BR112013012280A2

BR112013012280A2 - composto, composição farmacêutica, método de tratamento e método de inibição de uma infecção microbiana

Info

Publication number: BR112013012280A2
Application number: BR112013012280-3A
Authority: BR
Inventors: Vadim Makarov; Stewart Cole
Original assignee: Ecole Polytechnique Federale De Lausanne
Priority date: 2010-11-19
Filing date: 2011-11-21
Publication date: 2020-09-01
Also published as: AU2011330742A1; EP2640712A1; KR101871970B1; IL226289A; CN103221399A; LT2640712T; IL226289A0; GEP201606545B; AU2011330742B2; EA201390639A1; KR101851774B1; UA109557C2; JP6061346B2; ZA201303829B; US8796264B2; US20130245007A1; TR201815010T4; KR20140012956A; BR112013012280B1; CN107011287A

Abstract

  DERIVADOS DE 2-PIPERAZIN-1-IL-4H-1, 3-BENZOTIAZIN-4-ONA E SEUS USOS PARA O TRATAMENTO DE INFECÇÕES EM MAMÍFEROS. A presente invenção refere-se a novos derivados de 2-piperazin-1-il-4H-1,3-benzotiazin-4-ona e seus usos para o tratamento de doenças infecciosas de mamíferos causadas por bactérias, em especial doenças como tuberculose (TB), úlcera de-Buruli e lepra que resultam de_infecção com microbactérias intimamente relacionadas. (I)

Description

COMPOSTO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO DE TRATAMENTO

E MÉTODO DE INIBIÇÃO DE UMA INFECÇÃO MICROBIANA Domínio técnico A presente invenção refere-se a novos derivados de 5 2-piperazin-1-il-4H-1,3-benzotiazin-4-ona e seus usos para o tratamento terapêutico e/ou profilático de doenças infecciosas de mamíferos causadas por bactérias, em especial doenças como tuberculose (TB), úlcera de Buruli e lepra que resultam de infecção com micobactérias intimamente relacionadas. Antecedentes da invenção Micobactérias têm prejudicado a humanidade há vários milênios, causando doenças importantes como a tuberculose (TB), a lepra e úlcera de Buruli. Em termos de responsabilidade de doença e mortalidade, TB é incontestavelmente a ameaça mais importante e desafiadora para a saúde humana, em parte por causa do aumento da prevalência da resistência primária aos fármacos atuais. Assim, há uma necessidade crescente de novos compostos com um novo mecanismo de ação (Balganesh, T.S., P.M. Alzari e S. Cole. Trends Pharmacol Sci, 2008. 29(11): p. 578-81.) e estes também podem encontrar aplicação no tratamento de outras doenças micobacterianas. A lepra está em fase de eliminação como um problema de saúde pública (Britton, W.J. e D.N. Lockwood. Lancet, 2004. 363(9418): p. 1209-19), graças a medidas de controle implementadas pela Organização Mundial de saúde, enquanto que a doença emergente, úlcera de Buruli, é motivo de crescente preocupação (Demangel, C, T, Stinear e ST, Cole. Nat Rev Microbiol, 2009. 7(1):p. 50-60). Nos últimos vinte anos, a tuberculose resistente a fármaco assumiu novas dimensões alarmantes. De preocupação na década de 1990 era a forma resistente a múltiplos fármacos (MDR), onde a Mycobacterium tuberculosis adquiriu resistência aos principais fármacos de primeira escolha isoniazida e a rifampicina. Há uma estimativa de 500.000 casos de MDR-TB em todo o mundo, dos quais 70.000 ocorrem na Europa (Zignol, M. et al.

J Infect Dis, 2006. 194: 479-485; Fears, R., S, Kaufmann, V.

Ter Meulen & A.

Zumla.

Tuberculosis (Edinb) 2010. 90: 182-187). 5 Na última década, as cepas MDR de M. tuberculosis adquiriram mutações de resistência adicionais os fármacos de segunda linha, dando origem a uma extensão de doenças resistentes a fármacos (XDR). Além da isoniazida e rifampicina, cepas XDR de M. tuberculosis também são resistentes a fluoroquinolonas e aos aminoglicosídeos injetáveis (Jassal, M. & W.

R.

Bishai.

Lancet Infect Dis 2009. 9: 19-30). Mais de 50 países têm agora reportado XDR-TB, assim, destacando a necessidade e a importância de encontrar novos fármacos para tratar TB resistente a fármaco e sensível a fármaco.

Além de um novo mecanismo de ação, outras características desejáveis de um novo fármaco contra TB incluem alta potência, de modo que a duração do tratamento possa ser reduzida; alta especificidade, para evitar efeitos colaterais indesejados, incluindo a destruição da flora intestinal; e administração oral. 1,3-benzotiazino-4-onas 2-amino substituído pode ser usado como fármacos para o tratamento de doenças micobacterianas em seres humanos e mamíferos.

O composto mais ativo disponível até o momento é 2-[(2S)-2-metil-1,4-dioxa-8-azaspiro[4,5]dec-8-il]-8-nitro- 6-trifluormetil)-4H-1,3-benzotiazin-4-ona (BTZ043) (V.

Makarov et al.

Science, 2009, 324, 801; M.R.

Pasca, et al.

Antimicro b.

Agents Chemother., 2010, 54, 1616). 1,3-benzotiazino-4-onas 2-amino substituídas específicas são divulgadas, por exemplo, em WO 2007/134625 e WO 2009/010163. Em vista deste contexto, é altamente desejável produzir novas 1,3-benzotiazino-4-onas 2-piperazino substituídas que não tenham apenas alta atividade contra micobactérias, mas também exibam melhores propriedades como fármaco do que as 1,3-benzotiazino-4-onas anteriormente descritas. A presente invenção descreve uma nova geração de 1,3-benzotiazino-4-onas 5 com atividade contra micobactérias, como potenciais novos fármacos contra TB onde a substituição 2-amino é representada por piperazinas N-substituídas. Resumo da invenção A presente invenção refere-se a um composto de fórmula (1) R3 R1 N

S N (R4)n

N R2

O (1) em que R é NO2, NH2, NHOR4, COOR4, CONR5R6, ou CHO; R2 é halogênio, SO2NR5R6, alcóxi inferior, COOR4, CONR5R6, CHO, OCF3 ou mono, di ou trifluormetila; R3 é uma alquila saturada ou insaturada, halogenada ou não halogenada, linear, ramificada ou cíclica, com de 3 a 12 átomos de carbono, onde opcionalmente um ou dois grupos metileno quando presentes são substituídos por, O, S ou NR4, ou

Y Q

X Z em que X é um radical alifático saturado ou insaturado, linear ou ramificado com de 1 a 6 átomos de carbono; Y é O, S ou NR4; Z é uma ligação direta, radicais alifáticos lineares ou ramificados tendo de 1 a 3 átomos de carbono;

Q é fenila, naftila, piridila, quinolila, pirazinila, pirimidila, pirazolila, triazinila, imidazolila, furanil ou tienil e, opcionalmente, onde de um a três átomos de hidrogênio são substituídos por um grupo R7; 5 R4 é H ou alquila C1-3; n = 0, 1, 2, 3 ou 4 R5 e R6 são, independentemente entre si, selecionados de H, alquila C1-4, O-alquila C1-4, halogênio, COOR5, CONR6R7, OCF3, CF3 ou CN; O grupo R7 é halogênio, radical alifático saturado ou insaturado, linear ou ramificado, com de 1 a 3 átomos de carbono, SO2NR5R6, alcóxi inferior, COOR4, CONR5R6, CHO, OCF3, mono, di ou trifluormetila ou fenila, e/ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

É também divulgada uma composição farmacêutica que compreende um composto de fórmula (1) da invenção e/ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

É também divulgado um composto de fórmula (1) e/ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo para uso em um tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença.

É ainda divulgada uma composição farmacêutica que compreende um composto de fórmula (1) e/ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo para uso em um tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença.

A invenção fornece ainda um método de tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença em um paciente em necessidade disso causada por uma infecção microbiana, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto ou de uma composição farmacêutica.

É ainda divulgado um método de inibir uma infecção microbiana que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto ou de uma composição farmacêutica.

Descrição da figura

A figura 1 representa um diagrama e resultados estatísticos mostrando o efeito dos compostos 2 e 8 na redução da carga de UFC nos pulmões e baços em relação ao tratamento com BTZ043 em um modelo murino de TB crônica.

D0, carga de UFC 5 no início do tratamento; NT, animais não tratados no dia 28; ΙΝH indica isoniazida; 43-BTZ043; 169 = PBTZ169 indica o composto 2; 134=PBTZ134 indica o composto 8, os valores indicados na figura 1 estão tabelados abaixo.

Pulmão Pulmão Valor de P (test t) Diferen.

Signif. (p<0,05) 43 vs 169 0,0061 Sim 43 vs 134 0,1036 Não INH vs 43 0,0098 Sim INH vs 169 0,2528 Não INH vs 134 0,7732 Não Baço Baço Valor de P (test t) Diferen.

