<Desc/Clms Page number 1>
PROCEDE DE PRODUCTION DE CRISTAUX D'INSULINE.
Lettre rectificative jointe le 1.2.55 pour valoir comme de droit : Page 3 ligne 53 il faut lire : "0,08%" au lieu de 0,08#" Page 4 ligne 10 il faut après "cristaux d'ensemencement" : "(3 )" Page 4 ligne 20 il faut lire ''suspension de cristaux d'ensemencement" au lieu de "suspension cristalline" Page 4 ligne 31 11 faut lire "l'exemple 2" au lieu de "l'exemple 1" Page 4 ligne 41 11 faut lire "l'exemple ?.Il au lieu de "l'exemple 1" Page 4 ligne 49 il faut ajouter "1N" après "NaoH" Page 5 ligne 8 il faut "l'exemple 2" au lieu de "l'exemple 1".
<Desc/Clms Page number 2>
On connaît des préparations Injectables d'Insuline dont l'effet prolongé est du exclusivement ou principalement à la présence de cristaux d'
Insuline en suspension aqueuse. De même que d'autres préparations injecta- bles d'insuline, ces préparations sont mises our le marché en ampoules ayant une fermeture consistante en totalité ou en partie, en du caoutchouc de façon à pouvoir percer le caoutchouc avec la canule de la seringue d' injection, en vue d'introduire dans la seringue la dose requise. A l'or* dinaire, une ampoule contient la suspension aqueuse d'insuline cristalline en une quantité qui suffit pour plusieurs doses.
Chaque fois qu'on enlève une dose d'une ampoule, il est néces- saire au préalable de secouer l'ampuole de manière à disperser les cristaux d'insuline déposés, afin de former une suspension dans laquelle les cristaux d'Insuline sont uniformément distribués. Si on ne prend pas de précautions pour que les cristaux d'Insuline soient uniformément distribués dans le milieu de suspension aqueux avant que la suspensionsoit prélevée dans la seringue d'injection, aucune dose ne contiendra la même quantité d'Insuline.
Etant donné que l'administration de l'insuline est faite d'habitude par les patients eux-mêmes, il est important d'obtenir une suspension uniforme sans difficulté, simplement en secouant une ampoule, de façon à être abso- lument certain que chaque dose contient la même quantité d'Insuline.
Si la suspension aqueuse cristalline contient des cristaux d'in- suline qui, par suite de leur dimension, sont difficiles à maintenir en suspension, on n'a aucune garantie à ce sujet. C'est pourquoi il est impor- tant que la suspension cristalline ne contienne pas de cristaux particuliè- rement grands; en d'autres mots, la dimension des plus grands cristaux d'insuline ne doit pas dépasser une certaine dimension prédéterminée qui ne permettrait pas en toute certitude, lorsque le patient a secoué l'ampoule et qu' il a prélevé la dose voulue dans la seringue d'Injection, l'existence d'une môme concentration d'insuline dans toute la suspension, sans qu'il y ait donc des cristaux déposés au fond de l'ampoule.
Si on s'en rapporte aux procédés connus jusqu'à présent pour la préparation de l'insuline cristalline, rien n'a été fait pour ajuster la dimension des cristaux produits. Au reste, un ajustement aurait été sans objet pharmaceutique étant donné qu'antérieurement les cristaux d'insuline n'intervenaient pas dans les préparations d'insuline à usage clinique.
Il est bien connu que la cristallisation de l'insuline se fait principalement en provoquant la cristallisation de l'insuline à partir d'un milieu aqueux en changeant la valeur de pH du milieu pour être au voisinage du point isoélectrique de l'insuline. Si l'insuline elle-même ne contient pas à l'avance des quantités suffisantes d'un métal promoteur de cristalli- sation, ordinairement du zinc, par exemple sous la forme de chlorure de zinc, on confère au milieu de cristallisation la teneur voulue en ce métal; en outre, on fait usage généralement de substances tampons pour fixer la valeur du pH au cours de la cristallisation.
