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Coffret d'analyse pour la détermination du niveau de 1 indice de germination bactérienne dans le petit-lait.
La présente invention concerne un coffret d'analyse pour une détermination rapide du niveau de l'indice de germination bactérienne dans le petit-lait en utilisant la réaction de bioluminescence luciférineluciférase.
Le traitement du petit-lait exige une surveillance permanente de la qualité microbiologique du petit-lait utilisé, afin d'éviter une contamination microbienne des produits finaux obtenus. C'est pourquoi les laiteries et les entreprises de transformation du lait effectuent des tests microbiologiques, avant, pendant et après le traitement, qui permettent d'analyser les produits laitiers obtenus et le petit-lait initial transformé, afin de déceler la présence de germes indésirables. A cette occasion, il est nécessaire de déceler souvent de très faibles densités de germination d'un grand nombre de germes différents.
L'une des méthodes utilisées jusqu'à présent pour déterminer l'indice de germination dans les produits laitiers est le procédé par plaques de Koch. Dans cette méthode, les échantillons à analyser sont étalés sur des plaques d'agar-agar où elles incubent pendant environ 72 heures à 30"C. A partir du nombre de colonies développées sur les plaques d'agar-agar, il est possible de déterminer ensuite l'indice de germination des échantillons à examiner. Cette méthode de détermination est non seulement très longue, mais aussi très onéreuse, car jusqu'au moment de l'analyse des plaques d'agar-agar, il est nécessaire d'entreposer au froid les livraisons de petit-lait correspondant aux échantillons, pendant toute cette période.
DE-A-28 31 559 décrit une méthode d'analyse des cellules somatiques dans le lait. Cette méthode se base sur la réaction connue luciférine-luciférase, dans laquelle l'adénosine triphosphate (désignée ciaprès par ATP) est transformée par réaction enzymatique en adénosine monophosphate (désignée ci-après par AMP). La bioluminescence qui apparaît au cours de cette réaction est mesurée quantitativement, la quantité de lumière libérée étant proportionnelle à la quantité d'ATP
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contenue dans l'échantillon. Comme chaque cellule contient de l'ATP, la concentration en ATP permet de déterminer le nombre de cellules somatiques à partir de la corrélation entre l'échantillon mesuré et l'étalon connu.
La teneur en ATP est caractéristique de chaque type de cellule.
Ainsi, la teneur en ATP des cellules bactériennes est nettement inférieure à celle des cellules somatiques sensiblement plus grandes.
L'objet de la présente invention était de concevoir un coffret d'analyse pour une détermination rapide du niveau de l'indice de germination dans le petit-lait, permettant de déterminer rapidement la densité des germes bactériens. Il est également possible de diminuer le nombre de récipients d'analyse, telles que les boîtes de Pétri, par exemple.
Ainsi, on a découvert un coffret d'analyse qui permet de déceler la présence de germes bactériens dans le petit-lait à l'aide de la réaction de bioluminescence luciférine-luciférase.
Le coffret d'analyse conforme à l'invention permet de manière avantageuse d'utiliser la réaction de bioluminescence luciférine-luciférase pour déterminer le niveau de l'indice de germination dans le petit-lait. Le petit-lait est un sous-produit de la fabrication des fromages et de la caséine, dont la flore microbienne se distingue nettement de la flore microbienne du lait cru, par exemple.
Dans la fabrication des fromages, on détruit en règle générale d'abord la flore bactérienne initiale du lait par un traitement thermique. En ajoutant des ions nitrate, par exemple, il est possible d'éliminer d'autres micro-organismes (Clostridium, par exemple). Ensuite, on effectue le caillage de la caséine du lait. Le caillage est obtenu soit par fermentation lactique, au cours de laquelle des ferments microbiens, ajoutés spécifiquement, décomposent partiellement le sucre du lait (lactose) en acide lactique, soit par addition de présure, soit par une combinaison des deux processus. Des micelles de caséine se forment pendant le caillage,
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elles forment un réseau tridimensionnel et incluent les autres produits contenus dans le lait. Ce réseau est appelé coagulum.
