Procédé de préparation d'un vaccin antipoliomyélitique
La présente invention concerne un procédé de préparation d'un vaccin antipoliomyélitique à partir de virus vivant de poliomyélite.
Conformément à la présente invention, on soumet un fluide aqueux contenant du virus vivant de poliomyélite à l'action à la fois d'un rayonnement ultraviolet et de la p-propiolactone, de telle sorte que l'une desdites actions soit suffisante pour tuer une proportion importante du virus vivant de poliomyé- lite présent dans le fluide et que l'autre desdites actions soit suffisante pour tuer tout le virus vivant de poliomyélite résiduel présent dans le fluide, ni l'une ni l'autre de ces actions, dans la mesure où on les utilise, n'étant susceptible de tuer complètement le virus vivant de poliomyélite initialement présent dans le fluide.
L'ordre dans lequel on utilise les deux agents n'est pas critique, c'est-à-dire que l'on peut soumettre le virus tout d'abord à l'action du rayonnement ultraviolet puis à l'action de la (3-propiolac- tone ; l'ordre de traitement inverse est également satisfaisant. On peut également mettre les deux trai tements en oeuvre simultanément.
Le vaccin obtenu par ce procédé est non seulement exempt de virus vivant de poliomyélite, mais il possède encore un degré de pouvoir antigène plus élevé qu'un vaccin fabriqué par le procédé connu d'inactivation par le formaldéhyde. Il présente l'avantage supplémentaire, à l'opposé du vaccin tué au formaldéhyde, que le virus de poliomyélite tué et présent dans le vaccin ne montre aucune tendance à se réactiver lors du stockage. Ce vaccin présente un autre avantage qui réside dans le fait que l'agent chimique auquel on a recours pour son obtention, à la différence d'autres agents chimiques tels que le formaldéhyde, se détruit lui-même lors du stockage, en se décomposant facilement en sous-produits inoffensifs.
Le procédé selon l'invention est applicable aux différents types de virus poliomyélitiques, à savoir les types 1, 2 et 3. On peut utiliser comme matière première des mélanges de ces trois types, mais en n général on traite séparément chaque type de virus et le vaccin ainsi obtenu est combiné par la suite avec le vaccin ou les vaccins préparés à partir de l'autre ou des autres types de virus.
On peut obtenir commodément le fluide aqueux contenant le virus de poliomyélite vivant auquel on a recours comme matière première du procédé à partir d'un tisssu servant de milieu de culture dans lequel le virus poliomyélitique s'est accru ou s'est multiplié. On peut isoler le fluide par n'importe quel moyen convenable, par exemple par filtration, décantation, centrifugation, etc. Il est commode d'utiliser un filtrat de culture sur tissu provenant d'un milieu connu sous le nom de milieu de culture sur tissu 199 , porteur de virus poliomyélitique.
Un exemple d'un tel fluide de culture sur tissu est celui obtenu par filtration d'une culture de virus poliomyélitique sur tissu de rein de singe, obtenue comme il est décrit par Dulbecco et autres dans le Journal of Experimental Medicine Volume 99, page 167 (1954). Selon ce procédé, on soumet des tissus de rein de singe macérés à l'action de la trypsine en vue d'en séparer les tissus étrangers, on laisse les cellules résiduelles se multiplier, on inocule les milieux à l'aide de virus poliomyélitique, on fait incuber le mélange et on recueille le fluide. Bien que ce procédé soit celui que l'on préfère, on peut si on le désire omettre le stade de traitement par la trypsine.
Dans ce dernier cas, toutefois, la teneur en protéine du vaccin peut être excessivement élevée et il convient de l'essayer avant usage afin d'éviter la production de vaccins pouvant donner des réactions
aux protéines. Dans la fabrication de vaccins mixtes, c'est-à-dire de vaccins contenant plus d'un type de virus de poliomyélite, il est permis de mettre en commun ou de mélanger les fluides recueillis contenant les divers types de virus avant de mettre en oeuvre le procédé de la présente invention, mais comme on l'a indiqué ci-dessus, il est généralement préférable de mettre en commun ou de mélanger les vaccins individuels après la mise en oeuvre du procédé.
En pratique, on a intérêt à employer une matière première à base de virus possédant un pouvoir antigène élevé et c'est pourquoi il convient que le titre d'infectiosité du fluide aqueux soit d'ordre élevé, c'est-à-dire au moins égal à 10-5. On utilise en général un fluide ayant un titre d'infectiosité de l'ordre de 10-5 ou plus. Dans des conditions normales de stockage, on conserve le fluide aqueux en le soumettant à une réfrigération, par exemple à une température comprise entre-50 et 10 C. Lorsqu'il est traité ultérieurement, le fluide se réchauffe, sui- vant les conditions de température utilisées au cours du traitement.
Le fluide aqueux contenant le virus poliomyélitique vivant est en général produit dans des conditions aseptiques, ce que l'on assure en soumettant le milieu à une filtration bactérienne avant de l'appliquer dans le procédé. En outre, on peut concentrer et (ou) partiellement purifier le virus vivant et employer de telles solutions comme matières premières pour le procédé.
Comme il a été indiqué précédemment, le fluide contenantlelvirus estsoumis à l'aution du rayonnement ultraviolet et de la p-propicilaotone. On peut mettre en oeuvre la phase du procédé correspondant à l'irra- diation par l'ultraviolet en exposant une mince pellicule ou un mince courant du fluide aqueux contenant du virus de poliomyélite vivant à de la lumière ultraviolette dont la longueur d'onde est comprise entre 2000 et 3000 angströms et dont l'intensité est suffisamment forte pour réduire le titre d'infectiosité à une valeur extrêmement basse en un court espace de temps, ou bien lorsqu'on a recours à un fluide déjà exposé à la ss-propiolaotone,
suffisamment forte pour réduire le titre d'infectiosité à zéro en un court espace de temps. Pour garantir les résultats désirés, il convient en général que l'épaisseur moyenne de la pellicule ou du courant qui est exposé ne soit pas supérieure à 100 microns et soit de préférence infé- rieure ou égale à 50 microns. On peut utiliser une épaisseur un peu supérieure à 100 microns, mais dans ce cas on a besoin de durées d'exposition plus longues et en conséquence il en résulte également une perte plus grande du pouvoir antigène. Il convient que la source de lumière ultraviolette utilisée contienne une proportion élevée, de préférence s'élevant jusqu'à 95 %, d'énergie ayant une longueur d'onde de 2537 angströms.
Les sources de lumière émettant une proportion un peu plus faible d'énergie à cette longueur d'onde désirée sont satisfaisantes mais moins efficaces. Pour obtenir les meilleurs
résultats, on peut utiliser une source de lumière uniforme émettant 95 % de son énergie pour une lon- gueur d'onde de 2537 angströms, et ayant une puis
sance totale réelle de 10 à 25 watts. On utilise commodément la source lumineuse à une distance d'environ un centimètre de la surface du milieu aqueux à exposer. Pour des besoins ordinaires, il convient que l'intensité de rayonnement de la source de lumière soit telle qu'elle fournisse de 12 500 à 32 000 micro-watts environ par centimètre carré de surface de la pellicule soumise à l'exposition.
Lorsqu'on a recours comme matière première à un fluide aqueux contenant du virus et ayant un titre d'infectiosité compris entre 10- et 10-8 et que l'on a recours aux conditions d'irradiation indiquées, une proportion extrêmement élevée d'organismes vivants est tuée en l'espace de quelques secondes d'exposi- tion. On peut faire varier considérablement la durée d'exposition, mais en général il est avantageux de réduire au minimum cette durée d'exposition afin d'éviter toute destruction excessive du pouvoir antigène inhérent au virus. On préfère adopter une durée d'exposition inférieure à 10 secondes, et pour obtenir les meilleurs résultats, une durée de 0, 5 à 2 secondes.
Par exemple, lorsqu'on utilise de la lumière ultraviolette dont la longueur d'onde est de 2537 angströms avec une intensité d'environ 25 000 micro-watts par centimètre carré, l'exposition pendant une seconde du fluide contenant le virus vivant sous la forme d'une pellicule ayant une épaisseur moyenne de 50 microns réduit le titre d'infectiosité de 10-7 jusqu'à environ 10-t. En général, il convient que les conditions d'exposition soient telles que le titre d'infectiosité soit réduit à une valeur comprise entre l0¯ s5 et 10-25.
Pour la mise en pratique du procédé selon la présente invention, le dispositif que l'on préfère est un appareil centrifuge de formation de pellicule du type décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 2725462. Ce dispositif est constitué de plusieurs parties, à savoir : un tube ou un godet cylindrique légèrement conique et que l'on peut faire tourner, ayant environ 40 cm de longueur et présentant une inclinaison vers l'extérieur de 1 à partir de l'extrémité fermée constituant le fond et un diamètre intérieur de 9, 5 cm au sommet ; des moyens pour faire tourner rapidement le godet ; un tube d'amenée suspendu au centre du godet et dont l'orifice est placé près du fond du godet ;
six lampes à ultraviolet ayant approximativement 30cm de longueur efficace, suspendues dans le godet, entourant le tube d'amenée et disposées de telle sorte que leur surface externe soit à environ 1 cm de la paroi intérieure du godet ; et un récipient convenable entourant le sommet du godet en vue de recueillir et d'évacuer le fluide qui est refoulé du sommet du godet lorsque celui-ci tourne rapidement pendant le fonctionnement du dispositif. En fonc- tionnement, on introduit le fluide à irradier par le tube d'amenée dans le fond du godet en rotation rapide et il se trouve refoulé vers l'extérieur et dans une direction ascendante sous la forme d'une pelli- cule en regard des lampes à ultraviolet.
