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B D'INVENTION au nom de Fidia S. p. A., Via Ponte della Fabbrica, 3/A, 35031 Abano Terme, Italie pour Kit ou dispositif et méthode d'administration de gangliosides et de leurs dérivés par inhalation et compositions pharmaceutiques appropriées. Priorité de la demande de brevet en Italie No. 49288 A/83 du 8 novembre 1983.
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KIT OU DISPOSITIF ET METHODE D'ADMINISTRATION DE GANGLIOSIDES
ET DE LEURS DERIVES PAR INHALATION ET COMPOSITIONS
PHARMACEUTIQUES APPROPRIEES
La présente invention concerne un kit ou un dispositif et une méthode d'administration de gangliosides ou de dérivés de gangliosides par inhalation à des fins thérapeutiques et des compositions pharmaceutiques convenant à cette administration. Les préparations pharmaceutiques selon la présente invention sont utilisées pour traiter des désor- dres du système nerveux résultant d'accidents ou de maladies qui ont endommagé d'une certaine façon le tissu nerveux.
Les gangliosides sont un groupe de glycosphingolipides et ils ont une structure comportant une partie hydrate de carbone à laquelle sont liés un radical céramide et un radical acide sialique. La portion hydrate de carbone comprend au moins un radical galactose ou glucose et au moins un radical N-acétylglucosamine ou N-acétylgalactosamine. La structure générale d'un ganglioside peut ainsi être représentée par la formule suivante :
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- de ceramide, - moins une mole de galactose ou de glucose . une mole d'un acide sialique une mole de N-acétylglucosamine ou de N-acétylgalactosamine
EMI2.2
dans laquelle tous les radicaux sont liés par une liaison glucosidique.
De nombreux gangliosides ont été identifiés et on a trouvé qu'ils étaient particulièrement abondants dans le tissu nerveux, notamment dans les tissus du cerveau. Diverses études ont montré que les plus importants des acides sialiques que 1 Ion rencontrait dans les gangliosides étaient 1'acide N-acétylneuraminique (NANA) et à un moindre degré l'acide N-glycolylneuraminique. Parmi les nombreux gangliosides qui ont
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été identifiés, les gangliosides suivants, désignés par leurs symboles internationaux ont été trouvés en quantité significative dans des mélanges de gangliosides extraits des tissus du cerveau bovins.
GD1b (16%) 0 G Gal (13) Ga1NAC 4) 4) l)
EMI3.2
NANA /) . NANA
EMI3.3
GTlb (19%) 0 0 Gal (l3) GalNAC (l4) Gal (l4) Glc (ll) G
EMI3.4
( ( 2 2 NANA NANA zo zo NANA
EMI3.5
GM1 (21%) Gal (13) 4) 4) l)
EMI3.6
t W ( NANA
EMI3.7
GDla (40%) Gal (1+3) GalNAC
EMI3.8
t o e \2/\2/ NANA NANA
EMI3.9
dans ces formules : Glc représente le glucose, GalNAC représente la N-acétylgalactosamine,
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desGal représente 1e. galactose,
NANA représente 1'acide N-acéty1neuraminique, et les pourcentages entre parenthèses, indiquent la quantité de chaque ganglioside trouvé dans 1e mélange de gangliosides extrait du tissu du cerveau des boyins.
On sait que les gangliosides jouent un rôle important dans Ie système nerveux et l'on a récemment démontré que les gangliosides étaient utiles dans 1e traitement des désordres du système nerveux périphérique et des pathologies du système nerveux central (Adv. Exp.
Biol. 71,275 (1976)) ; Brain Res. 197,236, (1980) ; Acta Otoryngol. 92, 433-437 (1981) ; Muscle et Nerve 2,382-389 (1979) ; Neuroscience 8, (3) 417-429 (1983) ; Neuroscience Letters, 34,1-5 (1982) ; Eur. J. Pharmacol.
80,243-245 (1982) ; Experientia 37, 301-302 (1981) ; Muscle et Nerve 5, 107-110 (1982) ; Neurochem. Int. 4, (2-3) 167-174 (1982) ; Neuroscience 7, 495-499 (1982) ; Muscle et Nerve 5, 351-356 (1982) ; Acta Diabetol. Lat.
20, (3) 265-276 (1983) ; Rev. Clin. Esp. 168 (3) 193-198 (1983) ; Brain Res. 261,163-166 (1983).
L'action thérapeutique des gangliosides apparaît consister principalement dans la stimulation des phénomènes de bourgeonnement dans le tissu nerveux et dans 1'activation des enzymes de membranes impliqués dans la conduction des stimuli nerveux, tels que l'enzyme (Na+, K) ATPase (Brain Res., 197,236 (1980) ; J. of Neurochem., 37,350 (1981)).
