BR112013005287B1 - composição, ração, produto alimentício, método para fazer uma ração, método para fazer um produto alimentício, método para fazer uma composição e método para reduzir contaminação por ocratoxina - Google Patents

Abstract

enzima amidase isolada, aditivo de ração ou alimento, material de ração ou alimento, alimento para animais ou produto alimentício, composição, método e célula ou esporo recombinante. trata-se de enzimas amidase e um aditivo de ração ou alimento que compreende a enzima amidase que pode degradar ocratoxina.

Description

“COMPOSIÇÃO, RAÇÃO, PRODUTO ALIMENTÍCIO, MÉTODO PARA FAZER UMA RAÇÃO, MÉTODO PARA FAZER UM PRODUTO ALIMENTÍCIO, MÉTODO PARA FAZER UMA COMPOSIÇÃO E MÉTODO PARA REDUZIR CONTAMINAÇÃO POR OCRATOXINA”

Campo da Invenção [001] A presente invenção refere-se a um método de desintoxicação de micotoxinas. Mais especificamente, a invenção se refere a enzimas de amidase e aditivos de rações e ou alimentos que compreendem pelo menos uma amidase para desintoxicar ocratoxina, particularmente ocratoxina A.

Antecedentes [002] As micotoxinas são metabolitos secundários tóxicos de fungos pertencentes, essencialmente, aos gêneros Aspergillus, Penicillium e Fusarium. As mesmas podem ser produzidas em uma ampla faixa de mercadorias agrícolas e sob uma diversa faixa de condições agronômicas, ecológicas e de pós-colheita ao redor do mundo.

[003] As micotoxinas podem entrar na cadeia alimentar no campo, durante armazenamento de um material de gênero alimentício ou alimento, ou em pontos posteriores na cadeia alimentar. Seu acúmulo em alimentos e rações representa uma ameaça maior à saúde humana e animal embora seu consumo de uma dieta contaminada de micotoxina possa resultar em efeitos teratogênicos, carcinogênicos e oestrogênicos ou imunossupressivos.

[004] Em 1985, a Organização Mundial de Saúde estimou que aproximadamente 25% dos grãos do mundo estavam contaminados por micotoxinas (Jelinek et al., 1989). Esse número provavelmente cresceu desde então devido a um aumento na importação global de grãos e cereais e os padrões variáveis de ambiente e clima.

[005] Atualmente, há mais de 400 micotoxinas documentadas, porém as micotoxinas de maior preocupação e consequentemente as mais

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2/104 estudadas incluem: aflatoxina, desoxinivalenol, zearalenona, fumonisina e ocratoxina.

[006] Apesar de haver muitas espécies de moldes toxigênicos, somente algumas micotoxinas são consideradas significativas aos humanos.

[007] Três gêneros de fungos, Aspergillus, Penicillium, e Fusarium são mais frequentemente envolvidos com casos de contaminação de micotoxina. A colonização de fungos, crescimento e produção de micotoxina são geralmente influenciados por uma variedade de fatores. As mais importantes das quais são temperatura e atividade de água.

[008] Em geral, em regiões quentes, as aflatoxinas são de maior preocupação. Isso se deve ao fato de que às espécies Aspergillus que produzem essas toxinas encontram condições ideais presentes em regiões tropicais. Em contraste, as espécies Fusarium e Penicillium têm temperaturas ideais inferiores e, como resultado, são adaptadas a um clima mais moderado. Consequentemente, as ocratoxinas, fumonisinas e zearalenona são produzidas em regiões que fornecem essas condições.

[009] As ocratoxinas são um grupo de micotoxinas produzidas como metabolitos secundários por diversos fungos das famílias Aspergillus ou Penicillium e são ácidos orgânicos fracos que consistem em um derivado de uma isocumarina. Há três ocratoxinas geralmente reconhecidas, designadas A, B e C. A ocratoxina A é o membro mais abundante da família de ocratoxina e, portanto, a mais comumente detectada, mas é também a mais tóxica. A ocratoxina A (ocratoxina A) é uma micotoxina nefrotóxica, teratogênica, hepatotóxica, e carcinogênica, presente em cereais e outras comidas ricas em amido. Além de cereais e produtos de cereais, a ocratoxina A é também encontrada em uma faixa de outras mercadorias alimentícias, incluindo café, cacau, vinho, cerveja, leguminosos, temperados, frutas secas, suco de uva, rins de suíno e outra carne e produtos de carne de animais não ruminantes expostos

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3/104 a produtos alimentares contaminados com essa micotoxina. Muitos países definiram limites na ocratoxina. Um nível em comida, tipicamente entre 1 e 10 ppb (partes por billhão) dependendo do tipo e qualidade dos produtos alimentícios.

Estrutura molecular da ocratoxina A [010] A produção de ocratoxina A se dá devido a uma infecção de fungos em safras, no campo durante o crescimento, em colheita, em armazenamento e em embarque sob condições ambientais favoráveis, especialmente quando as mesmas não são apropriadamente secas.

[011] A ocratoxina A é um componente estável que pode ser hidrolisado em ocratoxina α (ΟΤα) e L-fenilalanina aquecendo-se sob refluxo por 48 horas em 6 M de ácido clorídrico (Van der Merwe et al., 1965) ou com a carboxipeptidase A (Pitout, 1969). A conversão de OTA em ocratoxina α é considerada como um meio de reduzir sua toxidade embora ΟΤα seja comumente relatada como muito menos tóxica do que a OTA. Além do mais, o meio tempo de eliminação de ocratoxina α no corpo (9,6 horas) é menor que o do OTA (103 horas) (Li et al., 1997).

[012] De modo a garantir a segurança do alimento, desenvolvemse diferentes abordagens para evitar a entrada de micotoxina em vários estágios ao longo da cadeia de produção alimentar.

[013] Sabe-se desde nos anos de 1970 que a enzima digestiva

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4/104 dos mamíferos, chamada carboxipeptidase A tem capacidade de degradar OTA, mas que a eficiência dessa enzima é baixa. De fato, em animais que tem carboxipeptidase A, tais como porcos, a toxidade de OTA devido à sua presença em rações é um problema. Além do mais, foi constatado que o OTA pode, até um determinado nível, inibir a atividade de carboxipeptidase A.

[014] Antes da presente invenção, não houve revelações de soluções eficientes de enzima para degradar ocratoxinas que incluem ocratoxina A (OTA). Foram relatadas atividades de enzima além da carboxipeptidase para degradação de OTA, mas até agora, ninguém foi capaz de identificar uma proteína que mostre atividade de degradação de OTA.

[015] Sabe-se que um produto comercial de lipase chamado “Amano™ lipase” que é uma lipase crua produzida de A. niger (Companhia Amano™, Japão) tem atividade de degradação de ocratoxina.

[016] A atividade de degradação de OTA nesse produto de lipase tem sido anteriormente atribuída a uma atividade ou lipase ou protease. Por exemplo, Maria A. Stander (J. Agric. Food Chem. 2000, 48, 5.736 a 5.739) concluiu que a atividade de degradação de OTA de lipase Amano™ lipase resultou de uma lipase.

[017] Abrunhosa et al., (Biotechnology Lett., 2007, 29, 1.909 a 1.914) descreve uma preparação de enzima isolada de A. niger que tem atividade de degradação de OTA. No entanto, essa preparação de enzima não foi preparada a uma extensão em que a sequência do componente ativo pudesse ser determinada no aminoácido ou nível de DNA. Foram relatados problemas similares em outros casos (Abrunhosa et al., TOXINAS, [2010], 2, 1.078 a 1.099)

Descrição Resumida [018] A presente invenção tem base em trabalho desenvolvido pelos inventores para identificar e isolar uma enzima que tem capacidade de degradar de forma eficiente a ocratoxina, mais especificamente, a ocratoxina A (OTA).

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5/104 [019] Os inventores constataram que, ao contrário de sua hipótese inicial, a formamidase de A. niger e A. nidulans e também a formamidase que existe no produto de lipase de Amano™ não têm atividade voltada à OTA, mas, conforme esperado, tem atividade voltada à formamida.

[020] Os inventores constataram de forma surpreendente que uma proteína hipotética de aminoácido 480, referida doravante como amidase 2, que é codificada por um A. niger quadro de leitura aberto tem atividade de degradação de ocratoxina, e, particularmente, atividade de degradação de ocratoxina A.

[021] Além do mais, os inventores também constataram de forma surpreendente a amidase 2 de aminoácido 480 de comprimento máximo que compreende o terminal N ou sequência de sinal e que tem um MW de cerca de 51 kDa (denominado como amidase 2 sig) tem atividade de degradação de ocratoxina A, assim como o amidase 2 de aminoácido 438 de maduro secretado que tem um MW de cerca de 47 kDa (denominado como amidase 2 mat).

[022] Foi constatado que, na amidase 2 mat, os aminoácidos de terminal N 42 são clivados, ou seja, quando a amidase 2 é secretada no meio de cultivo, seu terminal N 42 aa é clivado à forma de amidase madura 2 (isto é, amidase 2 mat) por uma peptidase A. niger.

[023] Os inventores isolaram e clonaram o gene A. niger que codifica a enzima de amidase responsável para a degradação de ocratoxina A e identificaram sua estrutura de cristal. Os mesmos identificaram que esse gene codifica um polipeptídeo que tem a sequência de SEQ ID NO: 1 (amidase 2 sig). Os mesmos identificaram adicionalmente que essa enzima é póstraducionalmente modificada por clivagem de uma sequência de aminoácidos de terminal N 42 mature amidase madura 2 madura mostrada como SEQ ID NO: 3 [024] De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, é apresentada uma enzima isolada de amidase com capacidade de degradar

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6/104 ocratoxina. Mais particularmente, ocratoxina A [025] De acordo com um segundo aspecto da presente invenção, é apresentado um aditivo de alimento ou ração que compreende uma enzima de amidase com capacidade de degradar ocratoxina. Mais particularmente, ocratoxina A.

[026] De acordo com um terceiro aspecto da presente invenção, é apresentado um material de alimento ou ração que compreende o aditivo de ração da presente invenção.

[027] De acordo com um quarto aspecto da presente invenção, é apresentado um produto alimentício ou ração que compreende um material de ração da presente invenção.

[028] De acordo com um quinto aspecto da presente invenção, é apresentado um método para criar um aditivo de alimento ou ração que compreende misturar uma enzima de amidase com capacidade de degradar ocratoxina com pelo menos um veículo fisiologicamente aceitável.

[029] De acordo com um sexto aspecto da presente invenção, é apresentado um método de redução de contaminação de ocratoxina em um material que compreende adicionar ao dito material uma enzima de amidase com capacidade de degradar ocratoxina.

[030] De acordo com um sétimo aspecto da presente invenção, é apresentada uma composição que compreende um material contaminado com ocratoxina e uma enzima de amidase com capacidade de degradar ocratoxina.

[031] De acordo com um oitavo aspecto da presente invenção, é apresentado um método de criação de um produto alimentício ou ração que compreende adicionar a um material de alimento ou ração um aditivo de alimento ou ração, de acordo com a presente invenção.

[032] De acordo com um nono aspecto da presente invenção, é apresentado um método de aumento da taxa de crescimento e/ou saúde de um

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7/104 animal que compreender alimentar o animal com uma quantia eficaz de um alimento para animais, de acordo com a presente invenção.

[033] De acordo com um décimo aspecto da presente invenção, é apresentado o uso de uma amidase que degrada a ocratoxina na fabricação de um produto alimentício ou alimento para animais.

[034] De acordo com um décimo primeiro aspecto da presente invenção, é apresentado um produto alimentício ou ração obtenível pelos métodos da presente invenção.

[035] De acordo com um décimo segundo aspecto da presente invenção, é apresentada uma célula recombinante que compreende uma enzima de amidase com capacidade de degradar ocratoxina.

[036] Em um décimo terceiro aspecto da presente invenção, é apresentada uma enzima de amidase que compreende uma sequência de polipeptídeo que tem pelo menos 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% de identificação à SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO: 3, ou um polipeptídeo que difere de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 por uma ou várias adições, deleções e/ou substituições de aminoácido; ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que tem pelo menos 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% de identificação à SEQ ID NO:2, ou um polinucleotídeo que difere da SEQ ID NO: 2 por uma ou várias adições, deleções e/ou substituições de nucleotídeo; e em que o dito polipeptídeo não é a SEQ ID NO:1.

[037] De acordo com um décimo quarto aspecto da presente invenção, é apresentado um aditivo de alimento ou ração que compreende a peptidase enzima PEPAd (SEQ ID NO: 12) com capacidade de degradar a ocratoxina A.

[038] De acordo com um décimo quinto aspecto da presente invenção, é apresentado um material de alimento ou ração que compreende o

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8/104 aditivo de ração do décimo terceiro aspecto.

[039] De acordo com um décimo sexto aspecto da presente invenção, é apresentado um produto alimentício ou ração que compreende um material de ração do quarto aspecto.

Descrição Detalhada da Invenção [040] Na descrição que se segue, deve-se entender que qualquer um dos recursos preferenciais descritos são aplicáveis a qualquer aspecto da presente invenção a menos que explicitamente declarado de outra forma. devese entender também que quaisquer dos recursos preferenciais são previstos conforme sendo usados em combinação onde for apropriado.

[041] Deve-se entender também que os termos ocratoxina ou uma enzima de amidase com capacidade de degradar ocratoxina em realizações preferenciais referem-se à ocratoxina A ou uma enzima de amidase com capacidade de degradar ocratoxina A.

[042] Conforme usado no presente documento, o termo amidase (amidoidrolase) refere-se a uma enzima da superfamília amidoidrolase que pode hidrolisar uma amida.

[043] Os inventores isolaram e clonaram a enzima amidase 2 da A. niger responsável pela degradação de ocratoxina. Essa enzima é particularmente eficaz em degradar ocratoxina A. Foi mostrado que essa enzima é expressa por um ORF que codifica uma proteína de aminoácido A. niger480 hipotética (An14g02080, Acc No. XP_001400834) que mostra ~40% de identificação às determinadas amidases bacterianas que são bioquimicamente descaracterizadas, especialmente em relação a sua especificação de substrato.

[044] A pesquisa de banco de dados indica que essa suposta amidoidrolase (amidase 2) tem 36% de identificação de sequência de aminoácidos com determinadas dipeptidases, tais como a carboxipeptidase Sgx9355e codificada por uma sequência de DNA ambiental isolada do Sargasso

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Sea (Bioquímica 48(2009): 4567-4576). A estrutura 3D de Sgx9355e é conhecida e a mesma é um membro da superfamília amidoidrolase (AHS). O alinhamento de sequência de amidase 2 com Sgx9355e sugere que a amidase 2 é como um membro da AHS.

[045] Esse é um grupo de enzimas que tem uma diversidade notável de substrato com uma dobra estrutural de (p/a)8-cilindro(cilindro Tim). A maioria das enzimas dentro dessa superfamília catalisam a hidrólise de ligações C-O, C-N, ou P-O. Nenhum membro da superfamília foi ligado à hidrólise de OTA.

[046] Será compreendido que os termos amidase (isto é, amidoidrolase) e amidase que podem degradar ocratoxina são usados de forma intercambiável no presente documento a menos que especificamente declarado de outra forma ou seja óbvio do contexto que uma enzima diferente esteja sendo discutida.

[047] Os termos amidase e amidase que podem degradar ocratoxina A referem-se a uma enzima que podem decompor pelo menos 5%, 10%,15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% da ocratoxina A presente em uma amostra à ocratoxina a.

[048] Será evidente à pessoa versada que qualquer amidase capaz de degradar ocratoxina será adequada para uso na presente invenção. Preferencialmente, a amidase para uso em qualquer aspecto da presente invenção é uma amidase que degrada pelo menos a ocratoxina A.

[049] Preferencialmente, as enzimas de amidase, de acordo com a presente invenção, compreende pelo menos uma, preferencialmente, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, mais preferencialmente, nove dos motivos de sequência de aminoácidos:

1) x-P-G-x-x-D-x-H-x-H-x-xG, em que os dois resíduos His estão no local ativo;

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2) G-x-T;

3) G-x-x-x-G-P;

4) G-H-x-D em que o resíduo His está no local ativo;

5) D-G-x-x-x-C-x-x-x-x-R-x-x-x-R-x-x-A-x-x-I-K, em que o resíduo Lys está no local ativo

6) G-G-V-x-S-x-x-D-x-P, em que o resíduo Val está no local ativo;

7) V-x-A-H-x-x-G-x-x-G, em que os dois resíduos His estão no local ativo;

8) H-x-x-x-x-D, em que o resíduo His está no local ativo;

9) G-V-x-I-x-x-G-T-D, em que o resíduo Asp está no local ativo.

[050] Preferencialmente, os motivos são:

1) x¹-P-G-x²-x³-D-x⁴-H-x⁵-H-x⁶-x⁷-G, em que os dois resíduos His estão no local ativo;

2) G-x⁸-T;

3) G-x⁹-x¹⁰-x¹¹-G-P;

4) G-H-x¹²-D em que o resíduo His está no local ativo;

5) D-G-x¹³-x¹⁴-x¹⁵-C-x¹⁶-x¹⁷-x¹⁸-x¹⁹-R-x²⁰-x²¹ -x²²-R-x²³-x²⁴-A-x²⁵-x²⁶-

I-K, em que o resíduo Lys está no local ativo

6) G-G-V-x²⁷-S-x²⁸-x²⁹-D-x³⁰-P, em que o resíduo Val está no local ativo;

7) V-x³¹-A-H-x³²-x³³-G-x³⁴-x³⁵-G, em que os dois resíduos His estão no local ativo;

8) H-x³⁶-x³⁷-x³⁸-x³⁹-D, em que o resíduo His está no local ativo;

9) G-V-x⁴⁰-I-x⁴¹-x⁴²-G-T-D, em que o resíduo Asp está no local ativo;

em que:

x1 = l/m; x²= l/m; x³= w/i; x⁴= c/v/s/a; x⁵= qualquer aminoácido; x⁶= f/y/l; x⁷= qualquer aminoácido; x⁸= y/f; x⁹= t/a/s/v/r; x¹⁰= i/f/a; x¹¹=- qualquer

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11/104 aminoácido; x¹²= g/s; x¹³= v/e; x¹⁴= qualquer aminoácido; x¹⁵= e/d/g; x¹⁶= qualquer aminoácido; x¹⁷= qualquer aminoácido; x¹⁸= a/g/t; x¹⁹= v/a; x²⁰= qualquer aminoácido; x²¹= q/m/a; x²²= l/i/v; x²³= r/h/c; x²⁴= g/n; x²⁵= k/r/t/e/d; x²⁶= qualquer aminoácido; x²⁷=l/m/v/g; x²⁸= qualquer aminoácido; x²⁹= qualquer aminoácido; x³⁰= qualquer aminoácido; x³¹= a/s/h; x³²= c/v/a; x³³=h/q; x³⁴=k/r; x³⁵= qualquer aminoácido; x³⁶= g/v/a; x³⁷= s/t/i; x³⁸= y/f/e; x³⁹= l/a/i; x⁴⁰= qualquer aminoácido; x⁴¹= a/v; x⁴²=-l/a.

[051] Será compreendido que o termo qualquer aminoácido se refere a qualquer um dos aminoácidos G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R ou H, ou um aminoácido não natural ou derivado de aminoácido.

[052] Em uma realização mais preferencial, os motivos são:

1) l/m-P-G-l/m-w-D-c-H-x-H-f-x-G, em que os dois resíduos His estão no local ativo;

2) G-y/f-T;

3) G-t-i-x-G-P;

4) G-H-g-D em que o resíduo His está no local ativo;

5) D-G-v-x-e-C-x-x-a-v-R-x-q-l-R-r-g-A-k-x-I-K, em que o resíduo

Lys está no local ativo

6) G-G-V-l/-S-x-x-D-x-P, em que o resíduo Val está no local ativo;

7) V-a-A-H-c-h-G-k-x-G, em que os dois resíduos His estão no local ativo;

8) H-g-s-y-l-D, em que o resíduo His está no local ativo;

9) G-V-x-I-a-l-G-T-D, em que o resíduo Asp está no local ativo.

[053] Será prontamente evidente à pessoa versada que as enzimas de carboxipeptidase da técnica anterior que têm capacidade de degradar ocratoxina não compreendem nenhum dos motivos citados e não mostram homologia de sequência às amidases da presente invenção.

[054] Em uma realização preferencial, a amidase é uma amidase

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12/104 isolada substancialmente livre de outros componentes nos meios de cultivo na qual é produzida.

[055] Em uma realização preferencial adicional, a amidase é uma amidase que compreende uma estrutura distorcida de cilindro similar ao Tim que inclui um local ativo que compreende 6 resíduos de histidina, 1 resíduo de lisina e 1 resíduo de ácido aspártico, em que os resíduos de aminoácidos no local ativo que correspondem às posições H111, H113, H191, K246, H287, H289, H307 e D378 da SEQ ID NO:1 quando a estrutura terciária da amidase e a SEQ ID NO:1 são comparadas.

[056] Será compreendido pela pessoa versada que um cilindro Tim é uma dobra de proteína conservada que consiste em oito hélices α e oito filamentos β que alternam ao longo da cadeia de peptídeo. Os cilindros Tim são considerados dobra de proteínas α/β devido ao fato de que os mesmos incluem um padrão de alternação de hélices α e filamentos β em um único domínio. Em um cilindro Tim, as hélices e filamentos (geralmente 8 de cada) formam um solenoide que se curva para se fechar em um formato de rosca, topologicamente conhecido como toroide. Os filamentos β paralelos formam a parede interna da rosca, enquanto as hélices α formam a parede externa da rosca. Cada filamento β se conecta com o próximo filamento adjacente no cilindro através de um longo laço do lado direito que inclui uma das hélices.

[057] A estrutura de amidase 2 pode ser dividida em dois domínios, um domínio catalisador de núcleo e um domínio sanduíche β menor. O domínio catalisador compreende resíduos 107 a 425, que formam um cilindro similar à TIM especialmente distorcido de oito filamentos β paralelos (β5 a 7, 9 a 13) flanqueado na face externa por hélices a. Uma torção no meio do filamento β7 que ocorre no resíduo 182 divide o mesmo em dois filamentos separados, β7a e β7ό. Essa torção representa os recursos que causam a distorção do c ilindro. Embora β7a tenha somente um

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13/104 filamento de cilindro vizinho, β6, o filamento β7ό tem dois vizinhos ao qual são ligados por hidrogênio, β8 e β9. O formador representa um elemento de estrutura secundária que é fixado ao núcleo do cilindro sem ser formalmente uma parte do mesmo. A segunda causa da distorção do cilindro é a ausência de uma interação canônica de ligação por hidrogênio dos resíduos 375 a 378 diretamente a jusante de β13 com o primeiro filamento de cilindro β5 que fecharia o círculo. Desse modo, a aparência total do núcleo de domínio se assemelha especialmente a u m sanduíche de lâminas β paralelas, sendo que uma consiste em três e a outra em sete filamentos. De todas, no total 13 hélices (12 α e 1 g) do domínio catalisador, aquelas que seguem diretamente os filamentos de cilindros e β8 podem ser determinados como hélices de cilindros, enquanto as quatro hélices remanescentes representam elementos adicionais de estrutura secundária que revestem o topo e o fundo do cilindro.

[058] O domínio em sanduíche β compreende resíduos tanto dos terminais N quanto dos terminais C (43 a 106, 426 a 480). Os três filamentos formados pelos resíduos de terminal C (β14 a 16) são parte da maior das duas lâminas. Dos quatro filamentos formados pelos resíduos de terminal N, β3 pertence à lâmina menor, enquanto os filamentos longos e acentuadamente tortos β1, β2 e β4 contribuem para a formação de ambas as lâminas. Somente β1 e β4 são paralelos um ao outro. As curvas helicoidais γ16 e γ17 são inseridas entre β 14 e β15 e empacotadas de forma desfavorável o domínio catalisador. As hélices γ1 e α2 in seridas entre β3 e β4 apontam na direção oposta e são expostas à solvente.

[059] Será compreendido pela pessoa versada que a estrutura terciária de uma dada amidase pode ser claramente comparada à estrutura terciária de SEQ ID NO:1 que tem coordenadas mostradas na Figura 25 que usam pacotes de softwares padrão com seus parâmetros padronizados, por

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14/104 exemplo, PyMOL (www.Pymol.org).

[060] Será ainda prontamente evidente à pessoa versada que as enzimas de carboxipeptidase da técnica anterior que têm capacidade de degradar ocratoxina não compreendem uma estrutura similar ao cilindro TIM que inclui os resíduos especificados no local ativo.

[061] Em uma realização, a amidase é uma enzima de EC 3.5.1.X, de acordo com as Recomendações do Comitê de Nomenclatura da União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUBMB) em que X é um número de designação fornecido pelo Comitê.

[062] Será compreendido pela pessoa versada na técnica que a carboxipeptidase A e carboxipeptidase Y da técnica anterior são designadas em EC 3.4.17.1 e 3.4.16.5 respectivamente.

[063] Em uma realização preferencial, a amidase é aquela que degrada ocratoxina A quando incubada em f3 a 9 e 21 a 40°C.

[064] Será evidente que a habilidade de uma enzima de amidase para degradar ocratoxina A pode ser determinada com o uso do ensaio de degradação de OTA descrito na seção de método abaixo.

[065] As amidases adequadas compreendem aquelas dentre Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Talaromyces stipitatus, Neurospora crassa, Streptomyces, por exemplo, S. roseosporus, Thermotoga lettingae, Salinispora arenicola, Glomerella graminicola, Metarhizium anisopliae e Aspergillus oryzae mostradas como SEQ ID NO: 1, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14 e 15 respectivamente ou uma sequência que tem pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% de identificação a qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 1, 3, 5 a 11, 13, 14 ou 15.

[066] Nas realizações preferenciais da presente invenção, a enzima de amidase para uso nos aditivos, alimentos, gêneros alimentícios, usos e métodos da presente invenção compreende um polipeptídeo que tem a

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15/104 sequência de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, ou uma sequência que tem pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% de identificação à SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, ou um polipeptídeo que difere de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 por uma ou várias adições, deleções e/ou substituições de aminoácido; ou um polipeptídeo produzido por expressão de um polinucleotídeo que compreende a SEQ ID NO: 2 ou um polinucleotídeo que tem pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% de identificação à SEQ ID NO: 2, ou um polinucleotídeo que difere da SEQ ID NO: 2 por uma ou várias adições, deleções e/ou substituições de nucleotídeo; ou uma sequência que hibridiza sob condições estringentes com o complemento da SEQ ID NO:2, ou uma sequência que tem pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identificação à mesma.

[067] Em realizações preferenciais adicionais, a enzima, de acordo com a presente invenção, catalisa a ruptura de ligação química de C-N, C-O ou P-O, mais Preferencialmente, C-N.

