<Desc/Clms Page number 1>
La présente invention se rapporte aux vaccins, c'est-à-dire à des substances capables de produire une réaction antigène chez l'homme et d'autres mammifères et à des procédés pour préparer ces vaccins à partir de virus susceptibles de produire des maladies. Plus spécialement, l'invention se rapporte aux vaccins de la poliomyélite et à des procédés pour préparer ces vaccinsà partir de virus poliomyélitiques vivants.
Jusqu'à présent, les vaccins à base de virus de poliomyélite ont été préparés en rendant ces virus inactifs par traitement par la formaldé- hyde ou la lumière ultra-violette, Le but de ce traitement est de rendre les virus non infectieux en les tuant, mais en même temps sans détruire en- tièrement leur propriété antigène spécifique, c'est-à-dire la propriété du virus de déterminer la production d'anti-corps lorsqu'il est introduit dans le sang ou les tissus de l'homme et d'autres mammifères. Une des dif- ficultés du procédé connu à la formaldéhyde pour tuer tous les virus de poliomyélite est que la marge de sécurité entre la concentration de formal- déhyde nécessaire pour tuer le virus et la concentration qui détruit la pro- priété antigène du virus est relativement étroite.
Le procédé à la formal- déhyde a quelquefois produit des résultats variables et entraîné dans cer- tains cas une destruction incomplète du virus. De même, le procédé utilisant le rayonnement ultra-violet seul produit des résultats variables, en ce qu'il ne permet pas de .tuer-', tous -. les virus ou a tendance à détruire les proprié- tés antigènes de ceux-ci. De la sorte, si l'on utilise l'irradiation dans la mesure nécessaire pour tuer complètement le virus,le caractère antigène est essentiellement détruit en même temps.
En raison de ce qui précède, le besoin s'est fait sentir d'un procédé généralement applicable à la production des produits à base de virus de poliomyélite possédant des caractéristiques antigènes à un haut degré, exempts de virus vivants et pouvant être utilisés pour l'immunisation contre l'infection par les virus de poliomyélite vivants.
Un des bues de la présente invention est de procurer un procédé sûr et efficace pour tuer les virus de poliomyélite vivants en détruisant moins les propriétés antigènes de ces virus que les procédés actuellement connus,
Un autre but de l'invention est de procurer un procédé de préparation de produits à base de virus de poliomyélite qui soient exempts d'agents toxiques, possèdent un haut degré de caractère antigène et conviennent pour immuniser contre les infections par le virus de poliomyélite vivants.
D'autres buts et avantages de l'invention ressortiront de la suite de la description.
Suivant l'invention ces buts sont atteints en soumettant un milieu aqueux contenant des virus de poliomyélite vivants à un traitement par une combinaison d'arradiation par des rayons ultra-violets et de chaleur et/ou de chaleur et de formaldéhyde dans des conditions choisies pour que le premier traitement destiné à tuer les virus soit suffisant pour tuer une forte proportion mais non les virus de poliomyélite vivants présents dans le milieu aqueux initial et que le traitement ou les traitements suivants dans la combinaison soient suffisants pour tuer tous les virus de poliomyélite vivants restant présents dans le milieu, aucun de ces deux traitements appliqués individuellement au milieu aqueux initial n'étant susceptible de tuer complètement tous les virus de poliomyélite vivants présents dans le milieu.
Le vaccin obtenu par ce procédé est non seulement exempt de virus de poliomyélite vivants mais possède également des caractéristiques antigènes à un degré plus élevé que les vaccins obtenus par les procédés connus. Ce résultat est. entièrement inattendu parce que les procédés connus
<Desc/Clms Page number 2>
qui utilisent soit l'irradiation par les rayons ultra-violets, soit la cha- leur seule, produisent une perte presqu'entière des caractéristiques anti- gènes lorsqu'ils sont utilisés dans la mesure nécessaire pour tuer comple- tement le virus.Le vaccin suivant la présente invention,
outre qu'il pos- sède des propriétés antigènes à un plus haut degré qu'unvaccin comparable tué à la formaldéhyde a pour avantage supplémentaire que le virus de poli- omyélite tué présent dans le vaccin n'a aucune tendance à redevenir actif pendant sa conservation.
L'ordre dans lequel les traitements de la combinaison ayant pour but de tuer les virus sont utilisés n'est pas particulièrement critique et n'a à la connaissance de la Demanderesse, aucun effet sensible, sur les résultats obtenus. Par exemple, on peut soumettre d'abord le milieu aqueux contenant les virus de poliomyélite vivants à l'action des rayons ultra- violets puis à celle de la chaleur, ou bien on peut soumettre d'abord le milieu à l'action de la formaldéhyde et de la chaleur, puis à celle des rayons ultra-violets On peut également soumettre d'abord le milieu à l'ac- tion de la formaldéhyde et de la chaleur, puis au rayonnement ultra-violet et finalement à la chaleur seule.
Si on le désire, on peut soumettre d'abo: le milieu à l'action du rayonnement ultra-violet, puis à l'action de la cha leur et de la formaldéhyde.
L'invention s'applique d'une manière générale aux virus de la poliomyélite et peut être appliquée aux virus soit isolément, soit en com- binaison., Les virus de poliomyélite les plus couramment utilisés appartien- nent aux types 1, 2 et 3 et, en général, chaque type de virus est traité séparément et le vaccin obtenu est ensuite combiné au vaccin ou vaccins pr@ parés à partir de l'autre ou des autres types.
Le milieu aqueux contenant le virus de poliomyélite vivant qui est utilisé comme matière de départ dans le procédé peut varier considéra- blement. Du point de vue pratique, il s'agit généralement de n'importe quel milieu aqueux dans lequel le virus peut se développer dans les meil- leures conditions, d'un produit de dilution de ce milieu ou d'un extrait aqueux ou suspension de tissus sur lesquels le virus de la poliomyélite pei se propager dans les meilleures conditions Un milieu aqueux approprié est une culture fluide sur tissus,par exemple le milieu de culture sur tissus "199", infecté de virus de poliomyélite.
Un exemple de ce milieu de cultur fluide est le milieu qu'on obtient en filtrant une culture sur tissus de rein de singe de virus de poliomyélite préparée comme décrit par Dulbec' et ses collaborateurs dans le Journal of Experimental Medicineo Volume 99, page 167 (1954). Suivant ce procédé, on traite par la trypsine pour élimi- ner les tissus étrangers des tissus de rein de singe soumis à une macérait on laisse multiplier les cellules restantes, on inocule le milieu à l'aide du virus de la. poliomyélite, on l'incube et on récolte le liquide obtenu.
Bien que ce procédé soit préféré, on peut supprimer le traitement par la t psine si on le désire.Dans ce dernier cas, toutefois, la teneur en proté- ine du vaccin peut être excessivement élevée et doit être déterminée avant l'emploi pour éviter la production de vaccin qui pourrait entraîner des in tolérances dues aux protéines. Dans la préparation de vaccins mixtes, c'es à-dire de vaccins contanant plus d'un type de virus de poliomyélite, il est admissible de réunir ou de mélanger les fluides récoltés contenant les différents types avant d'appliquer le procédé de l'invention, mais comme indiqué plus haut, il est-généralement préférable de réunir ou de mélangez les vaccins individuels après l'application du procédé.
A des fins pratiqu et dans le but d'utiliser une matière de départ possédant des caractéristi ques antigènes supérieures, le titre infectieux du milieu aqueux doit être levé, c'est-à-dire au moins 10 . En général, un milieu ayant un titre infe tieux dans la gamme de 10 ou plus est utilisé. Dans des conditions norma
<Desc/Clms Page number 3>
les de stockage, le milieu aqueux est conservé par le froid, par exemple à une température dans la gamme de-5 à 10 C. Lorsqu'il est soumis à d'autres traitements, suivant l'invention, le milieu s'échauffe dans les conditions de température utilisées pendant le traitement. Le milieu aqueux contenant le virus de poliomyélite vivant est en général produit dans les conditions aseptiques et est stérile du point de vue bactériologique.
Toutefois, en pratique générale, cette stérilité est obtenue en soumettant le milieu à une filtration bactérienne avant de le soumettre au-procédé de l'invention.
En outre, on peut concentrer et/ou purifier en partie le virus vivant et utiliser-ces suspensions ou solutions comme matières de départ pour le procédé.Pour plus de facilité, ces suspensions ou solutions seront consi- dérées comme incluses dans l'expression, "milieux aqueux contenant des vi- rus de poliomyélite vivants" utilisée dans la suite de la description.
Comme on l'a fait remarquer plus haut, on utilise une combinaison de rayonnement ultra-violet et de chaleur et/ou de chaleur plus de la for- maldéhyde pour obtenir les vaccins, de l'invention. La phase d'irradiation par la lumière ultra- violette du procédé s'effectue en exposant une couche ou un courant mince du milieu aqueux contenant des virus de poliomyélite vivants à la lumière ultra-violette à une longueur d'onde variant entre 200 et 300
Angstrom et ayant une intensité suffisamment élevée pour réduire le titre infectieux à une valeur extrêmement faible en une courte période. Pour 0%.- tenir les résultats désirés, l'épaisseur moyenne de la couche ou du cou- rant exposé ne doit en général pas dépasser 100 microns et de préférence doit être inférieure à 50 microns.
