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La présente invention est relative à de-nouvelles préparations vaccinales très utiles. Elle concerne également un nouveau procédé pour préparer des vaccins par un procédé possédant certains avantages définis vis-à-vis des procédés antérieùrs pour la fabrication de vaccins. En par- ticulier, l'invention concerne des vaccins préparés par inactivation de souches de virus infectieux par traitement des virus séparément avec de la formaldéhyde et avec de la -propiolactone. L'invention concerne égale- ment un nouveau procédé pour traiter un ou plusieurs virus infectieux à l'aide de formaldéhyde et de ss-propiolactone.
Des vaccins ont été fabriqués à partir d'une variété de virus infectieux dans le passé. Parmi ces virus,on compte non seulement les virus infectieux qui infectent les êtres humains, mais également ceux qui provoquent des maladies chez divers types d'animaux. Les procédés utilisés pour la production de ces vaccins sont décrits en détails dans la litté- rature scientifique. En général, les vaccins se préparent par culture du virus dans un animal vivant ou dans des oeufs fertilisés ou encore dans des préparations de tissus de divers types. Le virus est alors atténué ou tué par certains réactifs ou certaines forces physiques, qui sont ca- pables de supprimer ou d'éliminer l'effet virulent de l'organisme sans supprimer son aptitude à engendrer la formation d'anticorps, lorsqu'ils sont administrés à un animal.
Parmi les agents qui ont été utilisés pour le traitement de virus cultivés, on peut citer la formaldéhyde, la lumière ultra-violette, l'alcool méthylique, l'oxyde d'éthylène, la -propiolac- tone, etc...
Au cours des années récentes, des méthodes ont été mises au point pour la préparation de vaccins par les procédés généraux indiqués plus haut, en utilisant une ou plusieurs souches de virus poliomyélitiques humains. En général, la formaldéhyde a été utilisée pour l'inactivation du virus. La présente invention englobe un procédé pour la préparation de vaccins améliorés de la poliomyélite par traitement d'une ou plusieurs souches du virus poliomyélitique humain à l'aide de formaldéhyde pendant un temps et dans des conditions insuffisantes pour inactiver complètement le virus, suivi d'un traitement à l'aide de -propiolactone dans des con- ditions qui, en elles-mêmes, seraient insuffisantes pour inactiver le vi- rus de la poliomyélite.
Le vaccin ainsi produit a un degré supérieur d'an- tigénicité, en comparaison des vaccins préparés par traitement de la même souche ou d'autres souches de virus de la poliomyélitie avec de la formal- déhyde seule dans des conditions suffisantes pour tuer complètement l'or- ganisme. Le vaccin produit par le procédé suivant la présente invention est également nettement supérieur au point de vue antigénicité à un vaccin produit dans des conditions par ailleurs identiques, en utilisant-les effets inactivants de la -propiolactone.
Il est à noter que la combinaison du traitement avec de la for- maldéhyde et du traitement avec de la ss-propiolactone convient pour traiter des organismes pour la production de produits antigéniques destinés à 1' immunisation ou à la diagnose par traitement de virus, rickettsia ou bac- téries. Parmi ces matières, on peut citer le vaccin de la parotidite, le vaccin de la rougeole, le vaccin du virus de l'adénite humaine, l'encepha- lomyélite équine d'occident, l'encephalomyélite équine d'orient, le vaccin du virus de l'influenza, le vaccin de la rage, le vaccin de la variole, le vaccin de la coqueluche, etc...
Il y a lieu de noter que le procédé, qui est décrit dans le présent mémoire, avec référence particulière au vaccin de la poliomyélite, nécessitera certaine modification lors de son
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application à la fabrication d'autres préparations vaccinales ou diagno- stiques à partie de microorganismes.
Toutefois, étant donné que les pro- cédés pour déterminer la présence d'organismes vivants dans ces prépara- tions et que les procédés pour déterminer l'efficacité des préparations sont bien connus dans la technique, avec un minimum d'expérimentation 1' emploi de la combinaison de formaldéhyde et de -propiolactone peut être adapté aux propriétés de la souche'individuelle de microorganismeo Il faut ramarquer aussi que l'ordre inverse de traitement, c'est-à-dire le trai- tement consistant à utiliser d'abord la lactone, puis la formaldéhyde est également efficace. Toutefois, on préfère utiliser initialement de la for- maldéhyde.
Dans la description suivante, comme on l'a signalé plus haut, l'accent est mis sur la préparation d'un vaccin poliomyélitique et les conditions préférées pour conduire-cette préparation sont décrites, mais ces conditions peuvent subir des modifications considérables. Ainsi, pour une température donnée,dans des conditions par ailleurs identiques, un temps donné de traitement à l'aide de formaldéhyde et à l'aide de propio- lactone est optimum. Si la température est abaissée, il est ordinairement nécessaire de prolonger la durée du traitement. Si la température est 'élevée, le traitement peut être raccourci en durée.
