BR112013008505B1

BR112013008505B1 - Usos do nível de expressão do gene c-maf em uma amostra para projetar uma terapia personalizada e diagnosticar a presença e/ou risco de desenvolver metástase óssea em um indivíduo com câncer de mama

Info

Publication number: BR112013008505B1
Application number: BR112013008505-3A
Authority: BR
Inventors: Roger Gomis Cabré; María Tarragona Sunyer; Anna Arnal Estapé; Milica Pavlovic
Original assignee: Fundació Privada Institut De Recerca Biomèdica; Fundació Privada Institució Catalana De Recerca I Estudis Avançats
Priority date: 2010-10-06
Filing date: 2011-10-05
Publication date: 2023-01-24
Also published as: AU2019201493A1; CN103339265A; JP2019195340A; DK3091085T3; EP3517630B1; ES2721639T3; CA2813674C; CN108192972B; AU2021203599A1; CN108192972A; HK1187377A1; KR20140071946A; JP2017104115A; EP3091085A1; DK2626431T3; ES2562274T3; WO2012045905A3; AR083357A1; KR101944555B1; AU2019201493B2

Abstract

MÉTODO PARA O DIAGNÓSTICO, PROGNÓSTICO E TRATAMENTO DE METÁSTASE DE CÂNCER DE MAMA. Trata-se de um método para o diagnóstico ou o prognóstico de metástase em câncer de mama que compreende determinar se o gene de MAF está amplificado em uma amostra de tumor primária. Semelhantemente, a invenção também se refere a um método para o diagnóstico ou o prognóstico de metástase em câncer de mama ER, assim como a um método para determinar a tendência a desenvolver metástase óssea em relação à metástase em outros órgãos, o qual compreende determinar o nível de expressão de gene c-MAF. Finalmente, a invenção se refere ao uso de um inibidor de c-MAF como alvo terapêutico para o tratamento da metástase câncer de mama ER..

Description

Campo da invenção

[001] A presente invenção refere-se ao diagnóstico ou ao prognóstico de me- tástase em câncer de mama com base na determinação de se o gene de c-MAF está amplificado em uma amostra de tumor primária. De modo semelhante, a invenção também se refere a um método para o diagnóstico ou o prognóstico de metástase em câncer de mama, assim como a um método para projetar uma terapia personalizada em um indivíduo com câncer de mama, a qual compreende determinar o nível de expressão de gene c-MAF. Finalmente, a invenção se refere ao uso de um inibidor de c- MAF como alvo terapêutico para o tratamento de metástase de câncer de mama.

Fundamentos da invenção

[002] O câncer de mama é o segundo tipo mais comum de câncer no mundo todo (10,4%; depois do câncer de pulmão) e a quinta causa mais comum de morte por câncer (depois do câncer de pulmão, câncer de estômago, câncer de fígado e câncer de cólon). Entre as mulheres, o câncer de mama é a causa mais comum de morte por câncer. Em 2005, o câncer de mama causou 502.000 mortes no mundo todo (7% das mortes por câncer; quase 1% de todas as mortes). O número de casos por todo o mundo tem aumentado significantemente a partir dos anos de 1970, um fenômeno que é devido parcialmente ao estilo de vida moderno no mundo ocidental.

[003] O câncer de mama é classificado em estágios de acordo com o sistema TNM. O prognóstico está estreitamente relacionado aos resultados da classificação de estágio, e a classificação de estágio também é usada para designar pacientes para tratamentos tanto em testes clínicos como na prática médica. As informações para a classificação em estágios são conforme exposto a seguir:

[004] TX: O tumor primário não pode ser avaliado. T0: não há evidência de tumor. Tis: carcinoma in situ, nenhuma invasão. T1: O tumor tem 2 cm ou menos. T2: O tumor é maior do que 2 cm, mas menor do que 5 cm. T3: O tumor é maior do que 5 cm. T4: Tumor de qualquer tamanho crescendo na parede da mama ou pele, ou câncer de mama inflamatório.

[005] NX: Os nódulos linfáticos próximos não podem ser avaliados. N0: O câncer não tem se espalhado para os nódulos linfáticos regionais. N1: O câncer tem se espalhado para 1 a 3 nódulos linfáticos axilares ou para um nódulo linfático de mamas interno. N2: O câncer tem se espalhado para 4 a 9 nódulos linfáticos axilares ou múltiplos nódulos linfáticos de mamas internos. N3: Um dos seguintes se aplica:

[006] O câncer tem se espalhado para 10 ou mais nódulos linfáticos axilares, o câncer tem se espalhado para os nódulos linfáticos infraclaviculares, o câncer tem se espalhado para os nódulos linfáticos supraclaviculares, o câncer afeta os nódulos linfáticos axilares e tem se espalhado para os nódulos linfáticos de mamas internos ou o câncer afeta 4 ou mais nódulos linfáticos axilares e quantidades mínimas de câncer estão nos nós de mamas internos ou em biópsia de nódulo linfático sentinela.

[007] MX: A presença de disseminação (metástase) não pode ser avaliada. M0: Não há disseminação. M1: espalhamento para órgãos distantes que não incluem o nódulo linfático supraclavicular tem sido produzido.

[008] O fato de que a maioria dos pacientes com câncer de tumor sólido morre após a metástase significa que é crucial compreender os mecanismos moleculares e celulares que permitem que um tumor entre em metástase. As recentes publicações têm demonstrado como a metástase é causada por meio de mecanismos complexos ainda muito pouco conhecidos e também como os diferentes tipos de células metas- táticas têm um tropismo em direção a órgãos específicos. Estas células metastáticas específicas de tecido têm uma série de funções adquiridas que as permitem colonizar órgãos específicos.

[009] Todas as células têm receptores em sua superfície, em seu citoplasma e no núcleo celular. Determinados mensageiros químicos, tais como hormônios, se ligam a tais receptores e isto causa mudanças na célula. Existem três receptores sig- nificantes que podem afetar as células de câncer de mama: receptor de estrogênio (ER), receptor de progesterona (PR) e HER2/neu. Para o propósito de denominar as células que têm qualquer um destes receptores, um sinal positivo é colocado nas mesmas quando o receptor está presente e um sinal negativo se estiver ausente: ER positivo (ER+), ER negativo (ER-), PR+ (positivo), PR negativo (PR-), HER2+ (positivo) e HER2 negativo (HER2-). O estado do receptor tem se tornado uma avaliação crítica para todos os cânceres de mamas, uma vez que determina a adequação do uso de tratamentos específicos, por exemplo, tamoxifeno ou trastuzumab. A isoforma alfa do receptor de estrogênio (ER) é superexpressa em cerca de 65% dos casos diagnosticados de câncer de mama. Este tipo de câncer de mama é mencionado como “ER- positivo” (ER+). Neste caso, a ligação do estrogênio ao ER estimula a proliferação da célula de mama de tumor. As células de tumor ER+ são altamente dependentes deste estímulo para se proliferarem, portanto, ER é atualmente usado como um alvo terapêutico.

[010] A parte essencial para o tratamento câncer de mama consiste na cirurgia quando o tumor está localizado com possível terapia hormonal adjuvante (com tamo- xifeno ou um inibidor de aromatase), quimioterapia e/ou radioterapia. Atualmente, as sugestões para o tratamento após a cirurgia (terapia adjuvante) seguem um padrão. Este padrão está sujeito à mudança devido ao fato de que, a cada dois anos, acontece uma conferência mundial em St. Gallen, Suíça, para discutir os resultados reais dos estudos multicêntricos mundiais. De modo semelhante, o dito padrão também é revisto de acordo com o critério de consenso do National Institute of Health (NIH). Com base nestes critérios, mais do que 85 a 90% dos pacientes que não têm metástase em nódulos linfáticos seriam candidatos a receber a terapia sistemática adjuvante.

[011] Atualmente, os ensaios de PCR, tais como Oncotype DX, ou ensaios de microarranjo, tais como MammaPrint, podem prever o risco de reincidência de câncer de mama com base na expressão de genes específicos. Em fevereiro de 2007, o ensaio MammaPrint se tornou o primeiro indicador de câncer de mama na obtenção de autorização oficial a partir da administração de alimentos e medicamentos.

[012] O pedido de patente no. EP1961825-A1 descreve um método para predizer a ocorrência de metástase de câncer de mama para ossos, pulmão, fígado ou cérebro, o qual compreende determinar em uma amostra de tecido de tumor o nível de expressão de um ou mais marcadores em relação a seu nível de expressão correspondente em uma amostra de controle, entre os quais incluem c-MAF. No entanto, este documento exige a determinação de vários genes simultaneamente para possibilitar a determinação da sobrevivência de pacientes de câncer de mama e a correlação entre a capacidade da assinatura do gene para predizer a capacidade de sobrevivência livre de metástase óssea não foi estatisticamente significante.

[013] Bos, P.D., et al. [Nature, 2009, 459:1005-1009] descreve genes envolvidos na metástase de câncer de mama para o cérebro.

[014] O pedido de patente no. US2005/0181375 descreve métodos para a detecção de câncer de mama metastático com base na detecção dos níveis de expressão de uma série de genes que são aleatoriamente regulados ou regulados de modo descendente em tumores metastáticos e, particularmente, em tumores que se convertem em metástase no cérebro.

[015] O pedido de patente internacional no. WO2010/000907 descreve uma assinatura de gene útil como preditor genômico para metástase distal em pacientes de câncer de mama.

[016] No entanto, não existem marcadores genéticos, no estado da técnica, que permitem o diagnóstico e/ou o prognóstico de se um paciente que sofre de um câncer de mama específico, tal como câncer de mama ER- ou ER+, irá ou não sofrer metástase, deste modo, uma terapia adequada que seja capaz de ser aplicada ao indivíduo que sofre do dito câncer. Portanto, há uma necessidade de identificar novos marcadores que permitem diagnosticar a presença de metástase em indivíduos que sofrem de câncer de mama ER+ ou ER- e/ou predizer a probabilidade de um indivíduo que sofre de câncer de mama ER+ ou ER- de desenvolver metástase. A identificação de novos fatores de prognóstico irá servir como um guia na seleção dos tratamentos mais adequados.

Sumário da invenção

[017] Os autores da presente invenção têm identificado e validado c-MAF como marcador associado a uma tendência maior do câncer de mama ER+ causar metástase e, particularmente, metástase óssea. Esta superexpressão se deve parcialmente a uma amplificação do local 16q22-q24, no qual o gene de c-MAF está localizado. Embora não seja pretendido se ater a qualquer teoria em particular, acredita- se que o caminho de sinalização do receptor de estrogênio (ER) contribui para a me- tástase de câncer de mama conduzindo a eventos moleculares necessários para causar a dita metástase.

[018] O papel do gene de c-MAF em metástase de câncer de mama ER+ tem sido caracterizado pelos inventores por meio da inoculação da linha de célula MCF7 (linha de célula de câncer de mama ER+ humano) em camundongos imunodeficien- tes, para então obter o perfil de expressão associado a linhas de célula obtidas a partir de metástase óssea das ditas células MCF7. A partir do dito perfil de expressão e mediante a aplicação de diversos critérios, o gene de c-MAF foi selecionado, sendo que as variações nos níveis de expressão que predizem a recorrência de tumores de câncer de mama primários para ossos são demonstradas. Subsequentemente, os níveis de expressão de c-MAF foram estudados em duas bases de dados diferentes que contêm os perfis de expressão e as notas clínicas de tumores primários a partir de pacientes com câncer de mama e de metástase a partir de pacientes de câncer de mama, a expressão do gene de c-MAF se correlaciona positivamente com diferentes parâmetros clínicos, incluída a recorrência e metástase sendo observadas. Adicionalmente, os níveis de expressão de c-MAF em metástase óssea a partir de câncer de mama foram determinados, sendo que altos níveis de c-MAF são observados em me- tástase que se origina a partir de tumores ER+ e ER-. Finalmente, o gene de c-MAF foi validado individualmente por meio do ensaio de colonização de metástase in vivo seguido pelos experimentos de ganho de função por meio de vetores lentivirais e experimentos de perda de função por meio do uso de RNA de interferência (siRNA). Estes estudos têm demonstrado o papel de c-MAF como marcador para o prognóstico e como um gene alvo em metástase de câncer de mama, particularmente, metástase óssea a partir do câncer de mama. De modo semelhante, os inventores têm associado à amplificação do local 16q22-q24, que inclui o gene de c-MAF, com a presença de metástase em indivíduos com câncer de mama e a amplificação do gene de c-MAF em linhas de célula de câncer de mama com tendência a formar metástase óssea.

[019] Deste modo, em um primeiro aspecto, a invenção se refere a um método in vitro para o diagnóstico de metástase em um indivíduo com câncer de mama ER+ e/ou o prognóstico da tendência a desenvolver metástase em um indivíduo com câncer de mama ER+, o qual compreende quantificar o nível de expressão de gene c-MAF em uma amostra de tecido de tumor do dito indivíduo e comparar o nível de expressão obtido anteriormente com o nível de expressão do dito gene em uma amostra de controle, em que, se os níveis de expressão do dito gene estiverem aumentados em relação aos níveis de expressão do dito gene na amostra de controle, então, o dito indivíduo tem um diagnóstico positivo para metástase ou uma tendência maior a desenvolver metástase.

[020] Em um segundo aspecto, a invenção se refere a um método in vitro para projetar uma terapia personalizada para um indivíduo com câncer de mama ER+, o qual compreende quantificar o nível de expressão de gene c-MAF em uma amostra de tecido de tumor do dito indivíduo e comparar o nível de expressão obtido anteriormente com o nível de expressão do dito gene em uma amostra de controle, em que, se os níveis de expressão estiverem aumentados em relação aos níveis de expressão do dito gene na amostra de controle, então, o dito indivíduo é suscetível a receber uma terapia que tem como objetivo prevenir e/ou tratar a metás- tase.

[021] Em um terceiro aspecto, a invenção se refere a um método in vitro para projetar uma terapia personalizada para um indivíduo com câncer de mama com me- tástase óssea, o qual compreende quantificar o nível de expressão de gene c-MAF em uma amostra de tecido de tumor metastático ósseo do dito indivíduo e comparar o nível de expressão obtido na etapa (i) com o nível de expressão do dito gene em uma amostra de controle, em que, se os níveis de expressão de gene c-MAF estiverem aumentados em relação aos níveis de expressão do dito gene na amostra de controle, então, o dito indivíduo é suscetível a receber uma terapia que tem como objetivo prevenir a degradação do osso.

[022] Em um quarto aspecto, a invenção se refere a um método in vitro para o diagnóstico de metástase em um indivíduo com câncer de mama e/ou para o prognóstico da tendência a desenvolver metástase em um indivíduo com câncer de mama, o qual compreende determinar se o gene de c-MAF está amplificado em uma amostra de tecido de tumor do dito indivíduo; em que se o dito gene estiver amplificado em relação a uma amostra de controle, então, o dito indivíduo tem um diagnóstico positivo para metástase ou uma tendência maior a desenvolver metástase.

[023] Em um quinto aspecto, a invenção se refere ao uso de um agente inibidor de c-MAF na preparação de um produto medicinal para o tratamento e/ou prevenção de metástase de câncer de mama.

[024] Em um aspecto final, a invenção se refere ao uso de um agente capaz de evitar ou prevenir a degradação óssea na preparação de um produto medicinal para o tratamento de metástase óssea em um indivíduo que sofre de câncer de mama e que tem níveis de c-MAF elevados em uma amostra de tecido de tumor metastático em relação a uma amostra de controle.

Breve descrição dos desenhos

[025] A Figura 1 (A) mostra a representação gráfica do processo de seleção in vivo das subpopulações metastáticas específicas de tecido. Cada uma das gerações metastáticas ósseas subsequentes é designada como BoM0, BoM1 e BoM2. A capacidade metastática destes tipos de célula foi analisada por meio da injeção intra- cardíaca em um modelo de enxerto em camundongo com imunossupressão. (B) mostra o agrupamento hierárquico obtido a partir dos perfis transcricionais das células de câncer de mama ER+ mãe e suas linhas de célula derivadas metastática subsequentes BoM0, BoM1 e BoM2. (C) mostra as curvas de Kaplan-Meier, onde os grupos de pacientes são separados de acordo com os níveis de expressão de c-MAF e a probabilidade para cada grupo de pacientes reincidir e sofrer de metástase óssea no decorrer do tempo é indicada. O conjunto de dados inclui 560 tumores de câncer de mama primários. As análises foram restritas aos tumores ER+ e ER-, respectivamente (base de dados Gene Expression Omnibus, número de acesso GSE 2603, 2034 e 12276) (D) mostra que os níveis de expressão de c-MAF foram usados para separar os perfis de expressão dos 338 tumores de câncer de mama primários descritos na coorte do NKI. A probabilidade de sobrevivência dos pacientes a partir de cada grupo no decorrer do tempo é comparativamente mostrada por meio da curva Kaplan-Meier. Os dados de valor p mostrados em C e D indicam que a interseção entre a expressão do gene de c-MAF e o ER, com o uso destes valores como variáveis contínuas, prediz de uma maneira independente e significante a recorrência ou metástase com o uso de um modelo de multivariáveis do tipo COX (valor p <0,01).

