Procédé de purification de la substance Fr-1923.
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La substance FR-1923 est un antibiotique connu qu'on iso-
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Streptomyces, ainsi qu'il est décrit, par exemple, dans la
DOS n[deg.] 2.242.699.
Dans ce brevet, on a décrit des procédés comportant l'utilisation de charbon actif, de résine échangeuse d'ions et de "Sephadex DEAE" (marque déposée de Pharmacia Co.) pour isoler et purifier la substance FR-1923 à partir d'un bouillon de fermentation.
Cependant, les procédés connus n'ont pas abouti à des résultats satisfaisants lors de la fabrication industrielle de la substance FR-1923,étant donné que tous ces procédés exigent un nombre relativement important d'étapes pour isoler et purifier la substance FR-1923, de sorte que le rendement global
en antibiotique est relativement médiocre.
A la suite d'études très poussées, la demanderesse a maintenant trouvé un procédé nouveau de purification de la substance FR-1923 constituant l'une des étapes de sa récupération et permettant d'obtenir ladite substance FR-1923 avec un rendement plus important que par les procédés connus. D'autre part, le nouveau procédé est plus simple,d'une mise en oeuvre plus commode et plus économique à l'échelle industrielle,car la résine usée peut être régénérée et réutilisée.
En conséquence, la présente invention a pour objet un procédé nouveau de purification de la substance FR-1923 à l'aide d'une résine d'adsorption macroporeuse non-ionique,ainsi que de réaliser un procédé nouveau pour purifier ladite substance FR-1923, procédé par lequel on la récupère avec un rendement plus élevé que par les procédés connus,et,enfin,l'invention a pour objet un procédé plus simple, plus commode et plus économi-
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Comme on vient de le dire, l'invention concerne un procédé nouveau de purification de la substance FR-1923, utilisant une résine d'adsorption macroporeuse non-ionique, ledit procédé comprenant deux techniques différentes interchangeables d'utilisa- <EMI ID=5.1>
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une solution aqueuse contenant la substance FR-1923 et des impuretés.avec une résine d'adsorption macroporeuse non-ionique, puis à éluer la substance FR-1923 adsorbée avec, par exemple, un système solvant hydrophile (cette technique étant appelée ci-après "procédé A"). La seconde technique consiste à mettre
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et des impuretés avec une résine d'adsorption macroporeuse nonionique saturée de substance FR-1923 afin d'adsorber les impuretés, puis à récupérer la substance FR-1923 de la solution en circulation (cette technique étant appelée ci-après "procédé B"). On décrira maintenant en détail les procédés A et B.
Procédé A
Selon le procédé A conforme à l'invention, pour purifier la substance FR-1923, on met en contact une solution aqueuse contenant la substance FR-1923 ainsi que les impuretés avec une résine d'adsorption macroporeuse non-ionique, puis on élue la substance FR-1923 adsorbée en utilisant, par exemple, un système solvant hydrophile.
Les résines d'adsorption macroporeuses non-ioniques qu'on utilise selon l'invention peuvent être des résines réticulées dont la structure de base est aromatique. Parmi les résines préférées, on citera les polymères de styrène réticulés avec du divinylbenzène. Comme exemples de telles résines, on indiquera les produits "Amberlite" XAD-1, XAD-2, XAD-4, XAD-7 et XAD-8
(marque déposée de Rohm à Haas Co.); "Diaion" HP 10, HP 20,
HP 30, HP 40 et HP 50 (marque déposée de Mitsubishi Kasei Co., Ltd) et "Hitachigel" No. 3010 (marque déposée de Nissei Sangyo Co., Ltd.).
La variante A du procédé de purification de la substance FR-1923 à l'aide de la résine d'adsorption macroporeuse nonionique est applicable à toute solution aqueuse contenant la substance FR-1923 ainsi que des impuretés. Parmi les solutions de ce type, on mentionnera un filtrat du bouillon de culture
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solution de culture pré-extraite ainsi qu'une solution aqueuse contenant une matière solide brute qui renferme la substance FR-1923 (par exemple une poudre brute ou des cristaux bruts Il* obet 1,00
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culture, par une technique classique telle qu'un traitement facultatif du filtrat avec un solvant d'extraction approprié et/ ou par adsorption sur charbon actif.