Signif. (p<0,05) 43 vs 169 0,0078 Sim 43 vs 134 0,0199 Sim INH vs 43 0,0329 Sim INH vs 169 0,0082 Sim INH vs 134 0,1997 Não Descrição detalhada da invenção Uma das desvantagens dos previamente descritos derivados de 1,3-benzotiazino-4-ona 2-amino substituídos era a sua baixa solubilidade em água, o que limita a sua absorção no estômago e intestino.

Muitos esforços para tornar esses compostos mais solúveis em água foram realizados, por exemplo, pela adição de uma porção hidrofílica aos derivados de 1,3-benzotiazino-4-ona, mas estes compostos tinham atividade antimicobacteriana muito baixa.

Assim, por um lado, é melhor ter um composto mais solúvel em água com a parte hidrofílica e, por outro lado, este composto deve reter a lipofilicidade para ser capaz de atravessar a parede celular micobacteriana hidrofóbica. Estes problemas foram resolvidos na presente invenção fornecendo compostos onde uma pequena porção hidrofílica (piperazin) é "escondida" entre duas outras grandes porções, uma das quais sendo 1,3-benzotiazino-4-ona.

Porção lipofílica lipophylic moiety

N S N R N

O Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece compostos de Fórmula 1 R3 R1 N

S N (R4)n

N R2

O (1) em que R1 é NO2, NH2, NHOR4, COOR4, CONR5R6 ou CHO; R2 é halogênio, SO2NR5R6, alcóxi inferior, COOR4, CONR5R6, CHO, OCF3 ou mono, di ou trifluormetila; 3 R é uma alquila saturada ou insaturada, halogenada ou não halogenada, linear, ramificada ou cíclica, com de 3 a 12 átomos de carbono, onde opcionalmente um ou dois grupos metileno quando presentes são substituídos por, O, S ou NR4, ou

Y Q

X Z em que X é um radical alifático saturado ou insaturado, linear ou ramificado, com de 1 a 6 átomos de carbono; Y é O, S ou NR4; 5 Z é uma ligação direta, radicais alifáticos lineares ou ramificados com de 1 a 3 átomos de carbono; Q é fenila, naftila, piridila, quinolila, pirazinila, pirimidila, pirazolila, triazinila, imidazolila, furanil ou tienil e, opcionalmente, onde de um a três átomos de hidrogênio são substituídos por um grupo R7; R4 é H ou alquila C1-3; n = 0, 1, 2, 3 ou 4 R5 e R6 são, independentemente entre si, selecionados de H, alquila C1-4, O-alquila C1-4, halogênio, COOR5, CONR6R7, OCF3, CF3 ou CN; o grupo R7 é halogênio, radical alifático saturado ou insaturado, linear ou ramificado, com de 1 a 3 átomos de carbono, SO2NR5R6, alcóxi inferior, COOR4, CONR5R6, CHO, OCF3, mono, di ou trifluormetila ou fenila, e/ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

O termo "compreende" ou "compreendendo" geralmente é usado no sentido de incluir/incluindo, ou seja, permitir a presença de uma ou mais características ou componentes.

Além disso, o termo "compreendendo" compreende também o termo "consistindo". Conforme usado no relatório descritivo e nas reivindicações, a forma singular "um", "uma" e "o/a" inclui referências no plural, a menos que o contexto claramente especifique de outra forma.

Para uso na presente invenção, "pelo menos um" representa "um ou mais." Em uma modalidade preferencial, a invenção diz respeito aos compostos de fórmula (1) selecionados do grupo consistindo em

2-(4-R3-piperazin-1-il)-8-nitro-6-(trifluormetil)-4H-1,3- benzotiazin-4-ona, 2-(4-R3-piperazin-1-il)-8-nitro-6-R2-4H-1,3-benzotiazin-4- ona, 2-(4-R3-piperazin-1-il)-8-R1-6-(trifluormetil)-4H-1,3- benzotiazin-4-ona, 2-[4-(ciclo-hexilmetil)piperazin-1-il]-8-R1-6- (trifluormetil)-4H-1,3-benzotiazin-4-ona, 2-[4-(ciclo-hexilmetil)piperazin-1-il]-8-nitro-6-R2-4H-1,3- benzotiazin-4-ona, 2-{4-[2-(4-halogenfenóxi)etil]piperazin-1-il}-8-nitro-6- (trifluormetil)-4H-1,3-benzotiazin-4-ona, 2-{4-[2-(3-halogenfenóxi)etil]piperazin-1-il}-8-nitro-6- (trifluormetil)-4H-1,3-benzotiazin-4-ona, 2-{4-[3-(4-halogenfenoxi)propil]piperazin-1-il}-8-nitro-6- (trifluormetil)-4H-1,3-benzotiazin-4-ona, 2-{4-[3-(3-halogenfenoxi)propil]piperazin-1-il}-8-nitro-6- (trifluormetil)-4H-1,3-benzotiazin-4-ona, 2-(4-{2-[(4-halogenbenzil)óxi]etil}piperazin-1-il)-8-nitro- 6-(trifluormetil)-4H-1,3-benzotiazin-4-ona, em que R1, R2 e R3 têm os significados acima.

A presente invenção refere-se ainda mais particularmente com pelo menos um composto selecionado do grupo consistindo em 2-(4-hexilpiperazin-1-il)-8-nitro-6-(trifluormetil)-4H-1,3- benzotiazin-4-ona, 2-(4-heptilpiperazin-1-il)-8-nitro-6-(trifluormetil)-4H-1,3 -benzotiazin-4-ona, 2-[4-(ciclohexilmetil)piperazin-1-il]-8-nitro-6- (trifluormetil)-4H-1,3-benzotiazin-4-ona, 2-[4-(2-ciclo-hexiletil)piperazin-1-il]-8-nitro-6- (trifluormetil)-4H-1,3-benzotiazin-4-ona, 2-(4-butilpiperazin-1-il)-8-nitro-6-(trifluormetil)-4H-1,3- benzotiazin-4-ona,

2-[4-(3-metilbutil)piperazin-1-il]-8-nitro-6-(trifluormetil) -4H-1,3-benzotiazin-4-ona, 2-[4-(2-metilbutil)piperazin-1-il]-8-nitro-6-(trifluormetil) -4H-1,3-benzotiazin-4-ona, 2-[4-(2-etoxietil)piperazin-1-il]-8-nitro-6-(trifluormetil) -4H-1,3-benzotiazin-4-ona, 2-{4-[2-(benzilóxi)etil]piperazin-1-il}-8-nitro-6- (trifluormetil)-4H-1,3-benzotiazin-4-ona, 2-{4-[3-(4-fluorfenóxi)propil]piperazin-1-il}-8-nitro-6- (trifluormetil)-4H-1,3-benzotiazin-4-ona.

Além disso, a presente invenção refere-se aos sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos de fórmula (1), por exemplo, cloridrato, sulfato, acetato, trifluoracefato, maleato, fumarato, etc.

Os compostos com a fórmula (1) podem ser sintetizados por um dos métodos a seguir descritos na técnica anterior.

Estes métodos incluem: 1) a reação de sais de tiocianato com 2-clorobenzilcloroanidrido, e o subsequente tratamento da massa reacional com a amina correspondente (consulte, por exemplo, Coll.

Czech.

Chem.

Common., 1982, 47, 3268-3282; Coll.

Czech.

Chem, Commun., 1983, 48, 3315-3328; Coil.

Czech.

Chem.

Commun., 1983, 48, 3427-3432); 2) a reação de condensação dos ácidos 6-mercaptobenzoicos 3,4-dissubstituídos com uma cianamida adequada (consulte a U.S. 3.522.247); 3) a conversão de uma 2-halogen-4H-1,3-benzotiazin-4-ona com uma amina adequada (consulte a U.S. 3.470.168). 4) dois métodos para a preparação de 1,3-benzotiazino-4-onas 2-amino substituídas são descritos em WO 2007/134625 e WO 2009/010163, que divulgam os seguintes processos:

R1 Cl R2 CONH2 Excesso de excess NaSC(S)NR3R4 NaSC(S)NR3R4 NaSC(S)NR3R4

S R1 R1 S NR3R4 S NR3R4

N R2 CONH2 R2

O 5) O processo apresentado em WO 2009/01063 é: R1 R1 Cl S OAlk KSC(S)OAlk

N R2 CONH2 R2

O R1 HNR3R4 S NR3R4

N R2

O 5 6) um processo de preparação de derivados de 2-amino-1,3-benzotiazin-4-ona recém-descobertos e muito úteis que inclui a síntese inicial de 2-alquilmercapto-4H-1,3-benzotiazin-4-ona e sua posterior condensação com o correspondente derivado de piperazin

R1 CS2 R1 R1 NR3 NaOH S piperazine SAlk Derivado de S N Cl DMSO derivative piperazina (R4) NH2 N N R2 R2 R2

