BR102016021164A2 - Composição farmacêutica baseada no composto 1- cloro-6-nitro-2-({2-nitrofenil} sulfanil) - 2,3,3a,4,5,9b-hexahidro-1h-ciclopenta[c]quinolina-4- ácido carboxílico e seu uso na preparação de medicamentos para o tratamento de infecções causadas por micro-organismos do gênero paracoccidioides spp - Google Patents
Composição farmacêutica baseada no composto 1- cloro-6-nitro-2-({2-nitrofenil} sulfanil) - 2,3,3a,4,5,9b-hexahidro-1h-ciclopenta[c]quinolina-4- ácido carboxílico e seu uso na preparação de medicamentos para o tratamento de infecções causadas por micro-organismos do gênero paracoccidioides spp Download PDFInfo
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Abstract
a presente invenção se enquadra no contexto da química farmacêutica e se refere a composição farmacêutica e o seu uso no combate à infeções causadas por fungos. mais especificamente, a presente invenção trata-se de uma composição farmacêutica que é útil no tratamento de infecções humanas causadas por microrganismos do gênero paracoccidioides spp. a composição farmacêutica compreende o composto 1-cloro-6-nitro-2-({2-nitrofenil}sulfanil)-2,3,3a,4,5,9b-hexahidro-1h-ciclopenta[c]quinolina-4-ácido carboxílico, também denominado na presente invenção de cp1. a presente invenção descreve ainda o uso da composição, e do composto cp1 na formulação de um medicamento, aditivo, agente ou formulação para o tratamento de infecções fúngicas sistêmicas, como a paracoccidioidomicose.
Description
(54) Título: COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA BASEADA NO COMPOSTO l-CLORO-6NITRO-2-({2-NITROFENIL} SULFANIL) -2,3,3A, 4,5,9B-HEXAHIDRO-1H-CICLOPENTA[C] QUINOLINA-4-ÁCIDO CARBOXÍLICO E SEU USO NA PREPARAÇÃO DE MEDICAMENTOS PARA O TRATAMENTO DE INFECÇÕES CAUSADAS POR MICROORGANISMOS DO GÊNERO PARACOCCIDIOIDES SPP (51) Int. Cl.: A61K 31/473; A61P 31/10 (73) Titular(es): UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ (72) Inventor(es): FLAVIO AUGUSTO VICENTE SEIXAS; ÉRIKASEKI KIOSHIMA COTICA; FRANCIELE ABIGAIL VILUGRON RODRIGUES; CIDNEI MARSCHALK (57) Resumo: A presente invenção se enquadra no contexto da química farmacêutica e se refere a composição farmacêutica e o seu uso no combate à infeções causadas por fungos. Mais especificamente, a presente invenção trata-se de uma composição farmacêutica que é útil no tratamento de infecções humanas causadas por microrganismos do gênero Paracoccidioides spp. A composição farmacêutica compreende o composto l-cloro-6-nitro-2-({2-nitrofenil}sulfanil) -2,3,3a,4,5,9b-hexahidro-lh-ciclopenta[c] quinolina-4-ácido carboxílico, também denominado na presente invenção de CPI. A presente invenção descreve ainda o uso da composição, e do composto CPI na formulação de um medicamento, aditivo, agente ou formulação para o tratamento de infecções fúngicas sistêmicas, como a
Paracoccidioidomicose.
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COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA BASEADA NO COMPOSTO 1-CLORO-6NITRO-2-({2-NITROFENIL} SULFANIL) -2,3,3A,4,5,9B-HEXAHIDRO-1 HCICLOPENTA[C]QUINOLINA-4-ÁCIDO CARBOXÍLICO E SEU USO NA
PREPARAÇÃO DE MEDICAMENTOS PARA O TRATAMENTO DE INFECÇÕES CAUSADAS POR MICRO-ORGANISMOS DO GÊNERO PARACOCCIDIOIDES SPP.
[001] CAMPO DA INVENÇÃO [002] A presente invenção se enquadra no contexto da química farmacêutica e se refere genericamente a composições farmacêuticas e uso de compostos químicos no combate à infeções causadas por fungos.
[003] Mais especificamente, a presente invenção trata-se de uma composição farmacêutica que compreende o composto 1-cloro-6-nitro-2-({2nitrofenil} sulfanil) -2,3,3a, 4,5,9b-hexahidro-1 h-ciclopenta[c]quinolina-4-ácido carboxílico, que é útil no tratamento de infecções causadas por fungos do gênero Paracoccidioides spp em humanos.
[004] Adicionalmente a presente invenção descreve o uso da composição, e do composto 1-cloro-6-nitro-2-({2-nitrofenil} sulfanil) 2,3,3a, 4,5,9b-hexahidro-1h-ciclopenta[c]quinolina-4-ácido carboxílico na formulação de um medicamento, aditivo, agente ou formulação útil também no tratamento de paracoccidioidomicose.
[005] DESCRIÇÃO DO ESTADO DA TÉCNICA [006] Os fungos estão distribuídos em todo mundo e podem ocasionar doenças em humanos, animais e plantas. Infecções fúngicas em humanos incluem desde infecções superficiais até as disseminadas, que podem ser fatais. Estas micoses podem ser divididas em infecções de risco à vida tais como histoplasmose, candidíase sistêmica, aspergilose, paracoccidioidomicose (PCM) e criptococcose e infecções que não apresentam risco de vida, mas causam grande desconforto aos indivíduos tais como as causadas por fungos dermatófitos que são os causadores da tinea e ainda, a candidíase muco cutânea.
