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On connait des préparations d'insuline injectables dont l'effet prolongé est basé exclusivement ou principalement sur la présence de cris- taux d'insuline en suspension aqueuse. Il est également connu que l'effet prolongé de telles suspensions aqueuses d'insuline cristalline dépend dans une certaine mesure de la dimension des cristaux d'insuline en suspension.
Dans les procédés cinnus jusqu'à présent pour préparer de l'insuline cristallisée, rien n'a été fait pour régler la dimension des cristaux produits. Au reste, il n'y avait aucune raison d'effectuer un ré- glage, étant donné qu'auparavant les cristaux eux-mêmes n'étaient pas des constituants des préparations d'insuline à usage clinique.
Ce n'est seulement qu'à l'apparition des préparationsd'insu- line offrant une utilité clinique pratique basée sur des suspensions aqueu- ses d'insuline en cristaux que le problème s'est posé d'arriver à des cris- taux ayant en majeure partie la même dimension ou d'obtenir la majeure partie en poids des cristaux dans des dimensions comprises entre certaines limites déterminées.
La présente invention a pour but d'apporter une solution au problème soulevé plus haut. Ainsi, un des objets de l'invention est de fai- re cristalliser l'insuline au cours du processus de cristallisation sous la forme de cristaux ayant en majeure partie la même dimension. Un autre objet de l'invention est de produire des cristaux d'insuline propres à l'usage comme substance d'ensemencement pour la production de plus grands cristaux ayant en majeure partie la même dimension.
L'invention se fonde sur l'observation qu'au cours du proces- sus de cristallisation la présence d'insuline séchée par congélation influen- ce le cours de la cristallisation en ce qui concerne la dimension des cristaux produits et la quantité de cristaux ayant en majeure partie la même dimension.
La cristallisation de l'insuline est une chose bien connue; elle a été fréquemment décrite dans la littérature consacrée à l'insuline.
Bien que les diverses méthodes de cristallisation puissent différer quelque peu, elles reposent toutefois sur le même principe, consistant à provoquer la cristallisation de l'insuline à partir d'un milieu aqueux en changeant la valeur du pH du milieu jusqu'au voisinage du point isoélectrique de l'insuline.
La cristallisation requiert la présence d'un métal promoteur de cristallisation (zinc, cobalt, nickel, cadmium, cuivre, manganèse ou fer; de tous ces métaux, on utilise presque exclusivement le zinc), et si l'insuline ne contient pas d'elle-même un tel métal en quantité suffisante, on doit ajouter au milieu aqueux de cristallisation la quantité nécessaire de ce métal. La quantité nécessaire de métal promoteur de cristallisation représente environ 0,4% du poids de l'insuline. Pratiquement, pour la cristallisation on utilise d'habitude 2 à 5 fois la quantité nécessaire.
La valeur du pH de cristallisation est située d'ordinaire entre 5,4 et 6,2, et, dans le but de fixer cette valeur, on utilise généralement une substance tampon ou des mélanges de substances tampons. Comme exemples de telles substances tampons, on citera les tampons acétate, borate, citrate phosphate, diéthylbarbiturate et maléate.
Le plus communément, on produit une solution aqueuse acide d' insuline avec la teneur nécessaire en métal et, au besoin, en substance tampon, et on ajuste cette solution au pH de cristallisation; mais, il est également possible de précipiter l'insuline à l'état amorphe dans un milieu aqueux sans la teneur nécessaire en métal, et de transformer ensuite l'insuline en sa forme cristalline en ajoutant la quantité nécessaire de métal, par exemple sous la forme d'une solution aqueuse d'un sel métallique. Finalement, on peut encore approcher le pH de cristallisation par le côté basique, en utilisant des solutions d'insuline basiques.
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La présente invention se rapporte à un procédé du genre indiqué plus haut et, en accord avec l'observation signalée précédemment, la caractéristique principale de l'invention est que la cristallisation a lieu en présence d'insuline séchée par congélation.
Suivant une forme de réalisation de l'invention, on ajoute l'insuline séchée par congélation au milieu de cristallisation contenant de l'insuline, après ajustement de ce milieu à la valeur de pH de cristallisation, mais toutefois avant que la formation des cristaux ait commencé. Suivant une autre forme de réalisation, on produit le milieu de cristallisation contenant de l'insuline en mélangeant une solution aqueuse acide d'insuline et une solution basique contenant, au besoin, un métal promoteur de cristallisation et une substance tampon pour obtenir la valeur de pH de cristallisation, et en ajoutant l'insuline séchée par congélation à la solution basique avant le processus de mélange.
La cristallisation peut avoir lieu à un pH de 5 à 7, mais il convient qu'elle se produise à un pH de 6,2 à 6,5.
