WO2012151599A2 - Lamp-verfahren zum nachweisen von erwinia amylovora - Google Patents

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WO2012151599A2
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Thilo Fischer
Christian Gosch
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    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
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    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the present invention relates to methods for detecting the fire blast pathogen Erwinia amylovora.
  • Fire blight is caused by the gram-negative bacterium Erwinia amylovora, which affects plants of the family Rosacea, especially genera of the subfamily Maloideae (pome fruit trees), especially apple (Malus x domestica), pear (Pyrus communis) and quince (Cydonia oblonga).
  • the infection usually occurs via the flower (primary fire blight).
  • infections over the foliage, later in the growing season are referred to as secondary fire blight.
  • the infection of the flower spreads over the xylem and leads to a progressive necrosis in the wood. The disease causes devastating damage to orchards with corresponding economic losses.
  • prognoses of the fire-blight infection risk may e.g. be carried out according to the model MARYBLYT.
  • Current and local temperature and humidity values in the form of critical threshold values and time sums during flowering are assessed in this model (Steiner 1990, Lightner and Steiner 1990, Jones 1992).
  • the probable infection status derived from the previous year's fire blight situation is often taken into consideration, but may be inaccurate due to the high bacterial dynamics.
  • the most informative would therefore be specific test results on the current and local infection status during flowering.
  • tests with flowers or flower tufts are confronted with low cell titer during the early infection phase and should be sensitive accordingly.
  • the short flowering time is a very tight time frame for tests, which usually does not allow to send samples to laboratories to receive the results of tests during flowering and, if necessary, to be able to take timely countermeasures.
  • Tests for microbial pathogens are typically performed by selective culture or culture with indicators, or, less laboriously, by immunological assays such as ELISA, or by PCR reactions to specific nucleic acid sequences. Both ELISA and PCR assays for microbial pathogens are much faster than identification by culture, unless they need to be combined with precultures to reach the detection limit or to ensure sufficient specificity. Field conditions tests require further methodological simplifications and usually preclude the use of thermocyclers needed for PCR reactions. Therefore, ELISA tests are often used under field conditions, although they are usually much more non-sensitive and non-specific than PCR tests.
  • nucleic acid amplification methods operate at constant temperature, typically in the range of 60-65 ° C, bypassing the need for thermocyclers, yet still achieving the sensitivity of PCR reactions.
  • the most important of these isothermal amplification techniques are NASBA ("nucleic acid sequence-based amplification", Compton 1991), SDA ("Strand displacement amplification", Walker et al., 1992), HRCA (synonym: CRCA) ⁇ "hyperbranched (or: cascade) rolling circle amplification ", Lizardi et al. 1998, Thomas et al. 1999), HDA ⁇ "helicase dependent amplification", Vincent et al. 2004, An et al.
  • nicks Single-strand breaks
  • CRCA circular single-stranded DNA
  • NASBA strand separation in a promoter region
  • LAMP regenerating hairpin loops
  • RPA recombinase activity formed D- Grinding
  • LAMP is widely used since LAMP amplifies DNA with high efficiency and specificity (e.g., Gill and Ghaemi 2008, and the citations therein). LAMP also makes it possible to circumvent gel electrophoresis for the analysis of the products, since in positive reactions, a white magnesium pyrophosphate precipitate forms, which is visible to the naked eye. This allows homogeneous analysis without further handling and without reopening of the reaction vessels, which entails the risk of contaminating workplaces, equipment and ultimately subsequent reaction mixtures with the very high concentration of amplification products.
  • the LAMP reaction becomes even more practical with the addition of the metal ion indicator hydroxynaphthol blue (HNB) as a colorimetric test, which shows a color change from violet to blue upon positive amplification (Goto et al., 2009, Hadersdorfer et al., 201 1).
  • HNB hydroxynaphthol blue
  • the aim of the invention was therefore the development of an improved LAMP method for the DNA amplification of Erwinia amy / ovora sequences so as to be able to detect the pathogen with increased reliability.
  • pollinating honeybees can be carriers of the fire blight pathogen (Alexandrova et al., 2006) and that honeybees can be used to monitor the plants they pollinate, including: to prove Erwinia amylovora (Sabatini et al., 2002).
  • honeybees can be used to monitor the plants they pollinate, including: to prove Erwinia amylovora (Sabatini et al., 2002).
  • PCR or PCR ELISA method used for the detection of the bacterium.
  • a walking distance e.g. a perforated grid, a comb or a foil to allow it to pass
  • samples of the flowers flown by them e.g. Nectar or pollen samples, which are stripped off at the perforated grid or comb and fall into a collection container mounted underneath or DNA residues on the tarsen, which adhere to a film.
  • the honey bee is selected by default as a bee colony for sampling, which forms states of up to 80,000 individuals.
  • the apple and pear blossoms usually begin in April in Central Europe, but also in the warmer regions in early April (Sabatini et al., 2002) and occasionally in late March. However, the average temperatures prevailing at that time are too low for honeybees on many days to show normal flight behavior.
  • a further aim of the invention was to develop a method for obtaining sufficient information at the earliest possible point in the year on a potential infestation of crops with certain pathogens, in particular fruit plants with Erwinia amylovora.
  • a goal is achieved in a first aspect of the invention by providing a method for detecting Erwinia amyvora sequences in a sample by amplifying one or more Erwinia amyvora sequences using the LAMP method and optionally comparing them to known sequences in which the method of the invention is characterized in that on the one hand as reference sequence the genomic sequence of the bases 1378996 to 1379215 of the Erwinia amylovora genome which codes for the hypothetical protein AMY1267 of the strain Ea273, as set forth in SEQ ID NO: 1 , is used and other- on the other hand, the set of specific LAMP primers consisting of Seq. ID Nos. 2 to 7 is used for the amplification.
  • the above genomic sequence with SEQ ID NO: 1 was extracted from the Sanger Institute's decrypted (http://www.sanger.ac.uk/resources/downloads/bacteria/erwinia- amylovora.html) data of the Erwinia amylovora genome selected.
  • the present invention ensures that all known strains of the species Erwinia amylovora detected and artifacts due to plasmid deactivation or transfer effectively avoided become. False-negative results are thus practically excluded.
  • the LAMP primers of Seq. ID Nos. 2 to 7 used as primers for the amplification reaction allow a rapid and reliable amplification of the Erwinia amylovora DUA contained in the sample.
  • the amplification of potential contaminating DNA is virtually eliminated, so essentially no false-positive results, ie artifacts, can be obtained.
  • the selection of primers was made using the online software "PrimerExplorer V4" (http://primerexplorer.jp/e/, Eiken Chemical Co., Tokyo, Japan) and by screening databases using NCBI blast for sequences of possible con - taminants.
  • Primers that showed too much sequence similarity to available sequences of these DNA contamination sources were modified or excluded accordingly, until finally a complete set of primers could be determined, which in practice should give essentially no cross-reactions.
  • these primers was in particular a possible contamination by DNA from apple, pear, bee, epiphytic microorganisms such as Erwinia persicina, Erwinia pyrifoliae, Erwinia tasmaniensis, Erwinia piriflorinigrans, Erwinia billingiae, Panea agglomerans, Bacillus licheniformis, Bacillus coagulans, Bacillus cereus, Bacillus subtilis subsp. Subtilis and Staphylococcus aureus, but also by human DNA, which may have been introduced during the handling of the sample considered. As the later examples prove, no artifacts were observed with this primer set.
  • a relevant parameter was then determined, such as temperature, ⁇ sf DNA polymerase, Mg 2+ , HNB, betaine and deoxynucleoside triphosphate concentration, absolute and relative concentration of the primers and reaction time , optimized protocol, as outlined in the examples.
  • the thus developed method of the present invention allows colorimetric detection to a detection limit of about 80 to 100 fg of DNA, which corresponds to only 20 to 25 cells of Erwinia amylovora in 45 minutes, even under field conditions.
  • the detection limit for the use of bacterial cells as a template in the LAMP reaction is approximately 16 to 20 cells in 45 minutes.
  • the origin of the samples is not particularly limited, and it can, for example wash water of several or even individual flowers, shoots, leaves or laboratory samples are used to get to the required DNA.
  • samples collected from pollinating bees more preferably wild bees, especially bumblebees, are used, as will be described later in connection with the second aspect of the invention.
  • the products of LAMP amplification are analyzed by gel electrophoresis and / or with fluorescent dyes in real-time thermocyclers or fluorimeters, which gives particularly rapid and clearly assignable results.
  • the LAMP reaction is preferably carried out at 60-65 ° C, which is sufficient to allow LAMP amplification to proceed rapidly but at the same time requires no expensive equipment.
  • the heat sources can be in these cases, for example, field-suitable, voltage-independent or low-voltage heat generators or simply thermos flasks. This enables the provision of a portable device, i. an analyzer that can be operated easily on site, for example in a fruit plantation.
  • successful amplification of the reference sequence with SEQ ID NO: 1 is preferably detectable by simple visual inspection with the naked eye, for example because a color change or turbidity occurs, allowing a rapid determination of the analytical result and further simplifies the design of a portable analyzer mentioned above.
