CN114574577A - Mettl16基因及其用途 - Google Patents

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张世能
陈文颖
卢丽婷
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Abstract

本发明提供了一种胰腺癌标志物，该标志物为METTL16基因或者METTL16基因的表达产物。通过研究发现METTL16基因在胰腺癌组织中的表达水平，显著低于在正常组织中的表达表达水平，说明METTL16基因的表达水平与胰腺癌的相关性显著。METTL16基因和/或METTL16基因的表达产物是胰腺癌早期分子诊断与患病风险筛查的理想靶点，有利于改善胰腺癌诊断的及时性，提高胰腺癌诊断的特异性。METTL16基因和/或METTL16基因的表达产物作为胰腺癌无创性筛查的诊断的指标，监测胰腺癌的临床治疗效果，为胰腺癌的预防、早发现、早治疗提供了重要的临床信息，有利于改善患者生存质量，提高患者生存率。

Description

METTL16基因及其用途
技术领域
本发明涉及肿瘤分子生物学领域，具体涉及METTL16基因及其用途。
背景技术
胰腺癌是我国临床预后最差的消化道肿瘤之一，早期诊断困难，5年生存率极低，易复发。胰腺癌已经成为严重影响人们健康的潜在的恶性疾病。手术仍是胰腺癌的首选治疗方案，但由于早期诊断困难，实施根治性手术切除的患者仅约15％。同时，化疗和放疗对中晚期胰腺癌患者的疗效欠理想。胰腺癌诊治的关键在于能早期发现，并能精确的诊断，给予及时的干预。通过早期的筛查控制可显著降低胰腺癌的死亡率。
目前，胰腺癌特异性抗原CA19-9是公认为用于诊断，监测和风险预测的胰腺癌的首选肿瘤标志物。由解剖结构可知CA19-9分布于正常胎儿胰腺、胆囊、肝、肠和正常成年人胰腺、胆管上皮等处，一些疾病例如慢性胰腺炎、胃癌、结肠癌等，也会出现CA19-9水平升高的结果。CA19-9水平在不同健康个体之间也有显著差异。因此通过检测血清CA19-9水平来预测胰腺癌具有一定的假阳性率，而且用CA19-9水平来区分胰腺炎和胰腺癌是不可靠的，这时往往需要通过侵入性的穿刺活检进行确定，给患者带来极大痛苦及精神和经济负担。因此，CA19-9不具有作为胰腺癌诊断标志物的灵敏度和特异性，容易产生过度治疗等问题。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于现有的用于诊断胰腺癌的分子标志物存在灵敏度和特异性低、易产生过度治疗的缺陷，从而提供一种具有高特异性和灵敏度的胰腺癌相关的分子标志物。
为此，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种胰腺癌标志物，所述标志物为METTL16基因或者METTL16基因的表达产物。
进一步地，所述METTL16基因的表达产物包括METTL16 mRNA和/或METTL16蛋白。
本发明还提供了一种METTL16基因的表达抑制剂，所述表达抑制剂包括基于所述METTL16基因设计的siRNA和/或shRNA，优选地，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.10所示。
本发明还提供了一种METTL16基因的表达增强剂，所述表达增强剂包括基于所述METTL16基因设计的DNA核苷酸序列，优选地，所述DNA核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；优选地，所述DNA核苷酸序列由如SEQ ID NO.12所示引物和如SEQ ID NO.13所示的引物合成。
本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包括核苷酸序列如SEQ IDNO.5与SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.10所示的shRNA。
本发明还提供了一种稳定敲减METTL16基因的细胞株，所述细胞株是以胰腺癌细胞为目标细胞，通过上述所述的重组表达载体感染，获得的稳定敲减METTL16基因的胰腺癌细胞。
本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包括核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示的DNA核苷酸序列。
本发明还提供了一种过表达METTL16基因的细胞株，所述细胞株是以胰腺癌细胞为目标细胞，通过上述所述的重组表达载体感染，获得的过表达METTL16基因的胰腺癌细胞。
本发明还提供了所述的胰腺癌标志物、所述的表达抑制剂、所述的表达增强剂、所述的重组表达载体、所述的稳定敲减METTL16基因的细胞株或者所述的过表达METTL16基因的细胞株在如下(1)-(3)中至少一种中的用途；
(1)制备用于胰腺癌诊断的产品；
(2)制备用于胰腺癌预后评估的产品；
(3)制备用于筛选预防和/或治疗胰腺癌的药物的模型。
本发明还提供了上述所述的胰腺癌标志物、所述的表达增强剂、所述的重组表达载体或者所述的过表达METTL16基因的细胞株在如下(1)-(4)中至少一种中的用途；
(1)制备用于胰腺癌诊断的产品；
(2)制备用于胰腺癌预后评估的产品；
(3)制备用于预防和/或治疗胰腺癌的药物；
(4)制备用于抑制胰腺癌细胞增殖和/或迁移和/或侵扰的药物。
除非有另外说明，本发明的权利要求书和说明书的术语具有下述含义：
本发明权利要求书中的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序等检测METTL16基因表达的产品；其中RT-PCR和实时定量PCR的产品包括特异性扩增METTL16基因的引物、探针，检测METTL16 mRNA水平的引物、探针；免疫检测的产品包括与METTL16蛋白特异性结合的抗体；原位杂交的产品包括与METTL16基因的核酸序列杂交的探针；芯片包括蛋白芯片和基因芯片，其中蛋白芯片包括与METTL16蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与METTL16基因的核酸序列杂交的探针。
本发明权利要求书中的药物包括：增强METTL16基因表达或者提高METTL16蛋白活性的生物活性物质或基因治疗药物等。其中生物活性物质包括蛋白、多肽、脂类等等。基因治疗药物包括siRNA、miRNA、shRNA或者包括上述小分子的载体、细胞等等。例如，过表达METTL16基因的细胞株。
本发明权利要求书中的模型包括动物模型或者细胞模型，例如小鼠、大鼠、兔子、猪等。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明提供的胰腺癌标志物，所述胰腺癌标志物为METTL16基因和/或METTL16基因的表达产物。
