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Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Behandeln von Chromatographieträgern, Elektrophoreseträgern und Blotträgern, wobei die zur Behandlung verwendeten Flüssigkeiten hinsichtlich benötigtem Volumen für die Behandlung des Trägermaterials minimiert und hinsichtlich Standardisierung der Behandlung der Trägermaterialien mit den Flüssigkeiten und einfacher und sicherer Handhabung der Flüssigkeiten optimiert sind.
Die analytische Auftrennung von Substanzgemischen kann unter Zuhilfenahme der Dünnschichtchroma- tographie, die analytische Auftrennung von Proteingemischen kann unter Zuhilfenahme der Elektrophorese erfolgen.
Die Sichtbarmachung der Fraktionen auf dem Dünnschichtchromatographieträger erfolgt entweder durch Verwendung von UV-Licht bestimmter Wellenlänge, das auf den Fluoreszenzindikator, der im Chromatogra- phiematenal enthalten ist, abgestimmt ist, oder durch Behandeln des Chromatographieträgers mit chemischen Substanzen, die spezifisch oder unspezifisch mit den Fraktionen auf dem Chromatographieträger reagieren.
Die Sichtbarmachung der Fraktionen auf dem Elektrophoreseträger erfolgt entweder durch Behandlung des Elektrophoreseträgers mit chemischen Substanzen, die spezifisch oder unspezifisch mit den Fraktionen auf dem Eiektrophoreseträger reagieren. Die Fraktionen können aber auch auf ein weiteres Trägermaterial übertragen werden (beispielsweise durch blotten auf eine Nitrocellulosemembran), wo sie dann mit chemischen oder biologischen Substanzen behandelt werden und mit diesen spezifisch oder unspezifisch reagieren.
Übliche Chromatographieträger sind dünne Schichten von Kieselgelen, Aluminiumoxiden oder ähnlichem, aufgebracht auf ein Trägermaterial wie beispielsweise auf eine Glasplatte, eine Aluminiumfolie oder eine Kunststoffolie. Übliche Grössen der verwendeten Chomatographieträger sind z. B. (in cm) : 5x20,10x10, 20x20 oder auch jede andere Grösse, die bei Verwendung von dünnem, schneidbarem Trägermaterial unter Verwendung eines geeigneten Schneidegerätes hergestellt werden kann.
Übliche Elektrophoreseträger sind Gele (z. B. Agarosegele, Polyacrylamidgele), die entweder mit Trägermaterialien verbunden sind oder ohne zusätzlichen Träger eingesetzt werden können.
Die Gele können beispielsweise auf Folien aufpolymerisiert sein ; auf einzelne Platten (für horizontale Elektrophorese) oder zwischen 2 Platten gegossen (für vertikale Elektrophorese) sein. Übliche Grössen der
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sind beispielsweise Nitrocellulosemembranen. Diese können in jeder gewünschten Grösse mit einer Schere oder einem Schneidegerät zugeschnitten werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren und die dafür geeignete Vorrichtung sind für alle genannten Chromatographieträger, Elektrophoreseträger und Blotträger geeignet.
Analytische Trennungen von Substanzgemischen unter Zuhilfenahme von Dünnschichtchromatographieträgern erfolgen meist in der Weise, dass die für die Auftrennung erforderliche Menge des flüssigen Trennmittels in eine Kammer (vorzugsweise aus Glas oder durchsichtigem Kunststoffmaterial), in die der Träger vollständig hineinpasst, hineingefüllt wird, der Träger mit der aufgebrachten zu trennenden Substanz in die Kammer gestellt wird und die Kammer mit einem Deckel verschlossen wird, um das Austrocknen des Chromatographieträgers während des Trennungsvorganges zu vermeiden. Hat das Trennmittel die gewünschte Strecke auf dem Chromatographieträger durchflossen, dann wird der Träger aus der Kammer genommen und das auf dem Träger befindliche Trennmittel durch Verdampfen entfernt.
Das noch in der Kammer vorhandene überschüssige Trennmittel muss entsprechend durch Ausleeren der Trennkammer entfernt werden.
