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Verfahren zur Erhöhung der Empfindlichkeit der Messung von
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Mikrobenzellen Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung
der Empfindlichkeit und Genauigkeit der Messung von Mikrobenzellen (Mikroorganismenzellen).
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Die hohe Konzentration an nicht-mikrobiellem ATP in Urin, Milch, Blut
und Fleischprodukten erschwert die Anwendung des ATP-Verfahrens zur schnellen quantitativen
Bestimmung von Bakterien in solchen Proben oder macht sie unmöglich, auch wenn das
nichtmikrobielle ATP durch Hydrolyse mit Kartoffelapyrase-Enzym (einem Co ++-abhöngigen
ATPase-Enzym), durch Filtrieren oder Zentrifugieren eliminiert worden ist. Wenn
nur ein geringer Bruchteil des Prozentsatzes des nicht-bakteriellen ATP in der Probe
verbleibt, wenn das ATP aus den Bakterien extrahiert wird, können große Fehler bei
der Bakterienauszöhlung auftreten, wenn diese auf der Messung des bakteriellen ATP
basiert. Außerdem war es bisher nicht möglich, spezifische Mikroben (Mikroorganismen)
nachzuweisen und dazwischen zu differenzieren, weil bei dem ATP-Verfahren das gesamte
ATP nachgewiesen bzw. gemessen wird, unabhängig von den in den Proben gefundenen
Arten.
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Stoffwechselmäßig inaktive Mikrobenzellen weisen einen niedrigen ATP-Gehalt
auf und wenn die Zellen nicht aktiviert werden, leidet die Empfindlichkeit und Genauigkeit
dieses Verfahrens darunter.
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Mit der vorliegenden Erfindung werden diese Beschränkungen in Bezug
auf die Empfindlichkeit, Genauigkeit und das ungünstige Verhältnis zwischen mikrobiellem
und nicht-mikrobiellem ATP beseitigt. Diese Ziele werden erreicht durch eine kurze
Inkubation der Probe mit einem spezifischen Nahrmedium, das entweder fest oder flussig
sein kann. Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß es
damit möglich ist, die Inkubation und Messung in der gleichen KUvette durchzuführen,
wodurch mögliche Fehler durch Pipettierungen und Ubertragung der Probe eliminiert
werden. Wenn spezifische Medien verwendet werden, die das Wachstum einer bestimmten
Mikrobenart oder eines bestimmten Mikrobentyps unterstUtzen, kann das Verfahren
zur Identifizierung dieser Mikroben angewendet werden. Da weniger Manipulationen
erforderlich sind, kann das Verfahren auch leicht automatisiert werden.
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Das Prinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nachfolgend näher
erläutert.
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Eine kleine mikrobielle Probe von 10 bis 1000 l, vorzugsweise 10 bis
100 Sl, wird in ein ATP-freies Nährmedium eingefuhrt, bei dem es sich um ein generelles
Ndhrmedium, ein selektives Nährmedium oder ein spezifisches Ndhrmedium mit spezifischen
Nährstoffen, Substraten, Enzymen oder Wachstumsinhibitoren fUr spezifische Mikroben,
oberflächenaktiven oder anderen Substanzen
zum Auflösen oder Abtöten
von ausgewählten Mikroben- oder Nichtmikroben-Zellen oder zum Durchlssigmachen der
Zellwand und Zellmembran fUr ATP und anderenMetaboliten(Stoffwechselprodukten )von
ausgewählten Mikroben- oder Nichtmikroben-Zellen handeln kann. Das Medium kann auch
eine kontrollierte Menge ATPase-Enzym, wie z.B. Kartoffel-Apyrase, von 0,001 bis
0,5 Einheiten, vorzugsweise von 0,01 bis 0,1 Einheiten pro ml zum Hydrolysieren
von nichtmikrobiellem ATP während der Inkubation enthalten. Die Messung des extrahierten
mikrobiellen ATP kann durchgefUhrt werden ohne Inaktivierung des ATPase-Enzyms,
da die Aktivität der ATPase so gering ist, daß sie die Extraktion und Messung von
mikrobiellem ATP erlaubt, wenn das mikrobielle ATP innerhalb einer Minute nach der
Extraktion, vorzugsweise nach einer konstanten Zeitverzögerung ab der Extraktion,
