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La présente invention est relative à de-nouvelles préparations vaccinales très utiles. Elle concerne également un nouveau procédé pour préparer des vaccins par un procédé possédant certains avantages définis vis-à-vis des procédés antérieùrs pour la fabrication de vaccins. En par- ticulier, l'invention concerne des vaccins préparés par inactivation de souches de virus infectieux par traitement des virus séparément avec de la formaldéhyde et avec de la -propiolactone. L'invention concerne égale- ment un nouveau procédé pour traiter un ou plusieurs virus infectieux à l'aide de formaldéhyde et de ss-propiolactone.
Des vaccins ont été fabriqués à partir d'une variété de virus infectieux dans le passé. Parmi ces virus,on compte non seulement les virus infectieux qui infectent les êtres humains, mais également ceux qui provoquent des maladies chez divers types d'animaux. Les procédés utilisés pour la production de ces vaccins sont décrits en détails dans la litté- rature scientifique. En général, les vaccins se préparent par culture du virus dans un animal vivant ou dans des oeufs fertilisés ou encore dans des préparations de tissus de divers types. Le virus est alors atténué ou tué par certains réactifs ou certaines forces physiques, qui sont ca- pables de supprimer ou d'éliminer l'effet virulent de l'organisme sans supprimer son aptitude à engendrer la formation d'anticorps, lorsqu'ils sont administrés à un animal.
Parmi les agents qui ont été utilisés pour le traitement de virus cultivés, on peut citer la formaldéhyde, la lumière ultra-violette, l'alcool méthylique, l'oxyde d'éthylène, la -propiolac- tone, etc...
Au cours des années récentes, des méthodes ont été mises au point pour la préparation de vaccins par les procédés généraux indiqués plus haut, en utilisant une ou plusieurs souches de virus poliomyélitiques humains. En général, la formaldéhyde a été utilisée pour l'inactivation du virus. La présente invention englobe un procédé pour la préparation de vaccins améliorés de la poliomyélite par traitement d'une ou plusieurs souches du virus poliomyélitique humain à l'aide de formaldéhyde pendant un temps et dans des conditions insuffisantes pour inactiver complètement le virus, suivi d'un traitement à l'aide de -propiolactone dans des con- ditions qui, en elles-mêmes, seraient insuffisantes pour inactiver le vi- rus de la poliomyélite.
Le vaccin ainsi produit a un degré supérieur d'an- tigénicité, en comparaison des vaccins préparés par traitement de la même souche ou d'autres souches de virus de la poliomyélitie avec de la formal- déhyde seule dans des conditions suffisantes pour tuer complètement l'or- ganisme. Le vaccin produit par le procédé suivant la présente invention est également nettement supérieur au point de vue antigénicité à un vaccin produit dans des conditions par ailleurs identiques, en utilisant-les effets inactivants de la -propiolactone.
Il est à noter que la combinaison du traitement avec de la for- maldéhyde et du traitement avec de la ss-propiolactone convient pour traiter des organismes pour la production de produits antigéniques destinés à 1' immunisation ou à la diagnose par traitement de virus, rickettsia ou bac- téries. Parmi ces matières, on peut citer le vaccin de la parotidite, le vaccin de la rougeole, le vaccin du virus de l'adénite humaine, l'encepha- lomyélite équine d'occident, l'encephalomyélite équine d'orient, le vaccin du virus de l'influenza, le vaccin de la rage, le vaccin de la variole, le vaccin de la coqueluche, etc...
Il y a lieu de noter que le procédé, qui est décrit dans le présent mémoire, avec référence particulière au vaccin de la poliomyélite, nécessitera certaine modification lors de son
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application à la fabrication d'autres préparations vaccinales ou diagno- stiques à partie de microorganismes.
Toutefois, étant donné que les pro- cédés pour déterminer la présence d'organismes vivants dans ces prépara- tions et que les procédés pour déterminer l'efficacité des préparations sont bien connus dans la technique, avec un minimum d'expérimentation 1' emploi de la combinaison de formaldéhyde et de -propiolactone peut être adapté aux propriétés de la souche'individuelle de microorganismeo Il faut ramarquer aussi que l'ordre inverse de traitement, c'est-à-dire le trai- tement consistant à utiliser d'abord la lactone, puis la formaldéhyde est également efficace. Toutefois, on préfère utiliser initialement de la for- maldéhyde.