[026] A Figura 2 (A) mostra os níveis de expressão de gene c-MAF normalizados em metástase óssea que se origina a partir de câncer de mama em comparação com outros locais de metástase (cérebro, fígado e pulmão) (GSE14020). (B) mostra os níveis de expressão de gene c-MAF normalizados em diferentes subpopulações com capacidade de colonização óssea diferente e derivados de célula de câncer de mama MDA-MB-231 (ER-). (C) mostra os níveis de expressão de gene CTGF normalizados (gene induzido pela atividade transcricional de c-MAF) em diferentes subpo- pulações com capacidade de colonização óssea diferente e derivados de célula de câncer de mama MDA-MB-231 (ER-) ou com a superexpressão exógena do cDNA que codifica o gene MAF (isoforma longa).

[027] A Figura 3 (A) mostra a análise dos níveis de expressão de c-MAF nas células de câncer de mama ER+ MCF7 e seus derivados metastáticos (BoM) por meio de RT-Quantitativa-PCR. (B) e (C) mostram os experimentos de perda de função e ganho de função de c-MAF. O c-MAF perdido e ganho tem sido executado em células altamente e menos metastáticas em osso, respectivamente. Os derivados de linhas de célula com e sem a expressão de c-MAF são injetadas no ventrículo esquerdo dos camundongos com imunossupressão e a colonização óssea in vivo é analisada em tempo real por meio da técnica de imagem por bioluminescência para validar a contribuição de c-MAF para a metástase óssea em câncer de mama ER+. MAF-sho indica c-MAF curto (isoforma curta).

[028] A Figura 4 mostra o ensaio de diferenciação de osteoclasto a partir de células precursoras derivadas da medula óssea, a partir do meio de condicionamento que se origina a partir de células mãe MCF7 ou células que superexpressam qualquer uma das isoformas de c-MAF (isoforma curta - curta e isoforma longa - longa). O número de osteoclastos é medido por meio da técnica TRAP. As diferenças estatísticas entre os grupos são avaliadas por meio do teste wilcoxon bicaudal.

[029] A Figura 5 (A) mostra a análise do número de cópia a partir dos níveis de expressão de gene em células BoM2 em comparação com as células MCF7, no cromossomo 16. A parte superior mostra um indicador de expressão. A parte central da Figura mostra as sequencias de referência de produtos transcritos para os genes aos quais os valores de expressão são fornecidos (Sec. Ref. produtos transcritos), os quais são ordenados de acordo com sua posição genômica; (B) mostra que a análise ACE (análises de alteração por número de cópia com base em dados de expressão) identifica um ganho genômico recorrente na região 16q12-q24 em pacientes de câncer de mama com metástase em 348 tumores de câncer de mama ER+ primários. A dita região inclui o local 16q22-q24 que contém o gene de c-MAF. A expressão de gene e o desenvolvimento de metástase têm sido associados mediante a aplicação do mo-delo de “razão de risco de Cox log (HR)”. A significância estatística tem sido obtida mediante a permutação (1000 permutações) do algoritmo HR no genoma inteiro, ajustando os valores p através de Benjamini-Hochberg para controlar a FDR (false discovery rate - taxa de descoberta falsa) no nível de 0,05. Somente aquelas regiões com ao menos 15 genes significantes consecutivos são relatadas em cinza.

[030] A Figura 6 A) mostra a detecção do número de cópia do gene MAF e IGH por meio da hibridação por fluorescência in situ (FISH) com o uso de uma sonda específica de gene de c-MAF (seta com asterisco) e uma sonda específica de gene IGH (setas). O gene IGH é usado como controle. Escala: 25 μm. B) mostra a quantificação da porcentagem de células com a razão indicada entre o número de cópia de gene MAF em comparação com o número de cópia de gene IGH. (o número total de células contadas para cada grupo é indicado).

Descrição detalhada da invenção Métodos para o diagnóstico e prognóstico de metástase de câncer de mama com base em níveis de expressão de c-MAF

[031] Os inventores têm mostrado que o gene de c-MAF é superexpresso em metástase de câncer de mama, particularmente, em tumores ER+, e que os níveis de expressão de c-MAF em tumores primários estão correlacionados a diferentes parâmetros clínicos de câncer de mama, particularmente com probabilidade de recorrência e metástase. Deste modo, conforme observado nos exemplos da presente invenção (vide Exemplo 2), a superexpressão de c-MAF está correlacionada com o início da metástase de tumor de mama ER+ em ossos (vide Figura 1). Portanto, c-MAF pode ser usado como um marcador para o diagnóstico e/ou prognóstico de metástase em um indivíduo com câncer de mama ER+.

[032] Deste modo, em um aspecto, a invenção se refere a um método in vitro para o diagnóstico de metástase em um indivíduo com câncer de mama ER+ e/ou para o prognóstico da tendência a desenvolver metástase em um indivíduo com câncer de mama ER+ (mais adiante nesse documento, primeiro método da invenção), o qual compreende quantificar o nível de expressão de gene c-MAF em uma amostra de tecido de tumor a partir do dito indivíduo e comparar o nível de expressão obtido anteriormente com o nível de expressão do dito gene em uma amostra de controle, em que, se os níveis de expressão do dito gene estiverem aumentados em relação aos níveis de expressão do dito gene na amostra de controle, então, o dito indivíduo tem um diagnóstico positivo para metástase ou uma tendência maior a desenvolver metástase.

[033] O gene de c-MAF (homólogo de oncogene fibrosarcoma músculo-apo- neurótico v-maf (aviário) também conhecido como MAF ou MGC71685) é um fator de transcrição que contém um zíper de leucina que age como um homodímero ou um heterodímero. Dependendo do local de ligação de DNA,a proteína codificada pode ser um repressor ou ativador transcricional. A sequência de DNA que codifica c-MAF é descrita na base de dados NCBI sob o número de acesso NG_016440 (SEQ ID NO: 1). Dois RNA mensageiros são transcritos a partir da dita sequência de DNA, cada um dos quais dará origem a uma das duas isoformas de proteína c-MAF, a isoforma α e a isoforma β. As sequências complementares de DNA para cada uma das ditas isoformas são descritas, respectivamente, na base de dados NCBI sob os números de acesso NM_005360.4 (SEQ ID NO: 2) e NM_001031804.2 (SEQ ID NO: 3).

[034] No contexto da presente invenção, “metástase” é compreendida como a propagação de um câncer a partir de um órgão onde o mesmo iniciou para um órgão diferente. Isto geralmente ocorre através do sangue ou sistema linfático. Quando as células cancerígenas se espalham e forma um novo tumor, o último é chamado de um tumor secundário ou metastático. As células cancerígenas que formam o tumor secundário são semelhantes àquelas do tumor original. Se um câncer de mama, por exemplo, se espalha (converte-se em metástase) para o pulmão, o tumor secundário é formado de células de câncer de mama maligno. A doença no pulmão consiste em câncer de mama metastático e não câncer de pulmão. Em uma modalidade particular do método da invenção, a metástase consiste em câncer de mama ER+ que tem se espalhado (converte-se em metástase) para o osso.

[035] Na presente invenção, “câncer de mama ER+” é compreendido como câncer de mama, cujas células de tumor expressam o receptor de estrogênio (ER). Isto torna os ditos tumores sensíveis a estrogênios, que significa que o estrogênio faz o tumor de mama canceroso crescer. Em contrapartida, “câncer de mama ER-” é compreendido como câncer de mama cujas células de tumor não expressam o receptor de estrogênio (ER).

[036] Na presente invenção, “diagnóstico de metástase em um indivíduo com câncer de mama” é compreendido como a identificação de uma doença (metástase) por meio do estudo de seus sinais, isto é, no contexto da presente invenção por meio de níveis de expressão de gene c-MAF aumentados (isto é, superexpressão) no tecido de tumor de câncer de mama em relação a uma amostra de controle.

[037] Na presente invenção, “prognóstico da tendência a desenvolver metás- tase em um indivíduo com câncer de mama ER+” é compreendido como o conhecimento, com base nos sinais, se o câncer de mama ER+ que o dito indivíduo tem irá converter-se em metástase no futuro. No contexto da presente invenção, o sinal consiste na superexpressão do gene de c-MAF no tecido de tumor.

[038] O método da invenção compreende em uma primeira etapa quantificar o nível de expressão de gene c-MAF em uma amostra de tecido de tumor a partir de um indivíduo.

[039] Em uma modalidade preferida, o primeiro método da invenção compreende quantificar somente o nível de expressão de gene c-MAF como um único marcador, isto é, o método não envolve a determinação do nível de expressão de qualquer marcador adicional.

[040] Para uso na presente invenção, o termo “indivíduo” ou “paciente” se refere a todos os animais classificados como mamíferos e inclui, mas não se limita a, animais domésticos e rurais, primatas e humanos, por exemplo, seres humanos, primatas não humanos, vacas, cavalos, porcos, carneiro, cabras, cães, gatos ou roedores. Prefere-se que o indivíduo seja um homem ou mulher humana de qualquer idade ou raça.

[041] Na presente invenção, “amostra de tecido de tumor” é compreendida como a amostra de tecido que se origina a partir do tumor de câncer de mama ER+ primário. A dita amostra pode ser obtida por meio de métodos convencionais, por exemplo, biópsia, com o uso de métodos bem conhecidos pelos elementos versados nas técnicas médicas relacionadas. Os métodos para a obtenção de uma amostra de biópsia incluem partir um tumor em pedaços grandes, ou microdisseção, ou outros métodos de separação de célula conhecidos na técnica. As células de tumor podem ser adicionalmente obtidas por meio de citologia através da aspiração com uma agulha de calibre pequeno. Para simplificar a conservação e manuseio de amostra, as amostras podem ser fixadas em formalina e encharcadas em parafina ou primeiramente congeladas e, então, encharcadas em um meio de congelamento de tecido, tal como composto OCT, por meio da imersão em um meio altamente criogênico que permite o rápido congelamento.

[042] Conforme compreendido pelo elemento versado na técnica, os níveis de expressão de gene podem ser quantificados por meio da medição dos níveis de RNA mensageiro do dito gene ou da proteína codificada pelo dito gene.

[043] Para este propósito, a amostra biológica pode ser tratada para romper de maneira física ou mecânica a estrutura do tecido ou célula, liberando os componentes intracelulares em uma solução aquosa ou orgânica para a preparação de ácidos nucleicos. Os ácidos nucleicos são extraídos por meio de métodos comercialmente disponíveis conhecidos pelo elemento versado na técnica (Sambroock, J., et al., “Molecular cloning: a Laboratory Manual”, 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol. 1-3.).

[044] Deste modo, o nível de expressão de gene c-MAF pode ser quantificado a partir do RNA que resulta a partir da transcrição do dito gene (RNA mensageiro ou mRNA) ou, alternativamente, a partir do DNA complementar (cDNA) do dito gene. Portanto, em uma modalidade particular da invenção, a quantificação dos níveis de expressão de gene c-MAF compreende a quantificação do RNA mensageiro do gene de c-MAF ou um fragmento do dito mRNA, DNA complementar do gene de c-MAF ou um fragmento do dito cDNA ou as misturas dos mesmos.

[045] Praticamente qualquer método convencional pode ser usado dentro do escopo da invenção para detectar e quantificar os níveis de mRNA codificado pelo gene de c-MAF ou do cDNA correspondente do mesmo. A título de ilustração não limitadora, os níveis de mRNA codificado pelo dito gene podem ser quantificados com o uso de métodos convencionais, por exemplo, os métodos que compreendem a amplificação de mRNA e a quantificação do dito produto de amplificação de mRNA, tal como eletroforese e coloração, ou alternativamente, por Southern blot e com o uso de sondas adequadas, Northern blot e com o uso de sondas específicas do mRNA do gene de interesse (c-MAF) ou do cDNA correspondente do mesmo, mapeamento com S1 nuclease, RT-PCR, hibridação, microarranjos, etc., de preferência, por meio de PCR quantitativa em tempo real com o uso de um marcador adequado. De modo semelhante, os níveis de cDNA que correspondem ao dito mRNA codificado pelo gene de c-MAF também podem ser quantificados por meio do uso de técnicas convencionais; neste caso, o método da invenção inclui uma etapa para sintetizar o cDNA correspondente por meio da transcrição reversa (RT) do mRNA correspondente seguida pela amplificação e quantificação do dito produto de amplificação de cDNA. Os méto-dos convencionais para quantificar os níveis de expressão podem ser encontrados, por exemplo, em Sambrook et al., 2001. (citado ad supra).

[046] Em uma modalidade particular, os níveis de expressão de gene c-MAF são quantificados por meio da reação de cadeia de polimerase quantitativa (PCR) ou um arranjo de DNA ou RNA.

[047] Além disso, o nível de expressão de gene c-MAF também pode ser quantificado por meio da quantificação dos níveis de expressão da proteína codificada pelo dito gene, isto é, a proteína c-MAF (c-MAF) [NCBI, número de acesso O75444], ou qualquer variante funcionalmente equivalente da proteína c-MAF. Existem duas isoformas da proteína c-MAF, a isoforma α (NCBI, NP_005351.2) composta de 403 aminoácidos (SEQ ID NO: 4) e a isoforma β (NP_001026974.1) composta de 373 aminoácidos (SEQ ID NO: 5). O nível de expressão de gene c-MAF pode ser quantificado por meio da quantificação dos níveis de expressão de qualquer uma das isoformas da proteína c-MAF. Deste modo, em uma modalidade particular, a quantificação dos níveis da proteína codificada pelo gene de c-MAF compreende a quantificação da proteína c-MAF.

[048] No contexto da presente invenção, “variante funcionalmente equivalente da proteína c-MAF” é compreendida como (i) variantes da proteína c-MAF (SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5) nas quais um ou mais dos resíduos de aminoácido são substituídos por um resíduo de aminoácido conservado ou não conservado (de preferência, um resíduo de aminoácido conservado), em que tal resíduo de aminoácido substituído pode ou não ser um codificado pelo código genético, ou (ii) variantes que compreendem uma inserção ou um apagamento de um ou mais aminoácidos e que têm a mesma função que a proteína c-MAF, isto é, para agir como um fator de transcrição de ligação de DNA. As variantes da proteína c-MAF podem ser identificadas com o uso de métodos com base na capacidade de c-MAF para promover a proliferação de célula in vitro, conforme mostrado no pedido de patente internacional no. WO2005/046731, com base na capacidade do chamado inibidor para o bloqueio da capacidade de transcrição de um gene repórter sob o controle do promotor D2 de ciclina ou de um promotor que contém a região responsiva de c-MAF (elemento res- ponsivo MARE ou c-MAF) em células que expressam c-MAF, conforme descrito no documento sob o no. WO2008098351, ou com base na capacidade do chamado inibidor para o bloqueio da expressão de gene repórter sob o controle do promotor IL-4 em resposta ao estímulo com PMA/ionomicina nas células que expressam NFATc2 e c-MAF, conforme descrito no documento sob o no. US2009048117A.

[049] As variantes de acordo com a invenção têm, de preferência, similaridade de sequências com a sequência de aminoácido de qualquer uma das isoformas de proteína c-MAF (SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5) de ao menos 50%, ao menos 60%, ao menos 70%, ao menos 80%, ao menos 90%, ao menos 91%, ao menos 92%, ao menos 93%, ao menos 94%, ao menos 95%, ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98% ou ao menos 99%. O grau de similaridade entre as variantes e sequências de proteína c-MAF específicas definido anteriormente é determinado com o uso de algoritmos e processos de computador que são amplamente conhecidos pelos elementos versados na técnica. A similaridade entre duas sequências de aminoácido é determinada, de preferência, com o uso do algoritmo BLASTP [BLAST Manual, Al- tschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)].