gemessen wird. Das Volumen des Ndhrmediums kann von 10 bis 1000 l, vorzugsweise
von 25 bis 200 l, in einer sterilen transparenten Kunststoff- oder GlaskUvette mit
einem Durchmesser von 5 bis 30 mm, vorzugsweise von 6 bis 15 mm, variieren. Das
Nährmedium kann auch auf eine Filtermembran aufgebracht werden, welche.die mikrobielle
Probe enthält. Bei diesem Verfahren wird die Filtermembran mit der richtigen Seite
nach oben in einen sterilen Behalter mit einem ebenen Boden, beispielsweise eine
Petrischale, gelegt. Die Proben werden 0,2 bis 16 Stunden lang für Bakterien und
Hefen und 0,5 bis 5 Tage lang fUr Fungi und Mykobakterien inkubiert. Nach der Inkubationszeit
wird das ATP extrahiert durch Behandeln der inkubierten Probe mit 10 bis 1000 pl/NRB
(Nukleotid-Freisetzungreagens), einer 0,05 bis 2 %igen wäßrigen Lösung einer Mischung
von ionischen oberflöchenaktiven Agentien von Uthoxylierten Aminen und quateranderen
Salzen
von äthoxylierten Aminen, (NRB ist ein eingetragenes Warenzeichen der Firma Lumac
Systems AG, Basel, Schweiz) oder mit Mineralsouren, Basen oder einer anderen Substanz,
die ATP aus Mikrobenzellen extrahiert, ohne die Probe Ubermäßig stark zu verdUnnen
oder ohne Inhibitorsubstanzen fUr die Leuchtkäfer-Luziferin-Luziferase-Reaktion
einzufUhren. Wenn fUr die ATP-Extraktion Sduren oder Basen verwendet werden, muß
die Wasserstoffionenkonzentration vor der Messung des ATP mit einem Luziferin-Luziferase-Reagens
auf pH 6,5 bis 8,5, vorzugsweise auf pH 7,75, gebracht werden. Nach der Extraktion
des ATP aus den Mikrobenzellen wird die Probe in das Lumineszenz-Photometer eingefUhrt.
Vor der Messung der Probe werden 10 bis 100Q Fl, vorzugsweise 50 bis 200 CII, l,
Luziferin-Luziferase-Reagens in einem biochemischen Puffer (z.B. Tris- oder sogenannte
Good-Puffer, HEPES, MOPS, TES und dgl.) mit einer Polarität von 0,01 bis 0,1, Mg"-Ionen
in einer Molaritä.t.von 0,005 bis 0,05 und ein Chelatbildner, wie z.B. EDTA, in
einer Molaritdt von 0,001 bis 0,010, 0,01 bis 1 pg/ml Luziferase und 1 bis 100 Fg/ml
Luziferin mit der Probe gemischt. Die Zugabe und das Einmischen dieses Luziferin-Luziferase-Reagens
in die Probe können durchgeführt werden, bevor die Phiole in das Photometer eingesetzt
wird, jedoch vorzugsweise werden sie in dem Instrument selbst durchgeführt. Die
Intensität (Stärke) des erzeugten Lichtes steht in direkter Beziehung zu der Konzentration
an ATP in der Probe. Die Lichtemission kann als kontinuierliches Signal (oder Rate),
integriert Uber einen vorher festgelegten Zeitraum, oder als Spitzenwert (Maximum)
gemessen werden.
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Die Prinzipien der vorliegenden Erfindung bei verschiedenen Anwendungen
werden an Hand der folgenden Beispiele näher erldutert.
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Ausfulirungsform I: Messung einer Peringen Anzahl von Mikroben Die
Empfindlichkeit der Biolumineszenz-Messung von ATP hängt von der Empfindlichkeit
des Photometers und der Aktivität der verwendeten Reagentien ab. Bis vor kurzem
erlaubten die Handelsprodukte eine Messung von 100 000 Zellen/cm³ oder 0,1 ng/ 3
cm ATP. Das Verfahren selbst ist sehr viel empfindlicher und mit einem vor kurzem
auf den Markt gekommenen Instrument (vertrieben unter der Handeslmarke LUMACOUNTER
der Firma Lumac Systems AG, Basel) und mit Leuchtkufer-Luziferin-Luziferase-Reagentien
(vertrieben unter dem Warenzeichen "WOMIT" PM von der Firma Lumac Systems AG, Basel)
ist es möglich, bis herunter zu 0,1 pg ATP oder etwa 100 Bakterien in einer 20 bis
500 Fl-Probe zu messen. Wegen der Selbstabsorption des emittierten Lichtes und der
inhibierenden Substanzen (chemischen Extinktionsmittein)betrögt die praktische Empfindlichkeit
jedoch etwa 1000 bis 5000 Bakterienzellen pro ml. Zur Messung der hygienischen Qualität
von Wasser, pharmazeutischen und sterilisierten Produkten sollte es jedoch möglich
sein, bis herunter zu 1 Bakterienzelle zu messen.