Dans la description suivante, comme on l'a signalé plus haut, l'accent est mis sur la préparation d'un vaccin poliomyélitique et les conditions préférées pour conduire-cette préparation sont décrites, mais ces conditions peuvent subir des modifications considérables. Ainsi, pour une température donnée,dans des conditions par ailleurs identiques, un temps donné de traitement à l'aide de formaldéhyde et à l'aide de propio- lactone est optimum. Si la température est abaissée, il est ordinairement nécessaire de prolonger la durée du traitement. Si la température est 'élevée, le traitement peut être raccourci en durée.
Il est évidemment nécessaire que la température ne soit pas élevée bien au delà de 37 C,de façon que des réactions fâcheuses n'altèrent pas les propriétés antigéni- , ques précieuses de la matière vaccinale ou diagnostique. Ainsi, si une préparation virale est traitée à l'aide de formaldéhyde à 37 C pendant
2 jours pour l'amener dans un état satisfaisant pour le traitement avec de la -propiolactone, il peut être nécessaire, pour amener le virus au même stade, de le traiter pendant 3 jours, si une température de 23 est utilisée.
Bien que le virus de la poliomyélite soit actuellement cultivé de manière courante sur des cellules de rein de singe, le présent procédé peut être appliqué à des virus ou autres organismes cultivés sur une va- riété de types différents de tissus ou cultivés sur des animaux intactso
Ces méthodes sont décrites dans la littérature technique, de même que des méthodes pour séparer les organismes de tissus étrangers et d'autres ma- tières, qui sont indésirable dans le produit antigénique fini. Ainsi, le vaccin de l'encéphalite équine orientale peut être préparé en faisant pous- ser l'organisme sur des oeufs de poulets fertiles. Les embryons infectés sont séparés et broyés dans de la saumure. Ils sont alors traités avec de la formaldéhyde et avec de la ss-propiolactone, de manière à obtenir le vaccin.
Le vaccin de la parotidite est préparé sensiblement de la même manière, en infectant les oeufs dans la cavité chorio-allantoique à l'aide du virus. Le virus peut être isolé du fluide après une période d'incubation appropriée et le virus isolé peut ensuite être traité avec de la formaldé- hyde et avec de la propiolactone, de manière à obtenir le vaccins
La raison de l'action combinée de la formaldéhyde et de la pro- piolactone, en ce qui concerne leur effet sur les organismes pathogènes n'est pas élucidée.
Il est possible que le bref traitement avec de la formaldéhyde qui est appliqué dans le présent procédé entraîne un certain changement dans un organisme (tel que le virus de-la poliomyélite) sans provoquer la mort d'un pourcentage élevé des particules et sans réduire fortement l'antigénictiéde ces particules , lequel changement rend le virus beaucoup plus sensible-à l'effet destructeur de la ss-propiolactone, mais moins sensible à une perte d'antigénicité due à l'action de la ss-propio- lactone. Il est à noter que ceci ne constitue qu'une théorie et qu'il peut y avoir une autre explication au sujet de l'action combinée inattendue des deux réactifs sur les organismes.
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En tout cas, cette action inhabituelle est tout-à-fait bénéfique, en ce sens qu'elle permet la préparation de vaccins de la poliomyélite et d'autres vaccins extraordinairement efficaces. Un autre avantage découlant de l'uti- lisation dans le présent procédé réside dans le fait que le temps total requis pour le traitement du virus par les deux réactifs en succession (à savoir la formaldéhyde et la -propiolactone) est réduit de manière appré- ciable par rapport au temps qui est, par exemple, nécessaire pour le trai- tement d'une souche humaine du même virus poliomyélitique avec de la for- maldéhyde seule, pour l'amener à un stade comparable de nature non infec- tieuse.
Pour préparer un vaccin poliomyélitique humain, une ou plusieurs souches du virus sont cultivées dans un milieu contenant des cellules ani- males, qui servent d'hôte pour le viruso Bien que divers types de tissus puissent être utilisés à cette fin, l'expérience récente a montré que l'em- ploi de cellules provenant des reins de certains types de singes est par= ticulièrement utile. Des souches de singes tels que le rhésus et le cyno- molgus peuvent être utilisées à cette fin. Un contrôle soigneux de ces animaux, en vue d'acquérir la certitude qu'ils ne portent pas de maladies infectieuses qui pourraient être transférées par le vaccin, est évidemment essentiel. Des préparations cellulaires provenant des reins peuvent être obtenues par des procédés qui ont été décrits dans la littérature.