Il est évidemment nécessaire que la température ne soit pas élevée bien au delà de 37 C,de façon que des réactions fâcheuses n'altèrent pas les propriétés antigéni- , ques précieuses de la matière vaccinale ou diagnostique. Ainsi, si une préparation virale est traitée à l'aide de formaldéhyde à 37 C pendant
2 jours pour l'amener dans un état satisfaisant pour le traitement avec de la -propiolactone, il peut être nécessaire, pour amener le virus au même stade, de le traiter pendant 3 jours, si une température de 23 est utilisée.
Bien que le virus de la poliomyélite soit actuellement cultivé de manière courante sur des cellules de rein de singe, le présent procédé peut être appliqué à des virus ou autres organismes cultivés sur une va- riété de types différents de tissus ou cultivés sur des animaux intactso
Ces méthodes sont décrites dans la littérature technique, de même que des méthodes pour séparer les organismes de tissus étrangers et d'autres ma- tières, qui sont indésirable dans le produit antigénique fini. Ainsi, le vaccin de l'encéphalite équine orientale peut être préparé en faisant pous- ser l'organisme sur des oeufs de poulets fertiles. Les embryons infectés sont séparés et broyés dans de la saumure. Ils sont alors traités avec de la formaldéhyde et avec de la ss-propiolactone, de manière à obtenir le vaccin.
Le vaccin de la parotidite est préparé sensiblement de la même manière, en infectant les oeufs dans la cavité chorio-allantoique à l'aide du virus. Le virus peut être isolé du fluide après une période d'incubation appropriée et le virus isolé peut ensuite être traité avec de la formaldé- hyde et avec de la propiolactone, de manière à obtenir le vaccins
La raison de l'action combinée de la formaldéhyde et de la pro- piolactone, en ce qui concerne leur effet sur les organismes pathogènes n'est pas élucidée.
Il est possible que le bref traitement avec de la formaldéhyde qui est appliqué dans le présent procédé entraîne un certain changement dans un organisme (tel que le virus de-la poliomyélite) sans provoquer la mort d'un pourcentage élevé des particules et sans réduire fortement l'antigénictiéde ces particules , lequel changement rend le virus beaucoup plus sensible-à l'effet destructeur de la ss-propiolactone, mais moins sensible à une perte d'antigénicité due à l'action de la ss-propio- lactone. Il est à noter que ceci ne constitue qu'une théorie et qu'il peut y avoir une autre explication au sujet de l'action combinée inattendue des deux réactifs sur les organismes.
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En tout cas, cette action inhabituelle est tout-à-fait bénéfique, en ce sens qu'elle permet la préparation de vaccins de la poliomyélite et d'autres vaccins extraordinairement efficaces. Un autre avantage découlant de l'uti- lisation dans le présent procédé réside dans le fait que le temps total requis pour le traitement du virus par les deux réactifs en succession (à savoir la formaldéhyde et la -propiolactone) est réduit de manière appré- ciable par rapport au temps qui est, par exemple, nécessaire pour le trai- tement d'une souche humaine du même virus poliomyélitique avec de la for- maldéhyde seule, pour l'amener à un stade comparable de nature non infec- tieuse.
Pour préparer un vaccin poliomyélitique humain, une ou plusieurs souches du virus sont cultivées dans un milieu contenant des cellules ani- males, qui servent d'hôte pour le viruso Bien que divers types de tissus puissent être utilisés à cette fin, l'expérience récente a montré que l'em- ploi de cellules provenant des reins de certains types de singes est par= ticulièrement utile. Des souches de singes tels que le rhésus et le cyno- molgus peuvent être utilisées à cette fin. Un contrôle soigneux de ces animaux, en vue d'acquérir la certitude qu'ils ne portent pas de maladies infectieuses qui pourraient être transférées par le vaccin, est évidemment essentiel. Des préparations cellulaires provenant des reins peuvent être obtenues par des procédés qui ont été décrits dans la littérature.
En général, après séparation des reins du tissu étranger, ils sont finement divisés et les cellules sont séparées des cellules sanguines et de divers types de tissus en lavant la préparation finement divisée avec des solu- tions de sel, dont on sait qu'elles conservent les cellules de reins dans un état sain. La séparation des cellules des autres tissus est souvent facilitée par l'emploi d'une solution diluée de l'enzyme que constitue la trypsine, cette enzyme étant utilisée dans les solutions physiologiques de sel. Toutes les opérations doivent évidemment être exécutées dans des con- ditions aseptiques, en vue d'éviter la contamination par des microorganismes étrangers.