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Die Kultivierung von Mikrobenzellen (Bakterien, Hefe, Fungi, Schleim,
Schimmelpilzen) auf einem Ndhrmedium wird seit Beginn der Bakteriologie als gebröuchlichstes
Verfahren der quantitativen Bestimmung von Mikrobenzellen angewendet. Die gebruuchlichste
Methode
besteht darin, eine Reihenverdünnung einer flüssigen Probe herzustellen und feste
Ndhrmittel-Agar-Petri schalen damit zu inokulieren. Nach einer Inkubation von 16
bis 72 Stunden fUr Bakterien und 1 bis 40 Tagen fUr Hefe und Fungi bei 37 bis 560C
wird die Anzahl der auf dem Agar gewachsenen Kolonien visuell ausgezählt. Die Ergebnisse
werden ausgedruckt in Koloniebildungseinheiten (CFU) fUr Bakterien und Hefe und
in H>phen fUr Fungi. Die CFu geben nicht die Anzahl der Mikrobenzellen an im
Gegensatz zu der allgemeinen Annahme, sondern vielmehr geben sie die Anzahl der
Aggregate von Bakterien an, die sich vermehren können. In der Regel wächst jede
Kolonie aus einer Gruppe von 1 bis 50 Zellen, so daß die Gesamtanzahl der Zellen
in einer ursprunglichen Probe viel größer ist als die Anzahl der CFU.
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Die Messung der Mikrobenzellen mittels des Lumineszenz-Assays (unter
einem "Assay" ist hier ein biologisches Nachweisverfahren zu verstehen) von ATP
wird angewendet als Verfahren zur schnellen quantitativen Messung von Mikroben (Mikroorganismen).
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Dieses Verfahren ist an sich bekannt (US-Patentschrift 3 475 090).
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Mit gereinigten Luziferin-Luziferase-Reagentien und den derzeit auf
dem Markt befindlichen empfindlichen Lumineszenz-Photometern ist es möglich, bis
herunter zu 1000 Bakterien pro ml zu messen.
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Bei der Messung einer geringen Anzahl von Mikrobenzellen in Wasserproben
(Oberflechen-, Prozeß- oder Trinkwasser) kann der Biolumineszenz-Assay von ATP zu
einer signifikanten Unterschätzung der lebensfdhigen Mikrobenzellen aufgrund der
Tatsache
fUhren, daß Mikroben in Wasser verkUmmern und daß ihr
ATP-Ge ha lt pro Zelle niedriger ist als in den aktiv wachsenden Zellen. VerkUmmernde
Mikrobenzellen können weniger als 10 % des ATP-Gehaltes von metabolisch aktiven
Zellen aufweisen. In einem geeigneten Ndhrmedium werden Mikrobonzellen innerhalb
von 5 bis 10 Minuten metabolisch (stoffwochselmönig) aktiviert.
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Erfindungsgemäß wird eine Inkubationszeit von 10 bis 20 Minuten angewendet,
um die Genauigkeit und Empfindlichkeit von Mikrobenproben mit verkümmernden oder
anderweitig inaktiven lebensfähigen Zellen zu erhöhen. Das Verfahren wird wie folgt
durchgeführt: Eine Wasserprobe von 500 ml wird durch ein 0,2 mpm-Membranfilter filtriert
unter Anlegen eines geringen Vakuums (500 bis 600 mm Hg). Während des Filtrierens
läßt man das Filter nicht trokken werden, um eine Beanspruchung der Mikroben zu
vermeiden.
