KR20190028275A - 꿀벌의 진균성 질병 진단용 프라이머 세트, 이를 이용한 꿀벌의 진균성 질병을 진단하는 방법 및 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 꿀벌의 진균성 질병 진단용 프라이머 세트, 이를 이용한 꿀벌의 기생충성 및 세균성 질병을 진단하는 방법 및 키트에 관한 것으로서, 노제마병(Nosema), 석고병(Stonebrood) 및 백묵병(Chalkbrood)을 진단하는 프라이머 세트를 포함한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 고민감도, 고특이도 및 고정밀도(고반복성, 고재현성)로 꿀벌의 진균성 질병을 효과적으로 검출함으로써, 그에 소모되는 시간과 비용 절감이 가능하기 때문에, 다양한 시료의 병성감정에 유용하게 이용하는 효과가 있다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 고민감도, 고특이도 및 고정밀도(고반복성, 고재현성)로 꿀벌의 진균성 질병을 효과적으로 검출함으로써, 그에 소모되는 시간과 비용 절감이 가능하기 때문에, 다양한 시료의 병성감정에 유용하게 이용하는 효과가 있다.
Description
본 발명은 꿀벌의 진균성 질병 진단용 프라이머 세트와 이를 이용한 꿀벌의 진균성 질병을 진단하는 방법 및 키트에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 노제마병(Nosema), 석고병(Stonebrood) 및 백묵병(Chalkbrood)을 포함하는 꿀벌의 진균성 질병 진단용 키트, 이를 이용하여 꿀벌의 진균성 질병을 동시에 진단하는 방법에 관한 것이다.
꿀벌은 다양한 식물자원의 수분에 중요한 역할을 하며 벌꿀과 로얄제리, 프로폴리스 등의 생산으로 농가 소득을 증대시킬 수 있는 산업가축으로도 유용한 곤충이다.
꿀벌(Apis mellifera)은 수만 개체가 좁은 장소에서 집단생활을 하는 특성에 따라 각종 전염병의 발병 가능성이 매우 높고, 감염성 또는 기생성 질병은 일단 발병하는 경우 집단생활의 특성상 봉군 전체에 급속히 전파되고, 치료 행위가 수행되지 않는 한 개별 봉군의 피해 뿐 아니라, 인근 봉군에 전파되어 피해를 크게 확대시킬 수 있다.
양봉농가에서 문제시 되는 꿀벌의 바이러스성 질병의 원인체로는 낭충봉아부패병바이러스(SBV, sacbrood virus), 날개불구병바이러스(DWV, deformed wing virus), 여왕벌흑색병바이러스(BQCV, black queen cell virus), 급성꿀벌마비증바이러스(ABPV, acute bee paralysisvirus), 만성꿀벌마비증바이러스(CBPV, chronic bee paralysisvirus), 케시미어병바이러스(KBV, kashmir beevirus) 등이 있다 (Korean J. Apiculture 23(2);153-159 (2008)).
또한, 꿀벌의 세균성 질병으로는 유럽형부저병(AFB) 및 유럽형부저병(EFB), 진균성 질병인 노제마병(Nosema), 석고병(Stonebrood), 백묵병(Chalkbrood) 등도 성충 및 유충의 다량 폐사를 초래하고, 양봉 농가의 생산성 저하를 유발할 수 있는 전염성 질병들이다.
이러한 다양한 질병에 의하여 봉군전체가 피해를 입을 수도 있으며, 많은 경우 우선 그 생산성에 결정적 피해를 입힐 수 있다.
그런데, 꿀벌의 질병에서 꿀벌 자신의 방어력으로 항생 펩타이드 등이 존재하는 것으로 알려져 있는데, 질병의 발생은 기본적 방어력을 넘어선 것으로 성공적 양봉을 위하여 인간의 질병제어 노력은 필수적으로서, 꿀벌의 진균성 질병 제어에서 가장 근간이 되는 것은 신속하고 정확한 진단과 올바른 처치라 할 것이다.
그 동안 꿀벌 질병의 진단은 많은 부분 경험과 직관에 의존하여 왔는데, 이는 많은 오진을 야기하고, 결과적으로 경험에 의존한 처치방안으로 가장 손쉬운 항생제의 대량 사용을 하게 되었으며, 이는 또한 항생제 내성이 생긴 병원균이 출현하여 더욱 질병의 제어를 어렵게 만들고 있다.
