BR102018009020A2 - composição farmacêutica baseada em compostos 1,3,4-oxadiazólicos e seu uso na preparação de medicamentos para tratamento de infecções sistêmicas - Google Patents

Abstract

a presente invenção se enquadra no contexto da química farmacêutica e se refere a composições farmacêuticas e o seu uso no combate à infeções causadas por fungos. mais especificamente, a presente invenção trata-se de duas composições farmacêuticas com alvo de ação na enzima tioredoxina redutase de fungos que é útil no tratamento de infecções humanas causadas por microrganismos do gênero candida spp., cryptococcus spp. e paracoccidioides spp. as composições farmacêuticas compreendem os compostos 1,3,4-oxidiazólicos: 4-(n-benzil-n-metilsulfamoil)-n-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida e 4-(n-ciclohexil-n-etilsulfamoil)-n-(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida. a presente invenção descreve ainda o uso das composições, dos compostos 4-(n-benzil-n-metilsulfamoil)-n-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida e 4-(n-ciclohexil-n-etilsulfamoil)-n-(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida na formulação de um medicamento, aditivo, agente ou formulação para o tratamento de infecções fúngicas sistêmicas, como a candidíase, criptococose e paracoccidioidomicose.

Description

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA BASEADA EM COMPOSTOS 1,3,4OXADIAZÓLICOS E SEU USO NA PREPARAÇÃO DE MEDICAMENTOS PARA TRATAMENTO DE INFECÇÕES SISTÊMICAS [001] CAMPO DA INVENÇÃO [002] A presente invenção se enquadra no contexto da química farmacêutica e se refere genericamente a composições farmacêuticas e uso de compostos químicos no combate a infeções sistêmicas causadas por fungos, tendo como alvo de ação a inibição da enzima tioredoxina redutase.

[003] Mais especificamente, a presente invenção trata-se de composições farmacêuticas que compreendem os compostos 1,3,4oxadiazólicos: 4-(N-benzil-N-metHsulfamoH)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4oxadiazol-2-il)benzamida ou 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)1,3,4-oxadiazol-2-H)benzamida, que são úteis no tratamento de infecções causadas por fungos do gênero Candida spp., Cryptococcus spp. e Paracoccidioides spp. em humanos.

[004] Adicionalmente a presente invenção descreve o uso das composições, e dos compostos 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida e 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)N-(5-(furano-2-H)-1,3,4-oxadiazol-2-H)benzamida na formulação de um medicamento, aditivo, agente ou formulação útil também no tratamento de candidíase, criptococose e paracoccidioidomicose.

[005] DESCRIÇÃO DO ESTADO DA TÉCNICA [006] Os fungos estão distribuídos por toda a natureza, vivendo nos mais diversos locais, como: solo, pântanos, troncos, poeira, etc. São denominados de zoofílicos (preferência pelos animais), geofílicos (para o solo) e antropofílicos (homem). Eles compreendem um vasto campo de estudo, do setor industrial ao científico, passando por variados ramos de atividade com resultados benéficos e maléficos. Dentre a parte negativa dos fungos encontramos as infecções fúngicas que atingem os humanos, que são

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2/34 classificadas desde superficiais (ex. tinea), até disseminadas (ex. Candidíase sistêmica, Paracoccidioidomicose e Criptococcose) que podem ser fatais.

[007] As infecções hospitalares estão crescendo de forma significativa nos últimos anos, resultado dos avanços da medicina e o consequente prolongamento do tempo de vida de pacientes hospitalizados, porém esse aspecto levou ao aumento do número de pacientes imunologicamente vulneráveis a fungos e bactérias, elevando a frequência de infecções causadas por patógenos oportunistas.

[008] Os fungos do gênero Candida são os maiores responsáveis pelas infecções fúngicas em ambiente hospitalar e constituem causa relevante de infecções de corrente sanguínea. Entre as espécies mais invasivas, que são responsáveis por quadros graves de candidiases, incluem-se C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis e C. krusei. Esta enfermidade atinge principalmente pacientes transplantados, portadores de imunodeficiência, diabéticos, queimados, etc.

[009] A criptococose, doença causada por fungos do gênero Cryptococcus spp., é também uma infecção grave, principalmente para pacientes em estágio avançado da infecção pelo vírus da imunodeficiência adquirida (HIV), sendo a meningite a manifestação clínica mais comum. A patologia da criptococose está relacionada principalmente à inalação do fungo de fezes de pombos contaminadas, afetando primeiramente os pulmões, seguido do tropismo pelo epitélio cerebral.

[010] Dentre as infecções endêmicas na América Latina, a Paracococcidioidomicose (PCM) é a mais prevalente, causada por fungos do gênero Paracoccidioides spp. Os pacientes infectados são geralmente trabalhadores de zonas rurais que possuem grandes deficiências de acesso e suporte à rede de serviços de saúde, o que leva a um diagnóstico tardio e, consequentemente a um alto potencial incapacitante com quantidade significativa de mortes prematuras. Por ser uma doença negligenciada, não há registros precisos de sua incidência, nem mesmo um tratamento específico. Todos os órgãos são suscetíveis à doença que geralmente se apresenta como

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3/34 lesões pulmonares ou extra-pulmonares envolvendo mucosa oral, nariz e laringe.

[011] O tratamento antifúngico apresenta menos opções terapêuticas quando comparado à quimioterapia bacteriana. Limitações às atuais opções terapêuticas incluem, dentre outros: espectro de atividade limitado, falta de eficiência devido a crescente resistência, baixo perfil de segurança, interação múltipla com outras drogas, perfil farmacocinético inadequado e custo excessivo. O tratamento das infecções fúngicas invasivas (IFIs) e oportunistas permanece ainda insatisfatório com o uso da maior parte dos agentes antifúngicos existentes, tais como itraconazol e anfotericina B, e além disso os fungos oportunistas têm aumentado cada vez mais a sua resistência mesmo com o uso de novos agentes antifúngicos como, por exemplo, o voriconazol.

[012] A busca de novas alternativas antifúngicas baseada na estrutura e no mecanismo de ação tem se mostrado uma estratégia eficiente e menos dispendiosa. Os avanços nas técnicas computacionais e hardware tem habilitado métodos in siiico para acelerar a identificação e otimização destas possíveis novas drogas. A estratégia de varredura virtual (VS) de compostos ativos depositados em quimiotecas têm sido de grande interesse no aprimoramento dos processos de desenvolvimento de novas drogas, pois reduz o tempo e investimento inicial, permitindo a rápida varredura de grandes bibliotecas de pequenas moléculas (small molecules), para identificar as de melhores hits (moléculas bioativas), que podem ser compradas e/ou sintetizadas, e avaliadas experimentalmente. Estas metodologias in siiico tem contribuído com processo de desenvolvimento de fármacos utilizando como alvo, preferencialmente, enzimas que fazem parte apenas de rotas metabólicas dos patógenos, o que as confere a propriedade de toxicidade seletiva. A tioredoxina redutase (TRR1) é uma flavoenzima que está localizada no citoplasma e desempenha um papel crítico na manutenção do estado redox do citoplasma. Esta enzima faz parte de um complexo conhecido por sistema tioredoxina, no qual a tioredoxina (Trx) é reduzida pela flavoenzima, tioredoxina redutase, utilizando o NADPH e protegendo as células contra o estresse

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4/34 oxidativo. Duas classes de tioredoxina redutase foram caracterizadas. A isoforma de baixa massa molecular (~35 kDa), está presente em procariotos, plantas, alguns parasitas e fungos.

[013] Recentemente os inventores da presente solicitação de patente de invenção, por meio de modelagem molecular e varredura virtual foram selecionados onze compostos que interagem com a TRR1 do fungo Candida albicans e, apresentam atividade antifúngica contra fungos causadores de micoses invasivas e sistêmicas. Estes compostos foram selecionados utilizando como molde duas conformações da TRR1: flavina-oxidada e flavinareduzida, sendo que a última é forma ativa desta flavoenzima. Esta nova estratégia permitiu a obtenção de dois compostos com atividade antifúngica in vitro contra os três importantes fungos patogênicos (Candida, Cryptococcus e Paracoccidioides), mostrando-se promissores no desenvolvimento de novas drogas antifúngicas. Por meio dos experimentos a seguir foi possível a comprovação da atividade antifúngica in vitro e in vivo contra fungos do gênero Candida, Cryptococccus e Paracoccidioides dos potenciais compostos 1,3,4oxidiazólicos: 4-(N-benzH-N-metHsulfamoH)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4oxadiazol-2-il)benzamida e 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)1,3,4-oxadiazol-2-H)benzamida.

[014] Neste contexto a presente invenção apresenta uma alternativa viável de tratamento de infecções causadas por fungos do gênero Candida spp., Cryptococccus spp. e Paracoccidioides spp. por meio de composições farmacêuticas que tem como alvo de ação a inibição da enzima tioredoxina redutase, e que ao mesmo tempo que apresenta índices de resposta semelhantes a drogas de referência, apresenta baixos índices de citotoxicidade e eficiência no tratamento in vivo.

