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Procédé de préparation d'un vaccin adjuvant stabilisé
D'une façon générait, par vaccin adjuvant, on entend un Vaccin d'un. substance à activité antigène additionnée .'au- trot substances qui augmentent le pouvoir immunisant de l'asti gène.
En principe, la transformation d'un antigène dans un milieu aqueux en un vaccin adjuvant peut s'effectuer avec afin* porte quel Vaccin liquida. mais s'effectuera surtout lorsque d'autre. formes d'application de l'antigène n'engendrent qu'une immunité Insuffisante.
On! tome fréquemment utilisée de vaccin adjuvant consiste en une Pulsion d'une suspension aqueuse de l'antigone, appelée liquide de vaccin, dans une huile appelée huile de vac- cin, émulai on qui contient un émulsifiant eau dans huile, appe-
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lé émulsifiant ,/. C'est un toi vaccin que l'on envisage loi lorsque, dans la suite du mémoire, il est question d'un vaccin adjuvant.
Un bon vaccin adjuvant doit satisfaire a plusieurs conditions qu'il est difficile de réaliser simultanément en pra-
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tique, C'est ainsi que l'adjuvant prtt doit présenter une ttabi- lité physique longue durée afin de permettre le stockage pendant une longue période. Cette condition doit être satisfait* également '
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à des températures comprises entre 37 et 41* C, afin d'assurer une bonne stabilité de l'émulsion injectée dans le corps.
En effet, l'injection, forme dans le corps un dépôt du vaccin, de- pôt dont les composants de l'adjuvant sont étrangers au corps et ' provoquent une activité accrue de l'appareil formateur d'anti- corps, surtout aussi longtemps que le dépôt existe tel quel dans le corps.
De plus, surtout dans le cas d'application vétérinaire, le vaccin adjuvant doit pouvoir être injecté également à basse température extérieure, ce qui requiert une faible viscosité.
Enfin, les composants de l'adjuvant doivent être non toxiques.
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Ces conditions limitent le choix des huiles et eaul- sitiants à utiliser* C'est ainsi que parmi, les huiles oonnuoij les huiles saponifiables n'entrent pas en ligne de compte étant donné qu'elles se dissocient trop rapidement dans le corps. Com-
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me huiles de vaccin on utilise uniquement des huiles non toxiques, j non saponifiables, en particulier des hydrocarbures minutieuse-
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ment débarrassés de composants aromatiques et à point d'ébulli" tion compris entre 200 et 400'C.
De plus, la viscosité de l'huile doit être adaptée aux conditions de possibilités d#injeation in- posées au vaccin adjuvant. C'est ainsi que la viscosité d'un
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vaccin adjuvant, se prêtant bien à l'injection, devra $tre tom- prise entre 5 et 20 op et de préférence être environ 1S ap.
Pour la préparation de vaccin adjuvant, on dispose dans le comtneroe
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d'huiles spécialss, dites huiles de Vaccin* ¯ La choix de l'eaulaifiant est particulièrement impor- tant tant en ce qui concerné la stabilité que la non-toxicité du vaccin, En pratiqua, de choix est resté limité à quelques*
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uns parmi lesquels on peut aentionnef les MM" ou polyesters d'un acide iras, saturé ou non, contenant Il à 29 itestt de car* bonot des polyalcools à 3-12 atomes de carbone et dot'groupts 3-8 hydroxyliques tels que le sesquioldate de urbittnop le Bono- lauréate de eorbitane, le monopalmitate de ètsrbitane, le mono.
stéarate de sorbitanej le aono-oléate da sorbitm*p le mono- o3.ôste de mannide ou le trl-oléatt de eorbitane. (Il y a lieu dé noter que lorsque dans ce qui précède et dans ce qui suit, on cite des valeur* limites par exemple 12-20, lee deux valeurs doî-1 vent être considérées comme appartenant aux limites de la gamme indiquée),
Les vaccins adjuvants eau dans huile connus présentent
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généralement au bout d'un certain temps de conservation$ une notable séparation d'huile où 4o dissocient après un certain temps, et, de plus, leur viscosité devient souvent trop élevée.
