AT403098B - Antikörper zum nachweis und zur unterscheidung von verkürzten und nicht verkürzten formen von chemokinen - Google Patents

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   <Desc/Clms Page number 1> 
 



   Chemokine sind Polypeptide mit einem Molekulargewicht von etwa 7000 Dalton. Diese Proteine sind an der   Entwicklung entzündlicher Reaktionen   beteiligt, insbesondere an der Anlockung von Zellen, die an entzündlichen Prozessen beteiligt sind, in Geweberegionen, in denen entzündliche Prozesse initiiert oder unterhalten werden. Des weiteren wurde gezeigt, dass Chemokine die an der Entzündung beteiligten Zellen aktivieren und deren Wachstum fördern. Dies gilt auch für Zellen der Hämatopoese. 



  Die Familie dieser Proteine wird In zwei   Unterfamilien   eingeteilt. Die erste Unterfamilie enthält solche Chemokine, die zwischen den ersten belden Cysteinen eine einzige beliebige Aminosäure (AS) eingefügt haben (C-X-C). Dieser C-X-C-Unterfamilie gehören u a. "Melanoma Growth Stimulator Activity (MGSA) oder   GRO-Protein-a.-ss,-y, tnterteukin-8   und IP-10 an. Die murinen Homologe sind u. a. KC-Genprodukt und das "Macrophage Inflammatory Protein-2" (MIP-2) Die zweite Unterfamilie enthält solche Chemokine, bel denen die ersten beiden   Cysteine   direkt nacheinander in der AS-Sequenz zu liegen kommen (C-C). Dieser   C-C-Unterfamilie   gehören u. a. RANTES, "Monocyte Chemotactic Protein-1" (MCP-1)   und "Macrophage Inflammatory Protein-1a, -1 ss" (MIP-1a, -1 ss)   an.

   Die murinen Homologe sind u a. JE-Genprodukt und murines "Macrophage Inflammatory Protein-1a,   -iss" (MIP-la,-Iss).    



   Die meisten Vertreter dieser   beiden Chemokin-Unterfamilien   setzen sich als sekretierte Proteine zunächst aus circa 60-80 AS zusammen. Verkürzungen durch proteolytische Enzyme   z. B.   am   aminotermh     nalen   Ende   z. B.   um vier AS führen zu Chemokinformen, die eine vielfaches höhere Chemokin-artige Aktivität besitzen. 



   Um zwischen verkürzten und nicht verkürzten Chemokinen einfach und damit rasch unterscheiden zu können, wurden Antikörper als "Werkzeuge" geschaffen, die spezifisch die verkürzten und spezifisch die nicht-verkürzten Formen dieser Chemokine erkennen. 



   Gegenstand der Erfindung sind daher zum einen Antikörper, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie selektiv am aminoterminalen Ende an ein nicht verkürztes Peptid binden, zum anderen Antikörper, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie selektiv am aminoterminalen Ende eines am aminoterminalen Ende verkürzten Peptids oder Proteins oder irgendeines Chemokins binden. 



   Dieses Peptid kann unter anderem eines der folgenden sein : MGSA,   Gro-a,-ss,--y, IL-8, IP-10, KC-Genprodukt, Macrophage Inflammatory Protein-2,   RANTES, Monocyte Chemotactic Protein-1, Macrophage Inflammatory Protein-la   und -1 ss,   JE-Genprodukt und murines Macrophage   Inflammatory Protein-la und-Iss   oder irgend ein anderes Protein der C-X-C oder C-C   Chemokinfaml-   lie. 



   Für die Herstellung der Antikörper wird von der bekannten Aminosäuresequenz des Chemokins (trunklert oder reif) ein Peptid über die Aminosäuren (2-8)-20 bzw. 1-20 durch Festphasensynthese hergestellt. Dabei werden die In der ursprünglichen Aminosäuresequenz vorkommenden Cysteine durch Alanine ersetzt. Das Peptid wird an ein   Lysin-Gerüst,   das aus   6-Lysin-Molekülen   besteht, gekoppelt und so octamerislert, um ein Multiples Antigenes Peptid (MAP) zu erhalten. Dieses MAP wird in phosphatgepufferter Kochsalzlösung gelöst und mit vollständigem Freund's Adjuvant zu einer Emulsion vermischt. Kaninchen (Chinchilla Bastards) oder Meerschweinchen werden vorerst mit 1 mg bzw.   0. 2   mg (Meerschweinchen) MAP-Emulsion subkutan immunisiert.