Un des buts visés par la présente invention est d'apporter un procédé pour produire des cristaux d'Insuline ayant une dimension qui ne dépasse pas une certaine dimension prédéterminée, de façon à pouvoir obtenir directement dans le processus de cristallisation une masse cristalline quel'on peut utiliser telle quelle pour les applications cliniques, sans devoir la soumettre à une sédimentation fractionnée en vue de séparer les cristaux trop grands.
Le procédé de l'invention est du genre dans lequel on provoque la cristallisation de l'insuline à partir d'un milieu aqueux ayant une valeur de pH comprise entre 5 et 7, en présence d'un métal promoteur de cris- tallisation, le trait caractéristique de l'Invention étant que la cristallisation se fait en ensemençant le milieu avec des cristaux d'insuline.
A l'aide d'un processus d'ensemencement, il est possible d'arri- ver à des cristaux d'insuline ayant une dimension qui ne dépasse pas une di-
<Desc/Clms Page number 3>
mension prédéterminée, qui est fonction de la quantité de cristaux d'en- semencement utilisée, de la dimension de ces cristaux et de la concentra- tion en insuline durant la cristallisation.
Ici, et dans la description qui suit, on entend par dimension des cristaux d'Insuline la dimension en de la plus longue diagonale du cristal.
Quant à la quantité de cristaux d'ensemencement à ajouter, lorsque les cristaux d'insuline produits ne peuvent pas dépasser une dimen- sion définie, elle est donnée par l'équation suivante : d3
P = I x di3 - dp3 dans laquelle P Indique la quantité en gramme de cristaux d'ensemencement utilisés, I le poids en gramme d'Insuline devant cristalliser, dp la dimension la plus grande des cristaux d'ensemencement et d la limite supérieure désirée de la dimension des cristaux d'insuline à produire.
Lorsqu'on souhaite par exemple que les cristaux d'insuline ne dépassent pas envoron 30 et en supposant qu'on veuille faire cristalliser 100 grammes d'insuline, on doit employer les cristaux d'ensemencement à raison d'environ 30 mg au cas où les cristaux d'ensemencement ont une di- mension d'environ 2 et moins, et à raison d'environ 240 mg si les cris- taux d'ensemencement ont une dimension d'environ 4 et moins.
Avec les préparations injectables d'insuline, dont l'effet pro- longé repose sur la présence de cristaux d'Insuline en suspension, il est en outre important que les cristaux d'insuline en suspension aient en ma- jeure partie la même dimension, autrement dit que la majeure partie de l' insuline présente ait la forme de cristaux qui ne diffèrent pas ou qui dif- fèrent très peu les uns des autres en dimension. Ceci assurera un effet clinique constant et complètement reproductible.
Un autre objet de la présente invention consiste à produire des conditions telles au cours de la cristallisation que la majeure partie de 1'insuline cristallise à l'état de cristaux dont la dimension est voisine de la limite supérieure désirée.
On peut obtenir ce résultat en empêchant, dans la mesure du pos- sible, la formation de cristaux d'insuline due à la cristallisation sponta- née, et en utilisant des cristaux d'ensemencement ayant en majeure partie la même dimension. De cette façon, il est possible d'obtenir comme ré- sultat que la majeure partie de l'Insuline d'une masse cristalline traitée existe principalement dans la même dimension de cristal. Dans ces circon- stances dp Indiquera approximativement la dimension des cristaux d'ensemen- cement et di la dimension de cristal dans laquelle la majeure partie de 1' Insuline cristallisera.
A titre d'exemple on peut mentionner que par sup- pression de la cristallisation spontanée dans le procédé suivant la présente Invention, 90% de l'Insuline d'une masse cristalline traitée cristallisera sous la forme de cristaux ayant une dimension comprise entre 28 et 36 .
Pour que la cristallisation spontanée soit insignifiante, on peut suivant l'invention utiliser une addition d'une substance tampon dont l'anion ne fixe pas le métal promoteur de cristallisation à réaction neutre.
Comme exemples de telles substances tampons on citera les tampons borate, diéthylbarbiturate, maléate et acétate, parmi lesquels le dernier mentionné a la préférence lorsque les suspensions cristallines produites doivent être directement utilisées dans la production de préparations injectables d'in- suline.