Une épaisseur un peu plus grande que 100 mi- crons peut être utilisée, mais dans ce cas, des expositions plus longues sont requises et la perte des caractéristiques antigènes augmente en conséquence.
La source de lumière ultra-violette utilisée doit émettre une forte propor- tion, de préférence jusqu'à 95% d'énergie à une longueur d'onde de 2537 Ang- stromo Des sources de lumière émettant une proportion un peu plus faible d' énergie de longueur d'onde désirée donnent satisfaction mais sont moins ef- ficaces. Pour obtenir les meilleurs résultats, on utilisera une source de lumière uniforme émettant 95% d'énergie à une longueur d'onde de 2537 Ang; trom et ayant un rendement total de 10 à 25 watts. La source lumineuse est avantageusement placée à une distance d'environ 1cm de la surface du milieu aqueux à exposer. En termes d'intensité d'irradiation pour des besoins ordi- naires, la source de lumière doit être de nature à procurer de 12.500 à 32. 000 micro-watts environ par cm3 de surface de la couche exposée.
Lorsqu' on utilise un milieu de virus aqueux ayant un titre infectieux dans la gamme de 10 à 10 comme matière première et que les conditions d'irradia- tion sont comme indiqué ci-dessus une proportion extrêmement élevée d'orga- nismes vivants est tuée en quelques secondes d'exposition. La durée de l'ex- position peut varier considérablement, mais en général, il est désirable de réduire au minimum le tempsd'exposition pour éviter toute destruction indésirable des propriétés antigènes inhérentes au virus. La période d'ex- position préférée est inférieure à 10 secondes et comprise entre 0,5 et 2 secondes, si l'on veut obtenir des résultats optimum.
Par exemple, si l'on utilise de la lumière ultra-violette à une longueur d'onde de 2537 Angstrom avec une intensité d'environ 25. 000 micro-watts par cm2, l'exposition du milieu contenant les virus vivants en une couche ayant une épaisseur moyenne de 50 microns pendant une seconde réduit le titre infectieux de 10:- à 10 environ. En général, les conditions d'exposition doivent être de nature à réduire ce titre à une valeur de 10 ' à 10 ' 0 Un appareil préfé- ré pour l'application de l'invention est un appareil centrifuge du type dé- crit dans le brevet américain n 2.725.482.
Cet appareil est constitué de plusieurs parties : un tube extérieur, légèrement conique, pouvant être ani- mé d'un mouvement de rotation d'environ 40 cm de longueur avec une pente de 4 vers l'extérieur à partir de l'extrémité inférieure fermée et un diamè-
<Desc/Clms Page number 4>
tre intérieur de 9,5 cm à la partie supérieure; un tube d'entrée suspendu au centre du tube extérieur et dont l'ouverture est proche du fond du tube extérieur ; 6 lames tubulaires à rayons ultra-violets d'environ 30 cm de longueur efficace suspendues dans le tube extérieur entourant le tube d'en trée et agencées de telle sorte que leur surface extérieure soit à 1 cm environ de la paroi intérieure du tube rotatif externe ;
etun récipient ap- proprié entourant la partie supérieure du tube rotatif externe pour'receuil lir et évacuer le liquide chassé hors de la partie supérieure du tube extérieur animé d'un mouvement de rotation rapide pendant le fonctionnement de l'appareil. L'appareil est évidemment muni de dispositifs mécaniques appropriés pour entraîner le tube extérieur dans ce mouvement de rotation rapide. En fonctionnement, le liquide à irradier introduit par le tube d'en trée s'écoule sur le fond du tube extérieur à rotation rapide et est chassé vers l'extérieur et vers le haut sous la forme d'une couche mince dans le champ des lampes ultra-violettes.
La couche mince de liquide est continuellement repoussée vers le haut par l'introduction de nouvelles quantités de liquide par le tube d'entrée jusqu'à ce que le liquide jaillisse finalement hors du récipient entourant la partie supérieure du tube extérieur tou nant et soit recueilli. Un autre appareil convenable est décrit dans le brevet américain n 2.588.716. Bien entendu, tout autre dispositif compaBable pour exposer des couches minces ou des courants minces à la lumière ultraviolette pendant une courte période, convient pour la mise en oeuvre de l'invention.
La température du milieu aqueux au cours de l'irradiation n'est pas critique. A moins qu'on applique de la chaleur extérieure, le milieu ést généralement aune température ordinaire ou à une température plus basse. Toutefois, on obtient les meilleurs résultats lorsque l'irradiation s'effectue sur les milieux aqueux à une température comprise entre 30 et 42 C de préférence, 35-40 C, et par conséquent il est préférable d'exécutez la phase d'irradiation du procédé après avoir réchauffé le milieu à cette température.
La phase de chauffage du procédé, dans les cas où on l'utilise, est exécutée en chauffant ou en incubant le milieu aqueux à une température de 30 à 50 C pendant 2 à 20 jours environ. La gamme préférée des températures d'incubation est environ 35 à 40 C et la durée d'incubation préféra entre 3 et 10 jours .Pour obtenir l'effet maximum sur le virus, il est désirable de placer rapidement le milieu aiqueux dans les conditions d'incubation, c'est-à-dire dans les 2 ou 3 heures après qu'on l'a soumis à l'irrad: tion..ou à la chaleur plus la formaldéhyde puis à 1.'irradiation.
La phase chaleur plus formaldéhyde du procédé, dans les cas où on l'applique, est exécutée en ajoutant de la formaldéhyde au milieu aqueu: en concentration de 1 :2000 à1:12.000, de préférence de 1:3000 à 1:5000, et en chauffant le mélange obtenu à une température comprise entre 30 et 42 C. La température de chauffage préférée est comprise entre 35 et 40 C et la durée de chauffage préférée entre 2 et 6 jours. Lorsqu'on applique cette phase du procédé au milieu aqueux initial, le titre infectieux est réduit à 10 ou moins.
La présence de quantités non toxiques de formaldê- hyde dans le produit final est désirable pour éviter des réactions de décom position enzymatique nocive possibles et pour éviter la formation de levures, de moisissures, de bactéries, etc...On ajoute de préférence la form: déhyde au milieu sous la forme d'une solution aqueuse, stérile, à froid et en agitant soigneusement.
Dans la description qui précède de l'exécution des traitements par irradiation à la lumière ultra-violette, chaleur et chaleur plus formaldéhyde, on a limité pour plus de facilité, la description au traitement
<Desc/Clms Page number 5>
du milieu aqueux contenant le virus de poliomyélites vivant.
Il est à noter toutefois que les remarques précédentes s'appliquent également à des milieux aqueux qui ont déjà été soumis à l'un ou l'autre de ces traitements destruc- teurs.Par exemple, les remarques relatives à la phase chaleur plus formal- déhyde s'appliquent à des milieux aqueux contenant le virus de poliomyélite vivant qui n'ont été soumis à aucun traitement destructeur) à des milieux a- queux qui ont déjà été soumis à la phase'd'irradiation ultra-violette, à des milieux qui ont été soumis aux deux phases de chauffage et d'irradiation ultra-violette, etc...,. j
Dans la mise en pratique de l'invention, on a trouvé que les meil- leurs résultats sont obtenus si l'on soumet le milieu aqueux initial conte- nant le virus de poliomyélite vivant soit à une filtration bactérienne,
c' est-à-dire à une filtration de Seitz ou à une filtration sur verre fritte ultra-fin, soit à un traitement de préchauffage immédiatement avant l'exé- cution de l'irradiation ultra-violette et/ou du chauffage associé au trai- tement par la formaldéhyde. Si l'on utilise un traitement de préchauffage, la température préférée est comprise entre48 et 52 C et le chauffage est exécuté pendant 5 minutes à plusieurs heures. Ce traitement de préchauffage ou de filtration disperse apparemment les particules de virus vivant indi- viduelles qui ont normalement tendance à s'agglomérer, facilitant ainsi l'exposition subséquente des particules individuelles à une intensité maxi- mum d'irradiation ou à une concentration maximum de formaldéhyde.
Le traite- ment de préchauffage n'abaisse pas, dans là mesure où on a pu le déterminer, le titre ou la puissance du vaccin et en fait, semble augmenter finalement la puissance du vaccin. En outre, des filtrations bactériennes de ce type et/ ou un préchauffage peuvent avantageusement être utilisés entre les diffé- rentes phases du procédé.