La pellicule de liquide est continuellement repoussée vers le haut par l'introduction d'une nouvelle quantité de matière arrivant par le tube d'amenée jusqu'à ce que finalement elle se répande dans le récipient entourant le sommet du godet et soit recueillie. Un autre dispositif qui convient a été décrit dans le brevet des
Etats-Unis d'Amérique No 2588716.
La température du fluide aqueux pendant l'irra- diation n'est pas critique. A moins d'appliquer de la chaleur extérieure, le fluide sera ordinairement à une température inférieure ou égale à la température ambiante. Toutefois, on obtient des résultats satisfaisants lorsque l'on effectue l'irradiation sur des fluides aqueux ayant une température supérieure, 370 à 40 C par exemple.
Dans la phase du procédé où l'on a recours à la p-propiolactone, la quantité de p-propiolactone doit être inférieure à celle nécessaire pour tuer complètement tout le virus de poliomyélite vivant se trouvant dans le fluide aqueux non traité. Dans ce but, lorsqu'on utilise des fluides aqueux contenant du virus et dont le titre est compris dans la gamme de ceux auxquels on a recours ordinairement dans la fabrication des vaccins antipoliomyélitiques, la quantité de p-propiolactone à laquelle on a recours est ordinairement comprise entre 0, 0002 et 0, 0010 gramme ut de préférence entre 0, 0004 et 0, 0006 g par millilitre de fluide contenant du virus.
Dans les cas où on emploic la, 8-propiolactone en plus grande quantité, l'excès restant après l'inactivation de virus peut être aisément décomposé par chauffage. Dans s la mesure où il a été possible de le déterminer, chacun des types de virus de poliomyélite exige l'appli- cation d'environ les mêmes concentrations de P-pro- piolactone. Du fait de la sensibilité aux acides et aux alcalis de la protéine qui se trouve dans le fluide aqueux auquel on a recours comme matière pre mière, on met de préférence le procédé en oeuvre à une valeur du pH comprise entre 5 et 9, et pour obtenir les meilleurs résultats compris entre 7, 5 et 8, 5.
La température à laquelle on effectue cette phase du procédé n'est pas critique et on peut la faire varier largement. Pour une température relativement basse, la vitesse d'inactivation est faible, par exemple à une température de 4 C, on a besoin d'une période de 24 à 72 heures pour l'inactivation.
Par conséquent, il est préférable d'effectuer cette phase du procédé à la température ambiante ou à une température supérieure. La température optimum est d'environ 370 C et quoique l'on puisse effectuer cette phase du procédé à une température plus élevée, le produit final a tendance à cette tem pérature plus élevée à perdre de manière indésirable son pouvoir antigène. En conséquence, il est avantageux d'opérer à une température comprise entre 200 et 40O C. La réaction qui a lieu par suite du traitement par la p-propiolactone est à la fois irré- versible et rapide.
Le produit contenant le virus est fixé en ce qui concerne la destruction des virus, c'est-à-dire que le virus n'a pas de retour de virulence après stockage, dilution ou autre traitement.
Le virus est ordinairement tué complètement en l'espace de deux heures ou moins à une température de 37O C. Il est important que la p-propiolactone que l'on utilise soit fraîche. Il ne faut pas avoir recours à de la p-propiolactone qui n'a pas été stockée en étant soumise à une réfrigération ou bien que l'on a laissée venir au contact de l'humidité. La p-propiolaotone susceptible d'être obtenue dans le commerce sous forme purifiée est satisfaisante.
Ce qui précède a été limité au traitement des fluides aqueux contenant du virus poliomyélitique complètement virulent. Toutefois, on peut également traiter des fluides qui ont déjà été soumis à une inac- tivation partielle ou dans lesquels le virus a déjà été partiellement tué.
On a constaté que l'on obtient les résultats les plus réguliers si l'on soumet le fluide aqueux initial contenant le virus poliomyélitique vivant soit à une filtration bactérienne par exemple une filtration de Seitz, soit à une filtration sur du verre fritte extrê- mement fin, avant l'irradiation ou le traitement par la p-propiolactone.
Si on le désire, on peut incorporer dans les vaccins obtenus par le procédé de l'invention des agents germicides et (ou) stabilisants. Par exemple, on peut ajouter du chlorure de benzothonium dans les vaccins obtenus jusqu'à une concentration d'environ 1 : 20 000 à 1 : 50 000 et de préférence une concentration de 1 : 40 000.
Les vaccins obtenus par le procédé de l'inven- tion ne contiennent pas de virus poliomyélitique vivant. Ils sont également stériles sous tous les autres rapports, c'est-à-dire qu'ils ne contiennent pas de bactéries, de levures ou de moisissures vivantes. Les produits obtenus sont susceptibles après avoir été administrés à des mammifères sensibles à une con tamination par le virus poliomyélitique vivant, de produire une immunité du mammifère contre une contamination par le virus vivant correspondant. Le terme administrer signifie une injection sous-cutanée, intradermique ou intramusculaire.
On peut, si on le désire, administrer les produits sans les diluer, mais si leur activité est supérieure aux exigences des essais normalisés, on peut les diluer à l'aide d'une quantité raisonnable d'un milieu aqueux stérile convenable. Comme exemples de diluants convenables, on peut citer la solution stérile de Hank, de l'eau salée stérile et l'eau distillée stérile.
Exemple 1
On prépare des cellules destinées à la culture du virus poliomyélitique par le procédé de Dulbecco défini dans le Journal of Experimental Medicine, 92, page 167 (1954) . En résumé, ce mode opératoire consiste à préparer tout d'abord une suspen- sion de cellules épithéliales de rein de singe (voir
Dulbecco, Proc. Nat. Acad. Sci. 38, page 747 (1952)) en traitant un tissu macéré de rein de singe provenant de singes Cynomolgue ou Rhésus bien portants, parde ! latrypsineenvued'alimnner la matière étrangère et de libérer les cellules individuelles. On laisse ces cellules se multiplier sur une surface de verre convenable dans n'importe lequel d'un certain nombre de milieux de culture de tissus tels que le milieu 199 .
On inocule ensuite la couche de cellules de rein ainsi obtenue à l'aide d'une culture d'ensemencement du virus poliomyélitique du type 1 (souche Mahoney) et on fait incuber le mélange à une tem pérature de 36-370 C jusqu'à ce que la destruction des cellules soit complète et que l'on ait libéré de grandes quantités de virus nouveau. On recueille le fluide contenant le virus et on le fait passer à travers une bougie en verre fritté extrêmement fin. On essaie le filtrat contenant le virus poliomyélitique vivant du type 1 en ce qui concerne sa teneur en virus, sa stérilité bactérienne et la pureté de souche.
D'une manière analogue, on prépare un filtrat contenant du virus vivant du type 2 (souche MEF-1) et un filtrat contenant le type 3 (souche Saukett).
On refroidit à 40 C quatre litres du filtrat contenant du virus poliomyélitique du type 1 et ayant un titre d'infectiosité de 10-6, et on y ajoute, tout en agitant, 20 ml d'une solution aqueuse à 10 % contenant 0, 115 g/ml de ss-propiolactone. On laisse reposer à cette température pendant deux heures la solution ainsi obtenue, qui contient 0, 0005 g/ml de ss-propiolactone et on la fait ensuite passer à travers un appareil centrifuge de formation de pellicule, à la vitesse de 600 ml à la minute en l'exposant à un rayonnement ultraviolet ayant une puissance de 25 watts.
Le dispositif centrifuge de formation de pellicule que l'on utilise, qui appartint au type décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique No 2725482 précité et qui est fabriqué par la Research Laboratory Division de la General
Motors Corporation, Detroit, Michigan, comprend une chambre cylindrique en forme de godet disposée verticalement, susceptible d'être mise en rotation, des moyens pour faire tourner la chambre à une vitesse de fonctionnement normale de 1700 tours à la minute, et un ensemble tubulaire formé de six lampes à ultraviolet régulièrement réparties et disposées axialement à l'intérieur de la chambre.
Le diamètre intérieur du bord supérieur de la chambre est approximativement de 9, 5 cm et la paroi intérieure de la chambre est inclinée vers l'intérieur à partir du sommet, la pente étant de lo par rapport à la verticale. La hauteur verticale de la paroi intérieure de la chambre est approximativement de 40 cm. La surface extérieure de l'ensemble de lampes se trouve à une distance de 1 cm de la paroi intérieure de la chambre et l'intensité efficace du rayonnement ultraviolet sur la surface intérieure de la chambre est approximativement de 25 000 micro-watts par centimètre carré. L'épaisseur moyenne de la pellicule de la solution exposée à l'irradiation est approximativement de 75 microns et la durée totale d'exposition est d'une seconde.