本发明通过研究发现METTL16基因在胰腺癌组织中的表达水平，显著低于在正常组织中的表达表达水平，说明METTL16基因的表达水平与胰腺癌的相关性显著。METTL16基因和/或METTL16基因的表达产物是胰腺癌早期分子诊断与患病风险筛查的理想靶点，有利于改善胰腺癌诊断的及时性，提高胰腺癌诊断的特异性。METTL16基因和/或METTL16基因的表达产物作为胰腺癌无创性筛查的诊断的指标，监测胰腺癌的临床治疗效果，为胰腺癌的预防、早发现、早治疗提供了重要的临床信息，有利于改善患者生存质量，提高患者生存率。
本发明通过细胞学实验进一步验证了METTL16基因与胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的相关性，在低表达METTL16基因的胰腺癌细胞中，细胞的增殖、侵袭和转移能力增强，在过表达METTL16基因的胰腺癌细胞中，细胞的增殖、侵袭和转移能力被抑制，说明METTL16基因影响胰腺癌细胞的增殖、侵袭、转移，参与胰腺癌的发生、发展，METTL16基因能够作为胰腺癌的分子治疗靶点，为胰腺癌的临床靶向治疗以及个体化治疗提供依据。
Kaplan-Meier Plotter曲线分析METTL16基因高表达的胰腺癌患者，其生存期明显长于METTL16基因低表达的患者，说明METTL16基因的表达水平与胰腺癌患者的不良预后密切相关，METTL16基因和/或其表达产物能够作为胰腺癌的预后标志物，用于预测患者的预后情况。METTL16基因及其表达产物还能够作为胰腺癌的治疗靶点，用于制备治疗胰腺癌的药物，辅助胰腺癌的临床治疗，提高癌症治疗效果。
2、本发明提供的METTL16基因的表达抑制剂，包括siRNA和/或shRNA，siRNA和/或shRNA，尤其是所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7与SEQID NO.8或SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.10，用于基因抑制时，其干扰效果好，能够有效抑制METTL16基因的表达，能够用于制备胰腺癌模型，进而进行药物筛选。其中，shRNA由于脱靶效应低、在细胞中稳定性高，具有重要的基因治疗的应用前景。
3、本发明提供的METTL16基因的表达增强剂，基于所述METTL16基因设计的DNA核苷酸序列，尤其是所述DNA核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，用于基因增强时，其效果好，能够有效增强METTL16基因的表达，抑制肿瘤细胞的侵袭和转移，其中，shRNA由于脱靶效应低、在细胞中稳定性高，具有重要的基因治疗的应用前景。
4、本发明提供的重组表达载体，可选的为重组细胞或慢病毒颗粒，包括上述的表达增强剂，能够用于制备治疗胰腺癌的药物，用于胰腺癌的分子靶向治疗；或者，包括上述的表达抑制剂，能够用于制备特定遗传背景胰腺癌模型。
5、本发明提供的稳定敲减METTL16基因的细胞株，通过包装连接有shRNA片段的慢病毒颗粒，并利用慢病毒颗粒感染胰腺癌细胞，使shRNA序列插入到胰腺癌细胞的基因组中，转录后得到干扰RNA序列，干扰RNA序列通过靶向降解METTL16的mRNA，抑制METTL16基因表达，得到稳定敲减METTL16基因的细胞株。利用上述的细胞株，能够实现对METTL16基因功能的进一步研究，有利于揭示胰腺癌的发生、发展过程，能够用于制备胰腺癌模型，进而进行药物筛选，为胰腺癌的针对性治疗提供更多的临床应用信息。
6、本发明提供的过表达METTL16基因的细胞株，通过包装连接有目标METTL16开放编码框片段的慢病毒颗粒，并利用慢病毒颗粒感染胰腺癌细胞，使目标METTL16开放编码框序列插入到胰腺癌细胞的基因组中，转录后得到METTL16 mRNA序列，使METTL16 mRNA表达量增多，得到稳定过表达METTL16基因的细胞株，动物实验发现利用过表达METTL16基因的载体能够显著降低胰腺癌细胞的成瘤能力，可用于制备治疗胰腺癌的药物，或者联合使用其他药物(化疗药物、靶向药物或免疫药物)治疗胰腺癌。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1不同基因在胰腺癌中的表达情况(Oncomine数据库)；
图2为本发明实施例1中METTL16基因在胰腺癌关键驱动基因突变下的表达情况(TCGA-PAAD数据)。*P<0.05,***P<0.001；
图3为本发明实施例1中ALKBH5基因在胰腺癌关键驱动基因突变下的表达情况(TCGA-PAAD数据)。*P<0.05,***P<0.001；
图4为本发明实施例1中METTL16 mRNA在胰腺癌组织中的表达情况(GSE16515(A)和GSE28735(B))。T：Tumor；N：Normal。*P<0.05；
图5为本发明实施例1中ALKBH5 mRNA在胰腺癌组织中的表达情况(GSE16515(A)和GSE28735(B))。T：Tumor；N：Normal。*P<0.05；
图6为本发明实施例1中METTL16和ALKBH5蛋白在胰腺癌和癌旁组织的表达(HPA数据库)；
图7为本发明实施例2中METTL16作为胰腺癌预后分子标志物的价值。A-C和E-F来说，上方曲线为METTL16基因的高表达组(High METTL16 Grop)，下方曲线为METTL16基因的低表达组(Low METTL16 Grop)，对于D来说，两条曲线有交叉点，交叉点之后，METTL16基因的低表达组(Low METTL16 Grop)曲线位于METTL16基因的高表达组(High METTL16 Grop)曲线的上方，交叉点之前则相反；
图8为本发明实施例3中METTL16基因表达水平用于诊断胰腺癌的ROC曲线；横坐标specifity特异性，纵坐标sensitivity灵敏度；
图9为本发明实验例1中稳定敲减METTL16基因的HPAF-II细胞株和过表达METTL16基因的MIAPaCa-2细胞株中METTL16基因的表达(Relative express of METTL16)；
图10为本发明实验例2中稳定敲减METTL16基因的HPAF-II细胞株和过表达METTL16基因的MIA PaCa-2细胞株中的METTL16蛋白表达检测结果；
图11为本发明实验例2中CCK8细胞增殖实验检测结果，上图为稳定敲减APMAP基因的细胞株(sh-METTL16-1)与对照细胞株(sh-NC)的细胞增殖检测结果，下图为过表达METTL16基因的MIA PaCa-2细胞株(OE-METTL16)与对照细胞株(OE-NC)的细胞增殖检测结果；
图12为本发明实验例2提供的划痕检测结果，图A-B为稳定敲减APMAP基因的细胞株(sh-METTL16-1)与对照细胞株(sh-NC)的划痕检测结果，图B-C为过表达METTL16基因的MIA PaCa-2细胞株(OE-METTL16)与对照细胞株(OE-NC)的划痕检测结果；