A cette fin, divers antibiotiques, tels que de la pénicilline et de la streptomycine peuvent être ajoutés à-des concentrations appropriées aux solutions de sérum physiologique, afin d'aider à maintenir les prépa- rations exemptes de microorganismes infectants étrangerso Les suspensions de cellules de reins de singe peuvent être concentrées par centrifugation, en veillant cependant à ne pas endommager les cellules par un traitement trop vigoureux. Une concentration appropriée de cellules est alors placée dans des récipients de culture, tels que des flacons de Roux, dans une solution de sérum physiologique, telle que le milieu de Hanks, et on fait pousser les cellules dans les flacons, soumis à une agitation modérée, dans des conditions aseptiques, à une température d'environ 37 C pendant plusieurs jours, par exemple pendant 5 à 8 jours.
Pendant ce temps, les cellules forment une coucha proliférante à la surface des flacons. Le mi- lieu est alors séparé soigneusement de la couche cellulaire, les cellules sont rincées avec une solution physiologique de sel et de la solution fraîche est ajoutée. Les cellules de reins de singes sont alors traitées par une culture de la souche choisie du virus de la poliomyélite humaine.
Diverses souches de virus de la poliomyélite peuvent être utili- sées pour la préparation des vaccins suivant la présente invention, En général, il est souhaitable de cultiver séparément les souches de trois types différents de¯vaccin poliomyélitique, de façon que.les vaccins mono- valents ainsi produits puissent être combinés de manière à former un vaccin trivalent à administrer aux être humains. Les diverses souches, qui ont été utilisées dans le passé à cette fin.ou des souches fraîchement -isolées d'un type satisfaisant pourront servir.
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Les cellules infectées sont alors cultivées pendant plusieurs jours à une température d'environ 37 C. Des essais peuvent,être effectués au sujet du caractère infectieux de dilutions standards de la préparation en vue de déterminer le moment où une croissance suffisante du virus a été obtenue.
En général, environ trois à cinq jours sont suffisants pour assurer une bonne croissance. Pendant la croissance des organismes, les flacons sont soumis à une oscillation modérée. A ce moment, toutes les cellules de reins doivent avoir été détruites par le virus. Les contenus des flacons contenant le virus d'un seul type peuvent être combinés.
Après avoir combiné le contenu des flacons contenant le virus, le pHdu mélange est ajusté sensiblement jusqu'à neutralité, c'est-à-dire jusqu'à environ 6,5 à environ 7,0, La préparation est alors filtrée pour éliminer les bactéries, les agrégats de cellules et les autres grandes particules. La filtration peut s'effectuer en faisant passer la matière à travers des filtres'en verre fin, des filtres Seitz, des filtres cellu- losiques ou d'autres types appropriés de matières. Ces opérations sont évidemment exécutées dans des conditions aseptiques.
La solution filtrée est alors prête pour le traitement à l'aide de formaldéhyde dans le pre- mier stade du procédé suivant l'inventiono En général, on utilise environ 0,1 à 0,5 ml de formaldéhyde à 40% (0,04 g/1 à 0,2 g/1 de f ormaldéhyde pure) par litre de solution de virus, la quantité utilisée dépendant dans une certaine mesure de la concentration du virus. En général, les prépara- tions de virus poliomyélitique doivent avoir une concentration en virus d'environ 104 à oli particules virales par ml, cette concentration étant déterminée par dilution en série de la préparation, avec culture en tubes ou flacons sur tissu, tel que reins de singe.
Lorsqu'il est fait référence dans le présent mémoire à une "solution de formaldéhyde", il s'agit de la matière que l'on trouve dans le commerce, qui présente une concentration d'environ 40% en poids. Avant addition de cette matière aux virus, il peut être souhaitable de diluer ia formaldéhyde à l'eau et la solution virale est fortement agitée pendant l'addition de la solution diluée de formal- déhydee Bien qu'une concentration plus élevée de formaldéhyde puisse être utilisée pour l'inactivation des virus, ceci n'est généralement pas né- cessaire et n'est, en fait, pas conseillable, car l'emploi de formaldéhyde plus concentrée peut conduire à de plus grandes pertes d'antigénicité que ce n'est souhaitable.
Il est relativement simple de régler la concentration, de façon que l'inactivation initiale soit réalisée avec une perte limitée d'antigénicité et une conservation maximum des propriétés précieuses du vaccin. Le premier stade du procédé ne rend pas la préparation virale non infectieuse,contrairement aux procédés généralement en usage à présent pour la préparation de vaccins de la poliomyélite. Le traitement à la for- maldéhyde est exécuté à une température d'environ 25 à environ 40 C et, de préférence, à environ 37 C. Le traitement est poursuivi pendant environ 40 à 55 heures.