A la suite de cette exposition combinée, il n'y a aucun virus vivant résiduel susceptible d'être détecté dans la solution par une titration du type courant avec du tissu de rein de singe, titration dans laquelle on ensemence dix échantillons de 0, 5 ml et on les conserve pendant sept jours. Toutefois, des traces de virus vivant peuvent être présentes ; ceci peut être démontré par un essai de sécurité, par exemple l'essai normalisé de sécurité exposé dans le document Minimum Requirements of Poliomyelitis Vaccine publié le 11 novembre 1955 par le Ministère de la Santé Publique des
Etats-Unis d'Amérique.
On fait ensuite incuber la solution irradiée à une température de 37 C pendant trois heures. A la suite de l'incubation, la solution est complètement exempte de virus poliomyélitique vivant, comme l'in- dique le résultat négatif obtenu dans l'essai de sécurité. L'essai de sécurité utilisé est une variante de l'essai normalisé que l'on vient de citer, variante dans laquelle on ensemence chacune de dix bouteilles contenant le milieu nutritif de culture de tissu à l'aide d'une partie aliquote de 50 ml du vaccin et on les conserve dans des conditions favorables à la croissance du virus pendant 32 jours. L'absence de croissance du virus indique que le vaccin est sûr.
De la même manière, on prépare deux autres lots de vaccin à base de virus poliomyélitique tué à partir de souches différentes de virus, l'un des lots provenant de la souche du type 2 (MEF-1) et l'autre provenant de la souche du type 3 (souche Saukett).
Sous tous les autres rapports, la préparation de ces deux lots de vaccin est identique à la préparation du vaccin ci-dessus contenant la souche tuée du type 1 ; ces vaccins sont également exempts de virus vivant de poliomyélite, comme on peut le mettre en évi- dence par le procédé de l'essai de sécurité cité ci-dessus.
Les trois vaccins (des types 1, 2 et 3) possèdent un pouvoir antigène d'un ordre élevé et on peut les utiliser de manière convenable soit seuls soit en combinaison, ou bien on peut les diluer à l'aide d'eau salée stérile ou de solution de Hank stérile, comme on le désire, en vue de réaliser des vaccins moins concentrés.
On peut déterminer de la manière suivante le pouvoir antigène des vaccins obtenus. On prépare une gamme de dilutions progressives du vaccin. On répartit par groupes de cinq à dix de jeunes poussins (âgés de sept à dix jours) chaque groupe devant recevoir par injection individuelle intramusculaire une des dilutions préparées. On inocule alors à chaque poussin deux doses de 0, 5 ml du vaccin à deux semaines d'intervalle. On saigne ensuite les poussins une semaine après la dernière injection, on sépare le sérum du sang et on l'essaie séparément pour rechercher la présence d'anticorps spécifiques à un faible taux de dilution (1 : 4).
Dans cet essai, on oppose un volume de 0, 25 ml du sérum dilué à un volume égal de fluide de culture sur tissu contenant de 10 à 1000 doses infectieuses à 50% en culture sur tissu (TCIDÏo) du type particulier de virus de poliomyélite dont on doit rechercher les anticorps dans le sérum. Au mélange de ces deux volumes placé dans un récipient convenable, on ajoute 0, 25 ml de cellules de rein de singe trypsinisées en milieu nutritif, la concentration étant de 240 000 cellules par ml. On fait ensuite incuber tout le mélange dans des conditions favorables à la croissance des cellules et du virus. Sept jours après, on examine ces cultures de tissus au microscope pour déceler la dégénérescence cytopathique résultant de la croissance du virus.
Celles des cultures qui ont été protégées du virus qui leur a été opposé par les anticorps du sérum particulier ne manifestent pas cette dégénérescence. On peut déterminer le taux de dilution en antigène 50 % ou titre de dilution antigène à partir des sérums apportant une protection et provenant de poussins ayant reçu l'inoculum à la dilution maximum. On peut calculer commodément ce résultat par le procédé de Reed and Muench relaté dans le périodique American Journal of Hygiene , Volume 27, pages 492-497 (1938) et exposé sous une forme modifiée dans le livre d'essais normalisés Viral and Rickettsial Infections of
Man River, pages 75 et 76, J.-B. Lippincott Company.
Cette détermination révèle la mesure suivant laquelle on peut diluer la préparation d'antigène pour susciter la formation d'anticorps chez 50 % des poussins recevant la dilution d'inoculum. Etant donné que la concentration de la dose opposée dans l'essai de neutralisation par le sérum peut avoir une certaine influence sur la valeur numérique du titre de dilution antigène, on indique ci-après la dose opposée de manière à faire ressortir l'importance propre de la valeur de cette dose pour le titre de dilution antigène.
Dans le tableau 1 ci-dessous, on donne les résultats de la détermination du pouvoir antigène des vaccins obtenus par le procédé ci-dessus, que l'on peut comparer avec ceux des filtrats non traités contenant le virus vivant auquel on a recours comme matière première.
Tableau I
Titre Concentration
Echantillon soumis à l'essai de dilution antigène op-posee
(TCIDso)
Vaccin du type 1 obtenu par
traitement par 0, 05 % de
ss-propiolactone et par la
lumière ultraviolette 10-s. os 204
Filtrat non traité contenant
du virus poliomyélitique
vivant (type 1). 10- :
1, 32 204
Vaccin du type 2 obtenu par
traitement par 0, 05 % de
-proiolactane et par la
lumière ultraviolette (type
2) 10-259 32
Tableau 1 (suite)
Titre Concentration
Echantillon soumis à l'essai de dilution de la dose antigène opposée
(TCIDy-)
Filtrat non traité contenant
du virus vivant de polio
myélite (type 2) 10-3, 0 32
Vaccin de type 3 obtenu par
traitement par 0, 05 % de
0-propiolactone et par la
lumière ultraviolette.
lo-t, 58
Filtrat non traité contenant
du virus de poliomyélite
vivant (type 3) 10-2, 58
Le pouvoir antigène des produits reste à un niveau élevé pendant de longs espaces de temps.
Ceci est mis en évidence dans le cas des vaccins susmentionnés (des types 1, 2 et 3) après un stockage de six mois dans des conditions de réfri- gération. A la fin de la période de stockage, on dilue chacun des produits avec trois volumes de solutions stériles de Hank, on met en commun les trois solutions résultantes et on détermine le pouvoir antigène de ce mélange. On effectue cette détermination non seulement au moyen de l'essai susmentionné sur les poussins qui indique le titre de dilution antigène, mais également par un essai classique en utilisant des singes comme animaux d'essai au lieu de poussins.
Les détails de cet essai sont exposés dans le document Amendment Number 2 to the Minimum
Requirements of Poliomyelitis Vaccine publié le 20 mai 1954 par le Ministère de la Santé Publique des Etats-Unis d'Amérique. En résumé, on effectue cet essai de la façon suivante : on inocule des singes
Rhesus à l'aide de trois doses de 1 ml du vaccin à des intervalles d'une semaine, on saigne les animaux une semaine après la fin de la série d'inoculations, on prépare un sérum à partir du sang recueilli et on détermine le nombre d'anticorps présents dans le sérum.
On procède à cette détermination en effectuant une série de dilutions du sérum à l'aide d'eau salée, et en mélangeant les parties aliquotes diluées ainsi obtenues avec une solution normalisée contenant un nombre connu d'unités infectieuses du type donné de virus poliomyélitique. Par exemple si l'on procède à la détermination de l'activité du sérum vis-à-vis du virus du type 1, on a recours à une solution normalisée contenant un nombre connu d'unités infectieuses de virus de poliomyélite du type 1 ; pour effectuer la détermination en ce qui concerne le type 2 ou le type 3, on a recours à une solution normalisée de germes infectieux de virus de type 2 ou 3.
Le point final de la titration est la dilution pour laquelle le sérum contient suffisamment d'anticorps pour neutraliser exactement le nombre connu d'unités infectieuses de virus se trouvant dans la solution normalisée, c'est-à-dire pour se combiner avec elles et les rendre non infectieuses. On a recours à un certain nombre de singes pour l'analyse de l'activité pour chaque type de virus poliomyéli- tique. Etant donné que le titre géométrique moyen dépend du pouvoir de l'activité de la solution normalisée du virus poliomyélitique infectieux à laquelle on a recours dans l'essai, il est nécessaire de préciser le nombre d'unités infectieuses de virus de poliomyélite présentes dans la solution normalisée pour préciser la signification propre du titre géométrique moyen.
Le procédé de calcul du titre géométrique moyen est exposé en détail dans le document Amendment Number 2 of the Minimum Requirements of Poliomyelitis Vaccine publié le 20 mai 1954 par le Ministère de la Santé Publique des
Etats-Unis d'Amérique.
On détermine également le facteur d'activité sur le singe pour chaque type de virus : cette détermi- nation comporte une comparaison avec le titre géométrique moyen du sérum de Référence des Etats
Unis d'Amérique (IIA-1) du National Institutes of
Health . Les résultats de ces déterminations sont exposés dans le tableau II qui suit : Tableau 11
Essai sur des poussins Essai sur des singes
Type Titre Concentration Titre Concentration Facteur
Echantillon essaye de de dilution de la dose géométrique de la dose d'activité
virus antigène opposée opposée sur les singez.