O O O Todos os seis métodos descritos acima podem ser usados para a síntese dos compostos de fórmula (1). De preferência, o método 6 é usado. 5 Os compostos de fórmula (1) podem ser facilmente convertidos em sais farmaceuticamente aceitáveis solúveis em água, por exemplo, cloridrato, sulfato ou acetato, pelo tratamento do ácido correspondente em um solvente apropriado conhecido na técnica. Os compostos de fórmula (1) da invenção foram testados quanto à mutagenicidade potencial usando o SOS-chromotest (P. Quillardet, O. Huisman, R. D'Ari, M. Hofnung, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 1982, 79, 5971-5;) e verificou-se que eles eram não mutagênicos a 25-50 µg por mancha e negativos a 5 µg/mL no teste AMES na cepa de Salmonella typhimurium TA98, TA100 e TA1535 (D.M. Maron e B.N. Ames, Mutation Res., 1983, 113, 173-215). O alvo principal para BTZ043 em micobactérias é a enzima essencial decaprenilfosforil-β-D-ribose 2'-epimerase e cepas resistentes a BTZ de mutações sem sentido no gene correspondente, dprE1. A resistência cruzada aos compostos selecionados de fórmula (1) foi observada quando mutantes resistentes ao BTZ de BCG de Mycobacterium smegmatis ou Mycobacterium bovis (Makarov, V. et al. Science 2009. 324: 801-804) foram testados quanto à suscetibilidade a tais compostos, indicando deste modo que 1,3-benzotiazino-4-onas 2-piperazino substituídos compartilham o mesmo alvo que 1,3-benzotiazino-4-onas. Um segundo mecanismo de resistência a BTZ043 foi descrito em Mycobacterium smegmatis devido à superprodução de NfnB nitroredutase (Manina, G., et al.

Mol Microbiol 2010. epub 14 de julho de 2010). Quando o mutante superprodutor de NfnB MN39 foi testado quanto à suscetibilidade das 1,3-benzotiazino-4-onas 2-piperazino substituídas 5 selecionadas, verificou-se que o MIC era similar ao da cepa de origem tipo selvagem.

Por outro lado, MN39 apresentou um aumento de 6 vezes em MIC para BTZ043. Isto sugere que as 1,3-benzotiazino-4-onas piperazino substituídas podem ser menos propensas à nitrorredução de fontes indesejáveis do que os derivados de 1,3-benzotiazino-4-onas.

A fim de comparar a citotoxicidade relativa de 1,3-benzotiazino-4-onas piperazino substituídas selecionados com a de BTZ043, a IC90 foi determinada utilizando duas diferentes linhagens celulares humanas.

Ambas as séries de compostos exibiram IC90 na faixa de 12,5 a 100 µg/mL contra a linhagem celular de pneumócito A549, conforme medido pelo ensaio de redução de resazurina.

Usando o mesmo método, a IC90 era na faixa de 6,25 a 12,5 µg/mL contra a linhagem celular de hepatoma humano Huh7. Em um segundo aspecto da invenção, os compostos de fórmula (1) e/ou seus os sais farmaceuticamente aceitáveis são úteis para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, em particular para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença causada por uma infecção microbiana, mais particularmente para o tratamento terapêutico e/ou profilático da tuberculose e outras infecções micobacterianas, ou mesmo para outras infecções actinobacterianas como difteria, em seres humanos e em animais.

Surpreendentemente, os inventores mostraram que compostos selecionados da invenção são terapeuticamente ativos no modelo murino de TB crônica, conforme determinado pelo nível de redução de unidades formadores de colônias nos pulmões e baços.

A atividade de certos compostos é superior à do fármaco

TB principal, INH, que foi usado como controle positivo.

Além disso, conforme mostrado no exemplo 24, alguns do novos derivados piperazino de 1,3-benzotiazino-4-onas são significativamente mais ativos neste modelo do que as 5 2-amino-1,3-benzotiazino-4-onas, como exemplificado por BTZ043. Os compostos da invenção são não tóxicos após a administração via oral de doses variando até 2000 mg/Kg.

O composto foi bem tolerado pelos animais nas primeiras 24 horas após a introdução.

Durante 7 dias de investigações, os compostos (2) e (18) não causaram alterações no estado geral e comportamento dos camundongos, e nem afetou a atividade motora e reflexa, ciclos ativos e calmos, aparência ou consumo de alimentos.

Não houve casos de morte de animais.

A LD50 para os compostos (2) e (18) é > 2000 mg/Kg.

Em uma modalidade, o composto da invenção e/ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos são úteis para o tratamento e/ou tratamento profilático de uma doença.

Preferencialmente, a doença é selecionada do grupo consistindo em tuberculose, lepra ou úlcera de Buruli.

Geralmente, a infecção microbiana é causada por uma bactéria que pertence ao gênero Corynebacterium ou Nocardia ou Mycobacterium.

Nocardia asteroides é a espécie de Nocardia que infecta seres humanos com mais frequência, e a maioria dos casos ocorre como uma infecção oportunista em pacientes imunocomprometidos.

Outras espécies de interesse médico são N. brasiliensis e N. caviae.

A forma mais comum de doença nocardial humana é uma pneumonia lentamente progressiva.

O gênero Corynebacterium contém os bastões bacterianos responsáveis pela difteria.

Mycobacterium é um gênero de Actinobacteria, dada a sua própria família, a Mycobacteriaceae.

O gênero inclui patógenos conhecidos por causar doenças graves nos mamíferos, incluindo tuberculose (Mycobacterium tuberculosis) e lepra (Mycobacterium leprae). Nesse sentido, o segundo aspecto da invenção diz respeito 5 às composições farmacêuticas que compreendem um composto de fórmula (1) e/ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende ainda um veículo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

Excipientes farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica farmacêutica e são descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences, 15ª Ed., Mack Publishing Co., Nova Jérsei (1991). O excipiente farmacêutico pode ser selecionado em relação à via de administração intencionada e à prática farmacêutica padrão.

O excipiente deve ser aceitável no sentido de não ser nocivo ao seu receptor.

Conforme utilizado na presente invenção, o termo “veículo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável” refere-se, por exemplo, aos veículos, diluentes, solventes como álcoois mono-hídricos como etanol, isopropanol e álcoois poli-hídricos como glicóis e óleos comestíveis, como óleo de soja, óleo de coco, óleo de oliva, óleo de açafrão, óleo de semente de algodão, ésteres oleosos como oleato de etila, miristato de isopropila, aglutinantes, adjuvantes, solubilizantes, agentes espessantes, estabilizantes, desintegrantes, deslizantes, agentes lubrificantes, agentes tamponantes, emulsionantes, agentes umectantes, agentes de suspensão, agentes adoçantes, corantes, flavorizantes, agentes de revestimento, conservantes, antioxidantes, agentes de processamento, modificadores de liberação de fármaco e intensificadores como fosfato de cálcio, estearato de magnésio, talco, monossacarídeos, dissacarídeos, amido, gelatina, celulose, metilcelulose, carboximetilcelulose sódica, dextrose, hidroxipropil-β-ciclodextrina, polivinilpirrolidona, ceras com baixo ponto de fusão e resinas de troca iônica.

Em um terceiro aspecto, a invenção refere-se a um método de tratamento de uma doença causada por uma infecção microbiana, que compreende administrar uma quantidade 5 terapeuticamente eficaz de um composto de fórmula (1) e/ou os sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo ou uma composição farmacêutica para um paciente necessitado disso.

Conforme utilizado na presente invenção, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" é uma quantidade eficaz para melhorar ou prevenir os sintomas.

O termo "paciente que necessita disto" refere-se a um paciente que precisa de um tratamento de uma doença causada por uma infecção microbiana.

Em um aspecto da invenção, “um paciente que necessita disto” refere-se a qualquer paciente que possa ter, ou que esteja em risco de ter uma infecção microbiana.

Preferencialmente, o paciente que necessita disto refere-se a um animal, mais preferencialmente, a um mamífero, e ainda mais preferencialmente a um ser humano. "Administração", como se aplica na presente invenção, refere-se ao contato de um composto de fórmula (1) e/ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis ou uma composição farmacêutica geralmente sob a forma de uma quantidade terapeuticamente eficaz, com o paciente que necessita disto, preferencialmente um animal, mais preferencialmente um mamífero, e ainda mais preferencialmente, um ser humano.

Os compostos da invenção são formulados para uso pelo preparo de uma solução diluída ou suspensão em meio aquoso, orgânico ou aquoso-orgânico farmaceuticamente aceitável para administração tópica ou parenteral por injeção intravenosa, subcutânea ou intramuscular, ou para aplicação intranasal; ou são preparados em uma forma de comprimido, cápsula ou suspensão aquosa com excipientes convencionais para administração oral, ou como supositórios.