Dès que le coagulum a atteint la consistance souhaitée, il est coupé en morceaux. D'autres étapes de fabrication permettent que le coagulum élimine une grande partie du liquide aqueux inclus dans le coagulum, en même temps que les produits mis en solution dans ce liquide (essentiellement le lactose, les protéines du lait et des sels), à savoir le petit-lait.
Au sens de la présente invention, le terme petit-lait désigne, outre le petit-lait sucré obtenu lors de la fabrication du fromage, le concentré de petit-lait et le petit-lait dilué.
L'objet de l'invention est un coffret d'analyse pour la détermination rapide du niveau de l'indice de germination bactérienne d'un échantillon de petit-lait à analyser, dans lequel l'échantillon est préparé en vue d'une mesure de bioluminescence ; ainsi, l'échantillon de petit-lait est dilué avec une solution réactive contenant de l'ethoxylate de 4- (1, 1,3, 3tétraméthylbutyl) phénol, l'échantillon de petit-lait dilué est séparé par centrifugation en une phase liquide et un résidu solide, une solution réactive, qui contient un réactif bactériolytique, est ajoutée au résidu solide pour le transformer en suspension, la suspension est mélangée à une solution réactive hydrolysant l'ATP pour obtenir un mélange réactionnel,
on laisse réagir le mélange réactionnel obtenu pendant un temps suffisant pour réaliser l'hydrolyse de l'ATP et l'inactivation du réactif excédentaire hydrolysant l'ATP, on libère l'ATP bactérienne contenue dans le mélange réactionnel par traitement avec une solution réactive libérant de l'ATP bactérienne, on ajoute au mélange réactionnel une solution réactive composée de luciférine-luciférase qui tamponne autour d'un pH de, 7,0 à 7,9, afin de provoquer une.
réaction de bioluminescence-avec l'ATP libérée, qui détermine par voiephotométrique la quantité de lumière émise pendant la réaction de bioluminescence, et qui, par comparaison avec des courbes d'étalonnage obtenues dans les mêmes conditions avec des échantillons de même
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provenance dont l'indice de germination est connu, détermine le niveau de l'indice de germination dans l'échantillon à analyser, caractérisé en ce que le coffret d'analyse contient a) une solution réactive contenant l'éthoxylate de 4- (1, 1,3, 3- tétraméthylbutyl) phénol, b) une solution réactive réagissant par voie bactériolytique, c) des réactifs pour obtenir une solution réactive hydrolysant l'ATP, à savoir c1) du soma sous forme lyophilisée, c2)
le sel disodique de l'acide éthylenediaminetétraacétique (désigné par Na2EDTA ci-après) sous forme solide, c3) une solution réactive liquide pour libérer les nucléotides des cellules somatiques, d) une solution réactive libérant l'ATP bactérienne, e) un réactif composé de luciférine-luciférase, f) une solution tampon qui tamponne autour d'un pH de 7,0 à 7,9.
Le coffret d'analyse conforme à l'invention, qui est formé par la combinaison des réactifs cités ci-dessus, permet de déterminer d'une manière rapide et reproductible le niveau de l'indice de germination bactérienne dans le petit-lait en utilisant la réaction de bioluminescence luciférine-luciférase.
Au cours de l'analyse d'un échantillon de petit-lait avec le coffret d'analyse conforme à l'invention, on prépare l'échantillon de petit-lait en le diluant d'abord avec le réactif contenant de l'éthoxylate de 4- (1, 1,3, 3tétraméthylbutyl) phénol. La teneur en éthoxylate de 4- (1, 1,3, 3- tétraméthylbutyl) phénol est calculée de telle sorte que la concentration dans l'échantillon de, petit-lait traité avec cette substance soit suffisante pour ouvrir les membranes des cellules somatiques et libérer l'ATP somatique. En règle générale, on utilise le réactif Triton X 1 OO, commercialisé et connu en soi. Dans un mode de réalisation préféré,
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cette solution réactive contient en plus des détergents chimiques et des émulsifiants.