[050] O nível de expressão de proteína c-MAF pode ser quantificado por meio de qualquer método convencional que permite a detecção e quantificação da dita proteína em uma amostra a partir de um indivíduo. A título de ilustração não limitadora, os ditos níveis de proteína podem ser quantificados, por exemplo, com o uso de anticorpos com capacidade de ligação de c-MAF (ou um fragmento dos mesmos que contém um determinante antigênico) e a quantificação subsequente dos complexos formados. Os anticorpos usados nestes ensaios podem ou não ser rotulados. Os exemplos ilustrativos de marcadores que podem ser usados incluem isótopos radioativos, enzimas, fluoróforos, reagentes de quimiluminescência, cofatores ou substratos de enzima, inibidores de enzima, partículas, corantes, etc. Existe uma ampla gama de ensaios conhecidos que podem ser usados na presente invenção, os quais utilizam anticorpos não rotulados (anticorpo primário) e anticorpos rotulados (anticorpo secundário); estas técnicas incluem Western-blot ou transferência Western, ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado por enzima), RIA (radioimunoensaio), EIA competitivo (imu- noensaio de enzima competitivo), DAS-ELISA (ELISA sanduíche de anticorpo duplo), técnicas imunocitoquímicas e imunohistoquímicas, técnicas com base no uso de mi- croarranjos de proteína ou biochips que incluem anticorpos ou ensaios específicos com base na precipitação coloidal em formatos, tais como varas graduadas. Outras formas para detectar e quantificar a dita proteína c-MAF incluem técnicas de croma- tografia de afinidade, ensaios de ligação de ligante, etc. Quando um método imunoló- gico é usado, qualquer anticorpo ou reagente que é conhecido por ligar-se à proteína c-MAF com uma alta afinidade pode ser usado para detectar a quantidade do mesmo. Todavia, o uso de um anticorpo, por exemplo, soros policlonais, sobrenadantes de hibridomas ou anticorpos monoclonais, fragmentos de anticorpo, Fv, Fab, Fab’ e F(ab’)2, scFv, diacorpos, triacorpos, tetracorpos e anticorpos humanizados. Existem anticorpos anti-proteína c-MAF comerciais no mercado que podem ser usados no contexto da presente invenção, tais como, por exemplo, anticorpos ab427, ab55502, ab55502, ab72584, ab76817, ab77071 (Abcam plc, 330 Science Park, Cambridge CB4 0FL, Reino Unido), o anticorpo monoclonal O75444 (anticorpo monoclonal livre de azida anti-MAF humano de camundongo, não conjugado, Clone 6b8) de AbD Se- rotec, etc. Existem muitas companhias comerciais que oferecem anticorpos anti-c- MAF, tais como Abnova Corporation, Betil Laboratories, Bioworld Technology, GeneTex, etc.

[051] Em uma modalidade particular, os níveis de proteína c-MAF são quantificados por meio de western blot, ELISA ou um arranjo de proteína.

[052] O primeiro método da invenção compreende em uma segunda etapa comparar o nível de expressão de gene c-MAF obtido na amostra de tumor a partir do indivíduo com o nível de expressão do dito gene em uma amostra de controle.

[053] Uma vez que os níveis de expressão de gene c-MAF em uma amostra de tecido de tumor a partir de um indivíduo com câncer de mama ER+ têm sido medidos e comparados com a amostra de controle, se os níveis de expressão do dito gene estiverem aumentados em relação a seus níveis de expressão na amostra de controle, então, pode ser concluído que o dito indivíduo tem um diagnóstico positivo para me- tástase ou uma tendência maior a desenvolver metástase.

[054] A determinação dos níveis de expressão de gene c-MAF precisa ser correlacionada com os valores de uma amostra de controle ou amostra de referência. Dependendo do tipo de tumor a ser analisado, a natureza exata da amostra de controle pode variar. Deste modo, no evento que um diagnóstico deve ser avaliado, então, a amostra de referência é uma amostra de tecido de tumor a partir de um indivíduo com câncer de mama ER+ que não tem se convertido em metástase ou que corresponde ao valor médio dos níveis de expressão de gene c-MAF medidos em uma coleta de tecido de tumor em amostras de biópsia a partir de indivíduos com câncer de mama ER+ que não tem se convertido em metástase.

[055] A dita amostra de referência é tipicamente obtida pela combinação de quantidades iguais de amostras a partir de uma população alvo. Geralmente, as amostras de referência típicas serão obtidas a partir de indivíduos que estão clinicamente bem documentados e a quem a ausência de metástase é bem caracterizada. Em tais amostras, as concentrações normais (concentração de referência) do biomarcador (gene de c-MAF) podem ser determinadas, por exemplo, por meio do fornecimento da concentração média sobre a população de referência. Diversas considerações são levadas em conta quando se determina a concentração de referência do marcador. Entre tais considerações está a idade, peso, sexo, condição física geral do paciente, e similares. Por exemplo, as quantidades iguais de um grupo de ao menos 2, ao menos 10, ao menos 100 a, de preferência, mais do que 1000 indivíduos, de preferência, classificados de acordo com as considerações mencionadas anteriormente, por exemplo, de acordo com diversas categorias de idade, são tomadas como o grupo de refe-rência. A coleta de amostra a partir da qual o nível de referência é derivado será, de preferência, formada por indivíduos que sofrem do mesmo tipo de câncer que o paciente objeto do estudo.

[056] Uma vez que este valor médio tem sido estabelecido, o nível deste marcador expresso em tecidos de tumor a partir de pacientes com este valor médio pode ser comparado e, deste modo, designado para o nível de expressão “aumentado”. Devido à variabilidade entre os indivíduos (por exemplo, aspectos que se referem à idade, raça, etc.), é muito difícil (se não praticamente impossível) estabelecer valores de referência absolutos de expressão de c-MAF. Deste modo, em modalidade particular, os valores de referência para expressão “aumentada” ou “reduzida” da expressão de c-MAF são determinados mediante o cálculo dos percentis por meio convencional que envolve a execução de ensaios em uma ou várias amostras isoladas a partir de indivíduos cuja doença é bem documentada por meio de qualquer um dos métodos mencionados acima dos níveis de expressão de c-MAF. Os níveis “reduzidos” de c-MAF podem ser, então, de preferência, designados a amostras em que os níveis de expressão de c-MAF são iguais ou menores do que 50° percentil na população normal que inclui, por exemplo, os níveis de expressão iguais ou menores do que o 60° percentil na população normal, iguais ou menores do que o 70° percentil na população normal, iguais ou menores do que o 80° percentil na população normal, iguais ou menores do que o 90° percentil na população normal, e iguais ou menores do que o 95° percentil na população normal. Os níveis de expressão de gene c-MAF “aumentados” podem ser, então, de preferência, designados a amostras em que os níveis de expressão de gene c-MAF são iguais ou maiores do que o 50° percentil na população normal que inclui, por exemplo, níveis de expressão iguais ou maiores do que o 60° percentil na população normal, iguais ou maiores do que o 70° percentil na população normal, iguais ou maiores do que o 80° percentil na população normal, iguais ou maiores do que o 90° percentil na população normal e iguais ou maiores do que o 95° percentil na população normal.

[057] Na presente invenção, “níveis de expressão aumentados” é compreendido como o nível de expressão quando o mesmo se refere aos níveis do gene de c- MAF maiores do que aqueles em uma amostra de referência ou amostra de controle. Particularmente, uma amostra pode ser considerada como tendo altos níveis de expressão de c-MAF quando os níveis de expressão na amostra de referência são ao menos 1,1 vezes, 1,5 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes ou até mais em relação à amostra isolada a partir do paciente.

[058] No contexto da presente invenção, compreende-se que “um indivíduo tem um diagnóstico positivo para metástase” quando o câncer de mama ER+ sofrido pelo dito indivíduo tem se convertido em metástase para outros órgãos do corpo, em uma modalidade particular, para o osso.

[059] Em uma modalidade ainda mais preferida, a metástase em ossos é uma metástase osteolítica óssea. Para uso na presente invenção, a expressão “metástase osteolítica óssea” se refere a um tipo de metástase na qual a reabsorção do osso (perda progressiva da densidade óssea) é produzida nas proximidades da metástase que resulta a partir do estímulo da atividade de osteoclasto pelas células de tumor e é caracterizada por dor severa, fraturas patológicas, hipercalcemia, compressão da medula espinhal e outros sintomas que resultam a partir da compressão do nervo.

[060] Por outro lado, compreende-se na presente invenção que “um indivíduo tem uma tendência maior a desenvolver metástase” quando as probabilidades que o câncer de mama ER+ sofrido pelo indivíduo irá converter-se em metástase no futuro são altas.

[061] O elemento versado na técnica irá compreender que a predição da tendência para um tumor de mama primário converter-se em metástase não se destina a ser exata para todos os indivíduos a serem identificados (isto é, para 100% dos indivíduos). Todavia, o termo exige possibilitar a identificação de uma parte estatisticamente significante dos indivíduos (por exemplo, uma coorte em um estudo de coorte). Se uma parte é estatisticamente significante pode ser determinado de uma maneira simples pelo elemento versado na técnica com o uso de ferramentas de avaliação estatística bem conhecidas, por exemplo, a determinação de intervalos de confiança, a determinação de valores p, teste Student’s T, teste Mann-Whitney, etc. Os detalhes são fornecidos em Dowdy e Wearden, Statistics for Research, John Wiley e Sons, Nova Iorque, 1983. Os intervalos de confiança preferidos são ao menos 90%, ao menos 95%, ao menos 97%, ao menos 98% ou ao menos 99%. Os valores p são, de preferência, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 ou 0,0001. Com mais preferência, ao menos 60%, ao menos 70%, ao menos 80% ou ao menos 90% dos indivíduos de uma população podem ser adequadamente identificados pelo método da presente invenção.

Método para projetar a terapia personalizada da invenção em pacientes com tumores de mama ER+

[062] Conforme é conhecido não estado da técnica, o tratamento a ser administrado a um indivíduo que sofre de câncer depende de se o último é um tumor maligno, isto é, se tem altas possibilidades de se submeter à metástase, ou se o último é um tumor benigno. Na primeira suposição, o tratamento de escolha é um tratamento sistemático, tal como quimioterapia e na segunda suposição, o tratamento de escolha é um tratamento localizado, tal como radioterapia.

[063] Portanto, conforme descrito na presente invenção, supondo que a supe- rexpressão do gene de c-MAF em células de câncer de mama está relacionada à presença de metástase, os níveis de expressão de gene c-MAF permitem tomar decisões em termos da terapia mais adequada para o indivíduo que sofre do dito câncer.

[064] Deste modo, em outro aspecto, a invenção se refere a um método in vitro para projetar uma terapia personalizada para um indivíduo com câncer de mama ER+, mais adiante nesse documento, segundo método da invenção, o qual compreende quantificar o nível de expressão de gene c-MAF em uma amostra de tecido de tumor do dito indivíduo e comparar o nível de expressão obtido anteriormente com o nível de expressão do dito gene em uma amostra de controle, em que se os níveis de expressão estiverem aumentados em relação aos níveis de expressão do dito gene na amostra de controle, então, o dito indivíduo é suscetível a receber uma terapia que tem como objetivo prevenir e/ou tratar a metástase.

[065] Em uma modalidade particular, a metástase consiste em uma metástase óssea. Em uma modalidade mais preferida, a metástase óssea consiste em metástase osteolítica.

[066] Os termos e expressões “indivíduo”, “câncer de mama ER+”, “amostra de tecido de tumor”, “metástase”, “determinação de níveis de expressão”, “gene de c- MAF”, “níveis de expressão aumentados” e “amostra de controle” têm sido descritos em detalhes em relação ao primeiro método da invenção e são igualmente aplicáveis ao segundo e terceiro método da invenção.

[067] O segundo método da invenção compreende em uma primeira etapa quantificar o nível de expressão de gene c-MAF em uma amostra de tecido de tumor em um indivíduo que sofre de câncer de mama ER+.

[068] Em uma modalidade preferida, o segundo método da invenção compreende quantificar somente o nível de expressão de gene c-MAF como um único marcador, isto é, o método não envolve determinar o nível de expressão de qualquer marcador adicional.

[069] No caso do segundo método da invenção, a amostra é uma amostra de tecido de tumor primário do indivíduo. Ema uma segunda etapa, o nível de expressão de gene c-MAF obtido na amostra de tumor do indivíduo é comparado com o nível de expressão do dito gene em uma amostra de controle. A determinação dos níveis de expressão de gene c-MAF precisa está relacionada aos valores de uma amostra de controle ou amostra de referência. Dependendo do tipo de tumor a ser analisado, a natureza exata da amostra de controle pode variar. Deste modo, de preferência, a amostra de referência consiste em uma amostra de tecido de tumor de indivíduo com câncer de mama ER+ que não tem se convertido em metástase ou que corresponde ao valor médio dos níveis de expressão de gene c-MAF medidos em uma coleta de tecido de tumor em amostras de biópsia de indivíduos com câncer de mama ER+ que não tem se convertido em metástase.

[070] Uma vez que os níveis de expressão de gene c-MAF na amostra têm sido medidos e comparados com a amostra de controle, se os níveis de expressão do dito gene estiverem aumentados em relação a seus níveis de expressão na amostra de controle, então, pode ser concluído que o dito indivíduo é suscetível a receber a terapia que tem como objetivo prevenir (se o indivíduo não tiver ainda experimentado metástase) e/ou tratar metástase (se o indivíduo já tiver experimentado metástase).

[071] Quando o câncer tem se convertido em metástase, são usados os tratamentos sistemáticos que incluem, mas não se limitam a, quimioterapia, tratamento de hormônio, imunoterapia, ou uma combinação dos mesmos. Adicionalmente, a radioterapia e/ou cirurgia podem ser usadas. A escolha de tratamento geralmente depende do tipo de câncer primário, do tamanho, do local da metástase, da idade, da saúde geral do paciente e dos tipos de tratamentos usados anteriormente.

[072] Os tratamentos sistemáticos são aqueles que alcançam todo o corpo:

[073] A quimioterapia consiste no uso de medicamentos para destruir as células cancerígenas. Os medicamentos são geralmente administrados através de via oral ou intravenosa. Às vezes, a quimioterapia é usada em conjunto com o tratamento de radiação.

[074] A terapia hormonal tem por base o fato de que alguns hormônios promovem o crescimento de determinados câncer. Por exemplo, o estrogênio em mulheres produzido pelos ovários às vezes promove o crescimento do câncer de mama. Existem várias formas para parar a produção destes hormônios. Uma forma consiste em remover os órgãos que produzem os mesmos: os ovários no caso de mulheres, os testículos no caso dos homens. Mais frequentemente, os medicamentos para evitar que estes órgãos produzam os hormônios ou para evitar que os hormônios ajam sobre as células cancerígenas podem ser usados.

[075] A imunoterapia é um tratamento que ajuda o próprio sistema imune do paciente a combater o câncer. Existem vários tipos de imunoterapias que são usadas para tratar pacientes de metástase. Estas incluem, mas não se limitam a, citocinas, anticorpos monoclonais e vacinas antitumor.

Método para projetar a terapia personalizada da invenção em pacientes de câncer de mama com metástase óssea

[076] Os autores da presente invenção têm mostrado claramente que os meios condicionados de linhas de célula derivadas de tumores de mama primários que têm alta capacidade de causar metástase óssea e que superexpressam c-MAF são capazes de induzir a formação de osteoclasto em uma extensão maior do que as células que não superexpressam c-MAF. Deste modo, estes pacientes que sofrem de câncer de mama ER- que já tem se convertido em metástase no osso e em que existem níveis de c-MAF elevados podem, particularmente, se beneficiar de terapias com o objetivo de prevenir a degradação óssea causada pela atividade osteoclástica aumentada.

[077] Deste modo, em outro aspecto, a invenção se refere a um método in vitro para projetar uma terapia personalizada para um indivíduo com câncer de mama ER- com metástase óssea (mais adiante nesse documento, terceiro método da invenção), o qual compreende quantificar o nível de expressão de gene c-MAF em uma amostra de tecido de tumor metastático a partir do osso do dito indivíduo e comparar o nível de expressão obtido anteriormente com o nível de expressão do dito gene em uma amostra de controle, em que se os níveis de expressão estiverem aumentados em relação aos níveis de expressão do dito gene na amostra de controle, então, o dito indivíduo é suscetível a receber uma terapia que tem como objetivo prevenir a degradação do osso.

[078] Os termos e expressões “indivíduo”, “câncer de mama ER+”, “amostra de tecido de tumor”, “metástase”, “determinação de níveis de expressão”, “gene de c- MAF”, “níveis de expressão aumentados” e “amostra de controle” têm sido descritos em detalhes em relação ao primeiro método da invenção e são igualmente aplicáveis ao segundo e terceiro método da invenção.

