AT510418A4 - Lamp-verfahren zum nachweisen von erwinia amylovora - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen von Erwinia amylovora in einer Probe, indem eine oder mehrere Erwinia amylovora-Sequenzen in der Probe unter Anwendung der LAMP-Methode mittels für diese Sequenz(en) spezifischer Primer amplifiziert und gegebenenfalls mit bekannten Sequenzen verglichen werden, mit dem Kennzeichen, dass als Referenzsequenz die genomische Sequenz der Basen 1378996 bis 1379215 des Erwinia amylovora-Genoms, die für das hypothetische Protein AMY1267 des Stamms Ea273 kodiert, wie in Seq.-ID Nr. 1 dargelegt, verwendet wird und der aus den Seq.-ID Nrn. 2 bis 7 bestehende Satz spezifischer LAMP-Primer zur Amplifikation eingesetzt wird.

Description

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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen des Feuerbranderregers Erwinia amylovora.

Feuerbrand wird durch das gram-negative Bakterium Erwinia amylovora verursacht, das Pflanzen der Familie der Rosaceen befällt, besonders Gattungen der Unterfamilie Maloideae (Kernobstgehölze), vor allem Apfel (Malus x domestica), Birne (Pyrus communis) und Quitte (Cydonia oblonga). Die Infektion erfolgt in der Regel über die Blüte (primärer Feuerbrand). Im Gegensatz dazu werden Infektionen über das Laub, später in der Vegetationsperiode, als sekundärer Feuerbrand bezeichnet. Die Infektion der Blüte breitet sich über das Xylem aus und führt zu einer im Holz fortschreitenden Nekrose. Die Krankheit verursacht verheerende Schäden in Obstanlagen mit entsprechenden wirtschaftlichen Verlusten.

Regional können zur Blütezeit Prognosen des Feuerbrand-Infektionsrisikos z.B. nach dem Modell MARYBLYT durchgeführt werden. In diesem Modell werden aktuelle und lokale Temperatur- und Feuchtigkeitswerte in Form von kritischen Schwellenwerten und Zeitsummen während der Blüte beurteilt (Steiner 1990, Lightner und Steiner 1990, Jones 1992). Der aus der Feuerbrandsituation des Vorjahres abgeleitete vermutliche Infektionsstatus wird dabei oft auch in Betracht gezogen, kann aufgrund der hohen Bakteriendynamik allerdings ungenau sein. Am informativsten wären deshalb konkrete Testergebnisse zum aktuellen und lokalen Infektionsstatus während der Blüte. Allerdings sind Tests mit Blüten oder Blütenbüscheln mit niedrigen Zelltitem während der frühen Infektionsphase konfrontiert und müssten entsprechend sensitiv sein. Zudem ist durch die kurze Blütezeit ein sehr enger Zeitrahmen für Tests gegeben, der es in der Regel nicht erlaubt, Proben an Labore zu versenden, die Ergebnisse der Tests während der Blüte zu erhalten und gegebenenfalls auch rechtzeitig Gegenmaßnahmen ergreifen zu können.

Ein schneller und sensitiver Test auf Erwinia amylovora, der auch unter Feldbedingungen oder zumindest in einfach ausgestatteten Laboren vor Ort möglich ist, wäre aus diesen Gründen sehr wünschenswert. Ein solcher Test würde neben der MARY-BLYT-Prognose über Infektionsbedingungen die sehr wichtige Information über den -1 - • Λ

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···· ··«« I * · « I « · · « « aktuellen, lokalen Infektionsstatus liefern können. Dies würde eine rechtzeitige Entscheidung vor Ort über die Notwendigkeit von Gegenmaßnahmen gegen die Verbreitung des Pathogens während der Blüte ermöglichen. Die Wirtschaftlichkeit läge bei hohem Infektionsstatus selbstverständlich in der Vermeidung von Feuerbrandschäden, aber auch die nachgewiesene lokale Abwesenheit des Erregers ergäbe neben dem wirtschaftlichen Vorteil, keine unnötigen Maßnahmen ergreifen zu müssen, auch den ökologischen Vorteil eines verminderten, angepassten Pestizideinsatzes.

Tests auf mikrobielle Pathogene werden in der Regel durch selektive Kultur oder Kultur mit Indikatoren durchgeführt, oder, weniger aufwändig, durch immunologische Tests wie ELISA, oder aber durch PCR-Reaktionen auf spezifische Nukleinsäuresequenzen. Sowohl ELISA- als auch PCR-Tests auf mikrobielle Pathogene sind dabei wesentlich schneller durchzuführen als die Identifizierung mittels Kultivierung, wenn sie nicht mit Vorkulturen kombiniert werden müssen, um die Nachweisgrenze zu erreichen oder ausreichende Spezifität zu gewährleisten. Tests unter Feldbedingungen verlangen weitere methodische Vereinfachungen und schließen in der Regel die Verwendung von Thermocyclern, die für PCR-Reaktionen benötigt werden, aus, Daher werden unter Feldbedingungen oft ELISA-Tests verwendet, obwohl sie meist wesentlich unsensitiver und unspezifischer als PCR-Tests sind.