图13为本发明实验例2提供的Transwell(转移小室)迁移检测结果，图A-B为稳定敲减APMAP基因的细胞株(sh-METTL16-1)与对照细胞株(sh-NC)的Transwell迁移检测结果，图B-C为过表达METTL16基因的MIA PaCa-2细胞株(OE-METTL16)与对照细胞株(OE-NC)的Transwell迁移检测结果；
图14为本发明实验例2提供的细胞侵扰检测结果，图A-B为稳定敲减APMAP基因的细胞株(sh-METTL16-1)与对照细胞株(sh-NC)的细胞侵扰检测结果，图B-C为过表达METTL16基因的MIA PaCa-2细胞株(OE-METTL16)与对照细胞株(OE-NC)的细胞侵扰检测结果；
图15为本发明实验例3处理组(OE-METTL16)和阴性对照组(OE-NC)注射时间点(data acquired time point)、小鼠与肿瘤图片、肿瘤重量(Tumor weights)、染色图片以及Ki-67阳性百分率(positive percentage of Ki-67)。
具体实施方式
以下通过具体实施例来说明本发明的实施方式，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法均采用本技术领域常规技术，除非另有说明，下述实施例中所用到的试剂和原料均可由市场购得。下述实施例中所有涉及的细胞均购自上海生命科学研究院细胞所。所有引物合成以及测序工作由上海捷瑞生物工程有限公司完成。
下述实施例中涉及的主要试剂如下所示：
METTL16抗体购自Cell Signaling Technology公司。型号#17676S。
Ki67抗体购自Abcam公司，型号：ab92742。
PrimeScriptTM RT Master Mix试剂盒，购自Takara公司，说明书编号：v202008Da，产品编号：RR036A。
Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒，购自APExBIO公司，说明书编号：无，产品编号：K1018。
实施例1
本实施例提供利用生物信息学分析，检测21种基因在胰腺癌组织(Tumor，简称T)及正常组织(Normal，简称N)中的mRNA表达水平的方法，具体内容如下所示：
从Oncomine在线数据库(https://www.oncomine.org/resource/login.html)上获取METTL3,METTL5,METTL14,METTL16,RBM15,VIRMA,WTAP,CBLL1,IGF2BP1,IGF2BP2,IGF2BP3,HNRNPC,HNRNPA2B1,YTHDC1,YTHDC2,YTHDF1,YTHDF2,YTHDF3,RBMX,FTO,ALKBH5基因在泛癌的表达情况。从癌症基因组图谱(The cancer genome atlas,TCGA)库(https://portal.gdc.cancer.gov/)下载胰腺癌(Pancreatic cancer或PancreaticAdenocarcinoma，简称PAAD)的全基因单核苷酸多态性(Single nucleotidepolymorphism，SNP)以及转录组表达数据，分析在关键驱动基因(TP53，KRAS，CDKN2A和SMAD4)全突变情况下，METTL3,METTL5,METTL14,METTL16,RBM15,VIRMA,WTAP,CBLL1,IGF2BP1,IGF2BP2,IGF2BP3,HNRNPC,HNRNPA2B1,YTHDC1,YTHDC2,YTHDF1,YTHDF2,YTHDF3,RBMX,FTO,ALKBH5基因在癌和癌旁组织中的差异表达分析。在NCBI-Gene ExpressionOmnibus(GEO)数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/？term＝)下载胰腺癌组织基因芯片数据(GSE16515和GSE28735)。在人类蛋白质数据库(Human Protein Atlas，HPA)分析METTL16和ALKBH5蛋白水平。癌组织和癌旁组织mRNA表达差异采用t检验。P<0.05视为有统计学意义。
图1显示不同的基因在泛癌中的表达存在异常。图2和图3显示在TCGA-PAAD数据中，关键驱动基因(TP53，KRAS，CDKN2A和SMAD4)全突变情况下，21种基因中只有METTL16和ALKBH5在胰腺癌(mutant)和癌旁组织(wild-type)中mRNA表达(mRNA expression,RSEM)存在差异(P<0.05)。进一步地，在胰腺癌临床标本基因芯片数据(GSE16515和GSE28735)中进行验证，图4显示METTL16的mRNA表达水平(Relative espression of METTL16)，METTL16在胰腺癌组织中均呈低表达(P<0.05)。图5显示ALKBH5的mRNA表达水平(Relativeespression of ALKBH5)ALKBH5仅在单一临床标本芯片(GSE28735)呈现低表达(P<0.05)。图6显示，在蛋白水平，通过HPA数据库发现，METTL16蛋白在胰腺癌组织中呈低表达，较ALKBH5明显。
实施例2
本实施例提供利用生物信息学分析，本实施例提供了一种METTL16基因的表达与胰腺癌的癌症预后相关性的检测方法，具体内容如下所示：
利用Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis/)数据库分析METTL16表达和胰腺癌预后的关系。Kaplan-Meier Plotter数据库中包含177个胰腺导管腺癌(PDAC或PAAD)病人的mRNA测序以及随访信息样本按每个基因表达量的均值为界分成高低表达组，得到具有风险比(HR)和对数秩p(logrank p)的生存函数曲线，生存曲线表示METTL16基因与胰腺癌(PAAD)总生存率(Overall Survival，OS)和无病生存率(DiseaseFree Survival，DFS)之间的相关性，独立临床因素的筛选分析采用单因素Cox回归分析。P<0.05视为有统计学意义。
Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis/)数据库分析提示，总体(ALL)上，METTL16与胰腺癌总体生存时间(overall survival(propertion)，OS)(LogrankP＝0.0003)(HR(high)＝0.46，P＝0.0004)呈相关性(图7A)和无病生存时间(Disease FreeSurival,DFS)(Logrank P＝0.0098)(HR(high)＝0.56，P＝0.011)(图7B)均呈相关性，其中，在病理亚组(Classicl subtype)分析中，METTL16的表达和经典型(Classicalsubtype)的OS(Logrank P＝0.0078)(HR(high)＝0.43，P＝0.0095)(图7E)和DFS(LogrankP＝0.018(HR(high)＝0.43，P＝0.021)呈相关性(图7F)，在基底型(Basal subtype)则不备统计学差异(图7C和D)，提示高表达METTL16可能与胰腺癌预后良好相关，在经典型病理类型中可能更具预后预测价值。单因素Cox回归分析提示METTL16可作为胰腺癌的保护因素(HR：0.576,95％：0.378-0.877，P＝0.01)(图7G)。METTL16基因的低表达与胰腺癌的不良预后密切相关，提示METTL16基因的表达产物能够作为胰腺癌的预后标志物，通过检测METTL16基因表达，能够用于评估胰腺癌者预后、提示患者生存时间，监测癌症治疗效果，及时对癌症的临床治疗策略进行调整，有利于进一步提高临床治疗效果，改善患者生存质量。