Quand on utilise un filtrat de culture, on a intérêt à utiliser une solution de culture facultativement pré-extraite, ladite solution facultativement pré-extraite étant mise en contact avec une résine d'adsorption macroporeuse non-ionique
de façon usuelle et de préférence dans une colonne contenant un lit de résine.
Le traitement de la solution aqueuse contenant la substance FR-1923 en mélange avec des impuretés par la résine d'adsorption non-ionique se fait avantageusement à un pH de 2 à 7 et,
de préférence de 4 à 6. On peut obtenir les pH acides désirés en utilisant un acide quelconque/par exemple un acide organique tel que l'acide oxalique ou,mieux encore,un acide'minéral tel que l'abide chlorhydrique,phosphorique ou sulfurique.
D'autre part, on effectue avantageusement le traitement
de la solution aqueuse contenant la substance FR-1923 en mélange avec des impuretés à l'aide d'une résine d'adsorption nonionique, quand les impuretés sont des sels minéraux comme le chlorure de sodium, le diphosphate de sodium ou l'orthophosphate disodique.
Dans un tel procédé, on met en contact la solution aqueuse contenant la substance FR-1923 en mélange avec des impuretés avec une résine d'adsorption macroporeuse non-ionique pour adsorber la substance FR-1923 de façon usuelle, par exemple en opérant en discontinu ou sur colonne, après quoi on élue la substance FR-1923 adsorbée de la résine à l'aide, par exemple, d'un système solvant hydrophile.
Parmi les systèmes solvants hydrophiles qu'on utilise pour l'élution de la substance FR-1923 de la résine, on citera
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l'acétone ou la méthyléthyl-cétone) et les alcanols inférieurs
(par exemple le méthanol,- l'éthanol, le n-propanol, l'isopropanol, le n-butanol et l'isobutanol). On peut également utiliser des mélanges des dialkyl-cétones inférieures et des alcanols inférieurs. On peut aussi utiliser un mélange d'eau ou d'un
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exemple, l'acétate de méthyle, d'éthyle ou de butyle) avec <EMI ID=14.1>
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lume important d'eau et une solution aqueuse alcaline (de préférence à pH 8 à 13). On traite l'éluat ainsi obtenu par des moyens usuels tels que la concentration, le réglage du pH, la lyophilisation et la recristallisation,et on obtient alors une substance FR-1923 à l'état cristallisé, dont le degré de pureté est suffisant pour la plupart des utilisations médicales. Procédé B
Selon le procédé B, pour purifier la substance FR-1923
on met en contact une solution aqueuse contenant cette substance FR-1923 et des impuretés avec une résine d'adsorption macroporeuse non-ionique préalablement saturée avec de la substance FR-1923 pour adsorber les impuretés et on récupère la substance FR-1923 à partir de la solution en circulation.
Cette technique est basée sur le fait que la capacité d'adsorption d'une résine d'adsorption non-ionique vis-à-vis
de la substance FR-1923 est plus faible que vis-à-vis des impuretés spécifiques telles que des matières colorantes provenant du bouillon de fermentation et l'isomère de la substance FR-1923. En utilisant les différences d'affinité de la résine d'adsorption macroporeuse non-ionique respectivement pour la substance FR-1923 et les impuretés spécifiques, on peut adsorber sélectivement les impuretés spécifiques dans la résine saturée par la substance FR-1923 à partir d'une solution aqueuse contenant ladite substance FR-1923 ainsi que les impuretés, puis on récupère la substance FR-1923 à partir de la solution en circulation.
La capacité d'adsorption d'une résine d'adsorption macroporeuse non-ionique pour. la substance FR-1923 varie selon l'état de la solution aqueuse contenant cette substance FR-1923 et les impuretés ainsi que selon la nature de la résine macroporeuse non-ionique. Des exemples de la capacité d'adsorption d'une résine macroporeuse non-ionique vis-à-vis de la substance FR-1923, sont donnés par les résultats suivants qu'on obtient par la mise .en contact d'une solution tampon de phosphate 0,2M
(pH 4) contenant la substance FR-1923 avec la résine.