(TCIDso) (TCIDSa)
Vaccin mélangé contenant les types
1, 2 et 3 de virus de poliomyélite
tués par 0, 05 % de p-propiolactone
et par la lumière ultraviolette et
conservé pendant six mois 1 10¯ 24 83 53 1, 1
2 10-in 27 63 68 1, 27
3 10-1, 4 22 33 36 0, 47
* Pour un type de virus particulier, on calcule le facteur d'activité sur le singe en divisant le titre géométrique
moyen du sérum inoculé au singe soumis à l'essai par le titre géométrique moyen du sérum de Référence
IIA-1 (National Institutes of Health) en ce qui concerne le même type de virus.
Les facteurs minimums acceptables pour le singe pour les divers types de virus poliomyélitique sont : type 1-0, 29 ; type 2-0, 25 et type 3-0, 16. Des détails supplémentaires sont donnés dans Minimum
Requirements of Poliomyelitis Vaccine publié le 11 novembre 1955, par le Ministère de la Santé
Publique des Etats-Unis d'Amérique.
Il ressort du tableau ci-dessus qu'après un stockage de six mois, le vaccin n'est pas altéré de manière importante en ce qui concerne le pouvoir antigène ou l'activité. Il convient d'indiquer que les titres des dilutions antigènes des vaccins des tableaux I et II susceptibles d'être composés sont différents, mais que ceci est dû en grande partie au fait que le vaccin du tableau Il a été dilué au douzième. Il est important que l'activité du vaccin, après un stockage prolongé, dépasse les normes officielles pour chaque type de virus, et ceci très largement.
Bien que l'on ne connaisse pas les causes des qualités inhabituelles de conservation que présentent les vaccins obtenus par le procédé de la présente invention, on suppose que ces qualités sont dues au moins en partie au fait que l'agent chimique d'inacti- vation, à savoir la p-propiolactone, se distingue des autres agents chimiques tels que le formaldéhyde, par une dégradation rapide, sans précautions spé ciales, en se transformant en sous-produits inoffensifs qui sont compatibles avec les facteurs antigènes du vaccin et n'ont pas d'influence nuisible sur eux.
Exemple 2
Sur un filtre en verre fritté extrêmement fin, on filtre un milieu aqueux contenant du virus polio myélitique vivant du type 1 (Mahoney) (titre d'in fectiosité 10-6), préparé comme il est décrit dans l'exemple 1. Dans quatre litres du filtrat, on verse 20ml d'une solution aqueuse à dix pour cent de-pro piolactone (contenant 0, 115 g de, 8-propiolactone par millilitre).
On chauffe pendant deux heures à 37O C le mélange ainsi obtenu, qui contient 0, 0005 g de p-propiolactone par millilitre, et on fait ensuite passer la suspension ainsi obtenue, qui a un titre d'infectiosité inférieur à 10- st, à travers un appa reil centrifuge pour la formation de pellicules suivant un débit de 600 ml à la minute, en exposant ledit mélange à un rayonnement ultraviolet dont la puissance est de 25 watts, et en ayant recours au dispositif et au procédé décrits dans l'exemple 1.
L'épaisseur de la pellicule pendant l'exposition est approximativement égale à 50 microns et la durée d'exposition est légèrement inférieure à une seconde.
On filtre à nouveau la solution de virus ainsi obte- nue sur un filtre en verre fritté extrêmement fin et on en soumet un échantillon à un essai de sécurité, comme il est décrit dans l'exemple 1. A ce stade, le vaccin ne contient pas de virus vivant, ce qui est indiqué par un résultat négatif obtenu dans l'essai de sécurité.
On prépare de la même manière deux autres lots de vaccins tués de virus de poliomyélite à partir de différentes souches de virus, l'un des lots provenant de la souche du type 2 (MEF-1) et l'autre de la souche du type 3 (Saukett). Pour le reste, on a recours au mode opératoire utilisé pour le vaccin n ci-dessus contenant la souche tuée du type 1 ; ces vaccins sont également exempts de virus poliomyéli- tique vivant.
Les trois vaccins ainsi obtenus (types 1, 2 et 3) possèdent un pouvoir antigène d'un ordre élevé et peuvent être utilisés de manière convenable soit seuls, soit en combinaison, ou bien on peut les diluer soit à l'aide d'une solution saline stérile, soit avec une solution stérile de Hank, à volonté, de manière à obtenir des vaccins moins concentrés.
On détermine le pouvoir antigène des trois lots de virus en fonction du titre de dilution antigène, du titre géométrique moyen et du facteur d'activité sur le singe, en opérant conformément aux procédés exposés dans l'exemple 1. Dans le tableau III ci-dessous, on donne les résultats de la détermination du pouvoir antigène ainsi obtenu, que l'on rapproche des résultats comparables obtenus pour des filtrats non. traités contenant le virus vivant auquel on a recours comme matière première.
Tableau III
Essai sur des poussins Essai sur des singes
Titre Concentration Titre Concentration facteur Echantillon traite de dilution de la dose gométrique de la dose d'activité
antigène opposée moyen opposée sur les singes
(TCIDo) (TCIDso)
Vaccin du type 1 obtenu par traitement par
0, 05 % de ss-propiolactone et par la lumière
ultraviolette 10-2, 0 204 13, 4ci
Filtrat non traite contenant du virus poliomyéli-
tique vivant du type 1 10-2,33 204 - -
Vaccin du type 2 obtenu par traitement par
0, 05 % de p-propiolactone et par la lumière
ultraviolette.
10-2, 32 141 32 1, 18
Filtrat non traité contenant du virus poliomyéli-
tique vivant du type 2 10-3, 32---
Vaccin du type 3 obtenu par traitement par
0, 05 % de ss-propiolactone et par la lumière
ultraviolette 10-1, 58 100 58 1, 45
Filtrat non traité contenant du virus poliomyéli-
tique vivant du type 3 10-2, 58---
Il ressort du tableau III que le pouvoir antigène des trois types de vaccins obtenus par le procédé de la présente invention est sensiblement aussi élevé que celui des échantillons témoins non traités,
tout en étant bien supérieur aux normes officielles minima en ce qui concerne le facteur d'activité sur les singes. On détermine également le pouvoir antigène des produits après six mois de stockage. A la fin de la période de stockage, on dilue chacun des produits à l'aide de trois volumes de solution stérile de Hank, on mélange les solutions ainsi obtenues et on détermine le pouvoir antigène du produit mélangé. Le e résultat de cette détermination est exposé dans le tableau IV qui suit.
Tableau IV
Essai sur des poussins Essai sur des singes
Type Titre Concentration Concentration Facteur
Echantillon essayÚ @@@@ @@@@ de la dose @@@@ de la dose @@@@
de de dilution opposÚe gÚomÚtrique opposÚe d'activitÚ
virus antig¯ne (TCID50) moyen (TCID50) sur le singe
Vaccin mélangé contenant les types
1, 2 et 3 de virus de poliomyélite tués par 0, 05 % de B-propiolactone
et par la lumière ultraviolette et
conservé pendant six mois. 1 10-1, 24 26 53 0, 35
2 10-1, 10 27 42 68 0, 82
3 10-9, 34 22 18 38 0, 26
Le tableau IV illustre de plus la stabilité des vaccins obtenus par le procédé de l'invention après un stockage prolongé et une dilution au douzième.
Il fait ressortir également que des résultats satisfaisants sont susceptibles d'être obtenus même si l'on fait varier l'ordre des stades d'inactivation.
Exemple 3
Sur un filtre en verre fritté extrêmement fin, on filtre un milieu aqueux contenant du virus polio myélitique du type 1 (Mahoney) (titre d'infectiosité 10-6) préparé comme il est décrit dans l'exemple 1, et on refroidit le filtrat à une température de 4O C.
Dans quatre litres du filtrat refroidi, on verse, tout en agitant, 40 ml d'une solution aqueuse à 10 % contenant 0, 115 g par millilitre de p-propiolactone et on conserve pendant deux heures à la même tem pérature le mélange résultant qui contient 0, 001 g par ml de p-propiolactone. On fait ensuite passer le mélange à travers un appareil centrifuge pour la formation de pellicules, suivant un débit de 600 ml par minute, en l'exposant à un rayonnement ultraviolet ayant une puissance de 25 watts, et en utilisant l'appareil de façon conforme au procédé décrit dans l'exemple 1. L'épaisseur de la pellicule pendant l'exposition est approximativement égale à 50 microns et la durée légèrement inférieure à une seconde.
On recueille ensuite le produit qui en sort, on le chauffe à 37O C, et on le maintien à cette température pendant trois heures. On dilue la solution de virus ainsi obtenue à l'aide de trois volumes de solution de Hank, et on le mélange en vue de réaliser un milieu aqueux qui contienne du virus poliomyélitique tué, ainsi que l'indique le résultat négatif obtenu dans l'essai de sécurité.
Le milieu ainsi obtenu possède un pouvoir antigène d'un ordre élevé et on peut l'utiliser de manière convenable comme vaccin. On détermine le pouvoir antigène du milieu contenant le virus en fonction du titre de dilution antigène, du titre géométrique moyen, et du facteur d'activité sur le singe. Dans le tableau V, on donne les résultats de la détermination du pouvoir antigène ainsi obtenu que l'on rapproche des résultats comparables obtenus pour la matière première non traitée.
Tableau V
Essai sur des poulets Essai sur des singes
Titre Concentration Tire Concentration Facteur Echantillon soumis à l'essai de dilution de la dose géométrique de la dose d'activité
antigène opposée opposée sur le singe
(TCIDo) (TCIDSa)
Vaccin du type 1 obtenu par traitement par
0, 1 % de p-propiolactone et par la lumière
ultraviolette..
