AT403006B - Verfahren zur desinfektion von pflanzengut bzw. pflanzengewebsgut - Google Patents

Description

AT 403 006 B

Die Mikrovegetatiwermehrung erfordert in der Etablierungsphase die Sterilisation der Oberflächen des einzusetzenden Pflanzengewebes. Von diesem anfänglichen Schritt ist das weitere Gelingen der Inkultur-nahme wesentlich abängig. Verläuft diese Oberflächendesinfektion ungenügend und bleiben noch störende keimfähige Mikroorganismen am Pflanzengewebe haften, verursachen diese spätere Insterilität, die nicht oder nur schwierig beseitigt werden kann. Ist anderseits die Desinfektionsbehandlung zu stark, kann das Pflanzengewebe bis zur letalität beschädigt werden. Üblicherweise werden zur Desinfektionsbehandling oxidative Substanzen wie H202 (Wasserstoffperoxid oder OCI-(Hypochlorit)-lonen eingesetzt, wobei die Lösungen üblicherweise wässerig sind. Die Exposition der Pflanzenteile erfolgt in sterilen Gefäßen mit den oxidativen Substanzen in Abhängigkeit von Art und Eigenschaften des Gewebes mit verschiedener Einwirkungsdauer. Anschließend wird mehrmals mit sterilem Wasser nachgespült, gegebenenfalls mit Nach- bzw. Zwischenspülungen z.B. mit Alkohol.

Die mit dieser konventionellen Desinfektionsmethode erreichbaren Desinfektionsquoten sind insbesondere im Hinblick auf einen technisch ökonomischen Einsatz der modernen Vermehrungstechnik in großem Umfang immer zu gering gewesen. Hiebei ist deutlich darauf hinzuweisen, daß es sich nicht um Behandling von Pflanzengut handelt, das als Dauerform, z.B. als Samenkörper, Getreide, Samen, Sparen u.dgl. vorliegt, sondern als gegen Einfluß von Chemikalien und mechanische Desintegrationskräfte durchaus empfindliches, aktives, "lebendes" Gewebegut.

Es wurden intensiv Wege gesucht, die Überlebensrate des vorher desinfizierten explantierten Pflanzengewebegutes signifikant anzuheben und damit die moderne Vermehrungstechnik wesentlich zu fördern.

Es sei an dieser Stelle weiters darauf hingewiesen, daß seit langem eine Behandlung von "hartem" Gut, also z.B. zur Reinigung von Geräten aller Art mit stark haftenden Verunreinigungen und später auch eine derartige Reinigung von mechanisch wenig empfindlichen "harten" Pflanzendauerformen wie Samen, Körnern usw. mit Ultraschall, gegebenenfalls in Anwesenheit eines Desinfektionsmittels, bekannt geworden sind.

Dazu sei besonders auf DE-A1 4,306.645 und US-A 5,213.619 verwiesen, weiche die Behandlug und Reinigung von technischen oder medizinischen Artikeln wie Flüssigsauerstoffventilen, Zahnprothesen, Knochenklammern und Sprachprothesen sowie von botanischem, nicht mehr vermehrungsfähigem Material, wie getrockneten Sennesblättern und Zimt unter Einsatz von Ultraschall beschreiben, wobei dort einerseits eine Kombination von Ultraschall und elektrischen Wechselfeldern und als Medium verdichtete Fluide, wie Kohlendioxid, schwerere Edelgase u.dgl., welche bei Einwirkung von Ultraschall einen Kavitationseffekt ermöglichen, vorgesehen sind.

Es wurde nun gefunden, daß sich auch nicht in einer Dauerform vorliegendes, espfindliches Pflanzengewebegut, also "lebendes" Gut, mit Ultraschall behandeln läßt und daß unerwarteter-weise trotz dieser eher aggessiven, mechanischen Reinigungsmethode die dadurch zu erwartende mechanische Schädigung der Explantate sich in engen Grenzen hält und sich bei gleichzeitiger Anwesenheit eines Desinfektionsmittels, das neben seiner bioziden Wirkung auch Einfluß auf das Gewebe ausübt, ein synergistischer Effekt einstellt, durch welchen sich die Desinfektions- und Vermehrungsquote signifikant steigern lassen.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Desinfektion von - nicht als Dauerform -vorliegenden Pflanzen, Pflanzenteilen, Pflanzengeweben und/oder Pflanzengewebeteilen bzw. von deren Oberflächen, welche für eine Vegetativ- bzw. Mikrovegetatiwermehrung vorgesehen sind, wobei die genannten Pflanzengewebe u.dgl. mit, Desinfektionsmittel-Lösungen, welche oxidierende Substanzen enthalten, in innigen Kontakt gebracht werden bzw. in dieselben für eine vorgegebene Verweilzeit eingebracht bzw. eingetaucht werden, wonach unter Einhaltung von sterilen Bedingungen die Schritte Spülen, Trocknen, Lagern und letztlich Explantat bzw. Ausbringung mit jeweils vorgesehenen variierenden Wiederholungen und Abfolgen dieser Schritte erfolgen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß zur Steigerung der erwünschten Vermehrungsfähigkeit die genannten, nicht als Dauerform vorliegenden, zu desinfizierenden Pflanzen bzw. deren Teile, Gewebe und/oder Gewebeteile im Zuge ihres intensiven Kontaktes mit der, insbesondere während ihrer Anwesenheit in einem Bad, wässerigen Desinfektionsmittel-Lösung der Einwirkung des oxidativ wirksamen Desinfektionsmittels in Kombination mit einer gleichzeitig erfolgenden Einwirkung von Ultraschallenergie unterworfen werden.