Einige neuere Nukleinsäure-Amplifikationsmethoden funktionieren bei konstanter Temperatur, meist im Bereich von 60-65 X, und umgehen damit die Notwendigkeit von Thermocyclern, erreichen aber trotzdem die Sensitivität von PCR-Reaktionen. Die wichtigsten dieser isothermalen Amplifikations-Techniken sind NASBA ("nucleic acid sequence-based amplification", Compton 1991), SDA ("Strand displacement ampiification”, Walker et al. 1992), FIRCA (Synonym: CRCA) ("hyperbranched (oder: Cascade) rolling circle amplification", Lizardi et al. 1998, Thomas et al. 1999), HDA ("helicase dependent amplification", Vincent et al. 2004, An et al. 2005), LAMP ('Ίοορ-mediated isothermei amplification of DNA", Notomi et al. 2000, Nagamine et al. 2002) und RPA (’’recombinase polymerase amplification", Piepenburg et al. 2006). Generell umgehen diese Techniken das Aufschmelzen doppelsträngiger DNA (oder von DNA-RNA-Hybriden im Fall von NASBA) zur Erzeugung von Nukleinsäure-Ein- -2- ♦ * · ·* ···# ♦ * • * » · · ψ zelsträngen zur Hybridisierung der Primer (Startpunkte der Synthese) und als Vorlage zur Gegenstrangsynthese ("template").

Dabei werden Startpunkte der Synthese geschaffen durch Einzelstrangbrüche ("nicks") mittels Restriktionsenzym (SDA), durch zirkuläre Einzelstrang-DNA (CRCA), Strangtrennung in einem Promoterbereich (NASBA), sich regenerierende Haarnadelschleifen (LAMP) oder durch Rekombinase-Aktivität gebildete D-Schleifen (RPA). Die Notwendigkeit, eine Einzelstrang-Vorlage zur Synthese zu schaffen, wird in isothermalen Methoden vermieden, indem eine Strang-Verdrängungsaktivität einer DNA-Polymerase (NASBA, SDA, CRCA, LAMP, RPA) oder RNA-Polymerase (NASBA) genutzt wird; oder ein Einzelstrang wird durch eine separate Helikase-Aktivität (HDA) erzeugt; oder der Gegenstrang wird durch ein Enzym abgebaut (RNAse H, NASBA).

Von diesen Methoden zur DNA-Diagnostik wird LAMP in weitester Verbreitung eingesetzt, da LAMP mit hoher Effizienz und Spezifität DNA amplifiziert (z.B. Gill and Ghaemi 2008, und die Zitate darin). LAMP ermöglicht es auch, die Gelelektrophorese zur Analyse der Produkte zu umgehen, da sich in positiven Reaktionen ein weißer Magnesiumpyrophosphat-Niederschlag bildet, der mit bloßem Auge sichtbar ist. Dies ermöglicht die homogene Analyse ohne weitere Handhabung und ohne erneutes Öffnen der Reaktionsgefäße, was das Risiko birgt, mit den in sehr hoher Konzentration vorliegenden Amplifikationsprodukten Arbeitsplatz, Gerätschaften und letztlich nachfolgende Reaktionsansätze zu kontaminieren. Noch praxisgerechter wird die LAMP-Reaktion durch die Zugabe des Metallionen-Indikators Hydroxynaphtholblau (HNB) als kolorimetrischer Test, bei dem bei positiver Amplifikation ein Farbumschlag von violett nach blau stattfindet (Goto et al. 2009, Hadersdorfer et al. 2011).

Eine LAMP-Methode für plasmidspezifische Erwinia amylovora-Sequenzen wurde kürzlich publiziert (Temple und Johnson 2011). Die Autoren haben insgesamt 45 Primer-Sets zur Amplifikation von Erwinia amylovora-DNA getestet, wobei der Nachweis von Plasmid-DNA konkret beschrieben, gleichzeitig aber erwähnt wird, dass auch Tests mit chromosomaler DNA durchgeführt worden seien. Es gelang den Autoren allerdings nicht, das Bakterium zuverlässig nachzuweisen, da zahlreiche -3- * * • c · · * * • * Μ l «

Artefakte auftraten, und zwar sowohl falsch-positive als auch falsch-negative Reaktionen. Unter anderem kam es zu Verwechslungen mit dem Epiphyten Pantoea agglomerans, einem in Obstplantagen häufig vorkommenden Enterobakterium.

