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Chemokine sind Polypeptide mit einem Molekulargewicht von etwa 7000 Dalton. Diese Proteine sind an der Entwicklung entzündlicher Reaktionen beteiligt, insbesondere an der Anlockung von Zellen, die an entzündlichen Prozessen beteiligt sind, in Geweberegionen, in denen entzündliche Prozesse initiiert oder unterhalten werden. Des weiteren wurde gezeigt, dass Chemokine die an der Entzündung beteiligten Zellen aktivieren und deren Wachstum fördern. Dies gilt auch für Zellen der Hämatopoese.
Die Familie dieser Proteine wird In zwei Unterfamilien eingeteilt. Die erste Unterfamilie enthält solche Chemokine, die zwischen den ersten belden Cysteinen eine einzige beliebige Aminosäure (AS) eingefügt haben (C-X-C). Dieser C-X-C-Unterfamilie gehören u a. "Melanoma Growth Stimulator Activity (MGSA) oder GRO-Protein-a.-ss,-y, tnterteukin-8 und IP-10 an. Die murinen Homologe sind u. a. KC-Genprodukt und das "Macrophage Inflammatory Protein-2" (MIP-2) Die zweite Unterfamilie enthält solche Chemokine, bel denen die ersten beiden Cysteine direkt nacheinander in der AS-Sequenz zu liegen kommen (C-C). Dieser C-C-Unterfamilie gehören u. a. RANTES, "Monocyte Chemotactic Protein-1" (MCP-1) und "Macrophage Inflammatory Protein-1a, -1 ss" (MIP-1a, -1 ss) an.
Die murinen Homologe sind u a. JE-Genprodukt und murines "Macrophage Inflammatory Protein-1a, -iss" (MIP-la,-Iss).
Die meisten Vertreter dieser beiden Chemokin-Unterfamilien setzen sich als sekretierte Proteine zunächst aus circa 60-80 AS zusammen. Verkürzungen durch proteolytische Enzyme z. B. am aminotermh nalen Ende z. B. um vier AS führen zu Chemokinformen, die eine vielfaches höhere Chemokin-artige Aktivität besitzen.
Um zwischen verkürzten und nicht verkürzten Chemokinen einfach und damit rasch unterscheiden zu können, wurden Antikörper als "Werkzeuge" geschaffen, die spezifisch die verkürzten und spezifisch die nicht-verkürzten Formen dieser Chemokine erkennen.
Gegenstand der Erfindung sind daher zum einen Antikörper, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie selektiv am aminoterminalen Ende an ein nicht verkürztes Peptid binden, zum anderen Antikörper, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie selektiv am aminoterminalen Ende eines am aminoterminalen Ende verkürzten Peptids oder Proteins oder irgendeines Chemokins binden.
Dieses Peptid kann unter anderem eines der folgenden sein : MGSA, Gro-a,-ss,--y, IL-8, IP-10, KC-Genprodukt, Macrophage Inflammatory Protein-2, RANTES, Monocyte Chemotactic Protein-1, Macrophage Inflammatory Protein-la und -1 ss, JE-Genprodukt und murines Macrophage Inflammatory Protein-la und-Iss oder irgend ein anderes Protein der C-X-C oder C-C Chemokinfaml- lie.
Für die Herstellung der Antikörper wird von der bekannten Aminosäuresequenz des Chemokins (trunklert oder reif) ein Peptid über die Aminosäuren (2-8)-20 bzw. 1-20 durch Festphasensynthese hergestellt. Dabei werden die In der ursprünglichen Aminosäuresequenz vorkommenden Cysteine durch Alanine ersetzt. Das Peptid wird an ein Lysin-Gerüst, das aus 6-Lysin-Molekülen besteht, gekoppelt und so octamerislert, um ein Multiples Antigenes Peptid (MAP) zu erhalten. Dieses MAP wird in phosphatgepufferter Kochsalzlösung gelöst und mit vollständigem Freund's Adjuvant zu einer Emulsion vermischt. Kaninchen (Chinchilla Bastards) oder Meerschweinchen werden vorerst mit 1 mg bzw. 0. 2 mg (Meerschweinchen) MAP-Emulsion subkutan immunisiert.
Alle folgenden Immunisierungen erfolgen mit unvollständigem Freund's Adjuvant anstelle von vollständigen Freund's Adjuvant wobei 0. 5 mg bzw. 0. 1 mg (Meerschweinchen) Antigen appliziert werden Auf diese Weise werden die Tiere in 4 bis 6 wöchigem Abstand dreimal bis viermal geimpft.
Anschliessend wird der Titer der Serumbindung an das MAP und ebenso an ein synthetisches Chemokin, das um die entsprechende Anzahl der Aminosäuren verkürzt wurde (biologisch aktivere Form) mittels ELISA bestimmt und das Resultat mittels Westernblotmethode, also SDS-Polyacrylamidgelelektro- phorese, nachfolgender Übertragung auf eine Filtermembran und Inkubation mit verdünntem Serum oder gereinigter Antikörperlösung bestätigt.