Das Sichtbarmachen der aufgetrennten Fraktionen erfolgt, sofern es sich um chemische Umsetzungen mit einem spezifischen oder unspezifischen Reagenz handelt, durch Eintauchen des Chromatographieträgers in eine entsprechend grosse Menge flüssiges Reagenz. Dazu wird der Chromatographieträger, sofern es sich um einen starren Träger handelt, in eine Vorrichtung montiert, die es gestattet, nachfolgend den Chromatographieträger langsam in das darunter befindliche Gefäss mit dem spezifischen oder unspezifischen Umsetzungsreagenz einzutauchen und nach ausreichender Benetzung des Chromatographiematerials mit dem Reagenz den Träger mit Hilfe der Vorrichtung wieder aus dem Reagenz herauszuziehen und über dem Tauchbad das überschüssige Reagenz von dem Träger abrinnen zu lassen. Anschliessend wird der Chromatographieträger entsprechend getrocknet und ausgewertet.
Das Sichtbarmachen der unter Zuhilfenahme der Elektrophorese aufgetrennten Proteinfraktionen kann auf dem Elektrophoreseträger direkt erfolgen durch Umsetzung der Fraktionen mit chemischen Substanzen. Dazu sind meist mehrere Umsetzungsschritte notwendig, die durch Waschschritte voneinander getrennt sind.
Bei der am häufigsten verwendeten Methode zur Sichtbarmachung von Proteinfraktionen auf Elektrophoreseträgern werden die Elektrophoreseträger für die einzelnen Schritte der Behandlung manuell aus einem
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Flüssigkeitsbehälter in den nächsten gebracht und darin von Hand oder auf einem Schütteigerät bewegt.
Es gibt aber auch Geräte, die diesen Vorgang automatisch ausführen.
So wird im US-Patent Nr. 4 391 689 ein Gerät beschrieben, das eine grosse Anzahl von Wannen aufweist, die die für die einzelnen Schritte der Sichtbarmachung der Proteinfraktionen vorgesehenen Flüssigkeiten enthalten. In diesem Gerät wird der Elektrophoreseträger mechanisch von einer Wanne in die nächste transportiert.
Das US-Patent Nr. 4 222 843 beschreibt ein Gerät. bestehend aus einer Trommel und einer darunter befindlichen Wanne. Der Elektrophoreseträger wird auf der Trommel fixiert und in die für die Sichtbarmachung der Proteinfraktionen vorgesehenen Flüssigkeiten, die in der Wanne nacheinander vorgelegt werden, eingetaucht.
WO 87/05111 beschreibt ein Gerät für die Behandlung von Elektrophoreseträgern, das aus einem Behälter mit einer drehbaren Haltevorrichtung auf seinem Deckel besteht. In diese, in den Behälter hineinweisende Haltevorrichtung wird der Elektrophoreseträger eingespannt und während der Behandlung mit den vorgesehenen Flüssigkeiten, die nacheinander im Behälter vorgelegt werden, gedreht.
EP 0 435 074 A2 beschreibt ein Gerät, bestehend aus einem Behälter, in dem die einzelnen Flüssigkeiten zur Sichtbarmachung der Proteinfraktionen auf einem Elektrophoreseträger nacheinander vorgelegt werden. Hierbei ist jedoch keine Fixierung des Trägers notwendig, da die von unten nach oben durch den Behälter strömende Flüssigkeit den Elektrophoreseträger aufgrund seines Gewichtes in der Flüssigkeit schwebend hält und diesen somit aufallen Seiten gleichmässig umströmen kann. Werden Haltevorrichtungen für den Elektrophoreseträger verwendet, kann die Flüssigkeit auch horizontal durch den Behälter fliessen.
Das Sichtbarmachen der mit Elektrophorese aufgetrennten Proteinfraktionen kann aber auch unter Zuhilfenahme von Blotfolien wie beispielsweise Nitrocellulosemembranen erfolgen. Bei diesem Verfahren werden die aufgetrennten Proteinfraktionen vom gelartigen Elektrophoreseträger auf eine geeignete Nitrocellulosemembran unter Zuhilfenahme des elektrischen Stromes übertragen. Die nun auf der Membran befindlichen Proteinfraktionen werden durch Umsetzung der Fraktionen zuerst meist mit biologischen Substanzen und daran anschliessend durch Umsetzung mit chemischen Substanzen sichtbar gemacht.