Exemples de la capacité d'adsorption vis-à-vis de la substance FR-1923
env. 10 g/litre de "Diaion" HP 20
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tion aqueuse qui contient cette substance FR-1923 avec une résine d'adsorption macroporeuse non-ionique, ladite solution étant de préférence neutre ou légèrement alcaline.
En ce qui concerne les résines macroporeuses non-ioniques utilisables, elles peuvent être les mêmes que celles qui ont été énumérées à propos du procédé A.
La variante B du procédé de purification de la substance FR-1923 à l'aide d'une résine d'adsorption macroporeuse nonionique est applicable à toute solution aqueuse contenant la substance FR-1923 et des impuretés, en particulier les diverses impuretés qui ont été indiquées à propos du procédé A. En particulier,lorsque les impuretés sont des matières colorantes ou un isomère de la substance FR-1923, dans la solution aqueuse, le procédé B donne des résultats plus efficaces.
Quand on met en contact une solution aqueuse contenant la substance FR-1923 et des impuretés avec une résine d'adsorption macroporeuse non-ionique saturée avec la substance FR-1923,
on ne peut plus adsorber la substance FR-1923 dans cette résine et, au contraire, la résine adsorbe sélectivement les impuretés.
Le volume de la résine d'adsorptiçn macroporeuse nonionique qu'on doit utiliser dans cette version du procédé varie selon la teneur en substance FR-1923 de la solution aqueuse qui la contient ainsi que les impuretés,et selon la nature de la résine qu'on désire utiliser, ce volume étant habituellement de 1 litre par 100 à 500 g de substance FR-1923 dans la solution aqueuse.
On récupère la substance FR-1923 à partir de la solution en circulation qu'on obtient en mettant en contact une solution aqueuse renfermant la substance FR-1923 et des impuretés avec la résine d'adsorption macroporeuse non-ionique saturée avec la substance FR-1923. On peut effectuer la récupération par des moyens classiques, par exemple le réglage du pH, le traitement avec du charbon actif, la concentration, la lyophilisation et
la recristallisation, ce qui donne une substance cristalline FR-1923 dont la pureté est souvent suffisante pour les utilisations comme médicament.
D'autre part, on met en contact une solution aqueuse contenant la substance FR-1923 et des impuretés avec une résine
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avec un petit volume d'eau et on obtient de la substance FR-1923 provenant de l'espace entre la résine et la colonne.
On peut régénérer la résine épuisée par des techniques traditionnelles, par exemple par lavage de.la résine avec une solution aqueuse alcaline relativement forte ou une solution alcaline mixte eau-alcool.
Le procédé B est supérieur au procédé A plus commode dans la pratique et plus économique à l'échelle industrielle pour les motifs suivants : le procédé B n'exige pas d'étape d'élution de la substance FR-1923 de la résine et le volume de la résine nécessaire pour la purification dans le procédé B est inférieur
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récupération et le degré de pureté de la substance FR-1923 récupérée soient presqu'identiques dans les deux cas.
Les essais suivants permettent de comparer le procédé A et le procédé B lors de la purification de la substance FR-1923.
On a effectué les essais comparatifs en utilisant les mêmes cristaux bruts de la substance FR-1923 et la même résine, avec le même volume dans les deux cas,mais le volume des cristaux bruts de la substance FR-1923 dans le procédé A a été déterminé selon l'affinité de la résine avec la substance FR-1923 et le volume de cristaux bruts de la substance FR-1923 dans le procédé B est d'environ 20 fois celui des cristaux dans le procédé A.