Ziel der Erfindung war daher die Entwicklung eines verbesserten LAMP-Verfahrens zur DNA-Amplifikation von Erwinia amylovora-Sequenzen, um so den Erreger mit erhöhter Zuverlässigkeit nachweisen zu können.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Dieses Ziel wird erreicht durch Bereitstellung eines Verfahrens zum Nachweisen von Erwinia amylovora-Sequenzen in einer Probe, indem eine oder mehrere Erwinia amylovora-Sequenzen unter Anwendung der LAMP-Methode amplifiziert und gegebenenfalls mit bekannten Sequenzen verglichen werden, wobei das Verfahren der Erfindung dadurch gekennzeichnet ist, dass einerseits als Referenzsequenz die ge-nomische Sequenz der Basen 1378996 bis 1379215 des Erwinia amylovora-Ge-noms, die für das hypothetische Protein AMY1267 des Stamms Ea273 kodiert, wie in Seq.-ID Nr. 1 dargelegt, verwendet wird und andererseits der aus den Seq.-ID Nrn. 2 bis 7 bestehende Satz spezifischer LAMP-Primer zur Amplifikation eingesetzt wird.

Die obige genomische Sequenz mit Seq.-ID Nr. 1 wurde aus den vom Sänger Institute entschlüsselten und auf dessen Website für die Öffentlichkeit bereitgestellten (http://www.sanger.ac.uk/resources/downloads/bacteria/erwinia-amylovora.html) Daten des Erwinia amylovora-Genoms ausgewählt.

Ohne sich auf eine Theorie festlegen zu wollen, wird angenommen, dass die zahlreichen Artefakte beim Nachweis gemäß dem oben erwähnten Verfahren von Temple und Johnson auch daher rührten, dass als Target (zumindest vorwiegend) eine Plas-mid-DNA ausgewählt wurde. Der Vorteil der (möglichen) Gegenwart von PlasmidDNA in Mehrfachkopien, also in potenziell höherer Konzentration in der Probe, wird nach Ansicht der Erfinder dadurch zunichte gemacht, dass: a) ein bestimmtes Plasmid mitunter nicht in allen Stämmen der nachzuweisenden Spezies vorkommt (was auch Temple und Johnson bestätigt haben), b) Plasmide, z.B. durch äußere Einflüs- -4- ·* ·* * V* ««·· # * » · ♦ · · * ·»* * · · *#«· «· · • · · **«·*· · t * * · • · ♦ · · # · · · • ♦ ♦ * · · Φ · 4 » se, vergleichsweise leicht deaktiviert werden können und c) Plasmide auf andere Spezies oder sogar Gattungen übertragen werden können.

Durch Verwendung der in Seq.-ID Nr. 1 beschriebenen genomischen DNA-Sequenz von Erwinia amylovora als Referenzsequenz wird gemäß vorliegender Erfindung sichergestellt, dass sämtliche bekannten Stämme der Spezies Erwinia amylovora erfasst und Artefakte aufgrund von Plasmid-Deaktivierung oder -Transfer wirksam vermieden werden. Falsch-negative Ergebnisse sind somit praktisch ausgeschlossen.

Die als Primer für die Amplifikationsreaktion eingesetzten LAMP-Primer der Seq.-ID Nrn. 2 bis 7 ermöglichen eine rasche und zuverlässige Amplifikation der in der Probe enthaltenen Erwinia amylovora-DNA. Vor allem aber ist mit diesem für Seq.-ID Nr. 1 hochspezifischen Primersatz die Amplifikation potenzieller kontaminierender DNA praktisch ausgeschlossen, weswegen im Wesentlichen keine falsch-positiven Ergebnisse, d.h. Artefakte, erhalten werden können.

Die Auswahl der Primer erfolgte mit Hilfe der Online-Software "PrimerExplorer V4" (http://primerexplorer.jp/e/, Eiken Chemical Co., Tokyo, Japan) und durch Screenen von Datenbanken unter Verwendung von NCBI Blast auf Sequenzen möglicher Kon-taminanten. Primer, die mit verfügbaren Sequenzen dieser DNA-Kontaminationsquei-len zu große Sequenzähnlichkeit aufwiesen, wurden entsprechend abgeändert oder ausgeschlossen, bis schließlich ein vollständiger Primersatz ermittelt werden konnte, der in der Praxis im Wesentlichen keine Kreuzreaktionen ergeben sollte. Bei der Auswahl dieser Primer wurde insbesondere eine mögliche Kontamination durch DNA von Apfel, Birne, Biene, epiphytischen Mikroorganismen, wie z.B. Erwinia persicina, Erwinia pyrifoliae, Erwinia tasmaniensis, Erwinia piriflorinigrans, Erwinia billingiae, Pan-toea agglomerans, Bacillus licheniformis, Bacillus coagulans, Bacillus cereus, bacil-lus subtilis subsp. Subtilis und Staphylococcus aureus, aber auch durch menschliche DNA, die während der Handhabung der Probe eingeschleppt worden sein könnte, berücksichtigt. Wie die späteren Beispiele belegen, waren mit diesem Primerset keinerlei Artefakte zu beobachten. -5- • V* * * Φ * « f · « « «· » * · · f t · * ··· • · < * * * · # « * * 4· · * · « * Für dieses Primer-Set wurde dann ein hinsichtlich relevanter Parameter, wie z.B. Temperatur, Bst-DNA-Polymerase-, Mg2+-, HNB-, Betain- und Desoxynucleosidtri-phosphat-Konzentration, absolute und relative Konzentration der Primer und Reaktionszeit, optimiertes Verfahrensprotokoll erarbeitet, wie in den Beispielen dargelegt wird.