Dans les opérations commerciales où on utilise seulement de la formaldéhyde pour le traitement du virus de la poliomyélite, le traite- ment se poursuit généralement pendant au moins 5 jours, de manière à assurer une inactivation complète du virus. Pendant ce temps, une perte considérable de l'antigénicité des-préparations se produit.
Bien que, lorsqu'une concentration plus limitée de formaldéhyde (dans la gamme des eurs susindiquées) est utilisée, il ne soit pas essentiel d'opérer ainsi, la solution de virus traitée à la formaldéhyde est généralement soumise à l'action d'un bisulfite, tel que le bisulfite de sodium, pour éliminer la formaldéhyde résiduelleo La quantité de bisul- fite utilisée est fonction de la quantité de formaldéhyde originellement introduite pour traiter le virus
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Ainsi, si on utilise 0,35 ml de formaldéhyde à 40%, il faut employer approximativement 0,6 g de bisulfite de sodium.
En générale il est à con- seiller d'ajouter le bisulfite sous foime d'une solution aqueuse diluée à la solution de virus traitée,en opérant une forte agitation pour assurer un bon contacta Le virus est alors traité avec de la ss-propiolactone. A cette fin, on utilise de 0,5 à 1,5 ml environ de la lactone par litre de solution virale. Etant donné que la ss-propiolactone est une matière très réactive, elle doit être utilisée avec précautions. Bien que ceci ne soit pas essentiel, on préfère diluer la lactone en l'ajoutant à de l'eau froide juste avant le traitement des virus. La ss-propiolactone 'dans de l'eau gla- cée est alors ajoutée rapidement à la préparation virale. Tout retard accroît l'hydrolyse de la, lactone et réduit son efficacité sur les virus.
Pendant l'addition de la lactone, la préparation virale est fortement agitée. Il a été constaté que, lorsque la laotone agit sur le virus, la solution devient plus acide. Ceci se produit généralement quelques minutes après l'addition de la lactone. Un indicateur convenable pour suivre ce processus est le Rouge Phénolo L'acidité qui se manifeste pendant cette phase du procédé est, de préférence, neutralisée de manière continue ou intermittente, de façon que la solution soit maintenue sensiblement neutre.
Lorsque la, réaction est exécutée à la température préférée d'environ 37 C, le développement d'une acidité cesse ,généralement après environ 4 à 6 heures. La neutralisation s'opère avec un alcali, de préférence, de l'hy- droxyde de sodium diluéo La solution contenant les virus inactivés est généralement prête à l'emploi à ce moment. Toutefois, il est préférable de permettre au mélange de rester au repos pendant environ 12 à 14 heures encore. Pendant ce temps, la température est maintenue à environ 37 c.
Le pH est alors vérifié à nouveau et, au besoin, il est ajusté de façon à être voisin de la neutralité. La matière est stockée à basse température, de préférence à environ 4 C et divers essais sont exécutés sur des échan- tillons des virus inactivés. En particulier, la matière est testée, en vue de s'assurer que tous les virus ont été tués et que le degré élevé usuel d'antigénicité a été maintenu. Il est généralement souhaitable de combiner des virus inactivés des types le 2 et 3 dans une seule prépara- tion .Le volume de chaque type variera dans mie certaine mesure, en fonc- tion de l'activité relative des préparations individuelles. Les divers types ne sont pas combinés avant que les essais de sécurité et d'efficacité des virus particuliers traités aient été effectués.
Un stockage à basse température est conseillable, afin de maintenir l'activité de la prépara- tion à une valeur maximum. Divers agents préservatifs peuvent également être ajoutés aux préparations dans le même but. Parmi ces agents, on peut citer des matières telles que le phénol, le thiomersal, le chlorure de benzothonium, etc... Ces matières sont utilisées en faible concentration, comme indiqué dans diverses publications de la technique antérieure.
Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et ne doi- vent pas être considérés comme limitant l'invention. En fait, étant donné que de nombreuses formes d'exécution apparemment fort différentes de la présente invention peuvent être mises en oeuvre sans s'écarter de l'esprit et de la portée de cette invention, il doit être entendu que celle-ci n'est limitée que par les termes des revendications terminant le présent mémoire.
EXEMPLE I
Deux litres d'une suspension de virus actif de la poliomyélite humaine du type 1, qui a été récoltée après croissance sur des cellules de reins de singe, ont été filtrés sur un filtre de cellulose lavé initiale- ment à l'aide de solution de Hanks.
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La préparation virale avait une activité de 107 particules virulentes par ml, ainsi que l'a révélé un essai de culture sur tissu. L'opération de filtration et les autres opérations suivantes ont été exécutées dans des conditions aseptiques, le pH du mélange a été ajusté à 6,7 avant filtra- tion. Le mélange filtré a été maintenu à 37 C et, tout en l'agitant, on y a ajouté 0,35 ml d'une solution commerciale de formaldéhyde à 40% diluée dans 20 ml d'eau distillée stérilisée. Le mélange a été maintenu à 37 C pendant 48 heures. La formaldéhyde a ensuite été éliminée par addition d'une solution dans de l'eau distillée stérile de 0,61 g de bisulfite de sodium dans 10 ml d'eau stérile.