10-1, 5 204 218 53 5, 8
Filtrat non traité contenant du virus polio
myélitique vivant du type 1 10-2, 33 204---
Les résultats du tableau V montrent que le fait d'avoir recours à une proportion relativement plus forte de p-propiolactone fournit un vaccin conforme à l'invention qui dépasse fortement la norme minimum concernant le facteur d'activité.
Exemple 4
Sur un filtre en verre fritté ultra-fin, on filtre un milieu aqueux contenant du virus poliomyélitique vivant du type 1 (Mahoney) ayant un titre d'infec tiosité de 10-6 préparé comme il est décrit dans l'exemple 1. Dans quatre litres du filtrat, on verse 40ml d'une solution aqueuse à 10% contenant 0, 115 g de ss-propiolactone par millilitre.
On chauffe pendant deux heures à 370 C le mélange ainsi obtenu qui contient 0, 001 g de R-propiolactone par millilitre, et on fait ensuite passer la suspension ainsi obtenue (ayant un titre d'infectiosité inférieur à 10- ,) à travers un appareil centrifuge pour la formation de pellicule, suivant un débit de 600 ml par minute, en les exposant à un rayonnement ultraviolet d'une puissance de 25 watts, et en employant le dispositif et le procédé décrit dans l'exemple 1.
L'épaisseur de la pellicule pendant l'exposition est approximativement égale à 50 microns et la durée d'exposition est légèrement inférieure à une seconde.
On filtre à nouveau le mélange à travers un filtre en verre fritté ultra-fin et on en soumet un échantillon à un essai normalisé de sécurité. A ce stade, le vaccin ne contient pas de virus vivant, ainsi que l'indique le résultat négatif dans l'essai de sécurité.
De la même manière, on prépare deux autres lots de vaccin tué de virus de poliomyélite à partir de différentes souches de virus, l'un des lots provenant de la souche du type 2 (MEF-1) et l'autre de la souche du type 3 (Saukett). Pour le reste, la préparation de ces deux lots de vaccin est identique à la fabrication du vaccin ci-dessus contenant la souche tuée du type 1 ; ces vaccins sont également exempts de virus vivant de poliomyélite.
Les trois vaccins ainsi obtenus (des types 1, 2 et 3) possèdent un pouvoir antigène d'un ordre élevé et on peut les utiliser de manière convenable soit seuls, soit en combinaison, ou bien on peut les diluer soit à l'aide d'une solution saline stérile, soit d'une solution de Hank stérile, à volonté, en vue d'obtenir des vaccins moins concentrés.
On détermine le pouvoir antigène des trois vaccins en fonction du titre de dilution antigène, du titre géométrique moyen et du facteur d'activité sur le singe, en opérant conformément aux procédés exposés dans l'exemple 1. Dans le tableau VI ci-dessous, on donne les résultats de la détermination du pouvoir antigène ainsi obtenu, que l'on peut rapprocher des résultats comparables du filtrat non traité contenant du virus vivant auquel on a recours comme matière première.
Tableau VI
Essai sur des poussins Essai sur des singes
Titre Concentration Concentration Facteur
Echantillon soumis Ó l'essai @@@@ de la dose @@@@ de la dose @@@@ de dilution opposÚe gÚomÚtrique opposÚe d'activitÚ
antig¯ne (TCID50) moyen (TCID50) sur le singe
Vaccin du type 1 obtenu par traitement par
0, 1 % de p-propiolactone et par la lumière
ultraviolette. 10-t, 5 204 178 53 4, 78
Filtrat non traité contenant du virus vivant de
poliomyélite du type 1 10-2, 33 204---
Vaccin du type 2 obtenu par traitement par
0, 1 % de ss-propiolactone et par la lumière
ultraviolette 10-2, 32 320 68 2, 5
Filtrat non traité contenant du virus vivant de
poliomyélite du type 2.
10"3, o 32--
Vaccin du type 3 obtenu par traitement par
0, 1 % de p-propiolactone et par la lumière
ultraviolette.. 10-t, 5 58 110 36 1, 6
Filtrat non traité contenant du virus vivant de
poliomyélite du type 3 10-s 5g--
Il ressort du tableau VI que le pouvoir antigène des vaccins monovalents, pris séparément, obtenus par le procédé de l'invention, peut être comparé avantageusement à celui des échantillons témoins non traités, et qu'il est nettement plus important que les normes minima en ce qui concerne le facteur d'activité sur le singe.
On détermine également le pouvoir antigène des vaccins obtenus après six mois de stockage. A la fin de la période de stockage, on dilue chacun des produits à l'aide de 3 volumes de solution stérile de
Hank, on met en commun les solutions ainsi obte- nues et on détermine leur pouvoir antigène. Dans le tab. VII, on expose le résultat de cette détermination.
Tableau VII
Essai sur des poussins Essai sur des singes
Type Titre Concentration Concentration Facteur
Echantillon essaye dededilution'r,géométriqued'activité
virus antigène (TCIDso) moyen (TCIDS) sur les singes
Vaccin à l'état de mélange contenant
les types 1, 2 et 3 de virus de polio
myélite tués par 0, 1 % de,-propio-
lactone et par la lumière ultra
violette et conservé pendant six
mois 1 10-.
s 24 60 53 0, 8
2 10-l'o 27 91 68 1, 76
3 10-1, 5 22 53 36 0, 75
Le vaccin du tableau VII est un vaccin constitué par un mélange obtenu à partir de vaccins monovalents conservés pendant six mois et correspondant à une dilution au douzième, il peut être comparé avantageusement avec les vaccins du tableau VI en ce qui concerne le titre.
Method of preparing a polio vaccine
The present invention relates to a method of preparing a polio vaccine from live polio virus.
In accordance with the present invention, an aqueous fluid containing live poliomyelitis virus is subjected to the action of both ultraviolet radiation and p-propiolactone, such that one of said actions is sufficient to kill a virus. significant proportion of live polio virus present in the fluid and the other of said actions is sufficient to kill all residual live polio virus present in the fluid, neither of these actions, in the fluid. as they are used, not being capable of completely killing the live polio virus initially present in the fluid.
The order in which the two agents are used is not critical, i.e. the virus can be subjected first to the action of ultraviolet radiation and then to the action of ( 3-propiolactone, the reverse order of treatment is also satisfactory The two treatments can also be carried out simultaneously.
The vaccine obtained by this method is not only free from live poliomyelitis virus, but it also has a higher degree of antigenicity than a vaccine produced by the known method of inactivation with formaldehyde. It has the additional advantage, in contrast to the killed formaldehyde vaccine, that the killed polio virus present in the vaccine shows no tendency to reactivate on storage. This vaccine has another advantage which lies in the fact that the chemical agent which is used to obtain it, unlike other chemical agents such as formaldehyde, destroys itself during storage, by decomposing easily. into harmless by-products.
The method according to the invention is applicable to the different types of poliomyelitis virus, namely types 1, 2 and 3. Mixtures of these three types can be used as raw material, but in general each type of virus is treated separately and the vaccine thus obtained is subsequently combined with the vaccine or vaccines prepared from the other or the other types of virus.
The aqueous fluid containing the live poliomyelitis virus which is used as a raw material of the process can be conveniently obtained from a tissue serving as a culture medium in which the poliomyelitis virus has grown or multiplied. The fluid can be isolated by any suitable means, for example by filtration, decantation, centrifugation, etc. It is convenient to use a tissue culture filtrate from a medium known as tissue culture medium 199, which carries poliomyelitis virus.
An example of such a tissue culture fluid is that obtained by filtration of a culture of poliomyelitis virus through monkey kidney tissue, obtained as described by Dulbecco et al. In Journal of Experimental Medicine Volume 99, page 167 (1954). According to this process, macerated monkey kidney tissues are subjected to the action of trypsin in order to separate the foreign tissues, the residual cells are allowed to multiply, the media are inoculated with the aid of poliomyelitis virus, the mixture is incubated and the fluid collected. While this method is preferred, the step of trypsin treatment can be omitted if desired.
In the latter case, however, the protein content of the vaccine may be excessively high and it should be tested before use in order to avoid the production of vaccines which may give reactions.
to proteins. In the manufacture of mixed vaccines, that is, vaccines containing more than one type of polio virus, it is permissible to pool or mix the collected fluids containing the various types of virus before putting into place. carries out the method of the present invention, but as noted above, it is generally preferable to pool or mix the individual vaccines after performing the method.
In practice, it is advantageous to use a raw material based on viruses having a high antigenic power and this is why it is appropriate that the infectivity level of the aqueous fluid be of high order, that is to say at minus equal to 10-5. In general, a fluid having an infectivity titer of the order of 10-5 or more is used. Under normal storage conditions, the aqueous fluid is preserved by subjecting it to refrigeration, for example at a temperature between -50 and 10 C. When further processed, the fluid heats up, depending on the conditions of. temperature used during processing.
The aqueous fluid containing live poliomyelitis virus is generally produced under aseptic conditions, which is accomplished by subjecting the medium to bacterial filtration prior to application in the process. Furthermore, one can concentrate and (or) partially purify the live virus and employ such solutions as raw materials for the process.
