Vaccin et procédé pour le préparer
La présente invention est relative à un vaccin contre la varicelle ainsi qu'à des procédés pour la préparation d'un tel vaccin.
La présente'invention concerne, plus particulièrement, un vaccin de virus de varicelle vivant atténué sûr, ainsi qu'un procédé pour la production du vaccin en question par propagation sérielle
de virus de la varicelle dans des systèmes de culture sur cellules.
La varicelle ou petite vérole*volante, est principalement une maladie des enfants fortement contagieuse. Cette maladie se caractérise typiquement par l'apparition de fièvres et par le développement d'un rash maculaire qui évolue rapidement vers les stades de formation de papules et de vésicules. La guérison s'effectue habituellement sans incidents, mais la maladie, même sous sa forme modérée, est d'un aspect désagréable et peut entraîner l'apparition d'un grand nombre de cicatrices provenant des vésicules rompues. Dans certains cas, la maladie peut être très grave en ce sens qu'elle peut se compliquer d'une pneumonie chez les enfants ou les adultes. Des complications du système nerveux central, comme une ataxie cérébelleuse aiguë avec tremblements et hypotonie musculaire peuvent précéder, accompagner ou suivre la varicelle.
Plus rarement il y a atteinte généralisée.du sys- tème nerveux central avec hémorragie, infiltration
<EMI ID=1.1>
Une névrite et une myélite peuvent également se pro- duire. La teinte de la peau peut également être gênante avec apparition de lésions hémorragiques, bulbeuses ou gangreneuses.
Par conséquent, la prévention de la maladie par vaccination est justifiée afin d'empêcher l'apparition des troubles et inconvénients susmentionnés
et l'invention a plus particulièrement pour objet un vaccin à virus de la varicelle vivant atténué ainsi qu'un procédé pour sa préparation.
Plusieurs chercheurs ont, dans le passé, tenté de procéder à des vaccinations de volontaires humains sensibles avec des résultats variables quant aux "prises " et pas mal de désagréments en ce qui concerne l'efficacité protectrice. Cependant, on n'a pas obtenu d'effets significatifs recherchés en dépit du fait que les vaccinations tentées l'ont été sur
des volontaires sensibles avec des virus pleinement virulents dans le liquide vésiculaire provenant de cas de varicelle-zoster.
La technique antérieure a relaté que la propagation de la varicelle dans divers systèmes
de culture sur cellules, comme celles de l'amnios humain, de fibroblastes d'embryons humains, les cellules de Hela et les cellules de la thyroïde humaine, mais, antérieurement à la présente invention, on croyait généralement que la seule source de virus de la varicelle exempts de cellules, viables, était le liquide provenant des vésicules engendrées par
la maladie. Caunt et coll., Journal of Hygiene,
62, 413-424 (1964) ont rapporté l'isolement de
virus exempts de cellules du tissu thyroidien
humain et Brunell, Virolo�y, 31, 732-4 (1967) a décrit l'isolement de virus exempts de cellules
de fibroblastes d'embryons humains. Le liquide vésiculaire est manifestement une source inappropriée de virus vivants pour la production d'un vaccin en raison de leur virulence et de l'approvisionnement limité. Le tissu thyroidien humain est constitué d'une lignée de cellules humaines primaires et elle ne convient par conséquent pas comme système
de culture sur tissus pour la propagation et l'atténuation de virus afin de produire des vaccins à virus vivants.
On a découvert à présent, non sans surprise, que l'on pouvait obtenir un passage exempt de cellules dans des préparations de culture sur tissu convenables,que l'on pouvait obtenir en quantité des virus de la varicelle vivants extracellulaires pouvant être utilisés comme antigènes et que l'on pouvait en préparer un vaccin à base de virus de la varicelle vivants et atténués provoquant chez l'homme l'apparition d'une réponse en anticorps contre des virus de la varicelle virulents, sans pour autant provoquer les manifestations cliniques graves de cette maladie.
Le procédé conforme à la présente invention est caractérisé en ce qu'il comprend des passages en série de virus de la varicelle virulents dans un système de culture sur tissu. Le système de culture sur tissu peut être n'importe lequel convenant à la production de vaccins et dont on sait qu'il supporte la croissance du virus, comme des souches de cellules humaines diploïdes, telles qu'illustrées par les cellules WI-38 et MRC-5, des souches de cellules animales diploïdes (rhésus foetal) et des cellules primaires d'origine simienne. Les systèmes préférés sont ceux constitués par du tissu testiculaire de singe et du tissu pulmonaire de foetus humain diploïde, comme les cellules WI-38, préparés selon des procédés connus.