  • hydroxynaphthol blue is preferably added as an indicator of the LAMP reaction, thereby indicating successful amplification of the reference sequence of SEQ ID NO: 1 by an easily recognizable color change.
  • the extent of the color change is also evaluated semiquantitatively in order to be able to estimate the bacterial titer and thus the extent of the infestation (eg of fruit trees) with the pathogen with sufficient precision for a first report.
  • the extent of the infestation eg of fruit trees
  • the extent of the infestation eg of fruit trees
  • the pathogen with sufficient precision for a first report.
  • color scales, incubation time series or dilution series are used for this purpose.
  • the data obtained by means of the method of the invention can subsequently be used for rapid integration into fire-blight infection risk prognosis models, so as to be able to make reliable statements regarding a potential infestation of an orchard with the pathogen.
  • a bee population for obtaining samples of plants pollinated by these bees, the sample being obtained by means of a walking distance to be entered by the bees in front of the entrance to their habitat takes place and the use according to the invention is characterized in that
  • the sample to be recovered is a DNA sample, in particular a sample of Erwinia amylovora DUA.
  • the second aspect of the invention therefore relates exclusively to wild bees, which in the broadest definition means all bee species of the superfamily AAgodea with the exception of the honeybee (Apis mellifera).
  • a bee species selected according to the present invention can also form populations of no more than 500 or even less than 100 individuals without the risk of not accumulating sufficient amounts of DNA.
  • Sampling can be carried out in case of intended further use of the animals by means of a foil attached to the nest entrance. From this, a bacterial suspension is obtained after the exposure time by means of a buffer solution (rinsed), which is actually used for DNA detection.
  • a portion of the workers may be sacrificed by expressing their honey blisters, typically giving about 20 to 30 mg of honey to each worker, which is then combined into a mixed sample and then used for DNA detection.
  • the bee species are not specifically limited.
  • population is meant in the broadest sense any type of bee community in a limited area, ie both correspondingly small “states", colonies or colonies in a hive or subterranean nest, as well as a corresponding number of bees on a particular soil area, eg a few square meters.
  • solitary bees come into question for the present invention, ie bees who live alone in subterranean nests or wall columns and raise their offspring there, as long as a larger number of them per square meter is encountered. It can be provided before each entrance to their dwellings a corresponding course, such as a slide, and at the end of sampling, the samples collected by all running paths are simply combined.
  • nesting aids may also be provided to the bees, i. Prefabricated sticks or nests, among the latter also a larger number of Niströhren for solitary bees on an area of a few square meters to provide.
  • the bee species is selected from the genera bumblebee, sand bee and mason bee, more preferably a bumble bee species.
  • Their flight time typically begins in March, with some sand bees even in February, and bumblebees travel particularly early in the year, as explained in more detail below.
  • a social lifestyle ie a common nest, some of the actually known as solitary bees bee species is known. Therefore, if a nest is provided with a running track at the nest entrance as a nesting aid in a certain area, such as an orchard, for example, it can be shared by a bee species that is selectively exposed there.
  • various bumblebees also form colonies or states of about 50 to 600, sometimes up to 1, 000 animals and one queen.
  • a minimum temperature of only 6-9 ° C is sufficient to fly out (in queens even only 2 ° C), as they have a dense coat, but above all their body temperature due to vibrations of the chest muscles, with the wings uncoupled be able to raise themselves.
  • honey bees usually need outside temperatures of 10-15 ° C.
  • bumblebees are far more efficient pollinators and therefore samplers than other bee species, especially the honeybee. For example, a bumblebee produces up to 15 times as much honey as an equally large or small state of honeybees.
  • a strain of the red mason bee, Osmia bicornis (also known as Osmia rufa), or the ground bumblebee, Bombus terrestris, is used to obtain the sample.
  • the red mason bee is one of the belly collectors, ie they carry pollen on a hairline on the belly ("belly brush"), which increases the amount of collected pollen during sampling by means of running track compared to leg collectors. It is generally densely hairy, which gives it a higher temperature resistance than other bee species, and widespread in Europe, from southern Europe to southern Sweden. Their flight time starts in early April, in warmer climes at the end of March. Hardly any other bee species is as flexible in accepting nesting possibilities, which explains its widespread distribution and greatly simplifies its location in orchards. Although the red mason bee is typically solitary, it is possible to house a larger number of individuals in a limited area, eg under a thatched roof.
  • the bumblebee more specifically the dark bumblebee, Bombus terrestris, is also widespread in Europe and is starting to fly in March, even in Central Europe. It typically forms colonies of 100 to 500 individuals, and indeed both subterranean and underground, which greatly simplifies both their settlement and the trial.
  • the wild-bee-derived DNA is preferably pest DNA, especially Erwinia amylovora DUA, which can then be amplified and analyzed, in particular, by the method according to the first aspect of the invention.
  • the present invention provides a kit for use according to the second aspect of the invention, comprising:
  • a transport-safe packed bee population as described above and b) means for analyzing the DNA contained in the sample to be recovered.
  • the DNA samples obtained from the bees can be picked up in situ, e.g. directly in an orchard, to be analyzed.
  • the analysis means preferably comprise means for ampiifying the DNA by means of PCR or LAMP methods, whereby-for example, in comparison with ELISA methods-even very small amounts of sample are sufficient to reliably analyze the DNA.
  • the amplification means comprise instruments for performing a LAMP method, since LAMP ("loop-mediated isothermal amplification") does not require thermocyclers compared to PCR (“polymerase chain reaction”) amplification.
  • the assay means of the kit therefore preferably further comprise specific primers for the LAMP reaction, in particular specific primers having the sequences of SEQ ID NOS: 2 to 7, as described above.
  • the kit optionally comprises a heating device and / or means for visualization of products or by-products of the amplification, a preferred visualization agent being the color indicator hydroxynaphthol blue.
  • the optional heating device preferably only needs to produce a temperature of 60-65 ° C, since this is quite sufficient for LAMP method and a Mobile application in the field further simplified: For these temperatures, for example, hot water in a thermos flask is sufficient, which thus also falls under the definition of the heater.
  • battery-operated resistance heaters known as "pocket warmer” known systems based for example on the oxidation of on a support (eg cotton) finely divided iron powder or heat of crystallization released after mechanical release, or parabolic mirror for bundling solar steel used be, or voltage-independent or low-voltage heat generators, as already mentioned.
  • Hydroxynaphthol blue is preferred as a visualizing agent, since in the presence of alkaline earth metal ions a color change from violet to blue takes place, which is clearly visible to the naked eye.
  • the alkaline earth metal ions are derived, for example, from a magnesium pyrophosphate precipitate, which is a by-product of the LAMP reaction and causes turbidity, which as such could also be used for visualization. However, the color change is readily visible even with smaller amounts of amplification products and therefore preferred.
  • the set comprises all necessary means in order to be able to carry out the detection method according to the first aspect of the invention.
  • Figures 1 and 2 respectively show results of tests for cross-reactions of the primer set according to the invention by verification of the specificity by means of gel electrophoresis (2%, above) and by means of color change (bottom).
  • FIGS. 3 and 4 each show the results of gel electrophoresis in optimization experiments with the primers according to the invention.
  • FIGS. 5 and 6 show results of the investigation of the detection limits of the method according to the invention by means of gel electrophoresis (2%, above) and color change (below).
  • primer set sequences The location of the primer set sequences and their comparison theoretically preclude the formation of artifacts by primer mismatch.
  • the primers according to the invention of SEQ ID Nos. 2 to 7 were tested for their specificity with 64 E. amylovora strains (Gottsberger, 2010), see Table 3 below, and with 17 samples of foreign DNA, see Table 4 below , In this case, amplification was observed only in the E. amy / ovora samples, and no cross-reactions were detected with foreign DNA. Even closely related Erw / n / a species did not cross-react (see the results for E persicina, E.pyrifoliae, E. tasmaniensis and E piriflorinigrans). Table 3
  • concentrations of the individual components (betaine, MgSO 4 , primer FIP, BIP, F3, B3, LF, LB, deoxynucleoside triphosphates, hydroxynaphthol blue, ⁇ sf DNA polymerase) and the reaction temperature of the method of the invention were optimized for amplification efficiency. In general, the amplification over a wide concentration and temperature range was satisfactory. Maximum amplification was achieved with the following conditions in 25 ⁇ reaction volume:
  • reaction buffer New England Biolabs, Frankfurt, Germany; 20 mM Tris-HCl, 10 mM (NH 4 ) 2 SO, 10 mM KCl, 2 mM MgSO 4, 0.1% Triton X-100, pH 8.8), 8 IU Bst DNA polymerase, 8mM supplemental MgSO 4 (10mM final concentration), 0.7M betaine, 0.18 ⁇ 15-F3 and 15-B3 primer, 1.62 ⁇ 15-FIP and 15-BIP primer , 4.2 ⁇ L 15-LF and 15-LB loop primer, 1, 6 mM deoxynucleoside triphosphates, 120 ⁇ M hydroxynaphthol blue. Incubation at 63 ° C for 30 min (amplification) and at 80 ° C for 3 min (enzyme inactivation) in an Eppendorf EP gradient thermocycler.