[015] SUMÁRIO DA INVENÇÃO [016] A presente invenção apresenta composições farmacêuticas para o tratamento de infecções causadas por microrganismos do gênero Candida spp., Cryptococccus spp. e Paracoccidioides spp. por meio de duas composições farmacêuticas que tem como alvo de ação a inibição da enzima

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5/34 tioredoxina redutase, compreendendo como ingrediente ativo o composto 4-(Nbenzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida ou o composto 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-

2-il)benzamida ou um sal ou um hidrato ou um solvato dos mesmos.

[017] Outro objeto de proteção da presente invenção refere-se ao uso dos compostos 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4oxadiazol-2-il)benzamida ou 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida, ou um sal ou um hidrato ou um solvato dos mesmos, útil na preparação de composições farmacêuticas para o tratamento de infecções causadas por microrganismos do gênero Candida spp., Cryptococccus spp. e Paracoccidioides spp.

[018] BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [019] A Figura 1 apresenta a Fórmula Estrutural do composto 4-(Nbenzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida.

[020] A Figura 2 apresenta a Fórmula Estrutural do composto 4-(Nciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida.

[021] Na Figura 3 são apresentados os resultados de CFM (cultivo das concentrações de CIM em meio de cultura Sabouraud Dextrose Agar (SDA) a 35°C, 24 horas) para o gênero Candida spp. Foi possível observar que a CFM de 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N- (5-(4-metoxibenzil) -1,3,4-oxadiazol-2H)benzamida para as cepas padrões das espécies de Candida avaliadas foram todas >256 pg/mL. A redução significativa no crescimento dos isolados apresentada no CFM sugerem que provavelmente o composto 4-(N-benzil-Nmetilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida possua comportamento fungistático para as espécies de Candida avaliadas.

[022] Na Figura 4 são apresentados os resultados de CFM (cultivo das concentrações de CIM em meio de cultura Sabouraud Dextrose Agar (SDA) a 35°C, 24 horas) para o gênero Candida spp. Foi possível observar que a CFM de 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2H)benzamida para as cepas padrões das espécies de Candida avaliadas foi de >256pg/mL para ATCC de C. krusei, C. glabrata e C. tropicalis, e 128pg/mL

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6/34 para ATCC de C. albicans e C. parapsilosis. A redução significativa no crescimento dos isolados apresentada no CFM sugerem que provavelmente ο co m posto 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N- (5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2H)benzamida possua comportamento fungistático para as espécies de Candida avaliadas.

[023] Na Figura 5 são apresentados os resultados de CFM (cultivo das concentrações de CIM em meio de cultura Sabouraud Dextrose Agar (SDA), a 35°C, 48 horas) para o gênero Cryptococcus spp. Foi possível observar que a CFM de 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2H)benzamida para a cepa padrão I NCOS (C. neoformans) foi de 32 pg/mL e a INCQS (C. gatti) foi de 64pg/mL. A redução significativa no crescimento dos isolados apresentada no CFM sugere que provavelmente o composto 4-(Nbenzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida possua comportamento fungicida para Cryptococcus spp.

[024] Na Figura 6 são apresentados os resultados de CFM (cultivo das concentrações de CIM em meio de cultura Sabouraud Dextrose Agar (SDA), a 35°C, 48 horas) para o gênero Cryptococcus spp. Foi possível observar que a CFM de 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)-1,3,4oxadiazol-2-H)benzamida para a cepa padrão INCQS (C. neoformans) foi de 64 pg/mL e a INCQS (C. gattí) foi de 128 pg/mL. A redução significativa no crescimento dos isolados apresentada no CFM sugere que provavelmente a molécula 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2H)benzamida possua comportamento fungicida para Cryptococcus spp.

[025] Na Figura 7 são apresentados os resultados de CFM (cultivo das concentrações de CIM em meio de cultura infusão de coração e cérebro (BHI) ágar, a 37°C) para o gênero Paracoccidioides spp. Foi possível observar que a CFM de 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2il)benzamida foi de 16pg/mL para 16,67% (1/6), 32pg/mL para 16,67% (1/6), 64pg/mL para 16,67% (1/6), 128pg/mL para 33,33% (2/6) e 256pg/mL para 16,67% (1/6) dos isolados clínicos de P. brasiliensis. E de 1 pg/mL para 33,33% (1/3), 8pg/mL para 33,33% (1/3) e 64pg/mL para 33,33% (1/3) dos isolados

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7/34 clínicos de P. lutzii. A redução significativa no crescimento dos isolados apresentada na CFM sugerem que provavelmente o composto 4-(N-benzil-Nmetilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida possua comportamento fungicida para Paracoccidioides spp.

[026] Na Figura 8 são apresentados os resultados de CFM (cultivo das concentrações de CIM em meio de cultura infusão de coração e cérebro (BHI) ágar, a 37°C) para o gênero Paracoccidioides spp. Foi possível observar que a CFM de 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2il)benzamida foi de 8pg/mL para 66,67% (4/6) e de 16pg/mL para 33,33% (2/6) dos isolados clínicos de P. brasiliensis. E de 8pg/mL para 66,67% (2/3) e de 16pg/mL para 33,33% (1/3) dos isolados clínicos de P. lutzii. A redução significativa no crescimento dos isolados apresentada na CFM sugerem que provavelmente o composto 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)-

1.3.4- oxadiazol-2-H)benzamida possua comportamento fungicida para Paracoccidioides spp.

[027] A Figura 9 mostra os resultados da avaliação in vitro da citotoxicidade do composto 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-

1.3.4- oxadiazol-2-H)benzamida. Este experimento foi realizado em três linhagens de células por um ensaio colorimétrico nos tempos de 24 e 48 horas, avaliando as concentrações de 0,5 a 256 pg/mL. Houve redução significativa (p<0,05) da viabilidade celular apenas nas concentrações mais altas testadas, de 256 pg/mL (24 horas), 128 e 256 pg/mL (48 horas) para HeLa, e 256 pg/mL no tempo de 48 horas para HUVEC. O gráfico é representado por três experimentos independentes. As barras indicam o desvio padrão.

[028] A Figura 10 mostra os resultados da avaliação in vitro da citotoxicidade do composto 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)1,3,4-oxadiazol-2-H)benzamida. Este experimento foi realizado em três linhagens de células por um ensaio colorimétrico nos tempos de 24 e 48 horas, avaliando as concentrações de 0,5 a 256 pg/mL. Houve redução significativa (p<0,05) da viabilidade celular apenas nas concentrações mais altas testadas, para células da linhagem HeLa: nas concentrações 128 e 256 pg/mL (24 e 48

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8/34 horas), para linhagem de células Vero: na concentração de 256 pg/mL (24 e 48 horas) e para linhagem celular HUVEC: nas concentrações 128 e 256 pg/mL (24 e 48 horas). O gráfico é representado por três experimentos independentes. As barras indicam o desvio padrão.

[029] A Figura 11 mostra os resultados da avaliação in vitro da citotoxicidade do diluente dos compostos, o Dimetilsulfóxido (DMSO). Este experimento foi realizado em três linhagens de células (HeLa, HUVEC e Vero) por um ensaio colorimétrico nos tempos de 24 e 48 horas. O diluente (DMSO) não apresentou toxicidade significativa em nenhum dos parâmetros avaliados. O gráfico é representado por três experimentos independentes. As barras indicam o desvio padrão.

[030] As Figuras 12 e 13 mostram os resultados da avaliação in vivo da citotoxicidade do composto 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida. Foram utilizados camundongos machos da linhagem BALB/c divididos em quatro grupos: sem tratamento, tratamento com o diluente do composto (PBS, DMSO e Pluronic F-127 ®) e tratados em dose única por via intraperitoneal (50mg/Kg) e endovenosa (Composto - 12,5mg/kg). As alterações comportamentais foram observadas até 30 minutos em todos os grupos, sendo mais evidentes contorções abdominais e comprometimento motor no tratamento intraperitoneal e maior sedação por via endovenosa. Não houve alteração na evolução ponderai do peso dos animais, no perfil hematológico e na análise macroscópica dos órgãos. A administração por via endovenosa apresentou um melhor perfil para 4-(Nbenzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida.

[031] As Figuras 14 e 15 mostram os resultados da avaliação in vivo da citotoxicidade do composto 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)1,3,4-oxadiazol-2-H)benzamida. Foram utilizados camundongos machos da linhagem BALB/c divididos em quatro grupos: sem tratamento, tratamento com o diluente do composto (PBS, DMSO e Pluronic F-127 ®) e tratados em dose única por via intraperitoneal e endovenosa de 50mg/Kg. As alterações comportamentais foram observadas até 30 minutos em todos os grupos, sendo

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9/34 mais evidentes contorções abdominais e comprometimento motor no tratamento intraperitoneal e maior sedação por via endovenosa. Não houve alteração na evolução ponderai do peso dos animais, no perfil hematológico e na análise macroscópica dos órgãos.