On incube la culture à 30-38[deg.]C, de préférence à une température variant d'environ 32[deg.]C à 36[deg.]C, pendant une durée variant de 3.à environ 10 jours. La durée réelle de l'incubation varie et est déterminée
par l'ampleur de la propagation virale, telle qu'indi-
<EMI ID=2.1>
L'inoculum peut être une suspension de cellules infectées ou un virus libérés par des procédés classiques
(par exemple par traitement aux ultrasons).
Lorsque l'on constate que l'on a obtenu le degré d'infectiosité approprié, habituellement après environ 10 à environ 40 passages en série du virus,
on élimine de manière aseptique les liquides ayant servi à l'entretien. Il faut noter que le nombre de passages en série nécessaire peut dépendre de la source de virus ou de l'isolat particulier que l'on a utilisé pour la préparation du vaccin. Les feuilles de cellules sont ensuite rinçées à plusieurs reprises avec une solution physiologique exempte de sérum, comme une solution physiologique saline avec tampon au phosphate (PBS)
ou une solution de sel équilibrée de Hanks. Un agent de stabilisation approprié, comme une composition constituée de saccharose, d'albumine, de glutamine et de phosphate ou analogues est ajoutée en un volume cor-
<EMI ID=3.1>
original.
Les cellules infectées sont retirées de la surface du récipient dans le milieu stabilisateur par des moyens appropriés (par exemple par congélationdécongélation ou par grattage des cellules). Les suspensions stabilisant-cellules sont ensuite réunies et les cellules infectées sont davantage rompues par
des moyens appropriés, comme un traitement aux ultrasons. La suspension de cellules rompues ainsi obtenue est ensuite clarifiée par filtration de façon à la débarrasser des débris cellulaires afin de garantir l'obtention d'une préparation de virus exempts de cellules. La préparation de virus ainsi obtenue est alors subdivisée dans un récipient convenable afin d'être distribuée comme vaccin. La dose peut varier d'environ 0,1 à environ 2,0 ml contenant de 100 à environ 1000 unités infectées dans des ampoules scellées à la flamme ou bien le vaccin peut se présenter sous la forme d'un produit lyophilisé dans des fioles bouchées et prêt à être reconstitué dans de l'eau stérile. L'administration peut se faire par scarification (piqûres multiples) intradermique ou par des voies sous-cutanées.
Le virus d'ensemencement à utiliser pour- la mise en oeuvre du procédé ci-dessus est isolé du liquide de vésicules provenant d'un cas clinique de varicelle et conservé dans un bouillon d'infusion de veau
à -70[deg.]C.
EXEMPLE 1
Vaccin de la varicelle à base de virus exempts de cellules, vivants, atténués, préparé par 20 passages en série sur tissu de cellules WI-38.
19 passages en série du virus de la varicelle dans une culture sur tissu WI-38 ont été effectués de la façon suivante:
L'isolement initial des virus de la varicelle a été réalisé à partir d'un échantillon de liquide de vésicule prélevé sur un enfant atteint de varicelle clinique. On a recueilli l'échantillon de liquide de vésicule dans du bouillon d'infusion de veau et on l'a conservé à -70[deg.]C; au moment de 7 'isolement on a décongelé l'échantillon, on l'a dilué avec un volume égal de bouillon d'infusion de veau contenant 100 mcg de néomycine et 100 mcg de polymixine par ml et on l'a incubé pendant 30 minutes à 25[deg.]C. On a inoculé l'échantillon dans des cultures de cellules WI-38 établies originaires de foetus humain-diploïde et on a procédé à l'incubation à 32[deg.]C, cette étape constituant le passage n[deg.] 1 d'une série de sub-cultures sérielles.