기존의 꿀벌질병 진단법으로는 MLPA(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) 분석법(analysis), 마이크로어레이(microarray), PCR(Ploymerase chain reaction) 등이 있으며 그 중 MLPA 분석, 마이크로어레이를 이용한 진단법은 매우 정교한 기술과 많은 비용이 요구된다.
이에 비하여, PCR법은 간단하고 대부분의 실험실에서 수행 가능한 실험법이며, 꿀벌의 질병을 진단하기 위해서 주로 사용해 왔다. 그리고 일반적인 PCR법은 1종의 프라이머 세트를 사용하여 한 종의 질병만 진단할 수 있는 Single target RT-PCR 법을 사용하기 때문에, 하나의 시료 내 여러 종의 꿀벌의 진균성 질병을 진단하기 위해서 각각의 질병에 대한 PCR법을 여러 번 수행하여야 하는 바, 좀 더 빠른 질병 진단법이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
한국양봉학회지 제23권 제4호 통권48호 pp.241-249 (2008); 한국가축위생학회지 제36권 제2호 pp.147-150 (2013).
De Smet L1, Ravoet J, de Miranda JR, Wenseleers T, Mueller MY, Moritz RF, de Graaf DC.,2012, BeeDoctor, a versatile MLPA-based diagnostic tool for screening bee viruses.Plos ONE 7(10):e47953. doi: 10.1371/journal.pone.0047953.
Glover RH1, Adams IP, Budge G, Wilkins S, Boonham N.,2011.Detection of honey bee (Apis mellifera) viruses with an oligonucleotide microarray.J Invertebr Pathol. 2011 Jul;107(3):216-9.
본 발명의 목적은, 꿀벌의 진균성 질병 진단용 프라이머 세트와 이를 이용한 꿀벌의 진균성 질병을 진단하는 방법 및 키트를 제공함으로써, 꿀벌에 질병을 일으키는 주요 진균성 병원체 3종(노제마병, 석고병 및 백묵병)을 정확하고, 신속하며, 효과적으로 진단함에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍; 및 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는, 꿀벌의 진균성 질병 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 노제마병 진단용일 수 있다.
상기 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 석고병 진단용일 수 있다.
상기 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 백묵병 진단용일 수 있다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 꿀벌의 진균성 질병 진단용 프라이머 세트, 이를 이용한 꿀벌의 진균성 질병을 진단하는 방법 및 키트를 제공함으로써, 꿀벌의 진균성 질병을 고민감도, 고특이도 및 고정밀도(고반복성, 고재현성)로 효과적으로 검출함으로써, 그에 소모되는 시간과 비용 절감이 가능하여, 다양한 시료의 병성감정에 유용하게 이용하는 효과가 있다.
도 1a는 노제마병의 민감도 시험 결과로 Real-Time PCR의 Amplification Curve를 도시한 것이다.
도 1b는 노제마병의 민감도 시험 결과로 Conventional PCR 결과를 도시한 것이다.
도 2a는 석고병의 민감도 시험 결과로 Real-Time PCR의 Amplification Curve를 도시한 것이다.
도 2b는 석고병의 민감도 시험 결과로 Conventional PCR 결과를 도시한 것이다.
도 3a는 백묵병의 민감도 시험 결과로 Real-Time PCR의 Amplification Curve를 도시한 것이다.
도 3b는 백묵병의 민감도 시험 결과로 Conventional PCR 결과를 도시한 것이다.
도 4는 노제마병의 특이도 시험 결과로 노제마병에 감염된 검체를 대상으로 수행한 Real-Time PCR의 Amplification Curve를 도시한 것이다.
도 5는 석고병의 특이도 시험 결과로 석고병에 감염된 검체를 대상으로 수행한 Real-Time PCR의 Amplification Curve를 도시한 것이다.
도 6는 백묵병의 특이도 시험 결과로 백묵병에 감염된 검체를 대상으로 수행한 Real-Time PCR의 Amplification Curve를 도시한 것이다.