[032] A Figura 16 mostra os resultados da atividade antifúngica do composto 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2H)benzamida e do antifúngico comercial Fluconazol, no modelo experimental da Candidíase Sistêmica em camundongos. Figura 16A e 16B: Candidemia Experimental por Candida albicans. (A) Avaliação da atividade antifúngica in vivo do 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2H)benzamida de acordo com o órgão alvo rim. (B) Avaliação da atividade antifúngica in vivo do 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4oxadiazol-2-H)benzamida de acordo com o órgão alvo baço. Em ambos (A) e (B), Unidades Formadoras de Colônia (Log-ιο UFC). Controle: animais tratados com diluente do composto. Fluconazol: animais tratados com Fluconazol 5mg/kg. Composto: animais tratados com o composto 4-(N-benzil-Nmetilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida, 5mg/kg. Todos tratamentos foram realizados durante 5 dias. Os experimentos foram realizados em triplicata, e as barras indicam o desvio padrão. *p<0.05, redução estatisticamente significante quando comparado com o controle. Figura 16C: Candidemia Experimental por Candida glabrata. Avaliação da atividade antifúngica in vivo do 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4oxadiazol-2-H)benzamida de acordo com o órgão alvo rim. Unidades Formadoras de Colônia (Logw UFC). Controle: animais tratados com diluente do composto. Fluconazol: animais tratados com Fluconazol 5mg/kg. Composto: animais tratados com o composto 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4metoxibenzil)-1 ’SA-oxadiazol^-HJbenzamida, 25mg/kg. Todos tratamentos foram realizados durante 5 dias. Os experimentos foram realizados em triplicata, e as barras indicam o desvio padrão. *p<0.05, redução estatisticamente significante quando comparado com o controle.

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10/34 [033] A Figura 17 mostra os resultados da atividade antifúngica do co m posto 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N- (5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2H)benzamida e do antifúngico comercial Fluconazol, no modelo experimental da Candidíase Sistêmica em camundongos. Figura 17A e 17B: Candidemia Experimental por Candida albicans. (A) Avaliação da atividade antifúngica in vivo do 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2H)benzamida de acordo com o órgão alvo rim. (B) Avaliação da atividade antifúngica in vivo do 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)-1,3,4oxadiazol-2-H)benzamida de acordo com o órgão alvo baço. Em ambos (A) e (B), Unidades Formadoras de Colônia (Log-ιο UFC). Controle: animais tratados com diluente do composto. Fluconazol: animais tratados com Fluconazol 5mg/kg. Composto: animais tratados com o composto 4-(N-ciclohexil-Netilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2-H)benzamida_! 5mg/kg. Todos tratamentos foram realizados durante 5 dias. Os experimentos foram realizados em triplicata, e as barras indicam o desvio padrão. *p<0.05, redução estatisticamente significante quando comparado com o controle. Figura 17C: Candidemia Experimental por Candida krusei. Avaliação da atividade antifúngica in vivo do 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)-1,3,4oxadiazol-2-H)benzamida de acordo com o órgão alvo rim. Unidades Formadoras de Colônia (Logw UFC). Controle: animais tratados com diluente do composto. Fluconazol: animais tratados com Fluconazol 5mg/kg. Composto: animais tratados com o composto 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano2-H)-1,3,4-oxadiazol-2-H)benzamida_! 5mg/kg. Todos tratamentos foram realizados durante 5 dias. Os experimentos foram realizados em triplicata, e as barras indicam o desvio padrão. *p<0.05, redução estatisticamente significante quando comparado com o controle.

[034] A Figura 18 mostra os resultados da atividade antifúngica do composto 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2H)benzamida e do antifúngico comercial Itraconazol, no modelo experimental de Paracoccidioidomicose em camundongos. Unidades Formadoras de Colônia (Log-ιο UFC) do Pulmão infectado com Paracoccidioides brasiliensis. Controle:

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11/34 animais tratados com diluente do composto. Itraconazol: animais tratados com Itraconazol 5mg/kg. Composto: animais tratados com o composto 4-(N-benzilN-metilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida, 5mg/kg. Todos tratamentos foram realizados durante 14 dias. Os experimentos foram realizados em triplicata, e as barras indicam o desvio padrão. *p<0.05, redução estatisticamente significante quando comparado com o controle.

[035] A Figura 19 mostra os resultados da atividade antifúngica do co m posto 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N- (5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2il)benzamida e do antifúngico comercial Anfotericina B, no modelo experimental de Criptococose em camundongos. Unidades Formadoras de Colônia (Log-io UFC) do Cérebro e Baço infectado com Cryptococcus neoformans. Controle: animais tratados com diluente do composto. Anfo B: animais tratados com Anfotericina B 1mg/kg. Composto: animais tratados com o composto 4-(Nciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida, 5mg/kg. Todos tratamentos foram realizados durante 5 dias. Os experimentos foram realizados em triplicata, e as barras indicam o desvio padrão. *p<0.05, redução estatisticamente significante quando comparado com o controle.

[036] DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [037] A presente invenção se refere a duas composições farmacêuticas para o tratamento de infecções causadas por microrganismos do gênero Candida spp., Cryptococcus spp. e Paracoccidioides spp., com alvo de ação a inibição da enzima tioredoxina redutase, tendo como ingrediente ativo o composto 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2il)benzamida ou o composto 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)1,3,4-oxadiazol-2-H)benzamida, ou um sal ou um hidrato ou um solvato dos mesmos.

[038] Os compostos 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida e 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)N-(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida, representado pelas fórmulas estruturais Figura 1 e 2, respectivamente, possuem importantes grupos funcionais com propriedades biológicas em sua cadeia.

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12/34 [039] Adicionalmente, as referidas composições farmacêuticas da invenção compreendem pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável. Como excipiente farmaceuticamente aceitável entende-se qualquer excipiente que não interfira na eficácia da atividade do ingrediente ativo e que não seja tóxico para o hospedeiro no qual é administrado.

[040] Para uso humano, uma composição farmacêutica é geralmente administrada em conjunto com um excipiente farmaceuticamente aceitável, selecionado de acordo com a rota de administração pretendida e de acordo com a prática farmacêutica estabelecida.

[041] E m uma concretização preferencial da invenção, as referidas composições farmacêuticas objetos de proteção se apresentam nas formas farmacêuticas selecionadas entre pós, granulados, comprimidos, drágeas, cápsulas, soluções, xaropes, elixires, suspensões, emulsões, injetáveis, tinturas, extratos, pomadas, cremes, pastas, loções, géis, aerossóis, adesivos e outras formas para administração conhecidas.

[042] Diversos excipientes podem ser utilizados nas composições farmacêuticas da presente invenção. Entre os excipientes passíveis de serem utilizados para formas farmacêuticas líquidas (soluções, suspensões, elixir, loções, entre outros), pode-se citar, entre outros, veículos, agentes de aumento de viscosidade, agentes de tonicidade, agentes de suspensão, agentes acidificantes, agentes alcalinizantes, conservantes, tampões e agentes edulcorantes.

[043] Entre os excipientes passíveis de serem utilizados para formas farmacêuticas sólidas (pós, granulados, comprimidos, cápsulas, entre outros), pode-se citar, entre outros, diluentes, aglutinantes, desagregantes/ desintegrantes, lubrificantes, agentes de revestimento, absorventes e tensoativos.

[044] Entre os excipientes passíveis de serem utilizados para formas farmacêuticas semissólidas (cremes, géis, pomadas, loções, entre outros), pode-se citar, entre outros, veículos, espessantes, agentes umectantes, agentes emolientes, agentes emulsificantes, agentes antioxidantes, parabenos,

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13/34 conservantes, agentes levigantes ou pulverizantes, agentes sequestrantes ou quelantes, adsorventes, tampões e agentes edulcorantes.

[045] A presente invenção também se refere ao uso dos compostos 4(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N- (5-(4-metoxibenzil) -1,3,4-oxadiazol-2il)benzamida e 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-

2-H)benzamida, em uma de suas formas, selecionadas entre neutra, sal, hidrato ou solvato na preparação de um medicamento, aditivo, agente ou formulação útil no tratamento de infecções causadas por microrganismos do gênero Candida spp., Cryptococcus spp. e Paracoccidioides spp., com alvo de ação a inibição da enzima tioredoxina redutase.

[046] Tais compostos podem constituir uma alternativa na substituição a ingredientes ativos hoje utilizados e que possuem efeitos secundários que limitam sua utilização. Os resultados destes ensaios comprovaram relevante potencial fungitóxico e específico contra espécies de fungos do gênero Candida spp., Cryptococcus spp. e Paracoccidioides spp.

[047] EXEMPLOS [048] Os exemplos abaixo são apresentados a fim de ilustrar mais detalhadamente determinadas modalidades da invenção. É importante destacar que a presente invenção não se limita aos exemplos citados, podendo ser utilizada em todas as aplicações descritas ou em quaisquer outras variações equivalentes.

[049] Cabe salientar que os exemplos relacionados à atividade dos compostos 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol2-il)benzamida e 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)-1,3,4oxadiazol-2-H)benzamida, não ficam restritos a uma de suas formas, seja neutra, sal, hidrato ou solvato.