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2/18 [007] Entre os fungos conhecidos que causam doenças em humanos, as espécies do gênero Paracoccidioides spp. são de significativa importância médica. Este fungo é responsável por causar a Paracoccidioidomicose. Paracoccidioides spp. é um fungo patogênico termodimórfico e o agente etiológico da mais prevalente entre as micoses sistêmicas da América Latina. As infecções são endêmicas em muitas áreas do México até a Argentina. Os pacientes infectados são geralmente trabalhadores de zonas rurais que possuem grandes deficiências de acesso e suporte à rede de serviços de saúde, o que leva a um diagnóstico tardio e, consequentemente a um alto potencial incapacitante com quantidade significativa de mortes prematuras.
[008] Por ser uma doença negligenciada, não há registros precisos de sua incidência, nem mesmo um tratamento específico. Todos os órgãos são suscetíveis à doença que geralmente se apresenta como lesões pulmonares ou extra-pulmonares envolvendo mucosa oral, nariz e laringe. O local aonde ocorre a infecção primária é o pulmão e que começa com a inalação dos propágulos infecciosos. Uma vez estabelecida, a infecção pode se espalhar para outros locais, particularmente a mucosa oral e pode se estender para pele adjacente, sistema linfático gastrointestinal, fígado, glândulas supra-renais e baço. Lesões ulcerativas quando presentes são características e ocorrem no nariz e boca sendo os primeiros sintomas visíveis. As lesões pulmonares fibrosadas após a cicatrização e cura podem progridem para doença pulmonar crônica.
[009] O tratamento antifúngico apresenta menos opções terapêuticas quando comparado à quimioterapia bacteriana. Limitações às atuais opções terapêuticas incluem, dentre outros: espectro de atividade limitado, falta de eficiência devido a crescente resistência, baixo perfil de segurança, interação múltipla com outras drogas, perfil farmacocinético inadequado e custo excessivo.
[010] A maioria dos agentes antifúngicos conhecidos para o tratamento da Paracoccidioidomicose se situa entre três principais grupos. O grupo principal inclui derivados polienos representando pela anfotericina B. São
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3/18 drogas que tem atividade contra diversas espécies de fungo, sendo a mais eficiente entre as drogas utilizadas no tratamento da PCM, porém, apresenta alta nefrotoxicidade e possibilidade de sequelas para os pacientes. Assim, o tratamento com anfotericina B se restringe a pacientes em estado grave da doença. Este antifúngico se liga ao ergosterol, um componente das membranas celulares de fungos e, com isso, formam poros na membrana celular levando a célula à morte. Anfotericina B é geralmente efetiva para micoses sistêmicas, mas sua administração é limitada por causa de seus efeitos colaterais tais como febre, danos aos rins, anemia, baixa pressão sanguínea, dor de cabeça, náusea, etc. Por causa disso, seu uso é restrito ao ambiente hospitalar, por ser de administração endovenosa.
[011] Vários derivados da sulfa têm sido utilizados para tratar PCM desde 1940. Entretanto, várias desvantagens têm sido relatadas para o uso das sulfadiazinas, como: posologia (mais de 2x por dia), tratamento prolongado e efeitos adversos. Na fase de manutenção do tratamento da PCM, tem sido utilizado com frequência a sulfametoxazol-trimetoprima (SMX-TMT). Este medicamento é distribuído pelo Ministério da Saúde Brasileiro, e os estudos mostram que possui boa distribuição corporal. Porém, em 5% dos pacientes este tratamento não funciona. E a principal desvantagem dessa terapia é o tempo de tratamento longo e seus efeitos colaterais.
[012] O terceiro grupo de agentes antifúngicos inclui derivados azólicos que interferem na síntese do ergosterol, na enzima Lanosterol demetilase levando à acumulação de metabólitos na membrana dos fungos e inibem o crescimento dos mesmos. Este grupo de agentes antifúngicos inclui cetoconazol, clotrimazol, miconazol, econazol, butoconazol, oxiconazol, sulconazol, terconazol, fluconazol e itraconazol e mais recentemente voriconazol e posaconazol. Alguns destes agentes podem ser administrados para tratar micoses sistêmicas. Mesmo com o advento dos azólicos de terceira geração (voriconazol e posoconazol), o itraconazol, ainda é a melhor opção para o tratamento da PCM crônica. No entanto, o tratamento prolongado é um dos principais obstáculos a cura da doença, devido ao custo e aos efeitos
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4/18 adversos da medicação a longo prazo. Entre esses efeitos diversos podem-se citar desconforto epigástrico, diarréia, náuseas, febre, calafrios, arritmias cardíacas, danos renais, danos ao fígado, trombocitopenia, etc. Esses motivos levam o paciente muitas vezes a abandonar o tratamento, o que inevitavelmente pode levar ao surgimento de variedades mais resistentes deste e/ou de outros microrganismos oportunistas.
[013] O descobrimento de novos alvos moleculares e, consequentemente, de novas alternativas de tratamentos por vias acadêmicas representam esforços significativos tanto no combate desta doença, quanto de outras infecções cujo tratamento é ainda muito limitado quando comparado às doenças causadas por bactérias. Nesse contexto, a via do ácido chiquímico é uma rota metabólica para a síntese de vários metabólitos secundários como o PABA (ácido p-aminobenzóico), o ácido p-hidroxibenzóico (precursor da coenzima-Q), as micobactinas além de aminoácidos aromáticos, sendo que esta via está presente em P. brasiliensis, mas ausentes em animais. Esta característica torna a via do ácido chiquímico um excelente alvo de drogas que ainda permanece praticamente inexplorado contra a paracoccidioidomicose. A enzima Corismato Sintase (EC: 4.2.3.5) é a sétima enzima desta via e catalisa o último passo da rota, convertendo o substrato 5-enolpiruvilchiqiuimato-3fosfato (5-EPSP) em corismato na presença de um cofator, uma flavina mononucleotídeo reduzida (FMNH2) que não é consumida durante a reação. A estrutura da enzima Corismato Sintase de P. brasiliensis (PPCS) ainda é desconhecida, porém, o gene e a sequência de aminoácidos desta enzima já são conhecidos. Nosso grupo de pesquisa utilizou-se da sequência de aminoácidos da enzima PbCS para modelar sua estrutura tridimensional e utilizá-la como alvo em simulações de Varredura Virtual (virtual screening) de 204.400 compostos disponíveis na base de dados Zinc. Os resultados indicaram que o composto1-cloro-6-nitro-2-({2-nitrofenil} sulfanil) -2,3,3a,4,5,9bhexahidro-1 h-ciclopenta[c] quinolina - 4-ácido carboxílico, nominado aqui de CP1 se ligam a enzima com maior afinidade que seu substrato original o 5EPSP. Por meio dos experimentos a seguir foi possível a comprovação da
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5/18 atividade antifúngica in vitro e in vivo contra fungos do gênero Paracoccidioides de um dos potenciais compostos, o Zinc06445857 denominado de CP1.