Le bourgeonnement nerveux stimulé par les gangliosides favorise la restauration du fonctionnement du tissu nerveux endommagé.
En outre, il a été récemment établi par la demanderesse que quelques dérivés de ganglioside sont plus actifs que les gangliosides eux-mêmes pour favoriser le bourgeonnement des neurones et pour activer les enzymes de membranes impliqués dans la conduction des stimuli nerveux, te1s que la (Na K ATPase. En particulier, il a été établi que les dérivés d'esters internes des gangliosides sont spécialement actifs dans le traitement des désordres du, système nerveux et qu'ils sont plus actifs que les gangliosides apparentés initiaux.
Les dérivés esters internes des gangliosides se forment par réaction entre le groupe carboxylique d'un radical acide sialique avec un groupe hydroxyl de l'un des radicaux hydrate de carbone ou d'un autre acide sialique voisin au sein de la même molécule de gangliosides (J. of Neurochemistry, 34,1351 (1980) ; Bull. Mol. Biol. Med. 3,170 (1978)).
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A titre d'exemple, un dérivé d'ester interne possible d'un ganglioside pourrait être représenté par la structure suivante :
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dans laquelle :
R dans Ie radical acide sialique représente H ou OH ; et R. dans le groupe céramide représente un acide gras tel que
1'acide oléique, stéarique ou linoléique.
Le dérivé de ganglioside d'ester interne (1) est un exemple d'un dérivé dans lequel le groupe carboxylique de l'acide sialique est un ester lié à un groupe hydroxyle de 1 lun des radicaux hydrate de carbone, notamment de galactose. La formation de la liaison ester interne, en même temps que de la liaison glucosidique normale entre l'acide sialique et Ie radical hydrate de carbone crée un cycle lactonique, typiquement à
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5 ou 6 éléments, caractéristique de la structure des dérivés d'esters internes de gangliosides.
Tandis que 1'on a montré la formule (I) à titre d'exemple, i1 est à noter que d'autres cycles lactoniques possé- dant des structures cycliques à 5 éléments ou plus pourraient se former en tant que liaison ester du groupe de carboxyle de l'acide sialique avec 1e groupe hydroxyle d'un radical hydrate de carbone.
Comme noté ci-dessus, les dérivés d'esters internes de gangliosides peuvent aussi se former lorsque 1e groupe carboxyle d'un ester
EMI6.1
d'acide sialique se 1ie à un acide sialique voisin auquel i1 est lié par une liaison glucosidique dans 1e ganglioside à parenté initial. Une telle structure pourrait être représentée par la formule suivante :
EMI6.2
dans laquelle :
R2 représente Ie radical hydrate de carbone qui est lié par une liaison glucosidique au radical acide sialique.
Un autre dérivé de ganglioside ester interne possible pourrait être représenté par la formule suivante :
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dans laquelle :
R3 représente le radical hydrate de carbone auquel 1'acide sialique voisin est lié par une liaison ester. La formu- le (III) représente alors un dérivé d'ester interne de ganglioside dans lequel un acide sialique est lié par une liaison avec ester à un acide sialique voisin qui est lui-même lié par une liaison ester à un radical hydrate de carbone.
11 est alors évident que de nombreuses variations des dérivés décrits ci-dessus peuvent se former de telle sorte que les dérivés d'esters internes de gangliosides sont généralement formés d'une portion hydrate de carbone, d'au moins un céramide et d'au moins un radical acide sialique dans lequel un ou plusieurs des acides sialiques sont liés par une liaison ester à un radical hydrate de carbone et/ou un ou plusieurs des acides sialiques sont liés par une liaison ester à un acide sialique voisin. De nombreux dérivés d'esters internes de gangliosides sont ainsi possibles parmi lesquels ceux décrits ci-dessus sont donnés seulement à titre d'exemple.
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Quelques méthodes de l'art antérieur pour la préparation des dérivés de gangliosides d'esters internes comprennent les methodes suivantes : 1. - la formation des esters internes en laissant simplement séjourner les gangliosides dans une solution d'acide acétique ou d'acide trichloroacétique (Sphingolipides, Sphingolipidoses et désordres associés, Adv. Exp. Med. Biol. 19,95 (1972) ; J. neurochem. 28,
1133 (1977)).
2. - la réaction d'un carbodiimide soluble dans l'eau avec des ganglio- sides dans un milieu aqueux (Carbohydr. Res. 41,344 (1975)). selon Ie procédé de la demanderesse, des dérivés d'esters internes de gangliosides sont préparés en faison réagir les gangliosides avec un réactif de lactonisation dans un solvant organique non aqueux dans des conditions anhydres.