[079] Em uma modalidade preferida, a metástase óssea consiste em metás- tase osteolítica.

[080] O terceiro método da invenção compreende em uma primeira etapa, quantificar o nível de expressão de gene c-MAF em uma amostra de tecido de tumor em um indivíduo que sofre de câncer de mama. No caso do terceiro método da invenção, a amostra é uma amostra de tecido a partir de metástase óssea.

[081] Em uma modalidade preferida, o terceiro método da invenção compreende quantificar somente o nível de expressão de gene c-MAF como um único marcador, isto é, o método não envolve determinar o nível de expressão de qualquer marcador adicional.

[082] Em uma segunda etapa, o nível de expressão de gene c-MAF obtido na amostra de tumor do indivíduo é comparado com o nível de expressão do dito gene em uma amostra de controle. A determinação dos níveis de expressão de gene c-MAF precisa estar correlacionada aos valores de uma amostra de controle ou amostra de referência. Dependendo do tipo de tumor a ser analisado, a natureza exata da amostra de controle pode variar. Deste modo, no caso que envolve o terceiro método da invenção, então, a amostra de referência consiste em uma amostra de tecido de tumor de indivíduo com câncer de mama que não tem sofrido ou que corresponde ao valor médio dos níveis de expressão de gene c-MAF medido em uma coleta de tecido de tumor em amostras de biópsia de indivíduos com câncer de mama que não têm sofrido metástase.

[083] Uma vez que os níveis de expressão de gene c-MAF na amostra são medidos e comparados com a amostra de controle, se os níveis de expressão do dito gene estiverem aumentados em relação a seus níveis de expressão na amostra de controle, então, pode ser concluído que o dito indivíduo é suscetível a receber uma terapia que tem como objetivo de evitar ou prevenir a degradação óssea.

[084] Para uso na presente invenção, um “agente para evitar ou prevenir a degradação óssea” se refere a qualquer molécula capaz de tratar ou parar a degradação óssea por meio do estímulo da proliferação de osteoblasto ou inibição da proliferação de osteoclasto. Os exemplos ilustrativos de agentes usados para evitar e/ou prevenir a degradação óssea incluem, embora não limitados a:

[085] O hormônio da paratireoide (PTH) ou formas recombinantes do mesmo (teriparatida que corresponde aos aminoácidos 1 a 34 de PTH). Este hormônio age por meio da estimulação dos osteoblastos e aumento de sua atividade.

[086] Ranelato de estrôncio: é um tratamento oral alternativo, e forma parte do grupo de fármacos chamados de "agentes ósseos de dupla ação" (DABAs), devido ao fato de que estimulam a proliferação de osteoblasto e inibem a proliferação de osteoclasto.

[087] “Moduladores de receptor de estrogênio” (SERM) se refere a compostos que interferem ou inibem a ligação de estrogênios ao receptor, independente do mecanismo. Os exemplos de moduladores de receptor de estrogênio incluem, entre outros, estrogênios, progestágenos, estradiol, droloxifeno, raloxifeno, lasofoxifeno, TSE- 424, tamoxifeno, idoxifeno, L Y353381, LY117081, toremifeno, fluvestranto, 4-[7-(2,2- dimetil-1-oxopropoxi-4-metil-2-[4-[2-(1-piperidinil)etoxi]fenil]-2H-1-benzopiran-3-il]-fe- nil-2,2-dimetilpropanoato 4,4’dihidroxibenzofenona-2,4-dinitrofenil-hidrazona e SH646.

[088] Calcitonina: inibe diretamente a atividade de osteoclasto através do receptor de calcitonina. Os receptores de calcitonina têm sido identificados sobre a superfície dos osteoclastos.

[089] Bisfosfonatos: consistem em um grupo de produtos medicinais usados para a prevenção e o tratamento de doenças com reabsorção de osso e reabsorção, tal como osteoporose e câncer com metástase óssea, sendo que o último é com ou sem hipercalcemia, associado ao câncer de mama e câncer de próstata. Os exemplos de bisfosfonatos que podem ser usados na terapia projetada por meio do terceiro método da invenção incluem, embora não limitado a, bisfosfonatos de nitrogênio (tais como pamidronato, neridronato, olpadronato, alendronato, ibandronato, risedronato, incadronato, zoledronato ou ácido zoledrônico, etc.) e bisfosfonatos não nitrogenados (tais como, etidronato, clodronato, tiludronato, etc.).

[090] “Inibidores de catepsina K” se refere a compostos que interferem na atividade de catepsina K cisteína protease. Os exemplos não limitadores de inibidores de catepsina K incluem derivados de 4-amino-pirimidina-2-carbonitrila (descritos no pedido de patente internacional no. WO 03/020278 sob o nome de Novartis Pharma GMBH), pirrolo-pirimidinas descritas na publicação WO 03/020721 (Novartis Pharma GMBH) e na publicação WO 04/000843 (ASTRAZENECA AB), assim como os inibidores descritos nas publicações PCT WO 00/55126 de Axys Pharmaceuticals, WO 01/49288 de Merck Frosst Canada & Co. e Axys Pharmaceuticals.

[091] “Inibidores de RANKL”, para uso na presente invenção, se refere a qualquer composto que é capaz de reduzir a atividade de RANK. RANKL é encontrado sobre a superfície da membrana de osteoblasto das células do estroma e linfócito T, e estas células linfócito T são as únicas que têm demonstrado a capacidade de se- cretá-los. Sua função principal é a ativação dos osteoclastos, as células envolvidas na reabsorção de osso. Os inibidores de RANKL podem agir por meio do bloqueio da ligação de RANKL ao seu receptor (RANK), bloqueio da sinalização mediada por RANK ou redução da expressão de RANKL por meio do bloqueio da transcrição ou da translação de RANKL. Os inibidores ou antagonistas de RANKL adequados para o uso na presente invenção incluem, sem limitação:

[092] Uma proteína RANK adequada que é capaz de ligar RANKL e que compreende todo ou um fragmento do domínio extracelular de uma proteína RANK. O RANK solúvel pode compreender o peptídeo sinal e o domínio extracelular dos poli- peptídeos de RANK humano ou de rato, ou alternativamente, a forma madura da proteína com o peptídeo sinal removido pode ser usada.

[093] Osteoprotegerina ou uma variante da mesma com capacidade de ligação de RANKL.

[094] Moléculas antissenso específicas de RANKL

[095] Ribozimas capazes de processar os produtos transcritos de RANKL

[096] Anticorpos anti-RANKL específicos. “Anticorpo anti-RANKL ou anticorpo direcionado contra RANKL” é compreendido no presente documento como todo aquele anticorpo que é capaz de ligar especificamente ao ligante do receptor de ativação para o fato nuclear KB (RANKL) que inibe uma ou mais funções de RANKL. Os anticorpos podem ser preparados com o uso de qualquer um dos métodos que são conhecidos pelo elemento versado na técnica. Deste modo, os anticorpos policlonais são preparados por meio da imunização de um animal com a proteína a ser inibida. Os anticorpos monoclonais são preparados com o uso do método descrito por Kohler, Milstein et al. (Nature, 1975, 256: 495). Os anticorpos adequados no contexto da presente invenção incluem os anticorpos intatos que compreendem uma região de ligação de antígeno variável e uma região constante, fragmentos “Fab”, “F(ab')2” e “Fab'”, Fv, scFv, diacorpos e anticorpos biespecíficos.

[097] Em uma modalidade preferida, o anticorpo anti-RANKL é um anticorpo monoclonal. Em uma modalidade mais preferida ainda, o anticorpo anti-RANKL consiste em Denosumab (Pageau, Steven C. (2009). mAbs 1 (3): 210-215, CAS número 615258-40-7). No contexto da presente invenção, Denosumab é um anticorpo monoclonal que se liga a RANKL e evita sua ativação (não se liga ao receptor de RANK).

[098] Em uma modalidade preferida, o agente que previne a degradação óssea consiste em um bisfosfonato. Em uma modalidade mais preferida ainda, o bisfos- fonato é o ácido zoledrônico.

[099] Alternativamente, um tratamento combinado pode ser realizado, no qual mais do que um agente a partir daqueles mencionados acima são combinados para tratar e/ou prevenir a metástase ou os ditos agentes podem ser combinados com outros suplementos, tais como cálcio ou vitamina D ou com um tratamento hormonal.

Método de diagnóstico ou prognóstico de metástase em câncer de mama com base na detecção da amplificação do gene de c-MAF

[0100] Os autores da invenção têm identificado que as linhas de célula derivadas a partir de tumores de mama ER+ que têm uma alta capacidade metastática mostram uma amplificação do local 16q22-q24, o qual inclui o local que corresponde ao gene de c-MAF e uma amplificação do gene de c-MAF.

[0101] Deste modo, em um aspecto, a invenção se refere a um método in vitro para o diagnóstico de metástase em um indivíduo com câncer de mama (mais adiante nesse documento, quarto método de diagnóstico da invenção) e/ou para o prognóstico da tendência a desenvolver metástase em um indivíduo com câncer de mama, o qual compreende determinar se o gene de c-MAF é amplificado em uma amostra de tecido de tumor do dito indivíduo; em que se o dito gene é amplificado em relação a uma amostra de controle, então, o dito indivíduo tem um diagnóstico positivo para metás- tase ou uma tendência maior a desenvolver metástase.

[0102] Em uma modalidade particular, o câncer de mama diagnosticado no quarto método da invenção consiste em câncer de mama ER+ ou ER-.

[0103] Os termos “gene de c-MAF”, “metástase”, “amostra de tecido de tu-mor”, “câncer de mama ER+”, “diagnóstico de metástase em um indivíduo com câncer de mama ER+”, “prognóstico da tendência a desenvolver metástase em um indivíduo com câncer de mama ER+”, “indivíduo”, “paciente”, “indivíduo que tem um diagnóstico positivo de metástase”, “indivíduo que tem uma tendência maior a desenvolver me- tástase” têm sido descritos em detalhes no contexto do primeiro método da invenção e são igualmente aplicáveis ao quarto método da invenção.

[0104] Em uma modalidade particular, o grau de amplificação do gene de c- MAF pode ser determinado por meio da determinação da amplificação de uma região de cromossomo que contém o dito gene. Prefere-se que a região de cromossomo cuja amplificação é indicativa da existência da amplificação do gene de c-MAF consista no local 16q22-q24 que inclui o gene de c-MAF. O local 16q22-q24 fica localizado no cromossomo 16, no braço longo do dito cromossomo e em uma faixa entre banda 22 e banda 24. Esta região corresponde na base de dados NCBI com os contigs NT_010498.15 e NT_010542.15. Em outra modalidade preferida, o grau de amplificação do gene de c-MAF pode ser determinado por meio do uso de uma sonda específica para o dito gene.

[0105] O quarto método de diagnóstico/prognóstico da invenção compreende, em uma primeira etapa, determinar se o gene de c-MAF está amplificado em uma amostra de tecido de tumor de um indivíduo. Com esta finalidade, a amplificação do gene de c-MAF na amostra de tumor é comparada em relação a uma amostra de controle.

[0106] O termo “amplificação de um gene”, conforme compreendido no presente documento, se refere a um processo através do qual diversas cópias de um gene ou de um fragmento de gene são formadas em uma célula individual ou uma linha de célula. As cópias do gene não estão necessariamente localizadas no mesmo cromossomo. A região duplicada é muitas vezes chamada de um “amplicon”. Normalmente, a quantidade de mRNA produzido, isto é, o nível de expressão do gene também aumenta em proporção ao número de cópia de um gene particular.

[0107] Em uma modalidade particular, o quarto método da invenção para as diagnoses de metástase em um indivíduo com câncer de mama e/ou para o prognóstico da tendência a desenvolver metástase em um indivíduo com câncer de mama, compreende determinar o número de cópia do gene de c-MAF em uma amostra de tecido de tumor do dito indivíduo e comparar o dito número de cópia com o número de cópia de uma amostra de referência ou controle, em que se o número de cópia de c-MAF for maior em relação ao número de cópia de c-MAF de uma amostra de controle, então, o indivíduo tem um diagnóstico positivo de metástase ou uma tendência maior a desenvolver metástase.

[0108] A amostra de controle se refere a uma amostra de tecido de tumor de um indivíduo com câncer de mama ER+ ou ER- (de acordo com o tipo de câncer que o indivíduo sofre) que não tem sofrido metástase ou que corresponde ao valor médio do número de cópia do gene de c-MAF medido em uma coleta de tecido de tumor em amostras de biópsia de indivíduos com câncer de mama ER+ ou ER- que não têm sofrido metástase. A dita amostra de referência é tipicamente obtida por meio da combinação de quantidades iguais de amostras a partir de uma população alvo. Se o número de cópia do gene de c-MAF estiver aumentado em relação ao número de cópia do dito gene na amostra de controle, então, o indivíduo tem um diagnóstico positivo para metástase ou uma tendência maior a desenvolver metástase.

[0109] Para uso na presente invenção, o termo “gene número de cópia” se refere ao número de cópia de uma molécula de ácido nucleico em uma célula. O número de cópia de gene inclui o número de cópia de gene no DNA genômico (cromos- sômico) de uma célula. Em uma célula normal (célula não tumoral), o número de cópia de gene consiste normalmente em duas cópias (uma cópia em cada membro do par de cromossomos). O número de cópia de gene às vezes inclui metade do número de cópia de gene tomado a partir de amostras de uma população de células.

[0110] Na presente invenção, “número de cópia de gene aumentado” é compreendido como quando o número de cópia do gene de c-MAF é maior do que o número de cópia que uma amostra de referência ou amostra de controle tem. Em particular, pode ser considerado que uma amostra tem um número de cópia de c-MAF aumentado quando o número de cópia é maior do que 2 cópias, por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 cópias, e até maior do que 10 cópias do gene de c-MAF.

[0111] Em uma modalidade particular, a amplificação ou o número de cópia é determinado por meio de hibridação in situ ou PCR.

[0112] Os métodos para determinar se o gene de c-MAF ou a região de cromossomo 16q22-q24 é amplificado são amplamente conhecidos no estado da técnica. Os ditos métodos incluem, sem limitação, hibridação in situ (ISH) (tal como hibridação de fluorescência in situ (FISH), hibridação cromogênica in situ (CISH) ou hibridação in situ pela prata (SISH)), hibridação comparativa genômica ou reação de cadeia de po- limerase (tal como PCR quantitativa em tempo real). Para qualquer método de ISH, a amplificação ou o número de cópia pode ser determinado por meio da contagem do número de pontos fluorescentes, pontos coloridos ou pontos com prata nos cromossomos ou no núcleo.

[0113] A hibridação de fluorescência in situ (FISH) é uma técnica citogenética que é usada para detectar e localizar a presença ou ausência de sequências de DNA específicas em cromossomos. A FISH utiliza sondas de fluorescência que somente se ligam a algumas partes do cromossomo com as quais mostram um alto grau de similaridade de sequência. Em um método de FISH típico, a sonda de DNA é rotulada com uma molécula fluorescente ou um hapteno, tipicamente na forma de fluor-dUTP, digo- xigenina-dUTP, biotina-dUTP ou hapteno-dUTP, o qual é incorporado no DNA com o uso de reações enzimáticas, tais como translação nick ou PCR. A amostra que contém o material genético (os cromossomos) é colocada em lâminas de vidro e é desnaturada por meio de um tratamento formamida. A sonda rotulada é, então, hibridizada com a amostra que contém o material genético sob condições adequadas que serão determinadas pelo elemento versado na técnica. Após a hibridação, a amostra é visualizada diretamente (no caso de uma sonda rotulada com flúor) ou indiretamente (com o uso de anticorpos rotulados de maneira fluorescente par detectar o hapteno).

[0114] No caso de CISH, a sonda é rotulada com digoxigenina, biotina ou flu- oresceina e é hibridizada com a amostra que contém o material genético em condições adequadas.

[0115] Qualquer molécula de marcação ou rotulação que pode se ligar a um DNA pode ser usada para rotular as sondas usadas no quarto método da invenção, permitindo, deste modo, a detecção de moléculas de ácido nucleico. Os exemplos de rótulos para a rotulação incluem, embora não limitados a, isótopos radioativos, substratos de enzima, cofatores, ligantes, agentes de quimiluminescência, fluoróforos, ha- ptenos, enzimas e combinações dos mesmos. Os métodos para rotular e a diretriz para selecionar rótulos adequados para diferentes propósitos podem ser encontrados, por exemplo, em Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989) e Ausubel et al. (In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley e Sons, Nova Iorque, 1998).