도 7a는 노제마병의 정밀도(반복성) 1차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 7b는 노제마병의 정밀도(반복성) 2차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 7c는 노제마병의 정밀도(반복성) 3차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 8a는 석고병의 정밀도(반복성) 1차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 8b는 석고병의 정밀도(반복성) 2차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 8c는 석고병의 정밀도(반복성) 3차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 9a는 백묵병의 정밀도(반복성) 1차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 9b는 백묵병의 정밀도(반복성) 2차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 9c는 백묵병의 정밀도(반복성) 3차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 10a는 노제마병의 정밀도(재현성) 1차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 10b는 노제마병의 정밀도(재현성) 2차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 10c는 노제마병의 정밀도(재현성) 3차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 11a는 석고병의 정밀도(재현성) 1차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 11b는 석고병의 정밀도(재현성) 2차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 11c는 석고병의 정밀도(재현성) 3차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 12a는 백묵병의 정밀도(재현성) 1차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 12b는 백묵병의 정밀도(재현성) 2차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 12c는 백묵병의 정밀도(재현성) 3차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 1b는 노제마병의 민감도 시험 결과로 Conventional PCR 결과를 도시한 것이다.
도 2a는 석고병의 민감도 시험 결과로 Real-Time PCR의 Amplification Curve를 도시한 것이다.
도 2b는 석고병의 민감도 시험 결과로 Conventional PCR 결과를 도시한 것이다.
도 3a는 백묵병의 민감도 시험 결과로 Real-Time PCR의 Amplification Curve를 도시한 것이다.
도 3b는 백묵병의 민감도 시험 결과로 Conventional PCR 결과를 도시한 것이다.
도 4는 노제마병의 특이도 시험 결과로 노제마병에 감염된 검체를 대상으로 수행한 Real-Time PCR의 Amplification Curve를 도시한 것이다.
도 5는 석고병의 특이도 시험 결과로 석고병에 감염된 검체를 대상으로 수행한 Real-Time PCR의 Amplification Curve를 도시한 것이다.
도 6는 백묵병의 특이도 시험 결과로 백묵병에 감염된 검체를 대상으로 수행한 Real-Time PCR의 Amplification Curve를 도시한 것이다.
도 7a는 노제마병의 정밀도(반복성) 1차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 7b는 노제마병의 정밀도(반복성) 2차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 7c는 노제마병의 정밀도(반복성) 3차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 8a는 석고병의 정밀도(반복성) 1차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 8b는 석고병의 정밀도(반복성) 2차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 8c는 석고병의 정밀도(반복성) 3차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 9a는 백묵병의 정밀도(반복성) 1차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 9b는 백묵병의 정밀도(반복성) 2차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 9c는 백묵병의 정밀도(반복성) 3차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 10a는 노제마병의 정밀도(재현성) 1차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 10b는 노제마병의 정밀도(재현성) 2차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 10c는 노제마병의 정밀도(재현성) 3차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 11a는 석고병의 정밀도(재현성) 1차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 11b는 석고병의 정밀도(재현성) 2차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 11c는 석고병의 정밀도(재현성) 3차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 12a는 백묵병의 정밀도(재현성) 1차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 12b는 백묵병의 정밀도(재현성) 2차 시험 결과를 도시한 것이다.
도 12c는 백묵병의 정밀도(재현성) 3차 시험 결과를 도시한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 형태에 따른 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍; 및 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는, 꿀벌의 진균성 질병 진단용 프라이머 세트에 관한 것이다.
본 발명에서 “프라이머”는 단일가닥의 올리고뉴클레오티드로서, 적합한 조건 (4 가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도 및 적합한 버퍼 하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다.
상기 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 노제마병(Nosema) 진단용일 수 있다.
상기 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 석고병(Stonebrood) 진단용일 수 있다.
상기 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 백묵병(Chalkbrood) 진단용일 수 있다.