Il est également possible de faire appel au procédé signalé dans le brevet belge N 520.686 (demande N 407.820), suivant lequel la cristal-
<Desc/Clms Page number 4>
lisation se fait en présence d'un halogène sous une forme inonogène, à une concentration supérieure à 0,2 mole par litre. Il est préférable de pro- duire cette concentration en ion halogène par addition d'une quantité suf- fisante d'un sel halogéné d'un métal alcalin, d'ammoniac ou de métaux al- calino-terreux, ou d'un mélange de sels de ce genre. En vue d'obtenir des récoltes de cristaux maxima il y a lieu de ne pas employer des concentra- tlons en Ion halogène supérieures à environ 1 mole par litre.
Si la cristallisation est effectuée comme indiqué plus haut, il n'est pas nécessaire d'utiliser des substances tampons dont 1'anion ne fixe pas le métal promoteur de cristallisation à réaction neutre. On peut éga- lement utiliser des tampons phosphate ou citrate, ou des mélanges de ceux-ci.
Dans l'exécution du procédé suivant l'invention, on peut pro- duire de manière connue en soi le milieu de cristallisation contenant de l'insuline. Il est le plus courant de produire une solution aqueuse acide d'insuline avec la teneur nécessaire en un ou plusieurs métaux promoteurs de cristallisation (zinc, cobalt, nickel, cadmium, cuivre, manganèse et fer ;
parmi ceux-ci, on utilise presque exclusivement le zinc) et au besoin avec des substances tampons, et d'ajuster la solution au pH de cristalli- sation; mais il est également possible de précipiter l'insuline à l'état amorphe dans un milieu aqueux dépourvu de la teneur nécessaire en métal, et de provoquer ensuite la conversion de l'insuline en sa forme cristalline par addition ultérieure de la quantité nécessaire de .étal, par exemple sous la forme d'une solution aqueuse d'un sel du métal. Finalement, 11 est possible également d'approcher le pH de cristallisation par le coté basique, en utilisant des solutions basiques d'insuline.
On ajoute les cristaux d'ensemencement soit sous la forme d'une suspension aqueuse, suspendue par exemple dans le milieu aqueux dans lequel les cristaux d'ensemencement sont produits, ou sous une forme sèche, par exemple sous la forme obtenue en séchant par congélation. Si l'insuline est présente sous la forme précipitée amorphe sans la teneur nécessaire en métal dans le milieu de cristallisation., on peut ajouter les cristaux d'ensemencement conjointement avec la teneur manquante en métal, du fait que la suspension aqueuse des cristaux d'ensemencement peut par elle-même présenter une teneur suffisante en métal.
Comme indiqué, la cristallisation a lieu à une valeur de pH comprise entre 5 et 7, et il est avantageux d'employer dans cet intervalle un pH de 5,3 à 6,5, selon la composition du milieu de cristallisation.
Les cristaux d'ensemencement utilisés peuvent par exemple s'obtenir suivant le procédé signalé dans le brevet belge déposé,le 12.Il,1954 sous le n
Pour des renseignements plus détaillés sur le procédé suivant l'invention, on se rapportera aux exemples mentionnés ci-dessous.
Exemple 1.
On dissout 500 mg d'insuline cristalline de pancréas de boeuf dans 50 cm3 d'eau contenant 0,6 cm3 d'HCl 1 N. On ajoute alors 50 cm3 d'une solution tampon contenant 7 g de NaCl et 10 cm3 d'une solution aqueuse contenant 10 % d'acide citrique, 0,4% de zinc (à l'état de chlorure de zinc) et assez de NaOH pour avoir une solution dont le pH soit d'environ 6,3. Au besoin on ajuste le pH vers 6,0. Avant que la cristallisation spontanée ne commence, on ajoute 2 cm3 de suspension de cristaux d'ensemencement, cette suspension ayant la composition suivante : 0,03 % de cristaux d'insuline dont la dimension est de 3 et moins, 2,5 mg par 100 cm3 de zinc (à l'état de chlorure de zinc), 2,5 mg par 100 cm3 d'acide citrique, 0,08# de p-oxybenzoate de méthyle et de la soude caustique de manière à obtenlr un pH de 7,2 à 7,4.