[0116] Uma vez que a existência de amplificação é determinada, determi-nando-se diretamente a amplificação do gene de c-MAF ou determinando-se a amplificação do local 16q22-q24, e após ser comparada com a amplificação do dito gene na amostra de controle, se a amplificação no gene de c-MAF for detectada, isto é indicativo do fato de que o indivíduo tem um diagnóstico positivo para metástase ou uma tendência maior a desenvolver metástase.

[0117] A determinação da amplificação do gene de c-MAF necessita estar correlacionada com os valores de uma amostra de controle ou amostra de referência que correspondem ao nível de amplificação do gene de c-MAF medido em uma amostra de tecido de tumor de um indivíduo com câncer de mama que não tem sofrido metás- tase ou que corresponde ao valor médio da amplificação do gene de c-MAF medido em uma coleta de tecido de tumor em amostras de biópsia de indivíduos com câncer de mama que não tem sofrido metástase. A dita amostra de referência é tipicamente obtida por meio da combinação de quantidades iguais de amostras a partir de uma população alvo. Em geral, as amostras de referência típicas serão obtidas a partir de indivíduos que são clinicamente bem documentados e nos quais a ausência de me- tástase é bem caracterizada. A coleta de amostra a partir da qual o nível de referência é derivado será, de preferência, composta de indivíduos que sofrem do mesmo tipo de câncer que o paciente objeto de estudo. Uma vez que este valor médio tem sido estabelecido, o nível de amplificação de c-MAF em tecidos de tumor de pacientes pode ser comparado com este valor médio e, deste modo, se existir amplificação, o indivíduo tem um diagnóstico positivo de metástase ou uma tendência maior a desenvolver metástase.

[0118] Em uma modalidade preferida, a metástase consiste em metástase óssea. Em uma modalidade mais preferida ainda, a metástase óssea consiste em me- tástase osteolítica óssea. Para uso na presente invenção, a expressão “metástase osteolítica óssea” se refere ao tipo de metástase no qual a reabsorção de osso (perda progressiva da densidade óssea) é produzida nas proximidades da metástase que resulta a partir do estímulo da atividade de osteoclasto pelas células de tumor e é caracterizada por dor severa, fraturas patológicas, hipercalcemia, compressão da medula espinhal e outras síndromes que resultam a partir da compressão do nervo.

Métodos terapêuticos da invenção Tratamento de metástase óssea com o uso de agentes inibidors de c-MAF

[0119] Os autores da presente invenção têm mostrado claramente que a inibição da expressão de c-MAF em células de câncer de mama causa uma redução estatisticamente significante na formação de metástase óssea a partir das ditas células, com o uso, para esta finalidade, de um modelo de xenotransplante experimental. De modo contrário, a superexpressão de c-MAF em células de tumor neste mesmo sistema aumenta a capacidade metastática das ditas células. Deste modo, um agente inibidor de expressão de gene de c-MAF ou um agente inibidor da proteína codificada pelo dito gene pode ser usado no tratamento e/ou na prevenção de metástase de câncer de mama.

[0120] Portanto, em outro aspecto, a invenção se refere ao uso de um agente inibidor de expressão de gene de c-MAF ou um agente inibidor da proteína codificada pelo dito gene (mais adiante nesse documento, agente inibidor da invenção) na preparação de um produto medicinal para o tratamento e/ou prevenção de metástase de câncer de mama. Alternativamente, a invenção se refere a um agente inibidor de expressão de gene de c-MAF ou um agente inibidor da proteína codificada pelo dito gene para o uso no tratamento e/ou na prevenção de metástase de câncer de mama. Alternativamente, a invenção se refere a um método para o tratamento da metástase de câncer de mama em um indivíduo, o qual compreende administrar um inibidor de c-MAF ao dito indivíduo.

[0121] Para uso na presente invenção, um “agente inibidor de c-MAF” se refere a qualquer molécula capaz de inibir completa ou parcialmente a expressão do gene de c-MAF, tanto se evitando que o produto de expressão do dito gene seja produzido (interrompendo a transcrição do gene de c-MAF e/ou bloqueando a translação do mRNA que chega a partir da expressão do gene de c-MAF) como se inibindo diretamente a atividade da proteína c-MAF. Os inibidores da expressão do gene de C- MAF podem ser identificados com o uso de métodos com base na capacidade do suposto inibidor em bloquear a capacidade de c-MAF promover a proliferação celular in vitro, tal como mostrado no pedido de patente internacional no. WO2005/046731, com base na capacidade do suposto inibidor em bloquear a capacidade de transcrição de um gene repórter sob o controle do promotor D2 ciclina ou de um promotor que contém a região de resposta de c-MAF (elemento responsivo MARE ou c-MAF) em células que expressam c-MAF, tal como descrito no documento sob o no. WO2008098351, ou com base na capacidade do suposto inibidor em bloquear a expressão de um gene repórter sob o controle do promotor IL-4 em resposta ao estímulo com PMA/ionomicina em células que expressam NFATc2 e c-MAF, tal como descrito no documento sob o no. US2009048117A.

[0122] A título de ilustração não limitadora, os agentes inibidors de c-MAF adequados para o uso na presente invenção incluem oligonucleotídeos antissensos, RNAs de interferência (siRNAs), RNAs catalíticos ou ribozimas específicas e anticorpos inibidors.

Oligonucleotídeos antissensos

[0123] Um aspecto adicional da invenção se refere ao uso de ácidos nucleicos “antissensos” isolados para inibir a expressão, por exemplo, para inibir a transcrição e/ou translação de um ácido nucleico que codifica c-MAF, cuja atividade deve ser inibida. Os ácidos nucleicos antissensos pode ser ligados ao potencial alvo do fármaco por meio de complementaridade de base convencional ou, por exemplo, no caso de ligação ao DNA de filamento duplo através da interação específica na ranhura grande da estrutura helicoidal dupla. Geralmente, estes métodos se referem a uma faixa de técnicas geralmente usadas na técnica e incluem qualquer método que tem por base a ligação específica a sequências de oligonucleotídeo.

[0124] Uma construção antissenso da presente invenção pode ser distribuída, por exemplo, como um plasmídeo de expressão que, quando é transcrito em célula, produz RNA complementar a ao menos uma parte única do mRNA celular que codifica c-MAF. Alternativamente, a construção antissenso é uma sonda de oligonucleotídeo gerada ex vivo que, quando introduzida na célula, produz a inibição da expressão de gene que hibridiza com o mRNA e/ou sequências de gene de um ácido nucleico alvo. Tais sondas de oligonucleotídeo consistem, de preferência, em oligonucleotídeos modificados que são resistentes a nucleases endógenas, por exemplo, exonucleases e/ou endonucleases e são, portanto, estáveis in vivo. Os exemplos de moléculas de ácidos nucleicos para o uso das mesmas como um oligonucleotídeo antissenso consistem em análogos de DNA de fosforamidato, fosfotionato e metilfosfonato (vide também patente nos. US 5176996; 5264564 e 5256775). Adicionalmente, as aproximações gerais para construir oligômeros úteis na terapia antissenso têm sido revistas, por exemplo, em Van der Krol et al., BioTechniques 6: 958-976, 1988; e Stein et al., Cancer Res 48: 2659-2668, 1988.

[0125] Em relação ao oligonucleotídeo antissenso, as regiões de oligodeoxiribonucleotídeo derivadas a partir do local de partida da translação, por exemplo, entre -10 e +10 do gene alvo são preferidas. As aproximações antissenso envolvem o projeto de oligonucleotídeo (DNA ou RNA) que são complementares ao mRNA que codifica o polipeptídeo alvo. O oligonucleotídeo antissenso será ligado ao mRNA transcrito e a translação será evitada.

[0126] Os oligonucleotídeos que são complementares à extremidade 5’ do mRNA, por exemplo, a sequência 5’ não transladada até e incluindo o códon de início AUG, precisam funcionar da maneira mais eficiente para inibir a translação. Todavia, tem sido mostrado recentemente que as sequências complementares às sequências 3’ não transladas do mRNA também são eficientes para inibir a translação de mRNA (Wagner, Nature 372: 333, 1994). Portanto, os oligonucleotídeos complementares poderiam ser usados nas regiões 5’ ou 3’ não transladadas, regiões de não codificação de um gene em uma aproximação antissenso para inibir a translação deste mRNA. Os oligonucleotídeos complementares à região 5’ não transladada do mRNA precisam incluir o complemento do códon de início AUG. Os oligonucleotídeos complementares à região de codificação do mRNA são inibidores de translação menos eficientes, mas também poderiam ser usados de acordo com a invenção. Se fossem projetados para hibridizar com a região 5’, região 3’ ou região de codificação do mRNA, os ácidos nucleicos antissenso precisam ter ao menos seis nucleotídeos de comprimento e, de preferência, têm menos do que aproximadamente 100 e com mais preferência, menos do que aproximadamente 50, 25, 17 ou 10 nucleotídeos de comprimento.

[0127] Prefere-se que os estudos in vitro sejam executados primeiramente para quantificar a capacidade dos oligonucleotídeos antissensos para inibir a expressão de gene. Prefere-se que estes estudos utilizem controles que distinguem entre a inibição de gene antissenso e efeitos biológicos não específicos dos oligonucleotí- deos. Prefere-se também que estes estudos comparem os níveis de RNA alvo ou proteína com aqueles de um controle interno de RNA ou proteína. Os resultados obtidos com o uso dos oligonucleotídeos antissensos podem ser comparados com aqueles obtidos com o uso de um oligonucleotídeo de controle. Prefere-se que o oli- gonucleotídeo de controle seja aproximadamente do mesmo comprimento que o oli- gonucleotídeo a ser analisado e que a sequência de oligonucleotídeo não se difere da sequência antissenso mais do que é considerado necessário para evitar a hibridação específica á sequência alvo.

[0128] O oligonucleotídeo antissenso pode ser um DNA ou RNA de filamento duplo ou único, misturas quiméricas, derivados ou versões modificadas dos mesmos. O oligonucleotídeo pode ser modificado no grupo de base, no grupo de açúcar ou na cadeia principal de fosfato, por exemplo, para aperfeiçoar a estabilidade da molécula, sua capacidade de hibridação, etc. O oligonucleotídeo pode incluir outros grupos de ligação, tais como peptídeos (por exemplo, para direcioná-los para os receptores das células hospedeiras) ou agentes para facilitar o transporte através da membrana celular (vide, por exemplo, Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 86: 6553-6556, 1989; Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 648-652, 1987; publicação PCT no. WO 88/09810) ou a barreira de sangue-cérebro (vide, por exemplo, publicação PCT no. WO 89/10134), agentes de intercalação (vide, por exemplo, Zon, Pharm. Res. 5: 539-549, 1988). Para este propósito, o oligonucleotídeo pode ser conjugado a outra molécula, por exemplo, um peptídeo, um agente de transporte, agente de clivagem disparado por hibridação, etc.

[0129] Os oligonucleotídeos antissensos podem compreender ao menos um grupo de base modificada. O oligonucleotídeo antissenso também pode compreender ao menos um grupo de açúcar modificado selecionado a partir do grupo que inclui, mas não se limita a, arabinose, 2-fluoroarabinose, xilulose e hexose. O oligonucleotí- deo antissenso também pode conter uma cadeia principal similar a um peptídeo neutro. Tais moléculas são conhecidas como oligômeros de ácido nucleico de peptídeo (PNA) e são descritas, por exemplo, em Perry-O’Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 93: 14670, 1996, e em Eglom et al., Nature 365: 566, 1993.

[0130] Em mais outra modalidade, o oligonucleotídeo antissenso compreende ao menos uma cadeia principal de fosfato modificada. Em ainda outra modalidade, o oligonucleotídeo antissenso consiste em um oligonucleotídeo alfa-anomérico.

[0131] Embora os oligonucleotídeos antissensos complementares à região de codificação da sequência de mRNA alvo possam ser usados, aqueles complementares à região não transladada transcrita também podem ser usados.

[0132] Em alguns casos, pode ser difícil alcançar as concentrações intracelulares suficientes do antissenso para suprimir a translação de mRNA endógeno. Portanto, uma aproximação preferida utiliza uma construção de DNA recombinante na qual o oligonucleotídeo antissenso é colocado sob o controle de um promotor pol III ou pol II forte.

[0133] Alternativamente, a expressão de gene alvo pode ser reduzida direcio- nado-se as sequências de deoxiribonucleotídeo complementares para a região de regulação de gene (isto é, o promotor e/ou potencializadores) para formar estruturas helicoidais triplas que evitam a transcrição de gene nas células alvo no corpo (vide, em geral, Helene, Anticancer Drug Des. 6(6): 569-84, 1991).Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos antissensos consistem em morfolinas antissensos.

siRNA

[0134] O RNA de interferência pequena ou siRNA são agentes que são capazes de inibir a expressão de um gene alvo por meio da interferência de RNA. Um siRNA pode ser quimicamente sintetizado, pode ser obtido por meio da transcrição in vitro ou pode ser sintetizada in vivo na célula alvo. Tipicamente, o siRNA consiste em um RNA de filamento duplo entre 15 e 40 nucleotídeos de comprimento e pode conter uma região protuberante 3’ e/ou 5’ de 1 a 6 nucleotídeos. O comprimento da região protuberante é independente do comprimento total da molécula de siRNA. O siRNA age por meio da degradação ou silenciamento do mensageiro alvo após a transcrição.

[0135] O siRNA da invenção é substancialmente homólogo ao mRNA do gene que codifica c-MAF ou à sequência de gene que codifica a dita proteína. “Substancialmente homólogo” é compreendido como tendo uma sequência que é suficientemente complementar ou similar ao mRNA alvo de tal moco que o siRNA seja capaz de degradar o último através de interferência de RNA. O siRNA adequado para causar a dita interferência inclui siRNA formado por RNA, assim como siRNA que contém diferentes modificações químicas, tais como:

[0136] siRNA em que as ligações entre os nucleotídeos são diferentes daquelas que aparecem na natureza, tais como ligações de fosforotionato.

[0137] Conjugados do filamento de RNA com um reagente funcional, tal como um fluoróforo.

[0138] Modificações das extremidades dos filamentos de RNA, particular-mente da extremidade 3’, por meio da modificação com diferentes grupos funcionais hidroxila na posição 2’.

[0139] Nucleotídeos com açúcares modificados, tais como resíduos O-alqui- lados na posição 2’ como 2’-O-metilribose ou 2’-O-fluororibose.

[0140] Nucleotídeos com bases modificadas, tais como bases halogenadas (por exemplo, 5-bromouracil e 5-iodouracil), bases alquiladas (por exemplo, 7-metil- guanosina).

[0141] O siRNA pode ser usado como é, isto é, na forma de um RNA de filamento duplo com as características mencionadas anteriormente. Alternativamente, o uso de vetores que contêm a sequência de filamento senso e antissenso do siRNA é possível sob o controle de promotores adequados para a expressão da mesma na célula de interesse.

[0142] Os vetores adequados para expressar siRNA são aqueles nos quais as duas regiões de DNA que codificam os dois filamentos de siRNA são dispostas em conjunto em um e no mesmo filamento de DNA separado por uma região de espaçamento que, sob a transcrição, forma um ciclo e em que um único promoter direciona a transcrição do molécula de DNA que dá origem ao shRNA.

[0143] Alternativamente, é possível o uso de vetores nos quais cada um dos filamentos que formam o siRNA é formado a partir da transcrição de uma unidade transcricional diferente. Estes vetores são, por sua vez, divididos em vetores de transcrição divergentes e convergentes. Em vetores de transcrição divergentes, as unidades transcricionais que codificam cada um dos filamentos de DNA que formam o siRNA ficam localizadas em conjunto em um vetor de tal modo que a transcrição de cada filamento de DNA dependa de seu próprio promotor que pode ser igual ou diferente (Wang, J. et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100:5103-5106 e Lee, N.S., et al., 2002, Nat. Biotechnol., 20:500-505). Em vetores de transcrição convergentes, as regiões de DNA que dão origem ao siRNA formam os filamentos senso e antis- senso de uma região de DNA que são flanqueados por dois promotores reversos. Após a transcrição dos filamentos de RNA senso e antissenso, o último irá formar no híbrido para formar um siRNA funcional. Os vetores com sistemas de promotor reverso em que é usado o promotor 2 U6 (Tran, N. et al., 2003, BMC Biotechnol., 3:21), um promotor U6 de camundongo e um promotor H1 humano (Zheng, L., et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA., 135-140 e WO 2005026322) e um promotor U6 humano e um promotor H1 de camundongo (Kaykas, A. e Moon, R., 2004, BMC Cell Biol., 5:16) têm sido descritos.