13r* recherches effeetuoea en vue d'améliorer cette situation tua rent rendues difficiles par la fait que plusieurs eau a trou- vent cette faible stabilité.
C'est ainsi que la Stabilité de 1 'émulai on peut être
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Influencée par le typa ddmulxvt, la rapport des poids spéci- tiques de la phase eau et de la phase huile, la grandeur des particules tant de la phase émulsion que des substances solides misas en suspension de la phase eau,
et en outre de la concen- tration en électrolyte et en albumine dans la phase aqueuse
La Demanderesse a constaté que le problème complexe @ mentionné au paragraphe précédent peut être résolu par une seule disposition et que la mise en oeuvre de cette disposition per- met de préparer tant un vaccin adjuvant mieux stabilisé qu'un vaccin adjuvant à plus basse viscosité,
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Dans sa forme la plue senti 11*, l'invention *on
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siitt dans le fait que, comme 'mu1ltian'l on utilise un élan* se d'un émulai fiant H/8 non toxique et d'un '1.1t1ant VII non toxique* ce dernier émulai fiant formant,
en volugoj 10 à 20% du mélange total 4'dmul.1t1ant. Pour déterminer les imuloi- fiantx t utiliser, on peut recourir au système de classification des émulsifiante suivant William 04 Or1tt1n . l'aide des non-
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bras H.L.B. défini* par cet auteur (hydrophile-lipophile balane
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ce)$ système qui est publié dans Journal of th* Society of Cosmetio Chemistau 1, 311-326 (1949). Dans le aug d'utilisation
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de ce système do classification, la valeur H.L.B. du mélange
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d'émulsifiants doit être 4S colle de l"mul.1t1ant Euh 1-8 et oelle de l'4mula1tiant HIE de z..1$.
Comme énulsifiants Eln, on peut utiliser entre autres les mono ou polyesters précités' dun acide gras à 12-20 atomes de carbone et un polyaloool à 3-12 atomes de carbone et zus grou- pas hydroxyliquest En général, ce type d'4mull1t1antl a une bas-
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se valeur H.L.B. Parai les émulsifiants à basse valeur H.L.B. on peut
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mentionner par exemple les mono-, les bi- ou les trt-etters des acides gras précités avec du sorbltanop du nannitane, du mannite, du glyodrol ou des mélangea de ces esters, par exemple les ses quiesters.
Des exemples de ces *stars sont le mnoutéarate de sorbitane, le tristéarate de sorbîtanop le tonopalsiitate de sorte bitane, le dipalmitate de sorbitane, le tr1pAlm1tat. de sorbe- . tane, la sesquientdarate de acrrbitana, ou le aanclaurata de .or- bitane, le dilaurate de aorbitane, le trilaurate da sorbitanep le mono-oléate de sorbitane,, le diolêate de sorbitane,, le trio- ldate de sorbitanop la Mnoatearate de mannitane, le diatearate do mannitanop le trilt6ar.t.
de mannitane, le monopaloitate de mannitant, le dipalmitate de mannitane, le tripalmitate de man- nitane,, le monolaurate de mannitane, le dilaurate de mannitane, le trilaurate de mnnnitane, le mono-oléate de aann1tane, le
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dioléate de mannitane, le tricldate de aannitane, âruîîa rate de mannidup le diatéarate de xannidop la tri stéarate de mattn3da, le aonopalaitatt de aannide, le dipalaitate de nannidop le tripaliaitate de aannide, le monolaurate de mannido, la dilau" rate de sumidop le trilaurata de saannidaf le mono-ol4ate de mannîdep la dioldate de mannida, la trioldate de atmidup et les ##iquiatdtrttea de Iorbitane ou lra;aaaqutatbaraa da rni iana, le palmitate le laurate ou l'al<5ate de aannitana.