As previously indicated, the fluid containing the virus is subjected to the aution of ultraviolet radiation and p-propicilaotone. The ultraviolet irradiation phase of the process can be carried out by exposing a thin film or stream of the aqueous fluid containing living poliomyelitis virus to ultraviolet light having a wavelength of. between 2000 and 3000 angstroms and whose intensity is high enough to reduce the infectivity titer to an extremely low value in a short period of time, or when a fluid already exposed to ss-propiolaotone is used ,
strong enough to reduce the infectivity titre to zero in a short space of time. In order to ensure the desired results, it is generally appropriate that the average thickness of the film or stream which is exposed is no greater than 100 microns and preferably less than or equal to 50 microns. A little more than 100 microns thickness can be used, but in this case longer exposure times are required and therefore also a greater loss of antigenicity results. The ultraviolet light source used should contain a high proportion, preferably up to 95%, of energy having a wavelength of 2537 angstroms.
Light sources emitting a somewhat lower proportion of energy at this desired wavelength are satisfactory but less efficient. To get the best
results, we can use a uniform light source emitting 95% of its energy for a wavelength of 2537 angstroms, and having a then
Actual total session 10 to 25 watts. The light source is conveniently used at a distance of about one centimeter from the surface of the aqueous medium to be exposed. For ordinary purposes, the radiation intensity of the light source should be such as to provide about 12,500 to 32,000 micro-watts per square centimeter of film surface subjected to exposure.
When an aqueous fluid containing virus and having an infectivity titer of between 10- and 10-8 is used as the raw material and the irradiation conditions indicated are used, an extremely high proportion of living organisms is killed within seconds of exposure. The duration of exposure can be varied considerably, but in general it is advantageous to minimize this duration of exposure in order to avoid excessive destruction of the antigenic power inherent in the virus. It is preferred to adopt an exposure time of less than 10 seconds, and for the best results, a duration of 0.5 to 2 seconds.
For example, when using ultraviolet light having a wavelength of 2537 angstroms with an intensity of about 25,000 micro-watts per square centimeter, the exposure for one second of the fluid containing the living virus under the form of a film having an average thickness of 50 microns reduced the infectivity titer from 10-7 to about 10-t. In general, the exposure conditions should be such that the infectivity titre is reduced to a value between 10 ls5 and 10-25.
For the practice of the method according to the present invention, the preferred device is a centrifugal film forming apparatus of the type described in United States Patent No. 2725462. This device is made up of several parts. , namely: a cylindrical, slightly conical and rotatable tube or cup, approximately 40 cm in length and having an outward slope of 1 from the closed end constituting the bottom and a diameter inside 9, 5 cm at the top; means for rapidly rotating the bucket; a feed tube suspended from the center of the bucket and the orifice of which is placed near the bottom of the bucket;
six ultraviolet lamps of approximately 30cm in effective length, suspended in the cup, surrounding the supply tube and arranged so that their outer surface is about 1cm from the inner wall of the cup; and a suitable container surrounding the top of the cup for collecting and discharging the fluid which is discharged from the top of the cup as the latter rotates rapidly during operation of the device. In operation, the fluid to be irradiated is introduced through the supply tube into the bottom of the rapidly rotating bucket and it is discharged outwards and in an upward direction in the form of a film opposite. ultraviolet lamps.
The film of liquid is continuously pushed upwards by the introduction of a new quantity of material arriving through the supply tube until it finally spills out into the container surrounding the top of the cup and is collected. Another suitable device has been described in the
United States of America No 2588716.
The temperature of the aqueous fluid during irradiation is not critical. Unless external heat is applied, the fluid will usually be at or below room temperature. However, satisfactory results are obtained when the irradiation is carried out on aqueous fluids having a higher temperature, 370 to 40 ° C. for example.
In the phase of the process where p-propiolactone is used, the amount of p-propiolactone should be less than that required to completely kill all of the live poliomyelitis virus in the untreated aqueous fluid. For this purpose, when aqueous fluids containing virus are used whose titre is within the range of those which are ordinarily employed in the manufacture of polio vaccines, the amount of p-propiolactone which is ordinarily used is between 0, 0002 and 0, 0010 gram ut, preferably between 0, 0004 and 0, 0006 g per milliliter of fluid containing virus.
In cases where 8-propiolactone is employed in a larger amount, the excess remaining after virus inactivation can be readily decomposed by heating. As far as can be determined, each type of poliomyelitis virus requires application of approximately the same concentrations of P-propolactone. Due to the sensitivity to acids and alkalis of the protein which is found in the aqueous fluid which is used as raw material, the process is preferably carried out at a pH value of between 5 and 9, and for get the best results between 7, 5 and 8, 5.
The temperature at which this phase of the process is carried out is not critical and can be varied widely. For relatively low temperature the rate of inactivation is low, for example at a temperature of 4 ° C a period of 24-72 hours is needed for inactivation.
Therefore, it is preferable to carry out this phase of the process at room temperature or higher. The optimum temperature is about 370 ° C and although this phase of the process can be carried out at a higher temperature, the end product tends at this higher temperature to undesirably lose its antigenicity. Consequently, it is advantageous to operate at a temperature between 200 and 40O C. The reaction which takes place as a result of the treatment with p-propiolactone is both irreversible and rapid.
The virus-containing product is fixed with respect to virus destruction, that is, the virus does not have virulence return after storage, dilution or other processing.
The virus is usually killed completely within two hours or less at 37O C. It is important that the p-propiolactone that is used is fresh. P-Propiolactone which has not been stored refrigerated or allowed to come into contact with moisture should not be used. The p-propiolaotone obtainable commercially in purified form is satisfactory.
The foregoing has been limited to the treatment of aqueous fluids containing fully virulent poliomyelitis virus. However, it is also possible to treat fluids which have already been subjected to partial inactivation or in which the virus has already been partially killed.
It has been found that the most consistent results are obtained if the initial aqueous fluid containing the live poliomyelitis virus is subjected either to bacterial filtration, for example Seitz filtration, or to filtration through extremely sintered glass. end, before irradiation or treatment with p-propiolactone.
If desired, germicidal and (or) stabilizing agents can be incorporated into the vaccines obtained by the process of the invention. For example, benzothonium chloride can be added to the resulting vaccines up to a concentration of about 1: 20,000 to 1: 50,000 and preferably a concentration of 1: 40,000.
The vaccines obtained by the method of the invention do not contain live poliomyelitis virus. They are also sterile in all other respects, that is, they do not contain living bacteria, yeasts or molds. The products obtained are capable, after having been administered to mammals sensitive to contamination by the living poliomyelitis virus, of producing immunity of the mammal against contamination by the corresponding living virus. The term administer means subcutaneous, intradermal or intramuscular injection.
The products can be administered without dilution if desired, but if their activity exceeds the requirements of standard tests, they can be diluted with a reasonable amount of a suitable sterile aqueous medium. Examples of suitable diluents are sterile Hank's solution, sterile salt water and sterile distilled water.
Example 1
Cells for cultivation of polio virus are prepared by the Dulbecco method defined in Journal of Experimental Medicine, 92, page 167 (1954). In summary, this procedure consists of first preparing a suspension of monkey kidney epithelial cells (see
Dulbecco, Proc. Nat. Acad. Sci. 38, page 747 (1952)) by treating a macerated tissue of monkey kidney from healthy Cynomolgue or Rhesus monkeys, parde! latrypsin to feed foreign matter and free individual cells. These cells are allowed to grow on a suitable glass surface in any of a number of tissue culture media such as Medium 199.
The resulting kidney cell layer is then inoculated with a seed culture of poliomyelitis virus type 1 (Mahoney strain) and the mixture is incubated at a temperature of 36-370 ° C to that the destruction of the cells is complete and that large quantities of new virus have been released. The virus containing fluid is collected and passed through an extremely fine sintered glass candle. The filtrate containing live poliomyelitis virus type 1 is tested for virus content, bacterial sterility and strain purity.
In an analogous manner, a filtrate containing live virus type 2 (strain MEF-1) and a filtrate containing type 3 (strain Saukett) are prepared.
Four liters of the filtrate containing poliomyelitis virus type 1 and having an infectivity titer of 10-6 are cooled to 40 ° C., and 20 ml of a 10% aqueous solution containing 0. 115 g / ml of ss-propiolactone. The resulting solution, which contained 0.0005 g / ml of ss-propiolactone, was allowed to stand at this temperature for two hours and was then passed through a centrifugal film-forming apparatus at the speed of 600 ml at the speed of 600 ml. minute by exposing it to ultraviolet radiation having a power of 25 watts.
The centrifugal film forming device which is used, which belonged to the type described in the aforementioned United States Patent No. 2725482 and which is manufactured by the Research Laboratory Division of the General
Motors Corporation, Detroit, Michigan, comprises a vertically rotatable, cup-shaped cylindrical chamber, means for rotating the chamber at a normal operating speed of 1700 rpm, and a tubular assembly formed of six ultraviolet lamps regularly distributed and arranged axially inside the chamber.
The inside diameter of the upper edge of the chamber is approximately 9.5 cm and the inside wall of the chamber slopes inward from the top with the slope being 10 from the vertical. The vertical height of the interior wall of the chamber is approximately 40 cm. The outer surface of the lamp assembly is at a distance of 1 cm from the inner wall of the chamber and the effective intensity of ultraviolet radiation on the inner surface of the chamber is approximately 25,000 micro-watts per square centimeter. . The average film thickness of the solution exposed to irradiation is approximately 75 microns and the total exposure time is one second.