Des solvants organiques convenables à utiliser dans la réaction comprennent : diméthylsul- foxyde (DMSO), diméthylformamide (DMF), sulfolan, tétrahydrofu- ranre, diméthoxyéthane et pyridine ou leurs melanges. Des réactifs de lactonisation convenables comprennent des carbodiimides solu- bles dans des solvants organiques tels que : dicyclohexylcarbodii- mide, benzylisopropylcarbodiimide et benzyléthylcarbodiimide, des sels de 2-chloro-1-méthyl-pyridinium, éthoxyacéthylène et réactif de Woodward (N-éthyl-5-phényllisoxazolium-31-sulfonate).
Les dérivés d'esters internes de gangliosides peuvent être utilisés comme médicaments pour la thérapie de différentes pathologies du système nerveux central, particulièrement des désordres du système nerveux périphérique et du système nerveux central. Plus particulièrement, les dérivés d'esters internes de gangliosides peuvent être utilisés dans le traitement des désordres du système nerveux périphérique dus à des causes traumatiques, compressives, dégénératives ou toxiques lorsque la stimulation de la régénération des nerfs et de la récupération de la fonction neuromusculaire sont nécessaires et dans les désor- dres du système nerveux central dûs à des causes traumatiques, anoxiques,
dégénératives ou toxiques lorsque la stimulation du bourgeonnement des neuron0 est nécessaire pour la rêcupêration fonctionnelle. Ces désordres ont été, jusqu'a maintenant, traités par utilisation de gangliosides ; cependant, les dérivés esters internes de gangliosides ont une activité beaucoup plus grande que celle des gangliosides eux-mêmes.
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11 a été déterminé que des gangliosides et eurs dérivés agissent par voie systémique. Par conséquent, les composés étudiés ci-dessus, soit en tant que composés gangliosides uniques, soit en tant que dérivés d'esters internes de gangliosides uniques en. tant. que. tels ou sous laforme de sels pharmaceutiquement acceptables, ou d'un mélange de. gangliosides ou de leurs dérivés peuvent être administrés par voie systémi- que en vue d'obtenir un effet thérapeutique. Cette administration peut avoir lieu sous la forme d'une préparation pharmaceutique destinée à l'administration et peut être administrée a. l,'homme ou aux animaux par, voies intra-musculaire, sous-cutanée ou intra-dermique, au moyen d'injection ou au moyen de perfusions. intra-veineuse.
Cependant, il n'était pas connu jusqu'a maintenant que ces composés étaient susceptibles, d'atteindre Ie flux sanguin en passant par, les membranes biologiques du
EMI9.1
système respiratoire..,,..-.
L'objet de la présente est la découverte. que. les gangliosides, en tant que tels ou sous la forme de leurs sels pharmaceutiquement acceptables, aussi bien que les dérivés. de. gangliosides, soit seuls, soit en melanges, peuvent être administrés par inhalation et que ces composés sont facilement absorbés par cette. voie qui, leur permet d'atteindre le flux sanguin., ;.
La présente invention concerne spécifiquement la découverte inattendue que les gangliosides et. leurs dérivés d'esters internes peuvent être efficacement et facilement administres par inhalation. Pour cette administration par inhalation, les composés sont utilisés sous la forme de compositions pharmaceutiques telles,-, que cel. les étudiées ci- dessous..,.
Selon 1'invention, un dispositif de pulvérisation peut être utilisé pour administrer les compositions. pharmaceutiques sous la forme de solutions aqueuses. Un tel dispositif doit. comprendre une bouteille souple ou une bouteille à pompe de pulvérisation adaptée à 1'utilisation comme pulvérisation nasale pour administration par inhalation de la composition. Ou encore, des flacons de pulvérisation sous pression peuvent être utilisés pour administrer la composition sous la forme d'une suspension ou de solution, des composants actifs en même temps que des propulseurs liquides classiquesmlgn outre, on peut utiliser un kit ou dispositif d'inhalation en poudre par lequel, la composition pharmaceutique est préparée sous la forme de poudre dans un capsule que l'on peut briser.
Pour 1'administration de la poudre, la capsule est brisée
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ou on lui pratique un trou avec, par exemple, un percuteur ou à la main et la poudre de la capsule est absorbée par inhalation. Les compositions pour cette inhalation de la poudre, comprennent un. composé de ganglioside ou un dérivé d'ester interne de ganlioside sous une forme solide mélangé avec des excipients pharmaceutiquement, acceptables convenables ou des diluants tels que, par exemple, le lactose.