同样的方法进行ALKBH5预后分析，发现ALKBH5不具备预后预测功能。
实施例3
本实施例提供一种METTL16基因表达水平用于胰腺癌诊断价值的评估方法，具体内容为：将实施例2中通过UCSC XENA(https://xenabrowser.net/datapages/)下载TCGA和GTEx的TPM格式的RNAseq数据，保留有临床数据及去除重复样本，共获得179例TCGA的PAAD和171例GTEx中对应的正常组织数据。获取的胰腺癌病人数据及对应的正常组织数据通过软件进行编辑，获得ROC(receiver operator characteristic curve)曲线。
ROC曲线的绘制可以使用现有技术领域的软件或系统，比如＝MedCalc9.2.0.1医学统计软件、SPSS 9.0、R0CP0WER.SAS、DESIGNR0C.FOR、MULTIREADER_P0WER.SAS、R-studio、CREATE—ROC.SAS>GB STAT V10.0(Dynamic Microsystems,Inc.Silver Spring,MD,USA)等等。本实施例中绘制ROC曲线使用的软件为R-studio。
ROC曲线是反映真阳性率(灵敏度，又称敏感性，sensitivity)和假阳性率(特异性，specificity)连续变量的综合指标，是用构图法揭示灵敏度和特异性的相互关系。它通过设定一系列不同的分界值(阈值或临界值，cut-off value，是划分诊断试验结果正常与异常的界值)作为连续变量，从而计算出一系列灵敏度和特异性，再以灵敏度为纵坐标、特异性为横坐标绘制的曲线，曲线下面积(AUC)越大，诊断准确性越高。
图8显示METTL16基因表达水平用于诊断胰腺癌的ROC曲线，如图8所示，当cut-offvalue为3.022时，ROC曲线的曲线下面积(AUC)为0.923，CI为0.894-0.952，METTL16基因的表达用于诊断胰腺癌的灵敏度为84.9％，特异性为90.1％，阳性预测值为0.899，阴性预测值为0.851，约登指数为0.750。显示其作为癌症诊断标志物具有高特异性和高灵敏度，诊断胰腺癌的准确性高。METTL16基因的表达产物是胰腺癌早期分子诊断与患病风险筛查的理想靶点，有利于改善胰腺癌诊断的及时性，提高胰腺癌诊断的特异性。METTL16基因具有较高的诊断意义，能够为胰腺癌的预防、早期诊断和筛查提供有效信息，监测癌症治疗效果，有利于实现对胰腺癌早期患者的针对性治疗，从而改善患者生存质量，提高患者生存率。
实施例4
本实施例提供一种稳定敲减METTL16基因的细胞株的构建方法，以胰腺癌HPAF-II细胞作为目标细胞，构建稳定敲减METTL16基因的细胞株；构建过程中使用的病毒载体：hU6-MCS-CMV-puror载体，和病毒包装质粒pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体均由上海吉凯基因医学科技股份有限公司获取，其中，pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。构建方法包括以下步骤：
1、设计合成shRNA
以METTL16基因的3个转录本为分子靶标，设计的siRNA靶点，siRNA靶点包括siRNA1、siRNA2和siRNA3，如下表1所示(序列表中参见SEQ ID NO.1-3)，根据siRNA得到shRNA1、shRNA2和shRNA3，如下表2所示(序列表中参见SEQ ID NO.5-10)，shRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，shRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示，shRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示，以Si-NC作为对照，根据Si-NC得到的Sh-NC以及上述shRNA1、shRNA2和shRNA3均由金斯瑞生物科技股份有限公司合成。
表1构建慢病毒重组表达载体所需要的siRNA
名称 序列(5’-3’) 序列号
Si-NC TTCTCCGAACGTGTCACGT SEQ ID NO.4
siRNA1 GCATAGTCGTTGTCACGACAT SEQ ID NO.1
siRNA2 CCAAAGTAACGTACACTGAAT SEQ ID NO.2
siRNA3 ATCCATGACAGTCTACAACTT SEQ ID NO.3
表2构建慢病毒重组表达载体所需要的shRNA
Figure BDA0003454831890000151
2、构建慢病毒重组表达载体
(1)使用限制性内切酶AgeI和EcoRI对慢病毒载体hU6-MCS-CMV-puror进行酶切，然后连接慢病毒载体与上述带有粘性末端的双链shRNA片段，分别得到连接有shRNA1、shRNA2和shRNA3的重组表达载体shMETTL16-1、shMETTL16-2和shMETTL16-3。连接反应体系为：shRNA双链片段，1μl；酶切后载体，100-200ng；ligase buffer，2μl；T4 ligase，1μl；H2O，补齐至20μl。连接条件为：16℃过夜。
(3)将连接shRNA片段后的载体转化DH5α感受态细菌，涂布37℃的氨苄抗性的LB平板培养基，培养过夜。次日挑取单菌落接种于含5ml，100μg/ml Ampicillin(氨苄西林)抗性的LB培养液中，250rpm，37℃恒温摇床培养14小时，用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒，并用AgeI和EcoRI酶切鉴定，将酶切鉴定正确的重组克隆送测序验证，测序结果正确的质粒为构建成功的慢病毒重组表达载体。
3、慢病毒包装
(1)采用含10％胎牛血清(购自Invitrogen)的DMEM培养基(购自Invitrogen)培养胰腺癌HPAF-II细胞，细胞密度生长至约50％-60％汇合率时进行病毒的共转染。分别以重组表达载体shMETTL16-1、shMETTL16-2和shMETTL16-3中的一种，共转染的质粒包括病毒包装质粒pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体，转染使用jetprime转染试剂(购于达科为生物)。