[050] EXEMPLO 1: EXPERIMENTAÇÃO IN SILICO DA SELEÇÃO DO COMPOSTO E A INTERAÇÃO COM A ENZIMA TIOREDOXINA REDUTASE [051] Os compostos 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida e 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)

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N-(5-(furano-2-H)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida foram selecionados a partir de métodos in silico. Na ausência de estruturas 3D resolvidas experimentalmente, métodos computacionais são utilizados para predizer modelos tridimensionais de proteínas e fornecer informações sobre suas estruturas. Três moldes foram selecionados para modelagem por homologia da proteína tioredoxina redutase (TRR1): um de Saccharomyces cerevisiae na conformação oxidada e dois de Escherichia coll na conformação reduzida. Na segunda conformação reduzida, a estrutura 3D da tioredoxina redutase está complexada a tioredoxina, análogo de NADP+ e AADP+. Desta forma, seis modelos de TRR1 foram construídos: três para Candida albicans e três para Cryptococcus neoformans. Adicionalmente, foram obtidos 2 modelos da TRR1 de Paracoccidiodes lutzii, baseados nos moldes das conformações reduzidas e reduzida complexada. Desta forma, oito modelos foram submetidos à simulações de dinâmica molecular (DM). As análises dos valores de RMSd ao longo das simulações de DM mostram-se estáveis. As estruturas secundárias foram preservadas ao longo da simulação, sendo que a conformação oxidada da TRR1 sempre se mostrou mais estável que a conformação reduzida e complexada da TRR1, independente do patógeno. As análises de agrupamento das principais famílias de conformações, para cada um dos modelos, foram realizadas e as frames centrais de cada família de conformação selecionadas para a ancoragem molecular (docking). Do banco de dados de compostos químicos da Life Chemicals foram pré-selecionadas 3.000 moléculas com propriedades drug-like e diversidade química. A este número foram adicionadas 1080 moléculas, que são análogas a 3 moléculas deste banco com atividade antifúngica previamente avaliadas. Após a seleção dos melhores hits, onze moléculas selecionadas foram adquiridas e testadas nos ensaios in vitro e in vivo quanto a sua atividade antifúngica. Os compostos 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida e 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)N-(5-(furano-2-H)-1,3,4-oxadiazol-2-H)benzamida foram dois dos compostos que apresentaram melhores atividades, portanto é o alvo deste pedido de patente.

[052] EXEMPLO 2: TESTES DE SUSCETIBILIDADE DO FUNGO DO

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GÊNERO CANDIDA SPP. AOS COMPOSTOS 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)N-(5-(4-metoxibenzil)- 1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida e 4-(N-ciclohexil-Netilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida E AO ANTIFÚNGICO FLUCONAZOL [053] Para avaliar o perfil de suscetibilidade dos isolados clínicos de Candida spp. aos compostos 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida, 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N(5-(furano-2-H)-1,3,4-oxadiazol-2-H)benzamida e ao fluconazol, foi realizado o teste de microdiluição em caldo utilizando método proposto pelo CLSI (Clinicai and Laboratory Standards Institute, 2010), de acordo com o protocolo M27-A3 com modificações. Foram determinadas a concentração mínima inibitória (CIM) e a concentração mínima fungicida (CFM) para os patógenos utilizados.

[054] Os compostos 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida, 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida e o fluconazol (Sigma-Aldrich) foram testados. As drogas foram diluídas em meio RPMI [RPMI-1640 sem bicarbonato, com L-glutamina, suplementado com 2 % de glicose e tamponado (pH 7.0) com 0,165 mol/L de ácido morfolinopropanosulfonico (MOPS) (SigmaAldrich)]. O Dimetilsulfóxido (DMSO) e o Pluronic F-127 (Sigma-Aldrich) foram usados como diluente para os compostos 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida e 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)N-(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida. Os dois compostos foram preparados por diluição seriada em concentrações de 0.5 a 256 pg/mL, diluída em DMSO a 1% e 0,2% de Pluronic F-127 e as concentrações do fluconazol variaram de 0,125 a 64 pg/mL. Os fungos foram incubados na ausência e presença de DMSO 1 % (vol/vol) e Pluronic F-127 a 0,2% (vol/vol) para confirmar que a exposição a esse solvente não influencia no crescimento dos isolados testados.

[055] Os testes de suscetibilidade in vitro foram realizados em 79 isolados de Candida spp. entre cepas padrão e clínicas (C. albicans (16), C. glabrata (16), C. parapsilosis (15), C. tropicalis (13) e C. krusei (19)), as

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16/34 amostras fazem parte da coleção do Laboratório de Micologia Médica da Universidade Estadual de Maringá. Os fungos foram mantidos por subcultura em meio de cultura semi-sólido Ágar Sabouraud (SDA) a 35°C e os fungos foram utilizados com 24 horas de crescimento.

[056] Os inóculos das leveduras foram preparados em tampão salina estéril (0,85%) e RPMI, na concentração final de 2 a 3x10³ células/mL. Os testes foram realizados em microplacas estéreis contendo 96 poços. Como controle foi utilizado RPMI sem inóculo (negativo).

[057] A cepa de C. parapsilosis (ATCC 22019) foi utilizada como levedura referência para todos os testes. O tempo de incubação foi de 24 horas, a 35^SC. Os dados foram apresentados como a concentração inibitória mínima (CIM), que corresponde a leitura em leitor de ELISA (405 nm), à concentração do composto capaz de inibir 50% do crescimento fúngico. Para determinar a concentração fungicida mínima (CFM), foram semeados 5μΙ de cada poço da placa do CIM, em meio SDA. As placas foram incubadas a 35°C por 24 horas. A menor concentração do composto na qual não foi possível observar crescimento foi determinada como a concentração CFM. A tabela 1 mostra os resultados da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) do composto 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4oxadiazol-2-il)benzamida atuando diretamente sobre as leveduras de diferentes isolados de Candida spp. (79 amostras entre isolados clínicos e cepa padrão).

Amostras
25« 128	S4 32	ts	8 4	2 1 S,5
	_______		______	_____	_______
C. gtebrsia (16)	0 0	0 2	s	7 2	o c< δ
Ç. parapsí/ító ís (15)	δ 1	12 1	'J	8 0	e s ο
CL tropícs/às (13)	δ 0	2 2	6	2 1	0 0 δ
C. tosei' (1$)	ο δ	1 IS	3	δ δ	δ δ δ

Tabela 1. Concentração inibitória mínima (CIM) do composto 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida frente a isolados clínicos e cepa padrão de Candida spp., distribuição por espécie quanto aos resultados da CIM.

[058] A tabela 2 mostra os resultados da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) do composto 4-(N-ciclohexil-NPetição 870180036380, de 03/05/2018, pág. 34/74

17/34 etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida atuando diretamente sobre as leveduras de diferentes isolados de Candida spp. (79 amostras entre isolados clínicos e cepa padrão).

Amostras	Concentrações em jjg/mL de 4-(H-eielot>axíÍ-ll-sSlsuifam{>il)-H^S^furane-2-il}-4,3,4-
256	128	t»tBcBazo?-2<í7)&esnzamítfa	1 0,5
84	32	16	8	4	2
C. a&ícans {16)	0	Ü	2	12	2	0	0	S	0 0
	0	0	0	0	12	4	0	0	0 0
C. parapsifosis (15)	Ó	4	5	5	0	1	0	G	0 0
C. tropicatis (13}	0	0	7	5	1	0	8	0	0 0
C. fcmseí (19)	5	0	δ	13	3	0	0	δ	0 δ

Tabela 2. Concentração inibitória mínima (CIM) do composto 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida frente a isolados clínicos e cepa padrão de Candida spp., distribuição por espécie quanto aos resultados da CIM.

[059] A CIM do composto 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida foi de 8 pg/mL para 12,5% (2/16), 16 pg/mL para 31,25 % (5/16), 32 pg/mL para 43,75% (7/16) e 64 pg/mL para 12,5% (2/16) dos isolados clínicos e cepa padrão de C. albicans. De 4 pg/mL para 12,5% (2/16), 8 pg/mL para 43,75% (7/16), 16 pg/mL para 31,25% (5/16) e 32 pg/mL para 12,5% (2/16) dos isolados clínicos e cepa padrão de C. glabrata. De 16 pg/mL para 6,67% (1/15), 32 pg/mL para 6,67% (1/15), 64 pg/mL para 80% (12/15) e 128 pg/mL para 6,67% (1/15) dos isolados clínicos e cepa padrão de C. parapsilosis. De 4 pg/mL para 7,70% (1/13), 8 pg/mL para 15,38% (2/13), 16 pg/mL para 46,16% (6/13), 32 pg/mL para 15,38% (2/13) e 64 pg/mL para 15,38% (2/13) dos isolados clínicos e cepa padrão de C. tropicalis. E foi de 16 pg/mL para 15,79% (3/19), 32 pg/mL para 78,95%(15/19) e 64 pg/mL para 5,26% (1/19) dos isolados clínicos e cepa padrão de C.krusei.

[060] A CIM do composto 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano2-il)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida foi de 16 pg/mL para 12,5% (2/16),

32pg/mL para 75% (12/16) e 64 pg/mL para 12,5% (2/16) dos isolados clínicos e cepa padrão de C. albicans. De 8 pg/mL para 25% (4/16) e 16 pg/mL para 75% (12/16) dos isolados clínicos e cepa padrão de C. glabrata. De 8 pg/mL para 6,67% (1/15), 32 pg/mL para 33,33% (5/15), 64 pg/mL para 33,33% (5/15) e 128pg/mL para 26,67% (4/15) dos isolados clínicos e cepa padrão de C.