Si on le désire, des agents germicides et/ou stabilisants peuvent être incorporés aux vaccins de l'invention. Par exemple, le chlorure de ben- zéthonium peut être ajouté aux produits à une concentration d'environ 1:20.000 à 1:50.000, de préférence 1:40.000. Une petite quantité de formaldéhyde, c'est-à-dire une concentration de 1:9.000 à 1:20.000, peut, si on le désire, être ajoutée également aux vaccins qui ne contiendraient pas encore de formaldéhyde.
Les vaccins de l'invention ne contiennent pas de virus de poliomyélite vivant. Ils sont également stériles sous tous autres rapports, c'est-à-dire qu'ils ne contiennent ni bactéries, ni levures, ni moisissures vivantes. Ces produits sont susceptibles de produire par administration à des mammifères sensibles à l'infection par des virus de poliomyélite vivants, une immunité chez le mammifère contre l'infection par le virus vivant correspondant. Le terme " administration Il utilisé ici et dans les revendications qui suivent couvre l'injection sous-cutanée, intra-dermique ou intra-musculaire. Les vaccins peuvent être utilisés soit pour obtenir d'autres vaccins de virus de poliomyélite comme des vaccins contenant des virus précipités par l'alun ou le phosphate d'aluminium, ou peuvent être administrés à des mammifères pour obtenir l'immunité.
Les produits peuvent, si on le désire, être administrés sans dilution mais dans la plupart des cas il est préférable de les diluer avec une quantité raisonnable c'est-à-dire 1 à 4 volumes, d'un milieu aqueux stérile approprié. Quelques exemples de diluants appropriés sont la solution stérile de Hank, l'eau saline stérile et l'eau distillée stérile.
L'invention est illustrée par les exemples qui suivent.
EXEMPLE 1.
Des cellules pour la culture du virus de poliomyélite sont préparées suivant le procédé de Dulbecco, Journal of Expérimental Medicine, 99,
<Desc/Clms Page number 6>
page 167 (1954). En quelques mots,ce procédé consiste à préparer d'abord une suspension de cellules épithéliales de rein de singe (voir Dulbecco, Proc.Nat.Acad.Sci., 38, page 747 (1952).en traitant des tissus de rein de singe macérés provenant de singes sains de race Cynomolgus ou Rhésus, par d la trypsine pour éliminer les matières étrangères et libérer les cellules individuelles.
On laisse se multiplier ces cellules sur une surface de verr appropriée, dans un certain nombre de milieux de culture sur tissusoLa feu le de cellules de rein cultivé ainsi produite est alors inoculée d'une culture d'ensemencement du type 1 (souche de Mahoney), de virus de poliomyélit et le mélange est incubé à 36-37 C jusqu'à ce que la destruction des cellul soit complète et que des quantités importantes de nouveaux virus se soient formées. Le liquide contenant le virus est récolté et passé à travers une chandelle de verre frittée ultra-fine. Le filtrat contenant le virus de poliomyélite vivant type 1 est essayé au point de vue teneur en virus, stérilité bactérienne et pureté de la souche.
De la même manière, un filtrat contenant le type 2 vivant (souche NEF-1) et le type 3 (souche de Saukett) est préparé et les filtrats sont combinés.
Les filtrats combinés contenant les types 1, 2 et 3 du virus de la poliomyélite et ayant un titre infectieux de 10 ' sont alors passés dans une machine centrifuge formant une couche mince à raison de 600 cm3 par minute sous irradiation ultra-violette à un rendement de 20 watts.L'ap pareil centrifuge utilisé du type décrit dans le brevet américain n 2.725.4 produit par la Research Laboratory Division of Général Motors Corporation, Détroit, Michigan, comprend une chambre à cuvette cylindrique tournante vei ticale, un dispositif pour entraîner cette chambre dans un mouvement de rotation à une vitesse normale de 17000 tours/minute et un assemblage tubulai re de 6 lampes ultra-violettes uniformément réparties axialement à l'intérieur de la chambreoLe diamètre intérieur du rebord supérieur de la chambre est environ 9,
5 cm et la paroi intérieure de la chambre s'incline vers l'ir térieur depuis le sommet d'un angle de 4 sur la verticale. La hauteur de 1 paroi intérieure de la chambre est d'environ 40 cm. La surface extérieure de l'assemblage de lampes est écartée de 1 cm de la paroi intérieure de la chambre et l'intensité efficace de l'irradiation ultra-violette à la surfac intérieure de la chambre est environ 250000 micro-watts par cm2. L'épaisseu moyenne de la couche du milieu exposé au rayonnement est environ 75 microns et la durée totale d'exposition 1 seconde.
Le titre infectieux du milieu à la suite de cette exposition est approximativement 10 Une partie aliquote du milieu irradié est alors immédiatement incubée à 37 pendant 10 jours et le titre infectieux du milieu après l'incubation est 0, c'est-àdire que le milieu est complètement exempt du virus de poliomyélite vivant. Le produit ainsi irradié et incubé possède des propriétés antigènes considé rables, comme on le verra par la suite.
Les propriétés antigènes, des produits obtenus ci-dessus sont de terminées de la façon suivante :On inocule à des singes Rhésus 3 doses de
1 cm3 du vaccin à intervalles de une semaine, on saigne les animaux une semaine après la fin de la série d'inoculations, on prépare un sérum à par- tir du sang recueilli et on détermine le nomnre d'anti-corps dans le sérum, Cette détermination est effectuée en-diluant en série le sérum par une solution saline et en mélangeant les parties aliquotes diluées ainsi obtenues à une solution standardisée contenant un nombre connu d'unités infectieuses du type donné du virus de poliomyélite.
Par exemple, lorsqu'on cherche à nalyser la puissance du type 1, on utilise une solution standardisée contenant un nombre connu d'unités infectieuses du virus de poliomyélite du type
1; pour analyser le type 2 ou le type 3, au point de vue puissance, on utilise une solution standardisée de virus infectieux type 2 ou type 3o Le po: final de la titration est la dilution à laquelle le sérum contient suffisai
<Desc/Clms Page number 7>
ment d'anti-corps pour neutraliser exactement, c'est-à-dire combiner avec et rendre non infectieux, le nombre connu d'unités infectieuses du virus dans la solution standardisée. Un certain nombre de singes sont utilisés pour analyser la puissance de chaque type de virus de poliomyélite.
Les résultats ainsi obtenus sont exprimés sous une forme facilitant la comparaison et l'évaluation statistique en prenant le logarithme de la base 2 du point final de dilution pour le sérum de chaque singe, en faisant la moyenne de ces chiffres, puis en prenant l'anti-logarithme de la moyenne ainsi obtenue. Cet anti-logarithme est appelé le titre géométrique moyen des vaccins et est évidemment différent pour chaque type de virus présent dans le vaccin. Comme le titre géométrique moyen dépend de la puissance de la solution standardisée du virus de poliomyélite infectieux utilisé dans le test, il est nécessaire de spécifier le nombre d'unités infectieuses du virus de poliomyélite présent dans la solution standardisée - pour donner au titre géométrique moyen toute sa signification.
Le procédé de calcul du titre géométri- que moyen est indiqué en détail dans l'amendement n 2 de Minimum Requirements of Poliomyelitis Vaccine publié le 20 mai 1954, par United States Department of Health, Education and Welfare.
Les résultats de la détermination des propriétés antigènes du vaccin obtenu par irradiation après incubation à 37 C sont repris dans le tableau 1 ci-après.
<Desc/Clms Page number 8>
EMI8.1
z nvmav.L
EMI8.2
9 . 1 01 91 $ -T aldmaxa,1 ap gpgooid '.101. 099 eT qu-eATrLs U01+Bq -nout q.3 U01+B1PB1 1.101 I jT3d nua+qo U1BA . sa9s -TTuuqueu sniTA uaxom np sasnan+aJú1 U9iCora sasxTTin sso.i saq.lun.tP aaqraoM enbïjq.nioag a+1ili sa6gts ap aaqmon sniTA ap adxl S1IDnOS uOll1+UBq
EMI8.3
.S1sse sot strep e?s1T1+n e?S1PBpUB+S u01+nTQS T ep eUBSS1na $
<Desc/Clms Page number 9>
EXEMPLE 2.
On expose des filtrats de liquides de culture de virus de poliomy- élite contenant des virus de poliomyélite des types 1, 2 et 3 (titre .infec- tieux 10-6,83 ) à la lumière ultra-violette pendant une seconde à raison de 400 cm3/minute (épaisseur de la couche ;50 microns) en utilisant un appa- reil centrifuge, comme décrit dans l'exemple 1 dans les mêmes conditions -0,7 de travail. Le titre infectieux du milieu après exposition est environ 10-0,7.
Une partie aliquote du milieu est incubée à 45 C pendant 3 jours. Le vaccin incubé ainsi obtenu est complètement exempt de virus vivants et possède un haut degré de propriétés antigènes. Le tableau suivant présente une compa- raison au point de vue propriétés antigènes de ces produits avec vaccin obtenu par le procédé à la formaldéhyde à partir du même liquide de culture de virus.La formaldéhyde est utilisée à une concentration de 1 à 4.000 et le mélange est incubé à 37 C pendant 14 jours.