(2)转染后更换含10％胎牛血清FBS的新鲜完全培养基，如果在当天上午进行转染，转染后6h进行换液，如果当天下午进行转染，转染后第二天早上约转染后16h进行换液。
(3)转染后48h和72h分别两次收集病毒上清液(48h收集后置换新鲜完全培养基)。在48h收毒时，将100mm培养皿中的培养基倒入50ml离心管中，注意培养皿壁不要接触离心管口，以防出现细菌污染，随后补入10ml含10％胎牛血清FBS的新鲜完全培养基，平稳置于37℃，5％CO2的恒温培养箱中继续培养。在72h收毒时，直接将100mm培养皿中的培养基倒入50ml离心管中，同样注意培养皿壁不要接触离心管口，以防出现细菌污染。
将50ml离心管中的病毒上清，4℃，3000rpm，10min，去除细胞碎片；然后收集病毒原液上清置于超速离心管中，4℃，25000rpm，离心120分钟，获得浓缩后的病毒液。
4、感染目标细胞，得到稳定敲减METTL16基因的细胞株
(1)采用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基(购自Invitrogen)培养胰腺癌HPAF-II细胞，待细胞密度生长至约60％汇合率时进行细胞感染。采用步骤3得到的病毒液感染胰腺癌HPAF-II细胞，培养72h后，荧光显微镜下进行观察，可以观测到细胞内重组表达载体的绿色荧光蛋白GFP的表达。
以未进行基因敲减的胰腺癌HPAF-II细胞(sh-NC)作为对照，其中，未进行基因敲减的胰腺癌HPAF-II细胞是在与本实施例中上述步骤的相同实验条件下，采用sh-NC代替shRNA1构建慢病毒重组表达载体，以转染sh-NC片段的病毒载体GV248进行包装、感染得到的对照细胞株。
(2)用含有终浓度为1.5μg/ml嘌呤霉素的培养基传代筛选，得到能够稳定敲减METTL16基因的细胞株，-80℃冰箱冻存备用。
实施例5
本实施例提供一种过表达METTL16基因的细胞株的构建方法，以MIA PaCa-2细胞(人胰腺癌细胞)作为目标细胞，构建过表达METTL16基因的细胞株；构建过程中使用的病毒载体GV367载体，AgeI/NheI酶切，购自上海吉凯基因化学技术有限公司。
1、构建METTL16过表达的载体
(1)设计引物METTL16-F(5’-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGCTCTGAGTAAATCAATG-3’)和METTL16-R(5’-CACACATTCCACAGGCTAGCCTAGTTAACTGCAACAAGCCTGAAAATTTG-3’)，β-actin-F(5’-GTGGCCGAGGACTTTGATTG-3’)和β-actin-R(5’-CCTGTAACAACGCATCTCATATT-3’)用于构建过表达载体，β-actin作为内参；序列表中参见SEQID NO.12-13和SEQ ID NO.14-15。
(2)提取胰腺癌细胞MIAPaCa-2的RNA，逆转录得到cDNA，以cDNA为模板，利用步骤(1)中设计的引物METTL16-F和METTL16-R扩增METTL16片段，PCR扩增的反应体系为：METTL16-F，10μM，1μl；METTL16-R，10μM，1μl；PFU聚合酶，1μl；PFU buffer(4×)，5μl；dNTPs，4μl；ddH2O，9μl；PCR扩增的反应条件为：95°保持3分钟，94°保持30秒，55°保持2分钟，72°保持20秒，30个循环，72°保持10分钟；扩增产物为1736bp(SEQ ID NO.11所示)。
(3)将步骤(2)中扩增的PCR产物纯化后使用AgeI和NheI进行酶切，同时以AgeI和NheI酶切载体Ubi-MCS-EGFP(购于上海吉凯基因化学技术有限公司)，跑胶纯化后连接载体与PCR片段，连接体系如下：
Ubi-MCS-EGFP(AgeI/NheI双酶切产物)，50ng；
PCR产物(AgeI/NheI双酶切产物)，50ng；
10*T4 ligase buffer，2μl，
T4 ligase，1μl，
ddH2O，补齐20μl。
连接条件：4℃过夜，将连接产物转化挑克隆送测序，测序结果正确的质粒为构建成功的过表达载体Ubi-MCS-EGFP-METTL16。
2、构建过表达METTL16的胰腺癌细胞株
(1)采用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基(购自Invitrogen)培养MIAPaCa-2细胞，待细胞密度生长至约60％汇合率时，转染步骤1中构建的过表达载体Ubi-MCS-EGFP-METTL16，以转染Ubi-MCS-EGFP载体的MIAPaCa-2细胞作为对照；
(2)转染后的细胞在37℃，5％CO2的恒温培养箱中继续培养，期间更换新鲜的含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，以保持细胞的正常生长；
(3)细胞培养5天后，用含有终浓度为1.5μg/ml嘌呤霉素的培养基传代筛选，得到METTL16过表达的胰腺癌细胞株。
实验例1
本实验例对实施例4中以重组表达载体shMETTL16-1构建的稳定敲减METTL16基因的细胞株(shMETTL16-1)，以重组表达载体shMETTL16-2构建的稳定敲减METTL16基因的细胞株(shMETTL16-2)和以重组表达载体shMETTL16-3构建的稳定敲减METTL16基因的细胞株(shMETTL16-3)，以及实施例5中过表达METTL16基因的细胞株(OE-METTL16)进行验证，具体方法为：蛋白免疫印迹法分别检测稳定敲减METTL16基因的HPAF-II细胞株和过表达METTL16基因的MIA PaCa-2细胞中METTL16基因的表达，具体步骤为：
A、样品裂解：RIPA裂解前，用预冷的PBS清洗细胞3次以去除残留血清，按10μl/cm2细胞生长面积加入裂解液，细胞刮刮取，4℃离心后取上清，细胞裂解物使用Bradford法测定浓度。
B、蛋白变性：取20μl离心后上清物与5×PAGE电泳上样缓冲液、DTT混合，于100℃中加热5min，样品加至12％聚丙烯酰胺凝胶(含0.5wt％SDS、7.2wt％甘氨酸和1.515wt％Tris)上样孔中。
C、电泳：设定恒压80V，电泳30min，设定恒压120V，电泳1h。
D、转膜：设定恒流200mA，转膜100min，将PAGE胶上的蛋白转印至0.45μm PVDF膜。
E、封闭：5％脱脂奶粉-PBST溶液，室温摇床封闭1h。
F、一抗(METTL16抗体)孵育：一抗于室温下摇床孵育1h。
G、洗膜：用TBS-T洗膜3次，每次10min。
H、二抗孵育：二抗于室温下摇床孵育2h。
I、洗膜：用TBS-T洗膜3次，每次10min。
J、化学发光：弗德生物ECL发光液(FD8020)A液和B液1；1混合后，均匀滴于膜上，置于Syngen G:BOX Chemi XT4曝光机进行曝光。
结果见下表，以及图9(mRNA水平)和图10(蛋白水平)所示。