Die Vorgangsweise ist bei dieser Methode ebenfalls ein diskontinuierliches Verfahren, bei dem die Nitrocellulosemembran manuell für die einzelnen Schritte der Behandlung aus einem Flüssigkeitsbehälter in den nächsten gebracht wird und darin von Hand oder auf einem Schütteigerät bewegt wird.
Bei allen diesen genannten Verfahren kann die bei der Behandlung der Träger benötigte beziehungsweise die vom Trägermaterial aufgenommene Flüssigkeitsmenge nur ungefähr abgeschätzt werden. Bei der Sichtbarmachung von Proteinblots kann beispielsweise das für die Sichtbarmachung einzusetzende Volu- men und die Konzentration der zur Verfügung stehenden spezifischen Antikörperlösung limitiert sein.
Bei dem erfindungsgemässen Verfahren zum Behandeln von Chromatographieträgern, Elektrophoreseträgern
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der Behandlung im gleichen Gefäss. Die jeweils erforderliche Flüssigkeit wird in das Gefäss zugeführt und nach erfolgter Behandlung wieder entfernt. Falls es sich um einen länger andauernden Behandlungsschritt handelt wie beispielsweise bei der Behandlung von Eiektrophoreseträgern und Blotträgern, kann die Flüssigkeit auch mehrmals hintereinander durch den Behälter und somit am Elektrophoreseträger oder am Blotträger entlanggleitet werden. Die in den Behälter zugeführte Flüssigkeit kann entweder ständig erneuert oder im Kreis geführt werden.
Der Vorteil der Erfindung besteht darin, dass die für die Behandlung von Chromatographieträgern, Elektrophoreseträgern und Blotträgern notwendigen Flüssigkeitsmengen auf wenige Milliliter minimiert werden.
Dadurch können auch Reagenzien zur Behandlung herangezogen werden, die - wie beispielsweise biologische Substanzen - oft nur in sehr geringer Menge zur Verfügung stehen. Nach erfolgter Behandlung der Träger kann die verwendete Flüssigkeit nahezu vollständig und nahezu ohne Verdünnung durch eine Spülflüssigkeit aus dem Behälter abgesaugt und einer ordnungsgemässen Entsorgung zugeführt werden.
Zur Standardisierung von Färbungen, beispielsweise für quantitative Auswertungen, kann das vom Trägermaterial aufgenommene Flüssigkeitsvolumen durch Differenzbildung zwischen Ausgangsvolumen und abgesaugtem Volumen auf einfache Weise ermittelt werden.
Die erfindungsgemässe Vorrichtung zum Behandeln von Chromatographieträgern, Elektrophoreseträgern und Btotträgern, auf denen die Proben beziehungsweise die Fraktionen der Proben vorliegen, besteht aus einem Behälter, der für eine diskontinuierliche Behandlungsweise der Chromatographieträger, Elektrophoreseträger und Blotträger eine Öffnung in Behälterbodennähe aufweist, die sowohl als Zufluss als auch als Abfluss dient. In diesem Fall wird jene Flüssigkeitsmenge dem Behälter durch die Öffnung zugeführt, die notwendig ist. damit der vom Anwender erwünschte Teil des Chromatographieträgers, Elektrophoreseträgers oder Blotträger mit Flüssigkeit benetzt ist.
Nach ausreichender Einwirkungszeit wird die Flüssigkeit aus
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dem Behälter wieder herausgesaugt und entsorgt. Die Flüssigkeiten in der Kammer unterliegen Im wesentlichen einer vertikalen Bewegungsrichtung, wobei die Fliessrichtung bei Flüssigkeitszufluss von unten nach oben und bei Abfluss von oben nach unten gerichtet ist.
Wird die Vorrichtung hingegen im kontinuierlichen Verfahren eingesetzt, so weist das Gefäss zwei einander gegenüberliegende Öffnungen auf, wobei die in Behälterbodennähe angeordnete als Zufluss und die in der Nähe des oberen Behälterrandes als Abfluss für die zur Behandlung verwendeten Flüssigkeiten dient. Die Flüssigkeiten durchströmen hierbei den von Zufluss und Abfluss begrenzten Teil des Behälters. Die Strömungsrichtung der Flüssigkeiten ist im wesentlichen vertikal von unten nach oben orientiert.