<Desc/Clms Page number 10>
EMI10.1
HV31S7I
EMI10.2
'SJTLOf n 6'2""- 9 ± ± q.lrepued Oo±' 1 000" inod T ap u01++ue '01 a 2 -uoo ua ep.qapTeuzaoj 1 e1Bu1PO pod çzoz 01 ç ± I el aud tuagqo u"Ç:):)A g 201 G'7 E 0 ±' aidmexefi ap epgooid el qu-eAT-ns CC* 2 B±'1 z sno ±' UT3pued uO"Çq.q 0'C -noux qu uO"Çq."ÇP.I"Ç sz z OT 1 d nueq.qo utooeA . se8S -fl'ejq.nau snaf a ap sasnanq.oajuf ueAow S?s111q.n çssaZ S?q.TUn,P eaquion 9,nbTiqguiopO a..-s seize.9 ap ajqmo snJiA ap aul sfirmos uOIT1q.T#:)
EMI10.3
'stressa sel stzep G.as-11-4n easi-pi-e-puuqs uotq-alos ul ap aaussnd *
<Desc/Clms Page number 11>
EXEMPLE 3.
On prépare suivant le procédé indiqué dans l'exemple 1, 60 li- tres d'un milieu aqueux contenant les types 1, 2 et 3 de virus de poliomyé- lite vivants (titre infectieux 10 ' ), On expose une partie aliquote du milieu à la lumière ultra-violette pendant 1 seconde à une vitesse d'écou- lement de 600 cm3/minute de la façon indiquée dans l'exemple 1. Le milieu, qui a un titre infectieux après irradiation de 10 ' , est alors incubé à 37 C pendant 3 jours.
Une autre partie aliquote est irradiée de façon semblable, mélan- gée à une solution de formaldéhyde aqueuse stérile, de façon à obtenir une concentration en formaldéhyde de 1:4000, puis incubée à 37 C pendant 3 jours.
Une autre partie aliquote est chauffée à 52 C pendant environ une heure, refroidie à environ 37-40 C, puis irradiée de façon semblable et incubée. Une autre partie aliquote est semblablement chauffée, refroidie, irradiée, mélangée à une solution aqueuse stérile de fommaldéhyde de façon à obtenir une concentration de formaldéhyde 1:4000 et incubée à 37 C pen- dant 3 jours.
Les propriétés antigènes des vaccins obtenus et celles du milieu aqueux non traité contenant le virus de poliomyélite vivant, sont déterminées essentiellement par le même procédé que dans l'exemple 1, mais en utilisant des cobayes au lieu de singes Rhésus comme animaux d'essais. Les seules dif- férences de procédé dans les deux modes d'essais sont que les cobayes re- çoivent des injections de 0,5 cm3 du vaccin au lieu de 1 cm3 et que ces in- jections sont intra-dermiques au lieu d'intra-musculaires.
Les résultats de la détermination des propriétés antigènes sont donnés au tableau 3,qui suit.
<Desc/Clms Page number 12>
EMI12.1
z nvmsvi
EMI12.2
59*T 01 71 r/ * TOI 68 5e*-[ 01 09 aa..z. uou 4audap ap a.zaz.eyI 59*Tol- 91 te anal axlo gnid GP.&qap -vt/ - -ce 891 -Tuulaoj qe uo2.Eps,z.z-ç e3j 5,g e,-12e ?9 7 -nuo.zd Jd qtnpoad uxootba S±''Ca'C 99 'fez yy X0 ez -nout .a uo.e.p'sa-ç ca2uj -01 66 -jnqoajd JT3d q.pojd uToovA c.01 zz yy'.-j-OT 851 suid apuapTuz.zo, .a .uo.
,01 07 CI -T3-ppi3j:jT: jT3d qtnpoid utooba 0'I *IZ 'i ± ' 47+/ 01 ITZ 7 uoz.qnouç .a uotq 0I 7 7 1 -ps.z-ç aud qtnpojd UTOOBA Seas -Tluaqnau sita ap sesnanqoejut ueom saszT-r.n S9q.Tun<p a.zq,ao anb-pq.anio9 ejq.ji seguqoo ap eaqmon s-aiTA ap adel
EMI12.3
#sxBssa soi susp e?s111+n e?s1PPu+s Tiojq.n-xos i3'][ ep euss1nd *
<Desc/Clms Page number 13>
EXEMPLE 4.
On filtre sur un filtre bactériologique en verre fritte ultra- fin 30 litres d'un milieu aqueux contenant des virus de poliomyélite vivants du type 1 (titre infectieux 10-@,7). On ajoute assez de formol à la solution froide en agitant pour amener la concentration en formaldéhyde à 1:4000 et on incube le mélange à 37 C pendant 4 jours. La suspension obtenue qui a un titre infectieux de 10 est centrifugée dans un appareil centrifuge du type à cône (DeLaval Clarifier) à la vitesse de 600 cm3/minute et le liquide limpide qui en sort est exposé à la lumière ultra-violette en utilisant l'appareil centrifuge pour la formation d'une couche mince décrite dans l'exemple 1. La vitesse d'écoulement choisie est 600 cm3/minute et l'énergie de la lumière ultra-violette équivaut à 16-18 watts.
L'épaisseur de la cou- che pendant l'exposition est environ 50 microns et la durée d'exposition légèrement inférieure à 1 seconde. L'énergie ultra-violette incidente est d'environ 21.000 micro-watts/cm2 de couche de liquide. Sil'on utilise une vitesse d'écoulement de 150 ou 300 cm3/minute, l'énergie doit être réduite en conséquence.La solution de, virus obtenue est à nouveau filtrée par un filtre bactériologique en verre fritté ultra-fin et on en soumet un échan- tillon aux essais de sécurité standard. A ce moment, le vaccin ne peut con- tenir de virus vivants, comme l'indique un résultat négatif dans cet essai de sécurité. Toutefois, la suspension filtrée est encore incubée à 37 C pen- dant 3 jours et un autre échantillon est alors soumis aux mêmes essais.
Les essai,s sur cet échantillon prouvent également l'absence complète de virus vivants.
On prépare comme décrit dans J'exemple 1, 30 litres d'un milieu aqueux contenant les virus de poliomyélite vivants du type 2 (titre infectieux 10 ), et on le soumet au même procédé que ci-dessus.
On prépare comme décrit dans l'exemple 1,30 litres d'un milieu aqueux contenant du virus de poliomyélite vivant type 3 (titre infectieux 10-8,5 )et'on le soumet au même procédé que ci-dessus sauf que dans la phase d'irradiation, on utilise une vitesse d'écoulement de 600 cm3/minute et une énergie incidente de 14 à 16 watts.
Les trois suspensions de vaccins préparées de la façon décrite ci-dessus sont mélangées, puis diluées avec 3 volumes d'une solution stéri- le de Hank. Le vaccin contenant des virus de poliomyélite tués des types 1, 2 et 3 est soumis aux essais de sécurité avant et après dilution. Dans les deux cas:, les essais de sécurité indiquent l'absence complète de virus vivants. On ajoute assez de chlorure de benzéthonium sous la forme d'une solution aqueuse froide et on agite énergiquement pour amener la concentra- tion finale à 1:40.000 et on détermine la puissance du vaccin ainsi obtenu pour chaque type de virus de poliomyélite sur des singes en utilisant l'es- sai prescrit par United States National Institute of Health qui comprend une comparaison avec un échantillon standard Sera 2A de National Institute of Health.
Les résultats de'cet essai sont repris dans le tableau suivant.
TABLEAU 4.
EMI13.1
<tb>
<tb>
Echantillon <SEP> Type <SEP> de <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> #Facteur <SEP> de <SEP> puissance <SEP> sur
<tb> soumis <SEP> à <SEP> l'essai <SEP> virus <SEP> singes <SEP> utilisés <SEP> singes <SEP> (Echantillon <SEP> de <SEP> com-
<tb>
EMI13.2
paraison NIE Réf. Sera 2A)
EMI13.3
<tb>
<tb> Vaccin <SEP> obtenu <SEP> 1 <SEP> 12 <SEP> 1,0
<tb> par <SEP> irradiation <SEP> 2 <SEP> 12 <SEP> 2,0
<tb> et <SEP> formaldéhyde <SEP> 12 <SEP> 2,4
<tb> plus <SEP> chaleur <SEP> '
<tb>
* Le facteur de puissance sur singes est calculé dans chaque cas en divisant le titre géométrique moyen des sérums de singes soumis à l'essai
<Desc/Clms Page number 14>
pour un type de virus particulier par le titre géométrique moyen des sérums 2A du National Institute of Health, relativement au même type de virus.
Les facteurs minimes acceptables pour les singes dans le cas des différents types de virus de poliomyélite sont Type 1 -0,29; Type 2- 0,25 et Type 3 -0,16. (Pour de plus simples détails voir Minimum Requirements of Nationa Institute of Health, 11 novembre 1955).