  • FIG. 3 shows by way of example an example of an optimization step.
  • Fig. 4 shows the results of gel electrophoresis (2%) of primer ratio optimization products.
  • Several ratios of primers 15-F3, 15-B3: 15-FIP, 15-BIP in integer steps of 1: 7 to 1 are shown : 1 1.
  • the optimum was at a ratio of 1: 9.
  • M denotes the DNA marker Lambda Eco471.
  • Example 4 - Adaptation of the method with regard to the color change For the above reasons, the aim is to achieve the highest possible color change in the reaction for the above reasons. Since the initial concentrations of Mg 2+ ions and deoxynucleoside triphosphates influence the colouration with hydroxynaphthol blue (HNB), the optimized process was adapted to the practical application.
  • HNB hydroxynaphthol blue
  • the final concentration of MgS0 4 was reduced from 10 mM to 9 mM and that of the deoxynucleoside triphosphates from 1.6 mM to 1.2 mM.
  • E. amyvora DNA dilution series or dilutions of bacterial cells were prepared and used in the method of the invention.
  • At a incubation time of 45 min in a 25 ⁇ reaction mixture still 80 to 100 fg DNA could be reliably detected, as shown in Fig. 5.
  • FIG. 5 shows the results of verification of amplification by gel electrophoresis (2%, above) and color change (below).
  • FIG. 5 shows from left to right the results for 100, 80, 60, 40, 20 and 0 fg of isolated E. amyl lovora DUA and in FIG. 6 those for 20, 18, 16, 14, 12 , 10 and 0 cfu of E. amylovora.
  • M again denotes the DNA marker Lambda Eco47l. literature
  • thermostable helicase An, L., Tang, W., Ranalli, T.A. , Kim, HJ. , Wytiaz, J., Kong, H., Characterization of a thermostable helicase and its participation in helicase-dependent amplification, J. Biol. Chem. 280, 28952-28958 (2005).

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen von Erwinia amylovora in einer Probe, indem eine oder mehrere Erwinia amylovora-Sequenzen in der Probe unter Anwendung der LAMP-Methode mittels für diese Sequenz(en) spezifischer Primer amplifiziert und gegebenenfalls mit bekannten Sequenzen verglichen werden, mit dem Kennzeichen, dass als Referenzsequenz die genomische Sequenz der Basen 378996 bis 1379215 des Erwinia amylovora-Genoms, die für das hypothetische Protein AMY1267 des Stamms Ea273 kodiert, wie in Seq.-ID Nr. 1 dargelegt, verwendet wird und der aus den Seq.-ID Nrn. 2 bis 7 bestehende Satz spezifischer LAMP-Primer zur Amplifikation eingesetzt wird.

Description

LAMP-Verfahren zum Nachweisen von Erwinia amylovora
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweisen des Feuerbranderregers Erwinia amylovora.
Feuerbrand wird durch das gram-negative Bakterium Erwinia amylovora verursacht, das Pflanzen der Familie der Rosaceen befällt, besonders Gattungen der Unterfamilie Maloideae (Kernobstgehölze), vor allem Apfel (Malus x domestica), Birne (Pyrus communis) und Quitte (Cydonia oblonga). Die Infektion erfolgt in der Regel über die Blüte (primärer Feuerbrand). Im Gegensatz dazu werden Infektionen über das Laub, später in der Vegetationsperiode, als sekundärer Feuerbrand bezeichnet. Die Infektion der Blüte breitet sich über das Xylem aus und führt zu einer im Holz fortschreitenden Nekrose. Die Krankheit verursacht verheerende Schäden in Obstanlagen mit entsprechenden wirtschaftlichen Verlusten.
Regional können zur Blütezeit Prognosen des Feuerbrand-Infektionsrisikos z.B. nach dem Modell MARYBLYT durchgeführt werden. In diesem Modell werden aktuelle und lokale Temperatur- und Feuchtigkeitswerte in Form von kritischen Schwellenwerten und Zeitsummen während der Blüte beurteilt (Steiner 1990, Lightner und Steiner 1990, Jones 1992). Der aus der Feuerbrandsituation des Vorjahres abgeleitete vermutliche Infektionsstatus wird dabei oft auch in Betracht gezogen, kann aufgrund der hohen Bakteriendynamik allerdings ungenau sein. Am informativsten wären deshalb konkrete Testergebnisse zum aktuellen und lokalen Infektionsstatus während der Blüte. Allerdings sind Tests mit Blüten oder Blütenbüscheln mit niedrigen Zelltitern während der frühen Infektionsphase konfrontiert und müssten entsprechend sensitiv sein. Zudem ist durch die kurze Blütezeit ein sehr enger Zeitrahmen für Tests gegeben, der es in der Regel nicht erlaubt, Proben an Labore zu versenden, die Ergebnisse der Tests während der Blüte zu erhalten und gegebenenfalls auch rechtzeitig Gegenmaßnahmen ergreifen zu können.
Ein schneller und sensitiver Test auf Erwinia amylovora, der auch unter Feldbedingungen oder zumindest in einfach ausgestatteten Laboren vor Ort möglich ist, wäre aus diesen Gründen sehr wünschenswert. Ein solcher Test würde neben der MARY- BLYT-Prognose über Infektionsbedingungen die sehr wichtige Information über den aktuellen, lokalen Infektionsstatus liefern können. Dies würde eine rechtzeitige Entscheidung vor Ort über die Notwendigkeit von Gegenmaßnahmen gegen die Verbrei- tung des Pathogens während der Blüte ermöglichen. Die Wirtschaftlichkeit läge bei hohem Infektionsstatus selbstverständlich in der Vermeidung von Feuerbrandschäden, aber auch die nachgewiesene lokale Abwesenheit des Erregers ergäbe neben dem wirtschaftlichen Vorteil, keine unnötigen Maßnahmen ergreifen zu müssen, auch den ökologischen Vorteil eines verminderten, angepassten Pestizideinsatzes.
Tests auf mikrobielle Pathogene werden in der Regel durch selektive Kultur oder Kultur mit Indikatoren durchgeführt, oder, weniger aufwändig, durch immunologische Tests wie ELISA, oder aber durch PCR-Reaktionen auf spezifische Nukleinsäuresequenzen. Sowohl ELISA- als auch PCR-Tests auf mikrobielle Pathogene sind da- bei wesentlich schneller durchzuführen als die Identifizierung mittels Kultivierung, wenn sie nicht mit Vorkulturen kombiniert werden müssen, um die Nachweisgrenze zu erreichen oder ausreichende Spezifität zu gewährleisten. Tests unter Feldbedingungen verlangen weitere methodische Vereinfachungen und schließen in der Regel die Verwendung von Thermocyclern, die für PCR-Reaktionen benötigt werden, aus. Daher werden unter Feldbedingungen oft ELISA-Tests verwendet, obwohl sie meist wesentlich unsensitiver und unspezifischer als PCR-Tests sind.
Einige neuere Nukleinsäure-Amplifikationsmethoden funktionieren bei konstanter Temperatur, meist im Bereich von 60-65 °C, und umgehen damit die Notwendigkeit von Thermocyclern, erreichen aber trotzdem die Sensitivität von PCR-Reaktionen. Die wichtigsten dieser isothermalen Amplifikations-Techniken sind NASBA ("nucleic acid sequence-based amplification", Compton 1991 ), SDA ("Strand displacement amplification", Walker et al. 1992), HRCA (Synonym: CRCA) {"hyperbranched (oder: cascade) rolling circle amplification", Lizardi et al. 1998, Thomas et al. 1999), HDA {"helicase dependent amplification", Vincent et al. 2004, An et al. 2005), LAMP {"loop-mediated isothermal amplification of DNA", Notomi et al. 2000, Nagamine et al. 2002) und RPA ("recombinase Polymerase amplification", Piepenburg et al. 2006). Generell umgehen diese Techniken das Aufschmelzen doppelsträngiger DNA (oder von DNA-RNA-Hybriden im Fall von NASBA) zur Erzeugung von Nukleinsäure-Ein- zelsträngen zur Hybridisierung der Primer (Startpunkte der Synthese) und als Vorlage zur Gegenstrangsynthese ("template").
Dabei werden Startpunkte der Synthese geschaffen durch Einzelstrangbrüche ("nicks") mittels Restriktionsenzym (SDA), durch zirkuläre Einzelstrang-DNA (CRCA), Strangtrennung in einem Promoterbereich (NASBA), sich regenerierende Haarnadelschleifen (LAMP) oder durch Rekombinase-Aktivität gebildete D-Schleifen (RPA). Die Notwendigkeit, eine Einzelstrang-Vorlage zur Synthese zu schaffen, wird in isothermalen Methoden vermieden, indem eine Strang-Verdrängungsaktivität einer DNA- Polymerase (NASBA, SDA, CRCA, LAMP, RPA) oder RNA-Polymerase (NASBA) genutzt wird; oder ein Einzelstrang wird durch eine separate Helikase-Aktivität (HDA) erzeugt; oder der Gegenstrang wird durch ein Enzym abgebaut (RNAse H, NASBA).