Il est préférable d'utiliser de l'insuline cristalline ou de l'insuline de même pureté comme matière première pour l'insuline séchée par congélation. Le séchage par congélation peut se faire d'une manière connue en soi. Par exemple, on peut sécher par congélation de l'insuline cristalli- ne dissoute dans un acide dilué ou une base diluée, la solution ayant respectivement une valeur de pH de par exemple 3 et 7,5, ou bien on peut sécher par congélation une solution d'insuline de composition correspondante à celle du milieu de cristallisation auquel on ajoute ultérieurement l'insuline séchée par congélation. Il est aussi possible de sécher par congélation une solution d'insuline amorphe ( exempte de métaux).
D'habitude on sèche par congélation des solutions limpides, mais rien n'empêche de laisser une partie de l'insuline sous la forme précipitée amorphe avant l'opération de séchage par congélation.
On a trouvé que la quantité d'insuline séchée par congélation, qui est ajoutée au milieu de cristallisation influence le cours de la cristallisation, en ce sens que, dans des conditions identiques, les cristaux seront d'autant plus petits qu'on aura ajouté une quantité plus importante d'insuline séchée par congélation. Par conséquent, il est avantageux d'ajouter l'insuline séchée par congélation en une quantité en poids constituant une fraction prédéterminée de la quantité en poids d'insuline devant cris- talliser.
Finalement, il n'est pas nécessaire que le milieu de cristallisation contienne de l'insuline à l'avance, la concentration d'insuline désirée dans le milieu de cristallisation étant produite par l'addition d'insuline séchée par congélationo
D'habitude, lorsqu'on utilise le procédé suivant l'invention, on obtient des cristaux d'insuline dont la dimension peut varier depuis environ 2 jusqu'à environ 7u, suivant la quantité d'insuline séchée par congélation utilisée, la composition de l'insuline séchée par congélation et les conditions de cristallisation. Bien que les cristaux ou suspensionsde cristaux produits puissent trouver un usage thérapeutique, ils sont néanmoins mieux appropriés pour l'usage comme substance d'ensemencement, pour la production de cristaux d'insuline plus grands et de dimension uniforme.
Leur utilité à cette fin est due non seulement au fait que les cristaux possèdent des propriétés d'ensemencement, mais aussi parce qu'il est possible, en se servant du procédé selon l'invention, d'obtenir des cristaux séparés complètement les uns des autres, qui apparaissent ainsi sous la forme de corps cristallins individuels (libres).
Ci-dessous, on expliquera de façon plus détaillée, en se référant aux divers exemples, comment on peut produire l'insuline séchée par congélation et comment on peut exécuter le procédé de cristallisation en
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utilisant une addition d'insuline séchée par congélation. On notera que 1' insuline cristalline servant de matière première contient environ 0,4% de zinc.
Exemple 1.
On dissout 500 mg d'insuline cristalline dans 50 cm d'eau contenant 4 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1 N, et on sèche par congélation la solution produite, de la manière habituelle, sous une pression d'envi- ron 0,05 mm de mercure ou moins.
Lorsqu'on ajoute cette insuline séchée par congélation à un milieu de cristallisation aqueux contenant:
50 mg d'acide citrique ( à l'état de citrate de sodium) par 100 cm3,
2 mg de Zn ( à l'état de chlorure de zinc) par 100 cm3,
1/2 % d'insuline, 1 / de p-oxybenzoate de méthyle et ajusté à un pH de 6,5, à raison de 20% de la quantité d'insuline dans le milieu aqueux de cristallisation, l'insuline cristallise sous la forme de cristaux uniformes en dimension et'en forme, ayant une dimension d'environ 5u.
Exemple 2.
On dissout 500 mg d'insuline cristalline dans 50 cm3 d'eau contenant 4,3 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1 N. On mélange cette solution avec 50 cm3 d'une solution tampon contenant:
50 mg d'acide citrique,
10 cm3 d'hydroxyde de sodium 0,1 N,
2 mg de zinc (à l'état de chlorure de zinc),
1,6 / de p-oxybenzoate de méthyle, la valeur du pH du mélange est ajustée à 6,3, ce qui rend la solution trouble par suite de la précipitation d'insuline amorphe. On sèche par congélation le mélange trouble ainsi produit, de la manière habituelle, sous la même pression que dans l'exemple 1.
Lorsqu'on ajoute cette insuline séchée par congélation au même milieu de cristallisation que celui de l'exemple 1 et dans la même proportion, l'insuline cristallise sous la forme de cristaux de 5 à 7u Exemple 3,
Le procédé est le même que dans l'exemple 2, avec comme seule modification que la solution d'insuline qui doit être séchée par congélation est ajustée à un pH de 6,6 au lieu de 6,3, et ainsi la solution reste limpide étant donné qu'il n'y a pas de précipitation d'insuline.