Lorsque les essais de puissance et de sécurité ont été effectués le vaccin préparé comme ci-dessus est introduit dans des fioles dans des conditions stériles et les fioles sont scellées On choisit au hasard un certain nombre de fioles préparées de cette manière et on soumet leur con- tenu à l'essai de sécurité. Cet essai de sécurité indique l'absence complet de virus de poliomyélite vivant. Le vaccin obtenu convient pour immuniser les êtres humains contre les effets de l'infection par les types 1,2, 3 de virus de poliomyélite vivants. Si on le désire, le vaccin peut être éga- lement utilisé pour la production d'autres produits du genre vaccin, par exemple de vaccins de poliomyélite précipités par l'alun ou le phosphate d'aluminum.
EXEMPLE 5.
On filtre surun filtre bactérien en verre frittéultra fin, 30 litres d'un milieu aqueux contenant le virus de poliomyélite du type 1 (titre infectieux 10 ' ) préparé comme décrit dans l'exemple 1. On ajoute assez de formol à la solution froide en agitant pour amener la concentra- tion en formaldéhyde à 1:4000 et on fait incuber le mélange à 37 C pendant 4 jours. La suspension obtenue qui a un titre infectieux de moins de 10 'est centrifugée dans une centrifugeuse du type à cône. ( De Laval Clarifiez à la vitesse de 600 cm3/minute et l'effluent limpide est exposé à la lumièi ultra-violette en utilisant l'appareil centrifuge de formation de couches dé crit dans l'exemple 1.
La source de lumière ultra-violette a une incidence de 20 watts et une vitesse d'écoulement de 600 cm3/minute. L'épaisseur de la pellicule pendant l'exposition est environ 50 microns et la durée d'ex- position légèrement inférieure à une seconde. Le nombre de microwatts de l'énergie ultra-violette incidente est approximativement de 21.000/cm2 de couche de liquide. On soumet 600 cm3 du vaccin ainsi obtenu aux essais de sécurité standard et on constate qu'il ne contient aucun virus de poliomyé- lite vivant.
On prépare comme décrit dans l'exemple 1, 30 litres d'un milieL aqueux contenant des virus de poliomyélite vivants du -type 2 et on le trai- te comme décrit ci-dessus. Les résultats des essais de sécurité sur ce-vac- cin démontrent qu'il ne contient aucun virus de poliomyélite vivant.
On prépare 30 litres d'un milieu aqueux contenant des virus de poliomyélite vivants du type 3 comme décrit dans l'exemple et on le trai- te comme décrit ci-dessus. Les essais de sécurité appliqués à ce vaccin montrent qu'il ne contient pas de virus de poliomyélite vivants.
Les trois vaccins préparés comme décrit ci-dessus sont mélangés et après prélèvement d'un échantillon de 900 cm3 pour les essais de sécuri- té, on dilue le mélange par trois volumes de solution stérile de Hank. On soumet alors un échantillon de 900 cm3 du vaccin dilué â un essai de sécu- rité en même temps que l'échantillon non dilué et on constate que les deux sont parfaitement exempts de virus de poliomyélite vivant, On ajoute assez de chlorure de benzéthonium au vaccin pour amener la concentration à 1:40.000. Le produit obtenu est mis à l'épreuve au point de vue puissance sur des signes en utilisant le procédé indiqué dans l'exemple 4. Les résul- tats de cet essai figurent dans le tableau 5.
<Desc/Clms Page number 15>
TABLEAU 5.
EMI15.1
<tb>
<tb>
Echantillon <SEP> Type <SEP> de <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> Facteur <SEP> de <SEP> puissance <SEP> sur
<tb> soumis <SEP> à <SEP> l'essai <SEP> virus <SEP> singes <SEP> utilisés <SEP> singes <SEP> (Comparaison
<tb> Standard <SEP> NIH <SEP> Ref.Sera <SEP> 2A)
<tb> Vaccin <SEP> produit <SEP> 1 <SEP> 12 <SEP> 6,7
<tb> par <SEP> irradiation
<tb> et <SEP> formaldéhyde <SEP> 2 <SEP> ,12 <SEP> 4,5
<tb> plus <SEP> chaleur <SEP> 3 <SEP> 12 <SEP> 3,6
<tb>
Après avoir effectué les essais de puissance et de sécurité on introduit le vaccin dans des ampoules dans des conditions stériles et on scelle les ampoules.
Le produit ainsi obtenu convient pour immuniser des êtres humainscontre l'infection par des virus de poliomyélite vivants des types
1, 2 et 30
Bien qu'on ait décrit ci-dessus certaines formes particulières de l'invention, il est clair que celle-ci n'y est pas limitée et que de nombreux modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre.
<Desc / Clms Page number 1>
The present invention relates to vaccines, i.e. to substances capable of producing an antigen reaction in humans and other mammals and to methods of preparing these vaccines from viruses capable of producing diseases. . More especially, the invention relates to poliomyelitis vaccines and to methods for preparing such vaccines from live poliomyelitis viruses.
Until now, vaccines based on polio viruses have been prepared by rendering these viruses inactive by treatment with formaldehyde or ultraviolet light. The aim of this treatment is to make the viruses non-infectious by killing them. , but at the same time without entirely destroying their specific antigenic property, that is to say the property of the virus to determine the production of anti-bodies when it is introduced into the blood or the tissues of man and other mammals. One of the difficulties with the known formaldehyde process for killing all polio viruses is that the margin of safety between the concentration of formaldehyde needed to kill the virus and the concentration which destroys the antigenic property of the virus is relatively narrow.
The formaldehyde process has sometimes produced variable results and in some cases resulted in incomplete destruction of the virus. Likewise, the method using ultraviolet radiation alone produces variable results, in that it does not allow all to be killed. viruses or has a tendency to destroy the antigenic properties thereof. Thus, if irradiation is used to the extent necessary to completely kill the virus, the antigenicity is essentially destroyed at the same time.
In view of the foregoing, there has been a need for a process generally applicable to the production of polio virus products possessing high antigenic characteristics, free from live virus and which can be used for the production of polio virus products. immunization against infection with live poliomyelitis viruses.
One of the aims of the present invention is to provide a safe and effective method of killing live poliomyelitis viruses by destroying the antigenic properties of these viruses less than currently known methods,
Another object of the invention is to provide a process for the preparation of polio virus products which are free from toxic agents, possess a high degree of antigenicity and are suitable for immunizing against infections by live polio virus. .
Other objects and advantages of the invention will emerge from the remainder of the description.
According to the invention these objects are achieved by subjecting an aqueous medium containing live poliomyelitis viruses to treatment by a combination of irradiation with ultraviolet rays and heat and / or heat and formaldehyde under conditions selected for that the first treatment intended to kill the viruses is sufficient to kill a high proportion but not the live poliomyelitis viruses present in the initial aqueous medium and that the subsequent treatment or treatments in the combination are sufficient to kill all live poliomyelitis viruses remaining present in the medium, neither of these two treatments applied individually to the initial aqueous medium being capable of completely killing all the living poliomyelitis viruses present in the medium.
The vaccine obtained by this method is not only free from live poliomyelitis virus but also possesses antigenic characteristics to a higher degree than the vaccines obtained by the known methods. This result is. entirely unexpected because the known methods
<Desc / Clms Page number 2>
which use either ultraviolet irradiation or heat alone, produce almost all loss of antigenic characteristics when used to the extent necessary to completely kill the virus. according to the present invention,
in addition to having antigenic properties to a higher degree than a comparable vaccine killed with formaldehyde has the additional advantage that the killed polio-omyelitis virus present in the vaccine has no tendency to become active again during storage. .
The order in which the treatments of the combination with the aim of killing the viruses are used is not particularly critical and, to the knowledge of the Applicant, has no appreciable effect on the results obtained. For example, the aqueous medium containing the living poliomyelitis viruses can be subjected first to the action of ultraviolet rays and then to that of heat, or the medium can be subjected first to the action of heat. formaldehyde and heat, then that of ultraviolet rays The medium can also be subjected first to the action of formaldehyde and heat, then to ultraviolet radiation and finally to heat alone.
If desired, the medium can be subjected abo to the action of ultraviolet radiation, then to the action of heat and formaldehyde.
The invention is generally applicable to poliomyelitis viruses and can be applied to viruses either singly or in combination. The most commonly used poliomyelitis viruses belong to types 1, 2 and 3. and, in general, each type of virus is treated separately and the resulting vaccine is then combined with the vaccine or vaccines made from the other or other types.
The aqueous medium containing the live polio virus which is used as a starting material in the process can vary widely. From a practical point of view, this is generally any aqueous medium in which the virus can grow under the best conditions, a dilution product of this medium or an aqueous extract or suspension of. tissues on which the poliomyelitis virus can best spread under the best conditions. A suitable aqueous medium is a fluid culture on tissues, for example the tissue culture medium "199", infected with polio virus.