表2基因相对表达情况
Figure BDA0003454831890000201
结果显示，稳定敲减METTL16基因的细胞株，即载体sh-METTL16-1、sh-METTL16-2以及sh-METTL16-3均可显著降低胰腺癌细胞株METTL16基因的表达，sh-METTL16-1最为显著，干扰效果最好。过表达载体OE-METTL16可显著增强胰腺癌细胞株METTL16基因的表达。
实验例2
本实验例对实施例4中以重组表达载体shMETTL16-1构建的稳定敲减METTL16基因的细胞株(sh-METTL16-1)，和实施例5中过表达METTL16基因的细胞株(OE-METTL16)进行验证；检测METTL16基因对胰腺癌细胞增殖，侵袭和迁移的影响，具体内容如下：
1、CCK8细胞增殖实验
A，准备细胞悬液：取对数生长期的细胞，0.02％EDTA 和0.25％胰蛋白酶消化细胞后，完全培养基中和；
B，1000×g，离心5min；
C,96孔板接种细胞：完全培养基重悬细胞，轻轻吹打使细胞分散成单个细胞，在每个孔内接种2×103个细胞/100μl体积培养基，37℃恒温、5％CO2和饱和湿度的条件下培养24h；
D，显色：在不同培养时间点(0h，24h，48h，96h)时，每孔加入100μl CCK8，CCK8溶液配制应该避光条件下进行，比例为90μl无血清培养基内加入10μl CCK8，37℃恒温、5％CO2和饱和湿度的条件下继续培养3h；
E，酶标仪比色：酶标仪设定波长为450nm，测定各个孔的吸收度值(OD值)并做好记录。以OD值为纵坐标，时间为横坐标，绘制出的曲线，即为细胞的生长曲线。
2、细胞迁移实验(划痕实验)
A，第一天，在24孔板中放入培养插件，计数后分别加入步骤1中筛选好的稳定敲减或过表达METTL16基因的细胞株，使第二天细胞能刚好长满；
B，第二天取出培养插件，插件位置处形成划痕，用PBS洗两次，加入500μl无血清的培养基。并分别在0、24h对划痕位置进行拍照；
C，利用Image J统计划痕位置空白面积，0h面积与24h面积的差值即为细胞移动面积。
3、细胞侵袭实验
A，实验前48h以2×106/皿将稳定敲减或过表达METTL16的细胞株接种于10cm培养皿。
B，胰酶消化细胞，调整细胞浓度为2×105/ml。
C，2×104和4×104个细胞(分别于200μl和400μl无血清RPMI-1640)接种于24孔小室进行侵袭实验，该小室底部为8μl孔径的膜，用以模仿基底膜上的孔隙，侵袭实验时膜上有预先包被的matrigel胶，用以模仿细胞外基质的胶原，小室下面为0.7ml含有10％FBS的RPMI-1640。
D，细胞置于常规细胞培养条件中培养48h后，用甲醇固定5min，0.5％结晶紫染色1h，用自来水清洗后，用棉签去除没有迁移和侵袭的细胞。于室温晾干后，于光学显微镜下(200X)拍照观察细胞侵袭结果。
实验结果：
图11-14分别显示稳定敲减METTL16基因的细胞株与对照细胞株(NC)的细胞增殖、细胞迁移和细胞侵扰检测结果以及过表达METTL16的细胞株(METTL16)与对照细胞株(NC)的细胞增殖、细胞迁移和细胞侵扰检测结果。
图11，CCK8实验结果显示sh-METTL16-1可显著提高HPAF-II细胞的增殖能力，同样地，在过表达体系，OE-METTL16可显著削弱MIAPaCa-2细胞的增殖能力。
图12，划痕实验结果显示采用sh-METTL16-1下调METTL16后，HPAF-II细胞迁移距离增加，提示下调METTL16后HPAF-II细胞迁移能力增强(图12A和B)。同样地，采用OE-METTL16过表达METTL16后，MIAPaCa-2细胞迁移能力削弱(图12C和D)。
图13，Transwell迁移实验结果显示采用sh-METTL16-1下调细胞METTL16后，穿膜细胞数为(445±65)个/200×高倍镜视野，sh-METTL16-NC组平均穿膜细胞数为(234±5)个/200×高倍镜视野，提示下调METTL16后HPAF-II细胞迁移能力增强(图13A和C)，同样地，上调METTL16后MIAPaCa-2细胞的侵袭能力下降(图13B和C)。
图14，Transwell侵袭实验结果显示采用sh-METTL16-1下调细胞METTL16后，穿膜细胞数为(356±97)个/200×高倍镜视野，sh-METTL16-NC组平均穿膜细胞数为(183±10)个/200×高倍镜视野，提示下调METTL16后HPAF-II细胞侵袭能力增强(图14A和C)，同样地，上调METTL16后MIAPaCa-2细胞的侵袭能力下降(图14B和C)。
由上述结果可知，METTL16基因的表达抑制胰腺癌细胞的侵袭、转移，METTL16基因参与胰腺癌的发生进展，有潜力作为临床预测胰腺癌癌侵袭转移潜能的指标，通过检测METTL16基因表达，能够用于监控胰腺癌的疾病进展，实现对胰腺癌的预后评估、治疗效果监测，为胰腺癌的诊断和靶向治疗提供有效信息，以实现癌症的个体化治疗，提高患者的生存率和生存质量，METTL16基因是胰腺癌侵袭、转移和临床进展预测的理想分子标靶。
实验例3
按照实施例5的方法制备转染有OE-METTL16的胰腺癌MIAPaCa-2细胞株和转染有OE-METTL16-NC的胰腺癌MIAPaCa-2细胞株。
取雌性Balb/c裸鼠，6只，4-6周龄，购自中山大学实验动物中心。检疫期结束后，将转染有OE-METTL16的胰腺癌MIAPaCa-2细胞株(处理组)和转染有OE-METTL16-NC的胰腺癌MIAPaCa-2细胞株(阴性对照组)分别在Balb/c裸鼠背部行皮下注射，每只分别注射5×106个细胞(5×106cells injection)，裸鼠各侧分别做标记并记录成瘤裸鼠数量和瘤体体积。实验周期为35天。实验结束后，测量瘤体长径(a)和短径(b)，体积V(cm3)＝1/2×a×b2，瘤体于10％福尔马林溶液固定，梯度酒精脱水，包埋并做组织切片，进行苏木精-伊红(HE)染色和Ki67染色。
结果见如图15所示，其中15-A为处理组和阴性对照组的肿瘤体积，15-B为处理组和阴性对照组的肿瘤重量，15-C为肿瘤组织切片染色图，15-D为肿瘤组织切片染色阳性量化结果图，处理组Balb/c裸鼠成瘤率为100％(3/3)，阴性对照组成瘤率为100％(3/3)。处理组成瘤体积为(109.4±59.34)mm3，阴性对照组成瘤体积为(1266±422.6)mm3(P<0.001)，提示处理组移植瘤体积较阴性对照组明显变小，说明OE-METTL16可显著降低胰腺癌MIAPaCa-2细胞成瘤能力。处理组瘤体行组织切片提示瘤体组织学保留了胰腺癌病理学特点，Ki-67染色提示处理组的增殖力下降(图15)。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学孙逸仙纪念医院
<120> METTL16基因及其用途
<130> ZHA202100850