[068] Será evidente à pessoa versada que as variantes de amidase 2 de comprimento total podem ser feitas com o uso de qualquer técnica conhecida na técnica. As variantes mais estáveis resistentes à clivagem do terminal N ou da sequência de sinal podem ser produzidas realizando-se mutação das ligações de peptídeos responsáveis pela protease na sequência de peptídeos.

[069] Por exemplo, as mutações podem ser realizadas em um ou mais dos seguintes 71 locais da sequência de amidase de 2.480 aa mostrada na SEQ ID NO: 1. Essas podem alterar a sensibilidade à hidrólise por peptidases de sinal, peptidases secretadas pelo organismo hospedeiro em seu meio e a pepsina:

31 32 33 34 42 55 56 56 64 69 70 78 79 107 114 127 128 139

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146 147 156 184 185 194 195 197 202 203 220 236 262 264 269 270 304 317

318 325 335 336 336 337 343 344 351 352 354 355 359 360 374 375 386 387

388 389 390 391 400 412 420 424 425 435 436 440 446 461 462 462 480;

As mutações nos seguintes 44 locais podem alterar a resistência à tripsina:

4 36 48 66 75 88 89 92 99 138 141 155 166 231 232 235 239 240

243 246 256 271 279 282 291 299 303 320 322 330 346 351 361 368 395 405 426 445 451 458 461 464 476;

As mutações n 90 locais podem alterar a resistência à quimiotripsina:

11 16 19 23 32 34 39 53 56 57 65 70 79 90 91 98 103 107108

112 113 114 120 121 124 128 139 144 147 151 154 157 160 179 185 191195

203 206 209 215 216 221 236 248 254 262 265 270 287 289 295 305 307310

316 318 319 325 326 336 337 344 349 352 355 359 360 363 375 387 389391

398 401 413 421 425 429 436 441 447 455 457 462 463 471 479 480.

[070] Deve-se entender também que o polipeptídeo de amidase 2 de 480 aa ou suas variantes podem ser glicosilada de N e /ou O em qualquer de seus resíduos de asparagina (Asn), serina (Ser) e treonina (Thr) de modo a aprimorar a solubilidade e estabilidade térmica.

[071] Será compreendido que, conforme definido no presente documento, o termo condições estringentes se refere à lavagem a 50^oC e 0,2xSSC {1xSSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M, citrato de Na₃ pH 7,0}.

[072] Será compreendido que essas condições podem também ser altas condições estringentes que são definidas no presente documento conforme lavagem a 65^oC e 0,1xSSC {1xSSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M citrato de Na₃ pH 7,0}.

[073] Em outra realização preferencial, a enzima de amidase é produzida por expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo

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17/104 que tem uma sequência de aminoácidos que compreende a SEQ ID NO: 1,3, 5-11, 13, 14 ou 15, ou uma sequência que tem pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% de identificação à mesma, ou um polipeptídeo que difere da SEQ ID NO: 1, 3, 5 a 11, 13, 14 ou 15 por uma ou várias adições, deleções e/ou substituições de aminoácido.

[074] Mais preferencialmente, a amidase é codificada por um polinucleotídeo selecionado dentre:

a) um polinucleotídeo que compreende SEQ ID NO: 2 ou uma sequência que tem pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% de identificação à mesma, ou um polinucleotídeo que difere da SEQ ID NO: 2 por uma ou várias adições, deleções e/ou substituições de nucleotídeo;

b) um polinucleotídeo que difere de SEQ ID NO: 2 devido à degeneração do código genético;

c) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes com o complemento de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência que tem pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% de identificação à mesma, ou um polinucleotídeo que difere do complemento de SEQ ID NO: 2 por uma ou várias adições, deleções e/ou substituições de nucleotídeo.

[075] Em outra realização preferencial, é apresentado um vector que compreende um polinucleotídeo que codifica a enzima de amidase que degrada ocratoxina A para uso na presente invenção.

[076] Será evidente à pessoa versada que o vector pode ser qualquer vetor de expressão adequado e que a escolha do vector pode variar dependendo do tipo de célula no qual o vector deve ser inserido. Os Vetores adequados incluem pGAPT-PG, pRAX1, pGAMD e pGPT-pyrG1.

[077] Em uma realização preferencial adicional, o vetor é comprimido em uma célula. Em uma realização adicional, a célula é um esporo.

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18/104 [078] Será compreendido que, conforme usado no presente documento, o termo esporo se refere a um esporo fúngico ou bacteriano, endoesporo ou exoesporo.

[079] A célula, de acordo com a presente invenção, pode ser qualquer célula adequada. Mais preferencialmente, qualquer célula bacteriana, fúngica ou vegetal. Ainda mais preferencialmente, a célula é selecionada dentre E. coli, Streptomyces, Hansenula, Trichoderma fparticularmente T. reesei), Bacillus, Lactobacillus, Aspergillus (particularmente A. niger), uma célula vegetal e/ou esporos de Bacillus, Trichoderma, ou Aspergillus.

[080] Em uma realização mais preferencial, é apresentada uma célula ou esporo recombinante que compreende um polinucleotídeo que codifica uma enzima de amidase que degrada ocratoxina, preferencialmente, ocratoxina A para uso na presente invenção.

[081] Em realizações preferenciais adicionais, a enzima de amidase para uso na presente invenção é recombinante.

[082] Em um aspecto preferencial da presente invenção é apresentado um aditivo de alimento ou ração que compreende uma enzima de amidase que tem capacidade de degradar ocratoxina.

[083] Preferencialmente, a enzima de amidase degradará pelo menos a ocratoxina A.

[084] Mais preferencialmente, a enzima de amidase também degradará pelo menos uma outra ocratoxina, mais preferencialmente, pelo menos ocratoxina B.

[085] Em uma realização adicional, a enzima também degradará pelo menos um derivado de ocratoxina além da ocratoxina B e ocratoxina C, e/ou pelo menos um alcaloide de ergot.

[086] Será compreendido que alcaloides de ergot são compostos que contêm ligações de amida e incluem, por exemplo, ergomilhoina,

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19/104 ergomilhoinina, ergocristina, ergocristinina, ergocriptina, ergocriptinina, ergometrina, ergosina, ergotamina e ergotaminina. Esses compostos são tóxicos aos organismos vivos, incluindo humanos e animais de produção.

[087] Será evidente à pessoa versada que esse aditivo de alimento ou ração pode ser adicionado a um material de alimento ou ração contaminado com ocratoxina de modo a reduzir o nível da toxina presente na comida ou ração consumidos por um animal. A ocratoxina A é conhecida por ser um importante contaminante de cereais e outros alimentos ricos em amido assim como, por exemplo, café, cacau, vinho, cerveja, leguminosas, especiarias, frutas secas, suco de uva, leite, produtos lácteos ou de carne de animais não ruminantes. A ocratoxina A é um composto nefrotóxico, teratogênico, hepatotóxico e carcinogênico que, se presente mesmo em baixos níveis, pode ser prejudicial.

[088] Em uma realização mais preferencial, o aditivo é um aditivo de ração.

[089] Em realizações preferenciais, o aditivo de alimento ou ração compreende a amidase em um nível de pelo menos 0,001 g/kg, pelo menos 0,01 g/kg, pelo menos 0,1 g/kg, pelo menos 1 g/kg, pelo menos 5 g/kg, pelo menos 7,5 g/kg, pelo menos 10,0 g/kg, pelo menos 15,0 g/kg, pelo menos 20,0 g/kg, pelo menos 25,0 g/kg. Preferencialmente, o aditivo de alimento ou ração compreende a amidase em um nível tal que, quando adicionado a um material de alimento ou ração, o material de ração compreenda a amidase em uma faixa de 1 a 500 mg/kg, 1 a 100 mg/kg, mais Preferencialmente, 2 a 50 mg/kg ou 2 a 10 mg/kg.

[090] Em realizações preferenciais da presente invenção, a amidase podem hidrolisar pelo menos 10, 20, 50, 100, 200, 300, 500, 700, 900, 1000 nanomoles OTA por minuto por mg proteína em pH 7,0 e 40°C quando o OTA está presente em uma concentração de 1 pg/ml.

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20/104 [091] Mais preferencialmente, o aditivo de alimento ou ração da presente invenção compreende uma célula recombinante com capacidade de expressar uma enzima de amidase com capacidade de degradar ocratoxina. Mais preferencialmente, a enzima de amidase tem capacidade de degradar pelo menos a ocratoxina A.

[092] Ainda mais preferencialmente, a enzima de amidase também tem capacidade de degradar pelo menos um derivado adicional de ocratoxina ou ocratoxina e/ou pelo menos um alcaloide de ergot, mais preferencialmente, ocratoxina B.

[093] Mais preferencialmente, a amidase compreende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou qualquer uma dentre as SEQ ID NO: 5-11, 13, 14 ou 15 ou uma sequência que tem pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% de identificação a qualquer uma dentre as SEQ ID NOs:1, 3, 5 a 11, 13, 14 ou 15.

[094] Em outra realização preferencial, a célula é uma célula ou esporo Aspergillus. Será evidente à pessoa versada que a célula Aspergillus pode ser uma célula viva, uma célula morta ou uma célula rompida.

[095] Em realizações preferenciais, a célula recombinante é uma célula A. niger. Mais preferencialmente, a célula aumentou a atividade de degradação de OTA quando comparada a uma célula não recombinante da mesma espécie.

[096] Será compreendido pela pessoa versada na técnica que a enzima de amidase com capacidade de degradar ocratoxina A para uso na presente invenção pode ser apresentada independentemente tanto como composições liquidas como sólidas/granuladas.

[097] Preferencialmente, quando a dita enzima está em forma líquida, a dita enzima é secretada na cultura de sequência de meio de uma célula que compreende a dita enzima. Preferencialmente, o dito meio é livre de célula

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21/104 (isto é, a(s) célula(s) foram separadas do meio). Preferencialmente, o dito meio é concentrado. Será compreendido que o meio pode ser granulado para prover uma composição de enzima sólida.

[098] Deve-se entender também que o aditivo de alimento ou ração, de acordo com a presente invenção, pode ser apresentado na forma de uma solução ou como um sólido - dependendo do uso e/ou do modo de aplicação e/ou do modo de administração.

[099] Em uma realização adicional, o aditivo pode ser usado para pré-tratar um material que será usado como alimento ou gênero alimentício.

[0100] Por exemplo, a amidase pode ser usada para tratar líquidos tais como os produzidos como subprodutos das usinas de etanol. Nesse caso, o aditivo será adicionado a uma ração de fermentação líquida de modo a degradar os contaminantes de ocratoxina A encontrados no meio usado para cultivar levedura ou micróbios para produção de etanol.

[0101] Será compreendido que a ração pode ser subsequentemente seca e alimentada aos animais.

[0102] Em uma realização alternativa, o aditivo pode ser adicionado ao leite, por exemplo, leite de vaca, contaminado com OTA.

[0103]Em uma realização, o aditivo de alimento ou ração, de acordo com a presente invenção, está em uma formulação líquida adequada para consumo, preferencialmente, tal composição líquida compreende adicionalmente pelo menos um dentre um tampão, um sal, sorbitol e/ ou glicerol.

[0104] Preferencialmente, o aditivo de alimento ou ração compreende adicionalmente pelo menos um veículo fisiologicamente aceitável.

[0105] O veículo fisiologicamente aceitável é preferencialmente selecionado de pelo menos um dentre maltodextrina, limestona (carbonato de cálcio), ciclodextrina, trigo ou um componente de trigo, sacarose, amido,

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Na2SO4, talco, PVA e misturas dos mesmos.

[0106] Em uma realização adicional, o aditivo de alimento ou ração pode compreender adicionalmente um quelante de íon de metal. O quelante de íon de metal pode ser selecionado de EDTA ou ácido cítrico.

[0107] Em uma realização, a enzima de amidase é seca no veículo fisiologicamente aceitável.

[0108] Em uma realização, o aditivo de alimento ou ração é granulado ou cogranulado com outras enzimas.

[0109] Em realizações preferenciais, a amidase para uso na presente invenção que pode ser usada é a combinação de uma ou mais enzimas adicionais. Em realizações preferenciais, as uma ou mais enzimas adicionais são selecionadas do grupo que consiste nos envolvidos na degradação proteica que inclui carboxipeptidases, preferencialmente, carboxipeptidase A, carboxipeptidase Y, proteases de ácido aspártico de A. nigerde PEPAa, PEPAb, PEPAc e PEPAd, elastase, amino peptidases, pepsina ou semelhantes à pepsina, proteases de tripsina ou semelhantes à tripsina e proteases bacterianas que incluem subtilisina e suas variantes, e daqueles envolvidos no metabolismo de amido, degradação de fibra, metabolismo de lipídio, proteínas ou enzimas envolvidas no metabolismo de glicogênio, enzimas que degradam outros contaminantes, esterases de acetila, amilases, arabinases, arabinofuranosidases, exo- e endo-peptidases, catalases, celulases, chitinases, quimosina, cutinase, desoxirribonucleases, epimerases, esterases, formamidase, -galactosidases, galactosidases, por exemplo, α ou β, exo-glucanases, glucano lisases, endo-glucanases, glucoamilases, glicose oxidases, -glicosidases, glicosidases, por exemplo, α ou β , glicuronidases, hemicelulases, hidrolases, invertases, isomerases, lacases, oxidases de fenol, lipase, liases, manosidases, oxidases, oxidorredutases, pectinase, liases de pectato, esterases de acetila de pectina, depolimerases de pectina, peptidase,

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23/104 esterases de metila de pectina, enzimas pectinolíticas, peroxidases, fenoloxidases, fitase, poligalacturonases, ramno-galacturonases, ribonucleases, taumatina, transferases, proteínas de transporte, transglutaminases, xilanases, hexose oxidase (D-hexose: O2-oxidorredutase, EC 1.1.3.5), fosfatases de ácido e/ou outros ou combinações dos mesmos. Esses incluem enzimas que, por exemplo, modulam a viscosidade da composição ou gênero alimentício.

[0110] Em uma realização particularmente preferencial, a enzima é usada em combinação com carboxipeptidase A.

[0111] Em uma realização preferencial adicional, a enzima é usada em combinação com protease de PEPAd.

[0112] Em uma realização adicional, a amidase pode ser usada em combinação com pelo menos uma dentre uma enzima de desintoxicação selecionada do grupo que consiste em uma enzima de degradação de micotoxina, por exemplo, aflatoxina detoxizima, zearalenona esterases, lactonases de zearalenona, carboxilesterases de fumonisina, aminotransferases de fumonisina, oxidases de amina de aminopoliol, hidrolases de expóxido de desoxinivalenol, um micro-organismo de degradação de micotoxina, por exemplo, Bacillus subtilis, B. licheniformis, Lactobacillus ou um absorvente (isto é, ligantes de mictoxina) que inclui pelo menos um polímero, por exemplo, paredes celulares microbianas ou um material inorgânico, tal como bentonita.

[0113] Será compreendido que o aditivo de ração pode ser para qualquer animal adequado. Em uma realização preferencial, o animal é um animal monogástrico, por exemplo, aves, suínos, peixes, mariscos e crustáceos, por exemplo, camarões, animais de estimação, tais como, por exemplo, gatos ou cães. em um exemplo preferencial alternativo, o animal é um ruminante selecionado de, por exemplo, vacas ou outros bovinos, ovelhas, cabras, camelos, veados, lhamas, antílopes, alpacas ou gnus.

[0114] Será óbvio à pessoa versada que o aditivo de alimento ou

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24/104 ração, de acordo com a presente invenção, pode compreender também outros componentes tais como agentes estabilizadores e/ou agentes de volume e/ou outras enzimas.

[0115] Preferencialmente, o aditivo de alimento ou ração, de acordo com a presente invenção, será termicamente estável ao tratamento térmico de até cerca de 70°C; até cerca de 80°C; ou até cerca de 95°C. O tratamento térmico pode ser realizado for até cerca de 0,5 minuto; até cerca de 5 minutos; até cerca de 10 minutos; até cerca de 30 minutos; até cerca de 60 minutos. O termo termicamente estável significa que pelo menos cerca de 75% dos componentes de enzima que estiveram presentes/ativos no aditivo antes do aquecimento à temperatura especificada ainda estão presentes/ativos após o mesmo resfriar à temperatura ambiente. Preferencialmente, pelo menos cerca de 80% dos componentes de enzima que estiveram presentes e ativos no aditivo antes do aquecimento à temperatura especificada ainda estão presentes e ativos após o mesmo resfriar à temperatura ambiente.

[0116] O aditivo de alimento ou ração, de acordo com a presente invenção, pode ter uma vida útil maior que cerca de cerca de 30 semanas; maior que cerca de 40 semanas; maior que cerca de 50 semanas; maior que cerca de 1 ano; maior que cerca de 1,5 ano. A vida útil significa que pelo menos cerca de 80% dos componentes de enzima que estiveram presentes e ativos no aditivo quando o mesmo foi preparado ainda estão presentes e ativos.

[0117] Preferencialmente, o método de preparação de um aditivo de alimento ou ração, de acordo com a presente invenção, compreende uma etapa de mistura que compreende misturar a enzima de amidase que degrada ocratoxina, preferencialmente, a ocratoxina A, opcionalmente com pelo menos um veículo fisiologicamente aceitável.

[0118] Mais preferencialmente, a enzima de amidase também tem capacidade de degradar pelo menos um derivado ocratoxina ou ocratoxina

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25/104 adicional e/ou pelo menos um alcalóide de ergot, mais preferencialmente, ocratoxina B.

[0119] Em uma realização particularmente preferencial o aditivo de alimento ou ração é homogeneizado para produzir um pó.

[0120] Em uma realização preferencial alternativa, o aditivo de alimento ou ração é formulado em grânulos, conforme descrito no Documento de Patente WO2007/044968 (denominado como Grânulos TPT) incorporados no presente documento por referência.

[0121] Em outra realização preferencial, quando o aditivo de alimento ou ração é formulado em grânulos, os grânulos compreendem um sal de barreira hidratada revestido sobre o núcleo da proteína. A vantagem de tal revestimento de sal é aperfeiçoada em tolerância térmica, aperfeiçoada em estabilidade de armazenamento e proteção contra outros aditivos de alimento ou ração que tem de outra forma efeito adverso na enzima.

[0122] Preferencialmente, o sal usado para o revestimento de sal tem uma atividade de água menor que 0,25 ou umidade constante maior que 60% a 20°C.

[0123] Preferencialmente, o revestimento de sal compreende um Na2SO4.

[0124] O método de preparação de um aditivo de alimento ou ração pode também compreender a etapa adicional de peletizar o pó. O pó pode ser misturado a outros componentes conhecidos na técnica. O pó, ou mistura que compreende o pó, pode ser forçado através de um cunho e os filamentos resultantes são cortados em pelotas adequadas de comprimento variável.

[0125] Opcionalmente, a etapa de peletização pode incluir um tratamento de vapor, ou estágio de condicionamento, anterior à formação das pelotas. A mistura que compreende o pó pode ser colocada em um condicionador, por exemplo, um misturador com injeção de vapor. A mistura é

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26/104 aquecida no condicionador até uma temperatura especificada, tal como de 60 a 100°C, sendo que as temperaturas típicas seriam de 70°C, 85°C, 90°C ou 95°C. O tempo de residência pode ser variável de segundos a minutos e até mesmo horas. Tais como 5 segundos, 10 segundos, 15 segundos, 30 segundos, 1 minutos 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos e 1 hora.

[0126] Em um aspecto adicional, é apresentado um material de alimento ou ração que compreende o aditivo de alimento ou ração da presente invenção. Será compreendido que o aditivo de alimento ou ração da presente invenção é adequado para a adição a qualquer material de alimento ou ração apropriado.

[0127] Será óbvio à pessoa versada que o aditivo de alimento ou ração pode ser adicionado a qualquer material de alimento ou ração, como uma etapa de precaução. De forma alternativa, o aditivo de alimento ou ração pode ser adicionado aos materiais de alimento ou ração que são conhecidos por serem propensos à ocratoxina, preferencialmente, a ocratoxina A, contaminação ou aos materiais de alimento ou ração que foram mostrados ao serem contaminados com ocratoxina, preferencialmente, a ocratoxina A. será também evidente à pessoa versada que a presença de ocratoxina, preferencialmente, ocratoxina A pode ser identificada por quaisquer meios adequados, por exemplo, HPLC, ELISA ou através do uso de tiras de detecção de ocratoxina comercialmente disponíveis (Helica Biosystems, Inc., Fullerton CA).

[0128] Conforme usado no presente documento, o termo material de ração se refere ao material básico de ração a ser consumido por um animal. Deve-se entender também que o mesmo pode compreender, por exemplo, pelo menos um ou mais grãos não processados, e/ou plantas processadas e/ou material animal, tal como farinha de feijão de soja ou farinha de ossos.

[0129] Em algumas realizações, o material de ração compreenderá um ou mais dos seguintes componentes: a) cereais, tais como pequenos grãos

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27/104 (por exemplo, trigo, cevada, centeio, aveia e combinações dos mesmos) e/ou grãos grandes tal como milho ou sorgo; b) subprodutos de cereais, tal como farinha de glúten de milho, Grãos Secos de Destilaria com Solúveis (DDGS), farelo de trigo, sêmea de trigo, farelo fino de trigo, farelo de arroz, casca de arroz, casca de aveia, palmiste e polpa cítrica; c) silagem tal como silagem de milho;

d) proteína obtida a partir de fontes tal como soja, girassol, amendoim, tremoço, ervilhas, feijão-fava, algodão, canola, farinha de peixe, proteína de plasma seco, farinha de carne e ossos, proteína de batata, soro de leite, copra, gergelim; e) óleos e gorduras obtidos a partir de fontes vegetais e animais; f) minerais e vitaminas.

[0130] Conforme usado no presente documento, o termo ração se refere a um material de ração ao qual um ou mais aditivos de ração tenham sido adicionados. De acordo com outro aspecto, é apresentada uma ração que compreende o material de ração da presente invenção.

[0131] Será compreendido pela pessoa versada na técnica que diferentes animais exigem diferentes alimentações, e inclusive o mesmo animal pode exigir diferentes alimentações, dependendo do propósito para o qual o animal é criado.

[0132] Preferencialmente, a ração pode compreender materiais de ração que compreendem milho (maize) ou milho, trigo, cevada, triticale, centeio, arroz, tapioca, sorgo, e/ ou qualquer dos subprodutos, assim como componentes ricos em proteínas como meio de feijão de soja, farinha de semente de colza, farinha de canola, farinha de semente de algodão, meio de semente de girassol, farinhas de subproduto de animal e misturas dos mesmos. Mais preferencialmente, a ração pode compreender gorduras animais e / ou óleos vegetais.

[0133] Opcionalmente, a ração pode também conter minerais adicionais tais como, por exemplo, cálcio e/ou vitaminas adicionais.

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28/104 [0134] Conforme usado no presente documento, o termo material de alimento se refere a um alimento básico a ser consumido por um humano. Será compreendido que esse pode compreender grão, planta ou material animal.

[0135] Em algumas realizações, o material de alimento pode compreender um ou mais dentre um cereal ou produto de cereal, café, cacau, vinho, cerveja, leguminosas, especiarias, frutas secas, suco de uva, leite, carne ou produtos de carne.

[0136] Conforme usado no presente documento, o termo “produtos alimentícios” se refere a um material de alimento ao qual um ou mais aditivos de alimento tenham sido adicionados. De acordo com outro aspecto, é apresentado um produto alimentício que compreende o material de alimento da presente invenção.

[0137] Em realizações preferenciais, os produtos alimentícios ou rações compreendem amidase em um nível de cerca de 0,001 mg - 10 g/kg, 0,01 mg a 10 g/kg, 0,1 mg a 10 g/kg, 0,1 mg a 5 g/kg, 1 mg a 5 g/kg, 0,5 g a 1 g/kg alimento/alimento para animais.

[0138] Será prontamente evidente à pessoa versada que, de modo que o aditivo de alimento ou ração da presente invenção forneça as vantagens reivindicadas o alimento/ração precisa ser um alimento/ração contaminado com ocratoxina, preferencialmente, ocratoxina A.

[0139] Em outro aspecto, é apresentado um método para produzir um alimento para animais. A ração é tipicamente produzida em fábricas de alimentos para animais nos quais as matérias primas são primeiro trituradas a um tamanho de partícula adequado e então misturadas com aditivos apropriados. A ração pode então ser produzida como uma massa ou pelotas; sendo que a última envolve tipicamente um método pelo qual a temperatura é elevada a um nível almejado e então o gênero alimentício é passado através de um cunho para produzir pelotas de um tamanho particular. As pelotas podem

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29/104 resfriar. Subsequentemente, os aditivos líquidos, tais como gordura e enzima podem ser adicionados. A produção de ração pode também envolver uma etapa adicional que inclui extrusão ou expansão anterior à peletização - em particular, por técnicas adequadas que podem incluir pelo menos o uso de vapor.

[0140] A ração pode ser uma ração para qualquer animal adequado. Preferencialmente, a ração se destina a animais domésticos ou de produção.

[0141] Em uma realização, o animal é um animal monogástrico, tal como aves (por exemplo, frango, galinha poedeira, aves reprodutoras, peru, pato, ganso, aves marinhas), suínos (todas as categorias de idade), peixe, marisco incluindo crustáceos tais como camarões, um animal de estimação (por exemplo, cães, gatos).

[0142] Em uma realização adicional, o animal é um ruminante, tal como um bovino (por exemplo, vacas, búfalo d'água, bisão, iaques), ovelhas, cabras, camelos, veados, lhamas, antílopes, alpacas ou gnu.

[0143] A ração pode compreender pelo menos 0,0001% por peso do aditivo de ração. De modo adequado, a ração pode compreender pelo menos 0,0005%; pelo menos 0,0010%; pelo menos 0,0020%; pelo menos 0,0025%; pelo menos 0,0050%; pelo menos 0,0100%; pelo menos 0,020%; pelo menos 0,100% pelo menos 0,200%; pelo menos 0,250%; pelo menos 0,500% por peso do aditivo de ração.

[0144] Em um aspecto adicional, é apresentado o uso de pelo menos uma enzima de amidase com capacidade de degradar ocratoxina, preferencialmente, a ocratoxina A, na fabricação de um produto alimentício ou ração para reduzir o nível de contaminação de micotoxina nos produtos alimentícios ou alimento para animais.

[0145] Preferencialmente, a enzima de amidase também tem capacidade de degradar pelo menos um derivado ocratoxina ou ocratoxina

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30/104 adicional e/ou pelo menos um alcalóide de ergot, mais preferencialmente, ocratoxina B.