Le mélange a été agité pendant l'addition du bisulfite. 1,5ml de P-propiolactone, qui avait été stockée en glacière, a été dilué par addition de 10 ml d'eau distillée stérile glacée. Pendant l'addition, le mélange a été agité et refroidi au bain de glace. La dilu- tion a été poursuivie rapidement et la solution diluée froide a immédiate- ment été ajoutée à la suspension de virus agitée. Le temps qui s'écoule entre le début de la dilution et l'addition à la suspension de virus doit être de moins de 5 minutes. Une petite quantité d'indicateur (Rouge Phénol) incorporée à la préparation virale a permis de suivre aisément le dévelop- pement de l'acidité. Une solution diluée d'hydroxyde de sodium a été ajou- tée à intervalles réguliers pour maintenir le pH à environ 6,8 - 7,0.
En général, environ 5 heures sont nécessaires pour achever l'hydrolyse de la lactone et le développement de l'acidité* La solution de virus a ensuite été conservée à 37 C jusqu'au lendemain. Elle est alors prête à l'usage, pour immuniser des patients vis-à-vis des infections poliomyélitiques du type 1. Cette solution s'est avérée fortement antigénique au cours d'essais standards sur animaux (en comparaison d'une préparation vaccinale standard), cette antigénicité étant beaucoup plus forte que celle d'un vaccin obtenu avec de la formaldéhyde ou de la ss-propiolactone seule.
EXEMPLE II On a répété le mode opératoire de l'exemple I, en utilisant un virus poliomyélitique du type 2 (par exemple, Lansing) en concentration similaire, plutôt qu'un virus du type 1. Une troisième préparation a été obtenue en utilisant un virus du type 3 (par exemple, Saukett) de là même manière. A partir de 4 volumes de vaccin du type 1, de 3 volumes de vaccin du type 2 et de 3 volumes de vaccin du type 3, on a préparé un vaccin poly- valent. On a ajouté du chlorure de benzothonium comme agent préservatif à une concentration de 1/50.000,. Cette préparation s'est révélée très efficace pour immuniser des êtres humains contre la poliomyélite.
Le vaccin possé- dait un très haut degré d'antigénicité et un examen méticuleux d'échantil- lons n'a pas révélé la présence de particules virales infectieuses.
EXEMPLE III
Le procédé d'inactivation décrit dans l'exemple I a été répété, en utilisant une souche humaine pathogène d'adeno-virus. Le vaccin ainsi produit convient pour l'immunisation contre les infections du tractus respiratoire dues à des virus.
REVENDICATIONS.
1. Procédé pour la préparation d'antigènes immunisants et diag- nostiques, ce procédé comportant les stades consistant à soumettre une préparation aqueuse contenant des microorganismes infecteux et des antigènes séparément à l'action de formaldéhyde et à l'action de ss-propiolactone.
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The present invention relates to novel very useful vaccine preparations. It also relates to a novel process for preparing vaccines by a process having certain defined advantages over prior processes for the manufacture of vaccines. In particular, the invention relates to vaccines prepared by inactivating infectious virus strains by treating the viruses separately with formaldehyde and with -propiolactone. The invention also relates to a new method for treating one or more infectious viruses using formaldehyde and ss-propiolactone.
Vaccines have been made from a variety of infectious viruses in the past. These viruses include not only infectious viruses that infect humans, but also those that cause disease in various types of animals. The processes used for the production of these vaccines are described in detail in the scientific literature. In general, vaccines are prepared by culturing the virus in a living animal or in fertilized eggs or in tissue preparations of various types. The virus is then attenuated or killed by certain reagents or certain physical forces, which are capable of suppressing or eliminating the virulent effect of the organism without suppressing its ability to generate the formation of antibodies, when they are administered to an animal.
Among the agents which have been used for the treatment of cultured viruses, there may be mentioned formaldehyde, ultraviolet light, methyl alcohol, ethylene oxide, -propiolac- tone, etc.
In recent years, methods have been developed for the preparation of vaccines by the general methods indicated above, using one or more strains of human poliomyelitis virus. In general, formaldehyde has been used for virus inactivation. The present invention encompasses a process for the preparation of improved poliomyelitis vaccines by treating one or more strains of human poliomyelitis virus with formaldehyde for a time and under conditions insufficient to completely inactivate the virus, followed by treatment with -propiolactone under conditions which in themselves would be insufficient to inactivate the polio virus.