Das so entwickelte Verfahren der vorliegenden Erfindung erlaubt die kolorimetrische Detektion bis zu einer Nachweisgrenze von etwa 80 bis 100 fg DNA, was lediglich 20 bis 25 Zellen von Erwinia amylovora entspricht, in 45 Minuten, und das auch unter Feldbedingungen. Die Nachweisgrenze beim Einsatz von Bakterienzellen als Template in der LAMP-Reaktion liegt etwa bei 16 bis 20 Zellen in 45 Minuten. Durch die Verwendung der genomischen Zielsequenz mit Seq.-ID Nr. 1 können auch Plasmidfreie, aber trotzdem mitunter pathogene Erwinia amylovora-Siämme detektiert werden. Mittels Verdünnungsreihen aus den von den Proben gewonnenen Erwinia amy-/ovora-Zellsuspensionen bis unter die Nachweisgrenze können die Tests zur Ermittlung semiquantitativer Ergebnisse benutzt werden. ln bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Produkte der LAMP-Amplifikation durch Gelelektrophorese und/oder mit Fluoreszenzfarbstoffen in Echtzeit-Thermocyclern bzw. Fluorimetern analysiert, was besonders rasche und eindeutig zuordenbare Ergebnisse liefert.

Die LAMP-Reaktion wird vorzugsweise bei 60-65 °C durchgeführt, was ausreicht, um die LAMP-Amplifikation rasch ablaufen zu lassen, aber gleichzeitig keine aufwändigen Gerätschaften erfordert. Dies ermöglicht die Bereitstellung einer tragbaren Vorrichtung, d.h. eines Analysengeräts, das vor Ort, etwa in einer Obstplantage, betreibbar ist.

Im Hinblick auf die Durchführung solcher Analysen im Feld ist eine erfolgreiche Amplifikation der Bezugssequenz mit Seq.-ID Nr. 1 vorzugsweise durch einfache Sichtprüfung mit bloßem Auge feststellbar, was eine rasche Feststellung des Analysenergebnisses ermöglicht und darüber hinaus das Design eines oben erwähnten trag- -6- * * »· * M iM» * i • · · · * · I · ι • »« ·«»·«* «* »

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I · · I « » * · 4 I baren Analysengeräts weiter vereinfacht. Zu diesem Zweck wird gemäß vorliegender Erfindung vorzugsweise Hydroxynaphtholblau als Indikator zur LAMP-Reaktion zugesetzt, wodurch eine erfolgreiche Amplifikation der Bezugssequenz mit Seq.-ID Nr. 1 anhand eines leicht erkennbaren Farbumschlags angezeigt wird.

In weiteren besonders bevorzugten Ausführungsformen wird das Ausmaß des Farbumschlags aber auch semiquantitativ bewertet, um - mit für eine Erstbefundung ausreichender Genauigkeit - den Bakterientiter und damit das Ausmaß des Befalls (z.B. von Obstbäumen) mit dem Erreger abschätzen zu können.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen näher beschrieben. Diese zeigen Folgendes.

Die Fig. 1 und 2 zeigen jeweils Ergebnisse von Tests auf Kreuzreaktionen des erfindungsgemäßen Primersets durch Verifizierung der Spezifität mittels Gelelektrophorese (2 %, oben) und mittels Farbumschlag (unten).

Die Fig. 3 und 4 zeigen jeweils die Ergebnisse einer Gelelektrophorese bei Optimierungsversuchen mit den erfindungsgemäßen Primern.

Die Fig. 5 und 6 zeigen Ergebnisse der Untersuchung der Nachweisgrenzen des erfindungsgemäßen Verfahrens mittels Gelelektrophorese (2 %, oben) und Farbumschlag (unten).