Von diesen Methoden zur DNA-Diagnostik wird LAMP in weitester Verbreitung eingesetzt, da LAMP mit hoher Effizienz und Spezifität DNA amplifiziert (z.B. Gill and Ghaemi 2008, und die Zitate darin). LAMP ermöglicht es auch, die Gelelektrophorese zur Analyse der Produkte zu umgehen, da sich in positiven Reaktionen ein weißer Magnesiumpyrophosphat-Niederschlag bildet, der mit bloßem Auge sichtbar ist. Dies ermöglicht die homogene Analyse ohne weitere Handhabung und ohne erneutes Öffnen der Reaktionsgefäße, was das Risiko birgt, mit den in sehr hoher Konzentration vorliegenden Amplifikationsprodukten Arbeitsplatz, Gerätschaften und letztlich nachfolgende Reaktionsansätze zu kontaminieren. Noch praxisgerechter wird die LAMP- Reaktion durch die Zugabe des Metallionen-Indikators Hydroxynaphtholblau (HNB) als kolorimetrischer Test, bei dem bei positiver Amplifikation ein Farbumschlag von violett nach blau stattfindet (Goto et al. 2009, Hadersdorfer et al. 201 1 ).
Eine LAMP-Methode für plasmidspezifische Erwinia amy/ovora-Sequenzen wurde kürzlich publiziert (Temple und Johnson 201 1 ). Die Autoren haben insgesamt 45 Primer-Sets zur Amplifikation von Erwinia amylovora-DUA getestet, wobei der Nachweis von Plasmid-DNA konkret beschrieben, gleichzeitig aber erwähnt wird, dass auch Tests mit chromosomaler DNA durchgeführt worden seien. Es gelang den Autoren allerdings nicht, das Bakterium zuverlässig nachzuweisen, da zahlreiche Artefakte auftraten, und zwar sowohl falsch-positive als auch falsch-negative Reaktionen. Unter anderem kam es zu Verwechslungen mit dem Epiphyten Pantoea agglomerans, einem in Obstplantagen häufig vorkommenden Enterobakterium.
Ziel der Erfindung war daher die Entwicklung eines verbesserten LAMP-Verfahrens zur DNA-Amplifikation von Erwinia amy/ovora-Sequenzen, um so den Erreger mit erhöhter Zuverlässigkeit nachweisen zu können.
Weiters wurde festgestellt, dass bestäubende Honigbienen Überträger des Feuerbranderregers sein können (Alexandrova et al. 2006) sowie dass Honigbienen zur Überwachung der von ihnen bestäubten Pflanzen eingesetzt werden können, u.a. um Erwinia amylovora nachzuweisen (Sabatini et al. 2002). Zur Detektion des Bakte- riums werden wiederum z.B. PCR- oder PCR-ELISA-Verfahren angewandt.
Zur Probennahme ist es bekannt, Bienen am Eingang zum Bienenstock eine Laufstrecke, wie z.B. ein Lochgitter, einen Kamm oder eine Folie, passieren zu lassen, um zu verschiedenen Zwecken Proben der von diesen angeflogenen Blüten, z.B. Nektar- oder Pollenproben, zu gewinnen, die am Lochgitter oder Kamm abgestreift werden und in einen darunter montierten Auffangbehälter fallen oder DNA-Reste an den Tarsen, die an einer Folie haften bleiben.
Um in kurzer Zeit ausreichend große Probenmengen zu erhalten, wird standardmä- ßig die Honigbiene als Bienenvolk für die Probennahme gewählt, die Staaten aus bis zu 80.000 Individuen bildet.
Nachteilig ist hierbei jedoch die Tatsache, dass so große Bienenpopulationen riesige Gebiete abfliegen und dabei Pollen und Nektar zahlreicher unterschiedlicher Pflan- zenarten sammeln. Die Analyse von Pollen einer spezifischen Planzenart ist dadurch nahezu unmöglich, zumindest aber mit einem enormen Aufwand verbunden. Weiters ist bekannt, Wildbienenstämme zur Bestäubung von Pflanzen in einem definierten, begrenzten Areal, z.B. einer Obstplantage, einzusetzen. Wildbienen bilden, wenn überhaupt, weitaus kleinere Staaten aus wenigen tausend oder auch nur hun- derten Individuen, deren Fluggebiet in der Regel sehr eingeschränkt ist. Somit eig- nen sie sich nur bedingt zur Probennahme, da in einem bestimmten Zeitraum nur sehr geringe Probenmengen gewonnen werden könnten.
Andererseits besteht ein dringendes Interesse daran, möglichst früh über den eventuellen Befall einer Pflanzenart mit einem Erreger Bescheid zu wissen, um Gegen- maßnahmen ergreifen zu können. So ist etwa der Befall von Obstpflanzen mit dem Feuerbranderreger ein stetiges Problem in der Landwirtschaft.
Die Apfel- und Birnenblüte beginnt in Mitteleuropa üblicherweise im April, in wämeren Regionen auch Anfang April (Sabatini et al. 2002) und gelegentlich schon Ende März. Die zu dieser Zeit herrschenden Durchschnittstemperaturen sind für Honigbienen jedoch an vielen Tagen zu niedrig, um normales Flugverhalten zu zeigen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung war vor diesem Hintergrund die Entwicklung einer Methode, wie zu einem möglichst frühen Zeitpunkt im Jahr ausreichende Informatio- nen über einen potenziellen Befall von Nutzpflanzen mit bestimmten Erregern, insbesondere von Obstpflanzen mit Erwinia amylovora, erhalten werden können.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Ein Ziel wird in einem ersten Aspekt der Erfindung erreicht durch Bereitstellung eines Verfahrens zum Nachweisen von Erwinia amy/ovora-Sequenzen in einer Probe, indem eine oder mehrere Erwinia amy/ovora-Sequenzen unter Anwendung der LAMP- Methode amplifiziert und gegebenenfalls mit bekannten Sequenzen verglichen werden, wobei das Verfahren der Erfindung dadurch gekennzeichnet ist, dass einerseits als Referenzsequenz die genomische Sequenz der Basen 1378996 bis 1379215 des Erwinia amylovora-Genoms, die für das hypothetische Protein AMY1267 des Stamms Ea273 kodiert, wie in Seq.-ID Nr. 1 dargelegt, verwendet wird und anderer- seits der aus den Seq.-ID Nrn. 2 bis 7 bestehende Satz spezifischer LAMP-Primer zur Amplifikation eingesetzt wird.
Die obige genomische Sequenz mit Seq.-ID Nr. 1 wurde aus den vom Sanger Institu- te entschlüsselten und auf dessen Website für die Öffentlichkeit bereitgestellten (http://www.sanger.ac.uk/resources/downloads/bacteria/erwinia-amylovora.html) Daten des Erwinia amylovora-Genoms ausgewählt.
Ohne sich auf eine Theorie festlegen zu wollen, wird angenommen, dass die zahlrei- chen Artefakte beim Nachweis gemäß dem oben erwähnten Verfahren von Temple und Johnson auch daher rührten, dass als Target (zumindest vorwiegend) eine Plas- mid-DNA ausgewählt wurde. Der Vorteil der (möglichen) Gegenwart von Plasmid- DNA in Mehrfachkopien, also in potenziell höherer Konzentration in der Probe, wird nach Ansicht der Erfinder dadurch zunichte gemacht, dass: a) ein bestimmtes Plas- mid mitunter nicht in allen Stämmen der nachzuweisenden Spezies vorkommt (was auch Temple und Johnson bestätigt haben), b) Plasmide, z.B. durch äußere Einflüsse, vergleichsweise leicht deaktiviert werden können und c) Plasmide auf andere Spezies oder sogar Gattungen übertragen werden können. Durch Verwendung der in Seq.-ID Nr. 1 beschriebenen genomischen DNA-Sequenz von Erwinia amylovora als Referenzsequenz wird gemäß vorliegender Erfindung sichergestellt, dass sämtliche bekannten Stämme der Spezies Erwinia amylovora er- fasst und Artefakte aufgrund von Plasmid-Deaktivierung oder -Transfer wirksam vermieden werden. Falsch-negative Ergebnisse sind somit praktisch ausgeschlossen.