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18/34 parapsilosis. De 16 pg/mL para 7,69% (1/13), 32 pg/mL para 38,46% (5/13) e 64 pg/mL para 53,85% (7/13) dos isolados clínicos e cepa padrão de C. tropicalis. E foi de 32 pg/mL para 68,42% (13/19) e 64 pg/mL para 31,58% (6/19) dos isolados clínicos e cepa padrão de C. krusei.

[061] Para o Fluconazol a maioria dos isolados testados foram inibidos na concentração de 0,125 pg/mL para C. albicans, 8 pg/mL para C. glabrata, 0,5 pg/mL para C. parapsilosis e C. tropicalis e 16 pg/mL para C. krusei. A partir da CIM foi possível determinar a concentração fungicida mínima (CFM) (Figuras 3 e 4), revelando que os compostos 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida e 4-(N-ciclohexil-Netilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2-H)benzamida apresentam perfil fungistático (que não mata o fungo, inibe o crescimento) para Candida spp. Esse perfil é interessante uma vez que, o fluconazol que é um dos antifúngicos convencionais mais utilizados para tratamento da Candidíase também é um agente fungistático. A partir desses resultados, foi possível comparar a eficiência antifúngica in vitro entre o composto testado e a droga de referência fluconazol, verificando que, apesar da droga de referência apresentar os menores valores de CIM, ela apresenta perfil de resistência conhecido para tratamento de C. glabrata e C. krusei, portanto os compostos 4-(N-benzil-Nmetilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida e 4-(Nciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida apresentam eficiência antifúngica relevante em Candida spp, e podem ser promissores para o desenvolvimento de uma nova droga antifúngica.

[062] EXEMPLO 3: TESTES DE SUSCETIBILIDADE DO FUNGO DO GÊNERO CRYPTOCOCCCUS SPP. AOS COMPOSTOS 4-(N-benzil-Nmetilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)- 1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida e 4-(Nciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida E AO ANTIFÚNGICO ANFOTERICINA B.

[063] Para avaliar o perfil de suscetibilidade dos isolados clínicos de Cryptococcus spp. aos compostos 4-(N-benzll-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida, 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N

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19/34 (5-(furano-2-H)-1_!3,4-oxadiazol-2-H)benzamida e a anfotericina B, foi realizado o teste de microdiluição em caldo utilizando método proposto pelo CLSI (Clinicai and Laboratory Standards Institute, 2010), de acordo com o protocolo M27-A3 com modificações. Foram determinadas a concentração mínima inibitória (CIM) e a concentração mínima fungicida (CFM) para os patógenos utilizados.

[064] Os compostos 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida, 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N(5-(furano-2-H)-1,3,4-oxadiazol-2-H)benzamida e anfotericina B (Sigma-Aldrich) foram testados. As drogas foram diluídas em meio RPMI [RPMI-1640 sem bicarbonato, com L-glutamina, suplementado com 2 % de glicose e tamponado (pH 7.0) com 0,165 mol/L de ácido morfolinopropanosulfonico (MOPS) (SigmaAldrich)]. O Dimetilsulfóxido (DMSO) e o Pluronic F-127 (Sigma-Aldrich) foram usados como diluente para os compostos 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida e 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)N-(5-(furano-2-H)-1,3,4-oxadiazol-2-H)benzamida. Os dois compostos foram preparados por diluição seriada em concentrações de 1 a 512 pg/mL, diluída em DMSO a 1% e 0,2% de Pluronic F-127, e as concentrações de anfotericina B variaram de 0,03 a 16 pg/mL. Os fungos foram incubados na ausência e presença de DMSO 1 % (vol/vol) e Pluronic F-127 a 0,2% (vol/vol) para confirmar que a exposição a esse solvente não influencia no crescimento dos isolados testados.

[065] Os testes de suscetibilidade in vitro foram realizados em 16 isolados do fungo Cryptococcus spp. entre cepas padrão e clínicas (sendo 13 isolados clínicos da espécies C. neoformans e três isolados clínicos da espécie C. gatti) as amostras fazem parte da coleção do Laboratório de Micologia Médica da Universidade Estadual de Maringá. Os fungos foram mantidos por subcultura em meio de cultura semi-sólido Ágar Sabouraud (SDA) a 25°C e os fungos foram utilizados com 48 horas de crescimento.

[066] Os inóculos das leveduras foram preparados em tampão salina estéril (0,85%) e RPMI, na concentração final de 2 a 3x10³ células/mL. Os

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20/34 testes foram realizados em microplacas estéreis contendo 96 poços. Como controle foi utilizado RPMI sem inóculo (negativo).

[067] A cepa de C. parapsilosis (ATCC 22019) foi utilizada como levedura referência para todos os testes. O tempo de incubação foi de 24 horas, a 35^SC. Os dados foram apresentados como a concentração inibitória mínima (CIM), que corresponde a leitura em leitor de ELISA (405 nm), à concentração do composto capaz de inibir 100% do crescimento fúngico. Para determinar a concentração fungicida mínima (CFM), foram semeados 5ul de cada poço da placa do CIM, em meio SDA. As placas foram incubadas a 35°C por 48 horas. A menor concentração do composto na qual não foi possível observar crescimento foi determinada como a concentração CFM. A tabela 3 mostra os resultados da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) do composto 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4oxadiazol-2-il)benzamida atuando diretamente sobre as leveduras de diferentes isolados de Cryptococcus spp. (16 amostras entre isolados clínicos e

cepa padrão).
Amostras	Concentrações em yg/mL do 4-(N'hen2Íf-N-mefffSÉ/ífômoí/)-N-f5'(4-metojríàen£í(ji-í,3,4oxadiazoi-i-itybenzamida
	512	255	128	54 32	16	8	4	2	1
C. neofbrmans (13)	1	0	0	0 11	1	0	0	0	0
C. gatti (3)	0	0	0	0 3	O	Q	0	0	0

Tabela 3. Concentração Inibitória Mínima (CIM) do composto 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida frente a isolados clínicos e cepa padrão de Cryptococcus spp., distribuição por espécie quanto aos resultados da CIM.

[068] A tabela 4 mostra os resultados da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) do composto 4-(N-ciclohexil-Netilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida atuando diretamente sobre as leveduras de diferentes isolados de Cryptococcus spp. (16 amostras entre isolados clínicos e cepa padrão).

Amostras	Concentrações em pgftnL do 4-(N-c/cío/ie5rW-K-efírsuffamoífJ-N-f5-(íurarto-2-/Ç-T,3,4-
512 256	oxadiazoi~2-íf)benzamida	2 1
128	64 32	16	8	4
C. neoformans (13)	ΐ 0	10	2 0	o-	Õ	0	Õ Õ
C. gatti (3)	0 Ü	3	0 0	0	0	0	0 0

Tabela 4. Concentração Inibitória Mínima (CIM) do composto 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-NPetição 870180036380, de 03/05/2018, pág. 38/74

21/34 (5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida frente a isolados clínicos e cepa padrão de Cryptococcus spp., distribuição por espécie quanto aos resultados da CIM.

[069] A CIM do 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida foi de 16pg/mL para 7,69% (1/13), 32pg/mL para 84,62% (11/13) e 512pg/mL para 7,69% (1/13) dos isolados clínicos de C. neoformans e cepa padrão. E foi de 32pg/mL para 100% (3/3) dos isolados clínicos de C. gatti e cepa padrão.

[070] A CIM do 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)-1,3,4oxadiazol-2-il)benzamida foi de 64pg/mL para 15,39% (2/13), 128pg/mL para 76,92% (10/13) e 512pg/mL para 7,69% (1/13) dos isolados clínicos de C. neoformans e cepa padrão. E foi de 128pg/mL para 100% (3/3) dos isolados clínicos de C. gatti e cepa padrão.

[071] Para a anfotericina B a maioria dos isolados testados foram inibidos na concentração de 0,25 pg/mL.

[072] A partir da CIM foi possível determinar a concentração fungicida mínima (CFM) (Figuras 5 e 6), para a cepa padrão de C. neoformans foi de 32 pg/mL e de C. gatti foi de 64pg/mL, revelando que os dois compostos, 4-(Nbenzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida e 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida, com um perfil fungicida para Cryptococcus spp. A partir desses resultados, foi possível comparar a eficiência antifúngica in vitro entre o composto testado e a droga de referência anfotericina B, verificando que, apesar da droga de referência apresentar os menores valores de CIM e possuir também perfil fungicida, seu uso é limitado devido aos inúmeros efeitos colaterais e sua administração via endovenosa, que pode só ser realizada em ambiente hospitalar, concluindo que os compostos 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida e 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)N-(5-(furano-2-H)-1,3,4-oxadiazol-2-H)benzamida apresentam eficiência antifúngica fungicida relevante em Cryptococcus spp e podem ser promissores no desenvolvimento de uma nova droga antifúngica.

[073] EXEMPLO 4: TESTES DE SUSCETIBILIDADE DO FUNGO DO

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GÊNERO PARACOCCIDIOIDES SPP. AO COMPOSTO 4-(N-benzil-Nmetilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)- 1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida e 4-(Nciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida E AO ANTIFÚNGICO ITRACONAZOL.

