mlのフィブリノゲンを含み、前記第2の製剤が、1〜30U/mlのトロンビンを含み、前記第1および/もしくは第2の製剤が、合計5〜20%(v/v)の血小板溶解物を含む、または
    (iii)前記第1の製剤が、0.1〜12mg/mlのフィブリノゲンを含み、前記第2の製剤が、1〜25U/mlのトロンビンを含み、前記第1および/もしくは第2の製剤が、合計7〜14%(v/v)の血小板溶解物を含む、または
    (iv)前記第1の製剤が、0.2〜10mg/mlのフィブリノゲンを含み、前記第2の製剤が、2〜20U/mlのトロンビンを含み、前記第1および/もしくは第2の製剤が、合計8〜12%(v/v)の血小板溶解物を含む、請求項29〜37のいずれか1項に記載の方法。
  39. (i)前記第1の製剤が、1mg/ml未満(例えば、約0.4mg/ml)のフィブリノゲンを含み、前記第2の製剤が、0.5〜20U/ml(例えば、約1U/ml、約10U/ml、約20U/ml)のトロンビンを含み、前記第1および/もしくは第2の製剤が、合計5〜40%(v/v)(例えば、約20%(v/v))の血小板溶解物を含む、または
    (ii)前記第1の製剤が、1〜8mg/ml(例えば、約4mg/ml)のフィブリノゲンを含み、前記第2の製剤が、0.5〜20U/ml(例えば、約1U/ml、約10U/ml、約20U/ml)のトロンビンを含み、前記第1および/もしくは第2の製剤が、合計5〜40%(v/v)(例えば、約20%(v/v))の血小板溶解物を含む、または
    (iii)前記第1の製剤が、5〜15mg/ml(例えば、約10mg/ml)を含み、前記第2の製剤が、0.5〜20U/ml(例えば、約1U/ml、約10U/ml、約20U/ml)のトロンビンを含み、前記第1および/もしくは第2の製剤が、合計5〜40%(v/v)(例えば、約20%(v/v))の血小板溶解物を含む、請求項29〜37のいずれか1項に記載の方法。
  40. (i)前記第1の製剤が、約0.4mg/mlのフィブリノゲンを含み、
    前記第2の製剤が、約2U/ml、約10U/mlもしくは約20U/mlのトロンビンを含み、
    前記第1および/または第2の製剤が、合計約10%(v/v)の血小板溶解物を含む、または
    (ii)前記第1の製剤が、約4mg/mlのフィブリノゲンを含み、
    前記第2の製剤が、約2U/ml、約10U/mlもしくは約20U/mlのトロンビンを含み、
    前記第1および/または第2の製剤が、合計約20%(v/v)の血小板溶解物を含む、または
    (iii)前記第1の製剤が、約10mg/mlのフィブリノゲンを含み、
    前記第2の製剤が、約2U/ml、約10U/mlもしくは約20U/mlのトロンビンを含み、
    前記第1および/または第2の製剤が、合計約10%(v/v)の血小板溶解物を含む、請求項29〜37のいずれか1項に記載の方法。
  41. 前記組成物が、
    (i)少なくとも0.2mg/mlのフィブリノゲン、少なくとも1ユニット/mLのトロンビン、および約20%(v/v)の血小板溶解物、または
    (ii)約20%(v/v)の血小板溶解物、約2mg/mLのフィブリノゲン、および約5U/mLのトロンビン、を含む、請求項29〜37のいずれか1項に記載の方法。
  42. 前記第1の製剤および前記第2の製剤が、等体積である、または1%未満、2%未満、3%未満、4%未満、5%未満、10%未満、15%未満、20%未満、25%未満異なる体積である、請求項29〜41のいずれか1項に記載の方法。
  43. 前記第1および第2の製剤ならびに前記血小板溶解物の前記混合が、
    前記フィブリノゲンを含む第1の流れ、前記トロンビンを含む第2の流れ、および任意選択で第3の流れを生成することであって、前記流れが、当初互いに分離している、生成することと、
    前記流れをともに組み合わせることと、を含み、
    前記第1の流れ、前記第2の流れおよび/または前記第3の流れのうちのいずれか1つもしくは複数が、前記血小板溶解物を含む、請求項29〜42のいずれか1項に記載の方法。
  44. 請求項29〜43のいずれか1項に記載の方法により得られたまたは得ることができる組成物。
  45. フィブリノゲン、トロンビンおよび血小板溶解物を含む製剤を対象の組織に適用するための、請求項13〜28のいずれか1項に記載のキット、パッケージまたはデバイスの使用。