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Das Filter wird in einen Behalter mit einem ebenen Boden, wie z.B.
eine Petrischale, gelegt. Es wird ein geringes Volumen (0,1 bis 1 ml) ATP-freie
NährstoffbrUhe auf das Filter pipettiert und die Probe wird 10 bis 20 Minuten lang
bei Raumtemperatur stehen gelassen. Während dieser Inkubationszeit erholen sich
die Zellen von dem Filtrationsstreß und werden metabolisch aktiviert, die Zellen
vermehren sich jedoch nicht. Nach der Inkubationszeit wird ATP aus den Mikrobenzellen
extrahiert durch Zugabe von 0,1 bis 1 ml 1 bis 5 molarer Mineralsäuren (Schwefelsäure,
Trichloressigsdure, Perchlorsäure), Basen (Natrium-, Kaliumhydroxid) oder vorzugsweise
einer Mischung von ionischen oberflächenaktiven Mitteln, bestehend aus einer wäßrigen
Lösung von 0,1 bis 0,5 % eines äthoxylierten Amins und einem quaternorden
Uthoxylierten
Amin (Nukleotid-Freisetzungsreagens "NRB" der Firma Lumac Systems AG, Basel, Schweiz).
Nach dem Mischen des Extraktionsreagens mit der Probe wird ein aliquoter Anteil
von 0,1 bis 1 ml in eine transparente KUvette pipettiert. Ein Leuchtkäfer-Luziferin-Luziferase-Reagens
(0,1 bis 1 ml), das besteht aus 0,01 bis 1 Fg Luziferase, 1 bis 100 pg Luziferin,
1.0 bis 200 g/ml Dithiothreit, 0,1 bis 10 mg/ml Rinderserumalbumin, 5 bis 50 mM
Magnesiumionen in einem biochemischen Puffer, wie z.B. Tris, HEPES, MOPS und TES,
wird bei einem pH-Wert von 6,5 bis 8,5 der Probe zugesetzt und die Lichtemission
der Proben wird in einem Photometer gemessen, der Photonen zwischen den Wellenlängen
von 400 und 650 nm nachweisen kann. Die ATP-Menge in der Probe wird bestimmt durch
Vergleichen des Wertes der Probe mit denjenigen, die bei den Messungen der bekannten
ATP-Standards erhalten werden. Die Anzahl der Bakterien wird errechnet durch Dividieren
des ATP-Gehaltes in der Probe durch 1 fg (10 g), bei dem es sich um die ATP-Menge
pro Bakterienzelle handelt.
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Wenn die Anzahl der Mikrobenzellen zu gering ist, daß sie nicht direkt
nach dem ATP-Verfahren gemessen werden kann, ist es möglich, eine geringe Menge
eines flUssigen oder festen Wachstumsmediums (10 bis 1000 Sl) in einem transparenten
Glas oder einer KunststoffkUvette zu inokulieren. Die Probe wird dann mit oder ohne
SchUtteln bei Temperaturen zwischen 20 und 560C, je nach Typ der zu bestimmenden
Mikroben, inkubiert.
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Die Generationszeit der Bakterien variiert in der Regel von 15 bis
60 Minuten in Abhängigkeit von der Inkubationstemperatur und der Species. Die typischste
Generationszeit fUr Bakterien
beträgt 20 Minuten bei 370C. Bei
Hefe und insbesondere bei Fungi beträgt die Verdopplung der Zeit der Zellen oder
der Biomasse langer, bis zu mehreren Stunden. Bevor die Mikroben in einer neuen
Umgebung (nach der Inokulation) mit dem Wachstum beginnen, gibt es eine bestimmte
Zeit ohne jedes Wachstum. Diesewird als Verzögerungszeit oder Verzögerungsphase
bezeichnet. Die Ldnge derselben hängt von dem Organismus, dem Medium und der Temperatur
ab. FUr viele Bakterien beträgt die Länge der Verzögerungsperiode 20 bis 30 Minuten
bei 370C.
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Bei der Annahme einer Verzä.gerungsphase von 20 Minuten und einer
Generationszeit von 20 Minuten multipliziert sich die Population von Bakterien nach
dem folgenden Schema: Inkubationszeit (Min.) Multiplikationsfaktor fUr ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
die ursprüngliche Population 20 1 40 2 60 < 4 80 8 100 16 120 32 140 - 64 160
128 180 256 200 512 220 1024 240 204.8
Wenn fUr einen speziellen
Typ der Probe eine Populationswachstumskurve gezeichnet wird, ist es möglich, aus
einer oder zwei Messungen des ATP-Gehaltes in der Probe nach einer bestimmten Inkubationszeit
die ursprUngliche Menge der Mikroben in der Probe durch Extrapolation zu bestimmen.