On a observé une cytopathologie progressive typique de la varicelle et lorsque la culture fut suffisamment avancée (13 jours après l'inoculation) on
a décanté les liquides surnageants et on a réculté les cellules infectées par trypsinisation. Après l'élimination de la trypsine par centrifugation, on a remis
les cellules en suspension, on les a comptées et réinoculées à une série fraîche de cultures de cellules WI-38, cette opération constituant le second passage
sériel à 32[deg.]C. Les passages subséquents de suspensions
de cellules infectées se sont poursuivis de la même manière. Le passage du virus pouvait également être
amorcé au départ de suspensions de cellules infectées conservées à -70[deg.]C avec des additifs protecteurs cryogéniques, comme le glycérol, le sorbitol ou le sulfoxyde de diméthyle, dont on sait qu'ils conservent la viabilité des cellules.
En utilisant une suspension de cellules
infectées du dix-neuvième passage comme virus d'ensemencement, on a préparé un vaccin de la varicelle
à base de virus exempts de cellules,vivants et atténués, de la façon suivante :
On a préparé des cultures de cellules WI-38
dans des bouteilles roulantes en verre en utilisant
<EMI ID=4.1>
chauffé comme milieu de croissance. Deux jours après la plantation, on a ajouté le milieu de croissance et on a inoculé les cultures en bouteille avec appro-
<EMI ID=5.1>
tenant 2 % de sérum de veau agamma inactivé.
Trois jours après l'inoculation, on a réalimen-
<EMI ID=6.1>
de veau agamma inactivé. On a effectué l'incubation à
32[deg.]C dans un appareil permettant de faire rouler les bouteilles. 7 jours après l'ensemencement, on a rinçé les cultures en bouteilles à deux reprises avec une solution physiologique à tampon au phosphate, à raison de 100 ml par rinçage. On a ajouté 16 ml d'un stabilisant du type SPGA à chaque bouteille. Le stabilisant
du type SPGA était constitué des ingrédients suivants:
<EMI ID=7.1>
On a préparé le stabilisant en dissolvant
les ingrédients dans 800 ml d'eau distillée stérile
et en amenant le volume jusqu'à 1 litre avec de l'eau distillée supplémentaire. Le pH de.la composition doit varier de 6,9 à 7,1. On a incorporé de la néomycine
en une concentration de 50 mcg/ml aux milieux de croissance, de rinçage, d'entretien et de stabilisation.
On a réalisé des titrages d'infectiosité
de chaque récolte dans des cultures sur cellules
WI-38.
Après l'addition du stabilisant, on a con- gelé les bouteilles individuelles dans un bain C02- alcool (environ -70[deg.]C). On a ensuite rapidement décongelé les contenus congelés des bouteilles en les secouant vigoureusement, en rompant partiellement la feuille de cellules et en libérant les cellules dans l'agent de stabilisation liquide. On a réuni les contenus des bouteilles, on en a prélevé des échantillons
pour mesurer leur stérilité et leur infectiosité
(déterminées après traitement d'un petit échantillon
aux ultrasons) et on les a conservés à -70[deg.]C dans un congélateur à fonctionnement mécanique. Trois semaines
plus tard, après que les tests de stérilité et d'infectiosité préliminaires eurent donné satisfaction,
on a rapidement décongelé les suspensions stabilisantcellules réunies et on les a transférées dans un appareil de traitement aux ultrasons à passage continu.
En variante on aurait aussi pu omettre la conservation
des suspensions stabilisant-cellules réunies à -70[deg.]C
et on aurait pu poursuivre le procédé par un traitement aux ultra-sons continus et un remplissage achevés
en une seule opération continue.
L'appareil de traitement aux ultra-sons
à passage continu présentait les organes suivants:
1) dispositif de rupture des cellules aux ultra-sons
et accessoires (wattmètre, corne de rupture filetée d'un demi pouce et accessoire d'écoulement continu en acier inoxydable);
2) récipient en verre pyrex d'une contenance de 4 litres à chemise d'eau spéciale;
3) échangeur de chaleur en une tubulure d'acier inoxydable, enroulé en spirale et chemisé;
4) bain réfrigéré et circulateur;
5) débit-mètre; et
6) micro-pompe, à vitesse variable.
Les conditions de fonctionnement étaient les suivantes:
<EMI ID=8.1>
le wattmètre monté sur l'appareil;
2) débit : 150 ml/minute (mesuré sur le débit-mètre et
contrôlé à l'extérieur à l'aide de la micro-pompe);
3) cycles de traitement aux ultra-sons: quatre, par
exemple volume total déplacé à travers le dispositif de traitement pour ultra�sons à quatre reprises; et
4) température de fonctionnement : 0-4[deg.]C.