Os compostos desta invenção podem ser administrados sozinhos ou em combinação com veículos farmaceuticamente aceitáveis, por meio de, seja, mas sem se limitar, um ou mais de: oral (por exemplo, como um comprimido, cápsula, ou como uma 5 solução ingerível), tópica, pela mucosa (por exemplo, como um spray nasal ou aerossol para inalação), nasal, parenteral (por exemplo, por uma forma injetável), gastrointestinal, intraespinal, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, intrauterina, intraocular, intradérmica, intracraniana, intratraqueal, intravaginal, intracerebroventricuiar, intracerebral, subcutânea, oftálmica (incluindo intravítrea ou intracâmera), transdérmica, retal, bucal, eperidural e sublingual.

Mais particularmente, os novos compostos da invenção podem ser administrados em uma ampla variedade de diferentes formas de dosagem, ou seja, eles podem ser combinados com vários veículos inertes farmaceuticamente aceitáveis sob a forma de comprimidos, cápsulas, pastilhas, trociscos, balas duras, pós, sprays, cremes, pomadas, supositórios, geleias, pastas, loções, unguentos, suspensões aquosas, soluções injetáveis, elixires, xaropes e similares.

Tais veículos incluem diluentes sólidos ou enchimentos, meios aquosos estéreis e vários solventes orgânicos não tóxicos, etc.

Além disso, composições farmacêuticas orais podem ser convenientemente adoçadas e/ou flavorizadas.

A invenção refere-se ainda a um composto de fórmula (1) e/ou aos sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos para uso em um método para o tratamento ou profilaxia de infecções bacterianas nos mamíferos.

Compostos preferenciais de fórmula (1) e/ou os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos para uso em tal método são especificamente listados acima neste documento.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método de inibição de uma infecção microbiana, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de fórmula (1) e/ou os sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo ou uma composição farmacêutica que compreende um composto de 5 fórmula (1) e/ou seus os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. Os compostos de fórmula (1) da invenção podem ser usados em um método de inibição de uma infecção microbiana, uma vez que eles exibem uma forte atividade antibacteriana, especialmente contra micobactérias com concentrações inibitórias mínimas (MIC) na faixa de ~ 0,19 - 15 ng/mL para M. tuberculosis H37Rv. Surpreendentemente, os inventores verificaram que os compostos da invenção demonstram um alto nível de seletividade para micobactérias e actinobactérias relacionadas, o que reduz o potencial para efeitos colaterais adversos. Resultados típicos determinados de acordo com o método de redução de resazurina (J.C. Palomino, A, Martin, M. Camacho, H. Guerra, J. Swings, F. Portaels, Antimicrob, Agents Chemother., 2002, 48, 2720-2) são dados no exemplo 22. Os compostos podem ser usados em doses de 0,001 a 1000 mg/Kg de peso corporal. Os exemplos que se seguem na parte experimental subsequente servem para ilustrar a invenção, mas não devem ser interpretados como uma limitação da mesma. As estruturas dos compostos da invenção foram estabelecidos pelos modos de síntese e de análise elementar, e por ressonância magnética nuclear e espectros de massa.

EXEMPLOS Produtos químicos e solventes foram comprados de Alfa-Aesar (GB) ou de Aldrich Co (Sigma-Aldrich Company, St-Louis, EUA). Eles foram usados sem purificação adicional. Os pontos de fusão foram determinados de acordo com o procedimento da BP e são não corrigidos (Electrothermal 9001, GB). Se as análises são indicados apenas pelos símbolos dos elementos, os resultados analíticos estão dentro do intervalo de ± 0,3% dos valores teóricos (Carlo Erba 5500, Itália). Os espectros de RMN foram determinados com uma Varian Unity Plus 300 (EUA). Os deslocamentos para RMN 1H são relatados em ppm após o TMS (δ). Os espectros de massa foram obtidos utilizando um instrumento SSQ-700 Finnigan (EUA) com injeção direta. As reações e pureza dos compostos foram controlados por CCF usando folhas de alumínio de sílica gel 60 F254 (Merck Co., Alemanha). Exemplo 1 2-(4-ciclo-hexilpiperazin-1-il)-8-nitro-6-(trifluormetil)- 4H-1,3-benzotiazin-4-ona (composto 1) NO2 N

S N

N F3 C

O Hidróxido de sódio (0,9 g; pó) foi dissolvido em 10 mL de DMSO e 2,1 mL de dissulfeto de carbono foi adicionado a uma temperatura de 10 a 15°C. 3,0 g de 2-cloro-3-nitro-5-trifluormetilbenzamida foi adicionado à solução em pequenas porções a uma temperatura de 10°C. Após 15 minutos, 0,7 mL de Mel foi adicionado a uma temperatura de 10 a 20°C. A reação foi continuada durante 30 min, e posteriormente 100 mL de água foi adicionado. O sólido amarelo resultante de 2-metiltio-8-nitro-8-trifluormetil-4H-1,3-benzotiazin-4-ona foi separado por filtração.

Rendimento: 47 % pf: 200 a 203ºC (acetato de etila) MS (m/z): 322 (M+) RMN 1H (DMSO-d6): δ = 8,95 e 8,81 (dois 1Н, dois s, 2СН), 5 2,73 (3h, s, СН3) ppm Anal. para C10H5F3N2O3S2: Calc.: C, 37,28; H, 1,56; N, 8,69; S, 19,90 Encontrado: C, 37,21; H, 1,54; N, 8,64; S, 20,03 Uma suspensão de 3,0 g de 2-metiltio-8-nitro-6-trifluormetil-4H-1,3-benzotiazin-4-ona em 15 mL de etanol foi tratada com 1,5 g de 4-ciclo-hexilpiperazina em temperatura ambiente.

A mistura reacional foi aquecida a 50-60ºC durante 20 minutos.

Após o resfriamento, 100 mL de água foi adicionado.

O sólido amarelo claro resultante 2-(4-ciclo-hexilpiperazin-1-il)-8-nitro-6-(trifluormetil)-4 H-1,3-benzotiazin-4-ona foi separado por filtração.

Rendimento: 74 % pf: 189-191ºC (etanol). MS (m/z): 442 (M+) RMN 1H (DMSO-d6): δ = 8,87 e 8,76 (dois 1Н, dois s, 2СН), 3,89 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,66 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,32 (1H, m largo, 1CH), 1,79, 1,58 e 1,20 (10H, 3 m largo, C5H10) ppm Anal. para C19H21F3N4O3S: Calc.: C, 51,58; H, 4,78; N, 12,66 Encontrado: C, 51,56; H, 4,72; N, 12,81 Exemplo 2

NO2 N

S N

N F3 C 5 O 2-[4-(ciclo-hexilmetil)piperazin-1-il]-8-nitro-6- (trifluormetil)-4H-1,3-benzotiazin-4-ona (composto 2) O composto 2 foi preparado da mesma maneira como no Exemplo 1, mas usando 4-(ciclo-hexilmetil)piperazina como amina, e um sólido cristalino amarelo foi obtido. Rendimento: 71 % pf: 184-186ºC (etanol) MS (m/z): 456 (M+) RMN 1H (DMSO-d6): δδ = 8,86 e 8,76 (dois 1Н, dois s, 2СН), 3,91 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,51 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,13 (2H, d, CH2), 1,53 (1H, m largo, 1CH), 1,70, 1,20 e 0,85 (10H, 3 m largo, C5H10) ppm Anal. para C20H23F3N4O3S: Calc.: C, 52,62; H, 5,08; N, 12,27 Encontrado: C, 52,60; H, 5,01; N, 12,34 Exemplo 3 2-(4-butilpiperazin-1-il)-8-nitro-6-(trifluormetil)-4H -1,3-benzotiazin-4-ona (composto 3) NO2 N CH3

S N

N F3C

O O composto 3 foi preparado da mesma maneira como no exemplo 1, porém usando 4-butilpiperazina como a amina, e um sólido cristalino amarelo foi obtido.