An example of this fluid culture medium is the medium obtained by filtering a monkey kidney tissue culture of polio virus prepared as described by Dulbec 'et al in Journal of Experimental Medicineo Volume 99, page 167 ( 1954). According to this method, trypsin is treated to remove foreign tissue from the macerated monkey kidney tissue, the remaining cells are allowed to grow, the medium is inoculated with the virus. poliomyelitis, incubated and harvested the resulting liquid.
Although this method is preferred, treatment with tpsine can be omitted if desired. In the latter case, however, the protein content of the vaccine may be excessively high and should be determined before use to avoid vaccine production which could lead to protein tolerances. In the preparation of mixed vaccines, that is, vaccines containing more than one type of polio virus, it is permissible to pool or mix the collected fluids containing the different types before applying the method of. invention, but as indicated above, it is generally preferable to combine or mix the individual vaccines after application of the method.
For practical purposes and in order to use a starting material having superior antigen characteristics, the infectious titer of the aqueous medium should be raised, i.e. at least 10. In general, a medium having an infective titer in the range of 10 or more is used. Under normal conditions
<Desc / Clms Page number 3>
storage, the aqueous medium is kept cold, for example at a temperature in the range -5 to 10 C. When it is subjected to other treatments, according to the invention, the medium heats up in the temperature conditions used during processing. The aqueous medium containing the live poliomyelitis virus is generally produced under aseptic conditions and is bacteriologically sterile.
However, in general practice, this sterility is obtained by subjecting the medium to bacterial filtration before subjecting it to the process of the invention.
In addition, one can concentrate and / or partially purify the live virus and use these suspensions or solutions as starting materials for the process. For convenience, such suspensions or solutions will be considered as included within the term. "aqueous media containing live poliomyelitis viruses" used in the remainder of the description.
As noted above, a combination of ultraviolet radiation and heat and / or heat plus formaldehyde is used to obtain the vaccines of the invention. The ultraviolet light irradiation phase of the process is carried out by exposing a thin layer or stream of the aqueous medium containing live polio viruses to ultraviolet light at a wavelength varying between 200 and 300.
Angstrom and having a sufficiently high intensity to reduce the infectious titer to an extremely low value in a short period. For 0% to achieve the desired results, the average thickness of the exposed layer or current should generally not exceed 100 microns and preferably should be less than 50 microns.
A little larger than 100 microns can be used, but in this case longer exposures are required and the loss of antigenic characteristics increases accordingly.
The ultraviolet light source used should emit a high proportion, preferably up to 95% energy at a wavelength of 2537 Angstrom. Light sources emitting a somewhat lower proportion of energy of the desired wavelength are satisfactory but are less efficient. For best results, use a uniform light source emitting 95% energy at a wavelength of 2537 Ang; trom and having a total output of 10 to 25 watts. The light source is advantageously placed at a distance of approximately 1 cm from the surface of the aqueous medium to be exposed. In terms of irradiation intensity for ordinary purposes, the light source should be such as to provide approximately 12,500 to 32,000 micro-watts per cm 3 of exposed layer area.
When an aqueous virus medium having an infectious titer in the range of 10 to 10 is used as the starting material and the irradiation conditions are as stated above an extremely high proportion of living organisms is killed. in a few seconds of exposure. The duration of exposure can vary widely, but in general it is desirable to minimize the exposure time to avoid undesirable destruction of the antigenic properties inherent in the virus. The preferred exposure period is less than 10 seconds and between 0.5 and 2 seconds, if optimum results are to be obtained.
For example, if one uses ultra-violet light at a wavelength of 2537 Angstroms with an intensity of about 25,000 micro-watts per cm2, exposing the medium containing the living viruses in one layer having an average thickness of 50 microns for one second reduces the infectious titer from 10: - to about 10. In general, the exposure conditions should be such as to reduce this titre to a value of 10 'to 10' 0. A preferred apparatus for the application of the invention is a centrifugal apparatus of the type described in U.S. Patent No. 2,725,482.
This device consists of several parts: an outer tube, slightly conical, which can be animated by a rotational movement of about 40 cm in length with a slope of 4 outwards from the closed lower end. and a diameter
<Desc / Clms Page number 4>
be 9.5 cm inside at the top; an inlet tube suspended from the center of the outer tube and the opening of which is close to the bottom of the outer tube; 6 ultraviolet ray tubular blades of about 30 cm effective length suspended in the outer tube surrounding the inlet tube and arranged so that their outer surface is about 1 cm from the inner wall of the outer rotating tube ;
anda suitable container surrounding the upper part of the outer rotating tube for collecting and discharging the liquid expelled from the upper part of the outer tube with a rapid rotational movement during operation of the apparatus. The apparatus is obviously provided with suitable mechanical devices to drive the outer tube in this rapid rotational movement. In operation, the liquid to be irradiated introduced by the inlet tube flows over the bottom of the rapidly rotating outer tube and is forced outward and upward in the form of a thin layer in the field of ultra-violet lamps.
The thin layer of liquid is continually pushed upward by the introduction of new amounts of liquid through the inlet tube until the liquid finally gushes out of the container surrounding the top of the rotating outer tube and is collected. . Another suitable apparatus is described in U.S. Patent No. 2,588,716. Of course, any other compatible device for exposing thin layers or thin currents to ultraviolet light for a short period is suitable for the implementation of the invention.
The temperature of the aqueous medium during the irradiation is not critical. Unless external heat is applied, the medium is generally at room temperature or at a lower temperature. However, the best results are obtained when the irradiation is carried out on aqueous media at a temperature between 30 and 42 C preferably, 35-40 C, and therefore it is preferable to carry out the irradiation phase of the process after reheating the medium to this temperature.
The heating phase of the process, in cases where it is used, is carried out by heating or incubating the aqueous medium at a temperature of 30 to 50 C for about 2 to 20 days. The preferred range of incubation temperatures is about 35 to 40 C and the incubation time is preferred between 3 and 10 days. To obtain the maximum effect on the virus, it is desirable to quickly place the aqueous medium under the conditions of. incubation, that is, within 2 or 3 hours after being subjected to irradiation or heat plus formaldehyde followed by irradiation.
The heat plus formaldehyde phase of the process, in cases where it is applied, is carried out by adding formaldehyde to the aqueous medium: in a concentration of 1: 2000 to 1: 12,000, preferably 1: 3000 to 1: 5000, and by heating the resulting mixture to a temperature between 30 and 42 C. The preferred heating temperature is between 35 and 40 C and the preferred heating time between 2 and 6 days. When this phase of the process is applied to the initial aqueous medium, the infectious titer is reduced to 10 or less.
The presence of non-toxic amounts of formaldehyde in the final product is desirable to avoid possible harmful enzymatic decomposition reactions and to avoid the formation of yeasts, molds, bacteria, etc. The form is preferably added. : dehyde in the medium in the form of an aqueous solution, sterile, cold and by shaking carefully.
In the foregoing description of the performance of the treatments by irradiation with ultraviolet light, heat and heat plus formaldehyde, the description has been limited for convenience to the treatment.
<Desc / Clms Page number 5>
aqueous medium containing live poliomyelitis virus.
It should be noted, however, that the preceding remarks also apply to aqueous media which have already been subjected to one or other of these destructive treatments. For example, the remarks relating to the heat phase plus formal- dehyde apply to aqueous media containing live poliomyelitis virus which have not been subjected to any destructive treatment) to aqueous media which have already been subjected to the ultraviolet irradiation phase, to media which were subjected to the two phases of heating and ultraviolet irradiation, etc ...,. j
In the practice of the invention, it has been found that the best results are obtained if the initial aqueous medium containing the live poliomyelitis virus is subjected to either bacterial filtration,
that is to say to a Seitz filtration or to an ultra-fine sintered glass filtration, or to a preheating treatment immediately before the execution of the ultraviolet irradiation and / or the heating associated with the. formaldehyde treatment. If preheating treatment is used, the preferred temperature is 48 to 52 C and the heating is carried out for 5 minutes to several hours. This preheating or filtration treatment apparently disperses the individual live virus particles which normally tend to agglomerate, thus facilitating the subsequent exposure of the individual particles to a maximum irradiation intensity or a maximum concentration of. formaldehyde.
The preheating treatment does not, as far as can be determined, lower the titer or potency of the vaccine and indeed appears to ultimately increase the potency of the vaccine. In addition, bacterial filtrations of this type and / or preheating can advantageously be used between the different stages of the process.
If desired, germicidal and / or stabilizing agents can be incorporated into the vaccines of the invention. For example, benzethonium chloride can be added to the products at a concentration of about 1: 20,000 to 1: 50,000, preferably 1: 40,000. A small amount of formaldehyde, i.e. a concentration of 1: 9,000 to 1: 20,000, can, if desired, also be added to vaccines which do not yet contain formaldehyde.