En général, après séparation des reins du tissu étranger, ils sont finement divisés et les cellules sont séparées des cellules sanguines et de divers types de tissus en lavant la préparation finement divisée avec des solu- tions de sel, dont on sait qu'elles conservent les cellules de reins dans un état sain. La séparation des cellules des autres tissus est souvent facilitée par l'emploi d'une solution diluée de l'enzyme que constitue la trypsine, cette enzyme étant utilisée dans les solutions physiologiques de sel. Toutes les opérations doivent évidemment être exécutées dans des con- ditions aseptiques, en vue d'éviter la contamination par des microorganismes étrangers.
A cette fin, divers antibiotiques, tels que de la pénicilline et de la streptomycine peuvent être ajoutés à-des concentrations appropriées aux solutions de sérum physiologique, afin d'aider à maintenir les prépa- rations exemptes de microorganismes infectants étrangerso Les suspensions de cellules de reins de singe peuvent être concentrées par centrifugation, en veillant cependant à ne pas endommager les cellules par un traitement trop vigoureux. Une concentration appropriée de cellules est alors placée dans des récipients de culture, tels que des flacons de Roux, dans une solution de sérum physiologique, telle que le milieu de Hanks, et on fait pousser les cellules dans les flacons, soumis à une agitation modérée, dans des conditions aseptiques, à une température d'environ 37 C pendant plusieurs jours, par exemple pendant 5 à 8 jours.
Pendant ce temps, les cellules forment une coucha proliférante à la surface des flacons. Le mi- lieu est alors séparé soigneusement de la couche cellulaire, les cellules sont rincées avec une solution physiologique de sel et de la solution fraîche est ajoutée. Les cellules de reins de singes sont alors traitées par une culture de la souche choisie du virus de la poliomyélite humaine.
Diverses souches de virus de la poliomyélite peuvent être utili- sées pour la préparation des vaccins suivant la présente invention, En général, il est souhaitable de cultiver séparément les souches de trois types différents de¯vaccin poliomyélitique, de façon que.les vaccins mono- valents ainsi produits puissent être combinés de manière à former un vaccin trivalent à administrer aux être humains. Les diverses souches, qui ont été utilisées dans le passé à cette fin.ou des souches fraîchement -isolées d'un type satisfaisant pourront servir.
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Les cellules infectées sont alors cultivées pendant plusieurs jours à une température d'environ 37 C. Des essais peuvent,être effectués au sujet du caractère infectieux de dilutions standards de la préparation en vue de déterminer le moment où une croissance suffisante du virus a été obtenue.
En général, environ trois à cinq jours sont suffisants pour assurer une bonne croissance. Pendant la croissance des organismes, les flacons sont soumis à une oscillation modérée. A ce moment, toutes les cellules de reins doivent avoir été détruites par le virus. Les contenus des flacons contenant le virus d'un seul type peuvent être combinés.
Après avoir combiné le contenu des flacons contenant le virus, le pHdu mélange est ajusté sensiblement jusqu'à neutralité, c'est-à-dire jusqu'à environ 6,5 à environ 7,0, La préparation est alors filtrée pour éliminer les bactéries, les agrégats de cellules et les autres grandes particules. La filtration peut s'effectuer en faisant passer la matière à travers des filtres'en verre fin, des filtres Seitz, des filtres cellu- losiques ou d'autres types appropriés de matières. Ces opérations sont évidemment exécutées dans des conditions aseptiques.
La solution filtrée est alors prête pour le traitement à l'aide de formaldéhyde dans le pre- mier stade du procédé suivant l'inventiono En général, on utilise environ 0,1 à 0,5 ml de formaldéhyde à 40% (0,04 g/1 à 0,2 g/1 de f ormaldéhyde pure) par litre de solution de virus, la quantité utilisée dépendant dans une certaine mesure de la concentration du virus. En général, les prépara- tions de virus poliomyélitique doivent avoir une concentration en virus d'environ 104 à oli particules virales par ml, cette concentration étant déterminée par dilution en série de la préparation, avec culture en tubes ou flacons sur tissu, tel que reins de singe.
Lorsqu'il est fait référence dans le présent mémoire à une "solution de formaldéhyde", il s'agit de la matière que l'on trouve dans le commerce, qui présente une concentration d'environ 40% en poids. Avant addition de cette matière aux virus, il peut être souhaitable de diluer ia formaldéhyde à l'eau et la solution virale est fortement agitée pendant l'addition de la solution diluée de formal- déhydee Bien qu'une concentration plus élevée de formaldéhyde puisse être utilisée pour l'inactivation des virus, ceci n'est généralement pas né- cessaire et n'est, en fait, pas conseillable, car l'emploi de formaldéhyde plus concentrée peut conduire à de plus grandes pertes d'antigénicité que ce n'est souhaitable.