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Beispiel: Messung von Escherichia coli 1.) Es wird ein festes (Nährmittelagar)
oder flüssiges Medium (NdhrmittelbrUhe) hergestellt, das nicht durch ATP verunreinigt
ist; 2.) 700 l Medium werden in die erforderliche Anzahl von Kunststoff- oder GlaskUvetten,
die fUr das Lumineszenzphotometer verwendet werden, einpipettiert und sterilisiert;
3.) 10 bis 50 Fl der Proben werden in zwei bis drei Replikat Küvetten einpipettiert
und die KUvetten werden geschUttelt, um die Probe Uber das Feststoffmedium zu verteilen
oder die Probe mit dem flUssigen Medium zu mischen; 4.) die KUvetten werden in einenlnkubator
gestellt und bei 370C inkubiert, vorzugsweise unter kontinuierlichem SchUtteln;
5.) die KUvetten werde nach 2 Stunden aus dem Inkubator herausgenommen und auf Raumtemperatur
abgekühlt; 6.) die ATP-Menge wird wie folgt gemessen: - in die KUvette werden 100
Fl Nukleotid-Freisetzungsre agens fUr Mikrobenzellen (NRB) einpipettiert und durch
SchUtteln mit der Hand gemischt; innerhalb von 15 Sekunden wird das ATP aus den
Zellen freigesetzt; - die KUvette wird in die Zählkammer des Lumineszenz-Photometers
eingesetzt und die Kammer wird lichtdicht verschlossen;
- es werden
50 bis 200 jil Leuchtkdfer-Luziferin-Lziferase-Reagens der Probe zugesetzt; die
Lichtintensität der Biolumineszenz wird als Spitzenwert oder als integrierter Wert
Ubereine Prdsenzzeit von 5 bis 60 Sekunden gemessen; - die Werte der relativen Lichteinheiten
(RLU) werden in ATP-Konzentrationen oder in die Anzahl von E. coli-Zellen umgewandelt
durch interne Standardisierung, wobei 1 fg 15 (10 g) ATP/Zelle angewendet wird;
- die Anzahl der E. coli-Zellen in der ursprünglichen Probe wird wie folgt berechnet:
Anzahl der Zellen = Anzahl der gemessenen Zellen 2x worin x = C Inkvbationszeit
- Verzögerungsperiode ] Generationszeit Die folgenden Paramter wurden experimentell
bestimmt (vgl. Fig. 1A, die das Wachstum von E. coli in 100 µl Ndhrmittelbrühe zeigt
Die Verzögerungsperiode betrug 30 Minuten; und Fig. 1B, die zeigt das Wachstum der
E. coli-Bakterien auf 100 1 festemNdhrmittelagar in einer 12 mm x 47 mm großen GlaskUvette
bei 370C. Die VerzUgerungsperiode betrug 30 Minuten. Die vertikale Achse in beiden
Figuren reprösentiert den ATP-Gehalt in ng (in Lichteinheiten) und die horizontale
Achse repräsentiert die Inkubationszeit (in Minuten)).
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Verzögerungsperiode = 30 Minuten Generationszeit - 20 Minuten Anzahl
der Zellen nach 130-minUtiger Inkubation = 352 000
352 000 352
000 Anzahl der Zellen = ~~~~~~~~~~~~~ 130-30 5 2 20 2 = 32 (in der obigen Berechnung
bedeuten x = 5 und 2 = 32).
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Ausführungsform II: Messung der Mikroben in Körperfluids und Lebensmittelproben
Die Anzahl der Bakterien in Körperfluids und Lebensmittelproben wird gemessen als
Qualitatskontrolle fUr die Lebensmittelhygiene und fUr den Nachweis von Mikrobeninfektionen
von Körperfluids.