[0146] Preferencialmente, a pelo menos uma enzima de amidase é formulada como um aditivo de alimento ou ração. Mais preferencialmente, o aditivo de alimento ou ração é o aditivo de alimento ou ração, de acordo com a presente invenção.

[0147] Em um aspecto adicional da presente invenção, é apresentada uma composição que compreende uma ocratoxina, preferencialmente, a ocratoxina A, o material contaminado e uma amidase que degrada ocratoxina, preferencialmente, ocratoxina A, conforme descrito no presente documento.

[0148] Em uma realização preferencial da presente invenção, a composição compreende uma célula recombinante com capacidade de expressar a amidase de degradação da ocratoxina A.

[0149] Será compreendido que a dita composição pode compreender qualquer material contaminado de ocratoxina A adequado. Em realizações preferenciais, a composição compreende um material de alimento ou ração, um caldo de fermentação ou produto de refugo do processo de fermentação, tal como DDGS, água residual ou solo contaminado.

[0150] A pessoa versada compreenderá que a contaminação por ocratoxina A de composições além de materiais de alimento e de ração pode ser problemática. Por exemplo, a água residual que contém ocratoxina A de processos industriais pode resultar em contaminação de cursos d'água.

[0151] É também apresentado pela presente invenção um método de redução de contaminação de ocratoxina em um material que compreender adicionar ao material contaminado uma enzima de amidase com capacidade de degradar ocratoxina, preferencialmente, ocratoxina A.

[0152] É também apresentado pela presente invenção um material

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31/104 de alimento ou ração obtenível pelos métodos da presente invenção.

[0153] Em um aspecto adicional da presente invenção, é apresentado um método de aumento da taxa de crescimento e/ou saúde de um animal que compreende alimentar o animal com uma quantia eficaz de um alimento para animais, de acordo com a presente invenção.

[0154] Conforme usado no presente contexto, o termo saúde se refere a uma redução nos efeitos prejudiciais em um animal causados pela toxidade de ocratoxina resultante dos níveis de ocratoxina presentes no alimento para animais.

Exemplos [0155] A invenção será descrita adiante em referência aos exemplos e Figuras, nos quais:

[0156] A Figura 1 mostra a habilidade de lipase PEPAd (uma protease de ácido áspartico Danisco clonada de A. niger), Amano™ e Carboxipeptidase bovina A nas mesmas concentrações de proteína para decompor OTA. A atividade foi expressa em % OT-α (produto de OTA) por área: a área que corresponde ao produto dividido pela área total (área de pico de OTA mais OT-α).

[0157] A Figura 2 mostra a porcentagem da área de OT-α e atividade de lipase relativa (%) em frações de (A): cromatografia de interação hidrofóbica (HIC)/ cromatografia de afinidade com uma coluna empacotada de sefarose de Fenila (2,6 cm x 10 cm) e gradiente de 1 M sulfato de amônio a 0. (B): cromatografia de troca de ânion (AEX) coluna Q30 com gradiente de 0 a 1 M NaCl após a HIC.

[0158] A Figura 3 mostra análise de SDS-PAGE da fração de AEX concentrada que tem a maior atividade de degradação de OTA. As bandas indicadas A e B foram digeridas em gel com tripsina e os peptídeos digeridos foram separados na fase de HPLC reversa e analisada com MS para a

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32/104 identificação do peptídeo.

[0159] A Figura 4 mostra graficamente a separação de frações ativas de OTA por HIC/cromatografia de afinidade após o fracionamento de sulfato de amônio. A Figura 4A mostra HIC ou cromatografia de afinidade na coluna de sefarose de fenila; A Figura 4B mostra HIC na coluna de sefarose de butila. A Figura 4C mostra a distribuição de atividade de lipase e OTA nas frações coletadas 2-28 da coluna de sefarose de butila.

[0160] A Figura 5 mostra análise de SDS-PAGE de frações ativas de OTA concentradas após as etapas de purificação do fracionamento de amônio, HIC/afinidade na sefarose de fenila, HIC na sefarose de butila, a AEX na fonte Q30 e separação/concentração de membrana no concentrador 10 (corte molecular de 10 kDa) centriprep Amicon.

[0161] A Figura 6 mostra as atividades presentes na membrana separada e frações concentradas de AEX da Figura 5 na formamida (A Figura 6A) e OTA (A Figura 6B), picos de proteína ensaiados a 280nm.

[0162] A Figura 7 mostra a construção do cassete de expressão de amidase 2.

[0163] A Figura 8 mostra a análise de SDS-PAGE de proteínas intracelulares de transformantes de A. nigerque abrigam o gene de Amidase 2. A banda de proteína de amidase 2 é indicada por uma barra indicadora.

[0164] A Figura 9 mostra a análise de SDS-PAGE de proteínas extracelulares de transformantes de A. nigerque abrigam o gene de Amidase 2. A banda de proteína de amidase 2 é indicada por uma barra indicadora.

[0165] A Figura 10 mostra a triagem de frações intracelulares e extracelulares (caldo de fermentação) de transformantes Aspergillus niger (1 a 15) que abrigam o gene de amidase 2 para sua habilidade de decompor OTA. 10 pl das frações intracelulares ou da ração foi misturado com 25 pl, 1 pg/ml de OTA, 100 pl de fosfato de sódio (67 mM, f7,0) e incubado em 40°C por 35

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33/104 minutos. Ao fim da reação 130 μΙ de acetonitrila que contém 0,2% de ácido acético foi adicionado para parar a reação. A mistura de reação foi filtrada e 5 μl analisado pela análise de RP-HPLC do OTA em peso restante se refere à cepa progenitora usada para a transformação; ctrl, se refere à reação na ausência de transformantes A. niger.

[0166] A Figura 11 mostra o pH ideal da amidase 2 da preparação intracelular da A. nigertransgênica na degradação de OTA. A mistura de reação continha a mistura de 5 μl de amidase 2 (uma mistura das frações intracelulares de transformante 3, 4, 7 a 8,10 a 11 e 13 a 15) com uma concentração de proteína de 155 μg de proteína/ml), 0,1 ml 67 mM de tampão de fosfato (f3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9), 25 μl de OTA (1 μg/ml). A reação foi realizada a 30^oC por 60 minutos e parada pela adição de 0,13 ml de acetonitrila que contém 0,2% HAC. Um volume de injeção de 10 μl foi usado para a análise de RP-HPLC do OTA restante após a filtração.

[0167] A Figura 12 mostra a estabilidade térmica de amidase 2 da preparação intracelular do A. nigertransgênico. A mistura de pré-incubação em um tubo ependorpf de 1,5 ml continha 5 μl da mistura de amidase 2 (155 μg proteína/ml), e 45 μl de 67 mM de tampão de fosfato de pH 7,0. As amostras foram pré-incubadas a 80^oC por 0, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 min. Após o resfriamento a 15^oC, 50 μl 67 mM de tampão de fosfato e 25 μl de OTA (1 μg/ml) foram adicionados para iniciar a reação, sendo que esta foi incubada a 30^oC por 60 minutos, sendo que a reação foi interrompida pela adição de 130 μl de acetonitrila que contém 0,2% de HAC. Um volume de injeção de 10 μl w, conforme usado para análise de RP-HPLC do OTA restante após a filtração.

[0168] A Figura 13 mostra estabilidade de pH e temperatura de amidase 2 da preparação intracelular do A. niger transgênico em incubado a 70°C em pH de 3 a 9 em 67 mM de fosfato de sódio. A mistura de reação continha 5 μl mistura de amidase 2 (155 μg proteína/ml), 45 μl de 67 mM de tampão de

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34/104 fosfato tanto em pH 3, 4, 5, 6, 7, 8 como 9. As misturas de reação foram incubadas a 70^oC por 30 minutos, antes de 2 μl 0,5 mg/ml OTA em etanol e 80 μΐ de 0,2 M de Mops em pH 7,0 foram adicionados e as amostras incubadas a 30°C por 60 minutos. A reação parou adicionando-se 130 μΐ de acetonitrila que contém 0,2% HAC, filtrado e analisado por RP-HPLC.

[0169] A Figura 14 mostra a análise de amidase 2 recombinante purificada da ração de transformante A. niger 13 por SDS-PAGE em frações AEX (A) e por espectrometria de massa (B) na fração 13 após o AEX.

[0170] A Figura 15 mostra a degradação de OTA como uma função de concentração de proteína de amidase. A amidase usada foi purificada a partir da ração de transformante 13 (proteína 438aa denominada como amidase 2 mat).

[0171] A Figura 16 mostra o efeito de concentração de íon de cálcio na atividade de amidase 2 mat purificada a partir de A. niger transgênico e o produto de lipase Amano™.

[0172] Figura 17. Degradação de OTA pela amidase 2 extraída a partir da fração intracelular (Amidase 2 sig) de A. niger. Não é vista inibição por CaCl2 ou EDTA à amidase 2 sig.

[0173] A Figura 18A mostra a sequência de aminoácidos de amidase 2 (480 aa) (SEQ ID NO: 1) de Aspergillus niger em um formato de letra. As únicas sequências sublinhadas são aquelas obtidas da Figura 5; as sublinhadas duas vezes são aquelas obtidas da Figura 8.

[0174] A Figura 18B mostra a sequência de aminoácidos de amidase 2 (480 aa) somada a 6 resíduos de histidina em seu terminal C a partir de Aspergillus niger em um formato de letra (SEQ ID NO: 4).

[0175] A Figura 19 mostra a sequência de aminoácidos de amidase 2 (480 aa) a partir de Aspergillus niger em três formatos de letra. As características de recursos de amidases de degradação de OTA são indicadas

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35/104 em negrito e os resíduos de aminoácido sublinhados: resíduos conservados (em negrito) e nove motivos de sequência (sublinhados).

[0176] A Figura 20a mostra a estrutura do tetrâmero de proteína de amidase 2 (SEQ ID NO:1), a estrutura distorcida de cilindro similar ao Tim; b mostra a estrutura de uma das 8 subunidades.

[0177] A Figura 21 mostra a estrutura do ambiente de local ativo da amidase 2.

[0178] A Figura 22 mostra as coordenadas de cristal de um monômero de amidase 2.

[0179] A Figura 23 mostra uma representação esquemática do plasmídeo de expressão pTTT-pyrG13-Amidase G. graminicola.

[0180] A Figura 24 mostra a representação esquemática do plasmídeo de expressão pTTT-pyrG13-Amidase M. anisopliae.

[0181] A Figura 25 mostra um mapa do plasmídeo de expressão pRAX-Amidase A. oryzae.

[0182] A Figura 26 mostra um alinhamento de 11 sequências de amidase que mostram os 9 motivos de sequência que são essenciais para a atividade de degradação de ocratoxina de amidase.

[0183] A Figura 27 mostra um alinhamento de SEQ ID NO:1 e as carboxipeptidases A e Y que são conhecidas por ter baixa atividade de degradação de ocratoxina.

[0184] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado, conforme comumente compreendido por alguém de habilidade comum na técnica ao qual essa revelação pertence. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY E MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley e Sons, New York (1994), e Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) apresentam alguém com habilidade com

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36/104 um dicionário geral de muitos dos termos usados nessa revelação.

[0185] Esta revelação não está limitada pelos métodos materiais exemplares e descritos no presente documento, e quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos no presente documento podem ser usados na prática ou teste das realizações dessa revelação. As faixas numéricas são inclusivas dos números que definem a faixa. A menos que indicado de outra forma, as sequências de ácido nucleico são escritas da esquerda para direita em orientação de 5' a 3'; as sequências de aminoácidos são escritas da esquerda para direita em orientação de amino a carbóxi, respectivamente.

[0186] Os cabeçalhos apresentados no presente documento não são limitações dos vários aspectos ou realizações dessa revelação que possam ser tomadas por referência ao relatório descritivo como um todo.

Consequentemente, os termos definidos imediatamente abaixo são mais completamente definidos por referência ao relatório descritivo como um todo.

[0187] Aminoácidos são referidos no presente documento com o uso do nome do aminoácido, a abreviação de três letras ou a abreviação de uma única letra.

[0188] Conforme usado no presente documento, o termo “identidade” significa uma entidade que tem uma determinada homologia com as sequências de aminoácidos e as sequências de nucleotídeos. O termo “identidade” nesse contexto se refere à porcentagem de identidade de sequência entre duas enzimas após o alinhamento de suas sequências com o uso de algoritmos de alinhamento conforme descrito em mais detalhes abaixo.

[0189] No presente contexto, uma sequência de aminoácidos homóloga é tomada para incluir uma sequência de aminoácidos que pode ser pelo menos 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85 ou 90% idêntica, preferencialmente, pelo menos 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência. Tipicamente, os

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37/104 homólogos compreenderão os mesmos locais ativos etc. - por exemplo, como a sequência de aminoácidos em questão. Apesar de a homologia poder ser também considerada em termos de similaridade (isto é, os resíduos de aminoácido que têm propriedades/funções químicas similares A), no contexto da presente invenção, é preferencial expressar a homologia em termos de identidade de sequência.

[0190] Para as sequências de aminoácidos e as sequências de nucleotídeos, as comparações de homologia podem ser conduzidas a olho nu, ou mais comumente, com o auxílio de programas de comparação de sequência prontamente disponíveis. Esses programas de computador comercialmente disponíveis podem calcular a porcentagem de homologia entre duas ou mais sequências.

[0191] A porcentagem de homologia pode ser calculada sobre sequências contíguas, isto é, uma sequência é alinhada com a outra sequência e cada aminoácido em uma sequência é diretamente comparada com o aminoácido correspondente na outra sequência, um resíduo de cada vez. Isso é chamado alinhamento ‘'sem intervalo’’. Tipicamente, tais alinhamentos sem intervalo são realizados somente sobre um número relativamente curto de resíduos.

[0192] Apesar de esse ser um método muito simples e consistente, o mesmo falha ao levar em consideração que, por exemplo, em um par de sequências de outra forma idêntico, uma inserção ou deleção fará com que os seguintes resíduos de aminoácido sejam colocados fora de alinhamento, desse modo resultando potencialmente em uma grande redução na porcentagem de homologia quando um alinhamento global for realizado. Consequentemente, a maioria dos métodos de comparação de sequência é projetada para produzir alinhamentos ideais que levam em consideração possíveis inserções e deleções sem penalizar indevidamente a pontuação total de homologia. Isso é obtido inserindo-se “intervalos” no

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38/104 alinhamento de sequência para tentar maximizar a homologia local.

[0193] No entanto, esses métodos mais complexos determinam “penalidade de intervalo” para cada intervalo que ocorre no alinhamento de modo que, para o mesmo número de aminoácidos idênticos, um alinhamento de sequência com o mínimo de intervalos possível - que reflete maior relação entre as duas sequências comparadas - irá obter uma pontuação maior do que aquele com muitos intervalos. São tipicamente usados “custos de intervalo afim” que carregam um custo relativamente alto da existência de um intervalo e uma penalidade menor para cada resíduo subsequente no intervalo. Esse é o sistema de determinação de pontuação de intervalo mais comumente usado. A alta penalidade de intervalo irá obviamente produzir alinhamentos otimizados com menos intervalos. A maioria dos programas de alinhamento permitem que a penalidade de intervalo seja modificada. No entanto, é preferencial usar os valores padrão ao usar tal software para as comparações de sequência. Por exemplo, ao usar o pacote GCG Wisconsin Bestfit, a penalidade de intervalo padrão para as sequências de aminoácidos é -12 para um intervalo e -4 para cada extensão.

[0194] O cálculo da porcentagem máxima de homologia portanto, primeiramente requer a produção de um alinhamento ideal, levando em consideração a penalidade de intervalo. Um programa de computador adequado para executar tal alinhamento é o pacote GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et al 1984 Nuc. Acids Research 12 p387). Os exemplos de outro software que podem realizar comparações de sequência incluem, porém sem limitação, o pacote BLAST (ver Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4^a Ed - capítulo 18), FASTA (Altschul etal., 1990 J. Mol. Biol. 403 a 410) e o conjunto GENEWORKS de ferramentas de comparação. Ambos BLAST e FASTA estão disponíveis para busca fora de linha e em linha (ver Ausubel et al., 1999, Short Protocols in Molecular Biology, páginas 7 a 58 a 7 a 60).

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39/104 [0195] No entanto, para algumas aplicações, é preferencial usar o programa GCG Bestfit. Uma nova ferramenta, chamada Sequências de BLAST 2 é também disponível para comparar sequência de proteína e nucleotídeo (ver FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187 a 8 e tatiana@ncbi.nlm.nih.gov).

[0196] Apesar de a porcentagem final de homologia poder ser medida em termos de identidade, o próprio processo de alinhamento não é tipicamente baseado em uma comparação de par tudo ou nada. Ao invés disso, é geralmente usada uma matriz de pontuação de similaridade escalonada que determina a pontuação a cada comparação em pares com base na similaridade química ou distância evolucionária. Um exemplo de tal matriz comumente usada é a matriz BLOSUM62 - a matriz padrão para o conjunto BLAST de programas. Os programas GCG Wisconsin geralmente usam tanto os valores padrão públicos como uma tabela comparação de símbolo customizada se abastecida (ver manual do usuário para mais detalhes). Para algumas aplicações, é preferencial usar os valores padrão públicos para o pacote GCG, ou no caso de outro software, a matriz padrão, tal como BLOSUM62.

[0197]De forma alternativa, as homologias de porcentagem podem ser calculadas com o uso de recurso múltiplo de alinhamento em DNASIS^TM (Hitachi Software), com base em um algoritmo, análogo ao CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237 a 244).

[0198] Uma vez que o software tenha produzido um alinhamento ideal, é possível calcular a porcentagem de homologia, preferencialmente, a porcentagem de identidade de sequência. O software realiza isso tipicamente como parte da comparação de sequência e gera um resultado numérico.

[0199]Em um aspecto preferível da presente invenção, são usados o seguinte software e definições para cálculo da homologia de sequência de porcentagem/identidade. Para porcentagem de identidades

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40/104 (homologia) de sequências de aminoácidos ou positivas são calculados pelo AlignX VectorNTI (Vector NTI Advance 9.1 de Invitrogen Corporation, Carlsbad, Califórnia, USA.) para cada possível par de sequências de aminoácidos. As definições são parâmetros padronizados (Penalidade de abertura de intervalo - 10, Penalidade de extensão de intervalo 0,1).

[0200]Para a porcentagem de identidades de sequências de ácido nucleico (homologia) ou positivos são calculados pelo programa AlignX VectorNTI, de Informax Inc. (USA) para cada possível par de sequências de ácido nucleico. As definições são definições padrão para DNA são : Penalidade de abertura de intervalo: 15 e Penalidade de extensão de intervalo: 6,66 (mesmas definições para múltiplos alinhamentos).

[0201] Preferencialmente, a identidade (homologia) do aminoácido é calculada através da sequência de aminoácidos de comprimento total ou para ácido nucleico a um polinucleotídeo correspondente que codifica a respectiva sequência de aminoácidos de comprimento total.

[0202]As sequências podem também ter deleções, inserções ou substituições de resíduos de aminoácido que produzem uma mudança silenciosa e resultam em uma substância funcionalmente equivalente. As substituições deliberadas de aminoácido podem ser feitas com base na similaridade em propriedades de aminoácido (tal como polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade, e/ou a natureza anfipática dos resíduos) e é, portanto, útil para agrupar os aminoácidos em grupos funcionais. Os aminoácidos podem ser agrupados com base nas propriedades de sua cadeia lateral sozinha. No entanto é mais útil também incluir os dados de mutação. Desse modo, os conjuntos de aminoácidos derivados devem ser provavelmente conservados por razões estruturais. Esses conjuntos podem ser descritos na forma de um diagrama Venn (Livingstone C.D. e Barton G.J. (1993) Protein sequence alignments: a

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41/104 strategy for the hierarchical analysis of residue conservation Comput.Appl Biosci. 9: 745 a 756)(Taylor W.R. (1986) The classification of amino acid conservation J. Theor.Biol. 119; 205 a 218). As substituições conservadoras podem ser feitas, por exemplo, de acordo com a tabela abaixo que descreve um agrupamento de diagrama Venn de aminoácidos geralmente aceito.

CONJUNTO	SUB-SUBCONJUNTO
Hidrofóbico	F W Y H K M I L V A G C	Aromático	F W Y H
Alifático	I L V
Polar	W Y H K R E D C S T N Q	Carregado	H K R E D
Positivamente carregado	H K R
Negativamente carregado	E D
Pequeno	V C A G S P T N D	Minúsculo	A G S

[0203] A presente invenção também abrange substituição homóloga (substituição e recolocação são ambos usados no presente documento para representar o intercâmbio de um resíduo de aminoácido existente, com um resíduo alternativo) que pode ocorrer isto é, substituição igual por igual tal como básica por básica, ácida por ácida, polar por polar etc. A substituição não homóloga pode também ocorrer isto é, a partir de uma classe de resíduo à outra, ou de forma alternativa envolver a inclusão de aminoácido não naturais tais como ornitina (doravante denominado como Z), ornitina de ácido diaminobutírico (doravante denominado como B), ornitina de norleucina (doravante denominado como O), pirilalanina, tienilalanina, nafilalanina e fenilglicina.

[0204] As recolocações também podem ser feitas por aminoácidos não naturais.

[0205] O termo “proteína, conforme usado no presente documento, incluis proteínas, polipeptídeos, e peptídeos.

[0206] Os termos resíduo de aminoácido equivalente a, aminoácido correspondente a e equivalentes gramaticais dos mesmos são

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42/104 usados no presente documento para se referirem a um resíduo de aminoácido de uma proteína que tem a posição e efeito similares aos indicados em uma sequência de aminoácidos particular de uma proteína particular. A pessoa de habilidade na técnica reconhecerá a equivalência de resíduos especificados em proteínas comparáveis.

[0207] O termo propriedade ou equivalentes gramaticais dos mesmos no contexto de um polipeptídeo, conforme usado no presente documento, se refere a qualquer característica ou atributo de um polipeptídeo que pode ser selecionado ou detectado. Essas propriedades incluem, porém, sem limitação, estabilidade oxidativa, especificação de substrato, atividade catalítica, estabilidade térmica, perfil de atividade de temperatura e/ou pH, estabilidade de processamento de ração, e habilidade para ser secretado.

[0208] Conforme usado no presente documento, o termo “sequência de aminoácidos” é sinônimo do termo “polipeptídeo” e/ou do termo “proteína”. em alguns exemplos, o termo “sequência de aminoácidos” é sinônimo do termo “peptídeo”. Em alguns exemplos, o termo “sequência de aminoácidos” é sinônimo do termo “enzima”.

[0209] A sequência de aminoácidos pode ser preparada /isolada a partir de uma fonte adequada, ou pode ser feita sinteticamente ou pode ser preparada por meio de uso de técnicas de DNA recombinante.

[0210] Os termos proteína e polipeptídeo são usados de forma intercambiável no presente documento. na presente revelação e reivindicações, os códigos convencionais de uma letra e três letras para resíduos de aminoácido são usados. O código de 3 letras dos aminoácidos, conforme definido em conformidade com a IUPACIUB Comissão Mista de Nomenclatura em Bioquímica (JCBN). Deve-se também compreender que um polipeptídeo pode ser codificado por mais de uma sequência de nucleotídeos devido à

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43/104 degeneração do código genético.

[0211 ] O termo sequência de sinal ou” peptídeo de sinal se refere a qualquer sequência de nucleotídeos e/ou aminoácidos que podem participar na secreção das formas maduras ou precursoras da proteína. Essa definição de sequência de sinal é um significado funcional para incluir todas aquelas sequências de aminoácidos codificadas pela porção de terminal N do gene de proteína, que participam na efetuação da secreção de proteína. As mesmas são frequentes, porém, não universalmente ligadas à porção de terminal N de uma proteína ou à porção de terminal N de uma proteína precursora.

[0212] Por “fragmento funcional” é representado um fragmento do polipeptídeo que retém aquelas propriedades características daquele polipeptídeo. No contexto da presente invenção, um fragmento funcional de uma enzima de amidase é um fragmento que retém a capacidade de clivagem da enzima de amidase da proteína inteira.

[0213] O termo isolado, recuperado ou purificado se refere a um material que é removido de seu ambiente original. O termo “substancialmente purificado” significa que o material foi purificado a pelo menos um grau substancial.

[0214] Em um aspecto, preferencialmente, a sequência de nucleotídeos ou de aminoácido está em uma forma isolada. O termo “isolado” significa que a sequência é pelo menos substancialmente livre de pelo menos um outro componente com o qual a sequência é naturalmente associada na natureza e encontrada na natureza.

[0215] Outras definições de termos podem aparecer por todo o relatório descritivo. Antes que as realizações exemplificativas sejam descritas em mais detalhe, é para ser entendido que essa revelação não é limitada às realizações em particular descritas, como tais podem, certamente, variar. Também é para ser entendido que a terminologia usada no presente documento

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44/104 é para o propósito de descrever as realizações em particular somente, e não é destinada a ser limitante, uma vez que o escopo da presente revelação será limitado somente pelas reivindicações anexas.

[0216] Quando uma faixa de valores é fornecida, é entendido que cada valor de intervenção, até a décima parte da unidade do limite inferior, a menos que o contexto dite claramente de outro modo, entre os limites inferior e superior daquela faixa também é especificamente revelado. Cada faixa menor entre qualquer valor declarado ou valor de intervenção em uma faixa declarada, e qualquer outro valor de intervenção ou declarado naquela faixa declarada é englobado dentro dessa revelação. Os limites inferior e superior dessas faixas menores podem ser independentemente incluídos ou excluídos na faixa, e cada faixa onde um dos, nenhum dos ou ambos os limites sejam incluídos nas faixas menores também são englobadas dentro dessa revelação, sujeitas a qualquer limite especificamente excluído na faixa declarada. Onde a faixa declarada inclui um ou ambos os limites, sendo que as faixas que excluem um dos ou ambos esses limites incluídos, também são incluídas nessa revelação.

[0217] Deve ser observado que conforme usado no presente documento e nas reivindicações anexas, as formas singulares um, uma, o e a incluem os referentes plurais a menos que o contexto dite claramente de outro modo. Assim, por exemplo, referência a um gene inclui uma pluralidade de tais agentes candidatos, e referência a a célula inclui referência a uma ou mais células e equivalentes das mesmas conhecidos a aqueles versados na técnica, e assim por diante.

[0218]As publicações discutidas no presente documento são fornecidas unicamente para suas revelações anteriores à data de preenchimento do presente pedido. Nada no presente documento deve ser interpretado como uma admissão de que tais publicações constituem a técnica anterior às reivindicações anexadas ao presente documento.