Le résultat de la cristallisation est de l'insuline en cristaux ayant une dimension d'environ 2u Exemple 4,
On suit le même procédé que dans l'exemple 2 avec comme seule modification que la solution d'insuline qui est séchée par congélation est ajustée à un pH de 7,0. Dans ce cas également , le résultat de la cristallisation de l'insuline est qu'on obtient des cristaux d'insuline dont la dimension est d'environ 2u Exemple 5.
Le procédé est le même que dans l'exemple 2, avec pour seule modification que la solution d'insuline qui doit être séchée par congélation est ajustée à un pH de 7,5. Dans ce cas, le résultat de la cristallisation est qu'on obtient des cristaux ayant comme dimension 1 à 1,5w
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Exemple 6.
On dissout dans 50 cm3 d'eau, contenant 4,3 cm3 d'acide chlor- hydrique 0,1 N, 500 mg d'insuline amorphe extrêmement purifiée, ne contenant pas de méta promoteurs de cristallisation. On mélange la solution ainsi produite avec 50 cm3 d'une solution contenant 50 mg d'acide citrique, 10 cm3 d'hydroxyde de sodium 0,1 N et 1,6 / de p-oxybenzoate de méthyle, a- près quoi on ajuste la valeur du pH du mélange à 6,7. On sèche par congéla- tion le mélange ainsi produit, de la même manière que dans l'exemple 1.
Lorsqu'on ajoute cette insuline séchée par congélation au même milieu de cristallisation que celui de l'exemple 1 et en même quantité, 1' insuline cristallise sous la forme de cristaux de 5u Exemple 7.
On dissout 500 mg d'insuline cristalline dans 50 cm3 d'eau contenant 4,3 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1 N. On mélange la solution ainsi produite avec 50 cm3 d'une solution contenant 50 mg d'acide citrique, 2 mg de zinc (à l'état de chlorure de zinc), 10 cm3 d'hydroxyde de sodium 0,1 N et 1,6 / de p-oxybenzoate de méthyle. On ajuste la valeur du pH du mélan- ge à 5,0 environ, après quoi on ajoute 100 mg d'insuline séchée par congé- lation comme dans l'exemple 3, et on agite le mélange. L'insuline cristal- lise sous la forme de cristaux de 2,5u qui ont toutefois tendance à ad- hérer entre eux, ce qui les rend moins aptes à l'usage comme cristaux d'en- semencement.
Exemple 8,
Le procédé est le même que dans l'exemple 7, avec comme seule modification que la cristallisation a lieu à un pH de 5,5 au lieu de 5,0.
Les cristaux ainsi produits ont une dimension d'environ 2w, et ils adhèrent moins entre eux que ceux de l'exemple 7.
Exemple 9.
Le procédé est le même que dans l'exemple 7, avec comme seule différence que la cristallisation a lieu à un pH de 6,0; par ce procédé, on obtient des cristaux de 2u. qui sont complètement séparés les uns des autres.
Exemple 10.
Le procédé est le même que dans l'exemple 7, sauf que la cris- tallisation se fait à un pH de 6,3. Par ce procédé, on obtient le même ré- sultat que dans l'exemple 9.
Exemple 11
Le procédé est le même que dans l'exemple 7, sauf que la cris- tallisation se fait à un pH de 7,0. Par ce procédé, on obtient des cristaux d'insuline dont la dimension est de 1 à 2u, mais une partie seulement de l'in- suline est à même de cristalliser par suite de la solubilité relativement grande de l'insuline dans des conditions de cristallisation indiquées.
Exemple 12.
On dissout 500 mg d'insuline cristalline dans 50 cm3 d'eau contenant 4,3 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1 N, et on mélange la solution ain- si produite avec 50 cm3 d'une solution aqueuse contenant 178 mg de NaHPO4, 2H20, A mg de zinc ( à l'état de chlorure de zinc), 3,8 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1 N et 1,6 / de p-oxybenzoate de méthyle. On ajuste la valeur du pH du mélange à 6,3, après quoi on ajoute 100 mg de l'insuline séchée par congélation suivant l'exemple 3, et on agite le mélange jusqu'à achèvement de la cristallisation. On obtient des cristaux d'insuline dont la dimension est d'environ 2 /(/ @
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temple 13.
On dissout 500 mg d'insuline cristalline dans 50 cm3 d'eau contenant 4,3 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1 N, et on mélange la solution avec 50 cm3 d'une solution aqueuse contenant 136 mg de CH3COONa,3H20, 2 mg de zinc ( à l'état de chlorure de zinc), 4,5 cm3 d'hydroxyde de sodium
0,1 N, et 1,6 / de p-oxybenzoate de méthyle. On ajoute la valeur du pH du mélange vers 6,3, après quoi on ajoute 100 mg d'insuline séchée par con- gélation suivant l'exemple 3, et on agite le mélange. Les cristaux d'insu- line ainsi produits ont une dimension d'environ 2u
Exemple 14.