Die als Primer für die Amplifikationsreaktion eingesetzten LAMP-Primer der Seq.-ID Nrn. 2 bis 7 ermöglichen eine rasche und zuverlässige Amplifikation der in der Probe enthaltenen Erwinia amylovora-DUA. Vor allem aber ist mit diesem für Seq.-ID Nr. 1 hochspezifischen Primersatz die Amplifikation potenzieller kontaminierender DNA praktisch ausgeschlossen, weswegen im Wesentlichen keine falsch-positiven Ergebnisse, d.h. Artefakte, erhalten werden können. Die Auswahl der Primer erfolgte mit Hilfe der Online-Software "PrimerExplorer V4" (http://primerexplorer.jp/e/, Eiken Chemical Co., Tokyo, Japan) und durch Screenen von Datenbanken unter Verwendung von NCBI Blast auf Sequenzen möglicher Kon- taminanten. Primer, die mit verfügbaren Sequenzen dieser DNA-Kontaminationsquel- len zu große Sequenzähnlichkeit aufwiesen, wurden entsprechend abgeändert oder ausgeschlossen, bis schließlich ein vollständiger Primersatz ermittelt werden konnte, der in der Praxis im Wesentlichen keine Kreuzreaktionen ergeben sollte. Bei der Auswahl dieser Primer wurde insbesondere eine mögliche Kontamination durch DNA von Apfel, Birne, Biene, epiphytischen Mikroorganismen, wie z.B. Erwinia persicina, Erwi- nia pyrifoliae, Erwinia tasmaniensis, Erwinia piriflorinigrans, Erwinia billingiae, Pan- toea agglomerans, Bacillus licheniformis, Bacillus coagulans, Bacillus cereus, bacil- lus subtilis subsp. Subtilis und Staphylococcus aureus, aber auch durch menschliche DNA, die während der Handhabung der Probe eingeschleppt worden sein könnte, berücksichtigt. Wie die späteren Beispiele belegen, waren mit diesem Primerset kei- nerlei Artefakte zu beobachten.
Für dieses Primer-Set wurde dann ein hinsichtlich relevanter Parameter, wie z.B. Temperatur, ßsf-DNA-Polymerase-, Mg2+-, HNB-, Betain- und Desoxynucleosidtri- phosphat-Konzentration, absolute und relative Konzentration der Primer und Reak- tionszeit, optimiertes Verfahrensprotokoll erarbeitet, wie in den Beispielen dargelegt wird.
Das so entwickelte Verfahren der vorliegenden Erfindung erlaubt die kolorimetrische Detektion bis zu einer Nachweisgrenze von etwa 80 bis 100 fg DNA, was lediglich 20 bis 25 Zellen von Erwinia amylovora entspricht in 45 Minuten, und das auch unter Feldbedingungen. Die Nachweisgrenze beim Einsatz von Bakterienzellen als Template in der LAMP-Reaktion liegt etwa bei 16 bis 20 Zellen in 45 Minuten. Durch die Verwendung der genomischen Zielsequenz mit Seq.-ID Nr. 1 können auch Plasmid- freie, aber trotzdem mitunter pathogene Erwinia amy/ovora-Stärnrne detektiert wer- den. Mittels Verdünnungsreihen aus den von den Proben gewonnenen Erwinia amy- /ovora-Zellsuspensionen bis unter die Nachweisgrenze können die Tests zur Ermittlung semiquantitativer Ergebnisse benutzt werden. Die Herkunft der Proben ist dabei nicht speziell eingeschränkt, und es können beispielsweise Waschwasser von mehreren oder auch nur einzelnen Blüten, Triebe, Blätter oder Laborproben eingesetzt werden, um an die erforderliche DNA zu gelangen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden jedoch von bestäubenden Bie- nen, noch bevorzugter Wildbienen, insbesondere Hummeln, gesammelte Proben verwendet, wie dies später im Zusammenhang mit dem zweiten Aspekt der Erfindung näher ausgeführt wird.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Produkte der LAMP-Amplifikation durch Gelelektrophorese und/oder mit Fluoreszenzfarbstoffen in Echtzeit-Thermocyclern bzw. Fluorimetern analysiert, was besonders rasche und eindeutig zuordenbare Ergebnisse liefert.
Die LAMP-Reaktion wird vorzugsweise bei 60-65 °C durchgeführt, was ausreicht, um die LAMP-Amplifikation rasch ablaufen zu lassen, aber gleichzeitig keine aufwändigen Gerätschaften erfordert. Die Wärmequellen können in diesen Fällen beispielsweise feldtaugliche, spannungsunabhängige oder Niedervolt-Wärmegeneratoren oder auch einfach Thermoskannen sein. Dies ermöglicht die Bereitstellung einer tragbaren Vorrichtung, d.h. eines Analysengeräts, das vor Ort, etwa in einer Obst- plantage, problemlos betreibbar ist.
Im Hinblick auf die Durchführung solcher Analysen im Feld ist eine erfolgreiche Am- plifikation der Bezugssequenz mit Seq.-ID Nr. 1 vorzugsweise durch einfache Sichtprüfung mit bloßem Auge feststellbar, z.B. weil ein Farbumschlag oder eine Trübung auftritt, was eine rasche Feststellung des Analysenergebnisses ermöglicht und darüber hinaus das Design eines oben erwähnten tragbaren Analysengeräts weiter vereinfacht. Zu diesem Zweck wird gemäß vorliegender Erfindung vorzugsweise Hydro- xynaphtholblau als Indikator zur LAMP-Reaktion zugesetzt, wodurch eine erfolgreiche Amplifikation der Bezugssequenz mit Seq.-ID Nr. 1 anhand eines leicht erkenn- baren Farbumschlags angezeigt wird. In weiteren besonders bevorzugten Ausführungsformen wird das Ausmaß des Farbumschlags aber auch semiquantitativ bewertet, um - mit für eine Erstbefundung ausreichender Genauigkeit - den Bakterientiter und damit das Ausmaß des Befalls (z. B. von Obstbäumen) mit dem Erreger abschätzen zu können. Hierfür kommen bei- spielsweise Farbskalen, Inkubations-Zeitreihen oder Verdünnungsreihen zum Einsatz.
Die mittels des Verfahrens der Erfindung gewonnenen Daten können in der Folge zur raschen Integration in Feuerbrand-Infektionsrisiko-Prognosemodelle verwendet wer- den, um auf diese Weise zuverlässige Aussagen bezüglich eines potenziellen Befalls einer Obstplantage mit dem Erreger treffen zu können.
In einem zweiten Aspekt der Erfindung wird, wie erwähnt, die Verwendung einer Bienenpopulation zur Gewinnung von Proben von Pflanzen, die von diesen Bienen be- stäubt werden, bereitgestellt, wobei die Probengewinnung mittels einer von den Bienen zu betretenden Laufstrecke vor dem Eingang zu ihrer Behausung erfolgt und die erfindungsgemäße Verwendung dadurch gekennzeichnet ist, dass
a) als Bienenpopulation eine oder mehrere Bienenarten eingesetzt werden, die
i) normalerweise Populationen aus nicht mehr als 1 .000 Individuen bilden und ii) deren jährliche Flugzeit im April oder früher beginnt; und
b) die zu gewinnende Probe eine DNA-Probe, insbesondere eine Probe von Erwinia amylovora-DUA, ist.
Der zweite Aspekt der Erfindung betrifft somit ausschließlich Wildbienen, worunter in der weitesten Definition alle Bienenarten der Überfamilie Apoidea mit Ausnahme der Honigbiene (Apis mellifera) zu verstehen sind.
Auf diese Weise ist gewährleistet, dass von den Bienen ein relativ begrenztes Gebiet abgeflogen wird und dabei Pollen und Nektar von nur wenigen Pflanzenarten gesam- melt werden, wodurch die DNA-Probe einen relativ geringen Verdünnungs- bzw. Kontaminationsgrad aufweist, und dass die Analyse zu einem frühen Zeitpunkt, idealerweise unmittelbar nach dem Beginn der Blüte des jeweiligen Pflanzenart, durchge- führt werden kann. Eine solch kleine Bienenpopulation ist darüber hinaus wesentlich einfacher handzuhaben und zu transportieren.
Die eingangs erwähnte Tatsache, dass von so kleinen Bienenpopulationen in einem bestimmten Zeitraum nur sehr geringe Probenmengen gewonnen werden können, stellt für die Erfinder in bevorzugten Ausführungsformen, in denen die DNA-Probe Erwinia amylovora-DUA ist, keinerlei Einschränkung dar, da mittels des Verfahrens gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung sogar Probenmengen von nur 80 bis 100 fg an Erwinia amylovora-DUA zuverlässig und reproduzierbar nachgewiesen und Arte- fakte aufgrund von kontaminierender DNA praktisch ausgeschlossen werden können, wie dies in den Beispielen klar gezeigt wird.
Daher kann eine gemäß vorliegender Erfindung ausgewählte Bienenart auch Populationen aus nicht mehr als 500 oder sogar unter 100 Individuen bilden, ohne dass die Gefahr besteht, dass keine ausreichenden DNA-Mengen gesammelt werden können. Die Probennahme kann dabei bei beabsichtigter Weiterverwendung der Tiere mittels einer am Nesteingang angebrachten Folie erfolgen. Von dieser wird nach der Expositionszeit mittels einer Pufferlösung eine Bakteriensuspension gewonnen (abgespült), die zum eigentlich DNA-Nachweis eingesetzt wird. Alternativ kann ein Teil der Arbei- terinnen geopfert werden, in dem ihre Honigblasen ausgedrückt werden, dies ergibt pro Arbeiterin typischerweise etwa 20 bis 30 mg Honig, der zu einer Mischprobe vereinigt wird und dann dem DNA-Nachweis dient.