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45/104 [0219] As enzimas para uso na presente invenção podem ser produzidas ou por cultura submergida ou sólida, que inclui batelada, batelada alimentada e processos de fluxo contínuo. A criação de cultura é concluída em um meio de crescimento que compreende um meio de sais minerais aquoso, fatores de crescimento orgânico, o material de fonte de energia ou carbono, oxigênio molecular, e, certamente, um inóculo inicial de uma ou mais espécies de micro-organismo em particular a serem empregadas.

[0220] Adicionalmente à fonte de energia e carbono, oxigênio, nitrogênio assimilável, e um inóculo do micro-organismo, é necessário abastecer quantias adequadas em proporções apropriadas de nutrientes minerais para assegurar o crescimento de micro-organismo apropriado, maximizar a assimilação da fonte de energia e carbono pelas células no processo de conversão microbiana, e alcançar rendimento celular máximo com densidade de célula máxima nos meios de fermentação.

[0221] A composição do meio mineral aquoso pode variar sobre uma ampla faixa, dependente em parte do micro-organismo e do substrato empregado, conforme é conhecido na técnica. Os meios minerais devem incluir, em adição ao nitrogênio, quantias adequadas de fósforo, magnésio, cálcio, potássio, enxofre, e sódio, em formas combinadas e iônicas assimiláveis solúveis adequadas, e também estão presentes, preferencialmente, certos oligoelementos tais como cobre, manganês, molibdênio, zinco, ferro, boro, e iodo, e outros, novamente forma assimilável solúvel não adequada, tudo conforme conhecido na técnica.

[0222] A reação de fermentação é um processo aeróbico no qual o oxigênio molecular necessário é abastecido por um gás que contém oxigênio molecular, tal como ar, ar enriquecido em oxigênio, ou mesmo oxigênio molecular substancialmente puro, fornecido para manter os conteúdos do vaso de fermentação com uma pressão parcial de oxigênio adequada eficaz em

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46/104 auxiliar as espécies de micro-organismos a crescerem de uma forma próspera. De fato, pelo uso de um substrato de hidrocarbono oxigenado, a exigência de oxigênio para o crescimento do micro-organismo é reduzida. Contudo, o oxigênio molecular deve ser abastecido para crescimento, uma vez que a assimilação do substrato e do crescimento correspondente dos micro-organismos é, em parte, um processo de combustão.

[0223] Embora a taxa de aeração possa variar sobre uma faixa considerável, a aeração geralmente é conduzido em uma taxa que está na faixa de cerca de 0,5 a 10, preferencialmente de cerca de 0,5 a 7, ~ volumes (na pressão empregada e em 25°C.) de gás que contém oxigênio por volume líquido no fermentador por minuto. Essa quantia é baseada no ar de teor de oxigênio normal que é abastecido ao reator, e, em termos de oxigênio puro, as respectivas faixas seriam de cerca de 0,1 a 1,7, ou preferencialmente de cerca de 0,1 a 1,3, volumes (na pressão empregada e em 25°C.) de oxigênio por volume líquido no fermentador por minuto.

[0224] A pressão empregada para o processo de conversão microbiana pode variar amplamente. As pressões geralmente estão dentro da faixa de cerca de 101,33 a 446,06 kPa (0 a 50 psig), preferencialmente no presente de cerca de 101,33 a 308,17 kPa (0 a 30 psig), mais preferencialmente pelo menos pouco mais que a pressão atmosférica, como um balanço de custo de operação e equipamento versus solubilidade de oxigênio alcançada. Pressões maiores que a pressões atmosféricas são vantajosas em que tais pressões tendem a aumentar uma concentração de oxigênio dissolvido no fermento aquoso, o qual, por sua vez, pode ajudar a aumentar as taxas de crescimento celular. Ao mesmo tempo, isso é balanceado pelo fato de que pressões atmosféricas altas aumentam os custos operacionais e com equipamentos.

[0225] A temperatura de fermentação pode variar um pouco, mas

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47/104 para fungos filamentosos tais como Aspergillus niger ou Trichoderma reesei, a temperatura geralmente estará dentro da faixa de cerca de 20°C a 40°C, geralmente de modo preferencial na faixa de cerca de 25°C a 34°C, dependente da cepa do micro-organismo escolhido.

[0226] Os micro-organismos também exigem uma fonte de nitrogênio assimilável. A fonte de nitrogênio assimilável pode ser de qualquer composto que contém nitrogênio ou compostos capazes de liberar nitrogênio em uma forma adequada para utilização metabólica pelos micro-organismos. Embora uma variedade de compostos de fonte de nitrogênio orgânico, tais como os hidrolisados proteicos, possa ser empregada, compostos que contêm nitrogênio normalmente de baixo custo tais como amônia, hidróxido de amônio, ureia, e vários sais de amônio tais como fosfato de amônio, sulfato de amônio, pirofosfato de amônio, cloreto de amônio, ou vários outros compostos de amônio podem ser utilizados. O gás de amônia em si é conveniente para operações em larga escala, e pode ser empregado por borbulhamento através do fermento aquoso (meio de fermentação) in quantias adequadas. Ao mesmo tempo, tal amônia também pode ser empregada para auxiliar no controle de pH.

[0227]A faixa de pH no fermento microbiano aquoso (mistura por adição de fermentação) deve estar na faixa exemplificativa de cerca de 2,0 a 8,0. Com os fungos filamentosos, o pH normalmente está dentro da faixa de cerca de 2,5 a 8,0; com Aspergillius niger ou Trichoderma reesei, o pH normalmente está dentro da faixa de cerca de 3,0 a 7,0. Preferências de faixa de pH para certos micro-organismos são dependentes dos meios empregados de certa forma, assim como o micro-organismo em particular, e, assim, alterar um pouco com a alteração nos meios conforme pode ser prontamente determinado por aqueles versados na técnica.

[0228]Embora o tempo de retenção médio da mistura por adição de fermentação no fermentador possa variar de modo considerável,

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48/104 dependente, em parte, da temperatura de fermentação e da cultura empregada, geralmente o mesmo estará dentro da faixa de cerca de 24 a 500 horas, preferencialmente no presente de cerca de 24 a 400 horas. Preferencialmente, a fermentação é conduzida de tal maneira que o substrato que contém carbono pode ser controlado como um fator limitante, fornecendo, desse modo, boa conversão do substrato que contém carbono para as células, e evitar a contaminação das células com uma quantia substancial de substrato não convertido. O último não é um problema com substratos solúveis em água, uma vez que quaisquer traços remanescentes são prontamente removidos por lavagem. Pode ser um problema, entretanto, no caso de substratos não solúveis em água, e exigem etapas de tratamento por produto adicionado, tal como etapas de lavagem adequadas. Conforme descrito acima, o tempo para atingir esse nível não é crítico e pode variar com o micro-organismo em particular e com o processo de fermentação que é conduzido. Entretanto, é bem conhecido na técnica como determinar a concentração de fonte de carbono no meio de fermentação e se o nível desejado de fonte de carbono foi alcançado.

[0229] Embora a fermentação possa ser conduzida como uma batelada ou operação contínua, operação de batelada alimentada é preferida para facilidade de controle, produção de quantidades uniformes de produtos, e usos mais econômicos de todos os equipamentos. Se desejado, parte ou todo o material de fonte de energia ou carbono e/ou parte da fonte assimilável de nitrogênio, tal como amônia, pode ser adicionado ao meio mineral aquoso anterior a alimentar o meio mineral aquoso ao fermentador. Cada uma das correntes introduzidas no reator é controlada, preferencialmente, em uma taxa predeterminada, ou em resposta a uma necessidade determinável pela monitoração, tal como a concentração do substrato de energia e carbono, pH, oxigênio dissolvido, oxigênio ou dióxido de carbono nos gases de saída do

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49/104 fermentador, densidade de célula mensurável por transmitância de luz, ou semelhantes. As taxas de alimentação dos vários materiais podem ser variadas de modo a obter um crescimento de célula tão rápido quanto possível, consistente com a utilização eficiente da fonte de energia e carbono, para obter um rendimento de células de micro-organismo em relação à carga de substrato tão alto quanto possível.

[0230]Seja em uma batelada ou na operação de batelada alimentada preferida, todo o equipamento, reator, ou meio de fermentação, vaso ou reservatório, canalização, dispositivos de resfriamento ou circulação de assistente, e semelhantes, são inicialmente esterilizados, normalmente por empregar vapor, tal como em cerca de 121°C por pelo menos cerca de 15 minutos. Então, o reator esterilizado é inoculado com uma cultura do micro-organismo escolhido na presença de todos os nutrientes exigidos, que inclui oxigênio, e o substrato que contém carbono. O tipo de fermentador empregado não é crítico, embora o preferido no presente seja a operação sob Biolafitte de 15 litros (Saint-Germain-en-Laye, França).

[0231]A coleção e purificação das enzimas da presente invenção a partir do caldo de fermentação também podem ser feitas pelos procedimentos conhecidos por si só na técnica. O caldo de fermentação irá geralmente conter detritos celulares, que inclui células, vários sólidos suspensos e outros contaminantes de biomassa, assim como o produto de enzima desejado da presente invenção, sendo que são preferencialmente removidos do caldo de fermentação por meios conhecidos na técnica. Processos adequados para tal remoção incluem técnicas de separação de líquido e sólido convencionais, tais como, por exemplo, centrifugação, filtração, diálise, microfiltração, filtração de vácuo rotativa, ou outros processos conhecidos, para produzir um filtrado livre de célula. pode ser preferencial concentrar adicionalmente o caldo de fermentação ou o filtrado

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50/104 livre de célula com o uso de técnicas tais como a ultrafiltração, evaporação ou precipitação. Precipitar os componentes proteináceos do sobrenadante ou filtrado pode ser concluído por meio de um sal, por exemplo, sulfato de amônio. A purificação adicional pode ser alcançada opcionalmente por cristalização ou por uma variedade de procedimentos cromatográficos, por exemplo, cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade ou procedimentos reconhecidos de técnica similar.

Variantes/Derivados [0232] A presente invenção também engloba o uso de variantes, homólogos e derivados de qualquer sequência de aminoácidos de uma enzima ou de qualquer sequência de nucleotídeos que codifica tal enzima.

[0233] Sequências de aminoácidos de variante podem incluir grupos afastadores adequados que podem ser inseridos entre quaisquer dois resíduos de aminoácido da sequência que inclui grupos alquila, tais como grupos metila, etila ou propila, em adição aos afastadores de aminoácido, tais como resíduos de β-alanina ou glicina. Uma forma adicional de variação, que envolve a presença de um ou mais resíduos de aminoácido em forma de peptoide, será bem entendida por aqueles versados na técnica. Para evitar dúvida, “a forma de peptoide” é usada para referir-se aos resíduos de aminoácido de variante em que o grupo substituinte de α-carbono está no átomo de nitrogênio do resíduo, ao invés de no α-carbono. Os processos para preparar peptídeos na forma peptoide são conhecidos não técnica, por exemplo, Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9.367 a 9.371 e HorwellDC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132 a 134.

Outros Componentes [0234] As composições ou aditivos alimentícios da presente invenção podem ser usados em combinação com outros componentes ou veículos.

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51/104 [0235] Veículos adequados para alimentar as enzimas incluem maltodextrina, calcário (carbonato de cálcio), ciclodextrina, trigo, farelo de trigo ou um componente de trigo, arroz ou farelo de arroz, sacarose, amido, Na2SO4, Talco, PVA e misturas dos mesmos. Adicionalmente, existe um número de técnicas de encapsulamento que incluem aquelas com base em cobertura de gordura/cera, com a adição de gomas de planta etc.

[0236] Exemplos de outros componentes incluem um ou mais de espessantes, agentes gelificantes, emulsificantes, ligantes, modificadores de cristal, adoçantes (que inclui adoçantes artificiais), modificadores de reologia, estabilizadores, antioxidantes, corantes, enzimas, veículos, veículos, excipientes, diluentes, agentes lubrificantes, agentes aromatizantes, matéria colorante, agentes de suspensão, desintegrantes, ligantes de granulação etc. Esses outros componentes podem ser naturais. Esses outros componentes podem ser preparados pelo uso de técnicas químicas e/ou enzimáticas.

[0237] Conforme usado no presente documento, o termo “espessante ou agente gelificante”, conforme usado no presente documento, refere-se a um produto que previne a separação por diminuir ou prevenir o movimento das partículas, seja gotículas de líquidos imiscíveis, ar ou sólidos insolúveis.

[0238] O termo “estabilizador”, conforme usado aqui, é definido como um ingrediente ou combinação de ingredientes que impede que um produto (por exemplo, um produto alimentar) se altere ao longo do tempo.

[0239] O termo “emulsificante”, conforme usado no presente documento, refere-se a um ingrediente (por exemplo, um ingrediente de produto alimentar) que previne a separação de emulsões.

[0240] Conforme usado no presente documento, o termo “ligante” refere-se a um ingrediente (por exemplo, um ingrediente alimentar) que se aglutina ao produto conjuntamente através de uma reação física ou química.

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52/104 [0241] O termo “modificador de cristal”, conforme usado no presente documento, refere-se a um ingrediente (por exemplo, um ingrediente alimentar) que afeta a cristalização de ou gordura ou água.

[0242] Veículos ou excipientes significam materiais adequados para administração de composto e incluem qualquer tal material conhecido na técnica, tal como, por exemplo, qualquer líquido, gel, solvente, diluente líquido, solubilizador, ou semelhantes, sendo que é não tóxico e que não interage com quaisquer componentes da composição em uma maneira deletéria.

[0243] Exemplos de veículos nutricionalmente aceitáveis incluem, por exemplo, grão, água, soluções de sal, álcool, silicone, ceras, geleia de petróleo, óleos vegetais, e semelhantes.

[0244] Exemplos de excipientes incluem um ou mais de: celulose microcristalina e outras celuloses, lactose, citrato de sódio, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio dibásico, glicina, amido, açúcar de leite e glicóis de polietileno de peso molecular alto.

[0245] Exemplos de desintegrantes incluem um ou mais de: amido (preferencialmente milho, batata ou amido de tapioca), glicolato de amido de sódio, croscarmelose sódica e certos silicatos complexos.

[0246] Exemplos de ligantes de granulação incluem um ou mais de: polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), hidroxipropilcelulose (HPC), sacarose, maltose, gelatina e acácia.

[0247] Exemplos de agentes lubrificantes incluem um ou mais de: estearato de magnésio, ácido esteárico, beenato de glicerilo e talco.

[0248] Exemplos de diluentes incluem um ou mais de: água, etanol, propileno de glicol e glicerina, e combinações dos mesmos.

[0249] Os outros componentes podem ser usados simultaneamente (por exemplo, quando os mesmos estão em uma mistura por adição juntos, ou mesmo quando os mesmos são entregues por rotas diferentes)

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53/104 ou sequencialmente (por exemplo, os mesmos podem ser entregues por rotas diferentes).

[0250] Conforme usado no presente documento, o termo “componente adequado para consumo animal ou humano” significa um composto, sendo que é ou pode ser adicionado à composição da presente invenção como um aditivo que pode ser de benefício nutricional, um substituto de fibra ou tem um efeito geralmente benéfico para o consumidor.

[0251] Por meio de exemplo, os componentes podem ser prebióticos, tais como alginato, xantana, pectina, goma de alfarroba (LBG), inulina, goma de guar, galacto-oligossacarídeo (GOS), fruto-oligossacarídeo (FOS), lactosacarose, oligossacarídeos de feijão-soja, palatinose, isomaltooligossacarídeos, gluco-oligossacarídeos e xilo-oligossacarídeos.

Isolado [0252] Em um aspecto, preferencialmente, a enzima amidase para uso na presente invenção está em uma forma isolada. O termo “isolado” significa que a enzima amidase está pelo menos substancialmente livre a partir de pelo menos um outro componente com o qual a enzima amidase esteja naturalmente associada em natureza e conforme encontrado na natureza. O termo “isolado” pode significar que a enzima amidase está p elo menos substancialmente livre a partir de pelo menos um outro componente nos meios de cultura nos quais a mesma é produzida. A enzima amidase da presente invenção pode ser fornecida em uma forma que seja substancialmente livre de um ou mais contaminantes com os quais a substância pode, de outro modo, ser associada ou com os quais a enzima pode ser produzida.

[0253] Assim, por exemplo, a mesma pode ser substancialmente livre da(s) célula(s) ou de um ou mais moléculas de ácido nucleico e/ou polipeptídeos potencialmente contaminantes. A enzima amidase pode ser isolada por separar a(s)

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54/104 célula(s) do caldo durante ou após a fermentação de tal modo que a enzima amidase permaneça no caldo. A enzima amidase pode ser isolada por sujeitar o caldo de fermentação à separação de célula por filtração de vácuo.

[0254] Em uma realização, o termo isolado significa que a amidase é isolada do caldo de tal modo que a mesma é substancialmente livre de outros componentes nos meios de cultura, nos quais a mesma é produzida.

Purificado [0255] Em um aspecto, preferencialmente, a enzima amidase para uso na presente invenção está em uma forma purificada. O termo “purificado” significa que o dado componente está presente em um alto nível. O componente é desejavelmente o componente predominante presente em uma composição. Preferencialmente, o mesmo está presente em um nível de pelo menos de cerca de 30%, 40%, 50%, 60%, ou pelo menos de cerca de 65%, ou pelo menos de cerca de 70%, ou pelo menos de cerca de 75%, ou pelo menos de cerca de 80%, ou pelo menos de cerca de 85%, ou pelo menos de cerca de 90%, ou pelo menos de cerca de 95%, ou pelo menos de cerca de 97%, ou pelo menos de cerca de 99%, sendo que o dito nível é determinado em uma base de peso por peso/seco com relação à composição total sob consideração. Para algumas realizações, a quantia é de pelo menos cerca de 85%, sendo que o dito nível é determinado em uma base de peso por peso/seco com relação à composição total sob consideração.

Concentrado [0256] Em um aspecto, preferencialmente, a enzima amidase para uso na presente invenção é usada como um concentrado. O concentrado pode ser uma forma de concentrado do meio no qual a enzima foi excretada. Preferencialmente, o concentrado pode ser uma forma de concentrado do meio no qual a enzima foi excretada e em que a(s) célula(s) foi removida.

Materiais e Métodos [0257] A ocratoxina A era a partir de Fluka (cat. n^o. 32937-5MG). A

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55/104 carboxipeptidase A era a partir de pâncreas bovino (Sigma, cat. n^o. C9268). Todas as outras enzimas que incluem reagentes e amidases disponíveis comercialmente eram a partir de Sigma, Roche, Merck e Danisco. Amano™, lipase era a partir de Amano Enzyme Inc. (Nagoya, Japão). Todo o meio de cromatografia que inclui Fenil-, Octil- Butil-Sefarose, troca de ânion, a filtração de gel (coluna PD10) e o aparelho de purificação de proteína Akta explorer eram a partir de GE Healthcare. As microplacas eram a partir de Nunc A/S (Dinamarca) e Corning (EUA). O leitor de microplaca era a partir de Biotek (EUA). A farinha de milho foi obtida a partir do mercado local enquanto alimentação com base em soja e milho foi obtida a partir do Instituto Tecnológico Dinamarquês em Kolding (Dinamarca).

Ensaios de Degradação de Micotoxina:

Método Para Medir a Atividade de Formamidase [0258] Soluções usadas: Garrafa 1 de kit de ensaio de ácido fórmico de Megazyme (K-form 05/06), adicionar 4 ml de água milliQ para produzir tampão de fosfato de potássio de pH 7,6. Manter em 5^oC; Garrafa 2, adicionar 5,2 ml de água para obter a concentração de NAD certa (Mantida em -20^oC); Garrafa 3, é FDH sacudida antes do uso (Mantida em 5^oC). A formamida é um produto líquido em 99,80% a partir de Sigma (F9037) (mantida em 5^oC) e era usada como era sem diluição adicional.

[0259] Procedimento de ensaio: adicionar microplaca transparente para uv para 96 metade da área:

tampão de fosfato de potássio de 10 pl (pH 7.6) (Solução 1 a partir do kit), pl de NAD (Solução 2 a partir do kit),

2.5 pl de desidrogenase de ácido fórmico (FDH) (Solução 3 a partir do kit),

1.6 pl de 100% (v/v) solução de formamida (a partir de Sigma,

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F9037),

100 μΙ de água milliQ.

[0260] A 37^oC, em um leitor de microplaca, OD lido aumenta em 340nm a cada minuto e é sacudido antes de cada leitura por de 15 a 60min. Intervalo de leitura: 1 minuto.

[0261] Após a leitura de 5 minutos, adicionar de 5 μl a 20 μl de preparação A. niger (dependente da atividade). Conseguir a taxa de reação (declive linear máximo).

[0262] Controle: nenhuma formamidase foi adicionada, mas adicionar, ao invés, tampão ou água ou extrato de célula que não tenha atividade de formamidase.

[0263] Determinação de degradação enzimática de OTA. Os tampões empregados no ensaio eram: 50 mM de tampão de acetato de sódio (pH 4, 4,5, 5 e 5,5); 50 mM de tampão MES (pH 6, 6,5 e 7); 0,2M de Mops-NaOH) pH 7,0), 50 mM de tampão Tris-HCl (pH 7,5, 8 e 8,5). A solução de ocratoxina A (OTA) (1 mg/ml) foi feita com 5 mg de ocratoxina A (Sigma, ref. 32937) dissolvida em etanol/água (60/40) e armazenada em -20°C. Os ensaios de seleção foram executados com 15-l de solução OTA e concentrações de enzima diferentes (por exemplo, de 0,1 a 5 mg/ml) em um volume final de 300 μι Reações enzimáticas foram feitas em 37°C por 20 h, ±1 h sob agitação constante. Amostras foram filtradas com o uso de filtro de seringa de 0,20 μm para ensaio HPLC. O aparelho de HPLC consistiu em uma bomba Dionex P580 e um amostrador automático Dionex ASI-100 conectado a um detector de fluorescência Dionex RF-2000 (Àex=333 nm; Àem=460 nm) e um detector de UV Dionex UVD340U em 257 nm. A eluição foi através de uma coluna nucleosil 100-5 C18 (250x4,6 mm, tamanho de partícula de 5 μm; Chrompack) com água/acetonitrila/ácido acético (100:100:1, v/v/v) em uma taxa de fluxo de 0,6 ml/min. A coluna foi mantida em 30°C e foi conectada à coluna de guarda (C18, 1 mm, Optimize technologies). A

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OTA e seus produtos de degradação foram monitorados ambos por uv em 235 nm e fluorescência (excitação em 278 nm e emissão em 440 nm).

[0264] Ensaio de preparações de A. niger para atividade de OTA. A mistura das reações consistiu em 245 μl de OTA (1 μg/ml) diluído em tampão de pH 7,0 de 50 mM de Mes-NaOH e 5 μl da amostra (caldo de A. niger, extrato livre de célula, frações após fracionamento de amônio e cromatografia ou produto a partir de A. niger). A reação foi executada em 40^oC por de 30 minutos a 2 horas. Foi usado um aquecimento em 95°C por 5 minutos para parar a reação. Amostras foram filtradas com o uso de filtro de seringa de 0,20 μm e 5 μl foram injetados no aparelho de HPLC.

[0265] Ensaio de lipase e esterase. A atividade de lipase e de esterase foram ensaiadas com o uso de butirato de p-nitrofenil (pNPB) adquirido a partir de Sigma como o substrato. Cinco microlitros de pNPB 40 mM dissolvidos em acetonitrila foram adicionados a de 165 μl a 50 mM de tampão Tris-HCl de pH 7,5 e 5 μl de solução de enzima e usados para testar a degradação de OTA. Densidade óptica foi seguida em 410 nm por 60 minutos.

[0266] Ensaio de atividade de protease (Método de placa de Petri). A atividade de protease foi confirmada com o uso de placas que contêm 1% caseína, 1% agarose em 100 mM de tampão de fosfato de hidrogênio dissódico em pH 6. A placa foi incubada ao longo da noite em 37°C e a atividade de protease foi revelada pelo desenvolvimento de um anel esbranquiçado ao redor do poço que contém enzima.

[0267] Ensaio de concentração de proteína. A concentração de proteína foi determinada com ensaio de proteína de Bio-rad com base em reagente no método de Bradford de acordo com o procedimento fornecido pelo fabricante. Com o uso de BSA como padrão, o OD foi medido em microplaca em 595nm, cada uma das amostras foi dosada em duplicatas.

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Purificação de Atividade de Degradação de OTA a partir de A. niger [0268] Preparação de amostra: Fracionamento de sulfato de amônio. Cinco gramas de Enzima Amano lipase foram dissolvidos em 100 ml de 50 mM tampão de Tris/HCl em pH 7,5. A quantia de sulfato de amônio correspondente a 40% de saturação foi adicionada e cristais foram dissolvidos. Após 10 minutos de centrifugação a 3.500 rpm, o sobrenadante foi coletado e o sulfato de amônio adicionado para atingir 60% de saturação. Os cristais foram dissolvidos por agitação e a solução foi centrifugada novamente. O pélete que corresponde ao precipitado a partir de 40% a 60% de saturação de sulfato de amônio foi dissolvido em 4x40 ml de 50 mM de tricina, 1M de sulfato de amônio em pH 7 e filtrado com filtro de 0,22 pm.

[0269] Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC). A amostra do fracionamento de sulfato de amônio foi injetada e aplicada ou em Fenil Sefarose FF, Butil- ou na coluna CL4B de Octil-Sefarose equilibrada com 50 mM de tricina que contém 1M de sulfato de amônio em pH 7 (tampão A). A coluna, conectada ao sistema purificador Akta, foi lavada com tampão A (10 ml/min) e as proteínas de ligação foram eluídas em um gradiente linear de 50 mM de tricina (Tampão B). Frações de 10 ml foram coletadas e usadas para ensaio de formamidase ou ensaio de atividade de OTA.

[0270] Cromatografia de troca aniônica (AEX). Frações com alta conversão de OTA foram agrupadas e dessalinizadas em uma coluna de PD10 equilibrada em 20 mM de Tris-HCl, em pH 7,5 (tampão A). A amostra dessalinizada foi aplicada a uma coluna Fonte Q30 equilibrada em tampão A (10 ml/min). A coluna foi lavada com o tampão A e as proteínas de ligação foram eluídas em um gradiente linear com de 0 a 1 M de NaCl em tampão A (Tampão B é o mesmo que o Tampão A mas contendo 1M de NaCl). Durante a gradiente, frações de 5 ml foram coletadas.

[0271] Concentração de proteína. Frações com atividade de

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59/104 degradação de OTA obtidas pela cromatografia de troca aniônica foram concentradas com o uso de concentradores da Amicon Centriprep™ com membrana de celulose regenerada (limiar molecular de 10 kDa).