Um grössere Mengen an Serum für die Antikörperreinigung zu erhalten, werden die Tiere ausgeblutet und das Serum durch Zentrifugieren des koagulieren Blutes geerntet. Anschliessend werden die Antikörper durch Protein-A-Affinitätschromatographie aus dem Serum isoliert.
Bei der weiteren Charakterisierung der so gewonnenen Antikörper wurde überraschenderweise gefunden, dass sie mit hoher Spezifität das bei der Immunisierung verwendete Chemokin binden, und dass nur ein unbedeutender Teil der Bindung auch an die jeweils andere Form des Chemokins erfolgte.
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Beispiele 1. ) Polyklonale Antikörper gegen das am aminoterminalen Ende um 4 Aminosäuren trunkierte gro-ss (AS 5- 73)
Für die Herstellung dieser Antikörper wurde von der bekannten Aminosäuresequenz des gro-ss ein MAP über die Aminosäuren 5-20 hergestellt, Tiere wie oben beschrieben immunisiert und die Antikörper gewonnen. Diese wurden mittels EDSA und Western blot auf ihre Spezifität hin getested.
1. 1.) Polyklonale Meerschweinchen Antikörper (gp208)
Fig. 1 zeigt die mittels ELISA getestete spezifische Bindung des polyklonalen Antikörpers gp208 gegen Des4-gro-ss und das MAP (gro-ss 5-20) und die unbedeutende Kreuzreaktion des gp208 mit rekombinantem gro-ss (AS 1-73). Der Titer gegen Des4-gro-, ist 1:106, während der Titer für die Bindung an rekombinantes gro-ss 8 nur 1 : 102 beträgt.
Die gp208 Antikörper wurden zur Bestätigung im Westernblot in einer Verdünnung von 1 : 10. getestet.
Dabei zeigte sich nur spezifische Bindung an Des4-gro-ss und das MAP (gro-ss 5-20) nicht jedoch an rekombinantes gro-ss.
1. 2.) Polyklonale Kaninchen Antikörper (R28)
Fig. 2 zeigt die mittels ELISA getestete spezifische Bindung des polyklonalen Antikörpers R28 gegen Des4-gro-ss und das MAP (gro-ss 5-20) und die unbedeutende Kreuzreaktion des R28 mit rekombinantem gro-ss (AS 1-73). Der Titer gegen Des4-gro-j8 ist 1 : 105 während der Titer für die Bindung an rekombinantes gro-ss nur 1 : 102 beträgt.
EMI2.1
zeigte sich nur spezifische Bindung an Des4-gro-ss und das MAP (gro-ss 5-20), nicht jedoch an rekombinantes gro-ss.
2. ) Polyklonale Antikörper gegen nicht-trunkiertes gro-ss (AS 1-73)
Für die Herstellung dieser Antikörper wurde von der bekannten Aminosäuresequenz des gro-ss ein MAP über die Aminosäuren 1-20 hergestellt, Tiere wie oben beschrieben immunisiert und die Antikörper gewonnen.
2. 1.) Polyklonale Meerschweinchen Antikörper (gp202)
Fig. 3 zeigt die mittels ELISA getestete spezifische Bindung des polyklonalen Antikörpers gp202 gegen rekombinantes gro-ss und das MAP (gro-ss 1-20) und die unbedeutende Kreuzreaktion des gp202 mit Des4gro-ss. Der Titer gegen rekombinantes gro-ss ist 1 : 105 während der Titer für die Bindung an Des4-gro-ss nur 1 : 103 beträgt.
Die gp202 Antikörper wurden zur Bestätigung im Westernblot in einer Verdünnung von 1 : 10. getestet.
Dabei zeigte sich nur spezifische Bindung an rekombinantes gro-ss und das MAP (gro-ss 1-20) nicht jedoch an Des4-gro-.
2. 2.) Polyklonale Kaninchen Antikörper (R25)
Fig. 4 zeigt die mittels ELISA getestete spezifische Bindung des polyklonalen Antikörpers R25 gegen rekombinantes gro-ss und das MAP (gro-ss 1-20) und die unbedeutende Kreuzreaktion des R25 mit Des4gro-ss MAP (gro-ss 5-20). Der Titer gegen rekombinantes gro-ss ist 1 : 105 während der Titer für die Bindung an Des4-gro-j8 nur 1 : 103 beträgt.
Die R25 Antikörper wurden zur Bestätigung tm Westernblot In einer Verdünnung von 1 : 10. getestet. Dabei zeigte sich nur spezifische Bindung an rekombinantes gro-ss und das MAP (gro-ss 1-20) nicht jedoch an Des4-gro-ss.
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Verwendete Abkürzungen in den Zeichnungen : blocking reagent : BSA (Bovine Serum Albumin) als Blockierungsreagens lysine core : Lysinkern des MAP gro-ss 5-20 MAP : MAP über AS 5-20 des gro-ss gro-ss 1-20 MAP: MAP über AS 1-20 des gro-ss rec. gro-ss: rekombinantes gro-ss (AS 1-73)
Des4 gro-ss : trunkiertes gro-ss (AS 5-73)
EMI3.1
: rekombinantes IL-8Patentansprüche 1. Ein Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass er selektiv an ein nichtverkürztes Chemokin bindet, jedoch nicht an das entsprechende verkürzte Chemokin.