Anhand der folgenden Beschreibungen der Figuren 1 bis 5 und der Beispiele wird das Verfahren, die Vorrichtung und die Funktion der Vorrichtung erläutert, ohne die Erfindung auf diese Figuren und Beispiele einzuschränken.
Figur 1 stellt eine einfache Ausführungsform der erfindungsgemässen Vorrichtung für die diskontinuierliche Behandlung von jeweils einem Chromatographieträger, Elektrophoreseträger oder Blotträger dar. Diese Vorrichtung besteht aus einem quaderförmigen Gefäss, das mit einer Öffnung in der Nähe des Gefässbodens
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Behandlung der Chromatographieträger, Elektrophoreseträger oder Blotträger können mit einer Spritze, die in die Zu- und Abflussöffnung eingesetzt wird, in den Behälter eingebracht und anschliessend wieder herausgesaugt werden.
Die Flüssigkeiten können aber auch über ein Zuleitungsrohr, das in die Zu- und Abflussöffnung eingesetzt wird, in den Behälter, beispielsweise unter Zuhilfenahme einer Pumpe, eingeleitet und aus diesem wieder, durch Umkehrung der Pumprichtung der Pumpe, herausgesaugt werden. Die Vorgangsweise kann bei der Auftrennung von Substanzgemischen auf Chromatographieträgern, bei der Sichtbarmachung von aufgetrennten Fraktionen auf Chromatographieträgern, Elektrophoreseträgern und Blotträgern angewandt werden.
Wird die Vorrichtung zum Auftrennen von Substanzgemischen auf Chromatographieträgern verwendet, so empfiehlt es sich, das quaderförmige Gefäss mit einem Deckel zu versehen, damit das Trennmittel vom Chromatographieträger nicht verdampfen kann.
Figur 2 stellt eine einfache Ausführungsform der erfindungsgemässen Vorrichtung für die kontinuierliche Behandlung von Chromatographieträgern, Elektrophoreseträgern und Blotträgern dar. Diese Vorrichtung besteht aus einem quaderförmigen Gefäss, das mit einer Zuflussöffnung (1) und mit einer Abflussöffnung (2) versehen ist. Die Flüssigkeiten für die kontinuierliche Behandlung der Chromatographieträger, Elektrophoreseträger und Blotträger können beispielsweise mit einer Pumpe über ein Zuleitungsrohr, das In die Zuflussöffnung eingesetzt wird, in den Behälter eingebracht werden. Die Flüssigkeiten durchströmen den von der Zuflussöffnung und der Abflussöffnung begrenzten Teil des Behälters.
In diesem Fall wird die bereits in den Behälter eingeleitete Flüssigkeit durch die nachströmende Flüssigkeit aus dem Behälter wieder verdrängt. Auch bei dieser Vorgangsweise kann der Behälter mit einem Deckel zum Schutz vor dem Verdampfen der Flüssigkeiten versehen werden.
Die Gefässgrösse wird so gewählt, dass der gewünschte Teil des Chromatographieträgers, Elektrophoreseträgers oder Blotträgers von den zubehandelnden Flüssigkeiten vollständig benetzt wird. Wenn die Vorrichtung gemäss Figur 1 oder Figur 2 für das Behandeln eines Chromatographieträgers, Elektrophoreseträgers oder Blotträgers der Grösse 10x10 cm verwendet werden soll, ist es zweckmässig, einen Behälter mit etwa folgenden Massen zu verwenden : innere Breite des Behälters : 110 mm innere Höhe des Behälters : 120 mm innere Tiefe des Behälters : 4 mm Zufluss-/Abflussrohr für diskontinuierliche Behandlung : unmittelbar oberhalb des Behälterbodens, Zuflussrohr für kontinuierliche Behandlung :
unmittelbar oberhalb des Behälterbodens, Abflussrohr für kontinuierliche Behandlung : 110 mm oberhalb des Behälterbodens.