[0272] Determinação de pH ótimo. Cinco microlitros de solução de enzima foram combinados com 1 μg/ml de 245 μl de OTA diluídos em tampões diferentes: 50 mM de tampão de acetato de sódio (pH 4, 4,5, 5 e 5,5); 50 mM de tampão de MES-NaOH (pH 6, 6,5 e 7); 50 mM de tampão Tris-HCl (pH 7,5, 8 e 8,5). As reações foram executadas em 37°C por 30 minutos e paradas pelo aquecimento em 95°C por 5 minutos.

[0273] Temperatura ótima. Cinco microlitros de solução de enzima foram misturados com 1 μg/ml de 245 μl de OTA em pH ótimo e incubada em 20, 30, 40, 60, 70°C por 30 minutos. As reações foram paradas pelo aquecimento em 95°C por 5 minutos.

[0274]Estabilidade de temperatura. A solução de enzima foi incubada em temperatura diferente (30, 40, 60, 70, 80 e 90°C) por 1h e 5 μl foram misturados com 1 μg/ml de 245 μl de OTA para reação de degradação de ocratoxina sob condições ótimas. As reações foram paradas pelo aquecimento em 95°C por 5 minutos. O controle não foi incubado.

[0275]SDS-PAGE. Para separar e analisar, foi usado a eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio de proteínas, (SDS-PAGE). Amostras de quarenta microlitros foram misturadas com 10 μl tampão de carregamento de 5x (que contém DDT e SDS), e fervidas por 5 minutos. 20 μl foram carregados em uma NuPAGE de 4 a 12% de gel de Bis-Tris (Invitrogen, E.U.A). A eletroforese foi acionada de acordo com o procedimento do fabricante. O gel foi manchado com azul de Coomassie.

[0276] Espectrometria de massa. A proteína de interesse foi cortada do gel (como acima) com o uso de um bisturi e transferida para um

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60/104 tubo de Eppendorf. A proteína foi digerida com uma enzima (principalmente tripsina). Após a digestão, os peptídeos foram extraídos e analisados por HPLC-MS/MS. Os espectros de MS/MS foram automaticamente procurados contra os bancos de dados de proteína para o propósito de identificação e caracterização.

[0277]Ensaios de inibição para formamidase e amidase 2. Um tablete de coquetel de inibidor de protease (PIC) (Roche Applied Science, Mannhein, Alemanha) foi dissolvido em 1,5 ml de água milliQ para obter uma solução estoque de 7x. Para ensaio de inibição de formamidase, ao invés de 100 μl de água milliQ normalmente empregadas, 20 μl de solução estoque de PIC de 7x e 80 μl de água milliQ foram misturados com outros componentes listados na seção de ensaio de formamidase de atividade. Para atividade de degradação de OTA, 35 μl de solução de PIC de 7x foram misturados com 210 μl de 1 μg/ml de OTA e 5 μl de solução de enzima. Uma solução estoque EDTA de 125 mM foi preparada e volumes apropriados para obter 10 mM e 50 mM da concentração final foram misturados com 1 μg/ml de OTA e 5 μl de enzima. Para controles, a solução inibidora é substituída ou por água milliQ para ensaio de formamidase de atividade ou tampão de MES-NaOH em pH 7 para atividade de degradação de OTA.

Resultados

Exemplo 1: Seleção para atividade de OTA [0278]Trinta enzimas que inclui várias lipases, proteases e amidases foram investidas por suas habilidades para degradar a ocratoxina A (Tabela 1). Somente a carboxipeptidase A e a lipase de A. niger (Amano™ A) foram capazes de decompor OTA conforme reportado anteriormente (Pitout, 1969; Stander et al., 2000). Além do mais, a protease de ácido aspártico pepAd2 (Danisco) a partir de A. niger mostrou um OTA que converte a atividade, embora seja menos eficiente. Para facilitar a

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61/104 comparação dessas três enzimas, a concentração de proteína de PEPAd foi determinada e a solução de enzimas de carboxipeptidase A e lipase A da Amano™ foram preparadas na mesma concentração (1 mg/ml). Uma cinética da degradação foi colocada em prática (Figura 1). A Figura 1 mostra que as cinéticas de degradação de OTA de lipase A da Amano™ e carboxipeptidase A eram similares. Após uma reação de 7 horas em 37°C, nenhum pico de OTA foi visível, o que significa que uma conversão inteira de OTA foi obtida. Para PEPAd, a conversão inteira não foi atingida mesmo após 1 dia de reação. O produto de lipase A da Amano™ foi uma mistura de enzimas diferentes, sendo que a atividade dominante é a lipase. Ademais, PEPAd, outras proteases de ácido aspártico de A. niger de PEPAa, PEPAb e PEPAc (Wang, 2010), elastase porcina, e carboxipeptidase Y de levedura, todos mostraram certa atividade com OTA. Essa é a primeira vez que foi mostrado que proteases aspárticas que não seja a metalo-protease (isto é, a carboxipeptidase A, uma protease dependente de Zn²⁺), elastase de protease de serina e carboxipeptidase Y são capazes de decompor OTA. Outras proteases, lipases e amidases listadas na Tabela 1 não foram capazes de decompor OTA (dados não mostrados).

Tabela 1. Enzimas seletas para degradação de ocratoxina A

Enzima	Organismo	Ref	pH	Fabricante
Carboxipeptidase A	Pâncreas bovino	C926 8	7,5	Sigma
Carboxipeptidase Y	Levedura	1275 8	7	USB
Carboxipeptidase Y	Levedura	C388 8	7	Sigma
Quimotripsina Chymostar			8	Christian Hansen
Elastase	Pâncreas suíno	E025 8	8,5	Sigma
Endoproteinase Glu-C	S.Aureus	7911 56	7,5	Roche Diagnostics
LG12	Bacillus subtilis		7,5	Danisco

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Enzima	Organismo	Ref	PH	Fabricante
Lipase A de Amano™	Aspergillus niger	5347 81	7,5	Amano™
PROACT #3617	Nocardiopsis prasina		7,5 /4	Novozymes
Peptidase proC de prolina			7
Protease termolisina	Bacillus thermoproteolyticus rokko	P151 2	8	Sigma
Proteinase K	Tritirachium album	p039 0	8	Sigma
Protease P3000	Bacillus subtilis		7,5
Tripsina	Pâncreas bovino	1098 19	8	Roche Diagnostics
Fosfolipase KLM1			7	Danisco
lipase 3			5,5	Danisco
Lipase	Rhizopus arrhizus	6230 5	8,5	Sigma
Lipase	Candida cylindracea	6231 6	6,5	Sigma
Lipase	Rhizopus niveus	6231 0	7,5	Sigma
GAP3	Aspergillus Niger		6	Danisco
PEPAa	Aspergillus Niger		6	Danisco
PEPAb	Aspergillus Niger		6	Danisco
PEPAc	Aspergillus Niger		6	Danisco
PEPAd1 (eliminação de c-terminal)	Aspergillus Niger		6	Danisco
PEPAd2 (comprimento inteiro)	Aspergillus Niger		6	Danisco
Grindamyl	Aspergillus Niger		7,5	Danisco
Amidase	Pseudomonas aeruginosa	A669 1	7	Sigma
Peptídeo Amidase	Citrus sinensis	1723 2	7	Fluka
Amidase		PLY5 11	7	Profors
Amidase de penicillina	E. coli	7642 9	7	Sigma

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Exemplo 2: purificação de atividade de degradação de ocratoxina A a PARTIR DE UM LÍQUIDO DE FERMENTAÇÃO DE A. NIGER OU CALDO FILTRADO (LIVRE DE CÉLULA).

[0279] Primeiramente, a precipitação de sulfato de amônio foi empregada. Diversas concentrações de sulfato de amônio foram aplicadas a um extrato de proteína de A. niger cru. A atividade de degradação de OTA foi determinada em ambos o sobrenadante e o pélete. Por aumentar a concentração de sulfato de amônio, a atividade de degradação de OTA foi transferida a partir do sobrenadante para o pélete. Em 60% de sulfato de amônio, toda a atividade de degradação foi encontrada no pélete. Isso demonstrou que a enzima foi capaz de hidrolisar os precipitados de micotoxina de 40% a 60% de sulfato de amônio. Na mesma concentração de sal (60%), uma leve atividade de lipase permaneceu no pélete (dados não mostrados).

[0280] A fração de sulfato de amônio de 40% a 60% foi empregada como o material de partida para purificação de enzima degradante de ocratoxina adicional. A cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), seguida por cromatografia de troca aniônica (AEX), conforme descrito acima, foram usadas para separar a atividade de lipase da atividade de degradação de OTA. A fração ativa foi suspensa em 50 mM de tricina-HCl (pH 7,0) que contém 1M de (NH4)2SO4 (Tampão A).

[0281 ] A Figura 2A mostra a porcentagem da área de OT-alfa obtida após a reação de 1 hora das frações obtidas a partir de Fenil Sefarose com OTA. Essa Figura mostra um aumento na atividade de degradação de OTA a partir da fração de n^o. 51 a n^o. 64, embora a maior atividade de lipase/esterase foi encontrada na fração de n^o. 65 a 68. Essa observação indica que a atividade de degradação de ocratoxina aparentemente não participou da atividade de lipase/esterase no produto de lipase da Amano™ (foi indicado anteriormente que a atividade de degradação de OTA era devido a atividade de lipase, Stander et

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64/104 al., 2000). A proteína que degrada o OTA foi eluída entre 90% e 100% de tampão B (50 mM de tricina-HCl (pH 7,0), sendo que indica que o meio de cromatografia de Fenil Sefarose aparentemente funcionou como um meio de afinidade. O OTA também contém um grupo fenila e a enzima degradante de OTA deve ser capaz de aglutinar o grupo fenila a partir de ou do OTA ou do meio de separação usado aqui. Em relação à atividade de lipase/esterase, sendo que estava presente em todas as frações obtidas dessa etapa, a mesma foi eluída em 100% de tampão B. Isso não é inesperado, pois as lipases/esterases executam hidrólise de lipídios e triglicerídeos, sendo que são substratos muito hidrofóbicos e, portanto, se aglutinam firmemente com matrizes hidrofóbicas semelhante a Fenil-Sefarose.

[0282] A Figura 2B mostra a porcentagem da área de OT-alfa obtida após uma reação de 30 minutos das frações de AEX com OTA. A atividade de OTA máxima foi encontrada na fração n^o. 26. Entretanto, também era nessas frações que a atividade de lipase relativa era a maior. Isso indica que a etapa de AEX não foi capaz de separar a lipase/esterase da atividade de degradação de OTA, isso foi usado por investigadores predecessores como a única etapa de cromatografia em suas tentativas de purificar a atividade de degradação de OTA (Abrunhosa et al., 2007).

[0283] Em suma, as figuras 2A e 2B indicam que a lipase/esterase não é a enzima que é responsável pela degradação de OTA (Figura 2A), conforme foi suposto mais cedo (Stander et al. (2000) e a separação da atividade de lipase/esterase a partir da atividade de degradação de OTA não foi alcançada por AEX, sendo que foi praticado por investigadores predecessores em um esforço para purificar a enzima que degrada OTA a partir de lipase da Amano™ (Abrunhosa et al., 2007). Os investigadores predecessores não mostraram que o meio de cromatografia de Fenil Sefarose, normalmente considerado como um meio de cromatografia de interação hidrofóbica que separa as proteínas com base em suas diferenças em hidrofobicidade, poderia ser usado aqui como um

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65/104 meio de separação de atividade para atividade de degradação de OTA.

[0284] Após a purificação por fracionamento de sulfato de amônio seguido por cromatografia de afinidade/HIC em Fenil Sefarose e AEX, as frações as quais contêm a atividade de degradação de OTA ainda tinham alguma atividade de lipase/esterase. A Figura 4 mostra os resultados da análise das frações ativas em OTA obtidos no procedimento de purificação de AEX da Figura 2B por SDS-PAGE. Pode ser observado que no gel existem duas bandas principais: A e B. O sequenciamento parcial dessas bandas pela espectrometria de massa seguida pela procura por homologia no banco de dados da proteína sugere que a Banda A compreende pelo menos 3 proteínas que correspondem respectivamente a:

- Acetamidase/formamidase prevista a partir de Aspergillus oryzae 45.012Da (cobertura de 27%)

2- Formamidase a partir de Aspergillus fumigatus 45.277Da (cobertura de 24%)

3- Formamidase a partir de Aspergillus nidulans 44.907Da (cobertura de 20%) [0285] E que a Banda B compreende pelo menos 3 proteínas que correspondem a:

1- Redutase de glioxilato/hidroxipiruvato a partir de Aspergillus oryzae 39.603Da (cobertura de 34%)

2- Acetilesterase a partir de Aspergillus awamori 32.640Da (cobertura de 9%)

3- Endo-1,4-beta-xilanase A precursor de Aspergillus niger 35.486Da (cobertura de 17%).

[0286] A partir dos resultados indicados na Figura 4, pareceu provável que a enzima a qual decompõe o OTA era formamidase de A. niger. As outras enzimas identificadas teoricamente não participaram da degradação de

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OTA. A purificação adicional de formamidase de A. nigerfoi efetuada.

Exemplo 3: purificação aprimorada de enzima de degradação de ocratoxina A [0287] Aprimoramento adicional para a purificação por

HIC e AEX não foi alcançada pelo uso de tampões diferentes e programas de gradiente diferentes. A purificação com o uso de Fenil Sefarose pode ser considerada como uma etapa de afinidade pelo fato de que a molécula de OTA tem o grupo fenila, entretanto, as impurezas têm alta hidrofobicidade e se aglutinam firmemente ao meio de fenil Sefarose e, portanto, se eluem muito atrasado (Figura 4A). Quando Octil- e Butil Sefarose forem empregados, a fração de atividade de degradação de OTA foi encontrada nas frações de fluxo passante não adsorvidas. Isso indica que o mesmo tem baixa hidrofobicidade e que sua aglutinação firme ao Fenil Sefarose tem uma natureza de afinidade (Figura 4A) enquanto que as impurezas que têm alta hidrofobicidade se aglutinam firmemente e são eluídas posteriormente (Figura 4B), como no caso com FenilSefarose.

[0288] O procedimento foi aprimorado ainda com o uso de fracionamento de sulfato de amônio (AS), HIC/afinidade em Fenil-Sefarose (HIC1), HIC em Butil-Sefarose (HIC2) e AEX, a fração ativa foi concentrada e dessalinizada com uma peneira molecular com o limiar de 10 kDa. As frações concentradas e dessalinizadas 5 e 6 mostradas na Figura 4 foram analisadas em SDS-PAGE (Figura 5). As bandas de proteína foram isoladas do gel e digeridas com tripsina. A digestão foi separada em RP-HPLC e analisada por MS para identificar a identidade das bandas de proteína.

[0289] Os resultados de MS indicam que após 4 etapas de purificação, a atividade de degradação de OTA não foi confinada a uma única banda, ao invés, as seguintes enzimas serem identificadas (ordem de intensidade): A formamidase (cobertura de sequência de 51%), o produto de degradação de formamidase (causado por protease) (30%), sequência de

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67/104 proteína A. niger não anotada (An14g02080, XP_001400834) que tem similaridade à amidase bacteriana (25%), glutamiltranspeptidase (17%), e aldose 1-epimerase (14%). A partir desses resultados, a enzima identificada que mais provavelmente decompõe OTA foi considerada como formamidase de Aspergillus niger como indicado pelos resultados nas Figuras 3 e 5, seguido por uma sequência de proteína de A. niger não anotada que tem similaridade à amidase bacteriana e glutamiltranspeptidase, sendo que todos os três têm atividades em direção à ligação de C-N, a qual existe na molécula de OTA.

Exemplo 4: caracterização das enzimas identificadas que podem ter o POTENCIAL PARA DECOMPOR OTA.

[0290] Com base nos resultados das Figuras 3, 4, 5 e 6, estudos adicionais foram efetuados nas duras Glutamiltranspeptidase e formamidase de enzimas de Aspergillus putativas, e a proteína hipotética An14g02080 (XP_001400834).

[0291] A formamidase putativa de origem em Aspergillus não foi anteriormente com relação a suas propriedades bioquímicas que incluem especificidade de substrato, embora tenha sido clonada a partir de A. nidulans e expressada conforme indicado indiretamente pela atividade de atividade de betagalactosidase (Fraser et al., 2001). A formamidase é conhecida por estar envolvida em metabolismo de dicarboxilato e glioxilato, e também em metabolismo de nitrogênio. O mesmo converte a formamida na presença de água em ácido fórmico (formiato) e amônio (formamida + H2O formiato + NH3).

A presença de atividade de formamidase foi ensaiada com o uso de kit de ácido fórmico da Megazyme, conforme indicado na seção de Material e método acima.

[0292] Quando esse ensaio foi colocado em prática com frações obtidas na etapa de AEX, a formamidase foi observada nas frações de 25 a 30 (Figura 6A). Isso foi a primeira indicação de que as preparações fúngicas ou de fungos, que incluem o produto de lipase de Amano™ preparado a partir de A.

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68/104 niger, tiveram uma formamidase ativa que decompõe a formamida em ácido fórmico e amônio. Igualmente importante, a atividade de formamidase foi purificada com o uso das etapas de purificação modeladas para purificar a atividade de OTA, o que sugere que a formamidase fúngica decompõe a OTA. Quando as mesmas frações testadas para a atividade de formamidase foram ensaiadas para degradação de OTA, a conversão aumentou a partir da fração 26 para a 32 (Figura 6B). Como pode ser visto a partir da Figura 6A e da Figura 6B, as duas atividades foram apresentadas nas mesmas frações. A partir dos dados, foi feita uma hipótese adicional de que a formamidase de A. niger ou formamidase de Aspergillus que não foi caracterizada antes, tinham atividades de degradação de OTA.

Exemplo 5: Análise de Formamidase e atividade de degradação de OTA em TRANSFORMANTES de A. NIGER QUE ABRIGA O GENE DE FORMAMIDASE DE A. NIDULANS [0293]Os transformantes de formamidase de A. niger foram analisados para atividade de formamidase e para atividade de degradação de OTA. Como pode ser visto a partir da Tabela 2, a atividade de formamidase foi detectada em 12 em cada 15 transformantes. Surpreendentemente, a formamidase A. niger aparentemente não foi capaz de decompor a OTA, como pode ser visto nos transformantes que tiveram alta atividade de formamidase, mas baixa ou nenhuma atividade de degradação de OTA. Isso indica que a formamidase fúngica pode não ter atividade de degradação de OTA, mas foi copurificada com a atividade de OTA através das 4 etapas de purificação.

[0294]De modo interessante, por integrar o DNA estrangeiro como no caso do gene de formidase de A. nidulans no genoma de A. niger, os inventores tiveram sucesso por um mecanismo desconhecido em criar transformantes que têm maiores atividades de degradação de OTA em comparação à cepa progenitora usada para a transformação de A. niger, ver,

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69/104 por exemplo, os transformantes 7#, 2#, 8#, 11#, 15#. Observe que o 16# era do tipo selvagem (cepa progenitora). O controle era a reação sem a adição de caldo. O caldo de fermentação foi usado para todos esses ensaios. A mistura de reação continha 10 pl de caldo, 50 pl de OTA (1 pg/ml), 100 pl de fosfato de sódio (67 mM, pH 7 ou pH 9). Para o controle, 10 pl de caldo a partir de uma cultura de 5 dias de idade em uma fermentação de frasco sacudido foi substituído por 10 pl de água. No término da reação, 160 pl de acetonitrila foi adicionada para parar a reação, e filtrada, e 10 pl foram injetados para análise de HPLC.

[0295]Com base na verificação surpreendente de que a formamidase de Aspergilli não foi capaz de decompor a OTA, os inventores efetuaram uma pesquisa adicional para identificar se um segundo candidato para degradação de OTA, isto é, a amidase 2 designada da proteína de A. niger (An14g02080, XP_001400834) hipotética no presente documento teve atividade de degradação de OTA.

Exemplo 6: Construção de um plasmídeo de expressão do gene de amidase 2 PUTATIVA [0296] O gene de amidase 2 putativa a partir de Aspergillusniger codifica a proteína de amidase de 480 aminoácidos (SEQ ID NO: 1). Para construir o plasmídeo de expressão recombinante para o gene A. nigeramidase2, dois iniciadores GGAGATCTATCATGGTCCGCCGAATTG e AATCTAGACTAGTGATGGTGATGGTGATGCAGAAAAGGATTACGTG foram usados em uma reação Pfu Ultra II PCR com modelo de DNA genômico obtido a partir da cepa UVK143 de A. niger (Ward et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 39: 738-743, 1993). A reação de PCR foi executada por 30 ciclos de 95^oC por 30 segundos, 50^oC por 30 segundos e 72^oC por 1 minuto com os dois iniciadores. A extensão final em 72^oC foi feita por 5 minutos e a reação foi resfriada para 4^oC. A sequência de nucleotídeos da região de codificação do amplicon de PCR

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70/104 resultante, sem a etiqueta His, é listada como SEQ ID NO: 2. O fragmento de PCR foi purificado com uma coluna de rotação da Qiagen. O mesmo foi digerido com enzima de restrição BglII e Xbal e clonado no vetor de plasm ídeo de pGAPT (ver, por exemplo, patente n^o. U.S. 6. 426.410) que foi digerido com BglII e Xbal. O plasmídeo resultante, pGAPT-amidase 2 (mostrado na Figura 7) foi confirmado por sequenciamento de DNA para ter um gene recombinante que compreende A. nigeramidase 2 inserido entre o promotor de glucoamilase de A. niger e um terminador de glucoamilase de A. tubingensis. A sequência de proteína codificada correspondente é mostrada na SEQ ID No. 4, a qual é idêntica à SEQ ID No. 1, exceto pelo fato de que seis resíduos de histidina foram adicionados na extremidade de c-terminal da proteína para assistir a purificação de proteína. Exemplo 7 Construção de uma cepa de produção de amidase 2 recombinante [0297] A cepa AP4 de A. niger (Berka et al, Gene 86: 153-162, 1990) foi transformada com o plasmídeo de pGAPT-amidase 2 com o uso de um protocolo de transformação de fusão de protoplastos mediado por PEG. O protocolo de transformação utilizou uma modificação do método de Campbell (ver, Campbell et at., Curr. Genet. 16:53-56 (1989)) com Lysing Enzyme de Trichoderma harzianum (Sigma, L1412). Mais que cem transformantes foram obtidos e trinta transformantes foram selecionados na placa MM. A cepa progenitora AP4 de controle e quinze transformantes foram escolhidos para serem cultivadas em placas de CMA primeiro e os batoques de ágar com micélio, que contêm ambos o micélio e esporos das placas de CMA, foram transferidos para os frascos sacudidos que contêm 30 ml de meio de cultura. Os transformantes foram cultivados por 6 dias em 28°C. Os péletes de micélio da cepa AP4 de controle e todos os quinze transformantes foram lavados com água pelo menos duas vezes. Os péletes de micélio foram suspensos em CelLytic Y Cell Lysis Reagent (Sigma, C4482). As proteínas intracelulares foram extraídas em temperatura ambiente por 2 horas. As suspensões foram rotacionadas para

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71/104 baixo, e 15 μΙ dos sobrenadantes que contêm as proteínas intracelulares extraídas foram analisados com o uso de géis de SDS-PAGE (Figura 8). Os caldos de cultura foram rotacionados para baixo em uma microcentrífuga por 10 minutos e 15 μΙ do sobrenadante (proteínas extracelulares) foram analisados com o uso de géis de SDS-PAGE (Figura 8).

Tabela 2. Análise de formamidase e atividade de degradação de OTA em TRANSFORMANTES DE A. NIGER QUE ABRIGAM O GENE DE FORMAMIDASE DE A.

NIDULANS

Transformant e de A. niger no. # que abriga o gene de A. nidulans gene	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16 tipo selvage m	Controle
Área de pico de OTA, em pH 9, 19 horas, 37oC	3 0	7	2 3	1 3	27	20	0	7	10	11 5	7	37	70	10 8	8, 2	36	168
Área de pico de OTA, em pH 7, 19 horas em 37oC	*									10 2		0	14 5	13 8	0	20	128
Área de pico de OTA, em pH 9, 45oC, 4 horas			7 0	5 5			93			10 5	52	86	12 9	11 6		117	116
Área de pico de OTA de OTA, em pH 7, 45oC, 4 horas			1 7	1 7			4, 3			10 4	16	14	11 8	12 2		76	126
Atividade de formamidase em pH 7 a 37oC	2 1 6	2 3	0	0	32 5	16 0	19 5	10 4	12 9	10 8	4	43 1	23 2	0	17 1	0	0

* não analisado [0298] A Tabela 3 mostra o meio usado (por litro) para cultivar Aspergillus niger e seus transformantes em frascos siliconizados de 250 ml com 30 ml do meio. As cepas de A. nigerforam primeiramente cultivadas em placas de CMA por de 3 a 5 dias e 2 cm² e adicionalmente foram transferidos ao frasco e cultivados em 30^oC por 5 dias. Para o tipo selvagem (cepa de controle ou cepa progenitora 620), 0,5 mg/ml de uridina foi suplementada.

Sólidos de Maceração de Milho 50 g

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NaH2PO4.H2O 1 g

MgSO4.7H2O 1,0238173 g

50% (p/v) de Xarope de Milho de 100 ml

Staley 7350

Desidratação por Citrato de Sódio 8 g (Na3C6H5O72H2O) pH para 5,8 a 6,0

Levar ao volume com H2O milliQ [0299] Cepa pode ser cultivada em placa de CMA (por litro):

Dextrose (Glucose) 20g

Extrato de Malte de Bacto BD 20g

Peptona de Bacto BD1 g

Ágar de Bacto BD 20g

Autoclave e placas pobres [0300] Figura 8. Análise de SDS-PAGE das proteínas intracelulares de A. niger que abriga o gene de Amidase 2. A banda de proteína de amidase 2 foi indicada por uma barra indicadora. Marcador de m. molecular, AP4, a cepa progenitora de A. niger. Os transformantes foram numerados de 1 a 15.

[0301] A Figura 9 mostra o SDS-PAGE de proteínas extracelulares de A. nigerque abrigam o gene de Amidase 2. A banda de proteína de amidase 2 é indicada por uma barra indicadora. As outras bandas principais acima da banda de amidase 2 eram α-amilase e glucoamilase secretadas por A. niger. As amostras carregadas aos géis eram os caldos de fermentação dos transformantes diferentes.