Ensuite, la solution diluée de l'échantillon de petit-lait est soumise à une centrifugation pour obtenir la séparation en une phase liquide et un résidu solide. La centrifugation est exécutée de manière avantageuse pendant une durée de 3 à 7 minutes, de préférence 5 minutes, à 8 000- 16 000 g, de préférence, 12 000 g.
Au cours de l'étape suivante, le résidu solide séparé est transformé en suspension par l'addition d'une solution réactive bactériolytique. La solution réactive bactériolytique utilisée est, par exemple, une solution aqueuse d'un enzyme réagissant par voie bactériolytique, tel qu'un lysozyme. Ce dernier peut contenir en plus des stabilisateurs chimiques appropriés.
L'hydrolyse subséquente del'ATP est obtenue par réaction enzymatique. Pour ce faire, on utilise une combinaison de l'enzyme soma avec une solution réactive capable de libérer les nucléotides des cellules somatiques. La solution réactive hydrolysant l'ATP est obtenue à partir des réactifs contenus dans le coffret, du fait que l'on ajoute du NasEDTA à la solution réactive pour libérer les nucléotides, c'est-à-dire la solution d'un"Nucleotide Releasing Reagent for Somatic Cells", désignée ci-après par l'expression réactif NRS, et que l'on mélange la solution réactive ainsi obtenue avec du soma mis en solution dans la solution tampon.
La solution réactive libérant l'ATP appropriée dans le cas présent est une solution qui contient, parallèlement à la solution somatique tamponnée, un réactif NRS connu en soi, qui contient essentiellement une solution aqueuse d'acide trichloroacétique à 2-7 % en poids et un générateur de complexes pour des-cations bivalents, telsque Na2EDTA, à une concentration de 3 à 4 mg par ml de solution, et de préférence, de l'acide trichloroacétique à 5 % en poids et Na2EDTA à une concentration de 42 mg environ pour 11,2 ml de solution.
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Afin que l'ATP bactérienne libérée ultérieurement ne soit pas décomposée par réaction enzymatique, il est nécessaire d'inactiver un réactif excédentaire hydrolysant l'ATP en laissant reposer l'échantillon pendant un temps suffisant, c'est-à-dire environ 20 minutes. Afin d'obtenir une réaction complète, on agite l'échantillon de manière avantageuse dans un dispositif automatique adapté à cet effet à une vitesse d'environ 600 à 800 tours par min.
Pour libérer l'ATP bactérienne, le mélange réactionnel ainsi préparé est alors traité avec un réactif capable de réaliser la lyse des membranes cellulaires des bactéries. La lyse peut être produite par voie enzymatique, tel que le traitement au lysozyme, ou par voie chimique. Ainsi, la solution réactive libérant l'ATP bactérienne peut être soit une solution composée, par exemple, de lysozymes et de 1, 5 % en poids environ d'acide trichloroacétique, soit une solution composée de détergents pour réaliser la lyse par voie chimique, par solubilisation des membranes bactériennes, par exemple. De préférence, on utilise le "Nucleotide Releasing Reagent for Microbial Cells" (désigné ci-après par l'expression réactif NRB), réactif connu en soi.
Comme réactif NRB, on peut utiliser une solution contenant un détergent ionique à une concentration de 0,1 % à 2 % en poids environ.
Pour provoquer une réaction de bioluminescence avec l'ATP libérée, on utilise une solution d'un réactif composé de luciférine-luciférase, qui tamponne autour d'un pH de 7,0 à 7,9. Le coffret conforme à l'invention contient le réactif enzymatique composé de luciférine-luciférase, de préférence sous forme lyophilisée. Le réactif composé de luciférineluciférase est connu et peut être obtenu à partir d'organismes produisant de la bioluminescence quelconques. On utilise en particulier le réactif composé de luciférine-luciférase obtenu à partir des lampyres, c'est-à-dire un réactif couramment commercialisé.