Figur 3 zeigt eine Variante der erfindungsgemässen Vorrichtung für die kontinuierliche Behandlungsweise. Diese besteht aus dem quaderförmigen Behälter mit einander gegenüberliegenden Zu- (3) und Abflussöffnungen (4) entsprechend der Figur 2. Zusätzlich weist der Behälter jedoch eine weitere Abflussöffnung (5) In Behälterbodennähe auf, die dazu dient, dass bei der kontinuierlichen Behandlungswelse das Gefäss vollständig entleert werden kann, ohne dass die bereits im Behälter befindlichen Behandlungsflüssigkeiten durch die Zuflussöffnung abfliessen müssen.
Figur 4 zeigt eine weitere Vanante der erfindungsgemässen Vorrichtung für kontinuierliche und diskontinuierliche Behandlungsweise. Diese besteht aus dem quaderförmigen Behälter mit einer Zufluss-/Abflussöff- nung, wie in Figur 1 beschrieben, oder zwei gegenüberliegenden Öffnungen für getrennten Zufluss und Abfluss, wie in Figur 2 beschrieben. In dieser Ausführung ist aber der Boden V-förmig ausgebildet und die zu Figur 1 analoge Zufluss-/Abflussöffnung (Figur 4a) oder die zu Figur 3 analoge Abflussöffnung (5) (Figur 4b)
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befindet sich an der tiefsten Stelle des Behälterbodens, damit die nach den jeweiligen Behandlungsschritten im Behälter befindliche Flüssigkeit vollständig aus dem Behälter ausfliessen kann.
Figur 5 und Figur 6 zeigen jeweils eine Haltevorrichtung, damit der Behälter während der Behandlung eines Chromatographieträgers, Elektrophoreseträgers oder Blotträgers senkrecht oder nahezu senkrecht steht.
Beispiel 1 :
Als Beispiel für die Verwendung der erfindungsgemässen Vorrichtung mit diskontinuierlicher Behandlungsweise wird die chromatographische Auftrennung einer Allantoinlösung mit nachfolgender Sichtbarmachung der getrennten Substanzen beschrieben : Von der vorbereiteten Lösung der zu untersuchenden Allantoinlösung werden mit einer Spritze etwa 10 bis 20 ti) punktförmig auf der Startlinie (in der Nähe des unteren Randes) der Kieselgel-Dünnschichtchromatographieplatte aufgetragen und gut eintrocknen gelassen. Dann wird die Platte mit der aufgetragenen Probe so in das Gefäss gestellt, dass sich die Startlinie auf der Platte in der Nähe des Gefässbodens befindet.
Nun wird das Laufmittel (die Chromatographierflüssigkeit : n-Butanol:Eisessig:Wasser = 80:20:20) mit einer, in die Zufluss-/Abflussöffnung passenden Spritze aufgesaugt, die Spritze in die Zufluss-/Abflussöffnung gesteckt und so viel Laufmittel in das Gefäss gebracht, dass die Dünnschichtchromatographieplatte bis zur Hälfte der Distanz vom unteren Plattenrand bis zur Startlinie von Laufmittel umgeben ist. Die Spritze verbleibt während der ganzen folgenden Vorgangsweise in der Zufluss-Abflussöffnung stecken. Dann wird der Deckel auf das Gefäss aufgesetzt und das Laufmittel wandert durch Diffusion die Chromatographieplatte entlang bis zum gewünschten Chromatographieendpunkt, in diesem Fall etwa 8, 5 cm vom unteren Plattenrand entfernt.
Nun wird die Platte aus dem Gefäss herausgenommen und unter Verdampfen des Laufmittels getrocknet. Die im Gefäss verbliebene Flüssigkeit wird mit der Spritze vollständig aus dem Gefäss gesaugt und entsprechend entsorgt. Mit einer Spritze wird nun durch die Zufluss-/Abflussöffnung Wasser oder eine andere Spülflüssigkeit in das Gefäss gefüllt um eventuell noch vorhandene Laufmittelreste abzuspülen und durch Aussaugen der Spülflüssigkeit aus dem Gefäss zu entfernen.
Wenn die Chromatographieschicht der Platte vollständig getrocknet ist, kann die Behandlung der Platte zur Sichtbarmachung der Substanz (beispielsweise als Identitätsprüfung) erfolgen. Dazu wird die Platte wieder in das Gefäss zur diskontinuierlichen Behandlung für Chromatographieträger, Elektrophoreseträger oder Blotträger so hineingestellt, dass sich wiederum die Startlinie möglichst nahe beim Gefässboden befindet.