[014] Neste contexto a presente invenção apresenta uma alternativa viável de tratamento de infecções causadas por fungos do gênero Paracoccidioides spp. por meio de uma composição farmacêutica que, ao mesmo tempo que apresenta índices de resposta semelhantes a drogas de referência como o itraconazol, apresenta baixos índices de citotoxicidade e eficiência no tratamento in vivo.
[015] SUMÁRIO DA INVENÇÃO [016] A presente invenção apresenta uma composição farmacêutica para o tratamento de infecções causadas por microrganismos do gênero Paracoccidioides spp., compreendendo como ingrediente ativo o composto 1cloro-6-nitro-2-({2-nitrofenil} sulfanil) -2,3,3a,4,5,9b-hexahidro-1 hciclopenta[c]quinolina-4-ácido carboxílico, também chamado de CP1 ou um sal ou um hidrato ou um solvato do mesmo.
[017] Outro objeto de proteção da presente invenção refere ao uso do composto CP1 ou um sal ou um hidrato ou um solvato do mesmo, útil na preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de infecções causadas por microrganismos do gênero Paracoccidioides spp.
[018] BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [019] A Figura 1 apresenta a Fórmula Estrutural da molécula 1-cloro-6nitro-2-({2-nitrofenil} sulfanil) -2,3,3a, 4,5,9b-hexahidro- 1h-ciclopenta[c]quinolina4-ácido carboxílico (CP1) [020] A Figura 2 mostra os resultados na determinação da concentração inibitória mínima (MIC) e concentração fungicida mínima (MFC) do composto CP1 atuando diretamente sobre as leveduras de diferentes isolados de Paracoccidioides spp. Para o experimento apresentado na Figura 2A, o CP1 foi preparado por diluição seriada em concentrações de 0,2 a 128 mg/L, diluída em DMSO a 1% e 0,2% de Pluronic. As suspensões de leveduras foram diluídas em meio RPMI 1640 na concentração final de 0,5 a 1x104 células/ml. As placas de 96 poços foram incubadas por 7 dias a 35°C. A leitura foi definida
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6/18 como a concentração mais baixa de CP1, que mostra 90% e 100% de inibição de crescimento. P. brasiliensis - Mg14, P. lutzii - Pb01, P. lutzii - 8334 e P. lutzii - ROSC mostrando 90% de inibição de crescimento em 32 mg/L. Na Figura 2B é mostrado o cultivo das concentrações de MIC em meio de cultura: infusão de coração e cérebro (BHI) ágar, a 37°C. CP1 apresentou atividade fungicida para todos os isolados, particularmente para Pb18, para o qual o composto se mostrou promissor (MIC - 4mg/L).
[021] A Figura 3 mostra os resultados da avaliação in vitro da citotoxicidade do composto CP1. Este experimento foi realizado em três linhagens de células por um ensaio colorimétrico. Várias concentrações de CP1 foram testadas (0,0 para 128 mg/L) sem mostrar toxicidade significativa (p>0.05). As três linhagens celulares avaliadas mostraram viabilidade superior a 98% após 24 horas de exposição ao CP1, mesmo em concentração 2xMIC (64 mg/L). O gráfico é representado por três experimentos independentes. As barras indicam o desvio padrão.
[022] A Figura 4 mostra os resultados da atividade antifúngica do composto CP1 e do antifúngico comercial no modelo experimental da Paracoccidioidomicose em camundongos. O gráfico representa as unidades formadoras de colônia (CFU) de P. brasiliensis recuperadas após o tratamento com os compostos. Controle: animais tratados com veículo (DMSO a 1% e Pluronic a 0,2%). Itraconazol: animais tratados com itraconazol (5mg/kg). CP1: animais tratados com o composto CP1 (5mg/kg). Após 48h de infecção todos os animais foram tratados durante 14 dias. Os experimentos foram realizados em triplicata, e as barras indicam o desvio padrão. * p <0,05, estatisticamente significativo quando comparada com o controle.
[023] A Figura 5 mostra os resultados da análise histopatológica dos órgãos dos animais infectados com P. brasiliensis e tratados com itraconazol ou CP1. As fotomicrográficas apresentadas são dos pulmões dos camundongos infectados com 1 x 106 células de levedura de Paracoccidioides brasiliensis. (A, D) Corte pulmonar de camundongo infectado e tratado com veículo (x50 x400 e ampliação, respectivamente). (B, E) Corte pulmonar de
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7/18 camundongo infectado e tratado com Itraconazol (x50 x400 e ampliação, respectivamente). (C, F) Corte pulmonar de camundongo infectado e tratado com CP1(x50 x400 e ampliação, respectivamente).