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Dies wird normalerweise durchgefUhrt durch Kultivieren von Proben
auf einem festen Agarmedium.DasVerfahrenwird manuell oder halbmechanisiert durchgeführt
und erfordert eine Inkubationszeit von 24 Stunden. Als Maß wird die Anzahl der CFU
verwendet. Die CFU-Anzahl ist kein genaues Anzeic hen fUr eine bakterielle Verunreinigung
der Proben, weil diese Typen von Proben nicht homogen sind. Die Bakterien haften
an Teilchen, die Konglomerationen und Aggregate bilden. Jedes dieser Aggregate bildet
nur eine Kolonie; so gibt der CFU-Wert eine viel niedrigere Anzahl von Bakterien
an als sie tatsdchlich in der Probe enthalten sind.
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Das konventionelle Verfahren ist daher sowohl langsam als auch umständlich
und ungenau. Im Falle einer Lebensmittelprobe (Milch, Fleisch und dgl.) kann es
sein, daß das Produkt fUr den Verbrauch bereits verkauft worden ist, wenn die Testergebnisse
erhalten werden, und in der medizinischen Mikrobiologie kann eine Verzögerung von
24 Stunden fUr den Patienten fatal sein.
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Bisher wurde der Leuchtkdfer-Biolumineszenz-Assay von ATP auf die
Messung von Bakterien in Urin (US-Patentschrift 3 745 090) und in Lebensmittel angewendet
(vgl. A.N. Sharpe, M.N. Woodrow und A.K. Jackson, "Adenosine triphosphate levels
in foods contaminated by bacteria" in "J. Appl. Bacteriol'', 33, 758-767, 1970),
bei beiden Anwendungen fUhrt jedoch der hohe Gehalt an nicht-mikrobiellem ATP aus
Blutepithel- und Muskelzellen zu einem Problem. Es ist möglich, die nicht-mikrobiellen
Zellen mit einem oberflachenaktiven Mittel, wie Triton X-100,zu behandeln (US-Patentschriften
3 745 090 und 4 014 745), die nichtbakterielle Zellen auflösen, und anschließend
Kartoffelapyrase der Probe zuzusetzen zur Hydrolyse des extrahierten nicht-mikrobiellen
ATP während einer kurzen Inkubation (5 bis 20 Minuten) bei 20 bis 50°C (vgl. US-Patentschrift
3 745 090). Bei dieser Behandlung scheint ein geringer Anteil des nicht-mikrobiellen
ATP unangegriffen, wahrscheinlich assoziiert an die Zellmembranen, zurUckzubleiben.
Wenn das mikrobielle ATP später mit Mineralsauren (Schwefelsäure, Trichloressigsäure,
Perchlorsd.ure) oder mit einem siedenden Tris-EDTA-Puffer extrahiert wird, wird
auch ein Teil dieses nicht-mikrobiellen ATP zusammen mit mikrobiellem ATP extrahiert.
Dieses unzerstörte nicht-mikrobielle ATP stellt einen schwerwiegenden potentiellen
Fehlerfaktor bei der Messung von Bakterien in Körperfluids dar und erschwert die
Anwendung dieses Schnellverfahrens auf den Nachweis von Bakterien in Lebensmitteln.
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Zur Uberwindung der Probleme des restlichen nicht-mikrobiellen ATP
und der Beschränkungen in Bezug auf die Empfindlichkeit wurde ein Verfahren entwickelt,
bei dem das nicht-mikrobielle
ATP durch die eigenen Enzyme von
Nicht-Mikrobenzellen oder in Gegenwart einer niedrigen Aktivität eines ATPase-Enzyms
(O,01 bis 0,1 Einheiten pro ml) hydrolysiert und die Anzahl der Mikroben in der
Probe gleichzeitig vervielföltigt wird während einer kurzen Inkubation von 0,5 bis
5 Stunden fur Bakterien und Hefen und von 1 bis 5 Tagen fUr Fungi. Normalerweise
ist fUr Bakterien nur eine Inkubationszeit von 1 bis 2 Stunden erforderlich. Die
Inkubation wird direkt in der KUvette durchgefuhrt, in der das mikrobielle ATP gemessen
wird. Die Küvetten können hergestellt (vorbereitet) und verpackt werden. Dies erfordert
viel weniger Raum als die konventionellen Kulturröhrchen oder Petrischalen. Bei
Verwendung eines festen Mediums ist es möglich, diese sogar unter Feldbedingungen
zu verwenden. Die Verwendung der gleichen KUvette fUr die Inkubation und die Messung
fUhrt dazu, daß das Verfahren leicht automatisiert werden kann. In dem nachfolgenden
Beispiel wird die Anwendung dieses Verfahrens zur Messung von Bakterien in Milch
beschrieben.