As a result of this combined exposure, there is no residual live virus that can be detected in the solution by a standard titration with monkey kidney tissue, in which ten samples of 0.5 are seeded. ml and stored for seven days. However, traces of live virus may be present; this can be demonstrated by a safety test, for example the standardized safety test set out in the document Minimum Requirements of Poliomyelitis Vaccine published on November 11, 1955 by the Ministry of Public Health of
United States of America.
The irradiated solution is then incubated at a temperature of 37 ° C. for three hours. Following incubation, the solution is completely free of live polio virus, as indicated by the negative result obtained in the safety test. The safety test used is a variant of the standardized test just mentioned, a variant in which each of ten bottles containing the tissue culture nutrient medium is inoculated using an aliquot of 50 ml of the vaccine and stored under conditions favorable to virus growth for 32 days. The lack of growth of the virus indicates that the vaccine is safe.
In the same way, two other batches of vaccine based on poliomyelitis virus killed from different strains of virus are prepared, one of the batches originating from the type 2 strain (MEF-1) and the other originating from the strain of type 3 (Saukett strain).
In all other respects, the preparation of these two batches of vaccine is identical to the preparation of the above vaccine containing the killed strain of type 1; these vaccines are also free of live poliomyelitis virus, as can be seen by the method of the safety test cited above.
All three vaccines (types 1, 2 and 3) possess high order antigenicity and can be conveniently used either singly or in combination, or can be diluted with sterile salt water. or sterile Hank's solution, as desired, in order to make less concentrated vaccines.
The antigenic power of the vaccines obtained can be determined as follows. A series of progressive dilutions of the vaccine are prepared. We divide into groups of five to ten young chicks (aged seven to ten days) each group to receive by individual intramuscular injection one of the prepared dilutions. Each chick is then inoculated with two 0.5 ml doses of the vaccine two weeks apart. The chicks are then bled one week after the last injection, the serum is separated from the blood and tested separately for the presence of specific antibodies at a low dilution ratio (1: 4).
In this test, a volume of 0.25 ml of the diluted serum is opposed to an equal volume of tissue culture fluid containing 10 to 1000 50% tissue culture infectious doses (TCIDIO) of the particular type of poliomyelitis virus. whose antibodies must be tested in the serum. To the mixture of these two volumes placed in a suitable container, 0.25 ml of monkey kidney cells trypsinized in nutrient medium are added, the concentration being 240,000 cells per ml. The whole mixture is then incubated under conditions favorable to the growth of cells and virus. Seven days later, these tissue cultures are examined under a microscope for cytopathic degeneration resulting from virus growth.
Those of the cultures which have been protected from the virus which has been opposed to them by the antibodies of the particular serum do not show this degeneration. The 50% antigen dilution rate or antigen dilution titre can be determined from the sera providing protection and from chicks having received the inoculum at the maximum dilution. This result can be conveniently calculated by the method of Reed and Muench reported in the American Journal of Hygiene, Volume 27, pages 492-497 (1938) and disclosed in modified form in the book of standard tests Viral and Rickettsial Infections of
Man River, pp. 75 and 76, J.-B. Lippincott Company.
This determination reveals the extent to which the antigen preparation can be diluted to induce antibody formation in 50% of the chicks receiving the inoculum dilution. Since the concentration of the opposite dose in the serum neutralization test may have some influence on the numerical value of the antigen dilution titer, the opposite dose is indicated below in order to emphasize the specific importance of the value of this dose for the antigen dilution titer.
In Table 1 below, the results of the determination of the antigenic power of the vaccines obtained by the above method are given, which can be compared with those of the untreated filtrates containing the live virus which is used as material. first.
Table I
Title Concentration
Sample subjected to the op-posed antigen dilution test
(TCIDso)
Type 1 vaccine obtained by
treatment with 0.05%
ss-propiolactone and
10-s ultraviolet light. bone 204
Untreated filtrate containing
polio virus
alive (type 1). 10-:
1, 32 204
Type 2 vaccine obtained by
treatment with 0.05%
-proiolactan and by
ultraviolet light (type
2) 10-259 32
Table 1 (continued)
Title Concentration
Sample subjected to the opposite antigen dose dilution test
(TCIDy-)
Untreated filtrate containing
live polio virus
myelitis (type 2) 10-3.0 32
Type 3 vaccine obtained by
treatment with 0.05%
0-propiolactone and by
ultraviolet light.
lo-t, 58
Untreated filtrate containing
polio virus
alive (type 3) 10-2, 58
The antigenic potency of the products remains at a high level for long periods of time.
This is evidenced in the case of the above mentioned vaccines (types 1, 2 and 3) after storage for six months under refrigeration conditions. At the end of the storage period, each of the products is diluted with three volumes of sterile Hank's solutions, the resulting three solutions are pooled and the antigenicity of this mixture is determined. This determination is made not only by means of the above-mentioned chick assay which indicates the antigen dilution titer, but also by a conventional assay using monkeys as test animals instead of chicks.
Details of this test are set out in the document Amendment Number 2 to the Minimum
Requirements of Poliomyelitis Vaccine published May 20, 1954 by the Department of Public Health of the United States of America. In summary, this test is carried out as follows: monkeys are inoculated
Rhesus using three 1 ml doses of the vaccine at weekly intervals, the animals are bled one week after the end of the series of inoculations, a serum is prepared from the collected blood and determined. number of antibodies present in the serum.
This determination is made by performing a series of dilutions of the serum using salt water, and mixing the diluted aliquots thus obtained with a standard solution containing a known number of infectious units of the given type of poliomyelitis virus. For example, if the activity of the serum against the type 1 virus is determined, a standard solution containing a known number of infectious units of type 1 poliomyelitis virus is used; to carry out the determination for type 2 or type 3, a standardized solution of infectious germs of type 2 or 3 viruses is used.
The end point of the titration is the dilution at which the serum contains enough antibody to neutralize exactly the known number of infectious units of virus in the standard solution, i.e. to combine with them and make them non-infectious. A number of monkeys are used for the analysis of activity for each type of polio virus. Since the geometric mean titer depends on the potency of the activity of the standard solution of infectious poliomyelitis virus used in the assay, it is necessary to specify the number of infectious units of poliomyelitis virus present in the test. standardized solution to specify the proper meaning of the mean geometric title.
The method of calculating the geometric mean titer is detailed in the document Amendment Number 2 of the Minimum Requirements of Poliomyelitis Vaccine published on May 20, 1954 by the Ministry of Public Health of
United States of America.
The activity factor on the monkey is also determined for each type of virus: this determination includes a comparison with the mean geometric titre of the Reference serum of the States.
States of America (IIA-1) from the National Institutes of
Health. The results of these determinations are shown in Table II below: Table 11
Chick test Monkey test
Type Title Concentration Title Concentration Factor
Sample tries to dilute the geometric dose of the activity dose
virus antigen opposite opposite in monkeys.
(TCIDso) (TCIDSa)
Mixed vaccine containing types
Poliomyelitis virus 1, 2 and 3
killed by 0.05% p-propiolactone
and by ultraviolet light and
stored for six months 1 10¯ 24 83 53 1, 1
2 10-in 27 63 68 1, 27
3 10-1, 4 22 33 36 0, 47
* For a particular type of virus, the activity factor on the monkey is calculated by dividing the geometric titer
mean of the serum inoculated with the monkey subjected to the test by the mean geometric titer of the Reference serum
IIA-1 (National Institutes of Health) for the same type of virus.
The minimum factors acceptable to the monkey for the various types of poliomyelitis virus are: type 1-0, 29; type 2-0, 25 and type 3-0, 16. Further details are given in Minimum
Requirements of Poliomyelitis Vaccine published November 11, 1955, by the Ministry of Health
Public of the United States of America.
From the above table it can be seen that after six months storage the vaccine is not significantly altered with regard to antigenicity or activity. It should be noted that the titers of the antigen dilutions of the vaccines of Tables I and II which may be composed are different, but that this is largely due to the fact that the vaccine of Table II has been diluted to the twelfth. It is important that the activity of the vaccine, after prolonged storage, exceeds the official standards for each type of virus, and this very widely.
Although the causes of the unusual preservative qualities exhibited by vaccines obtained by the process of the present invention are not known, it is believed that these qualities are due at least in part to the fact that the inactivating chemical agent. vation, namely p-propiolactone, is distinguished from other chemical agents such as formaldehyde, by rapid degradation, without special precautions, by transforming into harmless by-products which are compatible with the antigenic factors of the vaccine and do not have no harmful influence on them.
Example 2
An aqueous medium containing live polio myelitis virus type 1 (Mahoney) (infectivity titre 10-6), prepared as described in Example 1, is filtered through an extremely fine sintered glass filter. In four liters of the filtrate, 20 ml of a ten percent aqueous solution of pro-piolactone (containing 0.15 g of, 8-propiolactone per milliliter) are poured in.
The mixture thus obtained, which contains 0.0005 g of p-propiolactone per milliliter, is heated for two hours at 37O C, and the suspension thus obtained, which has an infectivity titer of less than 10-st, is then passed to through a centrifugal apparatus for film formation at a flow rate of 600 ml per minute, exposing said mixture to ultraviolet radiation of 25 watts, and using the apparatus and method described in the example 1.