  46. 対象の組織を治療する方法であって、請求項1〜12または請求項44のいずれか1項に記載の組成物を前記組織に適用することを含む、方法。
  47. 対象の組織の治療に使用するための、請求項1〜12または請求項44のいずれか1項に記載の組成物。
  48. 対象の組織を治療するための薬剤の調製における、フィブリノゲンを含む第1の製剤、およびトロンビンを含む第2の製剤の使用であって、前記薬剤が、血小板溶解物をさらに含む、使用。
  49. 前記薬剤が、イオン、イオン源、アミノ酸、フィブロネクチン、麻酔薬、抗生物質、増殖因子(例えば、hEGF)、組織因子XIII、基質タンパク質(例えば、コラーゲン)のうちのいずれか1つまたは複数をさらに含む、請求項48に記載の使用。
  50. 前記薬剤が、細胞(例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞)をさらに含む、請求項48または請求項49に記載の使用。
  51. 対象の組織を治療する際に併用するための、フィブリノゲンを含む第1の製剤、トロンビンを含む第2の製剤、および任意選択での第3の製剤であって、前記第1の製剤、前記第2の製剤および/または前記任意選択での第3の製剤のうちのいずれか1つまたは複数が、血小板溶解物を含む、第1の製剤、第2の製剤、および任意選択での第3の製剤。
  52. 前記第1の製剤、前記第2の製剤、および/または前記任意選択での第3の製剤のうちのいずれか1つまたは複数が、イオン、イオン源、アミノ酸、フィブロネクチン、麻酔薬、抗生物質、増殖因子(例えば、hEGF)、組織因子XIII、基質タンパク質(例えば、コラーゲン)のうちのいずれか1つまたは複数を含む、請求項51に記載の製剤。
  53. 前記第1の製剤、前記第2の製剤、および/または前記任意選択での第3の製剤のうちのいずれか1つまたは複数が、細胞(例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞)を含む、請求項51または請求項52に記載の製剤。
  54. 前記イオンが、カルシウムイオンである、または
    前記イオン源が、イオン性塩であり、および/またはカルシウムイオンを含む、請求項49もしくは請求項50に記載の使用、または請求項52〜53に記載の製剤。
  55. 前記血小板溶解物が、ヒト血小板溶解物を含む、またはヒト血小板溶解物からなる、請求項48〜50もしくは請求項54のいずれか1項に記載の使用、または請求項51〜54のいずれか1項に記載の製剤。
  56. 前記血小板溶解物が、抗凝固剤(例えば、ヘパリン)を含まない、もしくは実質的に含まない、または10%(v/v)未満、9%(v/v)未満、8%(v/v)未満、7%(v/v)未満、6%(v/v)未満、5%(v/v)未満、4%(v/v)未満、3%(v/v)未満、2%(v/v)未満、1%(v/v)未満、0.5%(v/v)未満の抗凝固剤(例えば、ヘパリン)を含む、請求項48〜50、54もしくは55のいずれか1項に記載の使用、または請求項51〜55のいずれか1項に記載の製剤。
  57. (i)前記第1の製剤が、0.1〜20mg/mlのフィブリノゲンを含み、前記第2の製剤が、1〜40U/mlのトロンビンを含み、前記薬剤もしくは製剤が、合計5〜40%(v/v)の血小板溶解物を含む、または
    (ii)前記第1の製剤が、0.1〜15mg/mlのフィブリノゲンを含み、前記第2の製剤が、1〜30U/mlのトロンビンを含み、前記薬剤もしくは製剤が、合計5〜15%(v/v)の血小板溶解物を含む、または
    (iii)前記第1の製剤が、0.1〜12mg/mlのフィブリノゲンを含み、前記第2の製剤が、1〜25U/mlのトロンビンを含み、前記薬剤もしくは製剤が、合計7〜14%(v/v)の血小板溶解物を含む、または
    (iv)前記第1の製剤が、0.2〜10mg/mlのフィブリノゲンを含み、前記第2の製剤が、2〜20U/mlのトロンビンを含み、前記薬剤もしくは製剤が、合計8〜12%(v/v)の血小板溶解物を含む、請求項48〜50もしくは54〜56のいずれか1項に記載の使用、または請求項51〜56のいずれか1項に記載の製剤。