[0144] Os promotores adequados para o uso dos mesmos na expressão de siRNA a partir de vetores de expressão convergentes ou divergentes incluem qualquer promotor ou par de promotores compatíveis com as células nas quais o siRNA deve ser expresso. Deste modo, os promotores adequados para a presente invenção incluem, mas não necessariamente limitados a, promotores constitutivos tais como aqueles derivados a partir dos genomas de vírus eucarióticos, tais como o vírus poli- oma, adenovírus, SV40, CMV, vírus sarcoma aviário, vírus da hepatite B, o promotor de gene de metalotioneína, o promotor de gene timidina quinase do vírus de herpes simplex, regiões de retrovírus LTR, o promotor de gene de imunoglobulina, o promotor de gene de actina, o promotor de gene EF-1alfa, assim como promotores induzíveis, nos quais a expressão de proteína depende da adição de uma molécula ou um sinal exógeno, tal como o sistema tetraciclina, o sistema NFkappaB/luz UV, o sistema Cre/Lox e o promotor de gene de choque térmico, os promotores de RNA polimerase II reguláveis descritos no documento sob o no. WO/2006/135436, assim como os promotores de tecido específico (por exemplo, o promotor de PSA descrito no documento sob o no. WO2006012221). Em uma modalidade preferida, os promotores consistem em promotores de RNA polimerase III que agem de maneira constitutiva. Os promotores de RNA polimerase III são encontrados em um número limitado de genes, tais como 5S RNA, tRNA, 7SL RNA e U6 snRNA. Diferentes de outros promotores de RNA polimerase III, os promotores do tipo III não exigem qualquer sequência intragênica, mas necessitam, de preferência, de sequência na direção 5’ que compreendem uma caixa TATA nas posições -34 e -24, um elemento de sequência proximal ou PSE entre -66 e -47 e, em alguns casos, um elemento de sequência distal ou DSE entre as posições -265 e -149. Em uma modalidade preferida, os promotores de RNA polimerase III do tipo III consistem nos promotores de gene H1 e U6 humano ou de rato. Em uma modalidade mais preferida ainda, os promotores consistem em promotores 2 U6 humano ou de rato, um promotor U6 de camundongo e um promotor H1 humano ou um promotor U6 humano e um promotor H1 de camundongo. No contexto da presente invenção, os promotores de gene ER alfa ou promotores do gene ciclina D1 são especialmente adequados e, portanto, são especialmente preferidos para expressar de maneira específica os genes de interesse em tumores de mama, de preferência, em tumores de mama ER+.

[0145] O siRNA pode ser gerado de maneira intracelular a partir do chamado shRNA (RNA em forma de gancho curto) caracterizado pelo fato de que os filamentos antiparalelos que formam o siRNA são conectados por uma região em forma de gancho ou alça. Os shRNAs podem ser codificados por plasmídeos ou vírus, particularmente retrovírus, e são sob o controle de um promotor. Os promotores adequados para a expressão de shRNA consistem naqueles indicados no parágrafo acima para a expressão de siRNA.

[0146] Os vetores adequados para a expressão de siRNA e shRNA incluem os vetores de expressão procarióticos, tais como pUC18, pUC19, Bluescript e os derivados dos mesmos, mp18, mp19, pBR322, pMB9, CoIEl, pCRl, RP4, vetores de transporte e fagos, tais como pSA3 e pAT28, vetores de expressão de levedura, tais como vetores do tipo plasmídeo de 2 mícrons, plasmídeos de integração, vetores de YEP, plasmídeos centroméricos, e similares, vetores de expressão de inseto, tais como vetores da série pAC e vetores da série pVL, vetores de expressão de planta, tais como vetores da série pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE, e similares, e vetores de expressão de célula eucariótica superior à base de vetor viral (adenovírus, vírus associados com adenovírus, assim como retrovírus e particularmente lentivírus) ou vetores não virais, tais como pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5- His, pVAXl, pZeoSV2, pCI, pSVL e pKSV-10, pBPV-1, pML2d e pTDTl. Em uma modalidade preferida, os vetores consistem em vetores lentivirais.

[0147] Os siRNA e shRNA da invenção podem ser obtidos com o uso de uma série de técnicas conhecidas pelo elemento versado na técnica. A região da sequência de nucleotídeo tomada como uma base para projetar o siRNA é não limitadora e pode conter uma região da sequência de codificação (entre o códon de início e o códon final) ou pode conter alternativamente sequências da região 5’ ou 3’ não transladada, de preferência, entre 25 e 50 nucleotídeos de comprimento e em qualquer posição na posição de direção 3’ em relação ao códon de início. Uma forma de projetar um siRNA envolve a identificação dos motivos AA(N19)TT em que N pode ser qualquer nucleotídeo na sequência de gene de c-MAF, e a seleção daqueles que têm uma alto teor de G/C. Se o dito motivo não for encontrado, é possível identificar o motivo NA(N21) em que N pode ser qualquer nucleotídeo.

[0148] Os siRNAs específicos de c-MAF incluem o siRNA descrito no documento sob o no. WO2005046731, dos quais um dos filamentos consiste em ACGGCUCGAGCAGCGACAA (SEQ ID NO: 6). Outras sequências de siRNA específico de c-MAF incluem, mas não se limitam a, CUUACCAGUGUGUUCACAA (SEQ ID NO: 7), UGGAAGACUACUACUGGAUG (SEQ ID NO: 8), AUUUGCAGUCAUGGAGAACC (SEQ ID NO: 9), CAAGGAGAAAUACGAGAAGU (SEQ ID NO: 10), ACAAGGAGAAAUACGAGAAG (SEQ ID NO: 11) e ACCUGGAAGACUACUACUGG (SEQ ID NO: 12).

Enzimas de DNA

[0149] Por outro lado, a invenção também considera o uso de enzimas de DNA para inibir a expressão do gene de c-MAF da invenção. As enzimas de DNA incorporam algumas das características mecanicistas, tanto a tecnologia antissenso como de ribozima. As enzimas de DNA são projetadas de tal modo que reconheçam uma sequência de ácido nucleico alvo particular similar ao oligonucleotídeo antis- senso, todavia, como o ribozima, são catalíticas e especificamente clivam o ácido nu- cleico alvo.

Ribozimas

[0150] As moléculas de ribozima projetadas para clivar de forma catalítica produtos de transcrição de um mRNA alvo para evitar a translação do mRNA que codifica o c-MAF cuja atividade deve ser inibida, também podem ser usadas. Os ribozimas consistem em moléculas de RNA enzimáticas capazes de catalisar a clivagem de RNA específico. (Para uma revisão, vide, Rossi, Current Biology 4: 469-471, 1994). O mecanismo de ação de ribozima envolve uma hibridação específica de uma sequência de molécula de ribozima a um RNA alvo complementar seguida por um evento e clivagem endonucleolítica. A composição das moléculas de ribozima inclui, de preferência, uma ou mais sequências complementares ao mRNA alvo e a sequência bem conhecida responsável pela clivagem do mRNA ou uma sequência funcionalmente equivalente (vide, por exemplo, a patente no. US 5093246).

[0151] Os ribozimas usados na presente invenção incluem os ribozimas cabeça de martelo, endoribonuclease RNA (mais adiante nesse documento, “ribozimas do tipo Cech”) (Zaug et al., Science 224:574-578, 1984.

[0152] Os ribozimas podem ser formados por oligonucleotídeos modificados (por exemplo, para aperfeiçoar a estabilidade, direcionamento, etc.) e deveriam ser distribuídos para células que expressam o gene alvo in vivo. Um método de distribuição preferido envolve o uso de uma construção de DNA que “codifica” o ribozima sob o controle de um promotor pol III ou pol II constitutivo forte, de tal modo que as células transfectadas irão produzir quantidades suficientes do ribozima para destruir os mensageiros alvo endógenos e para inibir a translação. Uma vez que os ribozimas são catalíticos, diferentes de outras moléculas antissenso, uma baixa concentração intracelular é exigida para sua eficiência.

Anticorpos inibidors

[0153] No contexto da presente invenção, “anticorpo inibidor” é compreendido como qualquer anticorpo capaz de ligar-se especificamente à proteína c-MAF e inibir uma ou mais das funções da dita proteína, de preferência, aquelas relacionadas à transcrição. Os anticorpos podem ser preparados com o uso de qualquer um dos métodos que são conhecidos pelo elemento versado na técnica, alguns dos quais têm sido mencionados acima. Deste modo, os anticorpos policlonais são preparados por meio da imunização de um animal com a proteína a ser inibida. Os anticorpos mono- clonais são preparados com o uso do método descrito por Kohler, Milstein et al. (Nature, 1975, 256: 495). No contexto da presente invenção, os anticorpos adequados incluem anticorpos intatos que compreendem uma região de ligação de antígeno variável e uma região constante, fragmentos “Fab”, “F(ab')2” e “Fab'”, Fv, scFv, dia- corpos e anticorpos biespecíficos. Uma vez que os anticorpos com capacidade de ligação de proteína c-MAF são identificados, aqueles capazes de inibir a atividade desta proteína serão selecionados com o uso de um ensaio de identificação de agente inibidor.

Peptídeos inibidors

[0154] Para uso na presente invenção, o termo “peptídeo inibidor” se refere àqueles peptídeos capazes de ligar-se à proteína c-MAF e inibir sua atividade conforme tem sido explicado acima, isto é, evitar que o c-MAF seja capaz de ativar a transcrição de gene.

Dominantes de c-MAF negativos

[0155] Uma vez que as proteínas da família maf são capazes de homodimeri- zar e heterodimerizar com outros membros da família AP-1, tais como Fos e Jun, uma forma de inibir a atividade de c-MAF é por meio do uso de dominantes negativos capazes de dimerizar com c-MAF, mas que são desprovidos da capacidade para ativação de transcrição. Deste modo, os dominantes de c-MAF negativos podem ser qualquer uma das pequenas proteínas maf que existem na célula e que são desprovidas de dois terços da extremidade amino terminal que contém o domínio de transativação (por exemplo, mafK, mafF, mafg e pi 8) (Fujiwara et al (1993) Oncogene 8, 2371-2380; Igarashi et al. (1995) J. Biol.Chem. 270, 7615-7624; Andrews et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90, 11488-11492; Kataoka et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15, 2180-2190) (Kataoka et al. (1996) Oncogene 12, 53-62).

[0156] Alternativamente, os dominantes de c-MAF negativos incluem variantes de c-MAF que mantêm a capacidade para dimerizar com outras proteínas, mas que são desprovidos da capacidade para ativação de transcrição. Estas variantes consistem, por exemplo, naquelas desprovidas do domínio de transativação de c-MAF localizado na extremidade N-terminal da proteína. Deste modo, as variantes de dominante c-MAF negativo incluem, de uma maneira ilustrativa, as variantes em que ao menos os aminoácidos 1 a 122, ao menos os aminoácidos 1 a 187 ou ao menos os aminoácidos 1 a 257 (considerando-se a numeração de c-MAF humano, conforme descrito no documento sob o no. US6274338) têm sido removidos.

[0157] A invenção considera o uso tanto de variantes de dominante de c-MAF negativo como de polinucleotídeos que codificam c-MAF sob o controle operativo de um promoter adequado para a expressão em célula alvo. Os promotores que podem ser usados para regular a transcrição de polinucleotídeo da invenção podem consistir em promotores constitutivos, isto é, promotores que direcionam a transcrição em um nível basal, ou promotores induzíveis em que a atividade transcricional exige um sinal externo. Os promotores constitutivos adequados para regular a transcrição consistem, entre outros, no promotor de CMV, no promotor de SV40, no promotor de DHFR, no promotor de vírus de tumor mamário de camundongo (MMTV), o promotor de fator de alongamento 1a (EFla), o promotor de albumina, o promotor de ApoA1, o promotor de queratina, o promotor de CD3, o promotor de cadeia leve ou pesada de imunoglobu- lina, o promotor de neurofilamento, o promotor enolase específico de neurona, o pro-motor de L7, o promotor de CD2, o promotor de quinase de cadeia leve de miosina, o promotor e gene de HOX, o promotor de timidina quinase, o promotor de RNA polime- rase II, o promotor de gene de MyoD, o promotor de gene de fosfoglicerato quinase (PGK), o promotor de lipoproteína de baixa densidade (LDL), o promotor de gene de actina. Em uma modalidade preferida, o promoter que regula a expressão do transa- tivador é o promotor de gene de PGK. Em uma modalidade preferida, o promotor que regula a transcrição de polinucleotídeo da invenção é o promotor de RNA polimerase do fago T7.

[0158] Prefere-se que os promotores induzíveis que podem ser usados no contexto da presente invenção consistam naqueles que respondem a um agente indutor que mostra expressão basal zero ou insignificante na ausência de um agente indutor e são capazes de promover a ativação do gene localizado na posição 3’. Dependendo do tipo de agente indutor, os promotores induzíveis são classificados como promotores Tet on/off (Gossen, M. e H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 89:5547-5551; Gossen, M. et al., 1995, Science 268:1766-1769; Rossi, F.M.V. e H.M. Blau, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:451-456); promotores Pip on/off (US 6287813); promotores dependentes de antiprogestina (US 2004132086), promotores dependentes de ecdisona (Christopherson et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 89:6314-6318; No et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 93:3346-3351, Suhr et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 95:7999-8004 e WO9738117), um promotor dependente de metalotioneína (WO8604920) e promotores de dependentes de rapamicina (Rivera et al., 1996, Nat. Med. 2:1028-32).

[0159] Os vetores adequados para expressar o polinucleotídeo que codifica o variante de dominante de c-MAF negativo incluem os vetores derivados a partir de vetores de expressão procarióticos, tais como pUC18, pUC19, Bluescript e derivados dos mesmos, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColEl, pCRl , RP4, vetores de transporte e fago, tais como pSA3 e pAT28, vetores de expressão de levedura, tais como vetores de plasmídeo do tipo 2 mícrons, plasmídeos de integração, vetores de YEP, plasmí- deos centroméricos, e similares, vetores de expressão de célula de inseto, tais como vetores da série pAC e vetores da série pVL, vetores de expressão de planta, tais como vetores da série pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE, e similares, e vetores de expressão de célula eucariótica superior à base de vetor viral (adenovírus, vírus associados com adenovírus, assim como retrovírus e particularmente lentivírus) ou vetores não virais, tais como pSilencer 4.1-CMV (Am- bion), pcDNA3, pcDNA3.1/hyg pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl, pZeoSV2, pCI, pSVL e pKSV-10, pBPV-1, pML2d e pTDTl.

Outros compostos inibidors da atividade da proteína c-MAF

[0160] Outros compostos inibidores de c-MAFy adequados para o uso na presente invenção incluem: I Derivados de ácido endiandrico H, tais como aqueles descritos no documento sob o no. WO2004014888, que correspondem à fórmula geral

Tabela 1: pequenas moléculas com capacidade de inibição de c-MAF

[0161] Outros inibidores de c-MAF são descritos no pedido de patente WO2005063252, tal como mostrado na seguinte tabela (Tabela 2).

Tabela 2: inibidores de c-MAF

[0162] Em uma modalidade preferida, os agentes inibidors de c-MAF são usa-dos para o tratamento e/ou prevenção de metástase óssea. Em uma modalidade mais preferida ainda, a metástase óssea consiste em metástase osteolítica.

[0163] Os agentes inibidors de c-MAF são tipicamente administrados em com-binação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0164] O termo “veículo” se refere a um diluente ou um excipiente por meio do qual o ingrediente ativo é administrado. Tais veículos farmacêuticos podem ser líqui-dos esteriles, tais como água e óleo, que inclui aqueles de uma origem animal, vege-tal, sintética ou de petróleo tal como, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim, e similares. A água ou soluções salinas aquosas e soluções aquosas de dextrose e glicerol, particularmente, para soluções injetáveis, são usadas, de preferência, como veículos. Os veículos farmacêuticos adequados são descritos em “Remington's Pharmaceutical Sciences” por E.W. Martin, 1995. P refere-se que os veículos da invenção sejam aprovados pela agência reguladora do governo estadual ou federal ou estejam relacionados na farmacopeia dos Estados Unidos ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para o uso dos mesmos em animais e mais particularmente em seres humanos.