L'accessoire de passage ou écoulement continu, le récipient d'une contenance de 4 litres, l'échangeur de chaleur, le débit-mètre et la prise d'entrée de la micro-pompe ont été assemblés sous la forme d'une unité avant l'utilisation et stérilisés. Les connexions externes entre le bain réfrigéré en circulation et les parties chemisées de l'appareil ont permis à l'appareil tout entier d'être refroidi jusqu'à 0-4[deg.]C et maintenu à cette température au cours de toute l'opération de traitement aux ultra-sons.
Après le traitement aux ultra-sons, qui a permis d'obtenir une rupture des cellules sensi-
<EMI ID=9.1>
lons du vaccin en vrac pré-clarifié à des fins de contrôle et pouvant tester la sécurité. On a clarifié
le vaccin résiduel par filtration à travers une
bougie filtrante en verre fritté de porosité moyenne
(15 microns) de 2,5 x 8,3 cm et on a recueilli le
vaccin ainsi obtenu dans un récipient pré-refroidi. Avant l'utilisation, on a garni la bougie filtrante
d'un litre d'agent stabilisant. On a prélevé des échantillons après la clarification afin de tester
la sécurité sur animal et on a centrifugé un échantillon de 50 ml et on a remis le sédiment en suspen- sion dans 0,5 ml d'agent stabilisant (concentrat centuple) et on l'a transféré sur des lames à des
fins d'examen microscopique en présence de cellules intactes. On n'en a pas observé. On a réparti le
vaccin de la varicelle à virus vivants exempts de cellules final dans des fioles bouchées de caoutchouc et on l'a
<EMI ID=10.1>
dans des fioles à des fins de conservation ultérieures par lyophilisation, en utilisant les techniques bien connues des techniciens, telles que décrites dans
<EMI ID=11.1> dans des préparations de vaccins congelés à l'état
<EMI ID=12.1>
suivant la préparation.
On peut préparer une forme de dosage convenable en reconstituant la matière lyophilisée jus-
<EMI ID=13.1>
l'addition d'eau distillée stérile et en utilisant d'environ 0,1 ml à 1,0 ml de ladite substance reconstituée pour l'administration parentérale sous la forme d'un vaccin de la varicelle. La forme congelée à l'état humide du vaccin qui contient 0,7 à 1,2 ml de vaccin peut être décongelée avant l'utilisation, une dose variant d'environ 0,1 ml à 1,0 ml du vaccin étant administrée par la voie parentérale.
EXEMPLE 2
Vaccin de la varicelle à virus exempts de cellules, vivants et atténués, préparé par 15 passages en série
<EMI ID=14.1>
On peut préparer un vaccin de la varicelle
à base de virus exempts de cellules, vivants, atténués en utilisant sensiblement le même mode opératoire que celui décrit à l'exemple 1, sauf que l'on a réalisé un total de 15 passages dans la culture de tissu à base de cellules WI-38.
EXEMPLE 3
<EMI ID=15.1>
à base de virus exempts de cellules, vivants et atténués, en répétant sensiblement le même mode opératoire que celui décrit dans les exemples 1 sx 2, sauf qu'après 6 passages en série à 32[deg.]C, on anan-js une nouvelle série de passages à 36[deg.]C à partir gel septième passage et que l'on poursuit les passages à
<EMI ID=16.1>
une préparation de vaccin au 15ème passage.
EXEMPLE 4
<EMI ID=17.1>
On peut préparer un vaccin de la varicelle à base de virus exempts de cellules, vivants et atténués, en répétant sensiblement le même mode
<EMI ID=18.1>
une préparation de vaccin au 20ème passage.
EXEMPLE 5
Vaccin de la varicelle à base de virus exempts de cellules, vivants et.atténués, préparé par 30 passages en série dans des cellules WI-38.
On peut préparer un vaccin de la varicelle à base de virus exempts de cellules, vivants et atténués, en répétant sensiblement le même mode opératoire que celui décrit dans les exemples 1 et 4, sauf qu'après 6 passages en série à 32[deg.]C, on amorçe une nouvelle série de passages à 36[deg.]C à partir du 7ème passage et que l'on poursuit les passages à
36[deg.]C jusqu'au 29ème passage pour finalement obtenir une préparation de vaccin au 30ème passage.