상기 꿀벌의 진균성 질병 진단용 프라이머 세트의 염기서열은 하기 표 1에, 프로브의 염기서열은 하기 표 2에 도시하였다.
| 질병명 | 프라이머 | 염기서열(5' → 3') | 서열번호 |
| 노제마병 | Nosema_S (정방향) | CGGATAAAAGAGTCCGTTACC | 1 |
| Nosema_AS(역방향) | GAGCAGGGTTCTAGGGAT | 2 | |
| 석고병 | ASP-S (정방향) | GCTGCCCATCAAGCACGG | 3 |
| ASP_AS(역방향) | CCTACAGAGCGGGTGACAAAG | 4 | |
| 백묵병 | ASCO-S (정방향) | ATTGCGCCCTCTGGTATTC | 5 |
| ASCO_AS(역방향) | CCACTAGAAGTAAATGATGGTTAGA | 6 |
| 질병명 | 프로브명 | 형광물질-염기서열(5' → 3') | 서열번호 |
| 노제마병 | Nosema_P(프로브) | FAM-CGTTACCCTTCGGGGAATCTTC | 7 |
| 석고병 | ASP_P(프로브) | JOE-TGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCTCTC | 8 |
| 백묵병 | ASCO_P(프로브) | TexasRed-GCTTGAGGGTTGCAATGACGCTCG | 9 |
상기 노제마병(Nosema)은 진균성 질병으로 1909년 Zander에 의해 처음으로 기록된 성충벌의 질병으로서, 이 질병에 걸린 꿀벌의 수명은 약 40% 감소하며 정상적인 활동을 하지 못한다.
노제마병의 원인체는 Nosema apis Zander, Nosema cerana 이며, 포자는 먹이와 함께 내장 위벽에 들어가 증식되면서 발병이 시작된다. 이 생식체는 포자를 형성하고 다시 세포벽에서 생활환을 되풀이하며, 일부는 배설물과 함께 몸 밖으로 나온다.
노제마병에 걸린 일벌들은 설사(설사를 하는 것처럼 노란 똥을 싸는 것을 보통 설사한다고 칭함)를 하면서, 건강한 꿀벌의 위장은 담갈색인 것에 비해 노제마병에 걸린 일벌들의 위장은 부푼 모양에다 유백색을 띤다. 이 병에 걸린 일벌의 날개는 시구가 흩어져 앞뒤 날개가 따로따로 떨어지고, 배가 부풀고 벌침은 신축성을 잃으며, 날지 못하고 느릿느릿 걷는다.
석고병(Stonebrood)은 성충 및 유충의 다량 폐사를 초래하고, 양봉농가의 생산성 저하를 유발할 수 있는 전염성 질병으로서, 병원체는 Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus 및 Aspergillus niger에 의한 진균성 질병이다.
이것은 꿀벌 유충을 검게 변하고 단단하게 하는데, 상기 진균은 다른 곤충, 조류 및 포유동물에게도 병원성이 있으며, 감염의 초기 단계에서 확인이 어려운 어려움이 있다.
백묵병(Chalkbrood)은 진균성 질병으로 성충 및 유충의 다량 폐사를 초래하고 양봉농가의 생산성 저하를 유발할 수 있고, 성충 및 유충의 다량 폐사를 초래하고 양봉농가의 생산성 저하를 유발할 수 있는 전염성 질병으로서, 곰팡이 균사(병원체; Ascosphaera apis)에 의해 생산된 침입성 진균증으로 자라나면서 유충에 영향을 준다.
상기 백묵병은 병원체인 곰팡이 균사(Ascosphaera apis)가 자라면서 유충의 체액이 말라 백묵과 같이 굳어지는 질병으로서, 늦은 봄이나 초여름 사이에 벌통의 출입구나 벌통 내의 바닥, 소방 그리고 벌통 주변에서 감염된 것들을 흔히 볼 수 있는데, 주로 일하는 벌이 덜 감염되고, 성체는 영향을 받지 않는다.
본 발명의 다른 형태에 따른 상기 프라이머 세트를 이용하여 꿀벌의 진균성 질병을 진단하는 방법에 관한 것이다.
상기 프라이머 세트를 이용하여 시료에서 추출한 DNA를 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)시켜 증폭하는 단계; 및
상기 단계에 의해 생성된 증폭산물의 Ct 값을 분석하여 꿀벌의 질병을 진단하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 꿀벌의 진균성 질병을 진단하는 방법에 관한 것이다.
상기 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)은 한 번의 실험으로 하나의 질병만을 진단할 수 있는 Single target RT-PCR법 보다 진일보한 다중 실시간 중합효소연쇄반응(Multiplex RT-PCR)법이 바람직하며, 다중 실시간 중합효소연쇄반응(Multiplex RT-PCR)법은 한 번에 여러 종의 질병을 동시에 진단할 수 있는 PCR법이다.