Pour chacun des dispositifs décrits. ci-dessus pour administration par inhalation, la composition pharmaceutique comprend comme ingrédients actifs au moins un dérivé de ganglioside ou au moins un dérivé d'ester interne de ganglioside ou des mélanges de ceux-ci dans lesquels les composés peuvent être présents sous la forme. d'un de leurs sels pharmaceutiquement acceptables, La composition pharmaceutique pour administration par inhalation peut aussi comprendre d'autres ingrédients actifs qui sont connus en soi tels que des dilatateurs bronchiques pour agir contre les problèmes tels que la constriction des bronches qui est associée à 1'inhalation de la poudre. chez quel. ques patients.
A cette fin, n'importe quel dilatateur bronchique peut être utilise, par exemple l'adrénaline ou l'isoprénaline, à un. mveauide ; dosage efficace.
EXEMPLE 1 :. ! :
Les exemples suivants représentent des compositions pharmaceutiques contenant comme ingrédients. actifs des gangliosides simples ou des mélanges de gangliosides pouvant être, administrés par inhalation ;
EMI10.1
Composition a- (formulation pour, aérosol)
EMI10.2
<tb>
<tb> . <SEP> ganglioside <SEP> ......................... <SEP> 2%
<tb> . <SEP> mélange <SEP> propulseur <SEP> Fréon <SEP> 12 <SEP> +
<tb> Fréon <SEP> 114 <SEP> (60/40 <SEP> poids/poids) <SEP> 98%
<tb>
Composition b- (formulation solide)
EMI10.3
<tb>
<tb> Chaque <SEP> dose <SEP> unitaire <SEP> comprend <SEP> :
<tb> . <SEP> ganglioside <SEP> ....................... <SEP> 50 <SEP> mg
<tb> . <SEP> lactose,, <SEP> 20 <SEP> mg
<tb>
EXEMPLE 2, " "
Les exemples suivants représentent des compositions pharmaceutiques contenant comme agents actifs des gangliosides sous leur forme de sels de sodium, seuls-ou en melanges, pouvant être administrés par inhalation.
Composition a- (formulation pour aérosol),
EMI10.4
<tb>
<tb> . <SEP> sel <SEP> de <SEP> sodium <SEP> de <SEP> ganglioside <SEP> ... <SEP> 2%
<tb> . <SEP> mélange <SEP> propulseur <SEP> Fréon <SEP> 12 <SEP> +
<tb> Fréon <SEP> 114 <SEP> (60/40 <SEP> poids/poids) <SEP> 98%
<tb>
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Composition b- (formulation pour pulvérisation aqueuse)
EMI11.1
<tb>
<tb> . <SEP> sel <SEP> de <SEP> sodium <SEP> de <SEP> ganglioside... <SEP> 2%
<tb> . <SEP> solution <SEP> aqueuse <SEP> tamponnée <SEP> à <SEP> pH7 <SEP> 98%
<tb>
Composition c- (formulation solide) Chaque dose unitaire comprend :
EMI11.2
<tb>
<tb> . <SEP> sel <SEP> de <SEP> sodium <SEP> de <SEP> ganglioside... <SEP> 100 <SEP> mg
<tb> . <SEP> lactose <SEP> 15 <SEP> mg
<tb>
EXEMPLE 3
Les exemples suivants représentent des compositions pharmaceutiques contenant comme ingrédients actifs des dérivés d'esters internes de gangliosides, seuls ou en mélanges, pouvant être administrés par inhalation.
Composition a- (formulation pour aérosol)
EMI11.3
<tb>
<tb> . <SEP> ester <SEP> interne <SEP> de <SEP> ganglioside... <SEP> 3%
<tb> . <SEP> mélange <SEP> propulseur <SEP> Fréon <SEP> 12 <SEP> +
<tb> Fréon <SEP> 114 <SEP> (60/40 <SEP> poids/poids) <SEP> 97%
<tb>
Composition b- (formulation solide) Chaque dose unitaire comprend :
EMI11.4
<tb>
<tb> . <SEP> ester <SEP> interne <SEP> de <SEP> ganglioside... <SEP> 75 <SEP> mg
<tb> . <SEP> lactose <SEP> 30 <SEP> mg
<tb>
EXEMPLE 4
Les exemples suivants représentent des compositions pharmaceutiques contenant comme ingrédients actifs des sels de sodium de gangliosides, seuls ou en mélanges, et du sulfate d'isoprénaline pouvant être administrés par inhalation.