  58. (i)前記第1の製剤が、1mg/ml未満(例えば、約0.4mg/ml)のフィブリノゲンを含み、前記第2の製剤が、0.5〜20U/ml(例えば、約1U/ml、約10U/ml、約20U/ml)のトロンビンを含み、前記薬剤もしくは製剤が、合計5〜40%(v/v)(例えば、約20%(v/v))の血小板溶解物を含む、または
    (ii)前記第1の製剤が、1〜8mg/ml(例えば、約4mg/ml)のフィブリノゲンを含み、前記第2の製剤が、0.5〜20U/ml(例えば、約1U/ml、約10U/ml、約20U/ml)のトロンビンを含み、前記薬剤もしくは製剤が、合計5〜40%(v/v)(例えば、約20%(v/v))の血小板溶解物を含む、または
    (iii)前記第1の製剤が、5〜15mg/ml(例えば、約10mg/ml)を含み、前記第2の製剤が、0.5〜20U/ml(例えば、約1U/ml、約10U/ml、約20U/ml)のトロンビンを含み、前記薬剤もしくは製剤が、合計5〜40%(v/v)(例えば、約20%(v/v))の血小板溶解物を含む、請求項48〜50もしくは54〜56のいずれか1項に記載の使用、または請求項51〜56のいずれか1項に記載の製剤。
  59. (i)前記第1の製剤が、約0.4mg/mlのフィブリノゲンを含み、
    前記第2の製剤が、約2U/ml、約10U/mlもしくは約20U/mlのトロンビンを含み、
    前記薬剤もしくは製剤が、合計約20%(v/v)の血小板溶解物を含む、または
    (ii)前記第1の製剤が、約4mg/mlのフィブリノゲンを含み、
    前記第2の製剤が、約2U/ml、約10U/mlもしくは約20U/mlのトロンビンを含み、
    前記薬剤もしくは製剤が、合計約20%(v/v)の血小板溶解物を含む、または
    (iii)前記第1の製剤が、約10mg/mlのフィブリノゲンを含み、
    前記第2の製剤が、約2U/ml、約10U/mlもしくは約20U/mlのトロンビンを含み、
    前記薬剤もしくは製剤が、合計約20%(v/v)の血小板溶解物を含む、請求項48〜50もしくは54〜56のいずれか1項に記載の使用、または請求項51〜56のいずれか1項に記載の製剤。
  60. 前記薬剤または製剤が、
    (i)少なくとも0.2mg/mlのフィブリノゲン、少なくとも1ユニット/mLのトロンビン、および約10%(v/v)の血小板溶解物、または
    (ii)約10%(v/v)の血小板溶解物、約2mg/mLのフィブリノゲン、および約5U/mlのトロンビン、を含む、請求項48〜50もしくは54〜56のいずれか1項に記載の使用、または請求項51〜56のいずれか1項に記載の製剤。
  61. 前記第1の製剤および前記第2の製剤が、等体積である、または1%未満、2%未満、3%未満、4%未満、5%未満、10%未満、15%未満、20%未満、25%未満異なる体積である、請求項48〜50もしくは54〜56のいずれか1項に記載の使用、または請求項46〜51のいずれか1項に記載の製剤。
  62. 前記組織が、眼組織(例えば角膜組織)である、請求項45、48〜50、もしくは54〜61のいずれか1項に記載の使用、請求項51〜61のいずれか1項に記載の製剤、または請求項46に記載の方法、または請求項47に記載の組成物。
  63. 前記組織が創傷を含む、または前記組織が創傷を含む眼組織(例えば、創傷を含む角膜組織)である、請求項45、48〜50、もしくは54〜61のいずれか1項に記載の使用、請求項51〜61のいずれか1項に記載の製剤、または請求項46に記載の方法、または請求項47に記載の組成物。
  64. 前記製剤が、三次元(3D)バイオプリンティングを使用して前記対象の前記組織に適用される、請求項45、または54〜62のいずれか1項に記載の使用。
  65. 三次元(3D)バイオプリンティングを使用して前記対象の前記組織を治療するための薬剤である、請求項48〜50、または54〜62のいずれか1項に記載の使用。
  66. 前記組成物が、三次元(3D)バイオプリンティングを使用して前記組織に適用される、請求項46に記載の方法。
  67. 前記組織の前記治療が、三次元(3D)バイオプリンティングを利用する、請求項47に記載の組成物。
  68. 前記組織の前記治療が、三次元(3D)バイオプリンティングを利用する、請求項51〜62のいずれか1項に記載の製剤。
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