[0165] Os veículos e substâncias auxiliares necessárias para a fabricação da forma de dosagem farmacêutica desejada da composição farmacêutica da invenção irão depender, entre outros fatores, da forma de dosagem farmacêutica escolhida. As ditas formas de dosagem farmacêutica da composição farmacêutica serão fabricadas de acordo com os métodos convencionais conhecidos pelo elemento versado na téc-nica. Uma revisão dos diferentes métodos para administrar ingredientes ativos, os excipientes a serem usados e processos para a produção dos mesmos podem ser encontrados em “Tratado de Farmacia Galénica”, C. Faulí i Trillo, Luzán 5, S.A. edição de 1993. Os exemplos de composições farmacêuticas incluem qualquer composição sólida (comprimidos, pílulas, capsulas, grânulos, etc.) ou composição líquida (solu-ções, suspensões ou emulsões) para administração oral, tópica ou parenteral. Adici-onalmente, a composição farmacêutica pode conter, conforme considerado necessá-rio, estabilizantes, suspensões, conservantes, tensoativos, e similares.

[0166] Para o uso na medicina, os agentes inibidors de c-MAF podem ser en-contrados na forma de um pró-fármaco, sal, solvato ou clatrato, isolado ou em combi-nação com agentes ativos adicionais e podem ser formulados em conjunto com um excipiente farmaceuticamente aceitável. Os excipientes preferidos para o uso dos mesmos na presente invenção incluem açúcares, amidos, celuloses, borrachas e pro-teínas. Em uma modalidade particular, a composição farmacêutica da invenção será formulada em uma forma de dosagem farmacêutica sólida (por exemplo, comprimidos, cápsulas, pílulas, grânulos, supositórios, cristal estéril ou sólidos amorfos que podem ser reconstituídos para fornecer formas líquidas, etc.), forma de dosagem farmacêutica líquida (por exemplo, soluções, suspensões, emulsões, elixires, loções, pomadas, etc.) ou forma de dosagem farmacêutica semissólida (géis, pomadas, cremes e similares). As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas por meio de qualquer via, que inclui, mas não se limita a, via oral, via intravenosa, via intramus-cular, via intra-arterial, via intramedular, via intratecal, via intraventricular, via transdér- mica, via subcutânea, via intraperitoneal, via intranasal, via entérica, via tópica, via sublingual ou via retal. Uma revisão das diferentes formas para administrar ingredien-tes ativos, dos excipientes a serem usados e dos processos de fabricação dos mesmos podem ser encontrados em Tratado de Farmacia Galénica, C. Faulí i Trillo, Luzán 5, S.A., edição de 1993 e em Remington’s Pharmaceutical Sciences (A.R. Gennaro, Ed.), 20a edição, Williams & Wilkins PA, EUA (2000). Os exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis são conhecidos no estado da técnica e incluem solu-ções salinas tamponadas com fosfato, água, emulsões, tais como emulsões de óleo/água, diferentes tipos de agentes umectantes, soluções esteriles, etc. As compo-sições que compreendem os ditos veículos podem ser formuladas por meio de pro-cessos convencionais conhecidos no estado da técnica.

[0167] No evento que os ácidos nucleicos (siRNA, polinucleotídeos que codi-ficam siRNA ou shRNA ou polinucleotídeos que codificam dominantes de c-MAF ne-gativos) são administrados, a invenção considera as composições farmacêuticas par-ticularmente preparadas para administrar os ditos ácidos nucleicos. As composições farmacêuticas podem compreender os ditos ácidos nucleicos desprotegidos, isto é, na ausência de compostos que protegem os ácidos nucleicos contra degradação pelas nucleases do corpo, o qual implica a vantagem que a toxicidade associada com os reagentes usados para transfecção é eliminada. As vias de administração adequadas para compostos desprotegidos incluem a via intravascular, via intratumor, via intracra-nial, via intraperitoneal, via intraesplênica, via intramuscular, via sub-retinal, via sub-cutânea, via mucosal, via tópica e via oral (Templeton, 2002, DNA Cell Biol., 21:857-867). Alternativamente, podem ser administrados os ácidos nucleicos que formam parte de lipossomos conjugados a colesterol ou conjugados a compostos capazes de promover a translocação através de membranas celulares, tais como o peptídeo Tat derivado a partir da proteína HIV-1 TAT, a terceira hélice do homeodomínio da proteína de D. melanogaster antennapedia, a proteína do vírus herpes simplex VP22, oli- gômeros de arginina e peptídeos conforme descrito no documento sob o no. WO07069090 (Lindgren, A. et al., 2000, Trends Pharmacol. Sci, 21:99-103, Schwarze, S.R. et al. , 2000, Trends Pharmacol. Sci., 21:45-48, Lundberg, M et al., 2003, Mol Therapy 8:143-150 e Snyder, E.L. e Dowdy, S.F., 2004, Pharm. Res. 21:389-393). Alternativamente, pode ser administrado o polinucleotídeo que forma parte de um vetor de plasmídeo ou vetor viral, de preferência, vetores à base de adenovírus, em vírus adeno-associados ou em retrovírus, tais como o vírus com base no vírus de leucemia de rato (MLV) ou no lentivírus (HIV, FIV, EIAV).

[0168] Os agentes inibidors de c-MAF ou as composições farmacêuticas que contêm os mesmos podem ser administrados em uma dose de menos do que 10 mg por quilograma de peso corporal, de preferência, menos do que 5, 2, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005 ou 0,00001 mg por kg de peso corporal. A dose unitária pode ser administrada por meio de injeção, inalação ou administração tópica.

[0169] A dose depende da severidade e da resposta da condição a ser tratada e pode variar entre vários dias e meses ou até a condição abrandar. A dosagem ótima pode ser determinada medindo-se periodicamente as concentrações do agente no corpo do paciente. A dose ótima pode ser determinada a partir dos valores EC50 ob-tidos por meio de ensaios in vitro ou in vivo anteriores em modelos de animal. A dose unitária pode ser administrada uma vez ao dia ou menos do que uma vez ao dia, de preferência, menos do que uma vez a cada 2, 4, 8 ou 30 dias. Alternativamente, é possível administrar uma dose inicial seguida por uma ou várias doses de manuten-ção, geralmente de uma quantidade menor do que a dose inicial. O regime de manu-tenção pode envolver tratar o paciente com uma dose que se situa na faixa entre 0,01 μg e 1,4 mg/kg de peso corporal por dia, por exemplo 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 ou 0,00001 mg por kg de peso corporal por dia. As doses de manutenção são, de preferência, administradas no máximo uma vez a cada 5, 10 ou 30 dias. O tratamento precisa ser continuado por um tempo que irá variar de acordo com o tipo de distúrbio que o paciente sofre, da severidade do mesmo e da condição do paciente. Após o tratamento, o progresso do paciente precisa ser monitorado para determinar se a dose deveria ser aumentado no evento que a doença não responde ao tratamento ou a dose é reduzida se uma melhora da doença é observada ou se efeitos colaterais in- desejados são observados.

Tratamento ou prevenção da degradação óssea em pacientes de câncer de mama com metástase óssea com níveis de c-MAF elevados

[0170] Os autores da presente invenção têm demonstrado que os níveis de c- MAF estão elevados na metástase óssea a partir de tumores de mama. De modo semelhante, os autores da presente invenção têm mostrado claramente que o meio de condicionamento de linhas de célula derivadas a partir de tumores de mama primários que têm alta capacidade para causar uma metástase óssea e que superex- pressam c-MAF são capazes de induzir a formação de osteoclastos em uma extensão maior do que as células que não superexpressam c-MAF. Deste modo, aqueles pacientes que sofrem de câncer de mama que tem se convertido em metástase em osso e em que existem níveis de c-MAF elevados na dita metástase podem se beneficiar particularmente das terapias com o objetivo de prevenir a degradação óssea causada pela atividade osteoclástica aumentada.

[0171] Deste modo, em outro aspecto, a invenção se refere ao uso de um agente para evitar ou prevenir a degradação óssea na preparação de um produto me-dicinal para a prevenção e/ou o tratamento da metástase óssea em um indivíduo que sofre câncer de mama e tem níveis de c-MAF elevados em uma amostra de tecido de tumor metastático em relação a uma amostra de controle.

[0172] Alternativamente, a invenção se refere a um agente para evitar ou pre-venir a degradação óssea para o uso na prevenção e/ou no tratamento da metástase óssea em um indivíduo que sofre câncer de mama e tem níveis de c-MAF elevados em uma amostra de tecido de tumor metastático em relação a uma amostra de controle.

[0173] Alternativamente, a invenção se refere a um método de prevenção e/ou tratamento da degradação em um indivíduo que sofre câncer de mama e tem níveis de c-MAF elevados em uma amostra de tecido de tumor metastático em relação a uma amostra de controle, o qual compreende administrar um agente para evitar ou prevenir a degradação óssea ao dito indivíduo.

[0174] Em uma modalidade particular, a metástase óssea consiste em metás- tase osteolítica. Em outra modalidade particular, o câncer de mama consiste em câncer de mama ER+ ou ER-.

[0175] Os termos e expressões “indivíduo”, “câncer de mama ER+”, “amostra de tecido de tumor”, “metástase”, “gene de c-MAF”, “níveis de expressão aumentados ou elevados” e “amostra de controle” têm sido descritos em detalhes em relação ao primeiro método da invenção e são igualmente aplicáveis ao agente para evitar ou prevenir a degradação óssea.

[0176] Os agentes capazes de evitar ou prevenir a degradação óssea ade-quados para o método terapêutico descrito na presente invenção têm sido descritos em detalhes acima no contexto do método de terapia personalizada.

[0177] A amostra de controle ou referência consiste em uma amostra de tecido de tumor de um indivíduo com câncer de mama ER+ ou ER- que não tem sofrido metástase ou que corresponde ao valor médio dos níveis de expressão de gene c- MAF medidos em uma coleta de tecido de tumor em amostras de biópsia de indivíduos com câncer de mama ER+ que não têm sofrido metástase.

[0178] Os métodos para determinar ou quantificar se os níveis de c-MAF estão elevados em relação a uma amostra de controle têm sido descritos em detalhes em relação ao primeiro método da invenção e são igualmente aplicáveis ao agente para evitar ou prevenir a degradação óssea.

[0179] Alternativamente, um tratamento combinado pode ser realizado, em que mais do que um agente para evitar ou prevenir a degradação óssea a partir daqueles mencionados acima são combinados para tratar e/ou prevenir a metástase ou os ditos agentes podem ser combinados com outros suplementos, tais como cálcio ou vitamina D ou com um hormônio.

[0180] Os agentes para evitar ou prevenir a degradação óssea são tipicamente administrados em combinação com um veículo farmaceuticamente acei-tável. O termo “veículo” e os tipos de veículos têm sido definidos acima para o agente inibidor de c-MAF, assim como a forma e a dose em que podem ser administrados e são igualmente aplicáveis ao agente para evitar ou prevenir a degradação óssea.

[0181] Os seguintes exemplos ilustram a invenção e não limitam o escopo da mesma.

Exemplos Materiais e Métodos Modelos de estudo experimentais

[0182] Novos modelos experimentais têm sido desenvolvidos para o estudo de metástase em câncer de mama ER+. Para este propósito, tem sido usada uma linha de célula de câncer de mama ER+ humano chamada MCF7 que foi transfectada de uma maneira estável com um vetor que permite a expressão de GFP/Luciferase. Esta linha de célula foi inoculada em camundongos imunodeficientes (Balb-c/nude) por meio de injeção intraventricular ou em veia caudal para possibilitar a seleção de células com capacidade metastática em diferentes órgãos. Os camundongos tinham implantes de estrogênio subcutâneos assegurando a presença deste hormônio por todo o experimento.

Seleção de populações metastáticas

[0183] As populações metastáticas em diferentes tecidos foram selecionadas por meio da identificação e isolamento das células de lesões metastáticas. Com esta finalidade, a técnica de imagem por bioluminescência que utiliza a tecnologia que per-mite detectar a implantação e crescimento de células de tumor em órgãos de interesse em diferentes momentos e quantificar o número de células de tumor presentes, foram usadas. Para aplicar esta técnica, as células têm sido transladadas para a expressão da luciferase e do gene GFP e os métodos de rastreamento em tempo real não inva- sivo in vivo são, portanto, permitidos. A imagem de luminescência (atividade de luciferase) é capturada com o animal sob anestesia, com o uso do equipamento Xe- nogen IVIS e do software Livingimage, como metodologia preferida devido a sua sen-sibilidade e velocidade. Para isolar as células metastáticas, a lesão de tumor é disse-cada e, subsequentemente, por meio de técnicas de citometria de varredura a laser por fluorescência (GFP), as células metastáticas são isoladas das células do organismo hospedeiro. Uma vez que estas células são isoladas, o processo para enriquecer seu tropismo para os diferentes tecidos foi repetido. Por meio destes métodos, diferentes populações metastáticas com especificidade de tecido, que inclui metás- tase óssea, foram isoladas.

[0184] Uma vez que as populações metastáticas são identificadas e isoladas, uma análise transcricional de alto desempenho foi executada. Esta estratégia permitiu coletivamente identificar os genes cuja transcrição está aumentada e alguns que agem como mediadores do processo metastático em células cancerígenas com prog-nóstico insatisfatório. O envolvimento dos genes, cuja expressão está alterada, na colonização pelas células metastáticas em tecidos e órgãos específicos foi confirmado por meio de um método de seleção in vivo imparcial.

Identificação do grupo de genes enriquecidos em metástase óssea em câncer de mama ER+

[0185] Por meio da comparação dos perfis de perfil de expressão de gene das subpopulações de célula alta e deficientemente metastática, um grupo de genes, cuja superexpressão ou repressão está associada a um fenótipo osteolítico de metástase óssea, foi identificado. As lesões metastáticas osteolíticas ósseas (degradação) dife-rente das osteoblásticas (síntese), estão associadas às formas de câncer de mama metastático ósseo clinicamente mais agressivo. Os perfis de expressão associados às linhas de célula com alta capacidade metastática óssea foram obtidos com o uso de métodos padronizados. Os diferentes derivados metastáticos ósseos que se originam a partir de células mamárias ER+ foram classificados através de uma análise imparcial em relação a seu fenótipo de agressividade óssea e seu perfil de expressão. Em ambos os casos, os derivados de linha de célula metastática, BoM1 e BoM2, de-monstraram um comportamento metastático diferente daquele das células iniciais (MCF7), tanto no nível de perfil de expressão de gene assim como de maneira fenotí- pica (Figura 1A).

[0186] O grupo de genes enriquecidos para metástase óssea em câncer de mama ER+ inclui citocinas, moléculas de adesão de célula, proteases de membrana, mediadores de sinalização e fatores de transcrição.

[0187] O grupo de genes selecionado como candidatos para regular a capa-cidade de metástase óssea em câncer de mama ER+ foi, então, submetido à validação clínica em humanos. Com esta finalidade, as mudanças da expressão de gene candidato com aquelas que ocorrem nos perfis de expressão de gene de dois coortes, um a partir de tumores de mama primários e o outro a partir de metástase que incluem 560 e 58 tumores de mama e metástase, respectivamente, foram comparadas.

Identificação daqueles genes enriquecidos em metástase óssea em câncer de mama ER+ que são relevantes em metástase óssea em câncer de mama ER-

[0188] O papel dos genes enriquecidos em metástase óssea em câncer de mama ER+ no subtipo ER- foi, então, avaliado. O grupo de genes enriquecidos por metástase óssea em câncer de mama ER+ inclui o fator de transcrição de c-MAF.

Bioinformática e biologia computacional

[0189] Os pacotes R estatísticos e Bioconductor foram usados para se obter os grupos de genes enriquecidos em metástase e para verificar sua correlação clínica. As funções e estruturas específicas para o tratamento de dados foram importadas e são a partir do acesso público aberto através de www.bioconductor.org.

Exemplo 1 Seleção de genes relevantes

[0190] Uma análise foi conduzida para a seleção de genes que são expressos de uma maneira diferencial em células derivadas a partir de uma linha de célula de câncer de mama ER+ com tendência a formar metástase óssea (Figura 1A). A análise conduzida permitiu identificar 91 genes enriquecidos ou silenciados nas linhas de cé-lula derivadas a partir da linha de célula MCF7 ER+ com capacidade de converter-se em metástase em osso (Figura 1B). Os genes e funções de determinante únicas foram selecionados para um estudo mais detalhado que segue os seguintes critérios:

[0191] Correlação clínica com câncer de mama ER+ agressivo e metástase óssea.