Composition a- (formulation pour aérosol)
EMI11.5
<tb>
<tb> . <SEP> sel <SEP> de <SEP> sodium <SEP> de <SEP> ganglioside.. <SEP> 2%
<tb> . <SEP> sulfate <SEP> de <SEP> d1isoprénaline..... <SEP> 0,1%
<tb> . <SEP> mélange <SEP> propulseur <SEP> Fréon <SEP> 12 <SEP> +
<tb> Fréon <SEP> 114 <SEP> (60/40 <SEP> poids/poids) <SEP> 97,9%
<tb>
Composition b- (formulation solide) Chaque dose unitaire comprend :
EMI11.6
<tb>
<tb> . <SEP> sel <SEP> de <SEP> sodium <SEP> de <SEP> ganglioside.. <SEP> 75 <SEP> mg
<tb> . <SEP> sulfate <SEP> d'isoprénaline........ <SEP> 0,1 <SEP> mg
<tb> . <SEP> lactose <SEP> 25 <SEP> mg
<tb>
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PROPRIETES PHARMACOLOGIQUES
L'absorption du ganglioside et des dérivés d'esters internes de gangliosides a été démontrée sur des animaux expérimentaux en utilisant des techniques comprenant l'administration d'une solution aqueuse de la substance active marquée par intubation par la trachée, par nébulisation, par intubation par la trachée de ces solutions aqueuses ou par atomisation par intubation par la trachée, ou d'un mélange de poudre sèche contenant les substances actives. On a utilisé deux espèces animales, c'est-a-dire des rats et des lapins.
On a démontré l'absorp- tion en faisant des essais pour déceler la présence d'ingrédients actifs marqués dans le sang au cours du temps.
Matériaux et méthodes 1. - Substances utilisées a. - galglioside simple marqué
EMI12.1
------------------------Du monosialotétrahéxosylganglioside Go sur le radical sphingosine selon la méthode de Tettamanti et col. (dans "Gangliosides in Neurological and Neuromuscular Function, Development and Repair"Eds. M. M. Rapport, A. Gorio, Raven Press. (N. Y.) 1981, p. 225-240) est utilisé comme molécule de ganglioside représentative.
EMI12.2
b.-melange de ----------------------------- Le mélange de ganglioside utilisé est semblable au mélange naturel que 1 Ion obtient par extraction et purification à partir du cortex cébéral des bovins.
Le mélange est préparé par compositions des-fractions simples de gangliosides dans les proportions en % suivantes :
EMI12.3
. 21% . 40% disialotétrahexosylganglioside 17% . 19% Le monosialotétrahéxosylganglioside Go comme 3 marqueur du 3H sur la sphingosine tel que spécifié dans le paragraphe a.-comme traceur du mélange.
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EMI13.1
c. esters internes du GM1 marqué ------------------------------------- Les dérivés d'esters internes marqués du monosialganglioside sont obtenus à partir du monosialganglioside marqué sur le radical sphingosine selon la méthode citée dans le paragraphe a.Spécifiquement, les dérivés d'esters internes peuvent se préparer selon l'un des modes opératoires suivants :
Mode opératoire 1
Un mélange de gangliosides est obtenu par extraction de cerveaux de bovins et 5 9 de ce mélange sont dissous dans 50 ml de DMSO. Ensuite, 4 9 de résine de type styrénique anhydre (acide sulfonique) (50 à 100 mailles, forme H) sont ajoutés au mélange et le système qui en résulte est agité pendant 30 minutes à la température ambiante. Ce traitement avec un résine échangeuse d'ions transforme tous les groupes carboxylates du ganglioside en groupe COOH (carboxyle). La conversion complète des groupes carboxylates est confirmée par une méthode analytique physique appropriée, par exemple par absorption atomique. La résine est alors filtrée par aspiration sous vide et la solution est traitée avec 1,5 9 de dicyclohexylcarbodiimide et on la laisse séjourner pendant une heure.
La dicyclohexylurée qui se précipite est enlevée par filtration et la solution qui reste est traitée avec 100 ml d'acétone, ce qui occasionne la précipitation des dérivés d'esters internes de ganglioside produits. La méthode donne 4,6 9 d'esters internes (environ 90 à 95% de la valeur théorique).
Mode opératoire 2
9 9 d'un mélange de ganglioside (sel de sodium) sont dissous dans 80 ml d'eau distillée et on les fait passer à travers une colonne remplie de 20 9 de Dowex 50 w x 8 (100-200 mailles, forme triéthylammonium).
Ce produit, transformé en anhydride sous vide poussé, est dissous, (a 1'aide d'un bain de traitement sonique), dans 200 ml de tétrahydrofuranne anhydre contenant 8 ml de triéthylamine.
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Cette solution est lentement ajoutée à 600 ml de tétrahydrofuranne anhydre (4 heures) contenant 40 mM de sel de 2-chloro-1-méthyl-pyridinium (dans lequel l'anion peut être, par exemple, iodure, toluène-4-sulfonate, trifluorométhane sulfonate, etc. ), sous agitation continue et en maintenant une température constante de 45 C.