Essais
(i) - Capacité d'adsorption de "Diaion" HP 20 vis-à-vis de la
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On dissout 1,4 g de sel sodique de substance FR-1923
(pureté 95%) dans 1 litre d'une solution tampon de phosphate 0,2 M (pH 4,0). On ajuste le pH de la solution à 4,0 avec de l'acide chlorhydrique pentanormal sous agitation. On fait passer
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à travers une colonne remplie de'*100 ml de "Diaion" HP 20
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ge de la résine: 160 mm) à une vitesse de VS-1 (VS est une abréviation de vitesse spatiale). On recueille la solution en circulation par fractions successives de 100 ml. On détermine la teneur en substance FR-1923 dans la solution en circulation <EMI ID=23.1>
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tration de la substance FR-1923 dans la solution en circulation atteint la même valeur de concentration que celle dans la solu-
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(II) - Purification de la substance FR-1923 par le procédé A :
On met en suspension 9,5 g de cristaux bruts de la substance FR 1923 (contenant 7,9 g de FR-1923) dans 2,5 litres d'eau. On ajuste le pH de la suspension à 7,5 avec une solution aqueuse hexanormale d'hydroxyde de sodium pour mettre les cristaux en solution. On règle ensuite la solution à pH 6,0 avec de l'acide chlorhydrique hexanormal et on ajoute 150 g de chlorure de sodium et suffisamment d'eau pour obtenir un total de 3 litres de solution. On fait passer cette solution à travers une colonne remplie avec 1 litre de "Diaion".HP 20 (diamètre intérieur de la colonne: 77 mm, hauteur de remplissage de résine: 230 mm)
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lonne avec de l'eau. On recueille la fraction active (1950 ml) et on la concentre sous pression réduite. On ajuste le pH du concentré à 2,2 avec agitation et on laisse au repos pendant la nuit dans le réfrigérateur pour former des cristaux. On recueille les cristaux par filtration et on sèche. Les résultats
sont résumés dans le tableau ci-après.
(III) - Purification de la substance FR-1923 par le procédé B:
On met en suspension dans 2 litres d'eau 200 g de cristaux bruts de la substance FR-1923 (contenant 158 g de cette substance), ces cristaux bruts étant les mêmes que ceux utilisés dans l'essai (il). On ajuste le pH de la suspension à 7,2 pour dissoudre les cristaux. On fait passer la solution dans une colonne remplie de 1 litre de "Diaion" HP 20 saturée avec la substance FR-1923 (diamètre intérieur de la colonne: 77 mm, hauteur de remplissage de résine: 230 mm) à une vitesse VS=1. On fait passer 4 litres d'eau à travers la colonne. On recueille 4500 ml
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te à la solution ainsi obtenue de l'eau jusqu'à un total de
16 litres. On ajuste le pH de la solution à 2,5 avec agitation et on laisse au repos dans un réfrigérateur pendant une nuit <EMI ID=29.1>
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Il ressort de ces résultats que le volume de la substance FR-1923 qu'on traite par le procédé B est d'environ 20 fois plus grand que celui qu'on traite par le procédé A, bien que la pureté et la récupération de la substance FR-1923 soit sensiblement identiquesdans les deux procédés.
Les exemples suivants,dans lesquels toutes les proportions sont en poids,servent à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée :
EXEMPLE 1
A un bouillon de culture préparé en cultivant Nocardia uniformis var. tsuyamanensis ATCC 21806 à 30[deg.]C pendant 120 heures dans 150 litres d'un milieu rutritif qui contient 3% de
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phosphate monopotassique, 1,43% de phosphate disodique dodécahydraté, 0,5% de chlorure de magnésium heptahydraté, on ajoute 6% de "Radiolite" (marque déposée pour un adjuvant de filtration vendu par Showa Kagaku Kogyo Co., Ltd.), puis on filtre; on fait passer 3 litres du filtrat obtenu (contenant 3030 mg de substance FR-1923) à travers une colonne remplie d'une résine d'adsorption macroporeuse non-ionique "Diaion" HP 20 (diamètre intérieur de la colonne: 8 cm, hauteur de remplissage de résine:
26 cm) à une vitesse VS=1. On lave la colonne avec de l'eau, puis on élue la substance FR-1923 avec une solution aqueuse à
20% de méthanol, on concentre 3 litres de l'éluat ainsi obtenu sous pression réduite, on ajuste le pH à 2,5, on laisse la <EMI ID=32.1>
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à travers une colonne remplie d'une résine d'adsorption macropc-
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colonne: 3,6 cm, hauteur de remplissage de résine: 30 cm) à une vitesse VS=1. Après lavage de la colonne avec de l'eau, on élue la substance FR-1923 avec une solution aqueuse à 20% d'acétone. On concentre 600 ml d'éluat sous pression réduite, on ajuste à pH 2,0 avec de l'acide chlorhydrique dilué et on laisse au repos dans un réfrigérateur, ce qui donne 365 mg de cristaux incolores de la substance FR-1923.