Comme tampon, on utilise différents systèmes qui tamponnent autour du domaine physiologique de pH de 7,0 à 7,9, tel que le système tampon phosphate ou à base d'acide
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N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-2-éthanesulfonique (désigné ci-après par l'expression tampon HEPES). De préférence on utilise, le tampon Luminit, connu en soi, de la société LUMAC Systems, Bâle, qui contient 25 mmolll de tampon HEPES, 7,5 mmol/l de sulfate de magnésium et 1 mmol/l de Na2EDTA.
Pour mesurer la quantité de lumière émise par bioluminescence, on peut utiliser des appareils de mesure de photons classiques, tels que le photomètre ou un compteur de photons. Etant donné qu'il faut détecter de très faibles quantités de lumière, il est avantageux d'utiliser un compteur ae pnorons en parcu. ier un ccmpteur ae pnotcns capaole de mesurer les photons individuels. Après avoir mesuré la quantité de lumière émise par bioluminescence, les niveaux de l'indice de germination des échantillons à analyser, déterminés par le procédé conforme à l'invention, sont comparés aux courbes d'étalonnage qui ont été tracées à partir d'échantillons de même provenance et d'indices de germination connus.
Les indices de référence de ces échantillons de référence ont été déterminés avec le procédé par plaques de Koch.
L'étude comparative des valeurs de mesures déterminées par le procédé conforme à l'invention avec les courbes d'étalonnage permet alors de déterminer de manière fiable et rapide le niveau de l'indice de germination.
Il est également possible de comparer la quantité de lumière émise par bioluminescence des échantillons à analyser avec une concentration étalon en ATP, dont la quantité de lumière émise par bioluminescence a été déterminée au préalable quantitativement dans des conditions de mesure identiques. Avant d'effectuer les mesures proprement dites, on détermine en plus ladite valeur à blanc de ta méthode, qui est mesurée avec l'appareil de mesure des photons utilisé sans échantillons à analyser pour les solutions et les réactifs utilisés. Pour déterminer la quantité de lumière émise par bioluminescence des échantillons à
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analyser, il faut corriger les valeurs de mesure obtenues autour de la valeur à blanc de la méthode.
La détermination du niveau de l'indice de germination bactérienne dans un échantillon de petit-lait avec le coffret conforme à l'invention est réalisée de manière appropriée de sorte que, pour la poursuite de l'essai, une part volumique de l'échantillon de petit-lait est transférée dans un récipient approprié, de manière avantageuse un flacon pour centrifugeuse, puis diluée avec environ une moitié de la part volumique d'une solution réactive contenant l'éthoxylate de 4- (1, 1,3, 3tétraméthylbutyl) phénol. Après avoir obtenu un mélange intime de l'échantillon de petit-lait dilué, en agitant, par exemple, à multiples reprises le récipient, on place le récipient dans une centrifugeuse.
L'échantillon est centrifugé pendant environ 3 à 10 minutes à environ 8 000-16 000 g et à température ambiante. Ensuite, on élimine la partie surnageante (phase liquide), le plus souvent limpide, du résidu solide, ce qui est réalisable, par exemple, en utilisant avec précaution une pipette.
On ajoute au résidu solide restant environ un cinquième du volume d'une solution réactionnelle bactériolytique, puis, à plusieurs reprises, on remet le mélange obtenu en suspension. On ajoute ensuite au mélange remis en suspension environ un vingt-cinquième du volume d'une solution réactive hydrolysant l'ATP. Ensuite, pour réaliser l'hydrolyse de l'ATP et l'inactivation du réactif excédentaire hydrolysant l'ATP, l'échantillon ainsi préparé est agité dans un dispositif mécanique approprié à une vitesse de 400 à 1 000 tours par min pendant un temps suffisamment long, à savoir environ 20 minutes. On prélève-dans l'échantillon agité une fraction
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aliquote de 10 pl à 1 000 ut, de préférence 100 ut, que l'on introduit avec une-pipette dans une'cuvette.