Après agitation de quelques heures, la cristallisation est achevée, et les cristaux ont acquis une dimension d'environ 4 à 25 .
Sans le processus d'ensemencement, on obtient des cristaux ayant une dimen-
<Desc/Clms Page number 5>
sion variant entre 5 et 50 Exemple 2.
On dissout 500 mg d'Insuline cristalline de pancréas de porc dans 50 cm3 d'eau contenant 6 em3 de HCl 0,1N, on ajoute 15 cm3 d'acétone et ensuite 10 cm3 d'une solution tampon contenant 10% d'acide citrique, 0,4 % de Zn (à l'état de chlorure) et suffisamment de NaOH pour conférer à la solution tampon une valeur de pH voisine de 6,3. On ajoute alors de l'eau pour former un volume total de 100 cm3. On ajuste le pH aux environs de 6,2. Avant que la cristallisation spontanée ne commence, on ajoute 2 cm3 d'une suspension de cristaux d'ensemencement, cette sus- pension ayant la même composition que dans l'exemple 1.
Après agitation ménagée de plusieurs heures, la cristallisation est achevée; la majeure partie de l'Insuline cristallise sous la forme de cristaux ayant une di - mension de 20 à 25 .
Exeple 3.
On dissout 1,12 g d'insuline cristalline de pancréas de boeuf dans 50 cm3 d'eau contenant 10 mg de Zn (à l'état de chlorure de zinc) et 2 cm3 de HCl 1 N. On ajoute alors 50 cm3 d'une solution qui contient 7 g de NaCl et 1,7 cm3 de NaOH 1 N. Immédiatement après, on ajoute 2,5 cm3 d'une suspension cristalline ayant la même composition que dans l'exemple 1. On ajuste le pH à une valeur de 5,4 à 5,6. Après agitation de 15 à 20 heures, la cristallisation est achevée. La dimension des cristaux est moindre que 30 et la majeure partie de l'insuline est présente en cris- taux ayant à peu près cette dimension.
Exeple 4.
On dissout 1,6 g d'insoline cristalline de pancréas, de boeuf dans 50 cm3 d'eau contenant 10 mg de Zn (à l'état de chlorure) et 2 cm3 de HCl 1 N. On ajoute alors 50 cm3 d'une solution tampon qui contient 1,36 g de CH3COONa, 3H2O, 7 g de NaCl et 1 cm3 de NaOH 1 N. Immédiatement après on ajoute 3,5 cm3 d'une suspension de cristaux d'ensemencement comme celle de l'exemple 1. On ajuste le pH à 5,4 - 5,6. Après agitation de 15 à 20 heures, la cristallisation est achevée et la majeure partie de l' insuline cristallise sous la forme de cristaux ayant une dimension voisine de 30 .
Exeple 5.
On dissout 1,12 g d'insuline cristalline de pancréas de boeuf dans 50 cm3 d'eau contenant 10 mg de Zn (à l'état de chlorure de zinc) et 2 em3 de HCl 1 N. On ajoute alors 50 cm3 d'une solution aqueuse qui con- tient 1,36 g de CH3COONa, 3H2O, 11,9 g de KBr et 1 cm3 de NaOH 1 N. Immédiatement après on ajoute 2,5 cm3 d'une suspension de cristaux d'ensemencement comme celle décrite dans l'exemple 1; On ajuste le pH à une valeur de 5,4 à 5,6. Après agitation de 15 à 20 heures, la cristallisation est achevée.
La majeure partie de l'insuline cristallise sous la forme de cristaux dont la dimension est voisine de 30 .
Exemple 6.
On dissout 1,6 g d'insuline cristalline dans 500 cm3 d'eau con- tenant 100 mg de Zn (à l'état de chlorure de zinc) et 20 cm3 de HCl 1 N.