EXEMPLE 3
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tenu sensiblement par le même procédé que dans l'exemple 1 à travers une colonne de résine non-ionique "Diaion" HP 20 (diamètre intérieur de la colonne: 30 mm, hauteur de remplissage de résine:
160 mm) à une vitesse VS=1. On lave la colonne avec de l'eau, puis on élue la substance FR-1923 avec une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium (pH 12,0). On recueille 600 ml de la fraction active obtenue et on concentre jusqu'à 15 ml sous pression ré-
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tout en agitant, puis on laisse la solution au repos pendant
24 heures dans un réfrigérateur et on obtient 360 mg de cristaux incolores de la substance FR-1923.
EXEMPLE 4 ...
On met en suspension dans 6,2 litres d'eau 20 g de poudre brute (contenant 10,2 g de substance FR-1923). On ajuste le pH
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xyde de sodium, puis on ajoute 50 g de chlorure de sodium. On fait passer 1^'solution à travers une colonne de résine macroporeuse non-ionique "Diaion" HP 20 (diamètre intérieur de la colonne: 87 mm, hauteur de remplissage de résine: 520 mm) à une vitesse VS=1. On lave la colonne avec de l'eau puis on élue
<EMI ID=38.1> <EMI ID=39.1> laisse au..repos pendant une nuit dans un réfrigérateur et on obtient 10,0 g de cristaux incolores de substance FR-1923. EXEMPLE 5
On met en suspension dans 360 ml d'eau 18 g de poudre brute de FR-1923 (contenant 10,2 g de substance FR-1923), puis on ajuste le pH de la suspension à 7,0 avec une solution aqueuse hexanormale d'hydroxyde de sodium pour dissoudre la poudre brute. On fait passer la solution à travers une colonne remplie de résine macroporeuse non-ionique "Amberlite" XAD-8 (diamètre intérieur de la colonne: 30 mm, hauteur de remplissage de résine: 160.mm) saturée avec FR-1923 à une vitesse VS=1, puis on fait passer 400 ml d'eau à travers la colonne. De cette solution, on.recueille 700 ml de fractions actives et on concentre la solution sous pression réduite à un volume total de 200 ml.
On ajuste le pH du concentré obtenu à 2,5 avec une solution hexanormale de HC1, sous agitation,et on laisse au repos dans un réfrigérateur pendant 24 heures, pour obtenir 10,13 g de cristaux incolores de substance FR-1923.
EXEMPLE 6
On met en suspension dans 360 ml d'eau 18 g de poudre brute de FR-1923 (contenant 10,2 g de substance FR-1923)
et on ajuste le pH à 7,0 avec une solution hexanormale aqueuse d'hydroxyde de sodium pour dissoudre la poudre brute. On fait passer la solution dans une colonne remplie de résine macroporeuse non-ionique "Amberlite" XAD-4 (diamètre intérieur de la colonne: 30 mm, hauteur de remplissage de résine: 160 mm) sa-
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de fractions actives provenant de la solution en circulation et on concentre la solution-sous pression réduite jusqu'à un volume de 350 ml. On ajuste le pH du concentré obtenu à 2,5 avec de l'acide chlorhydrique en.solution hexanormale, tout en agitant, et on laisse au repos dans un réfrigérateur pendant 24 heures, ce qui permet d'obtenir 9,41 g de cristaux incolores de la substance FR-1923.