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Beispiel: Eliminierung von nicht-bakteriellem ATP und Messung der
Bakterien in Milch mit dem Biolumineszenz-ATP-Assay - 50 bis 200 Fl, vorzugsweise
100 jil, einer von ATP freien sterilen NährmittelbrUhe mit 50 bis 200 l einer 0,02
bis 0,5 %igen wäßrigen Lösung eines nicht-ionischen oberflöc henaktiven Mittels,
wie öthoxylierten Alkylphenolen, wie z.B. Nukleotid-Freisetzungsreagens fUr somatische
Zellen ("NRS", UIMACSystems AG, Basel), die 0,001 bis 0,2 Einheiten pro ml ATPase-Enzym
enthält, wird in die erforderliche Anzahl von sterilen transparenten Glas-oder Kunststoffküvetten
einpipettiert;
- 10 bis 100 Rl, vorzugsweise 10 bis 50 l, gut geschuttelte
Milchproben werden in die KUvetten einpipettiert und damit gemischt; NRS in dem
Medium macht die Zellmembranen der Leukozyten und der Epithelzellen fUr ATP durchlussig
und dieses nicht-mikrobielle ATP wird durch die Enzyme der nicht-mikrobiellen Zellen
und das zugesetzte ATPase-Enzym hydrolysiert; - die Probe wird 60 bis 120 Minuten
lang bei 280C mit oder ohne SchUtteln inkubiert; - die Röhrchen werden aus dem Inkubator
entnommen und es werden 50 bis 300 l zusätzliches NRB zugegeben und damit gemischt;
das NRB setzt aus den Bakterien innerhalb von 10 bis 20 Sekunden ATP frei; - die
Küvette wird in das Lumineszenz-Photometer eingesetzt und das ATP wird gemessen
mittels der Leuchtkäfer-Luziferin-Luziferase-Reaktion; - die Anzahl der Bakterien
wird errechnet durch Dividieren der gemessenen ATP-Konzentration durch 1 fg (1 -15
g), den ATP-Gehalt eines Bakteriums. Die Anzahl der Bakterien in der ursprünglichen
Probe wird, wie oben angegeben, aus der folgenden Formel errechnet: Anzahl der gemessenen
Zellen Anzahl der Zellen = 2x i E Inkubotiontzeit - Verzögerungsperiode Generationszeit
Die Kurven der Fig. 2 zeigen die Abnahme des nicht-bakteriellen ATP und die Zunahme
des bakteriellen ATP während der Inkubation unter Anwendung des vorstehend beschriebenen
Verfahrens.
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Auf die obige Weise wird die nicht-mikrobielle ATP aus der Probe bis
auf etwa 0,5 % seines ursprunglichen Gehaltes eliminiert und das bakterielle ATP
wird innerhalb von 120 Minuten auf etwa das 8-fache erhöht. Dies bedeutet, daß in
normaler Milch der Beitrag des restlichen nicht-mikrobiellen ATP weniger als 5 s
des bakteriellen ATP betrdgt. Dieser kann substrahiert werden und das tatsuchliche
nicht-mikrobielle ATP kann wie folgt gemessen werden: - Nach der Inkubation werden
50 bis 200 Rl, vorzugsweise 100 Fl, Leuchtkdfer-Luziferin-Luziferase-Reagens der
Probe zugesetzt und die Konzentration des nicht-mikrobiellen ATP wird gemessen.
Zu der Probe werden 200 ijl NRB zugegeben und das Gesamt-ATP wird gemessen; das
nicht-mikrobielle ATP wird von dem Gesamt-ATP abgezogen, wobei man das bakterielle
ATP erhält.
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Ausführungsform III: Identifizierung von Mikroben unter Verwendung
eines spezifischen Kulturmediums und durch Biolumineszenz-Messung von AXP Es ist
bekannt, spezifische Medien fUr das Wachstum bestimmter Species von Bakterien anzuwenden.
Dies wird ausgenutzt zur Identifizierung von Bakterien durch Inokulieren einer unbekannten
Species auf verschiedene Medien, die spezifische Substanzen enthalten, wie z.B.