A 50 cm3 d'une solution aqueuse contenant 50 mg d'acide citri- que, 4,5 mg de nickel ( à l'état de chlorure de nickel), 10 cm3 d'hydroxyde de sodium 0,1 N et 1,6 / de p-oxybenzoate de méthyle, on ajoute 50 cm3 d'une solution d'insuline ayant la même composition que celle de la solution d'insuline qui, suivant l'exemple 6, est soumise à un séchage par congélation, après quoi on ajoute immédiatement 100 mg d'insuline séchée par congélation suivant l'exemple 3. On ajuste la valeur du pH du mélange vers 6,2. Par cris- tallisation, on obtient des cristaux d'insuline ayant une dimension d'envi- ron 2 u Exemple 15.
A 100 cm3 d'une solution aqueuse contenant 50 mg d'acide citri- que, 2 mg de zinc (à l'état de chlorure de zinc) et 0,8 / de p-oxybenzoate. de méthyle, ajustée à un pH de 6,5 au moyen d'hydroxyde de sodium, or[ ajoute tout en agitant 600 mg d'insuline séchée par congélation suivant l'exemple 3. Après agitation de quelques heures, l'insuline ajoutée cristallise sous la forme de cristaux ayant une dimension d'environ 2u.
Exemple16
A 50 cm3 d'une solution aqueuse contenant 50 mg d'acide citrique, 2 mg de zinc ( à l'état de chlorure de zinc), 10 cm3 d'hydroxyde de sodium 0,1 N et 1,6 / de p-oxybenzoate de méthyle, on ajoute tout en agitant 100 mg d'insuline séchée par congélation suivant l'exemple 3, et immédiatement après 500 mg d'insuline cristalline dissoute dans 50 cm3 d'eau contenant 4,3 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1 N, après quoi on ajuste la valeur du pH du mélange au voisinage de 6,0. On exécute la cristallisation tout en agitant; les cristaux d'insuline produits ont une dimension d'environ 2u Exemple 17.
A 50 cm3 d'une solution aqueuse contenant 50 mg d'acide citrique, 2 mg de zinc ( à l'état de chlorure de zinc) et environ 9 cm3 d'hydroxyde de sodium 0,1 N (jusqu'à une valeur de pH d'environ 11,8), on ajoute 100 mg d'insuline séchée par congélation produite de la manière décrite dans 1' exemple 3.
L'insuline séchée par congélation semble, par ce moyen, entrer en solution. On ajoute alors 50 cm3 d'une solution d'insuline contenant 500 mg d'insuline cristalline, 4,3 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1 N et 1,6 de p-oxybenzoate de méthyle, et on ajuste le pH vers 6,3.
Au bout de quelques heures la cristallisation est achevée. La dimension des cristaux est d'environ 2 à 3u
Si les cristaux d'insuline produits suivant les exemples précédents sont utilisés comme substance d'ensemencement pour la production industrielle de suspensions injectables d'insuline cristalline qui contiennent des cristaux d'insuline approximativement de même dimension, il convient de prendre des précautions pour que les cristaux d'ensemencement obtenus se trouvant dans le milieu de suspension, ne subissent aucun changement au cours d'un entreposage éventuel.
A cette fin, on peut ajouter une quantité d'un métal promoteur de cristallisation au milieu de suspension des cris-
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taux d'ensemencement utilisés, suffisante pour que la suspension soit stable à un pH de 7, et-ensuite on ajuste le mélange à cette valeur de pH Ainsi, chacune des suspensions des cristaux d'insuline, produits suivant les exemples, peut être dans le rapport 1: 1 avec une solution aqueuse contenant 50 mg de @n ( à l'état de chlorure de zinc) par 100 cm3 et 1 /00 de p-oxybenzoate de méthyle, tout en ajoutant suffisamment d'hydroxyde de sodium pour obtenir une valeur de pH de 7 à 7,5.
Finalement, on notera que dans l'exécution industrielle pratique du procédé, la cristallisation est d'habitude effectuée dans des conditions de stérilité, de façon à obtenir des suspensions stériles de cristaux soit pour l'usage thérapeutique direct, soit pour l'emploi dans la préparation de suspension stériles de cristaux plus grands d'insuline destinés à l'usage thérapeutique direct.
REVENDICATIONS.
1. Procédé de cristallisation de l'insuline à partir d'un milieu aqueux en changeant la valeur du pH du milieu pour qu'elle soit au voisinage du point isoélectrique de l'insuline, caractérisé en ce que la cristallisation a lieu en présence d'insuline séchée par congélation.