Nun wird das Nachbehandlungsreagenz :, das"Färbemittel"für die Substanz (in diesem Fall : p-Dimethyla- minobenzaldehyd in 1n Salzsäure) mit einer in die Zufluss-/Abflussöffnung passenden Spritze aufgesaugt, die
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dem Gefäss gesaugt, eventuell die Differenz zur ursprünglichen Flüssigkeitsmenge festgestellt und die Flüssigkeit entweder für eine weitere"Färbung"aufbewahrt oder entsorgt.
Die auf diese Weise behandelte Platte wird getrocknet und entsprechend den Auforderungen ausgewertet.
Beispiel 2 :
Als Beispiel für die Verwendung der erfindungsgemässen Vorrichtung zur Behandlung von Chromatogra-
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Gerätes gemäss Figur 3 beschrieben : Das Gel wird nach Beendigung der elektrophoretischen Trennung in das Gefäss gelegt (bel vertikaler Elektrophorese : ohne Trägerplatte). Die Färbelösung (Coomassie-Blau-Lösung) wird unter Druck (durch eine Pumpe) durch die Zuflussöffnung (3) zugeführt und durch nachfolgende Färbelösung durch die Abflussöffnung (4) aus dem Gefäss wieder herausgedrängt. Durch einen Verbindungsschlauch zwischen Zuflussöffnung (3) und Abflussöffnung (4) mit zwischengeschalteter Pumpe wird die Färbelösung etwa 20 bis 30 Minuten im Kreis gepumpt und anschliessend durch die zusätzliche Abflussöffnung (5) in Bodennähe des Gefässes vollständig aus dem Gefäss entfernt.
Daran anschliessend wird die Entfärbelösung (bestehend aus Methanol-Eisessig-Wasser) durch die Zuflussöffnung (3) unter Druck in das Gefäss zugeführt und durch nachfolgende Flüssigkeit wieder durch die Abflussöffnung (4) in der Nähe des oberen Gefässrandes herausgedrängt. Durch den Verbindungsschlauch zwischen Zuflussöffnung (3) und Abflussöffnung (4) kann
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deutlich geringer wird, so kann frische Entfärbelösung in das Gefäss zugeführt werden und die gebrauchte Entfärbelösung durch die Abflussöffnung (5) aus dem Kreislauf entfernt werden. Dieser Entfärbevorgang wird so lange durchgeführt, bis der Untergrund annähernd farblos ist.
Dann wird die Entfärbelösung durch die Abflussöffnung (5) vollständig aus dem Gefäss entfernt. Anschliessend wird eine 2 %ige wässrige Glycerinlösung durch die Zuflussöffnung (3) in das Gefäss gepumpt und durch weitere nachfolgende Glycerinlösung wiederum durch die Abflussöffnung (4) in der Nähe des oberen Gefässrandes herausgedrängt. Durch den Verbindungsschlauch zwischen Zuflussöffnung (3) und Abflussöffnung (4) wird diese Flüssigkeit ca. 20 Minuten im Kreis geführt und anschliessend durch die Abflussöffnung (5) in der Nähe des Gefässbodens aus dem Gefäss vollständig entfernt. Nun wird das Gel aus dem Gefäss genommen und getrocknet.
Beispiel 3 :
Als weiteres Beispiel wird die Sichtbarmachung der von einem Elektrophoresegel auf eine Nitrocellulosemembran übertragenen Proteinbanden unter Verwendung der Vorrichtung gemäss Figur 3 beschrieben : Die Proteinbanden auf dem Elektrophoresegel werden unter Zuhilfenahme des elektrischen Stromes auf eine Nitrocellulosemembran übertragen (geblottet). Nun wird die Nitrocellulosemembran in das Gefäss gelegt und die Lösung mit dem identifizierenden Antikörper unter Druck durch die Zuflussöffnung (3) in das Gefäss geführt und durch weitere nachfolgende antikörperhältige Lösung durch die Abflussöffnung (4) in der Nähe des oberen Gefässrandes aus dem Gefäss herausgedrängt.