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On met en suspension dans 380 ml d'eau 19 g de poudre bru- <EMI ID=43.1>
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hexanormale d'hydroxyde de sodium. On. fait passer la solution à
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que "Amberlite" XAD-7 (diamètre intérieur de la colonne: 30 mm, hauteur de remplissage de résine: 160 mm) saturée par la substance FR-1923 à une *'vitesse VS=1, puis on fait passer à travers la colonne 400 ml d'eau. On recueille 700 ml de fractions actives de la solution en circulation, puis on ajuste le pH de la solution à 2,5 avec de l'acide chlorhydrique hexanormal tout en agitant et on laisse au repos dans un réfrigérateur pour donner
10,28 g de cristaux incolores de substance FR-1923.
EXEMPLE 8
On met en suspension dans 395 ml d'eau 19,75 g de poudre brute de FR-1923 (contenant 17,16 g de substance FR-1923) et on
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pentanormale d'hydroxyde de sodium pour mettre la poudre en solution. On fait passer la solution à travers une colonne de résine macroporeuse non-ionique "Diaion" HP 20 (diamètre intérieur de la colonne: 30 mm, hauteur de remplissage de résine: 160 mm)
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fait passer 400 ml d'eau à travers la colonne. On recueille 600 ml de fractions actives de la solution, puis on ajuste le pH de la solution obtenue à 2,5 avec une solution hexanormale de HC1 tout en agitant et on laisse au repos dans un réfrigérateur, ce qui permet d'obtenir 16,8 g de cristaux incolores de la substance FR-1923.
EXEMPLE 9
On fait passer à travers une colonne remplie de résine macroporeuse non-ionique "Diaion" HP 20 (diamètre intérieur de la colonne; 110 mm, hauteur de remplissage: 550 mm) à une vitesse VS=1, 15 litres d'un filtrat de culture (pH 4,0) conte,nant 14,25 g de substance FR-1923 et qu'on obtient sensiblement par la même technique que dans l'exemple 1. On lave la colonne avec 5 litres, d'eau, puis on élue la substance FR-1923 avec une
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fractions actives et on ajuste le pH à 3,3 avec de l'acide chlorhydrique hexanormal. On fait passer la solution à travers une colonne d'alumine (acide, diamètre intérieur de la colonne: 46 mm, hauteur de remplissage d'alumine: 300 mm). On lave la colon-ne avec 500 ml d'eau, puis on élue avec
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cueille 1800 ml de fractions actives et on concentre sous pression réduite à un volume de 800 ml. On ajuste le pH du concentré à 2,2 avec une solution hexanormale de HC1 en agitant puis on-laisse au repos dans un réfrigérateur pendant une nuit ce qui permet d'obtenir 11,94 g de cristaux incolores de substance FR-1923.
EXEMPLE 10
On fait passer à travers une colonne de résine macroporeuse non-ionique "Diaion" HP 20 (diamètre intérieur de la colonne: 140 mm, hauteur de remplissage de résine: 600 mm) à une vitesse VS=1, 30 litres d'un filtrat de culture (pH 4,0) contenant 32,4 g de substance FR-1923, qu'on obtient sensiblement comme dans l'exemple 1. On lave la colonne avec 10 litres d'eau, puis on élue la substance FR-1923 avec une solution aqueuse 0,01 N d'hydroxyde de sodium. On recueille 30,1 litres de fractions actives et on ajuste le pH à 3,3 avec du HC1 6N. On fait passer la solution à travers une colonne d'alumine (acide, diamètre intérieur de la colonne: 77 mm, hauteur de remplissage d'alumine: 440 mm). On lave la colonne avec 2 litres d'eau, puis on élue la substance FR-1923 avec une solution aqueuse de diphosphate de potassium 0,3 M.
On recueille 12,3 litres de fractions actives, puis on concentre sous pression réduite à un volume de 1600 ml. On ajuste le pH du concentré à 2,2 avec du
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gérateur pendant une nuit et on obtient 25,95 g de cristaux incolores de substance FR-1923.
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1 - Procédé de purification de la substance FR-1923, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact une solution aqueuse contenant de la substance FR-1923 et des impuretés avec une résine d'adsorption macroporeuse non-ionique.