Das Neue des Verfahrens liegt darin, daß die oxidativen Substanzen, z.B. NaOCI (Natriumhypochlorit) im Ultraschallbad angewendet werden und zwar mit Erfolg auf zu erwartender weise tatsächlich leicht desintegrierbares Gewebsgut, wie Triebe, Sprossen u.dgl.

Viele Versuche mit verschiedenen ohne Ultraschall nur unzureichend desinfizierbaren Pflanzenarten und Gewebearten zeigten, daß die Desinfektionswirkung durch das neue kombinierte Desinfektions- und Ultraschallbad wesentliche bessere Des^.fektionsquoten gegenüber den für die Desinfektion von Explantaten üblichen, herkömmlichen Verfahret mrigt. 2

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Bisher ist eine solche Ultraschall unterstützende Methode für die Desinfektion von derartigem empfindlichen Pflanzengewebsgut noch nicht versucht und beschrieben worden, was weiter nicht verwundert, da durch die an sich bekannte Desintegrationswirkung des Ultraschalls, der bekanntlich nicht einmal die metallische, meist auf Basis von Titan gebildete Abstrahlfläche des Ultraschallgenerators verschont, eher eine Erhöhung der Letalitätsrate erwartet werden mußte.

Die synergistische Wirkung - Ultraschall hat auf Mikroben praktisch keine sie selbst schädigende Wirkung - beruht vermutlich darauf, daß neben einer echt chemischen Unschädlichmachung und damit wesentlichen Reduktion der Mikroorganismen-Zahl eine meschanisch durchaus wesentliche Wirkung in der Weise eintritt, daß die an sich fest haftenden Mikroorganismen in großer Menge von der Oberfläche abgelöst und in das letztlich abgetrennte Desinfektionsmittel eingetragen werden dürften, wo sie demselben zu ihrer Vernichtung wesentlich besser zugänglich sind, und letztlich auch eine Abtrennung der Organismen zusammen mit der zu verwerfenden Desinfektionsauslösung und Wegspülen derselben nach der Behandlung erfolgt.

Es wurde gefunden, daß sich auf wirtschaftliche Weise hohe Überlebensquoten der Explantate bei Einhaltung von Desinfektionsmittel-Konzentrationen gemäß Anspruch 2 erzielen lassen, wobei die gemäß Anspruch 3 zu bevorzugenden oxidativen Substanzen besonders vorteilhaft ersetzbar sind.

Was die eingebrachte synergistisch vorteilhafte Ultraschallenergie betrifft, haben sich die im Anspruch 4 genannten Frequenzen und weiters die im Anspruch 5 genannten Energiedichten als für das empfindliche lebendige, sprossende od. dgl. Pflanzengewebsgut als durchaus genügend schonend und gleichzeitig dennoch ausreichend für den Wirkstoffeintritt erwiesen.

Eine Vorlauf- bzw. "Einweich"-Zeit vor Beginn der Ultraschallbehandlung in den von Anspruch 6 wiedergegebenen Ausmaßen hat sich auf den Erfolg der Desinfektion durchaus günstig ausgewirkt.

Verkürzte Desinfektionszeiten bringt ein Modus der Beschallung gemäß Anspruch 7.

Weiters kann in hartnäckigen Fällen alternativ oder zusätzlich eine an- und abschwellende Ultrabeschallung gemäß Anspruch 8 Vorteile bringen, wobei echte Pausen, wie gemäß Anspruch 9 vorgesehen, eine weitere Senkung der Letalitätswerte der so behandelten Gewebe erbringen kann.

Behandlungszeiten innerhalb der im Anspruch 10 angegebenen Bereiche haben sich für optimierte Resultate als am günstigsten erwiesen. Für besonders problematische Fälle, also bei hohem Organismusbefall auf besonders empfindlichen Geweben kann auch ein Wechsel, z.B. von einem anfänglich stärker wirksamen zu einem gegen Ende der Behandlung schwächerem Desinfektionsmittel, gegebenenfalls auch in Gradientenform gemäß Anspruch 11 vorgenommen werden.