[024] A Figura 6 mostra os resultados do tratamento in vitro das leveduras de Paracoccidioides brasiliensis (Pb18) após contato com diferentes concentrações do composto CP1, analisadas por microscopia eletrônica de varredura. As células de P. brasiliensis foram incubadas como duas concentrações do composto CP1 (64 e 128mg/L). (A, B) Controle: células de levedura sem tratamento. (C, D) Células de levedura tratadas com o composto CP1 (64mg/L). (E, F) Células de levedura tratadas com CP1 (128mg/L). As células fúngicas do controle estão com sua morfologia preservadas e apresenta células de levedura multibrotantes. Nota-se a presença de extravasamento de conteúdo celular na Figura 6C (setas amarelas), esmagamento da superfície celular e depressão nas figuras D, E e F (setas amarelas), além disso, pode ser observada aglomeração das leveduras (E, F). As amostras foram observadas em amplificações de 3000X (barras A, C, E: 5um) e 1000x (barras B, D, F: 10um).
[025] A Figura 7 mostra os resultados dos experimentos de fagocitose de P. brasiliensis (Pb18) in vitro por macrófagos peritoniais tratados ou não com CP1. O índice de fagocitose (PI) foi determinado após o tratamento da fagocitose com CP1 (128 mg/L) durante 24, 48 e 72 horas (Mo+Pb18+CP1). No ensaio do controle, os macrófagos foram cultivados e desafiados com P. brasiliensis e os tratados com o diluente de CP1 (DMSO 1% e Pluronic 0,2%) (Mo+Pb18+Diluente). Análises de fungos internalizados pelos macrófagos foram visualizados e contados por microscopia óptica de contraste e o PI foi determinado pelo cálculo da porcentagem de células fagocíticas (macrófagos), multiplicado pelo número médio de partículas internalizadas.
[026] DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [027] A presente invenção se refere a uma composição farmacêutica para o tratamento de infecções causadas por microrganismos do gênero Paracoccidioides spp., tendo como ingrediente ativo o composto 1-cloro-6-nitroPetição 870160051322, de 14/09/2016, pág. 18/47
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2-({2-nitrofenil} sulfanil) -2,3,3a, 4,5,9b-hexahidro-1h-ciclopenta[c]quinolina-4ácido carboxílico ou um sal ou um hidrato ou um solvato do mesmo.
[028] O composto 1-cloro-6-nitro-2-({2-nitrofenil} sulfanil) -2,3,3a,4,5,9bhexahidro-1h-ciclopenta[c]quinolina-4-ácido carboxílico - também denominado no presente documento de CP1, representado pela Fórmula Estrutural (Figura 1), possui importantes grupos funcionais com propriedades biológicas em sua cadeia.
[029] Adicionalmente, a referida composição farmacêutica da invenção compreende pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável. Como excipiente farmaceuticamente aceitável entende-se qualquer excipiente que não interfira na eficácia da atividade do ingrediente ativo e que não seja tóxico para o hospedeiro no qual é administrado.
[030] Para uso humano, uma composição farmacêutica é geralmente administrada em conjunto com um excipiente farmaceuticamente aceitável, selecionado de acordo com a rota de administração pretendida e de acordo com a prática farmacêutica estabelecida.
[031] Em uma concretização preferencial da invenção, a referida composição farmacêutica objeto de proteção se apresenta na forma farmacêutica selecionada entre pós, granulados, comprimidos, drágeas, cápsulas, soluções, xaropes, elixires, suspensões, emulsões, injetáveis, tinturas, extratos, pomadas, cremes, pastas, loções, géis, aerossóis, adesivos e outras formas para administração conhecidas.
[032] Diversos excipientes podem ser utilizados na composição farmacêutica da presente invenção. Entre os excipientes passíveis de serem utilizados para formas farmacêuticas líquidas (soluções, suspensões, elixir, loções, entre outros), pode-se citar, entre outros, veículos, agentes de aumento de viscosidade, agentes de tonicidade, agentes de suspensão, agentes acidificantes, agentes alcalinizantes, conservantes, tampões e agentes edulcorantes.
[033] Entre os excipientes passíveis de serem utilizados para formas farmacêuticas sólidas (pós, granulados, comprimidos, cápsulas, entre outros),
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9/18 pode-se citar entre outros, diluentes, aglutinantes, desagregantes/ desintegrantes, lubrificantes, agentes de revestimento, absorventes e tensoativos.
[034] Entre os excipientes passíveis de serem utilizados para formas farmacêuticas semissólidas (cremes, géis, pomadas, loções, entre outros), pode-se citar, entre outros, veículos, espessantes, agentes umectantes, agentes emolientes, agentes emulsificantes, agentes antioxidantes, parabenos, conservantes, agentes levigantes ou pulverizantes, agentes sequestrantes ou quelantes, adsorventes, tampões e agentes edulcorantes.
[035] Para concretização preferencial da invenção, a referida composição farmacêutica objeto de proteção compreende, preferencialmente, 10% a 30% de ingrediente ativo.
[036] A presente invenção também se refere ao uso do composto 1-cloro6-nitro-2-({2-nitrofenil} sulfanil) -2,3,3a, 4,5,9b-hexahidro- 1hciclopenta[c]quinolina-4-ácido carboxílico em uma de suas formas, selecionadas entre neutra, sal, hidrato ou solvato na preparação de um medicamento, aditivo, agente ou formulação útil no tratamento de infecções causadas por microrganismos do gênero Paracoccidioides spp.
[037] Tal composto pode constituir uma alternativa na substituição a ingredientes ativos hoje utilizados e possuem efeitos secundários que limitam sua utilização. Os resultados destes ensaios comprovaram relevante potencial fungitóxico e específico contra espécies de fungos do gênero Paracoccidioides spp.