On ajoute alors 500 cm3 d'une solution tampon qui contient 13,6 g de CH3 COONa,3H2O, 70 g de NaCl et 10 cm3 de NaOH. Ensuite on ajoute 1,8 cm3 d'une suspension de cristaux d'ensemencement comme celle décrite dans l' exemple 1. On ajuste le pH à une valeur de 5,4 à 5,6. Après agitation de 15 à 20 heures, la cristallisation est achevée. La majeure partie de l'in- suline cristallise sous la forme de cristaux dont la dimension est voisine de 40 .
<Desc/Clms Page number 6>
Exempt 7..
On dissout 3,2 g d'insuline cristalline dans 50 cm3 d'une solu- tion aqueuse contenant 20 mg de Zn (à l'état de chlorure) et 3 cm3 de HCl
1 N. On ajoute ensuite 50 cm3 d'une solution aqueuse qui contient 1,36 g de CH3COONa, 3H 0,7 g de NaCl et 2 cm3 de NaOH 1 N. Fuis on ajoute 5 cm3 d'une suspension de cristaux d'ensemencement qui, en ce qui regarde tous les constituants, est 10 fois plus concentrée que celle signalée dans l'exemple 1. Au bout d'environ 20 heures, la cristallisation est achevée.
La majeure partie de l'Insuline cristallise sous la forme de cristaux dont la dimension est voisine de 15 .
Exemple
On effectue la cristallisation de la manière Indiquée dans 1' exemple 4, mais au lieu d'ajouter 3,5 cm3 d'une suspension de cristaux d' ensemencement, on en ajoute une quantité équivalente sous la forme d'une poudre séchée par congélation. Par ce procédé on obtient la même dimen- sion de cristal que dans l'exemple 4.
On peut employer le procédé selon l'invention en combinaison avec les procédés de production de préparatlons Injectables d'insuline à effet prolongé mentionnés dans le brevet belge N 502. 327 (demande N 391.958). Dans ce cas, on exécute le procédé suivant la présente in- vention de manière à arriver à des suspensions stériles offrant une teneur prédéterminée en insuline par unité de volume, une teneur suffisante en composés isotoniques, un agent de conservation et, de plus, présentant une teneur en un ou plusieurs métaux promoteurs de cristallisation au-delà de la limite inférieure signalée dans le brevet mentionné. Finalement, comme tampon de cristallisation on ne doit pas se servir de substances dont les anions fixent les métaux promoteurs de cristallisation, à réaction neutre .
L'exemple ci-dessous montre comment on peut exécuter le procédé suivant l'invention.
Exemple 9.
On dissout 1,6 g d'insuline cristalline dans 50 cm3 d'eau conte- nant 10 mg de zinc (à l'état de chlorure) et 2 cm3 de HCl 1 N. On filtre stérilement la solution et on lave le filtre avec 25 cm3 d'eau. Aux 75 cm3 de filtrat on ajoute 25 cm3 d'une solution tampon préparée dans des condi- tions aseptiques, qui contient 1,36 g de CH3COONa, 3H2O, 7 g de NaCl et 1 cm3 de NaOH 1 N. On ajoute alors 3,5 cm3 dune suspension de cristaux d' ensemencement préparée dans des conditions aseptiques et ayant la même composition que dans l'exemple 2. On ajuste le pH à 5,5. Après agitation de 15 à 20 heures, la cristallisation est achevée. La majeure partie de l'insuline a cristallisé sous la forme de cristaux de dimension voisine de 30 .
On convertit la suspension cristalline en une préparation injec- table, prête à l'emploi en la diluant avec 900 cm3 d'une solution, préparée dans des conditions aseptiques, qui contient 70 mg de zinc (à l'état de chlo- rure), 1,1 # de p-oxybenzoate de méthyle et 2,7 cm3 de NaOH 1 N. Le pH doit être d'environ 7,3, et la suspension est ajustée à cette valeur au moyen de NaOH ou HCl, 0,1 N.
La préparation finale contient 40 unités internationales d'insu- line par cm3.
A partir des textes des brevets précités ressortiront d'autres manières d'employer la présente invention directement pour la production de préparations injectables, prêtes à l'emplol.
REVENDICATIONS.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.