Letztlich wird infolge des hier gegebenen Synergismus durch Reduktion der Gesamtzeit der beschallenden Desinfektion in den im Anspruch 12 genannten Ausmaßen eine Optimierung der Ausbeutequoten erzielt.

Anhand der Beispiele wird die Erfindung näher erläutert:

Beispiele: allgemein:

Ultraschallgerät: Elma Type T 460/H, Frequenz 35 kHz Desinfektionslösung: 4 bzw. 6%ige Natriumhypochloridlösung (NaOCI)

Zur Behandlung mit dem Ultraschallgerät wurde die Desinfektionslösung ca. 2/3 hoch (ca. 1,5 I) in die Ultraschallwanne gefüllt.

Ohne Ultraschallbehandlung erfolgte die Vergleichs-Desinfektion in sterilen Bechergläsern aus Glas.

Beispiel 1:

Winterknospen von Bergahorn wurden durch Tauchen 1,5 min lang mit 4%iger wässeriger NaOCI-Lösung behandelt. Anschließend wurden die Knospen 1 min lang in 70%iges Ethanol gelegt und nachher nochmals 5 min lang mit 4%iger wässeriger NaOCI-Lösung desinfiziert. Die Behandlung mit NaOCI erfolgte im Ultraschallbad sowie die Kontrolle ohne Ultraschall-Einsatz. Bei der Versuchsvariante mit Ultraschall wurden 88 Knospen und bei der Variante ohne Ultraschall-Behandlung 79 Knospen eingesetzt.

Die Auswertung des Versuches erfolgte 6 bzw. 12 Wochen nach Desinfektion und darauffolgende Ausbringung: 3

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Tab.l

Ergebnisse des Desinfektionsversuches mit Winterknospen von Bergahorn: Behandlung: 4% NaOCI: mit Ultraschall 25 kHz: ohne Ultraschall: Infektionen: % nach 6 Wochen 21,6 50,6 Infektionen: % nach 12 Wochen 25,0 57,0

Beispiel 2:

Ausgereifte noch nicht verholzte Triebe dreier verschiedener Stiel- und Traubeneichenklone, nämlich Klone 3113, 3223 sowie 3233 wurden zu verschiedenen Zeitpunkten im Frühjahr, jeweils Mitte März, April, Mai und im Sommer (Juli) aus dem Glashaus geerntet. Die entblätterten Sproßsegmente wurden unter Leitungswasser ca 1h gewässert.

Im Frühjahr erfolgte die Desinfektion der noch nicht exakt abgelängten Triebe mit 4 %iger NaOCI-Lösung und mit den Johannistrieben (Juli) mit 6 %iger NaOCI-Lösung, 10 min Einwirkungsdauer und einminütiger Behandlung mit 70 %igem EtOH. Anschließend wurde dreimal mit sterilem Wasser nachgespült. Danach wurden die Sprosse und Sproßspitzen in Explantatgröße von 1,5 bis 2 cm Größe geschnitten. Zur Entfernung der phenolischen Substanzen wurden die Explantate noch 15 min lang in 0,5 % steriler wässeriger Chinosollösung geschüttelt und danach auf Induktionsmedien aufgelegt. Für jede Versuchsvariante wurden mindestens 40 Explantate eingesetzt.

Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte vier bzw. sechs Wochen nach Desinfektionsbehandlung und Explantation.

Tab.2

Ergebnisse des Desinfektionsversuches mit Sproßspitzen und Nodiensegmenten von Stieleiche (Juli) Behandlung 6% NaOCI mit Ultraschall 30 kHz ohne Ultraschall Infektionen: % nach 6 Wochen 12 25

Tab.3

Infektionsraten (%) von Stie - und Traubeneiche (Frühjahr) Klone Behandlung mit 6% NaOCI mit Ultraschall 25 kHz ohne Ultraschall 3113 % nach 4 Wochen 77 96 3223 % nach 4 Wochen 67 97 3233 % nach 4 Wochen 75 100

Die Beispiele zeigen, daß selbst unter den noch nicht voll optimierten Test-Bedingungen durchaus beachtliche Erhöhungen der Überlebensquoten der Explantate erzielt wurden.

Sie zeigen auf, daß Ultraschall also unerwarteterweise eine günstige Wirkung auf die Oberflächendesinfektion von Pflanzengewebe ausübt. In allen angewendeten Beispielen, sei es unempfindlichere Knospen von Bergahorn oder frisch ausgetriebene Sprosse von Eichen zeigte sich, daß der Einsatz von Ultraschall die Desinfektionsrate und damit die Überlebensrate in vitro um mindestens 10 bis zu Werten von 50% erhöhen konnte, was durchaus vorteilhaft ist.