[038] EXEMPLOS [039] Os exemplos abaixo são apresentados a fim de ilustrar mais detalhadamente determinadas modalidades da invenção. É importante destacar que a presente invenção não se limita aos exemplos citados, podendo ser utilizada em todas as aplicações descritas ou em quaisquer outras variações equivalentes.
[040] Cabe salientar que os exemplos relacionados à atividade do composto 1-cloro-6-nitro-2-({2-nitrofenil} sulfanil) -2,3,3a,4,5,9b-hexahidro-1hPetição 870160051322, de 14/09/2016, pág. 20/47
10/18 ciclopenta[c]quinolina-4-ácido carboxílico não ficam restritos a uma de suas formas, seja neutra, sal, hidrato ou solvato.
[041] EXEMPLO 1: EXPERIMENTAÇÃO IN SILICO DA SELEÇÃO DO COMPOSTO E A INTERAÇÃO COM A ENZIMA CORISMATO SINTASE [042] O composto 1-cloro-6-nitro-2-({2-nitrofenil} sulfanil) -2,3,3a,4,5,9bhexahidro-1h-ciclopenta[c]quinolina-4-ácido carboxílico foi selecionado a partir de métodos in silico. Para isso foi construído um modelo tridimensional da enzima corismato sintase de Paracoccidioides brasiliensis com excelente qualidade estereoquímica. Simultaneamente forma montadas duas bibliotecas de compostos a serem testados. A primeira biblioteca, continha 2555 candidatos do banco de dados Zinc Database com 80% de similaridade estrutural com ligantes da enzima corismato sintase. A segunda biblioteca foi a de Produtos naturais da Zinc Database, contendo 204.400 compostos com disponibilidade comercial. Todos estes compostos candidatos foram testados virtualmente como possíveis inibidores do sítio catalítico da enzima corismato sintase, dos quais três compostos foram selecionados e submetidos à avaliação pelos critérios ADMETox, que inclui as regras de Lipinski pelo servidor FAF-Drugs, sendo então adquiridos comercialmente para testes in vitro e in vivo. No entanto, somente o composto 1-cloro-6-nitro-2-({2-nitrofenil} sulfanil) -2,3,3a, 4,5,9b-hexahidro-1h-ciclopenta[c]quinolina-4-ácido carboxílico apresentou promissora atividade antifúngica contra Paracoccidioides spp.
[043] EXEMPLO 2: TESTES DE SUSCETIBILIDADE DE FUNGO DO GÊNERO PARACOCCIDIOIDES SPP. AO COMPOSTO 1-cloro-6-nitro-2-({2nitrofenil} sulfanil) -2,3,3a,4,5,9b-hexahidro-1h-ciclopenta[c]quinolina-4ácido carboxílico E AO ANTIFÚNGICO ITRACONAZOL [044] Para avaliar o perfil de suscetibilidade dos isolados clínicos de Paracoccidioides spp. ao composto 1-cloro-6-nitro-2-({2-nitrofenil} sulfanil) 2,3,3a,4,5,9b-hexahidro-1h-ciclopenta[c]quinolina-4-ácido carboxílico e ao itraconazol, foi realizado o teste de microdiluição em caldo utilizando método proposto pelo CLSI (Clinicai and Laboratory Standards Institute, 2010), de acordo com o protocolo M27-A3 com modificações. Foram determinadas a
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11/18 concentração mínima inibitória (MIC - Minimum Inhibitory Concentration) e a concentração mínima fungicida (MFC - Minimum Fungicide Concentration) para os patógenos utilizados.
[045] Os compostos CP1 e o itraconazol (Sigma-Aldrich) foram testados. As drogas foram diluídas em meio RPMI [RPMI-1640 sem bicarbonato, com Lglutamina, suplementado com 2 % de glicose e tamponado (pH 7.0) com 0,165 mol/L de ácido morfolinopropanosulfonico (MOPS) (Sigma-Aldrich)]. O Dimetilsulfóxido (DMSO) e o Pluronic (Sigma-Aldrich) foram usados como diluente para o composto CP1. Os fungos foram incubados na ausência e presença de DMSO 1 % (vol/vol) e Pluronic 0,2% (vol/vol) para confirmar que a exposição a esse solvente não influencia no crescimento dos isolados testados.
[046] Os testes de suscetibilidade in vitro foram realizados em dois isolados de P. brasiliensis (Mg 14 e PB 18) e três isolados de P. lutzii (Pb01, 8334 e ROSO), as amostras fazem parte da coleção de Micologia Médica Laboratório da Universidade Estadual de Maringá. Os fungos foram mantidos por subcultura semanal em meio de cultura semi-sólido Fava Neto contendo 4% de glicose a 35°C e os fungos foram utilizados entre o quinto e o sétimo dia de crescimento em meio de cultura.
[047] Os inóculos das leveduras foram preparados em tampão salina estéril (0,85%), na concentração final de 0,5 a 2,5x105 células/mL. Os testes foram realizados em microplacas estéreis contendo 96 poços. Como controle foi utilizado RPMI sem inóculo (negativo).
[048] A cepa de C. parapsilosis (ATCC 22019) foi utilizada como levedura referência para todos os testes. O tempo de incubação foi de 5 dias, a 37°C. Os dados foram apresentados como a concentração inibitória mínima (CIM), que corresponde à concentração do composto capaz de inibir 80% do crescimento. Para determinar a concentração fungicida mínima (CFM), foram plaqueados 5ul de cada poço da placa do CIM, que apresentaram inibição do crescimento, em meio BHI ágar. As placas foram incubadas a 37°C durante 7 dias. A menor concentração do composto na qual não foi possível observar crescimento foi determinada como a concentração CFM. A Tabela 1 a seguir
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12/18 mostra o resultado obtido dos testes in vitro de suscetibilidade de fungos ao composto 1-cloro-6-nitro-2-({2-nitrofenil} sulfanil) -2,3,3a,4,5,9b-hexahidro-1hciclopenta[c]quinolina-4-ácido carboxílico e ao Itraconazol.