[0302] No intuito de confirmar a suposta banda de amidase 2 separada em SDS-PAGE era de fato o produto do gene de amidase, a banda foi cortada e digerida com tripsina por uma digestão em gel. Os digeridos foram separados por RP-HPLC e analisados por espectrometria de massa. Isso revelou 4 sequências de aminoácidos, sendo que são encontradas na sequência de amidase 2 putativa (SEQ ID NO: 1) (Figura 18A). As quatro sequências identificadas eram:

1. EALQNGY;

2. ALPAGEVLGSY;

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3. GAGPL;

4. SVGPQAPL.

Exemplo 8: Caracterização de amidase 2 recombinante com relação a sua DEGRADAÇÃO DE OTA E PARÂMETROS CATALÍTICOS E BIOQUÍMICOS [0303] Conforme mostrado na Figura 10, ambas as frações intracelulares e extracelulares (caldo) dos 15 transformantes de A. niger que abrigam o gene de codificação de proteína putativa (amidase 2) com adição da cepa progenitora (peso) foram ensaiadas por sua capacidade de decompor a OTA. A Figura 10 surpreendentemente mostra que a proteína hipotética que codifica o gene de A. niger da Genbank (An14g02080, Acc n^o XP_001400834) codifica uma enzima ativa que tem atividade de degradação de OTA, e essa enzima ativa foi encontrada ambas intracelularmente e extracelularmente. Um indivíduo pode ver que os melhores transformantes são os transformantes 3, 4, 7, 11, 13 e 14, como nenhum OTA detectável foi deixada (isto é, abaixo do nível detectável de 2 pbb) após a incubação com as frações extracelulares ou as intracelulares (o caldo). Comparada à cepa progenitora (peso) A. niger, os transformantes 8, 10 e 15 também tiveram uma atividade de degradação de OTA muito maior.

[0304] A amidase 2 recombinante estava ativa pelo menos entre pH 3 a 9 na OTA degradante. A Figura 11 mostra que a atividade de enzima era a maior em pH 7,0, seguido por pH 6 e 8; pH 5 e 9.

[0305] A amidase 2 recombinante era aparentemente termicamente estável, como visto a partir da Figura 12, conforme mais que 80% da atividade permaneceu após a pré-incubação de 5 a 30 minutos em 80^oC, comparada ao controle, onde nenhuma enzima foi adicionada. A mistura de reação de 5 pl de enzima com a adição de 45 pl de 67 mM de fosfato de sódio (pH 7,0) foi incubada em 80^oC por de 0a 30 minutos antes de adicionar outros 50 pl do tampão de fosfato e 25 pl de 1 pg/ml de OTA, e incubada em 30^oC por 60 minutos. A reação

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74/104 foi parada ao adicionar 130 μΙ de acetonitrila que contém 0,2% de ácido acético (v/v). A mistura de reação foi filtrada e injetada (10 μ^ para análise de HPLC. Ctrl era o controle onde nenhuma amidase foi adicionada.

[0306] Ainda mais, a amidase 2 recombinante era bem estável em 70^oC e entre pH 6 e 9. A estabilidade diminuía com a diminuição do pH (Figura 13). A atividade foi ensaiada em pH 7,0 e 30^oC. A mistura de pré-incubação continha 5 μl de mistura de amidase 2 (155 μg de proteína/ml), 45 μl de 67 mM de tampão de fosfato (pH 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9). As amostram foram pré-incubadas em 70^oC por 30 minutos. Após resfriar até 30^oC, 2 μl de 0,5 mg/ml de OTA em etanol e 80 μl de 0,2 M de Mops-NaOH (pH 7,0) foram adicionados e a reação incubada em 30^oC por 60 minutos. A reação foi parada ao adicionar 130 μl de acetonitrila que contém 0,2% de HAC, filtrada e injetada em RP-HPLC com uma injeção de 5 μl para monitorar a OTA remanescente.

Exemplo 9: Purificação da amidase 2 mat recombinante a partir do caldo de FERMENTAÇÃO DE A. NIGER QUE ABRIGA O GENE DE AMIDASE 2 [0307] O caldo do transformante 13, o qual teve alta atividade de OTA (Figura 10), foi usado para purificar a amidase 2 mat recombinante por fracionamento de sulfato de amônio, cromatografia de afinidade em Fenil Sefarose, HIC em Butil-Sefarose e AEX, conforme descrito abaixo.

1) Fracionamento de (NH4)2SO4. Para 40 ml do caldo de A. niger que abriga o gene de amidase 2 A. nigerfoi adicionado (NH4) 2SO4 para 40% de saturação por agitação. Após 10 minutos de centrifugação em 3.500 rpm, o sobrenadante foi coletado e (NH4) 2SO4 adicionado para 60% de saturação por agitação e a solução foi centrifugada novamente. O pélete que corresponde ao precipitado entre 40 e 60% de saturação de (NH4) 2SO4 foi dissolvido em 40 ml de 50 mM de tricina-HCl (pH 7,0) que contém 1M de (NH4) 2SO4 e filtrado com filtro de 0,22 μm.

2) Interação hidrofóbica/cromatografia de afinidade. A amostra

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75/104 filtrada a partir da etapa acima foi carregada em uma coluna de Fenil Sefarose FF (2.6x10 cm). Seguido por uma lavagem com tricina-HCl (pH 7,0) que contém 1M de (NH4) 2SO4, as frações ativas foram eluídas em 10 ml por tubo em uma taxa de fluxo de 10 ml/min com uma gradiente linear de 50 mM tricina-HCl (pH 7,0) a partir de 1 M a 0 M de (NH4) 2SO4. A purificação foi alcançada no sistema purificador Akta.

3) Cromatografia de troca aniônica. As frações ativas eram agrupadas e dessalinizadas em uma coluna de PD10 equilibrada em 20 mM de Tris/HCl, pH 7,5 (tampão A). A amostra dessalinizada foi aplicada a uma coluna fonte Q15 equilibrada em tampão A (10 ml/min). A coluna foi lavada com o tampão A e as proteínas de ligação foram eluídas em um gradiente linear de 0 a

M de NaCl em tampão A. Durante a eluição de gradiente, frações de 5 ml foram coletadas. As frações ativas foram analisadas em SDS-PAGE (Figura 14A), o qual indica que a amidase 2 mat foi purificada basicamente até a homogeneidade. A atividade foi relacionada a uma banda de proteína que tem uma massa molecular logo abaixo de 49 kDa no SDS-PAGE (Figura 14). A espectrometria de massa por medição de Maldi-tof indica que essa banda de proteína pode ter uma massa de 47,214 Da (+2%) (Figura 14B). O sequenciamento de N-terminal da fração 12 indica que o N-terminal da amidase mat iniciou em STDEAKVTI (SEQ ID NO. 33). O comprimento inteiro da amidase 2 de 480aa com 6 resíduos de histidina é estimado como que tem uma massa molecular de 51.983 Da, enquanto que é suposto que a amidase 2 truncada de 42aa de N-terminal com 6 resíduos de histidina em seu C-terminal tem uma massa de 47.338 Da. Isso indica que a amidase 2 secretada no caldo de A. niger, isto é, a amidase 2 mat, é a amidase 2 que foi processada por uma peptidase de sinal ou outra peptidase no caldo de cultura que cliva entre a ligação de peptídeo de Ala-Ser em Amidase 2 sig.

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Exemplo 10: Especificidade de substrato de amidase 2 Determinação de Km/Vm:

[0308]Com o uso das frações obtidas na etapa de AEX da amidase 2 mat, as constantes cinéticas de Km e Vm da enzima que degrada OTA eram de 0,29 μΜ/minutos e 13 μΜ, respectivamente, pelo uso do método de cálculo de Lineweaver-Burk.

Degradação de ocratoxina B:

[0309]A solução de enzima da amidase 2 mat obtida após o AEX foi testada em ocratoxina B na mesma concentração e sob condições ótimas por uma hora. A taxa de degradação com ocratoxina B era de 8% comparada à OTA.

Exemplo 11: Atividade de amidase 2 mat pura em decompor OTA [0310]A atividade de degradação de ocratoxina A (OTA) da amidase 2 mat purificada a partir do caldo de fermentação de A. niger que abriga o gene de amidase 2 como uma função de sua concentração é mostrada na Figura 15. Pode ser visto a partir da Figura 15 que a degradação de OTA era dependente da concentração de amidase 2 mat. Um indivíduo também pode ver que após 30 minutos com uma concentração de amidase 2 mat concentração de 160 ng/ml, a OTA diminuiu em 83%. A partir da região linear da Figura 15, a atividade específica calculada para a amidase 2 mat era de 900 nanomoles de OTA hidrolisados por minuto por mg de proteína em pH 7,0 e 40^oC em uma concentração de OTA de 1 μg/ml de mistura de reação. A reação para a Figura 15 foi executada em 0,1 Mops-NaOH (pH 7,0) e 40^oC por 30 minutos antes que fosse parada pela adição de volume igual de acetonitrila que contém 0,2% de ácido acético, e analisada em RPHPLC em uma coluna C18, conforme descrito na seção de Material e Método.

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Exemplo 12: Diferenças em sensibilidade para Ca²⁺ entre a amidase 2 INTRACELULAR E EXTRACELULAR ENCONTRADA EM A. NIGER.

[0311] Foi observado que a amidase 2 (isto é, amidase 2 mat) purificada a partir do produto de lipase da Amano™ ou a partir do caldo de A. niger transgênico que abriga o gene de amidase 2 eram ambos inibidos por cerca de 40% de sua atividade na hidrólise de OTA por 8 mM de CaCl2 (Figura 16), enquanto que a fração intracelular de amidase 2 (amidase 2 sig) de A. niger transgênico não foi apreciavelmente inibida por CaCl2 em 8 mM de CaCl2 (Figura 17). Esses resultados indicam que a perda do N-terminal de amidase 2 resultou na sensibilidade a inibição por Ca²⁺. A inibição por Ca²⁺ foi superada pela adição de quelantes divalentes que incluem EDTA em uma base molar igual. Também, é conhecido que a atividade de degradação de OTA no produto de lipase da Amano™ é sensível ao EDTA. Esse exemplo indica que o uso de amidase 2 mat em sistemas que contêm íons divalentes pode ser assistido pela adição de um quelante, tal como o EDTA. O ácido cítrico e outro ácido orgânico, tal como ácido propiônico, foram amplamente usados como aditivos de alimentação e podem quelar o íon divalente ou os íons trivalentes, o que alivia sua inibição de amidase 2 mat. Por outro lado, EDTA também inibiu a amidase 2 mat recombinante (dados não mostrados). Esses resultados sugerem que a amidase 2 mat pode ser usada para a desintoxicação de OTA, mas tem certas limitações devido a sua sensibilidade a íons de metal trivalente ou divalente e a quelantes como o EDTA, enquanto que foi verificado que a amidase 2 sig é muito menos sensível a íons de metal trivalente ou divalente e a quelantes como EDTA (ver abaixo), o que indica a importância do comprimento inteiro da amidase 2, ao invés da amidase 2 secretada ou processada ou madura (isto é, amidase 2 mat) encontrada no caldo de A. niger.

Exemplo 13: Degradação de OTA pela amidase 2 extraída da fração INTRACELULAR (Amidase 2 SIG) de A. NIGER.

[0312] Esse exemplo mostra a vantagem de usar a forma menos

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78/104 sensível de amidase 2, isto é, a amidase 2 sig. Como pode ser visto a partir da Figura 17, 20 mM de CaCl2 ou 20 mM de EDTA não causaram inibição à amidase 2 sig comparado à amidase 2 mat (Figura 16). Isso fornece uma vantagem clara para usar a amidase 2 sig em aditivos que compreendem um quelante na desintoxicação de OTA. A reação continha 60 μΙ de mops-NaOH (0,2M, pH 7,0), 20 mM de CaCl2, 20 mM de EDTA, amidase 2 sig (0,46 μg de proteína) extraída da célula de A. nigerque abriga o gene de amidase, 2 μl de 25 μg/ml de OTA e água para um volume final de 120 μΙ A reação foi executada em 37^oC por 30 minutos e parada por adicionar 150 μl de acetonitrila que contém 0,2% de ácido acético. A OTA e seu produto, OT-alfa (=OTa), foram analisados em RP-HPLC em coluna C18 com uma injeção de 5 μΙ O controle positivo (PC) não continha aditivos diferentes do tampão da amidase e da OTA. O material bruto continha somente tampão e OTA.

Exemplo 14: Degradação de OTA em farinha de milho e DDGS (Grãos Secos de Destilaria com Solúveis) pela amidase 2 sig extraída da fração INTRACELULAR (Amidase 2 SIG) de A. NIGER.

[0313] O milho é o veículo principal para OTA e a mesma pode ser carreada ainda através de e concentrada em DDGS em produção de bioetanol. Milho e DDGS são amplamente usados como ingredientes de alimentação. O nível de micotoxina em DDGS é o fator habitual que limita a quantia de DDGS que pode ser adicionada para a alimentação. Os exemplos aqui indicam essa habilidade da amidase 2 sig em degradar a OTA em farinha de milho e DDGS:

[0314] Para farinha de milho, para 50 mg de farinha de milho foram adicionados 210 μl de água, 8 μl de OTA(25 μg/ml) e 20 μl de amidase 2 sig (3,1 μg de proteína), misturados e incubados em 37^oC por 22 horas. A concentração de OTA diminuiu de 800 ppb no início para 14 ppb no término. A análise de OTA por HPLC é descrita na seção de materiais e métodos acima.

[0315] Para DDGS, 1 g foi suspensa em 10 ml de água, o pH foi

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79/104 ajustado para 6,7 com NaOH. Para 210 μΙ dessa pasta aquosa foram adicionados 8 μl de OTA (25 μg/ml) e 20 μl de amidase 2 sig (3,1 μg de proteína), misturados e incubados em 37^oC por 22 horas. A concentração de OTA diminuiu de 800 ppb no início para 5 ppb no término. A análise de OTA por HPLC foi descrita na seção de materiais e métodos acima.

Exemplo 15: Degradação de OTA em leite por amidase 2 mat.

[0316] É conhecido que muitos produtos alimentícios que incluem leite e queijo podem ser contaminados com OTA. Esse exemplo testa a degradação de OTA em leite com o uso de amidase 2 mat.

[0317] 0,15 ml de leite desnatado (1,5% de gordura, 3,4 g de proteína, 4,7g de carboidrato, 120 mg de Cálcio, 95 mg de Fósforo em 100 ml) a partir de Arla Foods Amba (Aarhus, Dinamarca), 3 μl de OTA (2,5 μg/ml), 7,5 μl de amidase 2 mat purificada (a partir do caldo de A. nigerque abriga o gene de amidase 2), que contém 0,22 μg de proteína, foram misturados e reagiram em 40^oC por 2,5 horas. A OTA diminuiu de 47 ppb no início para um nível não detectável (<2 ppb) após 2,5 horas de incubação. A análise de OTA por HPLC foi descrita na seção de materiais e métodos acima.

Exemplo 16: Amidase 2 mat na desintoxicação de OTA na farinha de milho [0318] A mistura de reação em 1,5 ml de tubos eppendorf (C1-3) compreendeu 60 mg de farinha de milho, 200 μl de Mops-NaOH (0,2 M, pH 7,0), 40 μl de mistura de amidase 2 (a qual era a mistura de um volume igual do caldo de transformante de A. niger que tem gene 3, 4, 7, 8, 10, 11, 13, 14, e 15 de amidase 2), 20 μl de OTA (0,5 mg/ml). O volume total dos três componentes era de 260 μ^ OTA final era de 38 μg/ml ou 38 ppm ( ppm, partes por milhão). Controle: Os tubos dos Controles (C-4-6) eram os mesmos que C1-3, exceto pelo fato de que a preparação de amidase (o caldo) foi substituída com água.

[0319] A reação foi executada em 30^oC com sacudidas por 20 horas antes da adição de volume igual de 260 μl de acetonitrila que contém 0,2% de

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80/104 ácido acético para parar a reação e para extrair a OTA. Após a centrifugação e a filtragem, o filtrado foi analisado em HPLC. Os resultados de HPLC indicam que a OTA remanescente não era detectável (menos que 2 ppb), o que indica que a amidase 2 mat foi capaz de reduzir a OTA na farinha de milho de 38 ppm para menos que 2 ppb.

Exemplo 17: Amidase 2 mat na desintoxicação de OTA em alimentação com base EM MILHO E SOJA.

[0320] Os testes de amidase 2 mat com a alimentação com base em soja e milho (cuja composição é dada na Tabela 3) contaminada com OTA foi exatamente como o teste com a farinha de milho, isso é, os tubos de S 1 a 3 (experimentais) estavam com o caldo enquanto para os tubos de S 5 a 6 (controles) o caldo foi substituído por água. Após incubação de 20 horas, o nível de OTA foi reduzido de 38 ppm para 6,6 ppm, uma redução de 6 vezes ou 82%.

Tabela 3. A composição da alimentação com base em milho/soja usada

Ingredientes da Dieta de Milho	Porcentual
Milho	60,01%
Farinha de feijão-soja 48	31,52%
Óleo de soja	4,00%
Sal	0,40%
DL Metionina	0,20%
Calcário	1,16%
Fos de dicálcio	1,46%
VIT/MIN	1,25%
Total	100%

Exemplo 18: Solver a estrutura de cristal de Amidase 2 [0321] 15 cristais de amidase 2 foram obtidos conforme mostrado na Tabela 4.

[0322] Os cristais AM7 e AM15 foram difratados por raio x e a estrutura desses dois cristais de amidase 2 (aa 45 e 480) foi solvida em resolução de 2,5A.

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81/104 [0323] Foi mostrado que a Amidase 2 tem uma estrutura similar a uma estrutura de Tim Barrel, conforme mostrado na Figura 20 e o local ativo conforme mostrado na Figura 21. Um resumo dos dados para a estrutura de cristal solvido para o conjunto de cristal AM7 é estabelecido abaixo.

Conjunto de dados: am7	Invólucro Externo 2,64
Baixo limite resolução	de	Totalidade 80,00	Invólucro Interno 80,00
Alto limite resolução	de	2,50	7,91	2,50
Rmerge		0,182	0,044	0,611
Rmerge em		0,057	-	-
Número total observações	de	441.395	14.486	65.195
Número total único	46.056	1.566	6.711
Meio((l)/sd(l))		9,4	20,5	3,3
Completude		96,5	93,3	97,6
Multiplicidade		9,6	9,3	9,7

[0324]A estrutura foi solvida com o uso de Phaser e ao analisar um ensemble das 5 estruturas mais similares.

[0325] Foi encontrado que o local ativo de amidase 2 (SEQ ID NO:1) inclui pelo menos os seguintes resíduos: His111, His113, His191, Lys246, His287, His289, His307, Asp378 e Val 253. O mesmo pode acomodar pelo menos dois íons d metal para propósitos de estrutura/e catálise, sendo que forma o assim chamado de um centro de metal binuclear.

[0326] As coordenadas para um monômero da enzima o qual está na forma de um tetrâmero são mostradas na Figura 22.

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Tabela 4: Conjuntos de cristal e parâmetros relacionados

Conjunto	SG	Célula	Resol./ após escal.	Rmerge	Compl	Mol/ASU	Placa/gota	Cond. de cristal	Linha de feixe/Sincroton
AM1	P212121 ?	80 112 173	1,85/1,9	15,5/50,6	95,3/97,4	2 a 4	AM3/C1	PEG3K, NaAc 4,6	ID14-4 ESRF
AM2	P42i2	184 184 79	3,19/3,2	16,5/46,4	100/100	2	AM8/B5	PEG3K, Kacit, Tris 8,5	ID29 ESRF
AM3	P42i2	183,5 183,5 79,5	2,8/3,4	17,4/43,0	99,9/99,6	2	AM8/B6	PEG3K, Kacit, Bicina 9	ID29 ESRF
AM4	???	???	2,9/?	??	??	??	AM13/C2	AS, Hepes 7	ID29 ESRF
AM5	P42i2	184 184 79	2,9/3,2	17,4/56,5	99,8/99,4	2	AM8/B6	PEG3K, Kacit, Bicina 9	ID29 ESRF
AM6	P42i2	184 184 79	2,81/3,5	22,3/50,9	99,7/100	2	AM8/A5	PEG3K, Kcit, Tris 8,5	ID29 ESRF
AM7	P42i2	184 184 80	2,5/2,5	18,2/61,1	96,5/97,6	2	AM8/A5	PEG3K, Kcit, Tris 8,5	ID29 ESRF
AM8	I2	213 80 218	2,7/~3	13,1/66,1	85,8/85,8	8	AM5/A5	PEG3K, K3cit	ID29 ESRF
AM9	P42i2	183 183 94	2,57/3,1	30,3/84,6	86,7/86,7	2	AM12/B5	PEG3K, Kcit, Tris 8,5	ID14-4 ESRF
AM10	P42i2	183 183 94	2,7/2,7	16,3/64,7	94,9/97,8	2	AM8/A6	PEG3K, K3cit, Bicina 9	ID14-4 ESRF
AM11_Zn	P2i2i2i ?	79 111 172,5	~2,5	??	??	2 a 4	AM3/C5	PEG3K, NaAc 4,6	ID29 ESRF
AM12	P42i2	184 184 79	2,5/2,95	18,3/62,9	91,5/92,8	2	AM15/C6	PEG3K, K3cit, Bicina 9	ID29 ESRF
AM13	P42i2	184 184 79					AM15/C6	PEG3K, K3cit, Bicina 9	ID29 ESRF
AM14	P42i2	183,5 183,5 79	2,5/3,0	19,7/74,6	96,2/97,2	2	AM15/C6	PEG3K, K3cit, Bicina 9	ID29 ESRF
AM15	I2	213 80 218	2,45/2,5	10,1/35,8	91,0/70,5	8	AM15/B1	PEG3K, K3cit, Cit 5	ID29 ESRF

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Tabela 5. Os elementos estruturais da amidase 2 [0327] Codificação de cor: branco = domínio de sanduíche menor, Cinza escuro = domínio de cilindro catalítico, cinza claro = filamentos de cilindro e hélices de cilindro; hélice a7 também pode ser considerado como uma hélice de cilindro

Nr. de filamento β	Resíduos de filamento β	Nr. hélice α	Resíduos de hélice α	Nr. de hélice y	Resíduos de hélice Y
1	48 a 58
2	65 a 74
3	76 a 83
				1	84 a 86
		2	87 a 94
4	96 a 105
5	106a 112
		3	124 a 130
		4	131 a 149
6	150 a 157
		5	160 a 170
7a	177 a 181
7b	184 a 186
		6	198 a 207
8	220 a 224
		7	226 a 240
9	245 a 249
		8	266 a 280
10	283 a 288
		9	290 a 301
11	303 a 308
		10	312 a 323
12	325 a 328
		11	329 a 338
		12	345 a 370
13	372 a 374
		13	386 a 395
		14	399 a 408
				15	410 a 419
14	432 a 437
				16	443 a 448
				17	449 a 451
15	452 a 458
16	461 a 464

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Exemplo 19. Expressão de amidases das espécies fúngicas Glomerella

M1.001 e Metarhizium ARSEF 23 em Trichoderma reesei.

[0328] Para expressar as amidases de Glomerella M1.001 e Metarhizium ARSEF 23, ambos os genes foram sintetizados como sequências otimizadas por códon para a expressão em T. reesei e clonados no vetor pDonor221 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) pela Life technologies (Alemanha). Códons 6xHis foram adicionados na região de codificação 3' de cada gene para propósitos de purificação. Para habilitar a expressão de ambas as amidases no Trichoderma reesei, suas sequências de codificação foram clonadas o vetor de destino compatível Gateway pTTT-pyrG13 (descrito em WO2010141779A1 e PCT/US10/57531) por meio da reação de recombinação LR Gateway®. Esse vetor contém as regiões de terminador e promotor derivado de T. reesei cbhI que permitem uma expressão induzível forte de um gene de interesse, os marcadores seletivos Aspergillus nidulans amdS e pyrG que conferem o crescimento de transformantes ou na acetamida como uma fonte de nitrogênio única ou na ausência de uridina ou ambos e as regiões de telômero de T. reesei que permitem a manutenção de plasmídeo não cromossômico em uma célula fúngica. As regiões de terminador e promotor cbhI são separadas pelo gene de resistência de cloranfenicol, Cm^R e o gene de E. coli letal, ccdB, flanqueado pelos sítios de recombinação específicos com base no bacteriófago lambda attR1, attR2. Tal configuração permite a seleção direta de recombinantes que contêm um gene de interesse sob o controle dos elementos reguladores cbhI na orientação correta por meio da reação de recombinação LR Gateway®.

[0329] As reações de recombinação LR entre os clones pEntry de cada gene de amidase e o vetor de destino pTTT-pyrG13 foram feitos com o uso da mistura de enzima LR clonase™ II de acordo com o protocolo da Invitrogen. Os produtos de recombinação gerados foram transformados em

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E.coli Max Efficiency DH5a, conforme descrito pelo fornecedor (Invitrogen) e os clones que contêm os construtos de expressão pTTT-pyrG13-Amidase G. graminicola e pTTT-pyrG13-Amidase M. anisoplia foram selecionados em placas de ágar 2xYT (16 g/l de Bacto Tryptone (Difco, EUA), 10 g/l de Bacto Yeast Extract (Difco, EUA), 5 g/l de NaCl, 16 g/l de Bacto Agar (Difco, EUA)) com 100 pg/ml de ampicilina. Após o crescimento das culturas bacterianas no meio 2xYT com 100 pg/ml de ampicilina, os plasmídeos isolados foram submetidos à análise de restrição e os clones com o padrão de restrição correto foram usados para a transformação da cepa negativa pyrG de Trichoderma reeei 2830 deletada para 4 celulases principais cbhl, cbhII, eglI, eglII (WO2010141779A1). Os plasmídeos de expressão finais pTTT-pyrG13-Amidase G. graminicola e pTTT-pyrG13Amidase M. anisopliae são mostrados nas Figuras 23 a 25.

[0330] 0,5 a 2 pg de cada plasmídeo de expressão foi transformado em T. reesei com o uso do método PEG-Protoplast com ligeiras modificações, conforme indicado. Para a preparação de protoplastos, esporos foram cultivados por 16 a 24 horas a 24°C no Meio Mínimo MM de Trichoderma (20 g/l de glicose, 15 g/l de KH2PO4, pH 4,5, 5 g/l de (NH4)2SO4, 0,6 g/l de MgSO4x7H2O, 0,6 g/l de CaCl2x2H2O, 1 ml da solução de elementos de oligoelementos de T. reesei 1.000X {5 g/l de FeSO4x7H2O, 1,4 g/l de ZnSO4x7H2O, 1,6 g/l de MnSO4xH2O, 3,7 g/l de CoCl2x6H2O}) com agitação a 150 rpm. Os esporos de germinação foram colhidos por centrifugação e tratados com uma solução de 50 mg/ml de Glucanex G200 (Novozymes AG, Suíça) para lises das paredes de célula fúngica. A preparação adicional de protoplastos foi realizada por um método padrão, conforme descrito por Penttilã et al. [Gene 61(1987) 155 a 164].