상기 Ct 값 분석하는 단계에서 Ct값이 35 이하면 양성으로 진단하는 것을 특징으로 하는 꿀벌의 진균성 질병을 진단하는 방법이다.
그러나, 상기 다중 실시간 중합효소연쇄반응(Multiplex RT-PCR)은 하나의 튜브 내에서 여러 종의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하기 때문에, 프라이머들 사이에 간섭 현상이 생길 수 있으며, 그 종류가 많아질수록 그 가능성은 높아지므로, PCR법을 수행하는데 여러 가지 조건을 수정하여 최적의 조건을 확립하는 것이 중요하다.
상기 꿀벌의 진균성 질병을 진단하는 방법에서, 상기 꿀벌의 질병은 노제마병, 석고병, 백묵병으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 꿀벌의 진균성 질병을 진단하는 방법에서, 상기 역전사 중합효소연쇄반응은 특정 DNA 단편을 선별적으로 증폭하는 방법으로서, 이에 대한 내용은 Miller, H. I. (WO 89/06700)에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.
본 발명의 상기 꿀벌의 진균성 질병을 진단하는 방법에서, 상기 역전사 중합효소연쇄반응은 다양한 DNA 중합효소가 증폭 반응에 이용될 수 있으며, 예컨대 E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우(Klenow) 단편", 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 꿀벌의 진균성 질병을 진단하는 방법에서, 바람직하게는, 상기 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus (Pfu)를 포함할 수 있다.
상기 꿀벌의 진균성 및 세균성 질병을 진단하는 방법에서, 증폭 반응액에는 dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), PCR 완충액(buffer) 및 DNA 중합 효소 조인자를 포함할 수 있다.
상기 꿀벌의 진균성 질병을 진단하는 방법에서, 중합효소연쇄반응에 의한 증폭 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다.
상기 꿀벌의 진균성 질병을 진단하는 방법에서, Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 하는 것이 바람직하다.
따라서, 상기 꿀벌의 진균성 질병을 진단하는 방법에서, 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명의 마지막 형태에 따른 상기의 프라이머 세트를 포함하는 꿀벌의 진균성 질병 진단용 키트에 관한 것이다.
진균성 질병 진단용 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 꿀벌의 세균성 및 기생충성 질병 진단용 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
상기 꿀벌의 진균성 질병 진단용 키트는 예컨대, 프라이머/프로브 믹스, 2X 마스터 믹스와 실시간 PCR 버퍼(real time PCR buffer)의 혼합액으로 이루어진 실시간 PCR 키트, 대조군 DNA로서 일정 농도로 희석된 양성 시료(꿀벌 플라스미드 DNA), 및 실시간 PCR 수행시에 사용하는 스트립 튜브의 뚜껑(flat cap)을 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 꿀벌의 주요 진균성 병원체 3종에 대한 민감도 테스트
3종(노제마, 석고병, 백묵병)의 각 병원체 프라이머가 증폭할 수 있는 최소 병원체 DNA 농도를 확인하기 위하여, single target PCR을 이용하여 각 병원체 프라이머의 민감도(sensitivity) 테스트를 수행하였다.
각각의 병원체 DNA를 10배로 단계 희석(10-3㎍/㎕ ~ 10-6㎍/㎕ 또는 10-1㎍/㎕ ~ 10-4㎍/㎕)한 후, 통상의 방법에 의한 PCR(conventional PCR) 및 실시간 PCR(real time PCR)을 수행하여 민감도 테스트를 한 결과를 표 3 내지 표 5에 도시하였으며, 민감도 테스트를 한 결과 그래프는 도 1a 내지 도 3b에 도시하였다.
| 노제마병(Nosema) | ||
| Serial Dilution # | Real-Time PCR | Conventional PCR |
| Ct value | Size | |
| 10-3 | 24.06 | 592bp |
| 10-4 | 27.85 | |
| 10-5 | 31.56 | |
| 10-6 | 36.40 | |
| 석고병(Stonebrood, Aspergillus flavus) | ||
| Serial Dilution # | Real-Time PCR | Conventional PCR |
| Ct value | Size | |
| 10-3 | 24.41 | 311bp |
| 10-4 | 27.42 | |
| 10-5 | 31.72 | |
| 10-6 | 34.85 | |
| 백묵병(Chalkbrood, Ascosphaera apis) | ||
| Serial Dilution # | Real-Time PCR | Conventional PCR |
| Ct value | Size | |
| 10-3 | 23.55 | 995bp |
| 10-4 | 26.69 | |
| 10-5 | - | |
| 10-6 | - | |
이때, 종래의 방법에 의한 PCR은 전변성 95℃, 5분; 40 싸이클의 변성 95℃, 30초; 신장; 확장 72℃, 10분으로 수행하였다.