[074] Para avaliar o perfil de suscetibilidade dos isolados clínicos de Paracoccidioides spp. aos compostos 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida e 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)N-(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida e ao itraconazol, foi realizado o teste de microdiluição em caldo utilizando método proposto pelo CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, 2010), de acordo com o protocolo M27-A3 com modificações. Foram determinadas a concentração mínima inibitória (CIM) e a concentração mínima fungicida (CFM) para os patógenos utilizados.

[075] Os compostos 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida, 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida e o itraconazol (Sigma-Aldrich) foram testados. As drogas foram diluídas em meio RPMI [RPMI-1640 sem bicarbonato, com L-glutamina, suplementado com 2 % de glicose e tamponado (pH 7.0) com 0,165 mol/L de ácido morfolinopropanosulfonico (MOPS) (SigmaAldrich)]. O Dimetilsulfóxido (DMSO) e o Pluronic F-127 (Sigma-Aldrich) foram usados como diluente para os compostos 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida e 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)N-(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida. Os dois compostos foram preparados por diluição seriada em concentrações de 1 a 512 pg/mL, diluída em DMSO a 1% e 0,2% de Pluronic F-127, e as concentrações de itraconazol variaram de 0,03 a 16 pg/mL. Os fungos foram incubados na ausência e presença de DMSO 1 % (vol/vol) e Pluronic F-127 a 0,2% (vol/vol) para confirmar que a exposição a esse solvente não influencia no crescimento dos isolados testados.

[076] Os testes de suscetibilidade in vitro foram realizados em 6 isolados de P. brasiliensis (Aírton, João, Orlando, Luiz, Apdo e PB18) e três

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23/34 isolados de P. lutzii (Pb01,8334 e ROSC), as amostras fazem parte da coleção de Micologia Médica Laboratório da Universidade Estadual de Maringá. Os fungos foram mantidos por subcultura semanal em meio de cultura semi-sólido Fava Neto contendo 4% de glicose a 35°C e os fungos foram utilizados entre o quinto e o sétimo dia de crescimento em meio de cultura.

[077] Os inóculos das leveduras foram preparados em tampão salina estéril (0,85%), na concentração final de 0,5 a 2,5x10⁵ células/mL. Os testes foram realizados em microplacas estéreis contendo 96 poços. Como controle foi utilizado RPMI sem inóculo (negativo).

[078] A cepa de C. parapsilosis (ATCC 22019) foi utilizada como levedura referência para todos os testes. O tempo de incubação foi de 5 dias, a 37^SC. Os dados foram apresentados como a concentração inibitória mínima (CIM), que corresponde à concentração do composto capaz de inibir 80% do crescimento. Para determinar a concentração fungicida mínima (CFM), foram plaqueados 5ul de cada poço da placa do CIM, que apresentaram inibição do crescimento, em meio BHI ágar. As placas foram incubadas a 37°C durante 7 dias. A menor concentração do composto na qual não foi possível observar crescimento foi determinada como a concentração CFM. A tabela 5 mostra os resultados da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) do composto 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2H)benzamida atuando diretamente sobre as leveduras de diferentes isolados de Paracoccidioides spp. (9 amostras).

Amostras	Concentrações em fig/mL da oxatfís20Á2>a)bensarwída
512 256	12B	64 32 16 8	4	2 1
P. brasílíensis >8·	o i	2	í 0	G	G	0
R íutüll (3)	δ 0	0	toot	0	0

Tabela 5. Concentração Inibitória Mínima do composto 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida frente a isolados clínicos de Paracoccidioides spp., distribuição por espécie quanto aos resultados da CIM.

[079] A tabela 6 mostra os resultados da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) do composto 4-(N-ciclohexil-NetHsulfamoH)-N-(5-(furano-2-H)-1_!3,4-oxadiazol-2-H)benzamida atuando

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24/34 diretamente sobre as leveduras de diferentes isolados de Paracoccidioides spp.

(9 amostras).

Amostras	Concentrações em pg/mL do 4-(N-cicIohexÍl-N-etilsuifatnoif)-N-{5-fíurano-2-il)-1,3,4-
512	oxadiazol-2-ii)benzamida	1
256	126	64 32	16	6	4	2
P. brasiliensis (6)	0	0	0	0 0	2	4	0	0	0
P. lutzii ¢3)	0	0	0	0 Õ	1	2	0	0	0

Tabela 6. Concentração Inibitória Mínima do composto 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida frente a isolados clínicos de Paracoccidioides spp., distribuição por espécie quanto aos resultados da CIM.

[080] A CIM de 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida foi de 16 pg/mL para 16,67% (1/6), 32pg/mL para 16,67% (1/6), 64 pg/mL para 16,67% (1/6), 128 pg/mL para 33,33% (2/6) e 256 pg/mL para 16,67% (1/6) dos isolados clínicos de P. brasiliensis. E foi de 1 pg/mL para 33,33% (1/3), 8 pg/mL para 33,33% (1/3) e 64 pg/mL para 33,33% (1/3) dos isolados clínicos de P. lutzii.

[081] A CIM de 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)-1,3,4oxadiazol-2-il)benzamida foi de 8 pg/mL para 66,67% (4/6) e de 16 pg/mL para 33,33% (2/6) dos isolados clínicos de P. brasiliensis. E foi de 8 pg/mL para 66,67% (2/3) e de 16 pg/mL para 33,33% (1/3) dos isolados clínicos de P. lutzii.

[082] Para o itraconazol todos os isolados testados foram inibidos na concentração de 1 pg/mL. A partir da CIM foi possível determinar a concentração fungicida mínima (CFM) (Figuras 7 e 8), revelando que os compostos 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol2-il)benzamida e 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)-1,3,4oxadiazol-2-H)benzamida tem perfil fungicida. Esta é uma característica extremamente relevante, uma vez que entre os medicamentos disponíveis para o tratamento da Paracoccidioidomicose apenas anfotericina B tem perfil fungicida, porém seu uso é limitado devido aos inúmeros efeitos colaterais e sua administração via endovenosa, que pode só ser realizada em ambiente hospitalar. O itraconazol que é um dos tratamentos para PCM mais utilizado é um agente fungistático, que não mata o fungo, apenas inibe o crescimento. A

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25/34 partir desses resultados, foi possível comparar a eficiência antifúngica entre os compostos testados e a droga de referência itraconazol, verificando que, apesar da droga de referência apresentar os menores valores de CIM, verificase que os compostos 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4oxadiazol-2-il)benzamida e 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida apresentam grande eficiência antifúngica por apresentar um perfil fungicida.

[083] EXEMPLO 5: TESTES DE CITOTOXICIDADE DOS COMPOSTOS 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4oxadiazol-2-il)benzamida e 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2il)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida EM TRÊS LINHAGEM CELULARES HUMANAS [084] A citotoxicidade dos compostos 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida e 4-(N-ciclohexil-Netilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida foi realizada em três linhagens de células, HeLa, Vero e HUVEC, usando o ensaio CelITiter 96 (Promega, Madison, Wl, EUA), com base na redução de MTS (3- [4,5dimetiltiazol-2-il] - 5- [3-carboximetoxifenil] -2- [4-sulfofenilo] -2H-tetrazólio). As células foram semeadas em placas de microdiluição de 96 poços a uma densidade de 2 χ 10⁴ células/poço em meio DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s médium) suplementados com soro fetal bovino (FBS), a 10% (v/v) (soro bovino fetal, Gibco BRL, Invitrogen, Paisley, Escócia). As células foram cultivadas em um ambiente úmido com 5% de CO2 e 95% de O2 a 37^SC. Após 24 horas de incubação, 200pl do composto 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida ou do composto 4-(Nciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida foram adicionados à fileira 1 das placas de microdiluição e diluídos 1:1 em série, a fim de obter concentrações finais que variassem de 0,5 a 256 pg/mL. As células cultivadas com o composto foram incubadas por 24 horas e 48 horas em um ambiente húmido com 5% de CO2 e 95% de O₂ a 37^SC. A células foram lavadas com PBS, 2 vezes e adicionado 10Oul de MTS na diluição 1:100,

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26/34 incubada 5% de CO2 e 95% de O2 a 37^SC e após 4 horas 0 sobrenadante foi transferido para uma nova placa nova, e estas foram transferidas para um leitor de placas de microdiluição de ELISA a A₄92nm· A citotoxicidade foi expressa como a porcentagem de viabilidade celular em comparação com células controle não tratadas.

[085] As Figuras 9 e 10 apresentam a viabilidade celular (%) em função da concentração dos compostos, que mostraram atividade antifúngica in vitro. Os métodos in silico utilizados buscaram compostos com atividade seletiva contra 0 fungo, sem causar danos para células de mamíferos. Assim, antes do ensaio em animais para avaliar a atividade antifúngica dos compostos, foi realizado 0 ensaio de citotoxicidade in vitro.

[086] A Figura 11 apresenta a viabilidade celular (%) em função da concentração do diluente (DMSO) utilizado para os compostos.