Rendimento: 69 % pf: 119-120ºC (n-hexano) MS (m/z): 416 (M+) RMN 1H (DMSO-d6): δδ = 8,85 e 8,76 (dois 1Н, dois s, 2СН), 5 3,90 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,51 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,32 (2H, t, CH2), 1,46 e 1,33 (4H, 2 m, 2CH2), 0,91 (3H, t, CH3) ppm Anal. para C17H19F3N4O3S: Calc.: C, 49,03; H, 4,60; N, 13,45 Encontrado: C, 48,94; H, 4,67; N, 13,38 Exemplo 4 2-(4-isobutilpiperazin-1-il)-8-nitro-6-(trifluormetil)-4H- 1,3-benzotiazin-4-ona (composto 4)

CH NO2 N S N CH3

N F3 C

O O composto 4 foi preparado da mesma maneira como no exemplo 1, porém usando 4-isobutilpiperazina como a amina, e um sólido cristalino amarelo foi obtido. Rendimento: 77 % pf: 150-153ºC (etanol) MS (m/z): 416 (M+) RMN 1H (DMSO-d6): δ = 8,85 e 8,76 (dois 1Н, dois s, 2СН), 3,90 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,50 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,11 (2H, d, CH2), 1,79 (1H, m, CH), 0,88 (6H, d, 2CH3) ppm Anal. para C17H19F3N4O3S: Calc.: C, 49,03; H, 4,60; N, 13,45 Encontrado: C, 49,12; H, 4,63; N, 13,43 Exemplo 5 2-(4-sec-butilpiperazin-1-il)-8-nitro-6-(trifluormetil)-4H- 1,3-benzotiazin-4-ona (composto 5)

CH3 CH3 NO2 N

S N 5 N F3 C

O O composto 5 foi preparado da mesma maneira como no exemplo 1, porém usando 4-sec-butilpiperazina como a amina, e um sólido cristalino amarelo foi obtido. Rendimento: 62 % pf: 127-128ºC (etanol) MS (m/z): 416 (M+) RMN 1H (DMSO-d6): δδ = 8,85 e 8,76 (dois 1Н, dois s, 2СН), 3,90 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,67 (H, s largo, CH), 2,50 (4H, s largo, N(CH2)2), 1,41 (2H, d m, CH2), 0,85 (6H, m, 2CH3) ppm Anal. para C17H19F3N4O3S: Calc.: C, 49,03; H, 4,60; N, 13,45 Encontrado: C, 49,10; H, 4,51; N, 13,37 Exemplo 6 2-[4-(2-ciclo-hexiletil)piperazin-1-il]-8-nitro-6- (trifluormetil)-4H-1,3-benzotiazin-4-ona (composto 6) NO2 N

S N

N F3C

O O composto 6 foi preparado da mesma maneira como no exemplo 1, porém usando 4-(2-ciclo-hexiletil)piperazina como a amina, e um sólido cristalino amarelo foi obtido.

Rendimento: 62 % pf: 175-177ºC (etanol) MS (m/z): 470 (M+) RMN 1H (DMSO-d6): δ = 8,86 e 8,76 (dois 1Н, dois s, 2СН), 5 3,91 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,51 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,36 (2H, t, CH2), 1,70 - 0,85 (13H, 4 m largo, CH2-CH(C5H10)) ppm. Anal. para C21H25F3N4O3S: Calc.: C, 53,61; H, 5,36; N, 11,91 Encontrado: C, 53,52; H, 5,43; N, 11,81 Exemplo 7 2-[4-(1-metilbutil)piperazin-1-il]-8-nitro-6- (trifluormetil)-4H-1,3-benzotiazin-4-ona (composto 7) CH3 NO2 N CH3

S N

N F3 C

O O composto 7 foi preparado da mesma maneira como no exemplo 1, porém usando 4-(1-metilbutil)piperazina como a amina, e o sólido cristalino amarelo foi obtido. Rendimento: 55 % pf: 132-133ºC (etanol) MS (m/z): 471 (M+) RMN 1H (DMSO-d6): δ = 8,85 e 8,76 (dois 1Н, dois s, 2СН), 3,85 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,65 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,54 (H, s largo, CH), 1,47 e 1,32 (4H, 2 m, 2CH2), 0,84 (6H, m, 2CH3) ppm Anal. para C18H21F3N4O3S: Calc.: C, 50,23; H, 4,92; N, 13,02 Encontrado: C, 50,21; H, 5,06; N, 13,13

Exemplo 8 2-(4-heptilpiperazin-1-il)-8-nitro-6-(trifluormetil)-4H-1,3 -benzotiazin-4-ona (composto 8) CH3 NO2 N 5

S N

N F3 C

O O composto 8 foi preparado da mesma maneira como no exemplo 1, porém usando 4-heptilpiperazina como a amina, e o sólido cristalino amarelo foi obtido. Rendimento: 68 % pf: 125-127ºC (etanol) MS (m/z): 458 (M+) RMN 1H (DMSO-d6): δ = 8,85 e 8,76 (dois 1Н, dois s, 2СН), 3,90 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,52 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,33 (3H, t, CH), 1,43 (2H, m largo, CH2), 1,28 (8H, m largo, 4CH2), 0,86 (3H, t, CH3) ppm Anal. para C20H25F3N4O3S: Calc.: C, 50,23; H, 4,92; N, 13,02 Encontrado: C, 50,21; H, 5,06; N, 13,13 Exemplo 9 8-nitro-2-[4-(piridin-4-ilmetil)piperazin-1-il]-6- (trifluormetil)-4H-1,3-benzotiazin-4-ona (composto 9) NO2 N

S N N

N F3 C

O O composto 9 foi preparado da mesma maneira como no exemplo

1, porém usando 4-(piridin-4-ilmetil)piperazina como a amina, e o sólido cristalino amarelo foi obtido. Rendimento: 64 % pf: 200-202ºC (etanol) 5 MS (m/z): 451 (M+) RMN 1H (DMSO-d6): δ = 8,85 e 8,76 (dois 1Н, dois s, 2СН), 8,52 (2H, d, N(CH)2), 7,37 (2H, d, 2CH), 3,95 (4H, s largo, N(CH2)2), 3,63 (2H, s, CH2), 2,58 (4H, s largo, N(CH2)2) ppm Anal. para C19H16F3N5O3S: Calc.: C, 50,55; H, 3,57; N, 15,51 Encontrado: C, 50,58; H, 3,56; N, 15,43 Exemplo 10 8-nitro-2-[4-(4-fenoxibutil)piperazin-1-il]-6- (trifluormetil)-4H-1,3-benzotiazin-4-ona (composto 10)

O NO2 N

S N

N F3C

O O composto 10 foi preparado da mesma maneira como no Exemplo 1, mas usando 4-(4-fenoxibutil)piperazina como a amina, e um sólido cristalino amarelo claro foi obtido. Rendimento: 44 % pf: 256-258ºC (etanol) MS (m/z): 508 (M+) RMN 1H (DMSO-d6): δ = 8,91 e 8,80 (dois 1Н, dois s, 2СН), 7,29 (2H, t, 2CH), 6,93 (3H, d, 3CH), 4,03 (2H, t, OCH2), 3,65 (2H, d, 2CH), 3,19 (4H, m largo, N(CH2)2), 1,94 e 1,79 (4H, 2 m largo, 2CH2) ppm Anal. para C23H23F3N4O4S: Calc.: C, 54,32; H, 4,56; N, 11,02 Encontrado: C, 54,36; H, 4,67; N, 11,07

Exemplo 11 2-[4-(3-metoxipropil)piperazin-1-il]-8-nitro-6- (trifluormetil)-4H-1,3-benzotiazin-4-ona (composto 11) 5 NO2 N OCH3

S N

N F3 C

O O composto 11 foi preparado da mesma maneira como no Exemplo 1, mas usando 4-(3-metoxipropil)piperazina como amina, e um sólido cristalino amarelo claro foi obtido. Rendimento: 37 % pf: 133-134ºC (mistura de n-hexano e acetato de etila) MS (m/z): 432 (M+) RMN 1H (DMSO-d6): δ = 8,85 e 8,76 (dois 1Н, dois s, 2СН), 3,85 (4H, s largo, N(CH2)2), 3,41 (2H, d, OCH2), 3,20 (3H, s, CH3), 2,55 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,34 (2H, t, NCH2), 1,68 (2H, m, CH2) ppm Anal. para C17H19F3N4O4S: Calc.: C, 47,22; H, 4,43; N, 12,96 Encontrado: C, 47,19; H, 4,54; N, 13,08 Exemplo 12 8-nitro-2-(4-pentilpiperazin-1-il)-6-(trifluormetil)-4H-1,3 -benzotiazin-4-ona (composto 12) CH3 NO2 N

S N

N F3 C

O O composto 12 foi preparado da mesma maneira como no exemplo 1, mas usando 4-pentilpiperazina como a amina, e um sólido cristalino amarelo claro foi obtido. Rendimento: 71 % pf: 133-134ºC (etanol) 5 MS (m/z): 430 (M+) RMN 1H (DMSO-d6): δ = 8,85 e 8,76 (dois 1Н, dois s, 2СН), 3,90 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,51 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,32 (2H, t, CH2), 1,48 (2H, m, CH2), 1,26 (4H, m, 2CH2), 0,88 (3H, t, CH3) ppm Anal. para C18H21F3N4O3S: Calc.: C, 50,23; H, 4,92; N, 13,02 Encontrado: C, 50,29; H, 4,85; N, 13,10 Exemplo 13 2-[4-(1-etilpropil)piperazin-1-il]-8-nitro-6- (trifluormetil)-4H-1,3-benzotiazin-4-ona (composto 13) CH3 CH3 NO2 N

S N

N F3C

O O composto 13 foi preparado da mesma maneira como no exemplo 1, porém usando 4-(1-etilpropil)piperazina como a amina, e um sólido cristalino amarelo foi obtido. Rendimento: 79 % pf: 152-153ºC (etanol) MS (m/z): 430 (M+) RMN 1H (DMSO-d6): δ = 8,85 e 8,76 (dois 1Н, dois s, 2СН), 3,90 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,62 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,23 (H, q, CH), 1,47 (4H, d q, 2CH2), 1,26 (4H, m, 2CH2), 0,90 (6H, t, 2CH3) ppm