상기 표 3 내지 표 5 및 도 1a 내지 도 3b에서 보는 바와 같이, 실시간 PCR의 경우 3종의 병원체 모두 높은 희석배수에서도 Ct 값이 35 이하로서 양성을 나타내는 바, 민감도가 우수함을 알 수 있다.
상기 Ct(threshold of cycle) 값은 원하는 유전자가 일정양 (초기 10배) 증폭되는 cycle 수를 의미하며 타켓 유전자가 많을수록 초기에 증폭된다. 즉 Ct 가 낮을수록 높은 감염이라고 생각할 수 있다. 따라서 타겟(병원체) 유전자가 얼마나(정량) 있는지 확인하기 위한 값이라고 판단 할 수 있다.
실시예 2. 꿀벌의 주요 진균성 병원체 3종에 대한 특이도 테스트
3종(노제마, 석고병, 백묵병)의 DNA 타겟 병원체의 특이도를 검증하기 위하여, 각각의 병원체 단독감염이 확인된 검체에 한하여 특이도(specificity) 테스트를 수행한 결과를 도 4 내지 도 6에 도시하였다.
이때, 백묵병의 경우 단독감염 검체가 없어 특이도 측정이 어려운 관계로 실험을 위하여 제작된 플라스미드 대조군(plasmid control)을 사용하였고, Ct 값을 기준으로 35 이하를 양성으로 판정하였다.
도 4 내지 도 5에서 보는 바와 같이, 3종의 병원체에 대한 특이도를 가지고 있음을 알 수 있다.
또한 본 발명은 한 test(tube) 내에서 3종(노제마, 석고병, 백묵병)을 동시에 진단할 수 있기 때문에, 확인하려는 시료가 2종 이상 교차 감염이 되었다고 하여도 동시 검출 및 진단이 가능하다.
실시예 3. 꿀벌의 주요 진균성 병원체 3종에 대한 정밀도(반복성) 테스트
3종(노제마, 석고병, 백묵병)의 DNA 타겟 병원체의 정밀도(반복성)을 확인하기 위하여, 각 병원체 DNA의 복제수를 10배 단위로 단계적으로 감소시킨 후(105 copies/Rx ~ 102 copies/Rx), 정밀도(반복성)을 테스트한 결과를 아래 표 6 내지 표8에 도시하였으며, 정밀도(반복성)을 테스트한 결과 그래프는 도 7a 내지 도 9c에 도시하였다.
도 7a 내지 도 9c에 3종(노제마, 석고병, 백묵병)의 정밀도(반복성) 그래프 결과는 1 내지 3차 모두 제시하였으며, 표 6 내지 표 8 에 Ct 값은 3종(노제마, 석고병, 백묵병)의 정밀도(반복성) 그래프 결과의 표준편차를 구해서 작성한 것이다.
| 노제마병(Nosema) | |
| Serial Dilution | Real-Time PCR |
| Ct value | |
| 105 copies/Rx | 23.1±0.43 |
| 104 copies/Rx | 27.2±0.36 |
| 103 copies/Rx | 30.6±0.13 |
| 102 copies/Rx | 34.4±0.35 |
| 석고병(Stonebrood, Aspergillus flavus) | |
| Serial Dilution | Real-Time PCR |
| Ct value | |
| 105 copies/Rx | 19.5±0.19 |
| 104 copies/Rx | 25.1±0.36 |
| 103 copies/Rx | 27.7±0.41 |
| 102 copies/Rx | 32.2±0.32 |
| 백묵병(Chalkbrood, Ascosphaera apis) | |
| Serial Dilution | Real-Time PCR |
| Ct value | |
| 105 copies/Rx | 24.4±0.20 |
| 104 copies/Rx | 27.5±0.19 |
| 103 copies/Rx | 31.7±0.14 |
| 102 copies/Rx | - |
상기 표 6 내지 표 8 및 도 7a 내지 도 9c에서 보는 바와 같이, 3종의 병원체 모두 102 내지 103 copies/Rx의 낮은 복제수에서도 Ct 값이 35 이하로서 양성을 나타내는 바, 정밀도(반복성)가 우수함을 알 수 있다.