Il est relativement simple de régler la concentration, de façon que l'inactivation initiale soit réalisée avec une perte limitée d'antigénicité et une conservation maximum des propriétés précieuses du vaccin. Le premier stade du procédé ne rend pas la préparation virale non infectieuse,contrairement aux procédés généralement en usage à présent pour la préparation de vaccins de la poliomyélite. Le traitement à la for- maldéhyde est exécuté à une température d'environ 25 à environ 40 C et, de préférence, à environ 37 C. Le traitement est poursuivi pendant environ 40 à 55 heures.
Dans les opérations commerciales où on utilise seulement de la formaldéhyde pour le traitement du virus de la poliomyélite, le traite- ment se poursuit généralement pendant au moins 5 jours, de manière à assurer une inactivation complète du virus. Pendant ce temps, une perte considérable de l'antigénicité des-préparations se produit.
Bien que, lorsqu'une concentration plus limitée de formaldéhyde (dans la gamme des eurs susindiquées) est utilisée, il ne soit pas essentiel d'opérer ainsi, la solution de virus traitée à la formaldéhyde est généralement soumise à l'action d'un bisulfite, tel que le bisulfite de sodium, pour éliminer la formaldéhyde résiduelleo La quantité de bisul- fite utilisée est fonction de la quantité de formaldéhyde originellement introduite pour traiter le virus
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Ainsi, si on utilise 0,35 ml de formaldéhyde à 40%, il faut employer approximativement 0,6 g de bisulfite de sodium.
En générale il est à con- seiller d'ajouter le bisulfite sous foime d'une solution aqueuse diluée à la solution de virus traitée,en opérant une forte agitation pour assurer un bon contacta Le virus est alors traité avec de la ss-propiolactone. A cette fin, on utilise de 0,5 à 1,5 ml environ de la lactone par litre de solution virale. Etant donné que la ss-propiolactone est une matière très réactive, elle doit être utilisée avec précautions. Bien que ceci ne soit pas essentiel, on préfère diluer la lactone en l'ajoutant à de l'eau froide juste avant le traitement des virus. La ss-propiolactone 'dans de l'eau gla- cée est alors ajoutée rapidement à la préparation virale. Tout retard accroît l'hydrolyse de la, lactone et réduit son efficacité sur les virus.
Pendant l'addition de la lactone, la préparation virale est fortement agitée. Il a été constaté que, lorsque la laotone agit sur le virus, la solution devient plus acide. Ceci se produit généralement quelques minutes après l'addition de la lactone. Un indicateur convenable pour suivre ce processus est le Rouge Phénolo L'acidité qui se manifeste pendant cette phase du procédé est, de préférence, neutralisée de manière continue ou intermittente, de façon que la solution soit maintenue sensiblement neutre.
Lorsque la, réaction est exécutée à la température préférée d'environ 37 C, le développement d'une acidité cesse ,généralement après environ 4 à 6 heures. La neutralisation s'opère avec un alcali, de préférence, de l'hy- droxyde de sodium diluéo La solution contenant les virus inactivés est généralement prête à l'emploi à ce moment. Toutefois, il est préférable de permettre au mélange de rester au repos pendant environ 12 à 14 heures encore. Pendant ce temps, la température est maintenue à environ 37 c.
Le pH est alors vérifié à nouveau et, au besoin, il est ajusté de façon à être voisin de la neutralité. La matière est stockée à basse température, de préférence à environ 4 C et divers essais sont exécutés sur des échan- tillons des virus inactivés. En particulier, la matière est testée, en vue de s'assurer que tous les virus ont été tués et que le degré élevé usuel d'antigénicité a été maintenu. Il est généralement souhaitable de combiner des virus inactivés des types le 2 et 3 dans une seule prépara- tion .Le volume de chaque type variera dans mie certaine mesure, en fonc- tion de l'activité relative des préparations individuelles. Les divers types ne sont pas combinés avant que les essais de sécurité et d'efficacité des virus particuliers traités aient été effectués.