Abgesehen von der Größe der Population und ihrer Flugzeit ab April oder früher sind die Bienenarten nicht speziell eingeschränkt. Unter Population ist hierin im weitesten Sinne jede Art von Bienengemeinschaft in einem begrenzten Areal zu verstehen, also sowohl entsprechend kleine "Staaten", Völker oder Kolonien in einem Bienenstock oder einem unterirdischen Nest als auch eine entsprechende Anzahl an Bienen auf einer bestimmten Bodenfläche, z.B. von einigen Quadratmetern. Theoretisch kommen daher auch Solitärbienen für die vorliegende Erfindung in Frage, d.h. Bienen, die jeweils alleine in unterirdischen Nestern oder Mauerspalten leben und dort ihre Nachkommen aufziehen, solange eine größere Anzahl von ihnen pro Quadrat- meter anzutreffen ist. Es kann vor jedem Eingang zu ihren Behausungen eine entsprechende Laufstrecke, z.B. eine Folie, vorgesehen werden, und am Ende der Probennahme werden die mittels aller Laufstrecken gesammelten Proben einfach kombiniert.
Vorzugsweise werden jedoch soziale Bienenarten verwendet, die eine gemeinsame Behausung, d.h. in einem Stock oder Nest, nutzen, um die Anzahl an erforderlichen Laufstrecken gering zu halten und dennoch in kurzer Zeit die notwendige Probenmenge sammeln zu können. Gemäß der Erfindung können den Bienen auch Nisthil- fen zur Verfügung gestellt werden, d.h. vorgefertigte Stöcke oder Nester, wobei unter Letzteren auch eine größere Anzahl an Niströhren für Solitärbienen auf einer Fläche von wenigen Quadratmetern zu versehen ist.
Der Fachmann wird ohne übermäßiges Experimentieren in der Lage sein, die für den jeweiligen Zweck am besten geeigneten Bienenarten auszuwählen, wobei vor allem die geografische Lage, das dortige Klima, die Bodenbeschaffenheit und natürlich die zu bestäubende und zu untersuchende Pflanzenart zu berücksichtigen ist. Vorzugsweise ist die Bienenart aus den Gattungen Hummel, Sandbiene und Mauerbiene ausgewählt, wobei noch bevorzugter eine Hummelart eingesetzt wird. Deren Flugzeit beginnt typischerweise im März, bei manchen Sandbienenarten sogar schon im Februar, und Hummeln sind besonders früh im Jahr unterwegs, wie nachstehend noch ausführlicher erläutert wird.
Von den zahlreichen Hummel-, Sandbienen- und Mauerbienenarten - in Mitteleuropa kommen etwa 40 Hummel-, 150 Sandbienen- und etwa 50 Mauerbienenarten vor - sind die meisten Solitärbienen. Allerdings ist auch eine soziale Lebensweise, d.h. ein gemeinsames Nest, mancher der eigentlich als Solitärbienen bekannten Bienenarten bekannt. Wird daher in einem bestimmten Gebiet, wie z.B. einer Obstplantage, ein Nest mit einer Laufstrecke am Nesteingang als Nisthilfe bereitgestellt, kann es von einer dort gezielt ausgesetzten Bienenart gemeinsam genutzt werden. Verschiedene Hummelarten bilden allerdings auch Kolonien oder Staaten aus etwa 50 bis 600, mitunter bis zu 1 .000 Tieren und einer Königin. Für Hummeln reicht bereits eine Mindesttemperatur von nur 6-9 °C aus, um ausfliegen zu können (bei Königinnen sogar nur 2 °C), da sie ein dichtes Haarkleid besitzen, vor allem aber ihre Körpertemperatur durch Vibrationen der Brustmuskulatur, wobei die Flügel abgekoppelt werden, selbst erhöhen können. Diese Fähigkeit ist unter den verschiedenen Bienengattungen einzigartig. Im Vergleich dazu benötigen Honigbienen üblicherweise Außentemperaturen von 10-15 °C. Darüber hinaus sind Hummeln weitaus effizientere Bestäuber und damit Probensammler als andere Bienengattungen, insbesondere als die Honigbiene. So produziert beispielsweise ein Hummelstaat bis zu 15-mal so viel Honig wie ein gleich großer bzw. kleiner Staat Honigbienen.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen wird zur Probengewinnung ein Stamm der roten Mauerbiene, Osmia bicornis (auch als Osmia rufa bekannt), oder der Erd- hummel, Bombus terrestris, eingesetzt.
Die rote Mauerbiene zählt zu den Bauchsammlern, d.h. sie tragen Pollen an einem Haarsaum am Bauch ("Bauchbürste"), was die gesammelte Menge an Pollen bei der Probennahme mittels Laufstrecke gegenüber Beinsammlern erhöht. Sie ist allgemein dicht behaart, was ihr eine höhe Temperaturresistenz verleiht als anderen Bienenarten, und in Europa weit verbreitet, von Südeuropa bis Südschweden. Ihre Flugzeit beginnt Anfang April, in wärmeren Gefilden bereits Ende März. Kaum eine andere Bienenart ist so flexibel bei der Annahme von Nistmöglichkeiten, was ihre weite Verbreitung erklärt und ihre Ansiedlung in Obstplantagen stark vereinfacht. Die rote Mauerbiene lebt zwar typischerweise solitär, doch ist es möglich, eine größere Anzahl an Individuen in einem begrenzten Bereich, z.B. unter einem Reetdach, anzusiedeln. Durch Vorsehen weniger Zugangsöffnungen zu solch einem Nistbereich kann eine effiziente Beprobung erfolgen. Die Erdhummel, genauer gesagt die dunkle Erdhummel, Bombus terrestris, ist in Europa ebenfalls weit verbreitet und beginnt - auch in Mitteleuropa - bereits im März auszufliegen. Sie bildet typischerweise Völker aus 100 bis 500 Individuen, und zwar sowohl unter- als auch überirdisch, was sowohl ihre Ansiedlung als auch die Bepro- bung stark vereinfacht.
Die mittels der Wildbienen zu gewinnende DNA ist vorzugsweise Schädlings-DNA, insbesondere Erwinia amylovora-DUA, die dann insbesondere nach dem Verfahren gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung amplifiziert und analysiert werden kann.
In einem dritten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Set zur Verwendung gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung bereit, das Folgendes umfasst:
a) eine transportsicher verpackte Bienenpopulation wie oben beschrieben und b) Mittel zum Analysieren der in der zu gewinnenden Probe enthaltenen DNA.
Mittels eines solchen Sets können die von den Bienen gewonnenen DNA-Proben vor Ort, also z.B. direkt in einer Obstplantage, analysiert werden. Die Analysenmittel um- fassen dabei vorzugsweise Mittel zum Ampiifizieren der DNA mittels PCR- oder LAMP-Verfahren, wodurch - beispielsweise im Vergleich mit ELISA-Methoden - auch sehr geringe Probenmengen ausreichen, um die DNA zuverlässig analysieren zu können. Noch bevorzugter umfassen die Amplifikationsmittel Instrumente zur Durchführung eines LAMP-Verfahrens, da LAMP ("loop-mediated isothermal ampli- fication") im Vergleich mit PCR- {"Polymerase chain reaction") Amplifikation keine Thermocycler erfordern.
Die Analysenmittel des Sets umfassen daher vorzugsweise weiters spezifische Primer für die LAMP-Reaktion, insbesondere spezifische Primer, die die Sequenzen der Seq.-ID Nrn. 2 bis 7 aufweisen, wie oben beschrieben.
Weiters umfasst das Set gegebenenfalls eine Heizvorrichtung und/oder Mittel zur Visualisierung von Produkten oder Nebenprodukten der Amplifikation, wobei ein bevorzugtes Visualisierungsmittel der Farbindikator Hydroxynaphtholblau ist.
Die optionale Heizvorrichtung braucht dabei vorzugsweise nur eine Temperatur von 60-65 °C zu erzeugen, da dies für LAMP-Verfahren durchaus ausreicht und einen mobilen Einsatz im Feld weiter vereinfacht: Für diese Temperaturen reicht beispielsweise auch Heißwasser in einer Thermoskanne aus, die somit ebenfalls unter die Definition der Heizvorrichtung fällt. Alternativ dazu können etwa batteriebetriebene Widerstandsheizungen, als so genannte "Taschenwärmer" bekannte Systeme, die beispielsweise auf der Oxidation von auf einem Träger (z.B. Watte) fein verteiltem Eisenpulver oder auf frei werdender Kristallisationswärme nach mechanischer Auslösung beruhen, oder auch Parabolspiegel zur Bündelung von Sonnenstahlen eingesetzt werden, oder auch spannungsunabhängige oder Niedervolt-Wärmegeneratoren, wie bereits erwähnt.
Hydroxynaphtholblau ist als Visualisierungsmittel bevorzugt, da in Gegenwart von Erdalkalimetallionen ein Farbumschlag von violett nach blau stattfindet, der mit bloßem Auge gut zu erkennen ist. Die Erdalkalimetallionen stammen beispielsweise von einem Magnesiumpyrophosphat-Niederschlag, der als Nebenprodukt der LAMP-Re- aktion anfällt und eine Trübung verursacht, die als solche ebenfalls zur Visualisierung herangezogen werden könnte. Der Farbumschlag ist jedoch schon bei geringeren Mengen an Amplifikationsprodukten gut sichtbar und daher bevorzugt.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung in ihrem dritten Aspekt umfasst das Set alle notwendigen Mittel, um damit das Nachweisverfahren gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung durchführen zu können.