[049] Tabela 1. Perfil de sensibilidade de isolados de Paracoccidioides spp, com os valores da CIM e CFM de CP1 e CIM de Itraconazol
| Isolado | Espécie | CIM CP1 mg/L | CFM CP1 mg/L | CIM Itraconazol mg/L |
| Pb18 | P. brasiliensis | 2 | 4 | 1 |
| Mg14 | P. brasiliensis | 16 | - | 1 |
| Pb01 | P. lutzii | 16 | 128 | 1 |
| ROSC | P. lutzii | 32 | 32 | 1 |
| 8334 | P. lutzii | 16 | 64 | 1 |
[050] Como o composto 1-cloro-6-nitro-2-({2-nitrofenil} sulfanil) 2,3,3a, 4,5,9b-hexahidro-1h-ciclopenta[c]quinolina-4-ácido carboxílico apresentou a menor concentração capaz de inibir o crescimento fúngico tanto de Paracoccidioides brasiliensis quanto Paracoccidioides lutzii, as duas espécies causadoras da PCM nos ensaios preliminares dos três compostos selecionados como inibidores da Corismato sintase. Ele foi adquirido comercialmente para os demais ensaios para comprovação da atividade antifúngica com fungos do gênero Paracoccidioides spp. Dessa forma, foi determinada a concentração inibitória mínima (CIM) de CP1 para vário isolados clínicos sendo dois isolados da espécie P. brasiliensis (Pb18 e Mg14) que apresentaram valores de CIM nas concentrações de 2 e 16mg/L, respectivamente, e três isolados da espécie P. lutzii (Pb01, ROSC e 8334), que apresentaram CIM nas concentrações de 16 a 32 mg/L como mostra a tabela 1 e representado na Figura 2A.
[051] Para o Itraconazol todos os isolados testados foram inibidos na concentração de 1mg/L (Tabela 1). A partir da CIM foi possível determinar a concentração fungicida mínima (CFM) (Figura 2B), que revelou o composto 1cloro-6-nitro-2-({2-nitrofenil} sulfanil) -2,3,3a, 4,5,9b-hexahidro-1 hciclopenta[c]quinolina-4-ácido carboxílico tem um perfil fungicida na
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13/18 concentração de 4mg/L para o isolado clínico de P. brasiliensis (Pb18). Esta é uma característica extremamente relevante, uma vez que entre os medicamentos disponíveis para o tratamento da Paracoccidioidomicose apenas Anfotericina B tem perfil fungicida, porém seu uso é limitado devido aos inúmeros efeitos colaterais e sua administração via endovenosa, que pode só ser realizada em ambiente hospitalar. O itraconazol que é um dos tratamentos para PCM mais utilizado é um agente fungistático, que não mata o fungo, apenas inibe o crescimento. A partir desses resultados, foi possível comparar a eficiência antifúngica entre o composto testado e a droga de referência itraconazol, verificando que, apesar da droga de referência apresentar os menores valores de CIM, verifica-se que o composto CP1 apresenta grande eficiência antifúngica por apresentar um perfil fungicida.
[052] EXEMPLO 3: TESTES DE CITOTOXICIDADE DO COMPOSTO 1CLORO-6-NITRO-2-({2-NITROFENIL} SULFANIL) -2,3,3A,4,5,9BHEXAHIDRO-1 H-CICLOPENTA[C]QUINOLINA-4-ÁCIDO CARBOXÍLICO EM TRÊS LINHAGEM CELULARES HUMANAS [053] A citotoxicidade do composto CP1 foi realizada em células HeLa, células de macrófagos J774 e HUVEC, usando o ensaio CelITiter 96 (Promega, Madison, Wl, EUA), com base na redução de MTS (3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] - 5[3-carboximetoxifenil] -2- [4-sulfofenilo] -2H-tetrazólio). As células foram semeadas em placas de microdiluição de 96 poços a uma densidade de 2 χ 104 células/poço em meio DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s médium) para as células HeLa e HUVEC e meio RPMI para os macrófagos, suplementados com soro fetal bovino (FBS), a 10% (v/v) (soro bovino fetal, Gibco BRL, Invitrogen, Paisley, Escócia). As células foram cultivadas em um ambiente úmido com 5% de CO2 e 95% de O2 a 37°C. Após 24 h de incubação, 200μΙ do composto CP1 foram adicionados à fileira 1 das placas de microdiluição e diluídos 1:1 em série, a fim de obter concentrações finais que variam de 16 a 128 mg/L. As células cultivadas com o composto foram incubadas por 24 h em um ambiente húmido com 5% de CO2 e 95% de O2 a 37°C. A células foram lavadas com PBS, 2 vezes e adicionado 100ul de MTS na diluição 1:100,
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14/18 incubada 5% de CO2 e 95% de O2 a 37°C e após 4 horas o sobrenadante foi transferido para uma nova placa nova, e estas foram transferidas para um leitor de placas de microdiluição de ELISA a Asyonm- A citotoxicidade foi expressa como a porcentagem de viabilidade celular em comparação com células controle não tratadas.
[054] A Figura 3 apresenta a viabilidade celular (%) em função da concentração do composto que mostra atividade antifúngica in vitro. Os métodos in silico utilizados buscaram compostos com atividade seletiva contra o fungo, sem causar danos para células de mamíferos. Assim, antes do ensaio em animais para avaliar a atividade antifúngica de CP1, foi realizado o ensaio de citotoxicidade in vitro, três linhagens celulares humanas, macrófagos J774, HUVEC e HeLa foram submetidas a concentrações crescentes do composto (128, 64 e 16mg/L). É possível afirmar que, mesmo em concentração 4 vezes maior que a CIM (128 mg/L), a viabilidade celular foi maior do que a de 80% para todas as células testadas, não houve diferença estatisticamente significativa (p> 0,05). Indicando que CP1 é um composto promissor para o desenvolvimento de novos medicamentos antifúngicos (Figura 3).