BEISPIELE

Beispiel 1: Auswahl der Bezuqsseauenz und der Primer

Als Bezugssequenz für den Nachweis des Erregers und Zielsequenz für die Entwicklung von Primern zur spezifischen Amplifikation von genomischer E. amy/ovora-DNA wurde, wie erwähnt, jener Sequenzabschnitt des hypothetischen Proteins AMY1267 des Stamms Ea273 (http://www.sanger.ac.uk/resources/downloads/bacteria/erwinia-amylovora.html) verwendet, der in Seq.-ID Nr. 1 dargelegt ist. Sequenzinformationen -7- • · *« « * * 4*M · * • * I f » · * · * * · » ****·· · » « · · ··*«·· · » II* • · » » * « 1 « ·* « * · ·* · · · von AMY1267 wurden kürzlich für die Entwicklung eines Taqman-Echtzeit-PCR-Tests auf £. amylovora verwendet (Gottsberger, 2010). Vergleiche der ausgewählten Zielsequenz mit Seq.-ID Nr. 1 in der NCBI Datenbank im Nucleotide Blast-Abfragemodus (www.ncbi.nlm.nih.gov) ergab keine Ähnlichkeit mit öffentlich zugänglichen Sequenzen außer mit £. amylovora, siehe die nachstehende Tabelle 1.

Tabelle 1

Zugriffs-Nr. Beschreibung Abfrage* erfassung maximale Identität FN434113.1 Erwinia amylovora CFBP1430 comptete genome 100% 100% FN666575.1 Erwinia amylovora ATCC 49946 chromosomal sequence 100% 100% FR719190.1 Erwinia amylovora ATCC BAA-2158, whole genome shotgun sequence. contig 10 99% 100%

Die Lage der Primerset-Sequenzen und deren Vergleich schließt theoretisch die Bildung von Artefakten durch Primerfehlpaarung aus. Das in nachfolgender Tabelle 2 aufgelistete und im Sequenzprotokoll als Seq.-ID Nr. 2 bis 7 angeführte Primerset wurde mit Hilfe der Online-Software "PrimerExplorer V4" (http://primerexplorer.jp/e/( Eiken Chemical Co., Tokyo, Japan) generiert. Die Bezeichnungen der Primer (erste Spalte) wurden analog zu Notomi et al. (2000) und Nagamine et al. (2002) gewählt.

Tabelle 2

Bez. Primer-Typ Sequenz (5 -3' Orientierung) 15-F3 forward outer CTTTTTT AAG AG AG G C AGC A 15-B3 backward outer TTGTCTGAATCCAGATGTCT 15-FIP forward inner GG AG ACCGAT CTTTT ACAGACTTTATT CGACGAACGTTT ATACGA 15-BIP backward inner GAGCTTCGAACATAGT C AAGGGGAAG ATTTAT GCCTT CCAG AAG 15-LF loop forward C AG AACTTACC ATAT AAT CA 15-LB loop backward ACGGCGCAAAAAAT

Beispiel 2: Spezifität des Verfahrens

Die erfindungsgemäßen Primer der Seq.-ID Nrn. 2 bis 7 wurden mit 64 £. amylovora-Stämmen (Gottsberger, 2010), siehe nachstehende Tabelle 3, und mit 17 Proben von Fremd-DNA, siehe nachstehende Tabelle 4, auf ihre Spezifität getestet. Dabei -8- ·* ·« « · ♦ *»·· ♦» t «I » · · » « » # # · »·»··· · · Ψ • ·· fr*··»« * » »* « * ft · *·«· « »« «* « * ♦ · ·· wurde Amplifikation ausschließlich bei den E. amylovora-Proben beobachtet, und es wurden keinerlei Kreuzreaktionen mit Fremd-DNA festgestellt. Selbst nahe verwandte Erw/ma-Spezies führten zu keinen Kreuzreaktionen (siehe die Ergebnisse für E. persicina, E. pyrifoliae, E. tasmaniensis und E. piriflorinigrans).

Tabelle 3

Spezies Ursprung, Stamm/Sorte Amplifikation Erwinia amylovora AGES 295/93 + Erwinia amylovora AGES 674/94 + Erwinia amylovora AGES 273/96 + Erwinia amylovora AGES 329/98 + Erwinia amylovora AGES 511/98 + Erwinia amylovora AGES 963/99 + Erwinia amylovora AGES 1851/01 + Erwinia amylovora AGES 2642/01 + Erwinia amylovora AGES 855/02 + Erwinia amylovora AGES 3218/02 4- Erwinia amylovora AGES 3331/02 + Erwinia amylovora AGES 3910/02 + Erwinia amylovora AGES 3962/02 Erwinia amylovora AGES 3975/02 + Erwinia amylovora AGES 1041/03 + Erwinia amylovora AGES 1141/03 + Erwinia amylovora AGES 1144/03 + Erwinia amylovora AGES 1168/03 + Erwinia amylovora AGES 1170/03 + Erwinia amylovora AGES 1195/03 + Erwinia amylovora AGES 1672/03 + Erwinia amylovora AGES 374/03 + Erwinia amylovora AGES 376/03 + Erninia amylovora AGES 377/03 + Erwinia amylovora AGES 378/03 Erwinia amylovora AGES 2663/03 + Erwinia amylovora AGES 408/05 + Erwinia amylovora AGES 769/05 + Erwinia amylovora AGES 703/06 + Erwinia amylovora AGES 384/07 + Erwinia amylovora AGES 2803/07 + Erwinia amylovora AGES 3204/07 + Erwinia amylovora AGES 3392/08 + Erwinia amylovora AGES 498/09 + Erwinia amylovora AGES 568/09 + Erwinia amylovora AGES 602/09 + Erwinia amylovora AGES 603/09 + Erwinia amylovora AGES 74/10 + Erwinia amylovora AGES 313/10 + Erwinia amylovora AGES 397/10 + Erwinia amylovora AGES 398/10 + Erwinia amylovora AGES 596/10 + Erwinia amylovora AGES 628/10 + Erwinia amylovora AGES 1-284/10 + Erwinia amylovora CFBP 1232 + Erwinia amylovora CFBP1399 + Erwinia amylovora CFBP 1430 + -9- I t · 4 · * ··» * * · k ι ι < « « i » * · * »·»·*· » * it | * * » * »··* · • * « · · # * * » ·