Durch die erfindungsgemäße Verwendung bestimmter, oben definierter Wildbienenarten, einschließlich der Gattung Hummel, zur DNA-Probengewinnung von Pflanzen, insbesondere von Nutzpflanzen wie Obst- und Gemüsepflanzen, können Informationen über den Befall der jeweilige Pflanze mit einem Erreger wie etwa Erwinia amylo- vora bereits kurz nach Beginn der Blütezeit erlangt werden, was mehr Zeit für eventuell erforderliche Gegenmaßnahmen zur Verfügung stellt. Vor allem bei Einsatz des Sets gemäß dem dritten Aspekt der Erfindung, insbesondere in Kombination mit dem oben beschriebenen spezifischen Primersatz der Seq.-ID Nrn. 2 bis 7, können auf zuverlässige Weise Informationen über die von den Wildbienen angeflogenen Pflanzen erhalten werden. KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen näher beschrieben. Diese zeigen Folgendes: Die Fig. 1 und 2 zeigen jeweils Ergebnisse von Tests auf Kreuzreaktionen des erfindungsgemäßen Primersets durch Verifizierung der Spezifität mittels Gelelektrophorese (2 %, oben) und mittels Farbumschlag (unten).
Die Fig. 3 und 4 zeigen jeweils die Ergebnisse einer Gelelektrophorese bei Optimie- rungsversuchen mit den erfindungsgemäßen Primern.
Die Fig. 5 und 6 zeigen Ergebnisse der Untersuchung der Nachweisgrenzen des erfindungsgemäßen Verfahrens mittels Gelelektrophorese (2 %, oben) und Farbumschlag (unten).
BEISPIELE
Beispiel 1 : Auswahl der Bezugssequenz und der Primer
Als Bezugssequenz für den Nachweis des Erregers und Zielsequenz für die Entwick- lung von Primern zur spezifischen Amplifikation von genomischer E. amylovora-DUA wurde, wie erwähnt, jener Sequenzabschnitt des hypothetischen Proteins AMY1267 des Stamms Ea273 (http://www.sanger.ac.uk/resources/downloads/bacteria/erwinia- amylovora.html) verwendet, der in Seq.-ID Nr. 1 dargelegt ist. Sequenzinformationen von AMY1267 wurden kürzlich für die Entwicklung eines Taqman-Echtzeit-PCR- Tests auf E. amylovora verwendet (Gottsberger, 2010). Vergleiche der ausgewählten Zielsequenz mit Seq.-ID Nr. 1 in der NCBI Datenbank im Nucleotide Blast-Abfrage- modus (www.ncbi.nlm.nih.gov) ergab keine Ähnlichkeit mit öffentlich zugänglichen Sequenzen außer mit E. amylovora; siehe die nachstehende Tabelle 1 . Tabelle 1
Figure imgf000017_0001
Die Lage der Primerset-Sequenzen und deren Vergleich schließt theoretisch die Bildung von Artefakten durch Primerfehlpaarung aus. Das in nachfolgender Tabelle 2 aufgelistete und im Sequenzprotokoll als Seq.-ID Nr. 2 bis 7 angeführte Primerset wurde mit Hilfe der Online-Software "PrimerExplorer V4" (http://primerexplorer.jp/e/, Eiken Chemical Co. , Tokyo, Japan) generiert. Die Bezeichnungen der Primer (erste Spalte) wurden analog zu Notomi et al. (2000) und Nagamine et al. (2002) gewählt. Tabelle 2
Figure imgf000017_0002
Beispiel 2: Spezifität des Verfahrens
Die erfindungsgemäßen Primer der Seq.-ID Nrn. 2 bis 7 wurden mit 64 E. amylovora- Stämmen (Gottsberger, 2010), siehe nachstehende Tabelle 3, und mit 17 Proben von Fremd-DNA, siehe nachstehende Tabelle 4, auf ihre Spezifität getestet. Dabei wurde Amplifikation ausschließlich bei den E. amy/ovora-Proben beobachtet, und es wurden keinerlei Kreuzreaktionen mit Fremd-DNA festgestellt. Selbst nahe verwandte Erw/n/a-Spezies führten zu keinen Kreuzreaktionen (siehe die Ergebnisse für E persicina, E. pyrifoliae, E. tasmaniensis und E piriflorinigrans). Tabelle 3
Figure imgf000018_0001
Erwin ia amylovora IVIA 1892-1 +
Erwin ia amylovora NCPPB 2292 +
Erwin ia amylovora NCPPB 595 +
Erwin ia amylovora OMP BO 1204.1/94 +
Erwin ia amylovora AGES 681/06 +
Erwinia amylovora pEA29-defizient IVIA 1596 +
Erwinia amylovora pEA29-defizient IVIA 1614-2 +
Tabelle 4
Species Ursprung, Stamm/Sorte Amplifikation
Erwinia persicina AGES 556/10 -
Erwinia pyrifoliae CFBP 4171 -
Pantoea agglomerans AGES R95-91 -
Pantoea agglomerans AGES 599 -
Pantoea agglomerans AGES 701 -
Erwinia tasmaniensis AGES 37/10 -
Erwinia piriflorinigrans CFBP 5888 -
Erwinia billingiae CFBP 6830 -
Malus x domestica 'Rewena' DNA (Jedlersdorf 2008) -
Pyrus communis 'Abbe Fetel' DNA (Jedlersdorf 2008) -
Homo sapiens DNA (Mundhöhlenabstrich 2010) -
Apis mellifera DNA (Bienen, AGES, 2010) -
Bacillus licheniformis NCTC 10341 -
Bacillus coagulans NCTC 10334 -
Bacillus cereus NCTC 2599 -
Bacillus subtilis subsp. subtilis NCTC 10315 -
Staphylococcus aureus ATCC 65389 -
Bezugsquellen:
Figure imgf000019_0001
In den Fig. 1 und 2 sind jeweils die Ergebnisse von Tests auf Kreuzreaktionen des erfindungsgemäßen Primersets durch Verifizierung der Spezifität mittels Gelelektrophorese (2 %, oben) und Farbumschlag (unten) dargestellt. Ganz links werden als Positivkontrollen die Ergebnisse die Reaktion von E. amylovora-DUA gezeigt, und ganz rechts ("M") jene des DNA-Markers Lambda Eco47l. Dazwischen finden sich Ergebnisse der ersten 8 (Fig. 1 ) bzw. der letzteren 9 (Fig. 2) Fremd-DNA-Proben aus Tabelle 4. Es ist deutlich zu erkennen, dass Fremd-DNA durchwegs eindeutig negative Ergebnisse lieferte.
Beispiel 3: Optimierung hinsichtlich Amplifikationseffizienz
Die Konzentrationen der einzelnen Komponenten (Betain, MgSO4, Primer FIP, BIP, F3, B3, LF, LB, Desoxynucleosidtriphosphate, Hydroxynaphtholblau, ßsf-DNA-Poly- merase) und die Reaktionstemperatur des Verfahren der Erfindung wurden hinsicht- lieh Amplifikationseffizienz optimiert. Generell verlief die Amplifikation über einen breiten Konzentrations- sowie Temperaturbereich zufrieden stellend. Die maximale Amplifikation wurde mit folgenden Bedingungen in 25 μΙ Reaktionsvolumen erreicht:
1 x Reaktionspuffer (New England Biolabs, Frankfurt, Deutschland; 20 mM Tris-HCI, 10 mM (NH4)2SO , 10 mM KCl, 2 mM MgSO , 0, 1 % Triton X-100, pH 8,8), 8 IE Bst- DNA-Polymerase, 8 mM zusätzliches MgSO4 (10 mM Endkonzentration), 0,7 M Betain, 0, 18 μΜ 15-F3 und 15-B3 Primer, 1 ,62 μΜ 15-FIP und 15-BIP Primer, 4,2 μΜ 15-LF und 15-LB Loop Primer, 1 ,6 mM Desoxynucleosidtriphosphate, 120 μΜ Hydroxynaphtholblau. Inkubation bei 63 °C für 30 min (Amplifikation) und bei 80 °C für 3 min (Enzym-Inaktivierung) in einem Eppendorf EP Gradient Thermocycler.
In Fig. 3 ist exemplarisch ein Beispiel für einen Optimierungsschritt gezeigt. Mit 1 und
2 sind die Gelelektrophorese (2 %) unterzogenen LAMP-Produkte einer nicht optimierten (1 ) bzw. einer optimierten (2) Reaktion gekennzeichnet. "M" bezeichnet erneut den DNA-Marker Lambda Eco47l.