The vaccine so produced has a higher degree of antigenicity, compared to vaccines prepared by treating the same or other strains of polio virus with formaldehyde alone under conditions sufficient to completely kill the virus. organism. The vaccine produced by the process according to the present invention is also significantly superior in antigenicity to a vaccine produced under otherwise identical conditions, using the inactivating effects of -propiolactone.
It should be noted that the combination of treatment with formaldehyde and treatment with ss-propiolactone is suitable for treating organisms for the production of antigenic products for immunization or for diagnosis by treatment of viruses, rickettsia. or bacteria. These materials include parotitis vaccine, measles vaccine, human adenitis virus vaccine, western equine encephalomyelitis, eastern equine encephalomyelitis, western equine encephalomyelitis, influenza virus, rabies vaccine, smallpox vaccine, pertussis vaccine, etc.
It should be noted that the method, which is described herein, with particular reference to the polio vaccine, will require some modification when being made.
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application to the manufacture of other vaccine or diagnostic preparations from microorganisms.
However, since the methods for determining the presence of living organisms in such preparations and the methods for determining the efficacy of the preparations are well known in the art, with minimal experimentation the use of the combination of formaldehyde and -propiolactone can be adapted to the properties of the individual strain of microorganism o It should also be noted that the reverse order of treatment, i.e. the treatment of first using the lactone, then formaldehyde is also effective. However, it is preferred to use formaldehyde initially.
In the following description, as noted above, the emphasis is on the preparation of a polio vaccine and the preferred conditions for performing this preparation are described, but these conditions can undergo considerable modification. Thus, for a given temperature, under otherwise identical conditions, a given treatment time with the aid of formaldehyde and with the aid of propi-lactone is optimum. If the temperature is lowered, it is usually necessary to prolong the duration of treatment. If the temperature is high, the treatment can be shortened in duration.
It is obviously necessary that the temperature is not raised well above 37 ° C., so that adverse reactions do not alter the valuable antigenic properties of the vaccine or diagnostic material. Thus, if a viral preparation is treated with formaldehyde at 37 C for
2 days to bring it to a satisfactory condition for treatment with -propiolactone, it may be necessary to bring the virus to the same stage to treat it for 3 days, if a temperature of 23 is used.
Although the poliomyelitis virus is currently cultivated routinely on monkey kidney cells, the present method can be applied to viruses or other organisms grown on a variety of different tissue types or grown in intact animals.
These methods are described in the technical literature, as are methods for separating organisms from foreign tissue and other material, which are undesirable in the finished antigen product. Thus, the eastern equine encephalitis vaccine can be prepared by growing the organism on fertile chicken eggs. The infected embryos are separated and crushed in brine. They are then treated with formaldehyde and with ss-propiolactone, so as to obtain the vaccine.
The parotitis vaccine is prepared in much the same way, infecting the eggs in the chorioallantoic cavity with the virus. The virus can be isolated from the fluid after a suitable incubation period and the isolated virus can then be treated with formaldehyde and with propiolactone, to obtain the vaccine.
The reason for the combined action of formaldehyde and propolactone with respect to their effect on pathogenic organisms is not clear.
It is possible that the brief treatment with formaldehyde which is applied in the present process will cause some change in an organism (such as polio virus) without causing the death of a high percentage of the particles and without greatly reducing the antigenicity of these particles, which change makes the virus much more sensitive to the destructive effect of ss-propiolactone, but less sensitive to loss of antigenicity due to the action of ss-propiolactone. Note that this is only a theory and that there may be another explanation for the unexpected combined action of the two reagents on organisms.
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In any case, this unusual action is quite beneficial, in that it allows the preparation of polio vaccines and other extraordinarily effective vaccines. Another advantage deriving from use in the present process is that the total time required for the treatment of the virus by the two reagents in succession (i.e. formaldehyde and -propiolactone) is appreciably reduced. Comparable with respect to the time which is, for example, necessary for the treatment of a human strain of the same poliomyelitis virus with formaldehyde alone, to bring it to a comparable stage of a non-infectious nature.
To prepare a human polio vaccine, one or more strains of the virus are grown in a medium containing animal cells, which serve as a host for the virus. Although a variety of tissue types can be used for this purpose, recent experience has shown that the use of cells from the kidneys of certain types of monkeys is particularly useful. Strains of monkeys such as rhesus and cynomolgus can be used for this purpose. Careful control of these animals, in order to ensure that they do not carry infectious diseases which could be transferred by the vaccine, is obviously essential. Cell preparations from the kidneys can be obtained by methods which have been described in the literature.
Usually, after separation of the kidneys from the foreign tissue, they are finely divided and cells are separated from blood cells and various types of tissues by washing the finely divided preparation with salt solutions, which are known to retain kidney cells in a healthy state. The separation of cells from other tissues is often facilitated by the use of a dilute solution of the enzyme that constitutes trypsin, this enzyme being used in physiological salt solutions. All operations must of course be carried out under aseptic conditions in order to avoid contamination by foreign microorganisms.