   Alle folgenden Immunisierungen erfolgen mit unvollständigem Freund's Adjuvant anstelle von vollständigen Freund's Adjuvant wobei   0. 5   mg bzw. 0. 1 mg (Meerschweinchen) Antigen appliziert werden Auf diese Weise werden die Tiere in 4 bis 6 wöchigem Abstand dreimal bis viermal geimpft. 



   Anschliessend wird der Titer der Serumbindung an das MAP und ebenso an ein synthetisches Chemokin, das um die entsprechende Anzahl der Aminosäuren verkürzt wurde (biologisch aktivere Form) mittels   ELISA   bestimmt und das Resultat mittels Westernblotmethode, also   SDS-Polyacrylamidgelelektro-   phorese, nachfolgender Übertragung auf eine Filtermembran und Inkubation mit verdünntem Serum oder gereinigter Antikörperlösung   bestätigt.   



   Um grössere Mengen an Serum für die Antikörperreinigung zu erhalten, werden die Tiere ausgeblutet und das Serum durch Zentrifugieren des koagulieren Blutes geerntet.   Anschliessend   werden die Antikörper durch Protein-A-Affinitätschromatographie aus dem Serum isoliert. 



   Bei der weiteren Charakterisierung der so gewonnenen Antikörper wurde überraschenderweise gefunden, dass sie mit hoher   Spezifität   das bei der Immunisierung verwendete Chemokin binden, und dass nur ein unbedeutender Teil der Bindung auch an die jeweils andere Form des Chemokins erfolgte. 

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  Beispiele 1. ) Polyklonale Antikörper gegen das am aminoterminalen Ende um 4 Aminosäuren trunkierte gro-ss (AS 5- 73) 
Für die Herstellung dieser Antikörper wurde von der bekannten Aminosäuresequenz des gro-ss ein MAP über die Aminosäuren 5-20 hergestellt, Tiere wie oben beschrieben immunisiert und die Antikörper gewonnen. Diese wurden   mittels EDSA   und Western blot auf ihre Spezifität hin getested. 



    1. 1.) Polyklonale   Meerschweinchen Antikörper (gp208) 
Fig. 1 zeigt die mittels ELISA getestete spezifische Bindung des polyklonalen Antikörpers gp208 gegen Des4-gro-ss und das MAP (gro-ss 5-20) und die unbedeutende Kreuzreaktion des gp208 mit rekombinantem gro-ss (AS 1-73). Der Titer gegen   Des4-gro-,     ist 1:106,   während der Titer für die Bindung an rekombinantes   gro-ss     8 nur 1 : 102   beträgt. 



  Die gp208 Antikörper wurden zur Bestätigung im Westernblot in einer Verdünnung von   1 : 10.   getestet. 



  Dabei zeigte sich nur spezifische Bindung an Des4-gro-ss und das MAP (gro-ss 5-20) nicht jedoch an rekombinantes gro-ss. 



    1. 2.) Polyklonale   Kaninchen Antikörper (R28) 
Fig. 2 zeigt die mittels   ELISA   getestete spezifische Bindung des polyklonalen Antikörpers R28 gegen Des4-gro-ss und das MAP (gro-ss 5-20) und die unbedeutende Kreuzreaktion des R28 mit rekombinantem gro-ss (AS 1-73). Der Titer gegen   Des4-gro-j8   ist 1 : 105 während der Titer für die Bindung an rekombinantes gro-ss nur   1 : 102   beträgt. 
 EMI2.1 
 zeigte sich nur spezifische Bindung an Des4-gro-ss und das MAP (gro-ss 5-20), nicht jedoch an rekombinantes gro-ss. 



  2. ) Polyklonale Antikörper gegen nicht-trunkiertes gro-ss (AS 1-73) 
Für die Herstellung dieser Antikörper wurde von der bekannten Aminosäuresequenz des gro-ss ein MAP über die Aminosäuren 1-20 hergestellt, Tiere wie oben beschrieben immunisiert und die Antikörper gewonnen. 