In paiou* lieri daxaal.anta résultat# ont été obtenue avec les =nouo bie ou tri*oldateater4 de mannide de sorbitant et de taannitans ou
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des aélangtt de ceux-oie En particulier, on peut mentionner le aono-oléatt de aannide (valeur H.L.B. a 4) et les sesquioliatte de sorbitant (valeur Ett4bê 3,7). De préférence, eonforaéatnt
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l'invention, on utilise du aono-oléatt de unaîdet CosMw dmulaifianta 9/±# on peut utiliser des dérivé$ de polyoxyethylene dbestera de l'un des polyalcools mentionnés ci-dessus et d'un acide gras$ éventuellement non saturé# à ia"20 atomes deL carbone.
Parmi ces derniers, on peut mentionner 1'tCi* de palaitique, l'acide stéarique, l'aeide civique, l'aeide lau. rinique ou l'acide riciniquet La chaîne de polyordtllria de ces
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émulsifiants peut avoir une longueur qui diffère d'aulaifiant à Inulst fiant. D'une façon générale, la chaîne de polyoxydthylln4 sera constituée par 10-60 groupes d'oxydthylbnoe Comme troupe da polyalcool on peut utiliser par exemple le glyedrol ou un alcool
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de sucre ou un alcool de sucre déshydraté*, tel que le sorbitant
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ou le mannitant.
Parmi ces 4-nulaitiante 9/li on peut mentionner la monolaurate de polyoxyéthylène sorbitant (valeur i..8. 13)# lt aonopaLnitane de polyoxyethylene aorbitane (valeur HtÏ..B, 1, le mono stéarate de polyoxydthyléne sorbitant (valeur R#Ltbo 14) et le aono-oléate de polyoxyethylene sorbltanes Des résultats particulièrement interesxanta sont obtenu* a l'aide de defifex de polyoxydthylenea contenant, par moldoul4j en moyenne 10 à 60 groupes Dans oaa composas, liaoide carboxylique peut $tre li< la chaîne de polyoxyethylene ou au groupe polio
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alcoolique, et les deux formes de liaison peuvent se rencontrer
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dans un seul composé* 81 l'aoide carboxylique est un acide hydroxy- eorboxylique, par exemple de l'acide riolnique,
00 groupe hydroxyo lique peut également ttre éthérisé par un groupe polyoxydthylda niques
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Par suite de son t4ible effet toxique* parmi les 4I.
.iti.nt, 1 basse valeur H#LoBo mentionnas, H y a lieu de ettie an particulier le mono-oléate de mannides Un u1.1t1ant , grande Valeur dllt H.L.D. <et le driv pci,yri7cy6thy,bni,ql:a d'huile de rixe ain contenant, en moyenne, bzz 4S groupes oxr'th11'n1qul. par molécule d'huile do ricins
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Le vaccin adjuvant préparé* conformément à l'invention contient de préférence, un mono-oléate de mannide comme 4ml tifiant E/H et eomae émulsifiant HIE de l'huile de rioin pol- ; oxydthylènique contenant, en moyenne 35 à 45 groupes exyethy" Uniques par molécule d'huile de ricin.
Il y a lieu de noter que l'huile de ricin (purifiée)
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est constituée par environ 95% d'ester d'acide tririoinolétque de glycérol.
Un vaccin adjuvant conforme à l'invention contient
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en outre une quantité de mélange "mul.it1&nt. constituant, en volume, 0,1 10% du volume d'adjuvant total.
En outre, le vaccin adjuvant conforme à l'invention est prépare, de préférence, à partir de 40 à 52% en volume de li-
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quide de vaccin aqueux, 59 9 à bzz en volume d'huile de vaccin et 0,1 à 10% en volume de mélange d$dmulaitiantue La préparation du vaccin adjuvant, s'effectue suivant des techniques connues.