Anal. para C18H21F3N4O3S: Calc.: C, 50,23; H, 4,92; N, 13,02 Encontrado: C, 50,14; H, 5,03; N, 12,92 Exemplo 14 5 2-[4-(3-ciclo-hexilpropil)piperazin-1-il]-8-nitro-6- (trifluormetil)-4H-1,3-benzotiazin-4-ona (composto 14) NO2 N

S N

N F3 C

O O composto 14 foi preparado da mesma maneira como no exemplo 1, porém usando 4-(3-ciclo-hexilpropil)piperazina como a amina, e um sólido cristalino amarelo foi obtido. Rendimento: 63 % pf: 145-147ºC (n-hexano) MS (m/z): 484 (M+) RMN 1H (DMSO-d6): δ = 8,85 e 8,76 (dois 1Н, dois s, 2СН), 3,90 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,62 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,23 (2H, t, CH2), 1,56, 1,49, 1,20 e 0,87 (15H, 4 m, CH2CH2CH(CH2)5) ppm Anal. para C22H27F3N4O3S: Calc.: C, 54,53; H, 5,62; N, 11,56 Encontrado: C, 54,48; H, 5,53; N, 11,71 Exemplo 15 2-[4-(1-adamantil)piperazin-1-il]-8-nitro-6- (trifluorometil)-4H-1,3-benzotiazin-4-ona (composto 15)

NO2 N

S N 5

N F3C

O O composto 15 foi preparado da mesma maneira como no exemplo 1, porém usando 4-(1-adamantil)piperazina como a amina, e um sólido cristalino amarelo foi obtido. Rendimento: 77 % pf: 236-238ºC (etanol) MS (m/z): 494 (M+) RMN 1H (DMSO-d6): δ = 8,85 e 8,76 (dois 1Н, dois s, 2СН), 3,90 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,74 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,08 (3H, m, 3CH), 1,63 (12H, m largo, 6CH2) ppm Anal. para C23H25F3N4O3S: Calc.: C, 55,86; H, 5,10; N, 11,53 Encontrado: C, 55,78; H, 5,17; N, 11,52 Exemplo 16 2-{4-[2-(benzilóxi)etil]piperazin-1-il}-8-nitro-6- (trifluormetil)-4H-1,3-benzotiazin-4-ona (composto 16)

O NO2 N

S N

N F3 C

O O composto 16 foi preparado da mesma maneira como no Exemplo 1, mas usando 4-[2-(benzilóxi)etil]piperazina como a amina, e um sólido cristalino amarelo foi obtido.

Rendimento: 64 % pf: 117-119ºC (etanol) MS (m/z): 494 (M+) RMN 1H (DMSO-d6): δ = 8,85 e 8,76 (dois 1Н, dois s, 2СН), 5 7,33 (5H, m, C6H5), 4,49 (2H, s, OCH2), 3,85 (4H, s largo, N(CH2)2), 3,60 (2H, t, CH2O), 3,41 (2H, d, OCH2), 3,20 (3H, s, CH3), 2,55 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,49 (2H, t, NCH2) ppm Anal. para C22H21F3N4O4S: Calc.: C, 53,44; H, 4,28; N, 11,33 Encontrado: C, 53,30; H, 4,11; N, 11,39 Exemplo 17 2-(4-{3-[2-(4-fluorfenil)-1,3-dioxolan-2-il]propil} piperazin-1-il)-8-nitro-6-(trifluormetil)-4H-1,3-benzotiazi n-4-ona (composto 17)

F NO2 N

O O S N

N F3 C

O O composto 17 foi preparado da mesma maneira como no exemplo 1, porém usando 4-{3-[2-(4-fluorfenil)-1,3-dioxolan-2-il]propil}piperazina como a amina, e um sólido cristalino amarelo foi obtido. Rendimento: 71 % pf: 152-154ºC (etanol) MS (m/z): 568 (M+) RMN 1H (DMSO-d6): δ = 8,85 e 8,76 (dois 1Н, dois s, 2СН), 7,45 (2H, m, 2CH), 7,19 (2H, t, 2CH), 4,01 e 3,66 (4H, 2 m, OCH2CH2O), 3,91 (1H, d, CH), 3,85 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,55 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,42 (3H, t, CH2), 1,82 (1H, d, CH), 1,42 (2H, m largo, CH2) ppm

Anal. para C24H25F4N4O5S: Calc.: C, 52,81; H, 4,25; N, 9,85 Encontrado: C, 52,93; H, 4,24; N, 9,84 Exemplo 18 5 2-{4-[3-(4-fluorfenóxi)propil]piperazin-1-il}-8-nitro-6- (trifluormetil)-4H-1,3-benzotiazin-4-ona (composto 18)

F NO2 N O

S N

N F3C

O O composto 18 foi preparado da mesma maneira como no exemplo 1, porém usando 4-[3-(4-fluorfenóxi)propil]piperazina como a amina, e um sólido cristalino amarelo foi obtido. Rendimento: 37 % pf: 165-167 ºC (etanol) MS (m/z): 512 (M+) RMN 1H (DMSO-d6): δ = 8,85 e 8,76 (dois 1Н, dois s, 2СН), 7,11 (2H, t, 2CH), 6,94 (2H, m, 2CH), 4,12 (2H, t, OCH2), 3,85 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,52 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,48 (2H, m, CH2), 1,83 (2H, q, CH2) ppm Anal. para C22H20F4N4O4S: Calc.: C, 51,56; H, 3,93; N, 10,93 Encontrado: C, 51,67; H, 4,02; N, 10,88 Exemplo 19 2-(4-propilpiperazin-1-il)-8-nitro-6-(trifluormetil)-4H-1,3 -benzotiazin-4-ona (composto 19)

CH3 NO2 N

S N

N 5 F3 C

O O composto 19 foi preparado da mesma maneira como no exemplo 1, porém usando 4-propilpiperazina como a amina, e o sólido cristalino amarelo foi obtido. Rendimento: 69 % pf: 130-132ºC (etanol) MS (m/z): 402 (M+) RMN 1H (DMSO-d6): δ = 8,85 E 8,76 (dois 1Н, dois s, 2СН), 3,90 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,51 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,32 (2H, t, CH2), 1,48 (2H, m, CH2), 0,90 (3H, t, CH3) ppm Anal. para C16H13F3N4O3S: Calc.: C, 47,76; H, 4,26; N, 13,92 Encontrado: C, 47,81; H, 4,20; N, 13,87 Exemplo 20 6-cloro-2-{4-[3-(4-fluorfenóxi)propil]piperazin-1-il}-8- nitro-4H-1,3-benzotiazin-4-ona (composto 20)

F NO2 N O

S N

N Cl

O Hidróxido de sódio (1,0 g; pó) foi dissolvido em 10 mL de DMSO e 2,4 mL de dissulfeto de carbono foi adicionado a uma temperatura de 10 a 15ºC. 3,0 g de 2,5-dicloro-3-nitrobenzamida foi adicionado à solução em pequenas porções a uma temperatura de 10ºC.

Após 15 minutos, 0,9 mL de MeI foi adicionado a uma temperatura de 10 a 20ºC.

A reação foi continuada durante 30 min, e posteriormente 100 mL de água foi adicionado.

O sólido amarelo resultante de 5 6-cloro-2-metiltio-8-nitrometil-4H-1,3-benzotiazin-4-ona foi separado por filtração.

Rendimento: 47 % pf: 200 a 203 ºC (acetato de etila) MS (m/z): 322 (M+) RMN 1H (DMSO-d6): δ = 8,54 e 8,40 (dois 1Н, dois s, 2СН), 2,71 (3H, s, СН3) ppm Anal. (C9H5ClN2O3S2): Calc.: C, 37,44; H, 1,75; N, 9,79 Encontrado: C, 37,40; H, 1,71; N, 9,874 Uma suspensão de 1,5 g de 6-cloro-2-metiltio-8-nitrometil-4H-1,3-benzotiazina em 10 mL de etanol foi tratada com 0,8 g de 4-[3-(4-fluorfenóxi)propil]piperazina em temperatura ambiente.

A mistura reacional foi aquecida a 50-60ºC durante 20 minutos.

Após o resfriamento, 100 mL de água foi adicionado.

O sólido amarelo claro resultante de 6-cloro-2-{4-[3-(4-fluorfenóxi)propil]piperazin-1-il}-8- nitro-4H-1,3-benzotiazin-4-ona foi separado por filtração.