Durch einen Verbindungsschlauch zwischen Abflussöffnung (4) und Zuflussöffnung (3) mit dazwischengeschalteter Pumpe wird die antikörperhältige Lösung ca. 20 Minuten im Kreis gepumpt und danach durch die Abflussöffnung (5) in der Nähe des Gefässbodens vollständig abgezogen. Nun wird die Waschlösung durch die Zuflussöffnung (3) zugeführt und ca. 5 Minuten über den Verbindungsschlauch zwischen Abflussöffnung (4) und Zuflussöffnung (3) im Kreis geführt. Dann wird sie durch die Abflussöffnung (5) vollständig aus dem Gefäss entfernt. Danach wird die Lösung mit dem nachweisenden Antikörper unter Druck durch die Zuflussöffnung (3) in das Gefäss geführt und durch weitere nachfolgende antikörperhältige Lösung durch die Abflussöffnung (4) in der Nähe des oberen Gefässrandes aus dem Gefäss herausgedrängt.
Durch den Verbindungsschlauch zwischen Abflussöffnung (4) und Zuflussöffnung (3) wird die antikörperhältige Lösung ca. 20 Minuten im Kreis gepumpt und danach durch die Abflussöffnung (5) in der Nähe des Gefässbodens vollständig abgezogen. Nun wird die Waschlösung durch die Zuflussöffnung (3) zugeführt und ca. 5 Minuten über den Verbindungsschlauch zwischen Abflussöffnung (4) und Zuflussöffnung (3) im Kreis geführt. Dann wird sie durch die Abflussöffnung (5) vollständig aus dem Gefäss entfernt.
Daran anschliessend wird das"Färbereagenz". mit dem das an den nachweisenden Antikörper gekoppelte Enzym reagiert, durch die Zuflussöffnung (3) unter Druck in das Gefäss geleitet und von nachfolgendem Färbereagenz durch die in der Nähe des oberen Gefässrandes befindliche Abflussöffnung (4) wieder aus dem Gefäss herausgedrängt. Durch den Verbindungsschlauch zwischen Abflussöffnung (4) und Zuflussöffnung (3) wird die Färbelösung so lange im Kreis gepumpt, bis die nachzuweisenden Banden auf der Nitrocellulose ausreichend gefärbt sind. Danach wird die Färbelösung durch die Abflussöffnung (5) in der Nähe des Gefässbodens vollständig abgezogen. Die Nitrocellulosemembran wird aus dem Gefäss genommen und getrocknet.
Die Beispiele können analog auch unter Verwendung anderer Dünnschichtchromatographieträger, Elektrophoreseträger oder Blotträger ausgeführt werden.
Die erfindungsgemässe Vorrichtung kann in vieler Hinsicht abgewandelt werden. Die in den obigen Beispielen beschriebene Zuflussöffnung kann auch aus mehreren Öffnungen bestehen, die entweder nur auf einer Geräteseite oder auch auf beiden Geräteseiten angebracht sein können. Ebenfalls kann auch die in der Nähe des oberen Geräterandes befindliche Abflussöffnung aus mehreren Öffnungen bestehen, die entweder nur auf einer Geräteseite oder auch auf beiden Geräteseiten angeordnet sein können.
Die Grösse der Vorrichtung wird entsprechend der Grösse der verwendeten Chromatographieträger, Elektrophoreseträger oder Blotträger gewähit. Wenn Chromatographieträger, Elektrophoreseträger oder Blotträger sehr unterschiedlicher Grösse in der selben Vorrichtung nach Figur 2 oder Figur 3 behandelt werden sollen, ist es zweckmässig, den Abfluss (4) in der Nähe des oberen Gefässrandes so zu gestalten, dass die Höhe des Flüssigkeitsstandes im Gefäss mit der Grösse des Chromatographieträgers, Elektrophoreseträgers oder Blotträgers variiert werden kann.
Das ist beispielsweise dadurch zu erreichen, dass in unterschiedlicher Höhe des Gefässes Abflussöffungen vorgesehen sind, die jeweils entsprechend der Grösse des gewählten Chromatographieträgers, Elektrophoreseträgers oder Blotträgers aktiviert werden.
Die beschriebenen Behandlungsverfahren können auch automatisiert werden, indem die Regelung des Zuflusses und Abflusses und des jeweiligen Volumens der einzelnen Flüssigkeiten über ein geeignetes Steuergerät (Datenverarbeitungsgerät) erfolgt.