C'est ainsi qu'il importe que dans chaque phase de préparation on travaille dans des conditions aseptiques.
On peut ajouter un émulsifiant H/E au liquide de
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vaccin aqueux et dnulsionner ce mélange dans l'huile de vaccin additionnée d'émulsifiant E/H. Toutefois, de préférence, le liquide de vaccin aqueux est émulsionné dans une huile de vaccin
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additionnée d'un mélange d'éMulsifiants de préférence stérilisé
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séparément.
Pour la préparation de vaccins adjuvants conformes à
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l'invention, il est recommamable d'ajouter le liquide de vaccin par parties à un mélange stérilisé d'émulsifiants et d'aile.
Déjà, pendant l'addition du liquide de vaccin au mélange stéri-
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lisé d'émulsifiant et d'huile il y a lieu d'homater et il est en outre recommandable de .procéder lentement a l'addition, faute de quoi il peut se produire une inversion de phase de l'émulsion, de sorte qu'il ne se tome pas d'émulsion Ils stable*
Le procédé conforma à l'invention entre en ligne de compte pour la transformation de tous les liquides de vaccin en vaccin adjuvant. Par liquide de vaccin, on entend ici des liquidas aqueux contenant une substance à même d'engendrer après l'in- jection, des anticorps dans l'individu en cause.
Des exemples de tels substances sont, par exemple, des virus, des bactéries, des
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protosones ou des produits de protozones at de métazones.
L'invention entre en ligne de compte pour la trans- formation en vaccins adjuvants de liquides de vaccin des virus ou bactéries suivants : virus: variole des poules, variole des moutons ou clavilée, rougeole, tant humaine que vétérinaire,
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anuooaa diseuse, fièvre aphteuse, polyomâlîtop rate, influenza, adénite, maladie des chiens, hépatite (hmat-Abp hdpatîts conta. . glosa canis, laryngo trloh61tl. infectieuse, féline disteaper, panlenoopéniop peste porcine, peste chevaline, peste bovine, bitte longue, paoudo peste des oiseaux, (New-Castle 41.....), peste des oies, tencose des poules, pleuro pneu#on1a-lik. organisme (P.P.t. 0 ) )8ptJt brucel1a mI11t.n.l. (fièvre de Malthe), brucel- la suis, bactéries du groupe Pasteurella (choiera des oiseaux), bactéries du groupe Clo.tr1d1um (botulisme), Streptocootai mierocoetti Leptospire.
L'invention est particulièrement appropriée à la pré* 1 paration d'un vaccin adjuvant Brucella aboyas faaille Me Sven 45/20 roulh.
EXMELE PP' ïtÏMM 5 jazz d'un. suspension de btotériei 1'111..bOr. ! h
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de la famille Me Ewen 45/20 rough dans de il.au distillée sté- rilisée sont homogénéisés, goutte à goutte, tout en agitant énergiquement, et dans des conditions stériles, dans un mélange stérile de 40 en? d'huile de vaccin (marque Bayol F), viscosité 9 c.p. à 37,7 C, trajet d'ébullition 314-357 C, 4,7 cm3 de mono- oléate de mannide et 0,3 eu) d'huile de ricin polyoxyéthylée con- tenant environ 40 mol. grammes d'oxyde d'éthylène par mol. gramme d'huile de ricin.
Le vaccin ainsi préparé fut conservé pendant 4 mois à 40 C, temps après lequel il était encore parfaitement stable et ne présentait aucune séparation d'huile. Lorsque, dans exactement les mêmes conditions, et avec l'utilisation des mêmes composants, mais en omettant l'huile de ricin polyoryéthylé, on réalise un second vacoin adjuvant, celui-ci présentait, âpres conservation dans les mêmes circonstances, au bout de 4 mois, 65% de séparation d'huile rapporté à la quantité d'huile minéra- le initiale, tandis que la possibilité d'injection de ce dernier vaccin était notablement moindre surtout à basse température (5-10 C).