The film thickness during exposure is approximately 50 microns and the exposure time is slightly less than one second.
The virus solution thus obtained is filtered again through an extremely fine sintered glass filter and a sample is subjected to a safety test, as described in Example 1. At this stage, the vaccine does not contain. no live virus, which is indicated by a negative result obtained in the safety test.
Two other batches of killed polio virus vaccines are prepared in the same manner from different strains of virus, one from the type 2 strain (MEF-1) and the other from the type 3 (Saukett). For the rest, recourse is had to the procedure used for the vaccine n above containing the killed strain of type 1; these vaccines are also free from live poliomyelitis virus.
The three vaccines thus obtained (types 1, 2 and 3) possess high order antigenicity and can be suitably used either singly or in combination, or they can be diluted or with the aid of a sterile saline solution, or with sterile Hank's solution, at will, in order to obtain less concentrated vaccines.
The antigenic power of the three batches of virus is determined as a function of the antigen dilution titer, the mean geometric titer and the activity factor on the monkey, by operating in accordance with the methods set out in Example 1. In Table III below. below, the results of the determination of the antigenic power thus obtained are given, which are compared with the comparable results obtained for non-filtrates. processed containing the live virus which is used as the raw material.
Table III
Chick test Monkey test
Title Concentration Title Concentration factor Sample treats of dilution of the geometric dose of the activity dose
opposite antigen mean opposite on monkeys
(TCIDo) (TCIDso)
Type 1 vaccine obtained by treatment with
0.05% ss-propiolactone and by light
ultraviolet 10-2, 0 204 13, 4ci
Untreated filtrate containing polio virus
live tick type 1 10 - 2.33 204 - -
Type 2 vaccine obtained by treatment with
0.05% p-propiolactone and by light
ultraviolet.
10-2, 32 141 32 1, 18
Untreated filtrate containing polio virus
live tick type 2 10-3, 32 ---
Type 3 vaccine obtained by treatment with
0.05% ss-propiolactone and by light
ultraviolet 10-1, 58 100 58 1, 45
Untreated filtrate containing polio virus
live tick type 3 10-2, 58 ---
It appears from Table III that the antigenic power of the three types of vaccines obtained by the method of the present invention is substantially as high as that of the untreated control samples,
while being well above the official minimum standards for activity factor in monkeys. The antigenic power of the products is also determined after six months of storage. At the end of the storage period, each of the products is diluted with three volumes of sterile Hank's solution, the solutions thus obtained are mixed and the antigenicity of the mixed product is determined. The result of this determination is shown in Table IV which follows.
Table IV
Chick test Monkey test
Type Title Concentration Concentration Factor
Sample testÚ @@@@ @@@@ of the dose @@@@ of the dose @@@@
of opposite geometric dilution of activity
Antigen virus (TCID50) medium (TCID50) in monkeys
Mixed vaccine containing types
1, 2 and 3 polio virus killed by 0.05% B-propiolactone
and by ultraviolet light and
kept for six months. 1 10-1, 24 26 53 0, 35
2 10-1, 10 27 42 68 0, 82
3 10-9, 34 22 18 38 0, 26
Table IV further illustrates the stability of the vaccines obtained by the method of the invention after prolonged storage and twelfth dilution.
It also shows that satisfactory results are likely to be obtained even if the order of the inactivation stages is varied.
Example 3
On an extremely fine sintered glass filter, an aqueous medium containing polio myelitic virus type 1 (Mahoney) (infectivity titre 10-6) prepared as described in Example 1 is filtered, and the filtrate is cooled. at a temperature of 4O C.
40 ml of a 10% aqueous solution containing 0.15 g per ml of p-propiolactone are poured into four liters of the cooled filtrate while stirring, and the resulting mixture is kept at the same temperature for two hours. contains 0.001 g per ml of p-propiolactone. The mixture is then passed through a centrifugal film forming apparatus at a rate of 600 ml per minute, exposed to ultraviolet radiation having a power of 25 watts, and using the apparatus in accordance with the requirements. to the method described in Example 1. The film thickness during exposure is approximately 50 microns and the time is slightly less than one second.
The product which comes out is then collected, it is heated to 37O C, and it is maintained at this temperature for three hours. The virus solution thus obtained is diluted with three volumes of Hank's solution, and mixed to obtain an aqueous medium which contains killed poliomyelitis virus, as indicated by the negative result obtained in safety test.
The medium thus obtained possesses high order antigenicity and can be suitably used as a vaccine. The antigenic potency of the medium containing the virus is determined as a function of the antigen dilution titer, the mean geometric titer, and the activity factor on the monkey. In Table V, the results of the determination of the antigenic power thus obtained are given, compared with the comparable results obtained for the untreated raw material.
Table V
Test on chickens Test on monkeys
Title Concentration Tire Concentration Factor Sample subjected to the geometric dose dilution test of the activity dose
antigen opposite opposite on the monkey
(TCIDo) (TCIDSa)
Type 1 vaccine obtained by treatment with
0.1% p-propiolactone and by light
ultraviolet.
10-1, 5 204 218 53 5, 8
Untreated filtrate containing polio virus
live myelitis type 1 10-2, 33 204 ---
The results of Table V show that using a relatively higher proportion of p-propiolactone provides a vaccine according to the invention which greatly exceeds the minimum standard for the activity factor.
Example 4
On an ultra-fine sintered glass filter, an aqueous medium containing live poliomyelitis virus type 1 (Mahoney) having an infection titer of 10-6 is filtered, prepared as described in Example 1. In four liters of the filtrate, 40 ml of a 10% aqueous solution containing 0.15 g of ss-propiolactone per milliliter are poured in.
The mixture thus obtained, which contains 0.001 g of R-propiolactone per milliliter, is heated for two hours at 370 C, and the suspension thus obtained (having an infectivity titer of less than 10 -) is then passed through a centrifugal apparatus for film formation, at a flow rate of 600 ml per minute, exposing them to ultraviolet radiation of a power of 25 watts, and employing the apparatus and method described in Example 1.
The film thickness during exposure is approximately 50 microns and the exposure time is slightly less than one second.
The mixture is again filtered through an ultra-fine sintered glass filter and a sample is subjected to a standard safety test. At this stage, the vaccine does not contain live virus, as indicated by the negative result in the safety test.
Likewise, two other batches of killed polio virus vaccine were prepared from different strains of virus, one from the type 2 strain (MEF-1) and the other from the strain of type 3 (Saukett). For the rest, the preparation of these two batches of vaccine is identical to the manufacture of the above vaccine containing the killed strain of type 1; these vaccines are also free from live poliomyelitis virus.
The three vaccines thus obtained (types 1, 2 and 3) possess high order antigenicity and can be suitably used either singly or in combination, or they can be diluted or with the aid of '' sterile saline, or sterile Hank's solution, at will, in order to obtain less concentrated vaccines.
The antigenic power of the three vaccines is determined as a function of the antigen dilution titer, the mean geometric titer and the activity factor on the monkey, by operating in accordance with the methods set out in Example 1. In Table VI below, the results of the determination of the antigenic power thus obtained are given, which can be compared with the comparable results of the untreated filtrate containing living virus which is used as a starting material.
Table VI
Chick test Monkey test
Title Concentration Concentration Factor
Sample subjected to the test @@@@ of the dose @@@@ of the dose @@@@ of the opposite geometrical dilution opposite activity
medium (TCID50) antigen (TCID50) on monkey
Type 1 vaccine obtained by treatment with
0.1% p-propiolactone and by light
ultraviolet. 10-t, 5 204 178 53 4, 78
Untreated filtrate containing live virus of
polio type 1 10-2, 33 204 ---
Type 2 vaccine obtained by treatment with
0.1% ss-propiolactone and by light
ultraviolet 10-2, 32 320 68 2, 5
Untreated filtrate containing live virus of
polio type 2.
10 "3, o 32--
Type 3 vaccine obtained by treatment with
0.1% p-propiolactone and by light
ultraviolet .. 10-t, 5 58 110 36 1, 6
Untreated filtrate containing live virus of
poliomyelitis type 3 10-s 5g--
It emerges from Table VI that the antigenic power of the monovalent vaccines, taken separately, obtained by the method of the invention, can be advantageously compared with that of the untreated control samples, and that it is clearly greater than the minimum standards in regarding the activity factor on the monkey.
The antigenic power of the vaccines obtained after six months of storage is also determined. At the end of the storage period, each product is diluted with 3 volumes of sterile solution of
Hank, the solutions thus obtained are pooled and their antigenic power is determined. In tab. VII, the result of this determination is presented.
Table VII
Chick test Monkey test
Type Title Concentration Concentration Factor
Sample tries to dilute'r, geometric activity
virus antigen (TCIDso) medium (TCIDS) in monkeys
Vaccine as a mixture containing
polio virus types 1, 2 and 3
myelitis killed by 0.1%, -propio-
lactone and by ultra light
violet and kept for six
month 1 10-.
s 24 60 53 0, 8
2 10-o 27 91 68 1, 76
3 10-1, 5 22 53 36 0, 75
The vaccine of Table VII is a vaccine consisting of a mixture obtained from monovalent vaccines stored for six months and corresponding to a twelfth dilution, it can be advantageously compared with the vaccines of Table VI as regards the title.