[0331] Em geral, as misturas de transformação que contêm aproximadamente 1 pg de DNA e 1 a 5x 10⁷ protoplastos em um volume total de 200 pl foram tratadas com 2 ml de solução PEG 25%, diluídas em 2

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86/104 volumes de sorbitol a 1,2M/ Tris a 10 mM, pH 7,5/ solução de CaCl2 a 10 mM, misturadas com 3% de superior seletiva MM que contém sorbitol a 1 M e acetamida a 20 mM (o mesmo Meio mínimo conforme mencionados acima, mas (NH4)2SO4 foi substituído por acetamida) e vertidas em agarose seletiva 2% com acetamida. As placas foram incubadas por 5 a 7 dias a 28°C antes dos transformantes crescerem e começarem a esporulação.

[0332] Uma mistura de esporos (10⁶ esporos/ml) colhida de uma placa de transformação foi usada para inocular frascos de agitação com o meio de produção (por 1l): Meio de produção de Glicina (4,7 g/l de (NH4)2SO4, 33 g/l de 1,4-Piperazinabis(ácido propanossulfônico), pH 5,5, 6,0 g/l de glicina, 5,0 g/l de KH2PO4, 1,0 g/l de CaCl2x2H2O, 1,0 g/l de

MgSO4x7H2O, 2,5 ml/l de oligoelementos de T. reesei 400X, 20 g/l de Glicose, 6,5 g/l de Soforose). Como um controle, a cepa de receptor de T. reesei 2830 foi cultivada sob as mesmas condições, mas na presença de uridina a 10 mM. Após 5 dias de fermentação a 30° C e 200 rpm, as culturas foram colhidas e submetidas à análise enzimática de ambos os extratos extracelular e intracelular.

Exemplo 20. Expressão da Aspergillus oryzae amidase na cepa Aspergillus niger GICC#2445 [0333] Para expressar o gene de amidase putativo de A. oryzae em Aspergillus niger, a sequência de codificação de amidase foi amplificada a partir do DNA gênomico de Aspergillus oryzae RIB40 (obtido junto à Fungal Genetics Stock Collection, FGSC, EUA) com o uso dos iniciadores específicos por gene com os sítios attBI e attB2 nos terminais 5' e 3' para a clonagem subsequente por meio de uma abordagem Gateway. Adicionalmente, o iniciador inverso contém tripletos de codificação 6 xHis para facilitar a purificação da proteína expressão.

[0334] O seguinte conjunto de iniciadores foi usado:

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Direto 5'

GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCACCATGCACCGGATGCTCACA GACGACAGAC3’

Inverso 5’

ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGAT TTAATCAGCATGCCGCCACGC 3’.

[0335] Todas as reações de PCR foram amplificadas com uma DNA polimerase de Fusão de alta fidelidade (Finnzymes OY, Espoo, Finlândia) sob condições padrão recomendadas pelo fornecedor. Após a separação do fragmento de DNA amplificado em um gel de agarose 0,8% e purificado com um kit de limpeza de PCR de Extrato Nucleospin® (Macherey-Nagel GmbH & co. KG, Duren, Alemanha) e 150 ng foram recombinados com o vetor pDonor221 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com a recomendação do fornecedor. As colônias de E. coli DH5a com clones pEntry que contêm a A. oryzae amidase foram selecionadas em placas de ágar 2xYT com 50 pg/ml de canamicina. Os plasmídeos isolados das células bacterianas foram analisados por seu padrão de digestão de restrição para a presença de inserto e verificados pela análise de sequência com o uso de um analisador de sequência ABI3100 (Applied Biosystems). O plasmídeo pEntry-Amidase A. oryzae resultante foi usado para clonar um vetor de destino pRAXdest2, conforme descrito na patente US07459299, por meio da reação LR Gateway de acordo com o protocolo da Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). Os produtos de recombinação formados foram transformados em E.coli Max Efficiency DH5α, conforme descrito pelo fornecedor (Invitrogen) e os clones que contêm o construto de expressão pRAXAmidase A. oryzae (Figura 25) foram selecionados em placas de ágar 2xYT (16 g/l de Bacto Tryptone (Difco, EUA), 10 g/l de Bacto Yeast Extract (Difco, EUA), 5 g/l de NaCl, 16 g/l de Bacto Agar (Difco, EUA)) com 100 pg/ml de ampicilina. Após o crescimento das culturas bacterianas no meio 2xYT com 100 pg/ml de

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88/104 ampicilina, os plasmídeos isolados foram submetidos à análise de restrição seguida pelo sequenciamento com o uso de um analisador de sequência ABI3100 (Applied Biosystems). Além de uma sequência bacteriana, o plasmídeo de expressão final pRAX2-Amidase A. oryzae contém a região de codificação de A. oryzae amidase sob o controle do terminador e promotor de A. niger glucoamilase, o gene pyrG de Aspergillus nidulans como um marcador seletivo e a sequência AMA1 de A. nidulans para a replicação autônoma em células fúngicas.

[0336] 0,5 a 2 ug desse plasmídeo foi transformado na cepa A. niger var awamori GICC#2445 desenvolvida por Genencor com o uso de um procedimento de transformação comum conhecido na técnica ou descrito na patente US07459299. Essa cepa é deletada para o gene de glucoamilase glaA endógeno e carrega uma mutação no gene pyrG que permite a seleção dos transformantes para a prototrofia de uridina. Os transformantes de A. niger foram cultivados no meio MM (o mesmo meio mínimo que foi usado para a transformação de T. reesei, mas NH4Cl a 10 mM foi usado ao invés de acetamida como uma fonte de Nitrogênio) por 4 a 5 dias a 37° C e uma população total de esporos (10⁶ esporos/ml) de diferentes placas de transformação foi usada para inocular frascos de agitação com o meio de produção (por 1l): 12 g de Trypton; 8 g de Soyton; 15 g de (NH4)2SO4; 12,1 g de NaH2PO4xH2O; 2,19 g de Na2HPO4x2H2O; 1 g de MgSO4x7H2O; 1 ml de Tween 80; 150 g de Maltose; pH 5,8. Após 5 dias de fermentação a 30° C e 200 rpm, as culturas foram colhidas e submetidas à análise enzimática de ambos os extratos extracelular e intracelular.

Exemplo 21. Amidases de três fungos adicionais para degradação de OCRATOXINA [0337]Todas as sequências de amidase putativas de Glomerella graminicola (GMGM), Metarhizium anisopliae e Aspergillus oryzae

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89/104 mostraram uma atividade na ocratoxina degradante A.

[0338]A Tabela 6 mostra a atividade de três amidases fúngicas da Glomerella graminicola, Metarhizium anisopliae e Aspergillus oryzae expressa de modo intracelular em Trichoderma reesei e Aspergillus niger. A mistura de reação com o uso de OTA como substrato consistido de 75 μΐ de fosfato (67 mM, pH 7), 5 μΐ de OTA (2,4 μg/ml) e 20 μΐ de fração livre de célula intracelular. A reação foi realizada a 23^oC por 17 horas e parada adicionando-se 0,15 ml de acetonitrila e analisada em HPLC com um volume de injeção de 5 μι

Tabela 6

Cepas/e atividades	Cepa progenitora de Trichoderma reesei usada para a transformação	Cepa progenitora de Trichoderma reesei transformada com o gene de amidase putativo da Glomerella gramicola	Cepa progenitora de Trichoderma reesei transformada com o gene de amidase putativo da Metarhizium anisopliae	Cepa de Aspergillus niger transformada com o gene de amidase putativo da Aspergillus oryzae
Atividade na ocratoxina A expressa como a área de pico de ocratoxina A	12,26	0,68	0,96	8,57

[0339] Os dados na tabela indicam que a amidase da G. gramicola tem a maior atividade contra a ocratoxina, enquanto que a amidase da A. oryzae tem a menor atividade contra esse substrato.

Exemplo 22 Comparação de sequência de Sequências de amidase putativa [0340] As comparações de sequência foram feitas sobre o comprimento inteiro das sequências de polipeptídeo com o uso do programa AlignX VectorNTI (InvitrogenCorporation) com o uso dos parâmetros padrão (Gap opening penalty -10, Gap extension penalty 0,1). Conforme pode ser visto na Tabela 7 as amidases putativas podem ter uma homologia geral baixa. Entretanto, conforme pode ser visto a partir da Figura 26 todos os polipeptídeos de SEQ ID NOs: 5 a 11, 13, 14 e 15 têm os mesmos motivos que a amidase 2 (SEQ ID NO:1 e 3).

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90/104 [0341] As sequências são alinhadas com a versão Multalin 5.4.1 (F. CORPET, 1988, Nucl. Acids Res., 16: 10.881 a 10.890). Parâmetros usados: blosum62, Peso de intervalo: 12, peso de comprimento de intervalo: 2, Níveis de consenso: alto=90% baixo=50%, Símbolos de consenso: ! é qualquer um dentre IV, $ é qualquer um dentre LM, % é qualquer um dentre FY, # é qualquer um dentre NDQEBZ. As descrições das sequências e seu número de acesso de web (em parênteses):

[0342]Ademais, conforme mostrado no Exemplo 21 (Tabela 6)

SEQ ID NO:13 a 15 têm atividade de degradação de ocratoxina.

Tabela 7

ID de Sequência NO	% de identidade com SEQ ID NO:1 (comprimento inteiro)
SEQ ID NO:5	41,8%
SEQ ID NO:6	42,4%
SEQ ID NO:7	42,4%
SEQ ID NO:8	40,7%
SEQ ID NO:9	36,5%
SEQ ID NO:10	28,2%
SEQ ID NO:11	36,5%
SEQ ID NO:13	56,1%
SEQ ID NO:14	53,4%
SEQ ID NO:15	34,6%

[0343] Os motivos de sequência comuns das 11 sequências têm o

Consenso:

1) l/m-P-G-l/m-w/i-D-c/v/s/a-H-x-H-f/y/l-xG, em que os dois resíduos de His estão no sítio ativo;

2) G-y/f-T;

3) G-t/a/s/v/r-i/f/a-x-G-P;

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4) 14) G-H-g/s-D, em que o resíduo de His está no sítio ativo;

5) D-G-v/e-x-e/d/g-C-x-x-a/g/t-v/a-R-x-q/m/a-l/i/v-R-r/h/c-g/n-Ak/r/t/e/d-x-I-K, em que o resíduo de Lis está no sítio ativo

6) G-G-V-l/m/v/g-S-x-x-D-x-P, em que o resíduo de Val está no sítio ativo;

7) V-a/s/h-A-H-c/v/a-h/q-G-k/r-x-G, em que os dois resíduos de His estão no sítio ativo;

8) H-g/v/a-s/t/i-y/f/e-l/a/i-D, em que o resíduo de His está no sítio ativo;

9) G-V-x-I-a/v-l/a-G-T-D, em que o resíduo de Asp está no sítio ativo;

SEQ ID NO:1, é amidase 2 de A. niger, SEQ5, amidoidrolase putativa A. niger (XP_001400981), SEQ ID NO:6, proteína hipotética de A. flavus (XP_002385313), SEQ ID NO:7, proteína hipotética de Talaromyces stipitatus (XP_002477972), SEQ ID NO:8, proteína hipotética de Neurospora crassa (XP_962238), SEQ ID NO:9, amidoidrolase putativa de Streptomyces roseosporus (ZP_04712156), SEQ ID NO:10, amidoidrolase putativa de Thermotoga lettingae (YP_001470371), SEQ ID NO:11, amidoidrolase putativa de Salinispora arenicola (YP_001536995), SEQ ID NO:13, amidoidrolase putativa de Glomerella graminicola (EFQ25792), SEQ ID NO:14, amidoidrolase putativa de Metarhizium anisopliae (EFZ00058), SEQ ID NO:15, amidoidrolase putativa Aspergillus oryzae (XP_001826758).

Exemplo 23 Comparação de sequência de SEQ ID NO:1 À carboxipeptidase QUE TEM ATIVIDADE DE DEGRADAÇÃO DE OCRATOXINA [0344] Duas carboxipeptidases são conhecidas que têm uma atividade de degradação de ocratoxina baixa, ou seja, a carboxipeptidase bovina A e carboxipeptidase levedura Y (Luís Abrunhosa, Robert R. M. Paterson e Armando Venâncio, Biodegradation of Ochratoxin A for Food and Feed

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Decontamination, Toxins 2010, 2, 1.078 a 1.099).

[0345] A atividade de degradação de ocratoxina dessas enzimas foi confirmada. Entretanto, conforme pode ser visto a partir da Figura 27, essas enzimas não mostram nenhuma homologia a SEQ ID NO:1 e não contêm nenhum dos 9 motivos associados à habilidade de degradação de ocratoxina. Ademais, essas enzimas não têm a estrutura de amidase tipo Tim Barrei.

Listagem De Sequência

SEQ ID NO: 1

Amidase 2 sig de A. niger

1	MVRRIASATP	MVQSPMSPLG	TTYCVRPNPV	SLNLQRRPLV	IASTDEAKVT
51	IIYAGLLIPG	DGEPLRNAAL	VISDKIIAFV	GSEADIPKKY	LRSTQSTHRV
101	PVLMPGLWDC	HMHFGGDDDY	YNDYTSGLAT	HPASSGARLA	RGCWE ALONG
151	YTSYRDLAGY	GCEVAKAIND	GTIVGPNVYS	SGAALSQTAG	HGDIFALPAG
201	EVLGSYGVMN	PRPGYWGAGP	LCIADGVEEV	RRAVRLQIRR	GAKVIKVMAS
251	GGVMSRDDNP	NFAQFSPEEL	KVIVEEAARQ	NRIVSAHVHG	KAGIMAAIKA
301	GCKSLEHVSY	ADEEVWELMK	EKGILYVATR	SVIEIFLASN	GEGLVKESWA
351	KLQALADSHL	KAYQGAIKAG	VTIALGTDTA	PGGPTALELQ	FAVERGGMTP
401	LEAIKAATAN	APLSVGPOAP	LTGQLREGYE	ADVIALEENP	LEDIKVFQEP
451	KAVTHVWKGG	KLFKGPGIGP	WGEDARNPFL

SEQ ID No. 2

Tipo de sequência: DNA; nome de DNA: DNA que contém o gene de amidase 2, Comprimento: 1443, Organismo: Aspergillus niger

ATGGTCCGCCGAATTGCTTCAGCTACACCTATGGTGCAATCGCCCATG TCGCCATTGGGCACAACATACTGCGTCCGTCCTAATCCTGTTTCACTGAA TCTTCAAAGAAGACCTCTCGTGATCGCATCAACAGACGAGGCCAAGGTC ACTATAATATATGCCGGACTATTAATCCCTGGCGACGGAGAACCTCTGC GCAATGCTGCCCTAGTCATCAGCGATAAGATCATCGCGTTCGTTGGATC CGAAGCCGACATCCCTAAGAAATACCTCCGGTCCACGCAGTCTACTCAT CGTGTCCCCGTGCTCATGCCTGGTTTGTGGGATTGCCACATGCATTTTG GCGGGGATGACGATTATTACAACGATTATACATCTGGTCTGGCCACTCAT CCAGCATCATCAGGTGCTCGACTAGCCCGTGGTTGCTGGGAAGCATTGC AGAATGGGTATACATCCTACCGCGACCTAGCCGGATACGGGTGCGAGGT

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CGCAAAGGCGATCAATGATGGCACTATCGTTGGTCCAAACGTGTACTCG TCTGGCGCTGCACTCAGTCAGACAGCTGGACACGGCGATATCTTCGCTC TTCCAGCAGGCGAAGTACTGGGGAGTTATGGAGTAATGAACCCACGCCC TGGGTACTGGGGGGCAGGGCCGCTATGTATCGCCGATGGCGTAGAGGA GGTCCGACGAGCAGTGAGGTTGCAGATCCGTCGCGGTGCAAAGGTTAT CAAAGTGATGGCCTCTGGGGGTGTCATGTCGCGAGACGATAATCCCAAC TTTGCACAGTTCTCTCCAGAAGAACTGAAGGTGATAGTGGAAGAGGCGG CTCGACAGAACCGGATCGTTTCTGCACATGTGCATGGCAAGGCGGGGAT TATGGCTGCTATCAAAGCAGGCTGCAAGAGTCTGGAGCATGTGTCTTAT GCTGACGAGGAGGTCTGGGAGCTCATGAAAGAGAAGGGAATTTTGTATG TGGCCACACGCTCGGTTATTGAAATCTTTCTGGCTAGTAATGGAGAGGG GTTGGTGAAAGAGTCGTGGGCCAAGTTGCAGGCCCTTGCCGATTCGCAT TTGAAAGCTTATCAGGGAGCTATTAAGGCGGGTGTTACCATTGCGTTGG GAACGGATACCGCCCCCGGTGGTCCTACCGCACTTGAGTTGCAGTTTGC CGTCGAGAGAGGAGGTATGACGCCGTTGGAGGCCATCAAAGCCGCAAC TGCGAACGCTCCCCTGTCAGTTGGTCCACAAGCACCGTTGACGGGTCAG CTTCGCGAGGGGTATGAGGCAGATGTGATTGCGTTGGAGGAGAATCCAT TGGAGGACATCAAAGTCTTTCAGGAGCCGAAGGCAGTTACCCACGTCTG GAAGGGAGGGAAACTGTTCAAAGGTCCAGGTATTGGTCCGTGGGGAGA AGATGCACGTAATCCTTTTCTGTAG

SEQ ID NO. 3

Tipo de sequência: Proteína; Nome de proteína: amidase 2 mat,

Comprimento: 438, Organismo: Aspergillus niger

SerTrAspGluAlaLisValTrIleIleTirAlaGliLeuLeuIleProGliAspGliGluProLeuAr gAsnAlaAlaLeuValIleSerAspLisIleIleAlaFeValGliSerGluAlaAspIleProLisLisTir LeuArgSerTrGlnSerTrHisArgValProValLeuMetProGliLeuTrpAspCisHisMetisF eGliGliAspAspAspTirTirAsnAspTirTrSerGliLeuAlaTrHisProAlaSerSerGliAlaAr gLeuAlaArgGliCisTrpGluAlaLeuGlnAsnGliTirTrSerTirArgAspLeuAlaGliTirGliC

Petição 870190135852, de 18/12/2019, pág. 106/236

94/104 isGluValAlaLisAlalleAsnAspGliTrlleValGliProAsnValTirSerSerGliAlaAlaLeuS erGInTrAlaGliHisGliAspIleFeAlaLeuProAlaGliGluVaLeuGliSerTirGliValMetAs nProArgProGliTirTrpGliAlaGliProLeuCisIleAlaAspGliValGluGluValArgArgAla ValArgLeuGlnIleArgArgGliAlaLisValIleLisValMetAlaSerGliGliValMetSerArgAs pAspAsnProAsnFeAlaGlnFeSerProGluGluLeuLisValIleValGluGluAlaAlaArgGl nAsnArgIleValSerAlaHisValHisGliLisAlaGliIleMetAlaAlaIleLisAlaGliCisLisSer LeuGluHisValSerTirAlaAspGluGluValTrpGluLeuMetLisGluLisGliIleLeuTirVal AlaTrArgSerValIleGluIleFeLeuAlaSerAsnGliGluGliLeuValLisGluSerTrpAlaLis LeuGlnAlaLeuAlaAspSerHisLeuLisAlaTirGlnGliAlaIleLisAlaGliValTrIleAlaLeu GliTrAspTrAlaProGliGliProTrAlaLeuGluLeuGlnFeAlaValGluArgGliGliMetTrPr oLeuGluAlaIleLisAlaAlaTrAlaAsnAlaProLeuSerValGliProGlnAlaProLeuTrGliG lnLeuArgGluGliTirGluAlaAspValIleAlaLeuGluGluAsnProLeuGluAspIleLisValF eGlnGluProLisAlaValTrHisValTrpLisGliGliLisLeuFeLisGliProGliIleGliProTrpGl iGluAspAlaArgAsnProFeLeu

SEQ ID NO. 4

Amidase 2 A. niger +c terminal 6H

MVRRIASATPMVQSPMSPLGTTYCVRPNPVSLNLQRRPLVIASTDEAKVTIIYAGLLIPGDGE PLRNAALVISDKIIAFVGSEADIPKKYLRSTQSTHRVPVLMPGLWDCHMHFGGDDDYYNDYTS GLATHPASSGARLARGCWEALQNGYTSYRDLAGYGCEVAKAINDGTIVGPNVYSSGAALSQTA GHGDIFALPAGEVLGSYGVMNPRPGYWGAGPLCIADGVEEVRRAVRLQIRRGAKVIKVMASGG VMSRDDNPNFAQFSPEELKVIVEEAARQNRIVSAHVHGKAGIMAAIKAGCKSLEHVSYADEEV WELMKEKGILYVATRSVIEIFLASNGEGLVKESWAKLQALADSHLKAYQGAIKAGVTIALGTD TAPGGPTALELQFAVERGGMTPLEAIKAATANAPLSVGPQAPLTGQLREGYEADVIALEENPL EDIKVFQEPKAVTHVWKGGKLFKGPGIGPWGEDARNPFLHHHHHH

SEQ ID NO. 5

Tipo de sequência: Proteína; Nome de proteína: Homólogo de amidase 2 putativa, Comprimento: 420, Organismo: Aspergillus niger MetisArgProLeuTrAspSerTrFeTirArgIleAsnAlaAspIleLeuIleProGliArgGliAlaPr oIleAlaArgGliAlaValValTrpLisSerLisTrIleLeuTirSerGliProGlnHisGluValProValGl uTirGlnAspAlaValTrTrHisValProValAlaMetProGliMetTrpAspCisHisIleHisFeLeu

Petição 870190135852, de 18/12/2019, pág. 107/236

95/104

GliAlaTrAlaAlaTrMetAspSerlleValAsnTrProGInAlaLeuAlaGliAlaArgSerValProTir LeuTirAIaTrllelleAIaGliFeTrSerValArgGluValGIiGIiTirGIiCisGIuLeuAIaLisVallleA spGluGliArgIleProGliProTrIleTirGliAlaHisSerAlaIleSerMetTrAlaGliHisGliAspVal HisGIiValAsnProGIuGIiLeuArgAspLeuCisTrHisGIiLeuProLeuTrIIeAIaAspGIiValP roGIuCisLeuGInAIaValArgLisGInLeuArgHisGIiAIaArgIIeIIeLisValCisAIaSerGIiGIi ValValSerAIaIIeAspAspProGInHisGInGIuFeSerFeGIuGIuLeuLisAIaIIeValAspGIu AlaAIaArgAIaArgArgValValAIaAIaHisCisHisGIiLisAIaGliIleMetAsnAIaLeuArgAIa GliCisArgTrIIeGIuHisGIiSerTirLeuAspGIuGluAIaIIeAspLeuMetLeuGIuLisGIiAIaM etLeuValAIaTrArgSerValIIeGIuSerGIiLeuAIaMetArgAspLeuFeTrProGIiSerTirGIn LisLeuLeuGluValAIaAspTrHisLisArgAIaTirGIuLeuAIaValArgArgGIiValProIleAIaL euGIiTrAspGInFeIIeSerSerAspAsnProAIaLeuGIiTirGIiArgAsnGIiLisGIuLeuValTir AlaValAIaAIaGIiMetTrProLeuAIaAIaIIeGluAIaAIaTrAIaAsnGliProLeuTrLeuGIiAsp GlnAIaProLisSerGIiGInLeuArgGIuGliFeAspAIaAspIIeIIeAIaLeuTrAIaAsnProLeu GluAsnIIeIIeValValSerAspProLisAsnValTrHisValTrpArgTirGIiLisLeuValLisSerAs n

SEQ ID NO. 6

Tipo de sequência: Proteína; Nome de proteína: Homólogo de amidase 2 putativa, Comprimento: 419, Organismo: Aspergillus flavus

MetisArgMetLeuTrAspAspArgLeuTirArgVaIAspAIaAspLeuLeuIIeProGIiLisGIi AspProIIeProHisGIiAIaVaIVaITrpGInCisLisTrIIeArgTirAIaGIiProArgSerGIuVaIPro AIaGIuFeGInGIiAIaTrTrTrHisVaIProVaIVaIMetProGIiMetTrpAspCisHisIIeHisFeL euGIiAIaTrAIaAIaTrMetAsnAIaIIeVaIAspTrProGInAIaLeuAIaGIiAIaArgSerVaIPro AspLeuHisAIaTrVaIMetAIaGIiFeTrSerVaIArgGIuVaIGIiGIiTirGIiCisAspLeuAIaLis AIaVaIGIiGIuGIiArgIIeProGIiProAsnIIeTirSerSerHisSerAIaIIeSerMetTrAIaGIiHis GIiAspVaIHisGIiVaIHisArgAspSerLeuLeuAspLeuCisAIaHisGIiLeuProLeuTrIIeAIa AspGIiVaIProGIuCisLeuLeuAIaVaIArgLisGInLeuArgArgGIiAIaTrVaIIIeLisVaICisA IaSerGIiGIiVaIVaISerAIaIIeAspAspProGInHisGInGIuFeSerFeGIuGIuLeuLisAIaIIe VaIAspGIuAIaAIaArgAIaArgArgVaIVaIAIaAIaHisCisHisGIiLisAIaGIiIIeMetAsnAIa

Petição 870190135852, de 18/12/2019, pág. 108/236

96/104

LeuArgAlaGliCisArgTrlleGluHisGliSerFeLeuAspGluGluAlaValGluLeuMetLisGlu LisGliAlalleLeuValAlaTrArgSerVallleGluSerGliLeuAlaMetLisAspLeuFeTrProSer SerTirGlnLisLeuLeuGluValAlaAspAlaHisArgLisAlaTirGlnLeuAlaIleSerArgGliVal TrIleAlaLeuGliTrAspGlnFeIleSerSerAspAsnProMetIleGliTirGliArgAsnGliHisGluV alArgTirAlaValAspAlaGliLeuTrProLeuAlaAlaIleGluAlaAlaTrAlaAsnGliProLeuTrL euGliTirGlnAlaProGlnSerGliGlnLeuLisGluGliTirAspAlaAspIleIleAlaValArgGluAs nProLeuGluAsnValAlaValLeuSerAsnSerLisAsnValTrHisValTrpArgGliGliMetLeuI leLisSer

SEQ ID NO. 7

Tipo de sequência: Proteína; Nome de proteína: Homólogo de amidase 2 putativa, Comprimento: 405, Organismo: Talaromyces stipitatus