Cette réaction est mise en oeuvre pendant 18 heures à 45 C.
Le réactif en excès est éliminé par filtration et le mélange est concentré dans un courant d'azote, le residu est redissous dans 90 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 1/1 et on le précipite dans 400 ml d'acétone. Le produit est finalement séché sous vide poussé.
Rendement : 7,9 9 (89,7% de la valeur théorique).
Mode opératoire 3
8 9 de GM1 (sel de sodium) sont dissous dans 80 ml d'eau distillée et on les fait passer à travers une colonne remplie de 10 9 de Dowex 50 w x 8 (100-200 mailles, forme
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triethylammonium).
Ce produit, transformé en anhydride sous vide poussé, est dissous, (a 1'aide d'un bain de traitement sonique), dans 200 ml de tétrahydrofuranne anhydre contenant 8 ml de triéthylamine.
Cette solution est lentement ajoutée à 600 ml de tétrahydrofuranne anhydre (4 heures) contenant 20 mM de sel de 2-chloro-1-méthyl-pyridinium (dans lequel l'anion peut être, par exemple, iodure, toluène-4-sulfonate, trifluorométhane sulfonate, etc. ), sous agitation continue et en maintenant une température constante de 45 C.
Cette réaction est mise en oeuvre pendant 18 heures à 45 C.
Le réactif en excès est éliminé par filtration et le mélange est concentré dans un courant d'azote, le résidu est redissous dans 80 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 1/1 et on le précipite dans 400 ml d'acétone. Le produit est finalement séché sous vide poussé.
Rendement : 7,0 9 (88,4% de la valeur théorique).
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Mode opératoire 4
9 9 d'un mélange de ganglioside (sel de sodium) sont dissous dans 80 ml d'eau distillée et on les fait passer à travers une colonne remplie de 20 9 de Dowex 50 w x 8 (100-200 mailles, forme pyridinium).
Ce produit, transformé en anhydride sous vide poussé, est dissous, dans 800 ml de tétrahydrofuranne anhydre et 4,2 g (60 mM) d'éthoxyacéthylène.
Le mélange est traité à reflux pendant 3 heures, le dispositif de reflux est refroidi à -100C et il est équipé d'une vanne de transformation en anhydride.
Après élimination des solvants et de l'excès d'éthoxyacéthylène, le résidu est dissous dans 80 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 1/1 et on le précipite dans 400 ml d'acétone.
Rendement : 8,1 g (92,0% de la valeur théorique).
Mode opératoire 5
8 9 de GM, (sel de sodium) sont dissous dans 80 ml d'eau distillée et on les fait passer à travers une colonne remplie de 10 9 de Dowex 50 w x 8 (100-200 mailles, forme pyridinium).
Ce produit, transformé en anhydride sous vide poussé, est dissous, dans 800 ml de tétrahydrofuranne anhydre et 2,1 g (30 mM) d'éthoxyacéthylène.
Ce mélange est traité à reflux pendant 3 heures, le dispositif de reflux est refroidi à -100C et il est équipé d'une vanne de transformation en anhydride.
Après élimination des solvants et de l'excès d'éthoxyacéthylène, le résidu est dissous dans 80 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 1/1 et on le précipite dans 400 ml d'acétone.
Rendement : 7,2 g (91,0% de la valeur théorique).
Mode opératoire 6
9 9 d'un mélange de ganglioside (sel de sodium) sont dissous dans 80 ml d'eau distillée et on les fait passer à travers une colonne remplie de 20 9 de Dowex 50 w x 8 (100-200 mailles, forme pyridinium).
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Ce produit, transformé en anhydride sous vide poussé et dissous dans 200 ml de pyridine anhydre est ajouté à une suspension de 5,52 9 (10 mM) de réactif de Woodward dipolaire (N-éthyl-t-phénylisoxazolium-3'-sulfonate, Woodward et col., J. Am. Chem. Soc. 83,1010-1012, 1961) dans 200 ml de pyridine anhydre. Ce mélange réactionnel est agité pendant 10 jours à la température ambiante.
Après filtration du réactif en excès et élimination complète du solvant, le résidu est dissous dans 90 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 1/1 et on le précipite dans 450 ml d'acétone.
Rendement : 7,2 9 (81,8% de la valeur théorique).
Mode opératoire 7
EMI16.1
8 9 de GM1 (sel de sodium) sont dissous dans 80 ml d'eau distillée et on les fait passer à travers une colonne remplie de 10 9 de Dowex 50 w x 8 (100-200 mailles, forme pyridinium).