상기 정밀도(반복성)은 실험을 첫 번째 수행했을 때와 두 번째, 세 번째 수행했을 때 모두 결과가 동일하다는 것을 보여주기 위한 것이다. 동일 날짜에 여러번 진행시에도 동일한 결과를 얻을 수 있는지, 키트 및 수행자가 정확한지, 안정적인지를 확인할 수 있다.
실시예 4. 꿀벌의 노제마병에 대한 정밀도(재현성) 테스트
노제마병의 DNA 타겟 병원체의 정밀도(재현성)을 확인하기 위하여, AFB 병원체 DNA의 복제수를 10배 단위로 단계적으로 감소시킨 후(105 copies/Rx ~ 102 copies/Rx), 정밀도(재현성)을 3회 테스트한 결과를 아래 표 9에 도시하였으며, 정밀도(재현성)을 3회 테스트한 결과 그래프는 도 10a 내지 도 10c에 도시하였다.
| 노제마병(Nosema) | |||
| Serial Dilution | Real-Time PCR (Ct value) | ||
| 1차_201707 | 2차_201710 | 3차_201801 | |
| 105 copies/Rx | 22.5 | 23.6 | 23.3 |
| 104 copies/Rx | 26.9 | 27.2 | 27.2 |
| 103 copies/Rx | 30.3 | 30.6 | 30.8 |
| 102 copies/Rx | 33.9 | 33.8 | 34.1 |
상기 표9 및 도 10a 내지 도 10c에서 보는 바와 같이, 노제마의 경우 102 copies/Rx의 낮은 복제수에서도 Ct 값이 35 이하로서 양성을 나타내는 바, 정밀도(재현성)가 우수함을 알 수 있다.
상기 정밀도(재현성)은 실험을 첫 번째 수행했을 때와 두 번째, 세 번째 수행했을 때 모두 결과가 동일하다는 것을 보여주기 위한 것이다. 상기 정밀도(반복성)과의 차이는 다른 날짜에 반복 실험을 한다는 것이다. 다른 날짜에 여러번 진행시에도 동일한 결과를 얻을 수 있는지, 키트 및 수행자가 정확한지, 안정적인지를 확인할 수 있다.
실시예 5. 꿀벌의 석고병에 대한 정밀도(재현성) 테스트
석고병의 DNA 타겟 병원체의 정밀도(재현성)을 확인하기 위하여, 석고병 병원체 DNA의 복제수를 10배 단위로 단계적으로 감소시킨 후(105 copies/Rx ~ 102 copies/Rx), 정밀도(재현성)을 3회 테스트한 결과를 표 10에 도시하였고, 정밀도(재현성)을 3회 테스트한 결과 그래프는 도 11a 내지 도 11c에 도시하였다.
| 석고병(Stonebrood, Aspergillus flavus) | |||
| Serial Dilution | Real-Time PCR (Ct value) | ||
| 1차_201707 | 2차_201710 | 3차_201801 | |
| 105 copies/Rx | 19.5 | 19.9 | 19.5 |
| 104 copies/Rx | 25.1 | 24.8 | 24.9 |
| 103 copies/Rx | 28.4 | 28.2 | 28.1 |
| 102 copies/Rx | 32.4 | 32.8 | 32.5 |
상기 표 10 및 도 11a 내지 도 11c에서 보는 바와 같이, 석고병의 경우 102 copies/Rx의 낮은 복제수에서도 Ct 값이 35 이하로서 양성을 나타내는 바, 정밀도(재현성)가 우수함을 알 수 있다.