[087] EXEMPLO 6: TESTES DE CITOTOXICIDADE IN VIVO DOS COMPOSTOS 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4oxadiazol-2-il)benzamida e 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-211)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida [088] A citotoxicidade in vivo dos compostos 4-(N-benzil-Nmetilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida e 4-(Nciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il) -1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida f 0 i realizado com camundongos machos da linhagem BALB/c divididos em quatro grupos: sem tratamento, tratamento com 0 diluente do composto (PBS, DMSO e Pluronic F-127 ® F-127) e tratados em dose única por via intraperitoneal (50mg/kg) e endovenosa (12,5mg/kg) para 0 composto 4-(N-benzil-Nmetilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida, e por via intraperitoneal e endovenosa (50mg/Kg) para 0 composto 4-(N-ciclohexil-NetHsulfamoH)-N-(5-(furano-2-H)-1_!3,4-oxadiazol-2-H)benzamida.

[089] Previamente aos tratamentos foi realizada avaliação hematológica inicial de todos os animais, e após a administração de cada tratamento foram observados individualmente, nos tempos 0, 15, 30, 60, 120, 240 e 480 minutos. Neste período foram avaliados os parâmetros

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27/34 comportamentais como: atividade motora, contorção abdominal, convulsão, salivação, sedação e piloereção. Adicionalmente, os animais foram observados por um período máximo de 14 dias para avaliação ponderai e sobrevida. Neste dia os animais foram anestesiados e posteriormente sacrificados; o sangue foi coletado para análises de parâmetros bioquímicos (aspartato amino transferase (AST), alamina amino transferase (ALT), creatinina e glicose) a partir de métodos enzimáticos colorimétricos; e hematológico final. A seguir, o fígado e rins de cada animal foram macromorfologicamente verificados e pesados.

[090] As alterações comportamentais foram observadas até 30 minutos em todos os grupos, sendo mais evidentes contorções abdominais e comprometimento motor no tratamento intraperitoneal e maior sedação por via endovenosa. Após este período não foram observadas alterações nos parâmetros analisados. Como é possível observar na Figura 12A e 14A houve alteração no peso do fígado dos animais que receberam o veículo e os compostos 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol2-il)benzamida e 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)-1,3,4oxadiazol-2-il)benzamida por via intraperitoneal (p<0.05), para esta mesma via de administração os mesmos compostos também foram capazes de alterar o peso dos rins dos animais que receberam a dose única dos mesmos (Figura 12B e 14B). No coração não houveram alterações significativas (Figura 12C e 14C). No entanto, a administração por via endovenosa apresentou um melhor perfil para 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol2-H)benzamida (Figuras 12D, 12E e 12F), não apresentando alterações significativas em nenhum dos órgãos avaliados. Para 4-(N-ciclohexil-Netilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2-H)benzamida a administração por via endovenosa também apresentou um melhor perfil alterando o peso do fígado, de maneira significativa, apenas do grupo que recebeu a dose do composto (Figuras 14D, 14E e 14F). Como é possível observar nas Figuras 13A e 13B, os valores das enzimas hepáticas AST e ALT, respectivamente, apresentaram um perfil aumentado quando comparado ao grupo normal e ao que recebeu o veículo. Já pela via endovenosa apenas a enzima AST se

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28/34 mostrou alterada para os grupos que receberam o veiculo e 4-(N-benzil-Nmetilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida (Figura 13E). Quanto aos parâmetros bioquímicos para 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)N-(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida, pela via intraperitoneal e endovenosa apenas a enzima AST (Figura 15A e 15E) se mostraram alterados para os grupos que receberam o composto. E para a via endovenosa os níveis séricos de glicose (Figura 15H).

[091] É importante ressaltar que não houve alteração na evolução ponderai do peso dos animais, no perfil hematológico e na análise macroscópica dos órgãos para ambos compostos.

[092] EXEMPLO 7: AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA IN VIVO DOS COMPOSTOS 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4metoxibenzil)- 1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida e 4-(N-clclohexll-Netilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida NO

MODELO EXPERIMENTAL DE CANDIDÍASE SISTÊMICA EM CAMUNDONGOS [093] Para realização destes ensaios in vivo foram utilizados camundongos Balb/c fêmeas, com seis semanas de idade, reproduzidos em condições específicas isentos de agentes patogênicos nas instalações de origem animal da Universidade Estadual de Maringá, Brasil. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com os regulamentos da Comissão de Ética institucional para a experimentação animal, Universidade Estadual de Maringá, Brasil (CEUA/UEM n° 9810191015). Os animais foram tratados de acordo com os Estados Unidos National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (http://oacu.od.nih.gov/ARAC/index.htm; acessada 21 de novembro de 2015).

[094] Para cada espécie de Candida avaliada, camundongos da linhagem Balb/c foram separados em três grupos de 5 camundongos: grupo de tratamento com o composto, grupo de tratamento com Fluconazol e grupo controle (tratado com PBS). Para o preparo dos inóculos de células fúngicas foram utilizadas as cepas padrões ATCC90028 de C. albicans, ATCC90030 de

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C. glabrata e ATCC6258 de C. krusei, crescidas em meio de cultura por 24 horas, verificou-se a viabilidade do fungo com o corante vital Tripan Blue (geralmente mais de 90%) e contadas as unidades formadoras de colônia em câmara de Neubauer. Uma suspensão em salina de 5x10⁵ (Candida albicans), 1x10⁷ (Candida krusei) ou 5x10⁷ (Candida glabrata) foi inoculada na veia lateral da cauda e após 3 horas da infecção, iniciou-se o tratamento. Ο composto foi administrado a 5mgkg'¹ para as espécies de C. albicans e C. krusei e a 25mgkg'¹ para C. glabrata, fluconazol a 5mgkg'¹, 2x/dia durante 5 dias, via intraperitoneal. Os animais de cada grupo foram eutanasiados 5 dias após o tratamento, parte dos órgãos foram para as análises histopatológicas e a outra parte para maceração. Os órgãos (rim e baço) de cada camundongo foram pesados e macerados utilizando gral e pistilo em 1 ml de PBS, e 20ul (puro, diluído 1:10 e 1:100) deste macerado foi plaqueado em SDA. O número de leveduras viáveis nos órgãos foi estimado pela contagem das unidades formadoras de colônias (UFC) crescidas por 24 horas a 35^SC. Os resultados foram apresentados como o log 10 do valor médio ± desvio padrão. O experimento foi realizado em triplicata.

[095] Como mostrado nas Figuras 16A e 16B (4-(N-benzil-Nmetilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida) e Figuras 17A e 17B (4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2H)benzamida), os dois compostos apresentaram eficiência em controlar a infecção causada por C. albicans em animais. Verificou-se que camundongos Balb/c fêmeas infectados com ATCC90028 e tratados com os compostos na concentração de 5 mg/kg via intraperitoneal, durante cinco dias, reduziram significativamente o número de unidades formadoras de colônias (CFU) de C. albicans remanescentes nos rins e baço dos animais em comparação ao grupo controle de animais infectados e tratados apenas com o veículo.

[096] Como mostrado na Figura 16C o composto 4-(N-benzil-Nmetilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida apresentou também eficiência em controlar a infecção causada por C. glabrata em animais. Verificou-se que camundongos Balb/c fêmeas infectados com ATCC90030 e

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30/34 tratados com 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4oxadiazol-2-il)benzamida na concentração de 25 mg/kg via intraperitoneal, durante cinco dias, reduziu significativamente o número de unidades formadoras de colônias (CFU) de C. glabrata remanescentes nos rins dos animais em comparação ao grupo controle de animais infectados e tratados apenas com o veículo.

[097] Como mostrado na Figura 17C o composto 4-(N-ciclohexil-NetHsulfamoil)-N-(5-(furano-2-H)-1,3,4-oxadiazol-2-H)benzamida apresentou também eficiência em controlar a infecção causada por C. krusei em animais. Verificou-se que camundongos Balb/c fêmeas infectados com ATCC6258 e tratados com 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-

2-H)benzamida na concentração de 5 mg/kg via intraperitoneal, durante cinco dias, reduziu significativamente o número de unidades formadoras de colônias (CFU) de C. krusei remanescentes nos rins dos animais em comparação ao grupo controle de animais infectados e tratados apenas com o veículo.

[098] Dessa forma, pela baixa citotoxicidade dos dois compostos avaliados e capacidade de inibir o crescimento dos fungos do gênero Candida (ação fungistática), mesma atividade encontrada no Fluconazol que é um dos antifúngicos convencionais mais amplamente utilizado na terapêutica de micoses e que vem apresentando falha terapêutica devido ao aparecimento de cepas resistentes, os compostos são bastante promissores para desenvolvimento de novos medicamentos para tratar micoses sistêmicas, como a candidíase. Neste contexto a presente invenção apresenta uma alternativa viável de tratamento de infecções causadas por fungos do gênero Candida spp.

[099] EXEMPLO 8: AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA IN VIVO DO COMPOSTO 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida e NO MODELO EXPERIMENTAL DE PARACOCCIDIOIDOMICOSE EM CAMUNDONGOS [100] Para realização destes ensaios in vivo foram utilizados camundongos Balb/c machos, com seis semanas de idade, reproduzidos em condições específicas isentos de agentes patogênicos nas instalações de

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31/34 origem animal da Universidade Estadual de Maringá, Brasil. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com os regulamentos da Comissão de Ética institucional para a experimentação animal, Universidade Estadual de Maringá, Brasil (aprovação no. 053/2014 CEP, 2014/02/10). Os animais foram tratados de acordo com os Estados Unidos National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (http://oacu.od.nih.gov/ARAC/ index.htm; acessada 21 de novembro de 2015).