Der verbesserte Effekt ist vermutlich auf die Ultraschallwellen zurückzuführen, die eine intensive Vibration erzeugen. Die dabei entstehenden Strömungen und Verwirbelungen führen vermutlich dazu, daß kleinste Partikel und Mikroorganismen von der Pflanzenoberfläche gelöst werden und dadurch das Desinfektionsmittel eine gesteigerte Wirkung entfalten kann. Eventuell wird durch den Ultraschall ein Eindringen des Desinfektionsmittels in die besonders mikroorganismenbefallenen Oberflächensporen erzielt. 4

Claims (12)

1. AT 403 006 B Patentansprüche 1. Verfahren zur Desinfektion von - nicht als Dauerform - vorliegenden Pflanzen, Pflanzenteilen, Pflanzengeweben und/oder Pflanzengewebeteilen bzw. von deren Oberflächen, welche für eine Vegetativ- bzw. Mikrovegetativvermehrung vorgesehen sind, wobei die genannten Pflanzengewebe u.dgl. mit wässerigen Desinfektionsmittel-Lösungen, welche oxidierende Substanzen enthalten, in innigen Kontakt gebracht werden bzw. in dieselben für eine vorgegebene Verweilzeit eingebracht bzw. eingetaucht werden, wonach unter Einhaltung von sterilen Bedingungen die Schritte Spülen, Trocknen, Lagern und letztlich Explantat bzw. Ausbringung mit jeweils vorgesehenen variierenden Wiederholungen und Abfolgen dieser Schritte erfolgen, dadurch gekennzeichnet, daß zur Steigerung der erwünschten Vermehrungsfähigkeit die genannten, nicht als Dauerform vorliegenden, zu desinfizierenden Pflanzen bzw. deren Teile, Gewebe und/oder Gewebeteile im Zuge ihres intensiven Kontaktes mit der, insbesondere während ihrer Anwesenheit in einem Bad, wässerigen Desinfektionsmittel-Lösung der Einwirkung des oxidativ wirksamen Desinfektionsmittels in Kombination mit einer gleichzeitig erfolgenden Einwirkung von Ultraschallenergie unterworfen werden.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine wässerige Desinfektionsmittel-Lösung mit einer Konzentration der desinfektions-wirksamen Substanz(en) im Bereich von 1 bis 15 Masse-%, vorzugsweise 2 bis 10 Masse-%, insbesondere im Bereich von 3 bis 8 Masse-%, eingesetzt wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine wässerige Desinfektionsmittel-Lösung mit Wasserstoffperoxid oder einem Hypochlorit, vorzugsweise Natrium- oder Kalziumhypochlorit, als oxidativer Wirksubstanz eingesetzt wird.
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet daß die kombinierte Behandlung mit Ultraschall und wässerigem Desinfektionsmittel mit Ultraschall mit Frequenzen im Bereich von 20 bis 50 kHz, insbesondere von 30 bis 40 kHz, vorgenommen wird.
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß in die wässerige Desinfektionsmittel-Lösung mit dem zu desinfizierenden Pflanzengut Ultraschall mit einer Energiechich-te von 5 bis 75 W/cm2, vorzugsweise von 20 bis 40 W/cm2, eingebracht wird.
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Ultraschall-Behandlung erst nach Ablauf eines Zehntels bis des Zwanzigfachen der gesamten jeweils vorgesehenen Kontaktzeit zwischen Pflanzengut und wässeriger Desinfektionsmittel-Lösung begonnen wird.
7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Ultraschallbehandlung mit während der Behandlungszeit, vorzugsweise maximal auf das Fünffache, ansteigender Frequenz und/oder Energiedichte vorgenommen wird.
8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Ultraschallbehandlung mit periodisch alternierender Frequenz und/oder Energiedichte vorgenommen wird.
9. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Ultraschallbehandlung mit jeweils von Null ausgehenden, periodischen Beschallungsimpulsen mit zwischen denselben angeordneten Pausen vorgenommen wird, deren Länge 1 bis 9 Zehntel der Impuls-Gesamtintervallszeit beträgt.
10. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Gesamtzeit der Ultraschallbehandlung im Bereich von 5 bis 30 min gehalten wird.
11. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß während der Behandlungsdauer, gegebenenfalls nach einer Spülung, die wässerige Desinfektionsmittel-Lösung in ihrer Wirkstoff-Konzentration geändert wird und/oder ein Wechsel des Desinfektionsmittels vorgenommen wird. 5 AT 403 006 B
12. 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß, jeweils bezogen auf gleiches bzw. gleichartiges Einsatzgut, wässerige Desinfektionsmittel-Lösung und Desinfektionsbedingungen, eine Reduktion der Einwirkungszeit des wässerigen Desinfektionsmittels auf das Pflanzengut im Bereich von 55 bis 80% vorgenommen wird. 6