Fig. 4 stellt die Ergebnisse einer Gelelektrophorese (2 %) von Produkten der Optimierung des Primerverhältnisses dar. Gezeigt werden mehrere Verhältnisse der Primer 15-F3, 15-B3 : 15-FIP, 15-BIP in ganzzahligen Schritten von 1 :7 bis 1 : 1 1 . Wie klar zu erkennen ist, lag das Optimum bei einem Verhältnis von 1 :9. Wiederum be- zeichnet "M" den DNA-Marker Lambda Eco47l. Beispiel 4 - Adaptierung des Verfahrens bezüglich des Farbumschlags Für den Praxiseinsatz ist aus obigen Gründen ein möglichst kontrastreicher Farbumschlag der Reaktion anzustreben. Da die Anfangskonzentrationen der Mg2+-lonen und Desoxynucleosidtriphosphate die Färbung mit Hydroxynaphtholblau (HNB) be- einflussen, wurde das optimierte Verfahren an den Praxiseinsatz angepasst. Dazu wurde die Endkonzentration von MgS04 von 1 0 mM auf 9 mM und jene der Desoxynucleosidtriphosphate von 1 ,6 mM auf 1 ,2 mM verringert. Durch diese Anpassungen konnte ein optimal erkennbarer Farbumschlag bei gleichzeitig noch sehr guter Ampli- fikationsrate erreicht werden.
Beispiel 5 - Empfindlichkeit des Verfahrens
Zur Überprüfung der Nachweisgrenzen wurden E. amy/ovora-DNA-Verdünnungsrei- hen bzw. Verdünnungen von Bakterienzellen hergestellt und im Verfahren der Erfindung eingesetzt. Dabei konnten bei einer Inkubationsdauer von 45 min in einem 25- μΙ-Reaktionsansatz noch 80 bis 100 fg DNA zuverlässig nachgewiesen werden, wie dies in Fig. 5 gezeigt wird. Dies entspricht rechnerisch bei einer Genomgröße von E. amylovora von 3,9053 x 10"9 g etwa 20 bis 25 Bakterienzellen. Unter denselben Reaktionsbedingungen konnten etwa 16 bis 20 Bakterienzellen im Ansatz zuverlässig nachgewiesen werden, wie in Fig. 6 gezeigt wird. Gelegentlich, aber nicht zuver- lässig reproduzierbar konnte selbst 1 einzige Bakterienzelle bzw. 1 ag DNA pro Reaktionsansatz nachgewiesen werden. Für die Infektion von Apfelblüten im Freiland sind etwa 105-106 Bakterien/Blüte (Taylor et al. , 2003) nötig. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können somit im Praxiseinsatz durch Farbumschlag Bakterientiter weit unterhalb der Infektionsschwelle nachgewiesen werden.
In den Fig. 5 und 6 werden die Ergebnisse der Verifizierung der Amplifikation mittels Gelelektrophorese (2 %, oben) und Farbumschlag (unten) gezeigt. In Fig. 5 sind von links nach rechts die Ergebnisse für 100, 80, 60, 40, 20 und 0 fg an isolierter E. amy- lovora-DUA dargestellt und in Fig. 6 jene für 20, 18, 16, 14, 12, 10 und 0 KBE von E. amylovora. "M" bezeichnet erneut den DNA-Marker Lambda Eco47l. Literatur
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SEQUENZPROTOKOLL
<1 10> Technische Universität Wien
<120> LAMP-Verfahren zum Nachweisen von Erwinia amylovora
<130> 1 1 1794
<160> 7
<170> NCBI Blast
<210> 1
<21 1 > 220
<212> DNA
<213> Erwinia amylovora
<220>
<221 > CDS
<222> (1) ... (220)
<223> Kodierende Sequenz für das hypothetische Protein AMY1267 von Stamm Ea273
<400> 1
ttgtctgaat ccagatgtct cttttttaga agatttatgc cttccagaag gtcattttta tcagcatgaa taactatttt ttgcgccgtc cccttgacta tgttcgaagc tctcattgcc gtggagaccg atcttttaca gactttaata tcagaactta ccatataatc ataaatgagt tcgtataaac gttcgtcgaa tgctgcctct cttaaaaaag
<210> 2
<21 1 > 20
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> LAMP-Primer
<400> 2
CTTTTTTAAG AGAGGCAGCA 20
<210> 3
<21 1 > 20
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> LAMP-Primer
<400> 3
TTGTCTGAAT CCAGATGTCT 20
<210> 4
<21 1 > 45
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz <220>
<223> LAMP-Primer
<400> 4
GGAGACCGAT CTTTTACAGA CTTTATTCGA CGAACGTTTA 40 TACGA 45
<210> 5
<21 1 > 44
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> LAMP-Primer
<400> 5
GAGCTTCGAA CATAGTCAAG GGGAAGATTT ATGCCTTCCA 40
GAAG 44
<210> 6
<21 1 > 20
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> LAMP-Primer
<400> 6
CAGAACTTAC CATATAATCA 20
<210> 7
<21 1 > 14
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> LAMP-Primer
<400> 7
ACGGCGCAAA AAAT

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1 . Verfahren zum Nachweisen von Erwinia amylovora in einer Probe, indem eine oder mehrere Erwinia amy/ovora-Sequenzen in der Probe unter Anwendung der LAMP-Methode mittels für diese Sequenz(en) spezifischer Primer amplifiziert und gegebenenfalls mit bekannten Sequenzen verglichen werden,
dadurch gekennzeichnet, dass als Referenzsequenz die genomische Sequenz der Basen 1378996 bis 1379215 des Erwinia amylovora-Genoms, die für das hypothetische Protein AMY1267 des Stamms Ea273 kodiert, wie in Seq.-ID Nr. 1 dargelegt, verwendet wird und der aus den Seq.-ID Nrn. 2 bis 7 bestehende Satz spezifischer LAMP-Primer zur Amplifikation eingesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Produkte der LAMP-Amplifikation durch Gelelektrophorese und/oder mit Fluoreszenzfarbstoffen in Echtzeit-Thermocyclern bzw. Fluorimetern analysiert werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die LAMP- Reaktion bei 60-65 °C durchgeführt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass eine erfolgreiche Amplifikation der Bezugssequenz mit Seq.-ID Nr. 1 durch Sichtprüfung mit bloßem Auge festgestellt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass Hydroxynaphthol- blau als Indikator zur LAMP-Reaktion zugesetzt wird und eine erfolgreiche Amplifikation der Bezugssequenz mit Seq.-ID Nr. 1 durch einen Farbumschlag angezeigt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausmaß des Farbumschlags semiquantitativ bewertet wird.
7. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe von Bienen gewonnen wird.
8. Verwendung einer Bienenpopulation zur Gewinnung von Proben von Pflanzen, die von diesen Bienen bestäubt werden, wobei die Probengewinnung mittels einer von den Bienen zu betretenden Laufstrecke vor dem Eingang zu ihrer Behausung erfolgt,
dadurch gekennzeichnet, dass
a) als Bienenpopulation eine oder mehrere Bienenarten eingesetzt werden, die
i) normalerweise Populationen aus nicht mehr als 1 .000 Individuen bilden und ii) deren jährliche Flugzeit im April oder früher beginnt; und
b) die zu gewinnende Probe eine DNA-Probe ist.
9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die zu gewinnende DNA-Probe eine Schädlings-DNA ist.
10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die zu gewin- nende DNA-Probe Erwinia amylovora-DUA ist.
1 1 . Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Bienenart Populationen aus nicht mehr als 500 Individuen bildet.
12. Verwendung nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Bienenart Populationen aus nicht mehr als 100 Individuen bildet.
13. Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Flugzeit der Bienenart bereits im März oder früher beginnt.
14. Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere aus den Gattungen Hummel, Sandbiene und Mauerbiene ausgewählte Bienenart eingesetzt werden.
15. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere Hummelarten eingesetzt werden.
16. Verwendung nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass ein Stamm der roten Mauerbiene, Osmia bicornis bzw. rufa, oder der Erdhummel, Bom- bus terrestris, eingesetzt wird.
17. Set zur Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 16, Folgendes umfassend:
a) eine transportsicher verpackte Bienenpopulation wie in einem der Ansprüche 8 bis 16 definiert und
b) Mittel zum Analysieren der in der zu gewinnenden Probe enthaltenen DNA.
18. Set nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Analysenmittel Mittel zum Amplifizieren der DNA mittels PCR- oder LAMP-Verfahren umfassen.
19. Set nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikationsmittel Instrumente zur Durchführung eines LAMP-Verfahrens umfassen.
20. Set nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Analysenmittel weiters spezifische Primer für die LAMP-Amplifikation umfassen.
21 . Set nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die spezifischen Primer die Sequenzen der Seq.-ID Nrn. 2 bis 7 aufweisen.
22. Set nach einem der Ansprüche 17 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass die Analysenmittel eine Heizvorrichtung umfassen.
23. Set nach einem der Ansprüche 17 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Analysenmittel weiters Mittel zur Visualisierung von Produkten oder Nebenprodukten der Amplifikation umfassen.
24. Set nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass ein Visualisierungsmittel der Farbindikator Hydroxynaphtholblau ist.
25. Set nach einem der Ansprüche 17 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass das Set zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7 dient.
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