EXEMPLE 6
Vaccin de la varicelle à base de virus exempts de cellules, vivants et atténués, préparé par 40 passages en série dans des cellules WI-38.
On peut préparer un vaccin de la varicelle à base de virus exempts de cellules, vivants et atténués, en répétant sensiblement le même mode opératoire que celui décrit dans les exemples 1 et 4, sauf qu'après 6 passages en série à 32[deg.]C, on amorçe une nouvelle série de passages à 36[deg.]C à partir du 7ème passage et que l'on poursuit les passages à
36[deg.]C jusqu'au 39ème passage pour finalement obtenir une préparation de vaccin au 40ème passage.
EXEMPLE 7
Vaccin de la varicelle à base de virus exempts de cellules, vivants et atténués, préparé par 20 passages en série dans une culture de tissus de cellules de testicules de singe.
On peut préparer un vaccin de la varicelle à base de virus exempts de cellules, vivants et atténués, en répétant sensiblement le même mode opératoire que celui décrit à l'exemple 1, sauf que l'on utilise une culture de tissu de cellules de test icules de singe connue au lieu de la culture sur cellules WI-38, le nombre total des passages en série s'élevant à 20.
EXEMPLE 8
Vaccin de la varicelle à base de virus exempts de cellules, vivants et atténués, préparé par 20 passages en série dans une culture de tissu de cellules de testicules de singe.
On peut préparer un vaccin de la varicelle à base de virus exempts de cellules, vivants et atténués, en répétant sensiblement le même mode opératoire que celui décrit à l'exemple 4, sauf que l'on utilise une culture de tissu de cellules de testicules de singe connue au lieu de la culture sur cellules WI-38, le nombre total des passages en série s'élevant à 20.
REVENDICATIONS
1.- Procédé dé préparation de virus de
la varicelle exempts de cellules, vivants et atténués, pouvant être utilisés à titre d'antigène dans
un vaccin qui provoque une réponse en anticorps chez
l'homme vis-à-vis d'un virus de la varicelle viru-
lant sans pour autant provoquer les manifestations
cliniques graves de la maladie, caractérisé en ce que
l'on fait passer en série des virus virulants à 30-
38[deg.]C dans une préparation de culture sur tissu choisie
dans le groupe formé par des souches de cellules diploïdes humaines et animales et des cellules primaires
d'origine simienne, les passages s'effectuant en nombre
suffisant pour atténuer les virus, cette opération
étant suivie de la libération des virus atténués des
cellules infectées, en présence d'un stabilisant.
Vaccine and process for preparing it
The present invention relates to a vaccine against chickenpox as well as to processes for the preparation of such a vaccine.
More particularly, the present invention relates to a safe live attenuated varicella virus vaccine, as well as a process for the production of the vaccine in question by serial propagation.
varicella virus in cell culture systems.
Chickenpox, or smallpox *, is primarily a highly contagious disease of children. This disease is typically characterized by the onset of fevers and the development of a macular rash which progresses rapidly to the stages of papule and vesicle formation. Healing usually takes place without incident, but the disease, even in its moderate form, is unpleasant in appearance and can cause a large number of scars to appear from the ruptured vesicles. In some cases, the disease can be very serious in that it can be complicated by pneumonia in children or adults. Central nervous system complications, such as acute cerebellar ataxia with tremors and muscle hypotonia may precede, accompany, or follow chickenpox.
More rarely there is generalized damage to the central nervous system with hemorrhage, infiltration
<EMI ID = 1.1>
Neuritis and myelitis can also occur. The color of the skin can also be troublesome with the appearance of hemorrhagic, bulbous or gangrenous lesions.
Therefore, the prevention of the disease by vaccination is justified in order to prevent the occurrence of the above-mentioned disorders and disadvantages.
and a more particular subject of the invention is a live attenuated varicella virus vaccine as well as a process for its preparation.
Several researchers have, in the past, attempted to carry out vaccinations of sensitive human volunteers with variable results as to the "catches" and a lot of inconvenience as regards the protective efficacy. However, no significant desired effects were obtained despite the fact that the vaccinations attempted were on
susceptible volunteers with fully virulent viruses in vesicular fluid from cases of varicella zoster.