The vaccines of the invention do not contain live poliomyelitis virus. They are also sterile in all other respects, that is to say they do not contain bacteria, yeasts or living molds. These products are capable of producing, by administration to mammals susceptible to infection by live poliomyelitis viruses, immunity in the mammal against infection by the corresponding live virus. The term "administration II used herein and in the claims which follow covers subcutaneous, intra-dermal or intramuscular injection. The vaccines can be used either to obtain other poliomyelitis virus vaccines such as vaccines containing polio virus. viruses precipitated by alum or aluminum phosphate, or can be administered to mammals to achieve immunity.
The products can, if desired, be administered without dilution, but in most cases it is preferable to dilute them with a reasonable amount, i.e. 1 to 4 volumes, of a suitable sterile aqueous medium. Some examples of suitable diluents are sterile Hank's solution, sterile saline water, and sterile distilled water.
The invention is illustrated by the examples which follow.
EXAMPLE 1.
Cells for culturing poliomyelitis virus are prepared according to the method of Dulbecco, Journal of Experimental Medicine, 99,
<Desc / Clms Page number 6>
page 167 (1954). Briefly, this process consists of first preparing a suspension of monkey kidney epithelial cells (see Dulbecco, Proc.Nat.Acad.Sci., 38, page 747 (1952). By processing monkey kidney tissue macerated from healthy monkeys of the Cynomolgus or Rhesus breed, with trypsin to eliminate foreign matter and free individual cells.
These cells are allowed to multiply on a suitable glass surface in a number of tissue culture media. The cultured kidney cell fire thus produced is then inoculated with a type 1 seed culture (Mahoney strain). , polio virus and the mixture is incubated at 36-37 C until destruction of the cells is complete and significant amounts of new viruses have formed. The liquid containing the virus is harvested and passed through an ultra-fine sintered glass candle. The filtrate containing live poliomyelitis virus type 1 is tested for virus content, bacterial sterility and strain purity.
Likewise, a filtrate containing live type 2 (NEF-1 strain) and type 3 (Saukett strain) is prepared and the filtrates are combined.
The combined filtrates containing types 1, 2 and 3 of the poliomyelitis virus and having an infectious titer of 10 'are then passed through a centrifugal machine forming a thin layer at a rate of 600 cm3 per minute under ultraviolet irradiation at a yield. The centrifugal apparatus used of the type described in U.S. Patent No. 2,725.4 produced by the Research Laboratory Division of General Motors Corporation, Detroit, Michigan, comprises a vertical rotating cylindrical cuvette chamber, a device for driving this chamber in a rotational movement at a normal speed of 17,000 revolutions / minute and a tubular assembly of 6 ultra-violet lamps evenly distributed axially inside the chambero The inner diameter of the upper rim of the chamber is approximately 9,
5 cm and the inner wall of the chamber tilts inward from the top at an angle of 4 from the vertical. The height of 1 interior wall of the chamber is approximately 40 cm. The outer surface of the lamp assembly is spaced 1 cm from the inner wall of the chamber and the effective intensity of the ultraviolet irradiation at the inner area of the chamber is approximately 250,000 micro-watts per cm2. The average thickness of the medium layer exposed to the radiation is about 75 microns and the total exposure time 1 second.
The infectious titer of the medium following this exposure is approximately 10 An aliquot of the irradiated medium is then immediately incubated at 37 for 10 days and the infectious titer of the medium after the incubation is 0, i.e. the medium is completely free of the live polio virus. The product thus irradiated and incubated has considerable antigenic properties, as will be seen below.
The antigenic properties of the products obtained above are completed as follows: Rhesus monkeys are inoculated with 3 doses of
1 cm3 of the vaccine at weekly intervals, the animals are bled one week after the end of the series of inoculations, a serum is prepared from the blood collected and the number of antibodies in the serum is determined. This determination is carried out by serially diluting the serum with saline solution and by mixing the diluted aliquots thus obtained with a standardized solution containing a known number of infectious units of the given type of the polio virus.
For example, when attempting to analyze the potency of type 1, a standardized solution containing a known number of infectious units of the type 1 polio virus is used.
1; to analyze type 2 or type 3, from the point of view of potency, a standardized solution of infectious virus type 2 or type 3o is used.The final po: of the titration is the dilution at which the serum contains sufficient
<Desc / Clms Page number 7>
anti-bodies to exactly neutralize, that is, combine with and render non-infectious, the known number of infectious units of the virus in the standardized solution. A number of monkeys are used to analyze the potency of each type of polio virus.
The results thus obtained are expressed in a form facilitating comparison and statistical evaluation by taking the logarithm of the base 2 of the end point of dilution for the serum of each monkey, averaging these figures, and then taking the anti-logarithm of the mean thus obtained. This anti-logarithm is called the geometric mean titer of the vaccines and is obviously different for each type of virus present in the vaccine. As the mean geometric titer depends on the potency of the standardized solution of infectious poliomyelitis virus used in the test, it is necessary to specify the number of infectious units of polio virus present in the standardized solution - to give the mean geometric titer all its meaning.
The method of calculating the geometric mean titer is detailed in Amendment No. 2 of Minimum Requirements of Poliomyelitis Vaccine published May 20, 1954, by United States Department of Health, Education and Welfare.
The results of the determination of the antigenic properties of the vaccine obtained by irradiation after incubation at 37 ° C. are given in Table 1 below.
<Desc / Clms Page number 8>
EMI8.1
z nvmav.L
EMI8.2
9. $ 1 01 91 -T aldmaxa, 1 ap gpgooid '. 101. 099 eT qu-eATrLs U01 + Bq -nout q.3 U01 + B1PB1 1.101 I jT3d nua + qo U1BA. sa9s -TTuuqueu sniTA uaxom np sasnan + aJú1 U9iCora sasxTTin sso.i saq.lun.tP aaqraoM enbïjq.nioag a + 1ili sa6gts ap aaqmon sniTA ap adxl S1IDnOS uOll1 + UBq
EMI8.3
.S1sse sot strep e? S1T1 + n e? S1PBpUB + S u01 + nTQS T ep eUBSS1na $
<Desc / Clms Page number 9>
EXAMPLE 2.
Poliomyelitis virus culture fluid filtrates containing poliomyelitis viruses types 1, 2 and 3 (infection titer 10-6.83) were exposed to ultra-violet light for one second at a rate of. 400 cc / minute (layer thickness; 50 microns) using a centrifugal apparatus, as described in Example 1 under the same working conditions -0.7. The infectious titer of the medium after exposure is approximately 10-0.7.
An aliquot of the medium is incubated at 45 ° C. for 3 days. The incubated vaccine thus obtained is completely free from live viruses and has a high degree of antigenic properties. The following table presents a comparison from the point of view of antigenic properties of these products with vaccine obtained by the formaldehyde process from the same virus culture liquid. Formaldehyde is used at a concentration of 1 to 4,000 and the mixture is incubated at 37 C for 14 days.
<Desc / Clms Page number 10>
EMI10.1
HV31S7I
EMI10.2
'SJTLOf n 6'2 "" - 9 ± ± q.lrepued Oo ±' 1 000 "inod T ap u01 ++ ue '01 a 2 -uoo ua ep.qapTeuzaoj 1 e1Bu1PO pod çzoz 01 ç ± I el aud tuagqo u "Ç :) :) A g 201 G'7 E 0 ± 'aidmexefi ap epgooid el qu-eAT-ns CC * 2 B ±' 1 z sno ± 'UT3pued uO" Çq.q 0'C -noux qu uO " Çq. "ÇP.I" Ç sz z OT 1 d nueq.qo utooeA. se8S -fl'ejq.nau snaf a ap sasnanq.oajuf ueAow S? s111q.n çssaZ S? q.TUn, P eaquion 9, nbTiqguiopO a ..- s seize.9 ap ajqmo snJiA ap aul sfirmos uOIT1q.T #: )
EMI10.3
'stressa sel stzep G.as-11-4n easi-pi-e-puuqs uotq-alos ul ap aaussnd *
<Desc / Clms Page number 11>
EXAMPLE 3.
60 liters of an aqueous medium containing types 1, 2 and 3 of live poliomyelitis virus (infectious titre 10 ') are prepared according to the method indicated in Example 1. An aliquot of the medium is exposed. in ultraviolet light for 1 second at a flow rate of 600 cm3 / minute as indicated in Example 1. The medium, which has an infectious titer after irradiation of 10 ', is then incubated at 37 C for 3 days.
Another aliquot is irradiated in a similar manner, mixed with a sterile aqueous formaldehyde solution, so as to obtain a formaldehyde concentration of 1: 4000, then incubated at 37 ° C. for 3 days.
Another aliquot is heated at 52 C for about an hour, cooled to about 37-40 C, then similarly irradiated and incubated. Another aliquot is similarly heated, cooled, irradiated, mixed with a sterile aqueous solution of formaldehyde so as to obtain a concentration of formaldehyde 1: 4000 and incubated at 37 ° C. for 3 days.