Erwinia amylovora CFBP2151 Erwinia amylovora CFBP 2584 Erwinia amylovora CFBP 3042 Erwinia amylovora CFBP 3794 Erwinia amylovora DSM 17948 + Erwinia amylovora GCCM 909 + Erwinia amylovora Ea12 + Erwinia amylovora 115-22 + Erwinia amylovora 7/74 + Erwinia amylovora IVIA 1509-B + Erwinia amylovora IVIA 1892-1 + Erwinia amylovora NCPPB 2292 + Erwinia amylovora NCPPB595 Erwinia amylovora OMPBO 1204.1/94 Erwinia amylovora AGES 681/06 + Erwinia amylovora pEA29-defizient IVIA 1596 + Erwinia amylovora pEA29-defizient IVIA 1614-2 +

Tabelle 4

Species Ursprung, Stamm/Sorte Amplifikation Erwinia persicina AGES 556/10 - En/vinia pyrifoliae CFBP 4171 - Panioea agglomerans AGES R95-91 - Pantoea agglomerans AGES 599 - Pantoea agglomerans AGES 701 - Erwinia tasmaniensis AGES 37/10 - Erwinia piriflorinigrans CFBP 5868 - Erwinia billingiae CFBP 6830 - Malus x domestica 'Rewena' DNA {Jedlersdorf 2008) - Pyrus communis 'Abbe Fetel· DNA (Jedlersdorf 2008) - Homo sapiens DNA (Mundhöhlenabstrich 2010) - Apis mellifera DNA (Bienen, AGES, 2010) - Bacillus licheniformis NCTC 10341 - Bacillus coagulans NCTC 10334 - Bacillus cereus NCTC 2599 - Bacillus subtilis subsp. subtilis NCTC 10315 - Staphylococcus aureus ATCC 65389 -

Bezugsquellen: OMP BO Osservatorio delle Malattie delle Piante, Bologna, Italien CFBP Collection Frangaise de Bacteries Phytopathogenes, INRA, Angers, Frankreich. AGES Österreichische Agentur für Gesundheit und Emährungssicherheit, Institut für Pflanzengesundheit, Wien, Österreich. DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland. IVIA Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias, Moncada (Valencia), Spanien. NCPPB National Collection of Plant Pathogenic Bacteria, Plant Pathology Laboratory, Harpenden, Hertsfordshire, U.K. GCCM Greek Coordinated Collections of Microorganisms, Benaki Phytopathological Institute, Athens, Griechenland. NCTC National Collection of Type Cultures, Central Public Health Laboratory, London, U.K. ATCC American Type Culture Collection, Manassas, Maryland, USA. -10- I > l I · · * ··«· * # • «I » ι · · * · * * * ······ «· * • · ·«»··« « 9 · * ΐ t · I t V··· · • * «« * iI · * »

In den Fig. 1 und 2 sind jeweils die Ergebnisse von Tests auf Kreuzreaktionen des erfindungsgemäßen Primersets durch Verifizierung der Spezifität mittels Gelelektrophorese (2 %, oben) und Farbumschlag (unten) dargestellt. Ganz links werden als Positivkontrollen die Ergebnisse die Reaktion von E. amylovora-DNA gezeigt, und ganz rechts ("M") jene des DNA-Markers Lambda Eco47l. Dazwischen finden sich Ergebnisse der ersten 8 (Fig. 1) bzw. der letzteren 9 (Fig. 2) Fremd-DNA-Proben aus Tabelle 4, Es ist deutlich zu erkennen, dass Fremd-DNA durchwegs eindeutig negative Ergebnisse lieferte.