The prior art has reported that the spread of chickenpox in various systems
culture in cells, such as those from human amnion, human embryonic fibroblasts, Hela cells, and human thyroid cells, but prior to the present invention it was generally believed that the sole source of chickenpox cell-free, viable, was the fluid from the vesicles produced by
disease. Caunt et al., Journal of Hygiene,
62, 413-424 (1964) reported the isolation of
viruses free from thyroid tissue cells
human and Brunell, Virolo � y, 31, 732-4 (1967) described the isolation of viruses free from cells
human embryonic fibroblasts. Vesicular fluid is clearly an inappropriate source of live virus for vaccine production due to their virulence and limited supply. Human thyroid tissue consists of a primary human cell line and is therefore not suitable as a system
tissue culture for the propagation and attenuation of viruses to produce live virus vaccines.
Surprisingly, it has now been found that a cell-free passage can be obtained in suitable tissue culture preparations, that there can be obtained in quantity of live, extracellular varicella viruses which can be used as antigens. and that a vaccine could be prepared from it based on live and attenuated varicella virus causing in humans the appearance of an antibody response against virulent varicella viruses, without causing serious clinical manifestations of this disease.
The method according to the present invention is characterized in that it comprises serial passages of virulent varicella viruses in a tissue culture system. The tissue culture system can be any suitable for vaccine production and known to support virus growth, such as diploid human cell strains, as exemplified by WI-38 cells and MRC-5, diploid animal cell strains (fetal rhesus) and primary cells of simian origin. Preferred systems are those consisting of monkey testicular tissue and diploid human fetal lung tissue, such as WI-38 cells, prepared according to known methods.
The culture is incubated at 30-38 [deg.] C, preferably at a temperature varying from about 32 [deg.] C to 36 [deg.] C, for a period varying from 3 to about 10 days. Actual incubation time varies and is determined
by the extent of the viral spread, as indicated
<EMI ID = 2.1>
The inoculum can be a suspension of infected cells or a virus released by conventional methods.
(eg by ultrasound treatment).
When the appropriate degree of infectivity is found to have been achieved, usually after about 10 to about 40 serial passages of the virus,
liquids used for maintenance are aseptically removed. It should be noted that the number of serial passages required may depend on the source of virus or the particular isolate which was used in the preparation of the vaccine. The cell sheets are then rinsed several times with a physiological serum-free solution, such as a physiological saline solution with phosphate buffer (PBS).
or Hanks' balanced salt solution. A suitable stabilizing agent, such as a composition consisting of sucrose, albumin, glutamine and phosphate or the like is added in a corresponding volume.
<EMI ID = 3.1>
original.
The infected cells are removed from the surface of the container into the stabilizing medium by suitable means (eg, by freeze-thaw or by scraping the cells). The stabilizer-cell suspensions are then pooled and the infected cells are further disrupted by
appropriate means, such as ultrasound treatment. The suspension of disrupted cells thus obtained is then clarified by filtration so as to rid it of cellular debris in order to ensure that a virus preparation free of cells is obtained. The virus preparation thus obtained is then subdivided into a suitable container for distribution as a vaccine. The dose may vary from about 0.1 to about 2.0 ml containing 100 to about 1000 infected units in sealed flame vials or the vaccine may be presented as a lyophilized product in stoppered vials. and ready to be reconstituted in sterile water. Administration can be by scarification (multiple punctures) intradermally or by subcutaneous routes.
The seed virus to be used for carrying out the above method is isolated from vesicle fluid from a clinical case of chickenpox and stored in calf infusion broth.
at -70 [deg.] C.
EXAMPLE 1
Chickenpox vaccine based on cell-free, live, attenuated virus prepared by serial 20 passages through tissue of WI-38 cells.
19 serial passages of varicella virus in WI-38 tissue culture were performed as follows:
The initial isolation of chickenpox viruses was performed from a sample of gallbladder fluid taken from a child with clinical chickenpox. The vesicle fluid sample was collected in veal infusion broth and stored at -70 [deg.] C; at the time of isolation the sample was thawed, diluted with an equal volume of calf infusion broth containing 100 mcg of neomycin and 100 mcg of polymixin per ml and incubated for 30 minutes at 25 [deg.] C. The sample was inoculated into cultures of established WI-38 cells originating from a human-diploid fetus and incubated at 32 [deg.] C, this step constituting passage n [deg.] 1 of ' a series of serial subcultures.