To this end, various antibiotics, such as penicillin and streptomycin can be added at appropriate concentrations to physiological saline solutions, in order to help maintain the preparations free of foreign infecting microorganisms. Monkey kidneys can be concentrated by centrifugation, however, being careful not to damage cells by too vigorous processing. An appropriate concentration of cells is then placed in culture vessels, such as Roux flasks, in physiological saline solution, such as Hanks' medium, and the cells are grown in the flasks, subjected to moderate shaking. , under aseptic conditions, at a temperature of about 37 ° C for several days, for example 5 to 8 days.
During this time, the cells form a proliferating layer on the surface of the vials. The medium is then carefully separated from the cell layer, the cells are rinsed with physiological salt solution and fresh solution is added. The monkey kidney cells are then treated with a culture of the selected strain of human polio virus.
Various strains of poliomyelitis virus can be used for the preparation of the vaccines according to the present invention. In general, it is desirable to separately cultivate the strains of three different types of polio vaccine, so that the mono-vaccines Valents thus produced can be combined to form a trivalent vaccine for administration to humans. The various strains which have been used for this purpose in the past or freshly isolated strains of a satisfactory type may be used.
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The infected cells are then cultured for several days at a temperature of about 37 C. Tests can be carried out for the infectivity of standard dilutions of the preparation in order to determine when sufficient growth of the virus has been obtained. .
Usually about three to five days are sufficient for good growth. While the organisms are growing, the vials are subjected to moderate oscillation. By this time, all kidney cells must have been destroyed by the virus. The contents of vials containing virus of one type can be combined.
After combining the contents of the vials containing the virus, the pH of the mixture is adjusted substantially to neutral, i.e. up to about 6.5 to about 7.0. The preparation is then filtered to remove bacteria, cell aggregates and other large particles. Filtration can be accomplished by passing the material through fine glass filters, Seitz filters, cellulosic filters or other suitable types of material. These operations are obviously carried out under aseptic conditions.
The filtered solution is then ready for the treatment with formaldehyde in the first stage of the process according to the invention. In general, about 0.1 to 0.5 ml of 40% formaldehyde (0.04 g / 1 to 0.2 g / 1 of pure formaldehyde) per liter of virus solution, the amount used depending to some extent on the concentration of the virus. In general, poliomyelitis virus preparations should have a virus concentration of about 104 to 1 virus particles per ml, this concentration being determined by serial dilution of the preparation, with culture in tubes or vials on tissue, such as. monkey kidneys.
When reference is made herein to a "formaldehyde solution", this is the commercially available material which has a concentration of about 40% by weight. Before adding this material to the viruses, it may be desirable to dilute the formaldehyde with water and the virus solution is stirred vigorously during the addition of the dilute formaldehyde solution. Although a higher concentration of formaldehyde may be. used for virus inactivation, this is generally not necessary and in fact not advisable, as the use of more concentrated formaldehyde can lead to greater losses of antigenicity than is necessary. is desirable.
It is relatively simple to adjust the concentration, so that the initial inactivation is achieved with limited loss of antigenicity and maximum retention of valuable vaccine properties. The first stage of the process does not render the viral preparation non-infectious, unlike the methods generally in use now for the preparation of poliomyelitis vaccines. The formaldehyde treatment is carried out at a temperature of about 25 to about 40 ° C and, preferably, about 37 C. The treatment is continued for about 40 to 55 hours.
In commercial operations where only formaldehyde is used for the treatment of polio virus, treatment is generally continued for at least 5 days, so as to ensure complete inactivation of the virus. During this time, a considerable loss of the antigenicity of the preparations occurs.
Although, when a more limited concentration of formaldehyde (in the range of the above-mentioned eurs) is used, it is not essential to do so, the virus solution treated with formaldehyde is generally subjected to the action of an agent. bisulfite, such as sodium bisulfite, to remove residual formaldehyde o The amount of bisulfite used depends on the amount of formaldehyde originally introduced to treat the virus
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Thus, if 0.35 ml of 40% formaldehyde is used, approximately 0.6 g of sodium bisulfite should be used.
In general, it is advisable to add the bisulfite in the form of a dilute aqueous solution to the solution of the virus treated, with vigorous stirring to ensure good contact. The virus is then treated with ss-propiolactone. For this purpose, approximately 0.5 to 1.5 ml of the lactone is used per liter of viral solution. Since ss-propiolactone is a very reactive material, it should be used with caution. Although this is not essential, it is preferred to dilute the lactone by adding it to cold water just before treatment for viruses. The s-propiolactone in ice water is then added rapidly to the viral preparation. Any delay increases the hydrolysis of la, lactone and reduces its effectiveness against viruses.