Zucker, Aminosäuren, Vitamine, Salze, Wachstumsinhibitoren, Antibiotika und dgl.,
die fUr das selektive Wachstum einer spezifischen Species von Bakterien benötigt
werden.Nach 16 bis 72-stUndiger Inkubation ist es möglich, visuell festzustellen,
ob die Species auf dem Medium gewachsen ist. Aufgrund
der Kombination
von positiven und negativen Wachstumsergebnissen ist es möglich, die Species zu
identifizieren. FUr bestimmte Species oder Typen von Bakterien gibt es auch selektive
Medien, auf denen keine andere Species wächst oder nur langsam wucht, wie z.B. das
McConkey-Medium fUr Coliform-Bakterien. Diese Verfahren benötigen heute 1 bis 3
Tage, um die Ergebnisse zu erkennen. Diese Zeit wird nach dem folgenden Verfahren
stark abgekürzt: - Ein steriles Medium, das spezifische Substanzen enthalt, wie
sie fUr die biochemische Identifizierung von spezifischen Mikroben verwendet wird,
wird in einem Volumen von 10 bis 200 iil, vorzugsweise 100 jil, in sterile, transparente
Kunststoff- oder Glaskuvetten gegeben; - 5 bis 200 Al, vorzugsweise 10 bis 50 Fl,
einer isolierten unbekannten Mikrobensuspension wird in 2 bis 20 verschiedene KUvetten,
die jeweils ein verschiedenes Wachstumsmedium, fest oder flussig, enthalten, einpipettiert
und damit gemischt, wobei Jedes Wachstumsmedium fUr spezifische Species von Mikroben
spezifisch ist; - die Anfangskonzentration an ATP in der Mikrobensuspension wird
gemessen unter Anwendung des Luziferin-Luziferase-Systems in einem Photometer unter
Verwendung von 50 bis 200 Rl NRB als Extraktionsreagens; - die diese Proben enthaltenden
Küvetten werden 2 bis 16 Stunden lang bei einer geeigneten Temperatur zwischen 20
und 56°C inkubiert; - nach der Inkubation wird das ATP gemessen durch Einpipettieren
von 50 bis 200 l NRB fUr die ATP-Extraktion aus Mikrobenzellen, wobei ein aliquoter
Anteil von 50 bis
200 1 der Probe in eine Kuvette eingeführt wird,
in das Photometer, in dem 100 bis 200 Sl Luziferin-Lziferase-Reagens der Probe zugesetzt
werden; - die Zunahme des ATP, verglichen mit dem Anfangswert, zeigt das Wachstum
der Mikrobe auf dem Medium, wdhrend ein unveränderter oder geringerer ATP-Wert ein
negatives Wachstumsergebnis anzeigt; - aus der Kombination von Wachstum, Grad des
Wachstums oder negativem Wachstum ist es möglich, den Typ oder die Species der Mikrobe
zu identifizieren.
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Die Methode der Verwendung eines Kulturmediums und die Anwendung einer
Inkubation in der MeßkUvette und der Behandlung der Probe mit anderen Reagentien,
wie NRS und NRBlvereinfacht den Assay zur Bestimmung des mikrobiellen ATP und ermöglicht:
1.) Die Erhöhung der Empfindlichkeit des Verfahrens; 2.) die Eliminierung oder Verringerung
des Fehlers durch das nicht-mikrobielle- ATP; und 3.) die schnelle Identifizierung
von Bakterien unter Verwendung spezifischer und selektiver Medien.
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Ausfuhrunpsform IV: Steri litatstest Lebensmittel, Arzneimittel und
dhnliche Produkte, die steril sein messen, können mit der Biolumineszenz-Messung
von ATP getestet werden. Feste Proben können homogenisiert und nach 4- bis 16-stUndiger
Inkubation in Gegenwart von NRS (und ATPase-Enzym, wenn nicht-mikrobielles ATP vorliegt)
gemessen werden.
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Flüssige Proben können durch ein Membranfilter mit einer Porengröße
von
0,2 bis 0,45 Fm filtriert werden. Das Filter wird 4 bis 8 Stunden lang in einer
ATP-freien NdhrmittelbrUhe inkubiert, danach wird das ATP extrudiert und wie in
der Ausfuhrungsform I gemessen. Wenn die Probe steril ist, hat man kein mikrobielles
ATP, und wenn die Probe Mikroben enthält, wird nach der Inkubation mikrobielles
ATP nachgewiesen.