A progressive cytopathology typical of chickenpox was observed and when culture was sufficiently advanced (13 days after inoculation)
the supernatants were decanted and the infected cells were harvested by trypsinization. After removal of the trypsin by centrifugation, the
the cells in suspension, were counted and reinoculated to a fresh series of WI-38 cell cultures, this operation being the second passage
serial at 32 [deg.] C. Subsequent passages of suspensions
of infected cells continued in the same manner. Passage of the virus could also be
initiated from suspensions of infected cells stored at -70 [deg.] C with cryogenic protective additives, such as glycerol, sorbitol or dimethyl sulfoxide, which are known to retain cell viability.
Using a cell suspension
infected with the nineteenth passage as a seed virus, a chickenpox vaccine was prepared
live attenuated cell-free virus as follows:
Cultures of WI-38 cells were prepared
in rolling glass bottles using
<EMI ID = 4.1>
heated as a growth medium. Two days after planting, growth medium was added and the bottle cultures were inoculated appropriately.
<EMI ID = 5.1>
holding 2% inactivated agamma calf serum.
Three days after inoculation, the
<EMI ID = 6.1>
of inactivated agamma calf. Incubation was carried out at
32 [deg.] C in a device for rolling the bottles. 7 days after seeding, the bottle cultures were rinsed twice with physiological phosphate buffered saline, 100 ml per rinse. 16 ml of an SPGA type stabilizer was added to each bottle. Stabilizer
of the SPGA type consisted of the following ingredients:
<EMI ID = 7.1>
The stabilizer was prepared by dissolving
the ingredients in 800 ml of sterile distilled water
and bringing the volume up to 1 liter with additional distilled water. The pH of the composition should vary from 6.9 to 7.1. Neomycin was incorporated
in a concentration of 50 mcg / ml in growth, rinse, maintenance and stabilization media.
Infectivity assays were performed
of each harvest in cell cultures
WI-38.
After addition of the stabilizer, the individual bottles were frozen in a CO 2-alcohol bath (about -70 [deg.] C). The frozen contents of the bottles were then rapidly thawed by shaking them vigorously, partially breaking the sheet of cells and releasing the cells into the liquid stabilizing agent. The contents of the bottles were collected, samples were taken
to measure their sterility and infectivity
(determined after processing a small sample
ultrasonic) and stored at -70 [deg.] C in a mechanically operated freezer. Three weeks
later, after the preliminary sterility and infectivity tests were satisfactory,
The combined cell stabilizing suspensions were rapidly thawed and transferred to a continuous ultrasonic treatment apparatus.
As a variant, we could also have omitted the conservation
stabilizer-cell suspensions combined at -70 [deg.] C
and we could have continued the process by continuous ultrasound treatment and filling completed
in one continuous operation.
The ultrasound treatment device
with continuous passage presented the following organs:
1) Ultrasonic cell disruption device
and accessories (power meter, half-inch threaded rupture horn and stainless steel continuous flow accessory);
2) pyrex glass container with a capacity of 4 liters with a special water jacket;
3) heat exchanger in stainless steel tubing, spiral wound and jacketed;
4) refrigerated bath and circulator;
5) flow meter; and
6) micro-pump, variable speed.
The operating conditions were as follows:
<EMI ID = 8.1>
the power meter mounted on the device;
2) flow rate: 150 ml / minute (measured on the flow meter and
controlled externally using the micro-pump);
3) ultrasound treatment cycles: four, for
example total volume moved through the ultrasound processing device four times; and
4) Working temperature: 0-4 [deg.] C.
The continuous flow or flow accessory, the container with a capacity of 4 liters, the heat exchanger, the flow meter and the inlet of the micro-pump were assembled as a unit. before use and sterilized. The external connections between the circulating refrigerated bath and the jacketed parts of the apparatus allowed the entire apparatus to be cooled down to 0-4 [deg.] C and maintained at that temperature throughout the entire period. ultrasound treatment operation.