Beispiel 3: Optimierung hinsichtlich Amplifikationseffizienz

Die Konzentrationen der einzelnen Komponenten (Betain, MgS04, Primer FIP, BIP, F3, B3, LF, LB, Desoxynucieosidtriphosphate, Flydroxynaphtholblau, ßsf-DNA-Poly-merase) und die Reaktionstemperatur des Verfahren der Erfindung wurden hinsichtlich Amplifikationseffizienz optimiert. Generell verlief die Amplifikation über einen breiten Konzentrations- sowie Temperaturbereich zufrieden stellend. Die maximale Amplifikation wurde mit folgenden Bedingungen in 25 μΙ Reaktionsvolumen erreicht: 1 x Reaktionspuffer (New England Biolabs, Frankfurt, Deutschland; 20 mM Tris-HCI, 10 mM (NH4)2S04, 10 mM KCl, 2 mM MgS04, 0,1 % Triton X-100, pH 8,8), 8 IE Bst-DNA-Polymerase, 8 mM zusätzliches MgS04 (10 mM Endkonzentration), 0,7 M Betain, 0,18 μΜ 15-F3 und 15-B3 Primer, 1,62 μΜ 15-FIP und 15-BIP Primer, 4,2 μΜ 15-LF und 15-LB Loop Primer, 1,6 mM Desoxynucieosidtriphosphate, 180 μΜ Hydroxynaphtholblau. Inkubation bei 63 °C für 30 min (Amplifikation) und bei 80 °C für 3 min (Enzym-Inaktivierung) in einem Eppendorf EP Gradient Thermocycler.

In Fig. 3 ist exemplarisch ein Beispiel für einen Optimierungsschritt gezeigt. Mit 1 und 2 sind die Geielektrophorese (2 %) unterzogenen LAMP-Produkte einer nicht optimierten (1) bzw. einer optimierten (2) Reaktion gekennzeichnet. "M" bezeichnet erneut den DNA-Marker Lambda Eco47l.

Fig. 4 stellt die Ergebnisse einer Gelelektrophorese (2 %) von Produkten der Optimierung des Primerverhältnisses dar. Gezeigt werden mehrere Verhältnisse der Primer 15-F3, 15-B3 : 15-FIP, 15-BIP in ganzzahligen Schritten von 1:7 bis 1:11. Wie -11 - *· ·» 4 ·* 4·Μ tl » · » Φ » ««· • « Φ »·«·«« · · » • * · ·««··« » 4 ··« • 4 · 4 « 4 4 4 · * * 44 * ·· 4 « + klar zu erkennen ist, lag das Optimum bei einem Verhältnis von 1:9. Wiederum bezeichnet "M" den DNA-Marker Lambda Eco47l.

Beispiel 4 - Adaptierung des Verfahrens bezüglich des Farbumschlags Für den Praxiseinsatz ist aus obigen Gründen ein möglichst kontrastreicher Farbumschlag der Reaktion anzustreben. Da die Anfangskonzentrationen der Mg2+-lonen und Desoxynucleosidtriphosphate die Färbung mit Hydroxynaphtholblau (HNB) beeinflussen, wurde das optimierte Verfahren an den Praxiseinsatz angepasst. Dazu wurde die Endkonzentration von MgS04 von 10 mM auf 9 mM und jene der Desoxynucleosidtriphosphate von 1,6 mM auf 1,2 mM verringert. Durch diese Anpassungen konnte ein optimal erkennbarer Farbumschlag bei gleichzeitig noch sehr guter Amplifikationsrate erreicht werden.

Beispiel 5 - Empfindlichkeit des Verfahrens

Zur Überprüfung der Nachweisgrenzen wurden £. amy/oi/ora-DNA-Verdünnungsrei-hen bzw. Verdünnungen von Bakterienzellen hergestellt und im Verfahren der Erfindung eingesetzt. Dabei konnten bei einer Inkubationsdauer von 45 min in einem 25-μΙ-Reaktionsansatz noch 80 bis 100 fg DNA zuverlässig nachgewiesen werden, wie dies in Fig. 5 gezeigt wird. Dies entspricht rechnerisch bei einer Genomgröße von E. amylovora von 3,9053 x 10'9 pg etwa 20 bis 25 Bakterienzellen. Unter denselben Reaktionsbedingungen konnten etwa 16 bis 20 Bakterienzellen im Ansatz zuverlässig nachgewiesen werden, wie in Fig, 6 gezeigt wird. Gelegentlich, aber nicht zuverlässig reproduzierbar konnte selbst 1 einzige Bakterienzelle bzw. 1 ag DNA pro Reaktionsansatz nachgewiesen werden. Für die Infektion von Apfelblüten im Freiland sind etwa 105-106 Bakterien/Blüte (Taylor et al., 2003) nötig. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können somit im Praxiseinsatz durch Farbumschlag Bakterientiter weit unterhalb der Infektionsschwelle nachgewiesen werden.

In den Fig. 5 und 6 werden die Ergebnisse der Verifizierung der Amplifikation mittels Gelelektrophorese (2 %, oben) und Farbumschlag (unten) gezeigt. In Fig, 5 sind von links nach rechts die Ergebnisse für 100, 80, 60, 40, 20 und 0 fg an isolierter E. amy- -12- »* «· · · ft · * · ♦ · • · · « · * # I · « · · «····· · » > * « ft · ft · · ft ft·· /ovora-DNA dargestellt und in Fig. 6 jene für 20, 18, 16, 14, 12, 10 und 0 KBE von E. amylovora. "M" bezeichnet erneut den DNA-Marker Lambda Eco47l.