    2. 1.) Polyklonale   Meerschweinchen Antikörper (gp202) 
Fig. 3 zeigt die mittels   ELISA   getestete spezifische Bindung des polyklonalen Antikörpers gp202 gegen rekombinantes gro-ss und das MAP (gro-ss 1-20) und die unbedeutende Kreuzreaktion des gp202 mit Des4gro-ss. Der Titer gegen rekombinantes gro-ss ist 1 : 105 während der Titer für die Bindung an   Des4-gro-ss   nur 1 : 103 beträgt. 



  Die gp202 Antikörper wurden zur Bestätigung im Westernblot in einer Verdünnung von   1 : 10.   getestet. 



  Dabei zeigte sich nur spezifische Bindung an rekombinantes gro-ss und das MAP (gro-ss 1-20) nicht jedoch an   Des4-gro-.   



    2. 2.) Polyklonale   Kaninchen Antikörper (R25) 
Fig. 4 zeigt die mittels   ELISA   getestete spezifische Bindung des polyklonalen Antikörpers R25 gegen rekombinantes gro-ss und das MAP (gro-ss 1-20) und die unbedeutende Kreuzreaktion des R25 mit Des4gro-ss MAP (gro-ss 5-20). Der Titer gegen rekombinantes gro-ss ist 1 : 105 während der Titer für die Bindung an   Des4-gro-j8   nur 1 : 103 beträgt. 



  Die R25   Antikörper   wurden zur Bestätigung   tm   Westernblot In einer Verdünnung von   1 : 10.   getestet. Dabei zeigte sich nur spezifische Bindung an rekombinantes gro-ss und das MAP (gro-ss 1-20) nicht jedoch an Des4-gro-ss. 

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  Verwendete Abkürzungen in den Zeichnungen : blocking reagent : BSA (Bovine Serum Albumin) als Blockierungsreagens lysine core : Lysinkern des MAP gro-ss 5-20 MAP : MAP über AS 5-20 des gro-ss gro-ss 1-20 MAP: MAP über AS 1-20 des gro-ss rec. gro-ss: rekombinantes gro-ss (AS 1-73)
Des4 gro-ss : trunkiertes gro-ss (AS 5-73) 
 EMI3.1 
 : rekombinantes IL-8Patentansprüche 1. Ein Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass er selektiv an ein nichtverkürztes Chemokin bindet, jedoch nicht an das entsprechende verkürzte Chemokin.

Claims (1)

  1. 2. Ein Antikörper nach Anspruch 1, wobei er an die nicht verkürzte Form von MGSA, Gro-&alpha;,-ss,-&gamma;, IL-8, IP-10, KC-Genprodukt, Macrophage Inflammatory Protein-2, RANTES, Monocyte Chemotactic Protein-1, Macrophage Inflammatory Protein-1&alpha; und -1ss, JE-Genprodukt und murines Macrophage Inflammatory Protein-'a und -1 ss oder andere Proteine der C-X-C oder C-C Chemokinfamilie bindet.
    3. Ein Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass er an ein am aminoterminalen Ende um 2-8 AS verkürztes Chemokin bindet, jedoch nicht an das entsprechende nicht verkürzte Chemokin.
    4. Ein Antikörper nach Anspruch 3, wobei er an die verkürzte Form von MGSA, Gro-a, -ss,-y, (L-8, IP-10, KC-Genprodukt, Macrophage Inflammatory Protein-2, RANTES, Monocyte Chemotactic Protein-1. Ma- crophage Inflammatory Protein-1&alpha; und -1ss. JE-Genprodukt und murines Macrophage Inflammatory Protein-1&alpha; und -1ss oder andere Proteine der C-X-C oder C-C Chemokinfamilie bindet.
    5. Verwendung der Antikörper nach Anspruch 1 oder 3 zur Unterscheidung von verkürzten und nicht EMI3.2
AT89695A 1995-05-29 1995-05-29 Antikörper zum nachweis und zur unterscheidung von verkürzten und nicht verkürzten formen von chemokinen AT403098B (de)

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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994029341A1 (en) * 1993-06-08 1994-12-22 Smithkline Beecham Corporation Methods of enhancing bioactivity of chemokines

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WO1994029341A1 (en) * 1993-06-08 1994-12-22 Smithkline Beecham Corporation Methods of enhancing bioactivity of chemokines

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