Un stockage à basse température est conseillable, afin de maintenir l'activité de la prépara- tion à une valeur maximum. Divers agents préservatifs peuvent également être ajoutés aux préparations dans le même but. Parmi ces agents, on peut citer des matières telles que le phénol, le thiomersal, le chlorure de benzothonium, etc... Ces matières sont utilisées en faible concentration, comme indiqué dans diverses publications de la technique antérieure.
Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et ne doi- vent pas être considérés comme limitant l'invention. En fait, étant donné que de nombreuses formes d'exécution apparemment fort différentes de la présente invention peuvent être mises en oeuvre sans s'écarter de l'esprit et de la portée de cette invention, il doit être entendu que celle-ci n'est limitée que par les termes des revendications terminant le présent mémoire.
EXEMPLE I
Deux litres d'une suspension de virus actif de la poliomyélite humaine du type 1, qui a été récoltée après croissance sur des cellules de reins de singe, ont été filtrés sur un filtre de cellulose lavé initiale- ment à l'aide de solution de Hanks.
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La préparation virale avait une activité de 107 particules virulentes par ml, ainsi que l'a révélé un essai de culture sur tissu. L'opération de filtration et les autres opérations suivantes ont été exécutées dans des conditions aseptiques, le pH du mélange a été ajusté à 6,7 avant filtra- tion. Le mélange filtré a été maintenu à 37 C et, tout en l'agitant, on y a ajouté 0,35 ml d'une solution commerciale de formaldéhyde à 40% diluée dans 20 ml d'eau distillée stérilisée. Le mélange a été maintenu à 37 C pendant 48 heures. La formaldéhyde a ensuite été éliminée par addition d'une solution dans de l'eau distillée stérile de 0,61 g de bisulfite de sodium dans 10 ml d'eau stérile.
Le mélange a été agité pendant l'addition du bisulfite. 1,5ml de P-propiolactone, qui avait été stockée en glacière, a été dilué par addition de 10 ml d'eau distillée stérile glacée. Pendant l'addition, le mélange a été agité et refroidi au bain de glace. La dilu- tion a été poursuivie rapidement et la solution diluée froide a immédiate- ment été ajoutée à la suspension de virus agitée. Le temps qui s'écoule entre le début de la dilution et l'addition à la suspension de virus doit être de moins de 5 minutes. Une petite quantité d'indicateur (Rouge Phénol) incorporée à la préparation virale a permis de suivre aisément le dévelop- pement de l'acidité. Une solution diluée d'hydroxyde de sodium a été ajou- tée à intervalles réguliers pour maintenir le pH à environ 6,8 - 7,0.
En général, environ 5 heures sont nécessaires pour achever l'hydrolyse de la lactone et le développement de l'acidité* La solution de virus a ensuite été conservée à 37 C jusqu'au lendemain. Elle est alors prête à l'usage, pour immuniser des patients vis-à-vis des infections poliomyélitiques du type 1. Cette solution s'est avérée fortement antigénique au cours d'essais standards sur animaux (en comparaison d'une préparation vaccinale standard), cette antigénicité étant beaucoup plus forte que celle d'un vaccin obtenu avec de la formaldéhyde ou de la ss-propiolactone seule.
EXEMPLE II On a répété le mode opératoire de l'exemple I, en utilisant un virus poliomyélitique du type 2 (par exemple, Lansing) en concentration similaire, plutôt qu'un virus du type 1. Une troisième préparation a été obtenue en utilisant un virus du type 3 (par exemple, Saukett) de là même manière. A partir de 4 volumes de vaccin du type 1, de 3 volumes de vaccin du type 2 et de 3 volumes de vaccin du type 3, on a préparé un vaccin poly- valent. On a ajouté du chlorure de benzothonium comme agent préservatif à une concentration de 1/50.000,. Cette préparation s'est révélée très efficace pour immuniser des êtres humains contre la poliomyélite.
Le vaccin possé- dait un très haut degré d'antigénicité et un examen méticuleux d'échantil- lons n'a pas révélé la présence de particules virales infectieuses.
EXEMPLE III
Le procédé d'inactivation décrit dans l'exemple I a été répété, en utilisant une souche humaine pathogène d'adeno-virus. Le vaccin ainsi produit convient pour l'immunisation contre les infections du tractus respiratoire dues à des virus.
REVENDICATIONS.
1. Procédé pour la préparation d'antigènes immunisants et diag- nostiques, ce procédé comportant les stades consistant à soumettre une préparation aqueuse contenant des microorganismes infecteux et des antigènes séparément à l'action de formaldéhyde et à l'action de ss-propiolactone.