Die Erfindung stellt somit ein Verfahren zum Nachweisen von Erwinia amylovora in einer Probe unter Verwendung von LAMP-Amplifikation bereit, mittels dessen der Erreger nun erstmals zuverlässig detektiert werden kann. -13-

·» · · · 9 · «««« «I 9 9 9 9 9 · a · « • * β · 9 · 9 » 9 »· 9 • «« *9»··· * 9 »99 « · I * 9999 9 * * *9 9 9» * *9

Literatur

An, L., Tang, W., Ranalli, T.A., Kim, H.J., Wytiaz, J., Kong, H., Characterization of a thermostable helicase and its participation in helicase-dependent amplification, J. Biol. Chem. 280, 28952-28958 (2005).

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• » · · · * · * · • « · »··»>* ·· » • ·· ·♦>··· 4 * «« I « « · · «··« ♦ »4 * · 4 4 · · · ·

SEQUENZPROTOKOLL <110=" Technische Universität Wien <120> Verfahren zum Nachweisen von Erwinia amytovora mittels LAMP <130> 111794 <160> 7 <170> NCBI Blast <210> 1 <211> 220 <212> DNA <213> Erwinia amyiovora <220> <221=> CDS <222> (1)...(220) <223> Kodierende Sequenz für das hypothetische Protein AMY1267 von Stamm Ea273 <400> 1 ttgtctgaat ccagatgtct cttttttaga agatttatgc cttccagaag gtcattttta 60 tcagcatgaa taactatttt ttgcgccgtc cccttgacta tgttcgaagc tctcattgcc 120 gtggagaccg atcttttaca gacfttaata tcagaactta ccatataatc ataaatgagt 180 tcgtataaac gttcgtcgaa tgctgcctct cttaaaaaag 220 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> LAMP-Primer <400> 2 CTTTTTTAAG AGAGGCAGCA 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> LAMP-Primer <400> 3 TTGTCTGAAT CCAGATGTCT 20 <210 4 <211 > 45 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz -1 • · « » · #» tt«l • » · * » · * < • * * « »· ··*·»· » · « « « · * ·4 « 4 « » « » * «··« * 4 * 4« Ψ Μ 0 · * * <220 <22 3> LAMP-Primer <400> 4 40 45

GGAGACCGAT CTTTTACAGA CTTTATTCGA CGAACGTTTA

TACGA <210> 5 <211> 44

<212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> LAMP-Primer <400 5 40 44

GAGCTTCGAA CATAGTCAAG GGGAAGATTT ATGCCTTCCA

GAAG <210> 6 <211> 20

<212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> LAMP-Primer <400> 6 20

CAGAACTTAC CATATAATCA <210 7 <211> 14

<212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220> <223> LAMP-Primer <400> 7 14 ACGGCGCAAA ΑΑΑΤ -1 -

Claims (6)

1. »« Μ · • ♦ * Λ φ Φ Φ Φ I f • « · · * * * · · ·· «ff· ·ι • · · · • Φ - Λ « · · • * 9 * * -; · • * · · · • * e · * * PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zum Nachweisen von Erwinia amylovora in einer Probe, indem eine oder mehrere Erwinia amy/ovora-Sequenzen in der Probe unter Anwendung der LAMP-Methode mittels für diese Sequenz(en) spezifischer Primer simplifiziert und gegebenenfalls mit bekannten Sequenzen verglichen werden, dadurch gekennzeichnet, dass als Referenzsequenz die genomische Sequenz der Basen 1378996 bis 1379215 des Erwinia amytovora-Genoms, die für das hypothetische Protein AMY1267 des Stamms Ea273 kodiert, wie in Seq.-ID Nr. 1 dargelegt, verwendet wird und der aus den Seq.-ID Nrn. 2 bis 7 bestehende Satz spezifischer LAMP-Primer zur Amplifikation eingesetzt wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Produkte der LAMP-Amplifikation durch Gelelektrophorese und/oder mit Fluoreszenzfarbstoffen in Echtzeit-Thermocyclern bzw. Fluorimetern analysiert werden.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die LAMP-Reaktion bei 60-65 °C durchgeführt wird.
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass eine erfolgreiche Amplifikation der Bezugssequenz mit Seq.-ID Nr. 1 durch Sichtprüfung mit bloßem Auge festgestellt wird.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass Hydroxynaphthol-blau als Indikator zur LAMP-Reaktion zugesetzt wird und eine erfolgreiche Amplifikation der Bezugssequenz mit Seq.-ID Nr, 1 durch einen Farbumschlag angezeigt wird.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausmaß des Farbumschlags semiquantitativ bewertet wird.

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