Ce produit, transformé en anhydride sous vide poussé et dissous dans 200 ml de pyridine anhydre est ajouté à une suspension de 1,26 9 (5 mM) de réactif de Woodward dipolaire (N-éthyl-t-phénylisoxazolium-31-sulfonate), dans 200 ml de pyridine anhydre. Ce mélange réactionnel est agité pendant 10 jours à la température ambiante.
Après filtration du réactif en excès et élimination complète du solvant, le résidu est dissous dans 80 ml d'un
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mélange chloroforme/méthanol 1/1 et on le précipite dans 400 ml d'acétone.
Rendement : 6, 3 9 (79, 5% de la valeur théorique). d. de dérivés d'esters internes de gangliosides -----------------------------------------------------------
Le mélange d'esters internes de gangliosides est obtenu de façon semblable à la facon dont on obtient le mélange des gangliosides décrit au paragraphe b.-ci-dessus, c'est-a-dire par mélange en proportions convenables des dérivés d'esters internes de gangliosides simples obtenus par la méthode d'estérification interne décrite dans la paragraphe c. - ci-dessus.
Spécifiquement, les espèces simples d'esters internes de gangliosides sont mélangées dans les
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2.proportions suivantes : . 21% du dérivé ester interne du monosialoganglioside GM, ; . 40% du dérivé ester interne du disialoganglioside GT,a ; . 17% du dérivé ester interne du disialoganglioside GT lb ; et . 19% du dérivé ester interne du trisialoganglioside GT,b.
L'ester interne de monosialoganglioside contient les espèces marquées sur le radical sphingosine obtenues comme décrit dans le paragrpahe c.-ci-dessus sous forme de traceur du mélange.
Méthodes d'administration a.-administration d'une solution aqueuse par intubation a travers la trachée L'administation des solutions aqueuses des substances décrites ci-dessus est effectuée selon la méthode décrite dans Enna et Schancher (Life Sci. 12, (1) 231-239,1973), par injection intra-trachéenne au moyen d'une micro-seringue de 50 mcl de la solution aqueuse des composés en considération. b. - administration de solutions aqueuses nébulisées par intubation trachéenne Selon la méthode de Moss et Ritchie (Toxicol. Appl.
Pharmacol. 17,699-707, 1970) les solutions des composés décrits ci-dessus sont administrées au moyen d'une canule trachéenne reliée à un nébuliseur convenable. c. - administration d'un mélange solide atomisé sec par intubation trachéenne Des poudres très fines des composés décrits ci-dessus sont atomises par voie intra-trachéenne après pesée au moyen d'une canule selon la méthode citée par Moss et Ritchie (Toxicol.
Appl. Pharmacol. 17,699-707, 1970).
Espèces animales a.-Rats Pour les expériences d'absorption pulmonaires, on utilise des rats Sprague Dawley fournis par Charles River (Calco) pesant entre 200 et 250 g. Les animaux sont traites selon les méthodes décrites ci-dessus avec 0,25 mg/kg de poids du corps de chaque composés marqué.
Après traitement, les animaux sont logés dans des cages métaboliques. Les échantillons de sang sont obtenus 2,4, 6,
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8 heures après le traitement. La radioactivité totale des échantillons est comptée au moyen d'un scintillateur de
Tricarb (Packard). b.-Lapins
Des lapins mâles de Nouvelle Zélande pesant entre 1,8 et
2,0 kg sont traités comme décrit au paragraphe a.-avec les composés décrits ci-dessus.
Résultats a. - administration d'une solution aqueuse par intubation tra- chéenne
La disponibilité biologique des composés à examiner après
5 heures à partir du traitement, sur la base du calcul de la surface en-dessous de la courbe de diminution du plasma apparaît être similaire pour les deux espèces animales. On note seulement des différences très légères entre les rats et les lapins. On trouve donc que la disponibilité biologique des composés à examiner est comparable.
Les résultats indi- qués sur le tableau 1 sont exprimés en pourcentage par rapport à la voie intra-musculaire prise comme représentant
100%. b. - administration de solutions aqueuses nébulisées par intuba- tion trachéenne
La disponibilité biologique, êgalement exprimée en pourcen-
EMI18.1
tdge par rapport à la voie intra-musculaire prise comme représentant 100%, est encore trouvée comme étant semblable pour l'intubation trachéeen des deux espèces et pour les différents composés à examiner.
On note, cependant, une absorption pulmonaire accrue des composés après nébulisation des solutions aqueuses (voir tableau 2). c. - administration d'un mélange solide atomisé sec par intubation trachéenne
11 est apparent, d'après les calculs de disponibilité biolo- gique après administration des poudres atomisées sèches, que cette méthode garantit la meilleure absorption pulmonaire des composés à examiner. Le tableau 3 montre que la disponibilité biologique 5 heures après l'administration par inhalation est semblable à la disponibilité biologique observée après injection intra-musculaire.