Il est nécessaire que la cuvette utilisée soit parfaitement transparente afin de pouvoir détecter la lumière émise par bioluminescence (562 nm). La cuvette est introduite dans un appareil de mesure des photons approprié à la mesure de la luminescence et on ajoute ensuite dans l'ordre une part de volume, équivalente à la quantité
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d'échantillon, une solution réactive NRB et une solution réactive composée de luciférine-luciférase. Ensuite, on mesure quantitativement la quantité de lumière émise par bioluminescence libérée dans l'échantillon.
A partir de la quantité de lumière émise par bioluminescence on détermine alors le niveau de l'indice de germination bactérienne dans l'échantillon, par corrélation entre l'échantillon mesuré et un étalon connu.
II est étonnant que le coffret mentionné permette de déterminer le niveau de l'indice de germination bactérienne, car les cellules bactériennes contiennent nettement moins d'ATP que les cellules
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somatiques cu les cellules ce levure, ; Jar exemole 1] est egalement étonnant que l'utilisation du coffret conforme à l'invention permette de déceler la bioluminescence luciférine-luciférase, même avec une faible densité de germes bactériens. De manière étonnante, on ne constate pratiquement pas de quenching chimique provoqué, par exemple, par les substances contenues dans le petit-lait, ni de quenching optique du à la forte coloration ou à la turbidité des échantillons prélevés dans le petit-lait.
Le coffret conforme à l'invention permet donc de déterminer de manière fiable et rapide le niveau de l'indice de germination dans le petitlait.
Comparé au procédé par plaques classique, le présent procédé permet de déterminer plus rapidement le niveau de l'indice de germination. En outre, il est possible d'utiliser moins de récipients pour les réactions, comme les boîtes de Pétri, par exemple.
Avec le coffret conforme à l'invention pour la détermination du niveau de l'indice de germination, on dispose ainsi d'une méthode permettant d'analyser de façon fiable, avec une économie de temps et d'instruments et de manière reproductible, la concentration de germes bactériens du petit-lait.
L'exemple suivant est donné à titre illustratif et non limitatif de l'invention.
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Exemple
Dans l'exemple ci-dessous, la bioluminescence a été déterminée quantitativement avec un compteur de photons, à savoir le Biocounter M2500 de la société Lumac Systems, Bâle. Le Biocounter M2500 possède une photocathode bialcaline qui permet de mesurer la lumière de longueurs d'ondes de 350 nm à 650 nm avec une vitesse de comptage maximale de 50 000 unités par seconde. L'étalonnage de l'appareil a été réalisé avec un ATP étalon de 200 picogrammes dans les conditions décrites ci-dessous pour les échantillons à analyser. Avant chaque série de mesures, les systèmes d'injection et les cuvettes ont été nettoyés au moins quatre fois avec de l'eau distillée stérile. Toutes les mesures à l'aide de l'appareil ont été exécutées dans les conditions les plus stériles possibles.
La valeur à blanc de la bioluminescence a été déterminée par des essais préalables dans toutes les solutions réactives et solutions tampon utilisées.
Réactifs utilisés
1. Une solution tampon qui tamponne autour d'un pH de 7, 0 à 7, 9 :
La solution tampon utilisée est le système tampon de la société Lumac Systems AG, commercialisé sous le nom Luit*, dont le pH est égal à 7, 75. Ce tampon se compose de 25 mmol/l de tampon HEPES, de 7, 5 mmol/l de sulfate de magnésium et de 1 mmolll d'EDTA.
2. Une solution réactive contenant de l'éthoxylate de 4- (1, 1,3, 3tétraméthylbutyle) phénol :
On a utilisé une solution réactive commercialisée par la société Promega, qui contient, outre la substance active connue sous le nom de Triton X dz des émulsifiants et des détergents chimiques.