After the ultrasound treatment, which made it possible to obtain a rupture of the sensi-
<EMI ID = 9.1>
lons of the pre-clarified bulk vaccine for control and safety testing purposes. We clarified
the residual vaccine by filtration through a
medium porosity sintered glass filter candle
(15 microns) of 2.5 x 8.3 cm and the
vaccine thus obtained in a pre-cooled container. Before use, we filled the filter candle
one liter of stabilizing agent. Samples were taken after clarification to test
animal safety and a 50 ml sample was centrifuged and the sediment resuspended in 0.5 ml stabilizer (100-fold concentrate) and transferred to slides at
microscopic examination in the presence of intact cells. We haven't seen any. We distributed the
final live cell-free chickenpox vaccine in rubber-capped vials and
<EMI ID = 10.1>
in vials for subsequent preservation by lyophilization, using techniques well known to those skilled in the art, as described in
<EMI ID = 11.1> in vaccine preparations frozen as
<EMI ID = 12.1>
depending on the preparation.
A suitable dosage form can be prepared by reconstituting the lyophilized material until
<EMI ID = 13.1>
adding sterile distilled water and using from about 0.1 ml to 1.0 ml of said reconstituted substance for parenteral administration in the form of a chickenpox vaccine. The wet frozen form of the vaccine which contains 0.7 to 1.2 ml of vaccine may be thawed prior to use, with a dose varying from about 0.1 ml to 1.0 ml of the vaccine being administered by the parenteral route.
EXAMPLE 2
Cell-free, live attenuated varicella virus vaccine prepared by 15 serial passages
<EMI ID = 14.1>
You can prepare a chickenpox vaccine
cell-free, live, attenuated virus-based using substantially the same procedure as described in Example 1, except that a total of 15 passages were made in the WI- cell-based tissue culture. 38.
EXAMPLE 3
<EMI ID = 15.1>
based on virus free from cells, living and attenuated, by repeating substantially the same procedure as that described in Examples 1 x 2, except that after 6 serial passages at 32 [deg.] C, one anan-js a new series of passages at 36 [deg.] C from freezing seventh passage and that one continues the passages at
<EMI ID = 16.1>
a vaccine preparation at the 15th passage.
EXAMPLE 4
<EMI ID = 17.1>
A chickenpox vaccine can be prepared from cell-free, live and attenuated virus by repeating substantially the same procedure.
<EMI ID = 18.1>
a vaccine preparation at the 20th passage.
EXAMPLE 5
Chickenpox vaccine based on cell-free, live and attenuated viruses prepared by serial passages in WI-38 cells.
A varicella vaccine based on cell-free, live and attenuated virus can be prepared by repeating substantially the same procedure as that described in Examples 1 and 4, except that after 6 serial passages at 32 [deg. ] C, we start a new series of passages at 36 [deg.] C from the 7th passage and that we continue the passages at
36 [deg.] C until the 29th passage to finally obtain a vaccine preparation at the 30th passage.
EXAMPLE 6
Chickenpox vaccine based on cell-free, live and attenuated viruses prepared by serial 40 passages in WI-38 cells.
A varicella vaccine based on cell-free, live and attenuated virus can be prepared by repeating substantially the same procedure as that described in Examples 1 and 4, except that after 6 serial passages at 32 [deg. ] C, we start a new series of passages at 36 [deg.] C from the 7th passage and that we continue the passages at
36 [deg.] C until the 39th pass to finally obtain a vaccine preparation at the 40th pass.
EXAMPLE 7
Varicella vaccine based on cell-free, live and attenuated viruses prepared by serial passages in tissue culture of monkey testis cells.
A chickenpox vaccine based on cell-free, live and attenuated viruses can be prepared by repeating substantially the same procedure as described in Example 1, except that a tissue culture of test cells is used. known monkey icules instead of cultured on WI-38 cells, the total number of serial passages being 20.
EXAMPLE 8
Varicella vaccine based on cell-free, live and attenuated viruses prepared by serial passages in tissue culture of monkey testis cells.
A chickenpox vaccine based on cell-free, live and attenuated virus can be prepared by repeating substantially the same procedure as described in Example 4, except that a tissue culture of testis cells is used. known monkey instead of cultivation on WI-38 cells, the total number of serial passages being 20.
CLAIMS
1.- Process for the preparation of
chickenpox cell-free, live and attenuated, which can be used as an antigen in
a vaccine that elicits an antibody response in
man against a viru-varicella virus
lant without provoking demonstrations
severe clinical disease, characterized in that
virulent viruses are serially changed to 30-
38 [deg.] C in a selected tissue culture preparation
in the group formed by human and animal diploid cell strains and primary cells
of simian origin, the passages being carried out
sufficient to attenuate viruses, this operation
being followed by the release of attenuated viruses from
infected cells, in the presence of a stabilizer.