[101] Grupos de 6 camundongos da linhagem Balb/c foram utilizados para avaliar a atividade antifúngica in vivo de 4-(N-benzH-N-metHsulfamoil)-N(5-(4-metoxibenzH)-1,3,4-oxadiazol-2-H)benzamida. Para o preparo do inóculo de células fúngicas foi utilizado Pb18 crescido em meio de cultura por 5 dias, verificou-se a viabilidade do fungo com o corante vital Tripan Blue (geralmente mais de 90%) e contadas as unidades formadoras de colônia em câmara de Neubauer. Os três grupos de camundongos (6-8 semanas de idade) foram infectados por via intratraqueal (IT) com 1 χ 10⁶ células de levedura viáveis em 50ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Após 24 horas de infecção, o tratamento foi iniciado com 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4metoxibenzH)-1,3,4-oxadiazol-2-H)benzamida (5mg/Kg), itraconazol (5mg/Kg) ou veículo (PBS, 1% DMSO e 0,2% Pluronic F-127). Os animais de cada grupo foram eutanasiados quinze dias após o tratamento, parte dos órgãos (pulmão e fígado) foi para as análises histopatológicas e a outra parte para maceração. Os órgãos de cada camundongo foram pesados e macerados utilizando gral e pistilo em 1 ml de PBS, e 300ul deste macerado foi plaqueado em BHI suplementado. O número de leveduras viáveis nos órgãos foi estimado pela contagem das unidades formadoras de colônias (UFC) crescidas até 15 dias a 35^SC. Os resultados foram apresentados como o log 10 do valor médio ± desvio padrão. O experimento foi realizado em triplicata.

[102] Como mostrado na Figura 18 o composto 4-(N-benzil-Nmetilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida apresentou eficiência em controlar a infecção causada por P. brasiliensis em animais. Verificou-se que camundongos Balb/c machos infectados com Pb18 e tratados

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32/34 co m 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N- (5-(4-metoxibenzil) -1,3,4-oxadiazol-2H)benzamida via intraperitoneal, durante quinze dias, reduziu significativamente o número de unidades formadoras de colônias (CFU) de P. brasiliensis remanescentes nos pulmões dos animais em comparação ao grupo controle de animais infectados e tratados apenas com o veículo. Os resultados do tratamento com 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4oxadiazol-2-H)benzamida foi semelhante ao grupo de animais tratados com itraconazol (p<0,05). Dessa forma, pela baixa citotoxicidade do composto 4-(Nbenzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida e a capacidade de matar os fungos (ação fungicida), o composto é bastante promissor para desenvolvimento de novos medicamentos para tratar micoses sistêmicas frente ao itraconazol que é a droga de escolha para pacientes não hospitalizados e que, no entanto, apresenta perfil fungistático e não fungicida como é o caso do composto 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida. Neste contexto a presente invenção apresenta uma alternativa viável de tratamento de infecções causadas por fungos do gênero Paracoccidioides spp.

[103] EXEMPLO 9: AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA IN VIVO DO COMPOSTO 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida NO MODELO EXPERIMENTAL DE CRIPTOCOCOSE EM CAMUNDONGOS [104] Para realização destes ensaios in vivo foram utilizados camundongos Balb/c fêmeas, com seis semanas de idade, reproduzidos em condições específicas isentos de agentes patogênicos nas instalações de origem animal da Universidade Estadual de Maringá, Brasil. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com os regulamentos da Comissão de Ética institucional para a experimentação animal, Universidade Estadual de Maringá, Brasil (CEUA/UEM n° 9810191015). Os animais foram tratados de acordo com os Estados Unidos National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (http://oacu.od.nih.gov/ARAC/index.htm; acessada 21 de novembro de 2015).

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33/34 [105] Camundongos da linhagem Balb/c foram separados em três grupos de 5 camundongos: grupo de tratamento com 4-(N-ciclohexil-Netilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-H)-1,3,4-oxadiazol-2-H)benzamida, grupo de tratamento com anfotericina B e grupo controle (tratado com PBS). Para o preparo do inóculo de células fúngicas foi utilizada a cepa padrão INCQS de C. neoformans, crescidas em meio de cultura por 48 horas, verificou-se a viabilidade do fungo com o corante vital Tripan Blue (geralmente mais de 90%) e contadas as unidades formadoras de colônia em câmara de Neubauer. Uma suspensão em salina de 2x10⁵ cels/mL foi inoculada na veia lateral da cauda e após 3 horas da infecção, iniciou-se o tratamento. O composto foi administrado a 5mgkg'¹ e a anfotericina B a 1mgkg'¹, 2x/dia durante 5 dias, pela via endovenosa. Os animais de cada grupo foram eutanasiados 5 dias após o tratamento, parte dos órgãos foram para as análises histopatológicas e a outra parte para maceração. Os órgãos (cérebro e baço) de cada camundongo foram pesados e macerados utilizando gral e pistilo em 1 ml de PBS, e 20ul (puro, diluído 1:10 e 1:100) deste macerado foi plaqueado em SDA. O número de leveduras viáveis nos órgãos foi estimado pela contagem das unidades formadoras de colônias (UFC) crescidas por 48 horas a 25^SC. Os resultados foram apresentados como o log 10 do valor médio ± desvio padrão. O experimento foi realizado em triplicata.

[106] Como mostrado na Figura 19 o composto 4-(N-ciclohexil-NetHsulfamoH)-N-(5-(furano-2-H)-1,3,4-oxadiazol-2-H)benzamida apresentou eficiência em controlar a infecção causada por C. neoformans em animais. Verificou-se que camundongos Balb/c fêmeas infectados com cepa padrão INCQS de C. neoformans e tratados com 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5(furano-2-H)-1,3,4-oxadiazol-2-H)benzamida na concentração de 5 mg/kg via endovenosa, durante cinco dias, reduziu significativamente o número de unidades formadoras de colônias (CFU) de C. neoformans remanescentes no cérebro e baço dos animais em comparação ao grupo controle de animais infectados e tratados apenas com o veículo. Dessa forma, pela baixa citotoxicidade do composto 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)

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1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida e capacidade de matar os fungos (ação fungicida), o composto é bastante promissor para desenvolvimento de novos medicamentos para tratar micoses sistêmicas frente a anfotericina B, que é a droga de escolha para pacientes hospitalizados, porém apresenta hepatoxicidade e outros efeitos colaterais. Neste contexto a presente invenção apresenta uma alternativa viável de tratamento de infecções causadas por fungos do gênero Cryptococcus spp.

Claims (10)

1. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender como ingrediente ativo o composto 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida com ação na inibição da enzima tioredoxina redutase de fungos.

2. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender como ingrediente ativo o composto 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida, com ação na inibição da enzima tioredoxina redutase de fungos.

3. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por compreender como ingrediente ativo o composto 4-(Nbenzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4-metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida em uma de suas formas, sendo estas neutra, sal, hidrato ou solvato.

4. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a Reivindicação 2, caracterizada por compreender como ingrediente ativo o composto 4-(Nciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5-(furano-2-il)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida, em uma de suas formas, sendo estas neutra, sal, hidrato ou solvato.

5. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a Reivindicação 3, caracterizada por compreender ao menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

6. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a Reivindicação 4, caracterizada por compreender ao menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

7. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a Reivindicação 1, ou 3 ou

5, caracterizada por compreender uma das formas de apresentação selecionadas entre pós, granulados, comprimidos, drágeas, cápsulas, elixir, solução, suspensão, emulsões, xaropes injetáveis, tinturas, extratos, loções,

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2/2 cremes, pastas, géis, aerossóis, adesivos e outras formas para administração conhecidas ou que venham a ser conhecidas.

8. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a Reivindicação 2, ou 4 ou

6, caracterizada por compreender uma das formas de apresentação selecionadas entre pós, granulados, comprimidos, drágeas, cápsulas, elixir, solução, suspensão, emulsões, xaropes injetáveis, tinturas, extratos, loções, cremes, pastas, géis, aerossóis, adesivos e outras formas para administração conhecidas ou que venham a ser conhecidas.

9. USO DA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com as Reivindicações 1,3, 5 e 7 e do composto 4-(N-benzil-N-metilsulfamoil)-N-(5-(4metoxibenzil)-1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamida em uma de suas formas, caracterizado por ser na preparação de um medicamento, aditivo, agente ou formulação a ser utilizada no tratamento de infecções causadas por microorganismos do gênero Candida spp., Cryptococcus spp. e Paracoccidioides spp.

10. USO DA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com as Reivindicações 2, 4, 6 e 8, e do composto 4-(N-ciclohexil-N-etilsulfamoil)-N-(5(furano-2-H)-1,3,4-oxadiazol-2-H)benzamida em uma de suas formas, caracterizado por ser na preparação de um medicamento, aditivo, agente ou formulação a ser utilizada no tratamento de infecções causadas por microorganismos do gênero Candida spp., Cryptococcus spp. e Paracoccidioides spp.