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gcatagtcgt tgtcacgaca t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ccaaagtaac gtacactgaa t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
atccatgaca gtctacaact t 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
ttctccgaac gtgtcacgt 19
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
ccgggcatag tcgttgtcac gacatctcga gatgtcgtga caacgactat gctttttg 58
<210> 6
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
aattcaaaaa gcatagtcgt tgtcacgaca tctcgagatg tcgtgacaac gactatgc 58
<210> 7
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
ccggccaaag taacgtacac tgaatctcga gattcagtgt acgttacttt ggtttttg 58
<210> 8
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
aattcaaaaa ccaaagtaac gtacactgaa tctcgagatt cagtgtacgt tactttgg 58
<210> 9
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
ccggatccat gacagtctac aacttctcga gaagttgtag actgtcatgg attttttg 58
<210> 10
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
aattcaaaaa atccatgaca gtctacaact tctcgagaag ttgtagactg tcatggat 58
<210> 11
<211> 1736
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
gaggatcccc gggtaccggt cgccaccatg gctctgagta aatcaatgca tgcaagaaat 60
agatacaagg acaaacctcc tgactttgca tatctggcat ccaaatatcc agattttaag 120
cagcatgttc agataaatct gaatggaaga gtgagcctta attttaaaga ccccgaagca 180
gtcagagctc tgacgtgtac tctcctaagg gaagattttg gactttctat tgatattcca 240
ttggagagac taattcccac agttcccttg agactcaact atattcactg ggtagaagat 300
ctgatcggtc accaggattc tgacaaaagt actctccgaa gaggaattga cataggcacg 360
ggggcatctt gcatctaccc cttacttgga gcaaccttga atggctggta tttcctcgca 420
acagaagtgg atgatatgtg tttcaactat gcaaagaaaa atgtggaaca gaataactta 480
tctgatctca taaaagtggt gaaagtgcca cagaagacac tcctgatgga tgctcttaaa 540
gaagaatctg agataatcta tgacttttgc atgtgcaacc ctcccttttt tgccaatcaa 600
ttggaagcca agggagtaaa ctcacgaaat cctcgaagac ctccgcctag ttctgttaat 660
acaggaggca tcacagagat catggcagaa ggaggtgaat tagagtttgt taaaaggatc 720
atccatgaca gtctacaact taaaaaaaga ttaagatggt atagctgcat gctgggaaag 780
aaatgcagcc tggcgcctct gaaggaggag cttcgcatac aaggggttcc caaagtaacg 840
tacactgaat tctgtcaagg tcggacaatg agatgggcct tagcttggag tttttatgat 900
gatgtcacag taccatcacc accaagtaag cgaagaaaat tagagaaacc gagaaaaccc 960
ataacattcg tggtgctggc gtccgtgatg aaggaattat ccctcaaagc atcacctctg 1020
cgctcggaga cggcggaagg catagtcgtt gtcacgacat ggattgaaaa aattctcact 1080
gatttgaagg tccagcataa acgagttccc tgtggaaaag aggaagtcag ccttttccta 1140
acggccatag aaaactcctg gattcattta aggagaaaga aaagagagcg tgtgagacag 1200
ctgagagaag ttccccgagc tcctgaggac gtcattcagg ccttggaaga gaaaaagccc 1260
acccccaaag agtctggcaa tagccaagaa ctggccaggg gcccccagga gaggaccccc 1320
tgtgggcctg ctctgcggga aggcgaggct gccgctgtgg agggcccgtg cccgagccag 1380
gagtccctgt cccaggagga aaacccggaa cccacggagg atgaaaggag tgaggaaaag 1440
ggaggggtgg aggttttgga aagttgtcaa ggctctagca acggagccca ggaccaagag 1500
gcttctgagc agttcggcag cccagtggct gaaaggggga aacgtctccc aggagtggcc 1560
ggacagtacc tgtttaagtg tttgataaac gttaagaagg aggtggacga tgccttagtg 1620