Rendimento: 68 % pf: 192-194ºC (etanol). MS (m/z): 478 (M+) RMN 1H (DMSO-d6): δ=8,64 e 8,53 (dois 1Н, dois s, 2СН), 7,11 e 6,94 (5H, 2 m, C6H4F), 4,12 (2H, t, OCH2), 3,85 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,55 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,50 (2H, m, CH2), 1,83 (2H, q, CH2) ppm Anal. para C21H20ClFN4O4S: Calc.: C, 52,66; H, 4,21; N, 11,70 Encontrado: C, 52,53; H, 4,14; N, 11,69

Exemplo 21 6-cloro-2-[4-(3-ciclo-hexilpropil)piperazin-1-il]-8-nitro-4 H-1,3-benzotiazin-4-ona (composto 21) NO2 N 5

S N

N Cl

O O composto 21 foi preparado da mesma maneira como no exemplo 19, porém usando 4-(3-ciclo-hexilpropil)piperazina como a amina, e um sólido cristalino amarelo foi obtido. Rendimento: 68 % pf: 194-195ºC (etanol) MS (m/z): 450 (M+) RMN 1H (DMSO-d6): δ = 8,64 e 8,53 (dois 1Н, dois s, 2СН), 3,90 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,52 (4H, s largo, N(CH2)2), 2,26 (2H, t, CH2), 1,67, 1,47, 1,19 e 0,85 (15H, 4 m, CH2CH2CH(CH2)5) ppm Anal. para C21H27ClN4O3S: Calc.: C, 55,93; H, 6,03; N, 12,42 Encontrado: C, 56,02; H, 6,14; N, 12,49 Exemplo 22 Determinação da atividade inibitória in vitro dos compostos da invenção contra micobactérias. A atividade contra M. smegmatis e M. tuberculosis H37Rv foi determinada pelo ensaio de redução de resazurina (MIC99). O método foi descrito em detalhes em: J.C. Palomino, A. Martin, M. Camacho, H. Guerra, J. Swings, F. Portaels, Antimicrob. Agents Chemother., 2002, 46, 2720-2. Os resultados estão apresentados na tabela 1: Tabela 1

Atividade inibitória in vitro dos compostos da invenção contra actinobactérias - valores de MIC típicos (ng/mL) Composto M.

M. smegmatis Corynebacterium tuberculosis glutamicum H37Rv ATCC13032 1 0,75 ≤170 NA 2 ≤0,19 ≤170 NA 3 1,5 ≤170 NA 4 ≤1,9 ≤1,9 31 5 0,37 ≤1,9 62 6 ≤0,19 ≤1,9 125 7 ≤0,19 ≤1,9 125 8 ≤0,19 ≤1,9 125 9 15 62 125 10 1,5 ≤1,9 ≤1,9 11 3,75 31 250 12 0,37 ≤1,9 15 13 0,37 ≤1,9 ≤1,9 14 ≤1,9 ≤1,9 750 15 15 62 <500 16 19 31 <500 17 37,5 3,75 250 18 ≤1,9 ≤1,9 250 19 3,7 ≤190 250 20 ≤1,9 ≤1,9 3,1 21 ≤1,9 ≤1,9 62 NA - não disponível Exemplo 23 Determinação da eficácia in vivo dos compostos (2) e (19) de fórmula (1) contra Mycobacterium tuberculosis no modelo murino de TB agudo.

Materiais e métodos.

A determinação da atividade antituberculose específica foi realizada in vivo em camundongos BALB/c/Cit machos pesando 22-23 g.

Os camundongos foram infectados por injeção intravenosa de 5 x 106 UFC da cepa de M. tuberculosis H37Rv na veia lateral da cauda.

M. 5 tuberculosis foi cultivada em quantidades preparativas e aliquotada no laboratório de Imunogenética de State Institution Central Research Institute of Tuberculosis, da Academia Russa de Ciências Médicas.

As alíquotas (1 mL) foram submetidas a armazenamento a -70°C.

Para infectar camundongos, as alíquotas foram descongeladas, dispersas em tampão fosfato com 0,025% de Tween 80 e ajustadas para 5 x 106 UFC/camundongo.

Todos os animais experimentais foram divididos em 10 grupos de 10 camundongos cada.

Os animais foram tratados por 4 semanas a partir de dois dias após a infecção.

Os compostos foram administrados intragastricamente todos os dias, exceto no fim de semana (5 vezes por semana). O volume administrado foi de 0,5 mL/camundongo.

Em seguida, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical para exame microbiológico.

A fim de determinar a eficácia de cada regime de quimioterapia, alterações macroscópicas nos órgãos parenquimatosos dos animais e o isolamento de M. tuberculosis do material patológico foram levados em consideração.

A fim de determinar a UFC de M. tuberculosis nos pulmões de camundongos infectados, os pulmões foram homogeneizados em 2 mL de solução salina, em seguida, uma série de diluições de dez vezes em soro fisiológico foi preparada, e 50 µL de cada diluição foi plaqueado por agar Dubos.

As placas com suspensão de células de pulmão foram incubadas durante 21 dias a 37°C, em seguida, o número de colônias foi contado e a quantidade de UFC nos pulmões foi determinada.

Compostos e preparação das soluções.

A quantidade exata (200 mg) dos compostos (2) e (19) foi colocada em frascos de vidro e 0,5 mL de ácido acético foi adicionado.

Os compostos foram imediatamente dissolvidos e 99,5 mL de água foi adicionado a esta solução. As soluções dos compostos estudados assim preparados foram usadas durante 4 semanas. Os compostos (2) e (19) foram usados na dose de 50 mg/Kg e isoniazida (INH) 5 foi usada na dose de 25 mg/Kg. Resultados do estudo. Nos animais do grupo controle negativo, os primeiros sinais da doença apareceram em 19-20 dias após a infecção: houve perda de peso, os ratos formaram um grupo mais frequentemente do que andaram ativamente ao redor da gaiola, surgiu a "gibosidade", mas não houve fezes líquidas. A mortalidade no grupo controle foi de 28 a 29 dias após a infecção. O exame macroscópico dos órgãos internos dos camundongos mortos deste grupo mostrou muitos focos de processo tubercular, grandes focos confluentes. O baço foi ampliado 3 vezes. O tratamento com os compostos (2) e (19), BTZ043 e INH pelo tempo prescrito resultou em uma melhoria acentuada. A condição dos pulmões foi próxima do normal, ou seja, ventilado, rosa, sem focos visíveis de infecção tuberculosa. 26 dias após a infecção, 3 camundongos sobreviventes do grupo controle foram sacrificados para determinar a UFC nos pulmões. De acordo com o programa de estudo, os pulmões foram extraídos dos grupos de 1 a 4 camundongos para determinação de UFC 4 semanas após início do tratamento. Os resultados do estudo estão listados na Tabela

2. Tabela 2 UFC de M. tuberculosis H37Rv nos pulmões de camundongos 4 semanas após o tratamento no modelo murino de TB agudo. Composto Dose Log de UFC nos Longevidade média estudado pulmões (dias) M ± SEM Composto 50 mg/Kg 4,30 Vivo no sacrifício (2) Composto 50 mg/Kg 4,63 Vivo no sacrifício

(19) BTZ043* 50 mg/Kg 4,78 Vivo no sacrifício Izoniazid 25 mg/kg 4,34 Vivo no sacrifício a Controle - 9,21 27 ± 0,22 negativo *BTZ043 - 2-[(2S)-2-metil-1,4-dioxa-8-azaspiro[4,5]dec-8-il]-8-nitro- 6-(trifluormetil)-4H-1,3-benzotiazin-4-ona de V.

Makarov et al.

Science, 2009, 324, 801. 5 Este exemplo demonstra claramente que a novas 2-piperazino-1,3-benzotiazino-4-onas, que estão aqui representadas pelos exemplos (2) e (19), são equivalentes ou mais ativas do que as 1,3-benzotiazino-4-onas descritas anteriormente.

Exemplo 24 Determinação da eficácia in vivo dos compostos da fórmula de (1) contra M. tuberculosis no modelo murino de TB crônico.

Materiais e métodos Camundongos BALB/c (Charles River Laboratories, França), com idades entre 4 a 6 semanas (20-25g) foram infectados via aerossol com a cepa H37Rv (CFU~100). O tratamento (5 camundongos por grupo) começou quatro semanas após a infecção, com os compostos administrados por gavagem uma vez por dia, seis vezes por semana, durante 4 semanas.

Os fármacos foram usados nas seguintes concentrações (mg/Kg): BTZ043 a 50 mg/Kg; INH a 25 mg/Kg; compostos 2 e 8 da invenção (ambos em 50 mg/Kg). INH foi dissolvido em água, enquanto BTZ043 e os compostos 2 e 8 foram preparados em carboximetilcelulose a 0,5%. Os camundongos de controle e tratados foram sacrificados e, em seguida, os pulmões e os baços foram homogeneizados, e as diluições foram plaqueadas em 7H10 para a contagem de bacilos viáveis (contagem de UFC). Análise estatística.

A UFC do pulmão foi transformada antes da análise como log10(x+1), onde x é a contagem absoluta de UFC.

Diferenças na média de UFC/grupo entre os controles e 5 regimes experimentais foram comparados por análise de variância de uma via usando GraphPad v 5.0. Resultados do estudo.