MetArgValArgLeuLisAlaSerIleLeuIleProGliArgGliGluProIleGluAsn GliAlaLeuIleIleAspGliProLisIleAlaTrpValGliGlnGlnSerAlaIleProTrLisTirGlnAspV alAspFeGluTirLeuProValLeuMetProGliLeuTrpAspCisHisTrHisFeMetGliLeuSerA spGluSerAspTrMetGlnAlaValFeGliSerAlaAlaLeuAlaGliAlaIleAlaAlaLisGluLeuGl uTrAlaLeuMetAlaGliFeTrTrIleArgGluValGliGliValAlaGliGluIleTirProAlaIleLisAsn GliTrIleValGliProAsnValTirSerSerIleGliValLeuGliIleTrGliGliHisSerAspValHisAsn ValProIleGluAlaValIleAlaLisArgAsnGluGliTrFeValValCisAspGliValSerAspCisIle LisTrValArgMetMetValArgArgGliAlaTrLeuIleLisIleCisAlaTrGliGliValGliSerLeuLe uAspAspProGluAspAlaGlnFeSerProGluGluIleLisAlaIleValAspGluAlaAlaArgSerL isArgIleValAlaAlaHisCisHisGliLisGluGliIleMetAsnAlaLeuHisAlaGliValHisTrIleGlu HisGliSerTirLeuAspGluGluValAlaAlaLeuMetLisGluLisLisAlaLeuFeValSerTrArgL euIleIleGluGluGliLeuLisAsnProLisLeuTrpProProSerSerTirArgLisLeuTrLisIleSer GluAlaHisLisLisAlaTirAlaLeuAlaValLisSerGliValLisIleValLeuGliTrAspTrpTrAlaGl iGluAsnGliLisGluLeuAlaTirAlaValGluAlaGliMetSerProLeuGluAlaIleGluAlaSerTr AlaArgCisProGluTrLeuGliSerHisFeAlaProLeuSerGliGlnLeuLisGluGliTirGliAlaAs pValIleAlaValAlaSerAsnProLeuAspAspIleLisValLeuGliGluProLisAsnIleTrHisVal TrpLisGliGliLisLeuTirLisGliTrLeu

Petição 870190135852, de 18/12/2019, pág. 109/236

97/104

SEQ ID NO. 8

Tipo de sequência: Proteína; Nome de proteína: Homólogo de amidase 2 putativa, Comprimento: 440, Organismo: Neurospora crassa

MetGlnIleLisValTrLeuProAsnAspTrIleAsnArgAspSerValAspAspArgAlaSerTir HisGliIleLeuAlaAspValLeuIleProGliArgGliGluProLeuLisAsnGliAlaLeuValValLisA spSerValIleGluTrpValGliProSerAspGluIleProSerGluTirSerSerIleArgValSerArgV alProValLeuMetProGliMetTrpAspValHisTrHisTirGluGliValGliValAlaGlnGliIleArg GluSerMetLisProFeLeuProGliTrAlaTrLeuIleGliAlaValIleValAspAspMetArgArgTr LeuMetAlaGliFeTrSerIleArgGluLeuGliGliTirAlaGliAspValAlaProAlaIleAspMetGli AlaIleValGliProHisValTirAlaAlaMetSerLeuLeuSerIleTrGliGliHisGliAspLeuHisAs pValProLeuArgTrValLeuAspAlaCisAlaAsnGliSerSerSerCisFeLeuCisAspGliValA spGliCisIleAsnAlaValArgGlnGlnIleArgArgGliAlaLisValIleLisValCisSerTrGliGliVal LeuSerLeuAsnAspGlnProGluAspTrGlnFeSerAlaGluGluLeuArgAlaIleValGlnGlu AlaLisArgSerSerArgValValAlaAlaHisAlaHisGliLisProGliIleMetAlaAlaLeuAspAla GliValLisSerIleGluHisGliSerFeLeuAspGluGluValAlaAlaLisMetLisGluLisAspAlaIl eLeuValProTrArgHisValValGluGliMetAlaAlaAsnAsnAspAspLeuAspProArgGlnAr gAlaLisLeuGluArgTrMetGlnLeuSerArgAspSerIleLisLeuAlaHisArgMetGliValLisIle AlaLeuGliTrAspTrFeArgSerAspLisAsnHisAlaValAlaHisGliLisAsnAlaMetGluLeuA rgTirAlaIleGluAlaGliMetTrProLeuGlnAlaIleGluMetAlaTrAlaTrProProGluTrLeuGli ProGlnAlaArgLisSerGliGlnLeuLisAlaGliTirAspAlaAspLeuIleAlaIleSerSerAsnPro LeuGluAspIleGluIleLeuIleAspProAspAsnIleTrHisValTrpLisGliGliValLeuFeLisCis ProGln

SEQ ID NO. 9

Tipo de sequência: Proteína; Nome de proteína: Homólogo de amidase 2 putativa, Comprimento: 413, Organismo: Streptomyces roseosporus

MetGluHisArgIleAspAlaAspLeuLeuIleProGliAlaGliGluProTrValAsnGliSerValV alHisAlaAspGliArgIleArgFeAlaGliProTrAlaGluLeuProArgGluHisArgAlaLeuGluPr oTrArgValAlaTrLeuLeuProGliLeuTrpAspCisHisValHisFeAlaGliIleArgGliArgValS

Petição 870190135852, de 18/12/2019, pág. 110/236

98/104 erTrGluGluLeuMetLeuTrProGluTrLeuAlaValValArgSerValLisAspAlaGluTrAlaLe uArgAlaGliFeTrSerValArgAspMetGliGliHisGliCisValLeuAlaGluAlaValArgGluGliT rFeTrGliProAsnIleTirSerAlaAsnGlnValIleGliGlnTrGliGliHisSerAspAlaHisArgLeu ProTirArgTrpValTrAspProCisArgSerGliGliTrLeuArgIleAlaAspGliValAspGluCisV alArgAlaValArgLeuGlnLeuArgAlaGliAlaGluLeuIleLisIleCisTrSerGliGliValLeuSer GluValAspAsnProValHisGlnGlnTirArgSerGluGluLeuAsnAlaIleValTrGluAlaAlaAr gAlaAspArgValValAlaAlaHisCisHisGliArgAlaGliIleLeuAlaAlaIleAspAlaGliCisHisT rValGluHisGliTrGluIleAspGluArgTrAlaAspLeuMetAlaGluArgGliMetTrLeuValPro TrArgTrIleTirGluAlaFeArgGlnAspValAlaAlaLeuProProAlaTrpArgAspArgFeAlaLe uMetAlaGluArgHisLeuTrAlaIleGliIleAlaHisArgAlaGliValTrIleAlaLeuGliTrAspLeu GliTrSerAspArgGliGliProLeuSerTrpGliGliHisGliSerGluFeAlaHisLeuValSerAlaGli LeuSerProLeuGluAlaIleLisAlaAlaTrAlaHisGliProGliTrLeuGliProArgAlaProArgSe rGliArgLeuGluAlaGliTirAspAlaAspLeuLeuAlaValAspGliAsnProLeuAlaAspIleTrV alLeuAlaAspProAspArgIleTrArgValTrpLisSerGliGluProValProSerGli

SEQ ID NO. 10

Tipo de sequência: Proteína; Nome de proteína: Homólogo de amidase 2 putativa, Comprimento: 407, Organismo: Thermotoga lettingae

GluSerAlaValFeIleGluGliAlaArgIleLeuAlaValGluLisIleLisArgSerGlnIleProSer GliFeTrGlnIleAspLeuGlnGliArgTirLeuMetProGliLeuIleAspAlaHisLeuHisLeuAlaG liMetArgSerGliAspMetValLisGluHisLeuLeuTrProTirGluTrLeuValAlaArgTrValTrA spLeuLisSerLeuIleGluAlaGliFeTrTrValValAspAlaGliGliSerIleAlaIleAsnLeuLisLis AlaIleGlnGluGliTrIleAlaGliProArgIleValAlaAlaGliHisSerLeuSerGlnTrFeGliHisGli AspGluHisFeLeuProIleAspTirValAspProArgTrSerLisFeLisGliGliFeGliSerLeuIleC isAspGliValAlaGluCisIleLisAlaAlaArgTirAlaLeuArgCisGliAlaAspFeIleLisIleMetAl aTrGliGliValLeuSerGluArgAspArgProGluTirTrGlnFeTrValGluGluIleLisAlaIleVal GluGluAlaAsnHisAlaArgLisFeValHisAlaHisAlaGlnGliLisAspGliIleMetAsnAlaLeu LeuGliGliValLisValIleAlaHisAlaIleTirIleAspAspGluSerCisLisLeuAlaLisGluLisAsn AlaIleIleValProTrLeuSerIleValGluHisLeuIleIleHisGliLisGlnIleGliAlaProGluTrpGli

Petição 870190135852, de 18/12/2019, pág. 111/236

99/104

LeuArgLisSerGluGluValTirLisIleHisValGluAsnIleLisLisAlaTirGluHisGliValLisIleAl aAlaGliTrAspFelleGliGliTrLisAlaFeLisHisGliGluAsnAlaLeuGluIleLeuLeuLeuVal AspLisIleGliMetLisProGluGlnAlaLeuLeuSerAlaTrLisValAlaAlaGluAlaAlaGliLeuS erGlnLeuValGliSerIleAspLisGliLisLeuAlaAspLeuLeuIleValGluAspAsnProLeuSer AsnValLisIleLeuMetAsfisSerLisIleSerAlaValFeLisGluGliIleLeuFeLisAspLisIleGli LeuGluLisTirFeAsn

SEQ ID NO. 11

Tipo de sequência: Proteína; Nome de proteína: Homólogo de amidase 2 putativa, Comprimento: 408, Organismo: Salinispora arenicola

MetIleGluCisIleGluAlaAspGlnLeuIleProGliArgGliGluProValAlaAsnAlaValValV alLeuGluAspAlaTrIleArgTirAlaGliProAlaGluHisAlaProLisValAlaGluAlaArgArgSer ArgAlaHisTrValLeuProGliLeuTrpAspSerHisValHisFeMetGliLeuArgSerAlaAspVa lGliIleLeuProGlnGluProValAlaLeuArgAlaAlaArgTrValAlaAspLeuArgAlaAlaLeuA spAlaGliFeTrSerValArgGluValGliGliLeuGliLeuAspLeuAlaArgAlaValGluGluGliTr AlaValGliProSerValTirAlaAlaGliCisAlaLeuSerTrTrGliGliHisGliAspLeuHisSerTirP roLeuAlaTrpMetGluGluFeAlaArgHisGliGliGluLeuArgLeuAlaAspGliGluAlaGluCis ValArgAlaValArgGluGlnLeuArgArgAsnAlaLisValIleLisValTirAlaSerGliGliValLeuS erGluValAsfisProIleHisArgGlnFeTrAspArgGluLeuArgAlaIleValGluValAlaGliLeuA laAspArgValValAlaAlaHisCisHisGliLisProGliMetMetAlaAlaIleGluAlaGliValArgTrIl eGluHisGliTrTirLeuAspGluGluValAlaAlaAlaMetArgGluTrGliAlaIleLeuValTrTrArg TrIleMetGlnGluLeuIleAspSerArgAlaLeuProProTirAlaLeuArgLisLeuGluSerIleVal AspArgHisAlaGluAlaIleValIleAlaArgGluSerGliValArgIleAlaAlaGliTrAspValAlaLe uTrGliAlaGluLeuProAspSerTrpGliArgAsnGliArgGluLeuProLeuLeuAlaGluIleGliF eSerProLeuGluValIleGluAlaAlaTrAlaAlaAlaProAlaTrLeuGliProGlnAlaProArgSer GliGlnLeuValGluGliTirAspAlaAspValIleTrLeuAspAlaAspProLeuAlaAspIleGliValL euAlaLisProAlaHisIleTrGliValTrpLisAlaGliCisArgValAla

SEQ ID NO. 12.

Tipo de sequência: Proteína; Nome de proteína: pepAd2

Petição 870190135852, de 18/12/2019, pág. 112/236

100/104 (protease), Comprimento: 480, Organismo: Aspergillus niger

MetisLeuProGInArgLeuValTrAlaAlaCisLeuCisAlaSerAlaTrAlaFelleProTirTrlle LisLeuAspTrSerAspAspIleSerAlaArgAspSerLeuAlaArgArgFeLeuProValProAsn ProSerAspAlaLeuAlaAspAspSerTrSerSerAlaSerAspGluSerLeuSerLeuAsnIleLis ArgIleProValArgArgAspAsnAspFeLisIleValValAlaGluTrProSerTrpSerAsnTrAlaAl aLeuAspGlnAspGliSerAspIleSerTirIleSerValValAsnIleGliSerAspGluLisSerMetTi rMetLeuLeuAspTrGliGliSerAspTrTrpValFeGliSerAsnCisTrSerTrProCisTrMetisA snTrFeGliSerAspAspSerSerTrLeuGluMetTrSerGluGluTrpSerValGliTirGliTrGliS erValSerGliLeuLeuGliLisAspLisLeuTrIleAlaAsnValTrValArgMetTrFeGliLeuAlaS erAsnAlaSerAspAsnFeGluSerTirProMetAspGliIleLeuGliLeuGliArgTrAsnAspSer SerTirAspAsnProTrFeMetAspAlaValAlaGluSerAsnValFeLisSerAsnIle

ValGliFeAlaLeuSerArgSerProAlaLisAspGliTrValSerFeGliTrTrAspLisAspLisTir TrGliAspIleTrTirTrAspTrValGliSerAspSerTirTrpArgIleProValAspAspValTirValGli GliTrSerCisAspFeSerAsnLisSerAlaIleIleAspTrGliTrSerTirAlaMetLeuProSerSerA spSerLisTrLeuHisSerLeuIleProGliAlaLisSerSerGliSerTirHisIleIleProCisAsnTrTr TrLisLeuGlnValAlaFeSerGliValAsnTirTrIleSerProLisAspTirValGliAlaTrSerGliSer GliCisValSerAsnIleIleSerTirAspLeuFeGliAspAspIleTrpLeuLeuGliAspTrFeLeuLis AsnValTirAlaValFeAspTirAspGluLeuArgValGliFeAlaGluArgSerSerAsnTrTrSerAl aSerAsnSerTrSerSerGliTrSerSerTrSerGliSerTrTrTrGliSerSerTrTrTrTrSerSerAl aSerSerSerSerSerSerAspAlaGluSerGliSerSerMetTrIleProAlaProGlnTirFeFeSer AlaLeuAlaIleAlaSerFeMetLeuTrpLeu

SEQ ID NO:13

Organismo Glomerella graminicola M1.001 (fungo), 472aa mggsfrpnya dgpeppfspt kkttlviikt sllipgdgep lkdgalviss kviawvgpqs slpseyadsp hrsytvpylm pglwdchahf ggespnddgg ndpyqvfite hpaasgarlt

121 rgcwlalqrg ytslrdvagl gcevsraied gsivgpnvys sgsglsqlag hgdifslpag

Petição 870190135852, de 18/12/2019, pág. 113/236

101/104

181 dvllnlgvsq itpghfgtha tmivdgvdec rravrlqirr gakcikvmas ggvmsrddnp

241 nyaqfsaael etiveeatrq nrvvaahvhg kagilaaina gvttlehasf adrecidlik

301 ekgivyiatr ivvhlllstg gkglpptvwe kaklvaknhm taykmaiesg vqialgtdtg

361 pgynmatele caveagmsnl eaikaatang plsvggqapk tgqlkvgyea dvigllqnpv

421 edvkvlqkvd nvgwvwkggk lfkgpgvgpw geepgvwedi tgvsrlrctt gy

SEQ ID NO:14

Organismo Metarhizium anisopliae ARSEF 23. 485aa, mtrrviphse saesvddaqh vsgriystgf giavrtgqpq sqdddaetgv kkvfytivmt kllipgdgep ikdaalvvkn kiidwvgrqa dlpneytekp hklhnvpylm pglwdchvhf

121 agsngereae egstglsfla dhpttagarl argcwdaiqr gytsmrdlag fgceiskaie

181 dgviigpniy sagaclsqla ghgdvfalpa gdallnlgla svkagqfgag msclvdgvde

241 crrgvrlqir rgakcikvma sggvlsrddn plyaqfsree ldtivseakr mertvaahvh

301 gkpgilqave agvtsvehvs fadqecidli kdrgtifvgt rtivnlllds kgegmpkkmw

361 ekaklvgths legykkaika gctialgtdt epgfnmaiel qyaveagmss leaikaatan

421 gpltvagqap ltgqlkagye admigvcdnp vedvkvlqkk snigwvwkgg klfkgpgigp

481 wgeel

SEQ ID NO:15

Petição 870190135852, de 18/12/2019, pág. 114/236

102/104

A. oryzae amidoidrolase

Mhrmltddrlyrvdadllipgkgdpiphgavvwqcktiryagprsgvptefqgattthvpvv mpgmwdchihflgataatmnaivdtpqalagarsvpdlhatvmagftsvrevggygcdlakavgegripgp niysshsaismtaghgdvhgvhrdslldlcahglpltiadgvpecllavrkqlrrgakvikvcasggvvsaiddp qhqefsfeelkaivdeaararrvvaahchgkagimnalragcrtiehgsfldeeavglmkekgailvatrsvies glamkdlftpssyqkllavadahrkayqlaisrgvtialgtdqfissdnpmigygrnghevryavdagltplaaie aatangpltlgyqapqsgqlkegydadiiavrenplenvavlsnsknvthvwrggmliks

SEQ ID NO:16

Carboxipeptidase bovina A (419 aa). Acesso: NP_777175. Produto

Sigma n^o C0261.

mqgllilsvl lgaalgkedf vghqvlrita adeaevqtvk eledlehlql dfwrgpgqpg spidvrvpfp slqavkvfle ahgiryrimi edvqslldee qeqmfasqsr arstntfnya

	121	tyhtldeiyd	fmdllvaehp	qlvsklqigr	syegrpiyvl	kfstggsnrp
aiwidlgihs
	181	rewitqatgv	wfakkftedy	gqdpsftail	dsmdifleiv	tnpdgfafth
sqnrlwrktr
	241	svtssslcvg vdanrnwdag fgkagasssp	csetyhgkya	nsevevksiv

dfvkdhgnfk

301 aflsihsysq lllypygytt qsipdkteln qvaksaveal kslygtsyky gsiittiyqa

361 sggsidwsyn qgikysftfe lrdtgrygfl lpasqiipta qetwlgvlti mehtlnnly SEQ ID NO:17

Carboxipeptidase Y da levedura de padaria (Saccharomyces cerevisiae), 532 aa, Acesso: EDV11788. Produto Sigma n^o C3888.

mkaftsllcg lglsttlaka islqrplgld kdvllqaaek fglnldldhl lkeldsnvld awaqiehlyp nqvmsletst kpkfpeaikt kkdwdfvvkn daienyqlrv nkikdpkilg

121 idpnvtqytg yldvededkh fffwtfesrn dpakdpvilw lnggpgcssl

Petição 870190135852, de 18/12/2019, pág. 115/236

103/104 tglffelgps

181 sigpdlkpig npyswnsnat vifldqpvnv gfsysgssgv sntvaagkdv ynflelffdq

241 fpeyvnkgqd fhiagesyag hyipvfasei lshkdrnfnl tsvlignglt dpltqynyye

301 pmacgeggep svlpseecsa medslerclg liescydsqs vwscvpatiy cnnaqlapyq

361 rtgrnvydir kdceggnlcy ptlqdiddyl nqdyvkeavg aevdhyescn fdinrnflfa

421 gdwmkpyhta vtdllnqdlp ilvyagdkdf icnwlgnkaw tdvlpwkyde efasqkvrnw

481 tasitdevag evksykhfty lrvfngghmv pfdvpenals mvnewihggf sl

Lista de referências

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Claims (10)

1. Reivindicações

   1. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender uma enzima amidase capaz de degradar ocratoxina de qualquer uma das sequências SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5-11, 13, 14 ou 15 e pelo menos um veículo fisiologicamente aceitável selecionado a partir de maltodextrina, calcário (carbonato de cálcio), ciclodextrina, trigo, farelo de trigo ou um componente de trigo, arroz ou farelo de arroz, sacarose, amido, Na2SO4, Talco, e PVA e misturas dos mesmos.
2. 2. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender uma ou mais enzima(s) adicional(is), preferivelmente em que a uma ou mais enzima(s) adicional(is) é selecionada a partir do grupo que consiste nas enzimas envolvidas na degradação proteica, incluindo carboxipeptidases, preferivelmente carboxipeptidase A, carboxipeptidase Y, proteases de ácido aspártico de A. nigerde PEPAa, PEPAb, PEPAc e PEPAd, elastase, amino peptidases, pepsina ou proteases semelhantes à pepsina, tripsina ou proteases semelhantes à tripsina e proteases bacterianas, incluindo subtilisina e suas variantes, e nas enzimas envolvidas no metabolismo de amido, degradação de fibra, metabolismo de lipídios, proteínas ou enzimas envolvidas no metabolismo de glicogênio, amilases, arabinases, arabinofuranosidases, catalases, celulases, quitinases, quimosina, cutinase, desoxirribonucleases, epimerases, esterases, -galactosidases, glucanases, glucano lisases, endo-glucanases, glucoamilases, glicose oxidases, glicosidases, incluindo β glicosidase, glicuronidases, hemicelulases, hexose oxidases, hidrolases, invertases, isomerases, enzimas lipolíticas, lacases, liases, manosidases, oxidases, oxidorredutases, pectato liases, pectina acetil esterases, pectina depolimerases, pectina metil esterases, enzimas pectinolíticas, peroxidases, fenoloxidases, fitases, poligalacturonases, proteases, ramno-galacturonases, ribonucleases, taumatina, transferases,

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   2/4 proteínas de transporte, transglutaminases, xilanases, hexose oxidase (Dhexose: O2-oxidorredutase, EC 1.1.3.5), fosfatases ácidas e/ou outras ou combinações das mesmas.
3. 3. RAÇÃO, caracterizada por compreender a composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicação 1 a 2, e um ou mais materiais de ração selecionados a partir do grupo que compreende a) cereais, tais como pequenos grãos, como trigo, cevada, centeio, aveia e combinações dos mesmos, e/ou grãos grandes, como milho ou sorgo; b) subprodutos de cereais, tais como farinha de glúten de milho, Grãos Secos de Destilaria com Solúveis (DDGS), farelo de trigo, sêmea de trigo, farelo fino de trigo, farelo de arroz, casca de arroz, casca de aveia, palmiste e polpa cítrica; c) silagem; d) proteína obtida a partir de fontes tais como soja, girassol, amendoim, tremoço, ervilhas, feijão-fava, algodão, canola, farinha de peixe, proteína de plasma seco, farinha de carne e ossos, proteína de batata, soro de leite, copra, gergelim; e) óleos e gorduras obtidos a partir de fontes vegetais e animais; f) minerais e vitaminas.
4. 4. PRODUTO ALIMENTÍCIO, caracterizado por compreender a composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 2, e um cereal tal como milho, trigo, cevada, sorgo, um produto de cereal tal como mingaus, macarrão (noodles), pão ou bolos, café, cacau, vinho, cerveja, leguminosas, especiarias, frutas secas, suco de uva, leite, produtos lácteos como queijo, carne ou produtos de carne.
5. 5. MÉTODO PARA FAZER UMA RAÇÃO, conforme definidana reivindicação 3, caracterizado por compreender adicionar a um material de ração uma composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 2.
6. 6. MÉTODO PARA FAZER UM PRODUTO ALIMENTÍCIO, conforme definido na reivindicação 4, caracterizado por compreender adicionar a um material de alimento uma composição, conforme definida em qualquer uma

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   3/4 das reivindicação 1 a 2.
7. 7. MÉTODO PARA FAZER UMA COMPOSIÇÃO, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por compreender misturar a amidase de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5-11, 13, 14 ou 15 com pelo menos um veículo fisiologicamente aceitável selecionado a partir de maltodextrina, calcário (carbonato de cálcio), ciclodextrina, trigo, farelo de trigo ou um componente de trigo, arroz ou farelo de arroz, sacarose, amido, Na2SO4, Talco, e PVA e misturas dos mesmos.
8. 8. MÉTODO PARA REDUZIR CONTAMINAÇÃO POR OCRATOXINA de um material, caracterizado por compreender identificar um material contaminado por ocratoxina e adicionar ao dito material uma enzima amidase de degradação de ocratoxina de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5-11, 13, 14 ou 15.
9. 9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pela amidase hidrolisar pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400 a 900 nanomoles de ocratoxina A por minuto por mg de proteína quando incubada em pH 7,0 e 40°C.
10. 10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações

    8 a 9, caracterizado por compreender ainda adicionar uma ou mais enzimas adicionais, preferivelmente em que a uma ou mais enzimas adicionais são selecionadas a partir do grupo que consiste nas enzimas envolvidas na degradação proteica, incluindo carboxipeptidases, preferencialmente, carboxipeptidase A, carboxipeptidase Y, proteases de ácido aspártico de A. niger de PEPAa, PEPAb, PEPAc e PEPAd, elastase, amino peptidases, pepsina ou protease semelhante a pepsina, tripsina ou protease semelhante a tripsina e proteases bacterianas, incluindo subtilisina e suas variantes, e nas enzimas envolvidas no metabolismo de amido, degradação de fibra, metabolismo de

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    4/4 lipídios, proteínas ou enzimas envolvidas no metabolismo de glicogênio, acetil esterases, aminopeptidases, amilases, arabinases, arabinofuranosidases, catalases, celulases, quitinases, quimosina, cutinase, desoxirribonucleases, epimerases, esterases, -galactosidases, glucanases, glucano lisases, endoglucanases, glucoamilases, glicose oxidases, -glicosidases, incluindo β glicosidase, glicuronidases, hemicelulases, hexose oxidases, hidrolases, invertases, isomerases, enzimas lipolíticas, lacases, liases, manosidases, oxidases, oxidorredutases, pectato liases, pectina acetil esterases, pectina depolimerases, pectina metil esterases, enzimas pectinolíticas, peroxidases, fenoloxidases, fitases, poligalacturonases, proteases, ramno-galacturonases, ribonucleases, taumatina, transferases, proteínas de transporte, transglutaminases, xilanases, hexose oxidase (D-hexose: O2-oxidorredutase, EC 1.1.3.5), fosfatases ácidas e/ou outras ou combinações das mesmas, opcionalmente compreende ainda adicionar pelo menos uma dentre uma enzima desintoxicante selecionada a partir do grupo que consiste em uma enzima de degradação de micotoxina, tal como enzima de detoxificação de aflatoxina, zearalenona esterases, zearalenona lactonases, fumonisina carboxilesterases, fumonisina aminotransferases, aminopoliol amina oxidases, desoxinivalenol expóxido hidrolases, um micro-organismo de degradação de micotoxina, tal como Bacillus subtilis ou um absorvente,tal como ligantes de micotoxinas, incluindo pelo menos um polímero, tal como paredes celulares microbianas ou um material inorgânico, tal como bentonita.