[055] EXEMPLO 4: AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA IN VIVO DOS COMPOSTOS 1-CLORO-6-NITRO-2-({2-NITROFENIL} SULFANIL) 2,3,3A,4,5,9B-HEXAHIDRO-1 H-CICLOPENTA[C]QUINOLINA-4-ÁCIDO CARBOXÍLICO NO MODELO EXPERIMENTAL DA PARACOCCIODIOIDOMICOSE EM CAMUNDONGOS [056] Para realização destes ensaios in vivo foram utilizados camundongos Balb/c machos, com seis semanas de idade, reproduzidos em condições específicas isentos de agentes patogênicos nas instalações de origem animal da Universidade Estadual de Maringá, Brasil. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com os regulamentos da Comissão de Ética institucional para a experimentação animal, Universidade Estadual de Maringá, Brasil (aprovação no. 053/2014 CEP, 2014/02/10). Os animais foram tratados de acordo com os Estados Unidos National Institutes of Health Guide
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15/18 para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (http://oacu.od.nih.gov/ARAC/ index.htm; acessada 21 de novembro de 2015).
[057] Grupos de 5 camundongos da linhagem Balb/c foram utilizados para avaliar a atividade antifúngica in vivo de CP1. Para o preparo do inóculo de células fúngicas foi utilizado Pb18 crescido em meio de cultura por 5 dias, verificou-se a viabilidade do fungo com o corante vital Tripan Blue (geralmente mais de 90%) e contadas as unidades formadoras de colônia em câmara de Neubauer. Os três grupos de camundongos (6-8 semanas de idade) foram infectados por via intratraqueal (IT) com 1 χ 106 células de levedura viáveis em 50ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Após 48 horas de infecção, o tratamento foi iniciado com CP1 (5mg/Kg), itraconazol (5mg/Kg) ou veículo (PBS, 1% DMSO e 0,2% Pluronic). Os animais de cada grupo foram eutansiados quinze dias após o tratamento, parte dos órgãos foi para as análises histopatológicas e a outra parte para maceração. Os órgãos de cada camundongo foram pesados e macerados utilizando gral e pistilo em 1 ml de PBS, e 300ul deste macerado foi plaqueado em BHI suplementado. O número de leveduras viáveis nos órgãos foi estimado pela contagem das unidades formadoras de colônias (UFC) crescidas até 15 dias a 35°C. Os resultados foram apresentados como o log 10 do valor médio ± desvio padrão. O experimento foi realizado em triplicata.
[058] Como mostrado na Figura 4 o composto CP1 apresentou eficiência em controlar a infecção causada por P. brasiliensis em animais. Verificou-se que camundongos Balb/c machos infectados com Pb18 e tratados com CP1 via intraperitoneal, durante quinze dias, reduziu significativamente o número de unidades formadoras de colônias (CFU) de P. brasiliensis remanescentes nos pulmões dos animais em comparação ao grupo controle de animais infectados e tratados apenas com o veículo, os resultados do tratamento com CP1 foi semelhante ao grupo de animais tratados com Itraconazol (p<0,05). Dessa forma, pela baixa citotoxicidade do composto CP1 e capacidade de matar os fungos, é bastante promissor para desenvolvimento de novos medicamentos para tratar micoses sistêmicas frente ao itraconazol que é a droga de escolha
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16/18 para pacientes não hospitalizados e que, no entanto, apresenta perfil fungistático e não fungicida como é o caso do composto CP1. Neste contexto a presente invenção apresenta uma alternativa viável de tratamento de infecções causadas por fungos do gênero Paracoccidioides spp.
[059] Para análise histopatológica, o pulmão e fígado de cada camundongo foram removidos, fixados em 10% formalina e embebidos em parafina. Secções de cinco micrômetros foram coradas com hematoxilinaeosina (H&E) e examinadas as mudanças microscópicas. As alterações patológicas foram analisadas com base na composição, tamanho, morfologia e células de lesões granulomatosas, presença de fungos e infiltrado inflamatório. Análise morfológica foi realizada utilizando uma câmera digital Nikon 1200c DXM (x5 e ampliação x40) e software Nikon NIS Elements AR 2,30.
[060] Os resultados obtidos a partir de análises histopatológicas indicam um melhor desempenho de CP1 frente ao itraconazol, quando comparado o dano residual do tecido pulmonar dos camundongos tratados com CP1 e itraconazol. Este composto foi capaz de reduzir significativamente o dano tecidual causado pela infecção com P. brasiliensis (Figura 5). Os pulmões dos animais tratados com CP1 mostraram uma grande área de tecido pulmonar preservado, com focos de infiltrado inflamatório e algumas células fúngicas. Por outro lado, o itraconazol não foi igualmente eficaz na redução do dano tecidual causado pela infecção por P. brasiliensis. A Figura 5B, mostra o grupo tratado com itraconazol com grandes áreas contendo infiltrado inflamatório e pouco tecido pulmonar preservado. Enquanto que, os pulmões dos animais controle que foram infectados e tratados apenas com veículo mostraram vários danos. Animais controle apresentaram comprometimento total do tecido pulmonar, contendo múltiplos focos de inflamação granulomatosa epitelioide e fibrose pulmonar precoce, nos cortes corados com hematoxilina e eosina (Figura 5A). Inesperadamente, não houve alterações hepáticas em animais infectados tratados ou não, além disso, não foi possível recuperar CFU deste órgão, sugerindo que a infecção foi limitada ao pulmão devido ao pouco tempo de infecção usado neste modelo experimental da Paracoccidioidomicose.