gagatgcact gggttgaggg ccagaacagg gatctgatga accagctttg cacctacata 1680
cgtaaccaaa ttttcaggct tgttgcagtt aactaggcta gcctgtggaa tgtgtg 1736
<210> 12
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
gaggatcccc gggtaccggt cgccaccatg gctctgagta aatcaatg 48
<210> 13
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
cacacattcc acaggctagc ctagttaact gcaacaagcc tgaaaatttg 50
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
gtggccgagg actttgattg 20
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
cctgtaacaa cgcatctcat att 23

Claims (10)

1.一种胰腺癌标志物，其特征在于，所述标志物为METTL16基因或者METTL16基因的表达产物。
2.根据权利要求1所述的胰腺癌标志物，其特征在于，所述METTL16基因的表达产物包括METTL16 mRNA和/或METTL16蛋白。
3.一种METTL16基因的表达抑制剂，其特征在于，所述表达抑制剂包括基于所述METTL16基因设计的siRNA和/或shRNA，优选地，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.10所示。
4.一种METTL16基因的表达增强剂，其特征在于，所述表达增强剂包括基于所述METTL16基因设计的DNA核苷酸序列，优选地，所述DNA核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；优选地，所述DNA核苷酸序列由如SEQ ID NO.12所示引物和如SEQ ID NO.13所示的引物合成。
5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.10所示的shRNA。
6.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示的DNA核苷酸序列。
7.一种稳定敲减METTL16基因的细胞株，其特征在于，所述细胞株是以胰腺癌细胞为目标细胞，通过权利要求5所述的重组表达载体感染，获得的稳定敲减METTL16基因的胰腺癌细胞。
8.一种过表达METTL16基因的细胞株，其特征在于，所述细胞株是以胰腺癌细胞为目标细胞，通过权利要求6所述的重组表达载体感染，获得的过表达METTL16基因的胰腺癌细胞。
9.权利要求1或2所述的胰腺癌标志物、权利要求3所述的表达抑制剂、权利要求5所述的重组表达载体或者权利要求7所述的稳定敲减METTL16基因的细胞株在如下(1)-(3)中至少一种中的用途；
(1)制备用于胰腺癌诊断的产品；
(2)制备用于胰腺癌预后评估的产品；
(3)制备用于筛选预防和/或治疗胰腺癌的药物的模型。
10.权利要求1或2所述的胰腺癌标志物、权利要求4所述的表达增强剂、权利要求6所述的重组表达载体或者权利要求8所述的过表达METTL16基因的细胞株在如下(1)-(4)中至少一种中的用途；
(1)制备用于胰腺癌诊断的产品；
(2)制备用于胰腺癌预后评估的产品；
(3)制备用于预防和/或治疗胰腺癌的药物；
(4)制备用于抑制胰腺癌细胞增殖和/或迁移和/或侵扰的药物。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105586391A (zh) * 2014-11-12 2016-05-18 上海吉凯基因化学技术有限公司 人gtpbp4基因的用途及其相关药物
CN108192972A (zh) * 2010-10-06 2018-06-22 生物医学研究机构基金会 用于乳腺癌转移的诊断、预后和治疗的方法
CN110343700A (zh) * 2019-07-05 2019-10-18 中山大学孙逸仙纪念医院 一种xpo1基因敲除的胰腺癌细胞系及其构建方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108192972A (zh) * 2010-10-06 2018-06-22 生物医学研究机构基金会 用于乳腺癌转移的诊断、预后和治疗的方法
CN105586391A (zh) * 2014-11-12 2016-05-18 上海吉凯基因化学技术有限公司 人gtpbp4基因的用途及其相关药物
CN110343700A (zh) * 2019-07-05 2019-10-18 中山大学孙逸仙纪念医院 一种xpo1基因敲除的胰腺癌细胞系及其构建方法

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BROAD INSTITUTE: "Gene: Human METTL16 (79066)", 《GPP WEB PORTAL》 *
COVELO-MOLARES H等: "Homo sapiens methyltransferase 16, N6-methyladenosine (METTL16), mRNA", 《GENBANK》 *
F.M.XIE等: "M6A Methyltransferase METTL16 Suppresses Pancreatic Cancer Proliferation Through p21 Pathways", 《PANCREAS》 *
FEI LI等: "The N6-Methyladenosine- (m6A-) Associated Genes Act as Strong Key Biomarkers for the Prognosis of Pancreatic Adenocarcinoma", 《HINDAWI》 *
N6-METHYLADENOSINE (M6A) IN PANCREATIC CANCER: REGULATORY MECHAN: "N6-methyladenosine (m6A) in pancreatic cancer: Regulatory mechanisms and future direction", 《INT J BIOL SCI》 *
宋海飞等: "m6A甲基化在多种消化道肿瘤中的研究进展", 《现代肿瘤医学》 *
戴东军: "KRas通过N6-甲基腺嘌呤上调CAPN2促进胰腺癌细胞增殖的机制", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士)医药卫生科技辑》 *

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