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3. Une solution réactionnelle qui contient un réactif bactériolytique :
On a utilisé une solution commercialisée par la société Promega, qui contient du lysozyme (Muramida Mucopeptide-Glucohydrolase) et un stabilisateur chimique.
4. Une solution réactive hydrolysant l'ATP
Le réactif utilisé contenait du soma lyophilisé, disponible dans le commerce, qui a été reconstitué, avant utilisation, avec le tampon Luit' commercialisé par la société Lumac Systems AG, Bâle. 6,4 unités de soma ont été reconstituées avec 2 ml de solution tampon. Pour ce faire, on a utilisé un réactif NRS. Le réactif NRS utilisé était une solution aqueuse composée de 5 % en poids d'acide trichloroacétique et de 42mg/11, 2ml de NazEDTA. On a utilisé le réactif N commercialisé par la société Lumac Systems AG, Bâle.
5. Un réactif libérant l'ATP bactérienne (solution réactive NRB) :
La solution réactive de NRB utilisée était une solution aqueuse d'un détergent ionique avec une concentration de 0,1 % à 2 % en poids. On a utilisé le réactif de L-NRB* commercialisé par la société Lumac Systems AG, Bâle.
6. Une solution réactive composée de luciférine-luciférase
Le réactif composé d'insectes luminescents, de luciférine-luciférase est commercialisé sous forme lyophilisée, les produits commercialisés contenant le plus souvent aussi de l'albumine et du sérum de boeuf, ainsi que du dithiothréitol. Pour exécuter les mesures décrites dans l'exemple, on a utilisé le réactif composé de luciférine-luciférase commercialisé sous le nom Lumit-PM"par la société Lumac Systems AG, Bâle.
La solution prête à l'emploi du réactif composé de luciférine-luciférase a été obtenue en mettant en solution le réactif composé de luciférine-luciférase lyophilisé dans un tampon de Luit, dont la valeur du pH est égale à 7, 75.
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Détermination de l'indice de germination bactérienne dans le petitlait
1 ml de petit-lait a été introduit avec une pipette dans un récipient pour centrifugeuse approprié et on ajoute 0,5 ml du réactif contenant le Triton X 100@ (réactif 2 parmi les réactifs utilisés) avec une micropipette.
Le récipient contenant le mélange intime de l'échantillon de petit-lait dilué a été placé dans une microcentrifugeuse et centrifugé pendant 5 minutes à 12 000 g et à température ambiante. La partie surnageante limpide a été éliminée avec une pipette, puis éliminée, on a ajouté au résidu solide (culot), dans l'ordre, 0,2 ml de solution réactionnelle contenant un réactif bactériolytique (réactif 3) et 40 ut de solution réactive hydrolysant l'ATP (réactif 4). On a ensuite agité l'échantillon pendant 20 minutes dans un agitateur (modèle IKA-Vibrax-VXR) avec une vitesse de 600 tours par min à 800 tours par min. Avec une pipette stérile on introduit 100 ut de cette solution dans une autre cuvette que l'on place ensuite dans le compteur de photons.
Par le système d'injection du compteur de photons sont ajoutés automatiquement 100 ut de solution réactive NRB (réactif 5) et ensuite 100 ut de solution réactive composée de luciférine-luciférase (réactif 6), puis on mesure la quantité de lumière émise par bioluminescence. Après un temps d'intégration de 60 secondes, on a prélevé une valeur RLU, à partir de laquelle on a déterminé la quantité d'ATP contenue dans l'échantillon, en corrélation avec la valeur RLU de l'ATP étalon.
Pour déterminer la valeur à blanc de la bioluminescence, on a exécuté encore une fois, l'ensemble des mesures dans des conditions identiques, mais sans petit-lait.
Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation décrits ci-dessus, à partir desquels on pourra prévoir d'autres modes de réalisation, sans pour autant sortir du cadre de l'invention.