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17/18 [061] EXEMPLO 5: AVALIAÇÃO DOS DANOS CELULARES NAS LEVEDURAS DE Paracoccidioides brasiliensis OCASIONADOS PELO COMPOSTO 1-cloro-6-nitro-2-({2-nitrofenil} sulfanil) -2,3,3a,4,5,9bhexahidro-1h-ciclopenta[c]quinolina-4-ácido carboxílico [062] Como mostrado na Figura 6 podemos observar as alterações celulares provocadas pelo tratamento das leveduras de P. brasiliensis com CP1. As células foram cultivadas na presença deste composto nas concentrações de 128 e 64 mg/L e observada em microscopia eletrônica de varredura (MEV). As amostras foram então observadas com Shimazu SS-550 Super varredura (Shimadzu, Tóquio, Japão) em ampliações de 1000x e 3000x.
[063] A análise aponta que CP1 foi capaz de causar alterações morfológicas nas células. As eletromicrografias revelaram deformações, incluindo depressão e superfície áspera, ocorrendo também aglomeração das leveduras (Figuras 5C-F). Estas alterações marcantes foram observadas em cerca de 80% da população após o tratamento. Nas células do controle não foram observadas nenhuma alteração, uma vez que a morfologia típica celular da levedura de P. brasiliensis foi preservada (Figura 6A-B).
[064] EXEMPLO 5: AVALIAÇÃO DO EFEITO DO COMPOSTO 1-cloro6-nitro-2-({2-nitrofenil} sulfanil) -2,3,3a,4,5,9b-hexahidro-1hciclopenta[c]quinolina-4-ácido carboxílico NO PROCESSO DE FAGOCITOSE DE LEVEDURAS DE Paracoccidioides brasiliensis [065] A fim de avaliar um possível mecanismo de ação da CP1, os ensaios de fagocitose foram realizados na presença do composto CP1 (128 mg/L). Os macrófagos peritoniais de camundongos foram retirados e 2x105 células foram cultivadas em meio RPMI suplementado com 10% de soro fetal bovino em placas de 24 poços. Após 24 horas estas culturas de macrófagos foram infectadas com leveduras de P. brasiliensis (Pb18) em concentração 5 vezes maior do que o número de macrófagos. Junto com o inóculo fúngico foi adicionado aos poços de tratamento a concentração de 128mg/L de CP1, e no controle positivo foi adicionado apenas meio de cultura e o veículo (PBS, 1% DMSO, 0,2% Pluronic). O índice de fagocitose (PI) foi determinado após
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18/18 tratamento com CP1 (128 mg/L) durante 24, 48 e 72 horas de incubação com 5% de CO2 e 95% de O2 a 37°C. Análise da fagocitose, ou seja, fungos internalizados foram visualizados e contados por microscopia óptica de contraste e PI foram calculados como a percentagem de células fagocíticas multiplicado pelo número médio de partículas internalizadas.
[066] Como é possível observar na Figura 7, nas primeiras 24 horas, este composto foi capaz de reduzir significativamente o índice de fagocitose (PI). No entanto, às 48 e 72 horas após o desafio, o CP1 para capaz de aumentar significativamente o PI, em comparação com o controle (1,5 e 1,6 vezes, respectivamente; p <0,05. A PI de controle foi constante durante todos os tempos avaliados, sem diferença significativa (p <0,05). Possivelmente as modificações que CP1 causou na morfologia do fungo, alterou a resposta fagocítica dos macrófagos nas primeiras 24h e após este período com a debilidade de P. brasiliensis exposto ao composto foi mais facilmente internalizado pelos macrófagos, aumentado assim, o índice de fagocitose.
[067] Dessa forma, pela baixa citotoxicidade, pela atividade antifúngica capaz de matar o fungo e reduzido dano tecidual em camundongos tratados, o composto 1-cloro-6-nitro-2-({2-nitrofenil}sulfanil)-2,3,3a, 4,5,9b-hexahidro-1 hciclopenta[c]quinolina-4-ácido carboxílico é bastante promissor para o desenvolvimento de novos medicamentos. Neste contexto a presente invenção apresenta uma alternativa viável de tratamento de infecções causadas por fungos do gênero Paracoccidioides spp.
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Claims (5)
- REIVINDICAÇÕES1. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender como ingrediente ativo o composto 1-cloro-6-nitro-2-({2-nitrofenil}sulfanil)2,3,3a,4,5,9b-hexahidro-1h-ciclopenta[c]quinolina-4-ácido carboxílico em uma de suas formas, sendo estas neutra, sal, hidrato ou solvato.
- 2. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por compreender ao menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
- 3. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com as Reivindicações 1 e 2, caracterizada por compreender uma das formas de apresentação selecionadas entre pós, granulados, comprimidos, drágeas, cápsulas, elixir, solução, suspensão, emulsões, xaropes injetáveis, tinturas, extratos, loções, cremes, pastas, géis, aerossóis, adesivos e outras formas para administração conhecidas ou que venham a ser conhecidas.
- 4. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com as Reivindicações 1 a 3, caracterizada por compreender entre 10% a 30% de ingrediente ativo.
- 5. USO DA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com as Reivindicações 1 a 4, e do composto 1-cloro-6-nitro-2-({2-nitrofenil}sulfanil)2,3,3a,4,5,9b-hexahidro-1h-ciclopenta[c]quinolina-4-ácido carboxílico em uma de suas formas, caracterizado por ser na preparação de um medicamento, aditivo, agente ou formulação a ser utilizada no tratamento de infecções causadas por micro-organismos do gênero Paracoccidioides spp.Petição 870160051322, de 14/09/2016, pág. 30/471/7DESENHOS
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