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EMI19.1
TABLEAU 1 Disponibilité biologique après 2 à 5 heures à partir de 1'administration de 0,25 mg/kg par intubation trachéenne
Solutions aqueuses des composés à examiner
EMI19.2
<tb>
<tb> Composés <SEP> Rat <SEP> Lapin
<tb> Administrés <SEP> (voie <SEP> intra- <SEP> (voie <SEP> intra- <SEP>
<tb> musculaire <SEP> = <SEP> 100) <SEP> musculaire <SEP> = <SEP> 100)
<tb> . <SEP> monosialoganglioside <SEP> 10,5 <SEP> 12
<tb> . <SEP> mélange <SEP> de <SEP> ganglioside <SEP> 9,8 <SEP> 11
<tb> . <SEP> ester <SEP> interne <SEP> de <SEP> monosialoganglioside <SEP> 12 <SEP> 11,5
<tb> .
<SEP> esters <SEP> internes <SEP> de
<tb> mélange <SEP> de <SEP> gangliosides <SEP> 10 <SEP> 11
<tb>
TABLEAU 2 Disponibilité après 2 à 5 heures à partir de 1'administration de 0,25 mg/kg par intubation trachéenne
Solutions aqueuses nébulisées des composés à examiner
EMI19.3
<tb>
<tb> Composés <SEP> Rat <SEP> Lapin
<tb> Administrés <SEP> (voie <SEP> intra- <SEP> (voie <SEP> intramusculaire <SEP> = <SEP> 100) <SEP> musculaire <SEP> = <SEP> 100)
<tb> . <SEP> monosialoganglioside <SEP> 34 <SEP> 22
<tb> . <SEP> mélange <SEP> de <SEP> ganglioside <SEP> 31 <SEP> 35
<tb> . <SEP> ester <SEP> interne <SEP> de <SEP> monosialoganglioside <SEP> 35 <SEP> 33,5
<tb> .
<SEP> esters <SEP> internes <SEP> de
<tb> mélange <SEP> de <SEP> gangliosides <SEP> 31,8 <SEP> 33
<tb>
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TABLEAU 3 Disponibilité après 2 à 5 heures à partir de l'administration de 0,25 mg/kg par intubation trachéenne
Poudres sèches atomisées des composés à examiner
EMI20.1
<tb>
<tb> Composés <SEP> Rat <SEP> Lapin
<tb> Administrés <SEP> (voie <SEP> intra- <SEP> (voie <SEP> intra- <SEP>
<tb> musculaire <SEP> = <SEP> 100) <SEP> musculaire <SEP> = <SEP> 100)
<tb> . <SEP> monosialoganglioside <SEP> 85 <SEP> 87
<tb> . <SEP> mélange <SEP> de <SEP> ganglioside <SEP> 88 <SEP> 88
<tb> . <SEP> ester <SEP> interne <SEP> de <SEP> monosialoganglioside <SEP> 80 <SEP> 85
<tb> .
<SEP> esters <SEP> internes <SEP> de
<tb> mélange <SEP> de <SEP> gangliosides <SEP> 82 <SEP> 84
<tb>
A partir des résultats indiqués ci-dessus, on peut voir que 1'administration par inhalation des gangliosides, des dérivés d'esters internes des gangliosides ou de leurs mélanges procurent une bonne disponibilité biologique des composés, sensiblement comparable à celle obtenue par administration intra-musculaire. Ceci est inattendu puisqu'il n'était pas connu jusqu'a maintenant que ces composés étaient capables d'attendre Ie flux sanguin en pénétrant à travers les membranes biologiques du système respiratoire.
Cette découverte est à la fois inattendue et importante parce qu'elle montre que les composes peuvent être efficacement et facilement administrés par inhalation en utilisant des suspensions des solutions ou des poudres solides des composés utilisables avec des propulseurs liquides ou pressurisés de façon diverses ou compris dans des flacons pour pulvérisation. De cette facon, les composés de gangliosides ou leurs dérivés, particulièrement les dérivés esters internes, peuvent être administrés par des moyens plus surs, plus faciles et plus commodes que les voies utilisées précédemment d'injection ou d'infusion. Les patients individuels peuvent, ainsi, s'administrer les composés euxmêmes sans 1'aide de personnel médical ou d'autres fournitures médica- les.
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Par conséquent, la présente invention procure un kit ou un dispositif pour administration par inhalation grace auquel les composés gangliosides ou leurs dérivés d'esters internes ou leurs mélanges peuvent être administrés au moyen d'un dispositif de pulvérisation nasale, d'un dispositif de pulvérisation sous pression ou d'une capsule contenant une poudre pour administration par inhalation.