실시예 6. 꿀벌의 백묵병에 대한 정밀도(재현성) 테스트
백묵병의 DNA 타겟 병원체의 정밀도(재현성)을 확인하기 위하여, 백묵병 병원체 DNA의 복제수를 10배 단위로 단계적으로 감소시킨 후(105 copies/Rx ~ 102 copies/Rx), 정밀도(재현성)을 3회 테스트한 결과를 표 11에 도시하였으며, 정밀도(재현성)을 3회 테스트한 결과 그래프는 도 12a 내지 도 12c에 나타내었다.
표 10에 결과 값 중에 10-2 은 증폭이 없어 Ct 값을 기재하지 않았습니다.
| 석고병(Stonebrood, Aspergillus flavus) | |||
| Serial Dilution | Real-Time PCR (Ct value) | ||
| 1차_201707 | 2차_201710 | 3차_201801 | |
| 105 copies/Rx | 24.2 | 24.1 | 24.4 |
| 104 copies/Rx | 27.9 | 27.8 | 27.9 |
| 103 copies/Rx | 31.7 | 31.9 | 31.6 |
| 102 copies/Rx | - | - | - |
상기 표 11 및 도 12a 내지 도 12c에서 보는 바와 같이, 백묵병의 경우 103 copies/Rx의 낮은 복제수에서도 Ct 값이 35 이하로서 양성을 나타내는 바, 정밀도(재현성)가 우수함을 알 수 있다.
실시예 7. 임상적 민감도 테스트
꿀벌 임상시료 111건을 대상으로 하여, 상기 방법으로 실시간 PCR(real time PCR) 및 통상의 PCR(conventional PCR)을 수행하여, 3종(노제마, 석고병, 백묵병)의 병원체에 대한 민감도를 테스트한 결과를 하기 표 12에 나타내었다.
| 검체 수 | ＜ Ct.35 | C_PCR 결과 | 민감도 증가율 | |
| Nosema | 111개 | 15 개 | 11 개 | 36% 증가 |
| A.flavus | 111개 | 1 개 | 0 개 | 검출 가능해짐 |
| A.apis | 111개 | 12 개 | 7 개 | 71% 증가 |
상기 표 1에서 보는 바와 같이, 실시간 PCR(RT-PCR)의 경우 통상의 PCR에 비하여, 민감도가 현저하게 우수함을 알 수 있다.
본 발명은 상기와 같은 실시예들을 통해 기존에 uniplex PCR로 진행되던 국내 병성감정방법을 민감하고 실시간 정량이가능한 multiplex 진단방법으로 개발한 것을 확인하였으며, 이를 통해 국내 꿀벌질병의 모니터링 및 초기 진단을 가능하게 하여 꿀벌질병의 진단 및 예방 등 활용 연구에 유용하게 사용하고자 한다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 기존에 uniplex PCR로 진행되던 국내 병성감정방법을 민감하고 실시간 정량이가능한 multiplex 진단방법으로 개발한 것으로, 국내 꿀벌질병의 모니터링 및 초기 진단을 가능하게하여 꿀벌질병의 진단 및 예방 등 활용 연구에 유용하게 사용하고자 한다.
Claims (9)
- 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍; 및 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는, 꿀벌의 진균성 질병 진단용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서,
상기 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 노제마병 진단용인 것을 특징으로 하는 꿀벌의 진균성 질병 진단용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서,
상기 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 석고병 진단용인 것을 특징으로 하는 꿀벌의 진균성 질병 진단용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서,
상기 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 백묵병 진단용인 것을 특징으로 하는 꿀벌의 진균성 질병 진단용 프라이머 세트.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 이용하여 시료에서 추출한 DNA를 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)시켜 증폭하는 단계; 및
상기 단계에 의해 생성된 증폭산물의 Ct 값을 분석하여 꿀벌의 질병을 진단하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 꿀벌의 진균성 질병을 진단하는 방법.
- 제5항에 있어서,
상기 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)은 다중 실시간 중합효소연쇄반응(Multiplex RT-PCR)인 것을 특징으로 하는 꿀벌의 진균성 질병을 진단하는 방법.
- 제5항에 있어서,
상기 Ct 값 35이하를 양성으로 진단하는 것을 특징으로 하는 꿀벌의 진균성 질병을 진단하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는 꿀벌의 진균성 질병을 진단하는 방법.
- 제8항에 있어서,
상기 꿀벌의 진균성 질병은 노제마병, 석고병 및 백묵병으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 꿀벌의 진균성 질병을 진단하는 방법.
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