[0192] Funções anteriormente conhecidas pela participação em processos compatíveis com um fenótipo agressivo (por exemplo, reabsorção óssea, inflamação, angiogênese),

[0193] Variações no nível de expressão entre as populações metastáticas em comparação com as populações mãe, conforme tem sido descritas acima, e

[0194] Papel central nas redes de regulação de gene e caminho de sinaliza-ção de célula

[0195] Com base nestes critérios, o fator de transcrição de c-MAF foi identifi-cado e como suas variações nos níveis de expressão predizem a recorrência de tu-mores primários de câncer de mama ER+ em osso foi confirmado.

Exemplo 2 Valor terapêutico e valor de prognóstico dos genes enriquecidos para metástase óssea independentemente do subtipo de câncer de mama

[0196] Os genes enriquecidos na metástase óssea por meio do sistema expe-rimental para a seleção de populações de células metastáticas implantadas aqui foram avaliados frente a duas bases de dados diferentes que contêm os perfis de expressão e as notas clínicas de 560 tumores de câncer de mama primários e 58 metástases de pacientes de câncer de mama. Estes tumores são representativos de todos os subti- pos de câncer de mama e local de metástase. Ambas as bases de dados e suas notas clínicas são publicamente acessíveis (GSE 2603, 2034, 12276 e 14020).

[0197] A expressão do gene em tumores primários ER+ dos genes de metás- tase óssea correlacionou-se significantemente com a recorrência, sobrevivência livre de metástase e sobrevivência (Figuras 1C e D).

[0198] Além disso, os níveis de expressão de gene c-MAF em tecido metas- tático em um corte de 58 metástases de pacientes de câncer de mama (GSE 14020) foram avaliados. Estas metástases foram isoladas do pulmão, fígado, osso e cérebro. O enriquecimento do gene de c-MAF especificamente em metástase óssea indepen-dentemente do subtipo de câncer de mama, ER+ ou ER-, ao qual o tumor ou lesão metastática (Figura 2A) pertence, foi verificado.

Exemplo 3 Validação funcional in vivo do gene metastático ósseo de c-MAF em câncer de mama ER-

[0199] O gene metastático de c-MAF que foi positivo na análise foi validado funcionalmente em um ensaio de colonização metastática óssea em um modelo de enxerto experimental de metástase de câncer de mama em camundongos. A seleção de células de câncer de mama ER- com alta capacidade para o crescimento em osso é acompanhada pela seleção de altos níveis do gene metastático de c-MAF (Figura 2B).

[0200] As aproximações executadas para validar o gene candidato para dire-cionar o processo de metástase consistiram em ensaios de ganho de função. Para este propósito, o gene de c-MAF foi expresso nas células MDA-MB-231 mãe e subse-quentemente sua capacidade para induzir a expressão de genes que contribui para a metástase (CTGF) (Figura 2C), foi avaliada.

Exemplo 4 Validação funcional in vivo dos genes metastáticos específicos de tecido

[0201] O gene metastático de c-MAF que foi positivo na análise foi funcionalmente validado em um ensaio de colonização metastática óssea em um mo-delo de enxerto experimental de metástase de câncer de mama em camundongos.

[0202] As aproximações executadas para validar o gene candidato para dire-cionar o processo de metástase consistiram em ensaios de perda de função e ganho de função. Para este propósito, o gene de c-MAF foi expresso ou silenciado nas célu-las mãe ou nos derivados de célula altamente metastática óssea e subsequentemente sua capacidade metastática óssea foi avaliada in vivo.

Ensaios de ganho de função

[0203] Para expressar o gene de c-MAF, sistemas lentivirais foram usados para induzir a expressão heteróloga do gene candidato nas células de tumor mãe e aquelas selecionadas com baixa capacidade metastática. A capacidade de indução de metástase do gene de c-MAF foi determinada por meio de técnicas para rastrear por bioluminescência as células metastáticas inoculadas no camundongo através de via intracardíaca (conforme descrito na seção “modelos de estudo experimentais”). Em todos os casos, as células controle correspondentes infectadas com vetores len- tivirais que não expressaram a proteína c-MAF foram injetadas de uma maneira para-lela em um coorte paralelo de animais como controle negativo (Figura 3B).

Ensaios de perda de função

[0204] A expressão do gene de c-MAF foi suprimida na linha de célula BoM2 altamente metastática óssea que tem altos níveis de expressão de gene de c-MAF endógenos (Figura 3A e 3C). Para este propósito, foi usado um vetor lentiviral que permite a expressão de um RNA de interferência (siRNA) com capacidade para a re-dução da expressão do gene de c-MAF por 80% em relação aos níveis presentes na linha de célula BoM2. Esta população de célula com a expressão do gene de c-MAF silenciada foi inoculada através de via intracardíaca (conforme descrito na seção “mo-delos de estudo experimentais”) em camundongos com imunossupressão, sendo que estes animais são monitorados para detectar a atividade metastática por meio da técnica de imagem por bioluminescência. Nestes experimentos, as células obtidas a partir da linha BoM2 por infecção com um vetor lentiviral que codifica um siRNA que age de modo eficaz contra a expressão de outro gene que é irrelevante para o pro-cesso metastático, foram usadas como controle negativo.

Exemplo 5 Ensaio de diferenciação de osteoclasto

[0205] As células primárias que se originam da medula óssea de um camun-dongo foram isoladas e cultivadas em cultura na presença de M-CSF (fator de estimu-lação de colônia de macrófago). Após 3 dias, as células foram tripsinizadas e semea-das em placas de 24 poços (1,5 x 104 células por poço) em três vias para cada condi-ção experimental. Para induzir a diferenciação de osteoclasto, estes precursores foram cultivados com meio de condicionamento a partir de células de câncer de mama ER+ MCF7 com ou sem superexpressão de isoforma “curta” e “longa” do gene de c- MAF, na presença do ligante RANK e M-CSF. O meio foi alterado a cada três dias e, no sétimo dia, a coloração específica de osteoclastos que consiste na detecção da enzima fosfatase ácida resistente a tartrato (TRAP) foi executada. As imagens foram obtidas por meio de microscopia óptica de feixe invertido. O número de células TRAP positivas foi determinado e foi dividido entre o número total de células por campo. Finalmente, todos os valores foram normalizados com aqueles do grupo de controle, MCF7. Conforme pode ser observado na Figura 4, o número de osteoclastos aumentou quando os precursores de osteoclasto foram colocados em contato com o meio de células de câncer de mama ER+ MCF7 que superexpressam a isoforma curta ou a isoforma longa de c-MAF.

[0206] Este ensaio permite a determinação da interação das células metastá- ticas com os componentes a partir do ambiente ou nicho metastático do osso. Os osteoclastos são responsáveis pela degradação do osso e a degradação é mostrada nas lesões metastáticas osteolíticas.

hExemplo 6 Identificação de amplificação de cromossomo na região chr16q22-q24 (inclui gene de c-MAF)

[0207] A detecção de número de alterações de cópia (CNA) por meio da aná-lise de perfil de expressão é teoricamente possível devido ao fato de que existe uma forte correlação entre as alterações genômicas e a expressão de gene anormal nas regiões genômicas afetadas (Pollack et al. 2002; PNAS; 99:12963-12968). Especifi-camente, a detecção exata de CNAs com o uso da análise de expressão de gene é possível e sua dificuldade originária do tipo de dados de expressão de partida (Hu et al. 2009 Cancer Cell, 15:9-20).

[0208] O papel dos genes enriquecidos em metástase óssea em câncer de mama ER+ tem sido avaliado. Com esta finalidade, as alterações no número de cópia de genoma nas células altamente metastáticas ósseas, BoM2, derivadas a partir da linha de célula de câncer de mama MCF7 que são geradas no laboratório das próprias pesquisas e que são caracterizadas pela expressão de altos níveis de gene de c-MAF, foram analisadas. Esta análise tem sido com base na comparação dos perfis de ex-pressão de gene das células mãe e BoM2 derivadas a partir de MCF7. As diferenças de expressão de gene observadas nas células BoM2 em comparação com as células mãe na posição das mesmas, nos tipos 23 de cromossomos presentes em células humanas, foram alinhadas e localizadas.

[0209] Deste modo, as regiões genômicas (Figura 5) têm sido identificadas, nas quais os genes cuja expressão é superexpressa ou subexpressa são descritos nas células BoM2 em comparação com as células mãe, o qual é um indicador de amplificação ou apagamento de DNA genômico (Hu et al. 2009, Cancer Cell, 15:9-20). Com esta finalidade, o software “Partek Genomic Suite 6.5” tem sido usado. Este sof-tware tem permitido a identificação daqueles genes cuja expressão é aumentada ou reduzida nas células BoM2 em comparação com as células mãe. Uma vez que estes genes são identificados, as diferenças de expressão observadas para cada gene foram descritas no local cromossômico correspondente do dito gene. A descrição gráfica destas observações tem permitido a identificação de ganho ou perda de regiões cro- mossômicas com base em uma expressão de gene reduzida ou aumentada contínua com o local cromossômico consecutivo (Figura 5). Os autores da invenção têm sido capazes de localizar estas regiões com o uso de citobandas bem conhecidas descritas acima.

[0210] Entre as regiões amplificadas de modo diferencial nas células BoM2, em comparação com as células de câncer de mama mãe ER+ MCF7, um ganho na região de cromossomo 16q22-q24, o qual inclui o local que codifica o gene de c-MAF, tem sido observado.

[0211] A razão entre as alterações no número de cópia de gene em tumores de mama e metástase em pacientes de câncer de mama tem, então, sido avaliada. Deste modo, as regiões cromossômicas com um número significante de genes associados com metástase em pacientes têm sido identificadas com o uso do modelo de razão de risco “Cox log” (HR). Os conceitos em ACE (análises de alteração no número de cópia em expressão de dados) (Hu et al. 2009, cited ad supra) têm sido seguidos, localizando regiões potenciais com variações no número de cópia. As funções do pacote “PhenoTest” R têm sido usadas. Deste modo, o “log HR” tem sido obtido para cada gene através da generalização de modelos aditivos, escolhendo-se parâmetros através de validação cruzada e a significância estatística tem sido avaliada por meio de permutação (1000 permutações) do “log HR” através de todo o genoma, e ajustando-se os valores P através de Benjamini-Hochberg para controlar a taxa de descoberta falsa (FDR) em um nível de 0,05. Somente aquelas regiões com ao menos 15 genes significantes e consecutivos têm sido identificadas (Figura 5B). A região 16q12- q24 que inclui o gene de c-MAF está entre estas regiões.

[0212] O número de cópia do gene de c-MAF foi subsequentemente caracterizado por meio da hibridação de fluorescência in situ (FISH) em células mão MCF7 e na linha de célula BoM2 caracterizada por ter alta tendência a formar metás- tase em tecido ósseo. O número de cópia de gene de IGH foi determinado simultane-amente como o controle do experimento. Os resultados mostraram que a maioria das células MCF7 estudadas tem uma razão entre o número de cópia do gene de c-MAF e o número de cópia de gene de IGF igual ou menor do que 1,5, isto é, que o número de cópia de ambos os genes é similar (Figura 6), enquanto que a maioria das células BoM2 estudadas mostrou uma razão entre o número de cópia do gene de c-MAF e o número de cópia do gene de IGF maior do que 2 (Figura 6). Estes resultados demons-tram que a aquisição do fenótipo metastático ósseo pelas células de câncer de mama é acompanhada por um aumento no número de cópia do gene de c-MAF.

Conclusões

[0213] O c-MAF é um marcador para o diagnóstico e prognóstico e um gene alvo causal no processo de metástase em câncer de mama, particularmente, em me- tástase óssea a partir do câncer de mama ER+. Esta conclusão é suportada pelos dados de validação clínica e pelos experimentos de ganho de função e perda de fun-ção que formam parte da presente invenção.

[0214] Levando em conta os resultados apresentados na presente invenção, nos quais é demonstrado que a expressão de c-MAF em tumores primários prediz um alto risco de pacientes de câncer de mama sofrerem metástase óssea, os pacientes cujos tumores contêm células que têm uma amplificação na região genômica chr16q22-q24 ou uma amplificação do gene de c-MAF, também serão suscetíveis a sofrerem um alto risco de metástase óssea. Portanto, a determinação da amplificação do gene de c-MAF ou do local 16q22-q24 é útil como um método de diagnóstico e um método de predizer a me- tástase óssea a partir de tumores de câncer de mama primários.

[0215] De modo semelhante, os experimentos da presente invenção (Exem-plos 4 e 5) sugerem que o c-MAF é um alvo adequado para o tratamento e/ou prevenção da metástase (tanto a partir de tumores ER+ como ER-). Deste modo, os inibidores de c-MAF seriam úteis para o tratamento da metástase em indivíduos com câncer de mama.

Claims

1. Uso do nível de expressão do gene c-MAF CARACTERIZADO pelo fato de que é para diagnosticar a presença e/ou risco de desenvolver metástase óssea em um indivíduo humano com câncer de mama receptor de estrogênio positivo (ER+) e compreendendo: (i) quantificar o nível de expressão do gene c-MAF em uma amostra de tecido de tumor de mama do dito indivíduo pela quantificação do ácido ribonucleico mensageiro (mRNA) do dito gene, ou de um fragmento do dito mRNA, do ácido desoxirribo- nucleico complementar (cDNA) do dito gene, ou de um fragmento do dito cDNA, ou pela quantificação dos níveis de proteína codificada pelo dito gene ou uma variante deste, e (ii) comparar o nível de expressão obtido anteriormente em (i) com o nível de expressão do dito gene em uma amostra de controle, em que se o nível de expressão do dito gene estiver aumentado em relação ao nível de expressão do dito gene na amostra de controle, então, o dito indivíduo tem um diagnóstico positivo para metástase ou uma tendência maior a desenvolver me- tástase, e em que a amostra de controle é uma amostra de tecido de tumor de câncer de mama de um indivíduo que não sofreu metástase.

2. Uso do nível de expressão do gene c-MAF CARACTERIZADO pelo fato de que é para projetar uma terapia personalizada para um indivíduo com câncer de mama ER+, compreendendo: (i) quantificar o nível de expressão do gene c-MAF em uma amostra de tecido de tumor de mama do dito indivíduo pela quantificação do ácido ribonucleico mensageiro (mRNA) do dito gene, ou de um fragmento do dito mRNA, do ácido desoxirribo- nucleico complementar (cDNA) do dito gene, ou de um fragmento do dito cDNA, ou pela quantificação dos níveis de proteína codificada pelo dito gene ou de uma variante deste, e (ii) comparar o nível de expressão obtido na etapa (i) com o nível de expressão do dito gene em uma amostra de controle, em que se o nível de expressão do gene c-MAF estiver aumentado em relação ao nível de expressão do dito gene na amostra de controle, então o dito indivíduo tem um diagnóstico positivo para metástase ou uma tendência maior a desenvolver me- tástase, e em que a amostra de controle é uma amostra de tecido de tumor de câncer de mama de um indivíduo que não sofreu metástase.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão é quantificado por meio de uma reação em cadeia da polimerase quantitativa (PCR), um arranjo de ácido desoxirribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA), western blot, técnicas imuno-histoquímicas, imunoensaio ligado por enzima (ELISA) ou um arranjo de proteína.

4. Uso do nível de amplificação de c-MAF CARACTERIZADO pelo fato de que é para diagnosticar metástase óssea em um indivíduo com câncer de mama e/ou para o prognóstico da tendência a desenvolver metástase óssea em um indivíduo com câncer de mama, que compreende: (i) quantificar o nível de amplificação do gene c-MAF em uma amostra de te-cido de tumor de mama do dito indivíduo pela quantificação do número de cópias do gene c-MAF, e (ii) comparar o nível de amplificação obtido em (i) com o nível de amplificação do dito gene em uma amostra de controle, em que se o dito gene estiver amplificado em relação ao nível de amplificação do dito gene na amostra de controle, então, o dito indivíduo tem um diagnóstico positivo para metástase ou uma tendência maior a desenvolver metástase, e em que a amostra de controle é uma amostra de tecido de tumor de câncer de mama de um indivíduo que não sofreu metástase.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a amplificação do gene c-MAF é quantificada por meio da determinação da amplificação do locus 16q22-q24.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a amplificação do gene c-MAF é quantificada por meio do uso de uma sonda específica de gene c-MAF.

7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a amplificação é quantificada por meio de hibri- dação in situ ou PCR.

8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer de mama é ER+ ou ER-.

9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a metástase óssea é metástase osteolítica.