During the addition of the lactone, the viral preparation is strongly stirred. It has been found that when laotone acts on the virus, the solution becomes more acidic. This usually happens a few minutes after the addition of the lactone. A suitable indicator for monitoring this process is Phenolo Red. The acidity which manifests itself during this phase of the process is preferably continuously or intermittently neutralized, so that the solution is kept substantially neutral.
When the reaction is carried out at the preferred temperature of about 37 ° C, the development of acidity ceases, generally after about 4 to 6 hours. Neutralization is carried out with an alkali, preferably dilute sodium hydroxide. The solution containing inactivated viruses is generally ready for use at this time. However, it is best to allow the mixture to stand still for about 12 to 14 hours more. During this time, the temperature is maintained at about 37 c.
The pH is then checked again and, if necessary, it is adjusted so as to be close to neutrality. The material is stored at low temperature, preferably about 4 ° C and various assays are performed on samples of the inactivated viruses. In particular, the material is tested to ensure that all viruses have been killed and that the usual high level of antigenicity has been maintained. It is generally desirable to combine inactivated viruses of types 2 and 3 in a single preparation. The volume of each type will vary to some extent, depending on the relative activity of the individual preparations. The various types are not combined until the safety and efficacy testing of the particular viruses being treated has been performed.
Storage at low temperature is advisable, in order to maintain the activity of the preparation at a maximum value. Various preservatives can also be added to the preparations for the same purpose. Among these agents, there may be mentioned materials such as phenol, thiomersal, benzothonium chloride, etc. These materials are used in low concentration, as indicated in various publications of the prior art.
The following examples are given by way of illustration and should not be considered as limiting the invention. Indeed, since many apparently quite different embodiments of the present invention may be practiced without departing from the spirit and scope of this invention, it should be understood that the latter does not is limited only by the terms of the claims ending this specification.
EXAMPLE I
Two liters of a suspension of active human poliomyelitis virus type 1, which was harvested after growth on monkey kidney cells, was filtered through a cellulose filter washed initially with sodium solution. Hanks.
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The viral preparation had an activity of 107 virulent particles per ml, as revealed by a tissue culture test. The filtration operation and the following other operations were carried out under aseptic conditions, the pH of the mixture was adjusted to 6.7 before filtration. The filtered mixture was kept at 37 ° C and, while stirring, 0.35 ml of a commercial 40% formaldehyde solution diluted in 20 ml of sterilized distilled water was added thereto. The mixture was kept at 37 C for 48 hours. The formaldehyde was then removed by adding a solution in sterile distilled water of 0.61 g of sodium bisulfite in 10 ml of sterile water.
The mixture was stirred during the addition of the bisulfite. 1.5 ml of P-propiolactone, which had been stored in a cooler, was diluted by adding 10 ml of ice-cold sterile distilled water. During the addition, the mixture was stirred and cooled in an ice bath. The dilution was continued rapidly and the cold dilute solution was immediately added to the stirred virus suspension. The time between the start of the dilution and the addition to the virus suspension should be less than 5 minutes. A small quantity of indicator (Phenol Red) incorporated in the viral preparation made it possible to easily follow the development of acidity. Dilute sodium hydroxide solution was added at regular intervals to maintain the pH at about 6.8 - 7.0.
Usually about 5 hours are needed to complete lactone hydrolysis and acidity development. The virus solution was then stored at 37 ° C overnight. It is then ready for use, to immunize patients against type 1 poliomyelitis infections. This solution has been shown to be highly antigenic in standard animal tests (compared to a standard vaccine preparation ), this antigenicity being much stronger than that of a vaccine obtained with formaldehyde or ss-propiolactone alone.
EXAMPLE II The procedure of Example I was repeated, using a polio virus type 2 (eg, Lansing) in similar concentration, rather than a virus type 1. A third preparation was obtained using a virus type 3 (eg Saukett) in the same way. From 4 volumes of type 1 vaccine, 3 volumes of type 2 vaccine and 3 volumes of type 3 vaccine, a multipurpose vaccine was prepared. Benzothonium chloride was added as a preservative at a concentration of 1 / 50,000. This preparation has been shown to be very effective in immunizing humans against polio.
The vaccine possessed a very high degree of antigenicity and careful examination of the samples did not reveal the presence of infectious viral particles.
EXAMPLE III
The inactivation process described in Example I was repeated, using a pathogenic human strain of adeno-virus. The vaccine thus produced is suitable for immunization against infections of the respiratory tract caused by viruses.
CLAIMS.
A process for the preparation of immunizing and diagnostic antigens, said process comprising the steps of subjecting an aqueous preparation containing infectious microorganisms and antigens separately to the action of formaldehyde and the action of ss-propiolactone.