Os resultados do experimento são apresentados na figura 1, onde pode ser observado que o tratamento com os compostos de 2 e 8 foi significativamente mais eficaz na redução da carga de UFC nos pulmões e nos baços do que o tratamento com BTZ043. O tratamento com os compostos de 2 e 8 mostra uma diferença estatisticamente significativa em relação ao BTZ043, que foi ligeiramente inferior à INH.

Estes resultados do modelo murino de TB crônica indicam que os compostos da invenção mantêm a promessa como potenciais agentes antituberculose.

Exemplo 25 Uma série de experimentos comparativos ADME/T in vitro foram realizados para prever se a eficácia melhorada observada em camundongos com PBTZ169 (composto 2) em comparação com BTZ043 também poderia ser esperada em seres humanos.

Primeiramente, a estabilidade química no fluido gástrico simulado de PBTZ169 na concentração de 5µΜ foi medida e, após 60 minutos, de 67% do composto permaneceu e a meia-vida no plasma humano a (5 µm) foi verificada como sendo > 60 minutos.

Em seguida, PBTZ169 e BTZ043 foram incubados a uma concentração de 0,1 µg/mL com 0,1 mg de microssomos do fígado humano ou de camundongo (Invitrogen) para medir a depuração intrínseca.

As quantidades relativas do composto restante original ao longo do tempo foram determinadas por HPLC.

Carbamazipina e nifedipina foram usados como controles de depuração intrínsecos baixo e alto, respectivamente.

Os resultados indicam que a BTZ043 e PBTZ169 são compostos de depuração mediana (9 < Clint < 47 µL/min/mg de proteína) em microssomos tanto humanos quanto de camundongo, com PBTZ169 mostrando um ligeiro aumento na depuração intrínseca (Tabela 3). Tanto a nifedipina quanto a carbamazepina mostraram a esperada 5 depuração intrínseca alta e baixa.

Valores Clint para BTZQ43, PBTZ169 e fármacos de controle Depuração Intrínseca (Clint) µL/min/mg de proteína Microssomos de fígado Microssomos de fígado humano de camundongo Carbamazepina 0,6 1,1 Nifedipina 55,3 48,4 BTZ043 16,2 10,3 PBTZ169 23,9 20,9 Tabela 3. O índice de seletividade (IS) de um composto fornece uma boa indicação da tolerabilidade potencial de um candidato a fármaco.

O IS é a concentração do composto que causa um efeito citotóxico de 50% (TC50) dividido pelo seu MIC.

A TC50 de PBTZ169 e BTZ043 foram estabelecidas usando duas linhagens de células humanas, a linhagem de hepatócito HepG2 e a linhagem de pneumócito A549, usando o ensaio de redução de resazurina após a incubação com quantidades variadas dos compostos durante 72 h.

As TC50 de PBTZ169 e BTZ043 foram 66,7 e 6.3 µg/mL contra células HepG2, respectivamente.

As TC50 de PBTZ169 e BTZ043 foram 73,2 e 16,3 µg/mL contra células A549, respectivamente.

As respectivas MICs foram 1 e 2 ng/mL para PBTZ169 e BTZ043. Consequentemente, uma vez que em ambos os casos observou-se consideravelmente menos citotoxicidade com PBTZ169, a IS é muito superior do que a de BTZ043 (Tabela 4). Em termos clínicos, PBTZ169 deve ser mais segura e mais bem tolerada do que BTZ043. Comparação de IS para duas linhagens celulares

Composto IS para HepG2 IS para A549

PBTZ169 66.000 73.000 BTZ043 3.155 8.130 Tabela 4.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. COMPOSTO de fórmula (1) R3 R1 N

S N (R4)n

N R2 O (1) caracterizado pelo fato de que R1 é NO2, NH2, NHOR4, COOR4, CONR5R6 ou CHO; R2 é halogênio, SO2NR5R6, alcóxi inferior, COOR4, CONR5R6, CHO, OCF3 ou mono, di ou trifluormetila; R3 é uma alquila saturada ou insaturada, halogenada ou não halogenada, linear, ramificada ou cíclica, com de 3 a 12 átomos de carbono, onde opcionalmente um ou dois grupos metileno, quando presentes, são substituídos por, O, S ou NR4, ou

Y Q

X Z em que X é um radical alifático saturado ou insaturado, linear ou ramificado, com de 1 a 6 átomos de carbono; Y é O, S ou NR4; Z é uma ligação direta, radical alifático linear ou ramificado com de 1 a 3 átomos de carbono; Q é fenila, naftila, piridila, quinolila, pirazinila, pirimidila, pirazolila, triazinila, imidazolila, furanil ou tienil e, opcionalmente, onde de um a três átomos de hidrogênio são substituídos por um grupo R7; R4 é H ou alquila C1-3; n = 0, 1, 2, 3 ou 4 R5 e R6 são, independentemente entre si, selecionados de H, alquila C1-4, O-alquila C1-4, halogênio, COOR5, CONR6R7, OCF3, CF3 ou CN;

o grupo R7 é halogênio, radical alifático saturado ou insaturado, linear ou ramificado, com de 1 a 3 átomos de carbono, SO2NR5R6, alcóxi inferior, COOR4, CONR5R6, CHO, OCF3, mono, di ou trifluormetila ou fenila, e/ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

2. COMPOSTO de fórmula (1), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto é 2-(4-R3-piperazin-1-il)-8-nitro-6-(trifluormetil)-4H-1,3- benzotiazin-4-ona e R3 tem o significado dado na reivindicação

1.

3. COMPOSTO de fórmula (1), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto é 2-(4-alqulpiperazin-1-il)-8-nitro-6-R2-4H-1,3-benzotiazin-4 -ona, R2 representa halogênio e R3 tem o significado dado na reivindicação 1.

4. COMPOSTO de fórmula (1), de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o composto é 2-[4-(ciclo-hexilmetil)piperazin-1-il]-8-nitro-6- (trifluormetil)-4H-1,3-benzotiazin-4-ona.

5. COMPOSTO de fórmula (1) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto é 2-{4-[3-(4-fluorfenóxi)propil]piperazin-1-il}-8-nitro-6- (trifluormetil)-4H-1,3-benzotiazin-4-ona.

6. COMPOSTO de fórmula (1), de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o composto é 2-(4-heptilpiperazin-1-il)-8-nitro-6-(trifluormetil)-4H-1,3 -benzotiazin-4-ona.

7. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pelo fato de compreender um composto de fórmula (1) e/ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6.

8. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de compreender ainda um veículo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

9. COMPOSTO, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de ser para uso em um tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença. 5

10. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a doença é causada por uma infecção microbiana.

11. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 9 e 10, caracterizado pelo fato de que a doença causada por uma infecção microbiana é selecionada do grupo consistindo em tuberculose, lepra ou úlcera de Buruli.

12. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a infecção microbiana é causada por uma bactéria pertencente ao gênero Mycobacterium, Corynebacterium ou Nocardia.

13. MÉTODO DE TRATAMENTO terapêutico e/ou profilático de uma doença em um paciente em necessidade disso causada por uma infecção microbiana, caracterizado pelo fato de compreender administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6, ou uma composição farmacêutica de acordo com uma qualquer das reivindicações 7 a 8.

14. MÉTODO DE INIBIÇÃO DE UMA INFECÇÃO MICROBIANA, caracterizado pelo fato de compreender a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6, ou uma composição farmacêutica, de acordo com uma qualquer das reivindicações 7 a 8.

* .4 n * e " IM " -" " " p 0 .-. · - ~ ^ UJ 0 iO

E 5 . 8j Q- | [ O CJ\

GU çj] 6 » i mi m ' ' a ·' " — '.y ±- i h% / ;Xz I wr m"' O ' %a .G" r ' '" ' & . . 'Tt"' ÈT':"| '= 4 T" Yy '{ "' $ '" ' ·--- z,j :: '., S |)t)l :' "·¥YF*'G' çi :.^C?2'. "" {á\ " " "" , d. '" "¥"' y 4 '2€ 'M ? :. ): · jsl r 'tg. C,) l4),)))) h"L2m . f -ml ; / [7eS' ·1 [k"j $3 cm @W W íLw Á))| _ }'-* :! T 2 ' 'é'j - I'Á, í" ¥'4 , , + , )" DO "'NT INH ' 43 \JH 1))))I 169 134 D28 FlG. 1

, 1/1 m - — r ' — . — ,. .- , — ?- &- RES'UMO COMPOSTO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO DE TRATAMENTO

E MÉTODO DE INIBIÇÃO DE UMA INFECÇÃO MICROBIANA a A presente ínvenção refere-se a novos derivados de

P 5 2-piperazin-1-i1-4H-l,3-benzotiazin-4-ona, e seus usos pa-ra o tratamento de doenças infeccíosas de mawíferos causadas por bactérias, em especial doenças como túberculose (TB), úlcera de Büruli e lepra que resultaní de ínfecção COÍü míco'baeté.rias _ - intímamente-relacionadas. "(I):" "" " "' " " " "" = "

Á

Z g 4--6 -M "_a