The antigenic properties of the vaccines obtained and those of the untreated aqueous medium containing the live poliomyelitis virus are determined essentially by the same method as in Example 1, but using guinea pigs instead of Rhesus monkeys as test animals. The only procedural differences in the two test modes are that the guinea pigs receive injections of 0.5 cm3 of the vaccine instead of 1 cm3 and that these injections are intra-dermal instead of intra-dermal. -muscle.
The results of the determination of the antigen properties are given in Table 3, which follows.
<Desc / Clms Page number 12>
EMI12.1
z nvmsvi
EMI12.2
59 * T 01 71 r / * TOI 68 5th * - [01 09 aa..z. uou 4audap ap a.zaz.eyI 59 * Tol- 91 te anal axlo gnid GP. & qap -vt / - -ce 891 -Tuulaoj qe uo2.Eps, zz-ç e3j 5, ge, -12e? 9 7 -nuo. zd Jd qtnpoad uxootba S ± '' Ca'C 99 'fez yy X0 ez -nout .a uo.e.p'sa-ç ca2uj -01 66 -jnqoajd JT3d q.pojd uToovA c.01 zz yy' .- j -OT 851 suid apuapTuz.zo, .a .uo.
, 01 07 CI -T3-ppi3j: jT: jT3d qtnpoid utooba 0'I * IZ 'i ±' 47 + / 01 ITZ 7 uoz.qnouç .a uotq 0I 7 7 1 -ps.z-ç aud qtnpojd UTOOBA Seas - Tluaqnau sita ap sesnanqoejut ueom saszT-rn S9q.Tun <p a.zq, ao anb-pq.anio9 ejq.ji seguqoo ap eaqmon s-aiTA ap adel
EMI12.3
#sxBssa soi suspended? s111 + n e? s1PPu + s Tiojq.n-xos i3 '] [ep euss1nd *
<Desc / Clms Page number 13>
EXAMPLE 4.
30 liters of an aqueous medium containing live poliomyelitis virus type 1 (infectious titer 10 - @, 7) are filtered through an ultra-fine sintered glass bacteriological filter. Enough formalin is added to the cold solution with stirring to bring the formaldehyde concentration to 1: 4000 and the mixture is incubated at 37 ° C for 4 days. The suspension obtained which has an infectious titer of 10 is centrifuged in a centrifugal apparatus of the cone type (DeLaval Clarifier) at the speed of 600 cm3 / minute and the clear liquid which comes out is exposed to ultraviolet light using the The centrifugal apparatus for the formation of a thin film described in Example 1. The selected flow speed is 600 cm3 / minute and the energy of ultra-violet light is equivalent to 16-18 watts.
The thickness of the layer during exposure is about 50 microns and the exposure time is slightly less than 1 second. The incident ultraviolet energy is approximately 21,000 micro-watts / cm2 of liquid layer. If a flow rate of 150 or 300 cm3 / minute is used, the energy should be reduced accordingly. The virus solution obtained is again filtered through an ultra-fine sintered glass bacteriological filter and subjected to one sample to standard safety tests. At this time, the vaccine cannot contain live virus, as indicated by a negative result in this safety test. However, the filtered suspension is further incubated at 37 ° C. for 3 days and another sample is then subjected to the same tests.
The tests on this sample also prove the complete absence of live virus.
As described in Example 1, 30 liters of an aqueous medium containing live poliomyelitis viruses of type 2 (infectious titre 10) are prepared, and subjected to the same process as above.
1.30 liters of an aqueous medium containing live poliomyelitis virus type 3 (infectious titre 10-8.5) are prepared as described in Example and subjected to the same process as above except that in the irradiation phase, a flow rate of 600 cm3 / minute and an incident energy of 14 to 16 watts are used.
The three vaccine suspensions prepared as described above are mixed and then diluted with 3 volumes of Hanks sterile solution. The vaccine containing killed polio viruses types 1, 2 and 3 is tested for safety before and after dilution. In both cases :, security tests indicate the complete absence of live viruses. Sufficient benzethonium chloride is added in the form of a cold aqueous solution and stirred vigorously to bring the final concentration to 1: 40,000 and the potency of the vaccine thus obtained is determined for each type of polio virus in monkeys. using the test prescribed by the United States National Institute of Health which includes a comparison with a standard Sera 2A sample from the National Institute of Health.
The results of this test are shown in the following table.
TABLE 4.
EMI13.1
<tb>
<tb>
Sample <SEP> Type <SEP> of <SEP> Number <SEP> of <SEP> #Factor <SEP> of <SEP> power <SEP> on
<tb> submitted <SEP> to <SEP> test <SEP> virus <SEP> monkeys <SEP> used <SEP> monkeys <SEP> (Sample <SEP> of <SEP> com-
<tb>
EMI13.2
parison NIE Ref. Will be 2A)
EMI13.3
<tb>
<tb> <SEP> vaccine obtained <SEP> 1 <SEP> 12 <SEP> 1.0
<tb> by <SEP> irradiation <SEP> 2 <SEP> 12 <SEP> 2,0
<tb> and <SEP> formaldehyde <SEP> 12 <SEP> 2.4
<tb> plus <SEP> heat <SEP> '
<tb>
* The monkey power factor is calculated in each case by dividing the geometric mean titer of the monkey sera tested
<Desc / Clms Page number 14>
for a particular virus type by the mean geometric titer of National Institute of Health sera 2A, relative to the same virus type.
The minimal factors acceptable to monkeys for the different types of polio virus are Type 1 -0.29; Type 2- 0.25 and Type 3 -0.16. (For more simple details see Minimum Requirements of Nationa Institute of Health, November 11, 1955).
When the potency and safety tests have been carried out the vaccine prepared as above is placed in vials under sterile conditions and the vials are sealed. A number of vials prepared in this manner are randomly selected and their content is submitted. - held to the safety test. This safety test indicates the complete absence of live polio virus. The resulting vaccine is suitable for immunizing humans against the effects of infection with live types 1,2,3 of poliomyelitis viruses. If desired, the vaccine can also be used for the production of other vaccine-like products, for example, polio vaccines precipitated by alum or aluminum phosphate.
EXAMPLE 5.
30 liters of an aqueous medium containing the type 1 poliomyelitis virus (10 'infectious titer) prepared as described in Example 1 are filtered through an ultra-fine sintered glass bacterial filter. Sufficient formalin is added to the cold solution in shaking to bring the formaldehyde concentration to 1: 4000 and the mixture is incubated at 37 ° C. for 4 days. The suspension obtained which has an infectious titer of less than 10 'is centrifuged in a centrifuge of the cone type. (De Laval Clarify at the rate of 600 cc / minute and the clear effluent is exposed to ultraviolet light using the centrifugal layering apparatus described in Example 1.
The ultra-violet light source has an incidence of 20 watts and a flow rate of 600 cm3 / minute. The film thickness during exposure is about 50 microns and the exposure time slightly less than one second. The number of microwatts of incident ultra-violet energy is approximately 21,000 / cm2 of liquid layer. 600 cc of the vaccine thus obtained was subjected to standard safety tests and found to contain no live poliomyelitis virus.
As described in Example 1, 30 liters of an aqueous medium containing live poliomyelitis viruses of type 2 were prepared and treated as described above. The results of the safety trials on this vaccine show that it does not contain any live polio virus.
30 liters of an aqueous medium containing live poliomyelitis virus type 3 is prepared as described in the example and treated as described above. Safety tests applied to this vaccine show that it does not contain live polio virus.
The three vaccines prepared as described above are mixed and after taking a 900 cm3 sample for safety testing, the mixture is diluted with three volumes of sterile Hank's solution. A 900 cc sample of the diluted vaccine was then tested for safety together with the undiluted sample and both were found to be completely free of live poliomyelitis virus. Sufficient benzethonium chloride was added to the vaccine. vaccine to bring the concentration to 1: 40,000. The obtained product is potency tested on signs using the method given in Example 4. The results of this test are shown in Table 5.
<Desc / Clms Page number 15>
TABLE 5.
EMI15.1
<tb>
<tb>
Sample <SEP> Type <SEP> of <SEP> Number <SEP> of <SEP> Factor <SEP> of <SEP> power <SEP> on
<tb> submitted <SEP> to <SEP> test <SEP> virus <SEP> monkeys <SEP> used <SEP> monkeys <SEP> (Comparison
<tb> Standard <SEP> NIH <SEP> Ref.Sera <SEP> 2A)
<tb> Vaccine <SEP> product <SEP> 1 <SEP> 12 <SEP> 6.7
<tb> by <SEP> irradiation
<tb> and <SEP> formaldehyde <SEP> 2 <SEP>, 12 <SEP> 4,5
<tb> plus <SEP> heat <SEP> 3 <SEP> 12 <SEP> 3.6
<tb>
After performing the potency and safety tests, the vaccine is filled into ampoules under sterile conditions and the ampoules sealed.
The product thus obtained is suitable for immunizing humans against infection with live poliomyelitis viruses of the types
1, 2 and 30
Although certain particular forms of the invention have been described above, it is clear that the latter is not limited thereto and that numerous modifications can be made thereto without departing from its scope.