AT396248B - Verfahren zur herstellung von neuen peptid-verbindungen und ihrer salze - Google Patents
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Description
AT396248B
Maul- und Klauenseuche (FMD) ist eine hoch ansteckende, entkräftende Erkrankung, die paarzehige Tiere befällt Der Erreger, das Maul- und Klauenseuche-Virus (FMDV), ist ein kleines tierisches Virus der Picornavirus-Familie, das ein einzelsträngiges, positiv-sinniges RNS-Genom von etwa 8000 Nukleotiden aufweist
In der Vergangenheit sind Vakzine für FMD unter Verwendung entweder eines inaktivierten Virus oder eines 5 abgeschwächten Lebendvirus produziert worden. Diese Versuche, obgleich im allgemeinen wirksam, waren nicht problemfrei. Fälle, bei welchen das Virus unvollständig inaktiviert oder ungenügend abgeschwächt war, können zu FMD-Ausbrüchen Anlaß geben und haben dafür Anlaß gegeben. Eine synthetische FMDV-Vakzine, welche alle Aspekte von Virushandhabung bei der Produktion und Vakzinierung ausschalten würde, wird als eine höchst wünschenswerte Alternative angesehen [D. Rowlands, Endeavor 8 (3), 123-127 (1984)]. 10 Untersuchungen des FMDV während der letzten Jahre haben »geben, daß das Picornavirus in erster Linie vier
Capsidproteine enthält, die mit VP^, VP2« VP3 und VP4 bezeichnet werden. Die tatsächliche Bezeichnung dies» VP-Proteine war Gegenstand von Widersprüchlichkeiten. Das einschlägige Protein, insofeme, als diese Erfindung betroffen ist, ist von einigen Forschergruppen [siehe z. B. Kleid und Mitarbeit», Science214,1125 (1981)] mit VP3 bezeichnet worden, während es von anderen [siehe z. B. Clarke und Mitarbeit», FEBS Leiters 1S7,261 (1983)] mit 15 VPj bezeichnet worden ist. Für die vorliegenden Zwecke wird dieses Protein mit VPj bezeichnet VPj war Gegenstand beträchtlicher Untersuchungen und Strukturanalysen, wobei gefunden wurde, daß es eine neutralisierende Antikörperreaktion beim Schwein [J. Laporte, J. Grosclaude, J. Wantyghem, S. Bemard, P. Rouze, CR. Acad. Sei. 276,3399 (1973)] auslöst und sowohl Schweine als auch Rindvidi gegen FMDV-Infektion schützt [HL.Bachrach,D.M Moore,P.D.McKercher, J.Polatnick, J. Immunol. 115,1636(1975)]. Von einem biosynthetischen 20 Fusionspolypeptid aus TrpLE und VP} ist berichtet worden, daß es nach mehrfach» Vakzinierung Rindvieh und Schweine gegen eine virale Kontaktinfektion schützt [D.G. Kleid, D. Yansura, B. Small, D. Dowbenko, D. Moore, M. Grubman, P. McKercher, D.O. Morgan, E.V. Robertson, HL. Bachrach, Science 214,1125-1129 (1981)].
StrohmaierundMitarbeiter.J.Gen.Virol, 59,295-306(1982),haben,nachdem sie VPj chemisch undenzymatisch abgebaut hatten, den Schluß gezogen, daß die immunogenen Hauptbereiche, die befähigt sind, neutralisierende 25 Antikörper hervorzurufen, in den Aminosäuresequenzen 146-154 und 201-213 vorliegen.
Bitüe und Mitarbeiter, Nature 298,30-33 (1982), haben Peptide, die den Bereichen 141-160 und 200-213 des VPj-Polypeptids von FMDV entsprechen, chemisch synthetisiert und die Fähigkeit dies» Peptide gezeigt, hohe Spiegel von neutralisierendem Antikörper in Meerschweinchen und Kaninchen hervorzurufen. Ein Bericht üb» diese Arbeit ist auch in d» Internationalen PCT-Patentanmeldung Nr. WO83 03.547, v»öffendicht am 27. Oktob» 30 1983, enthalten.
Ein Hauptthema durch die gesamten vorstehenden Arbeiten mit den kleinen Peptidsequenzen ist die Annahme und der Befund, daß deren immunogene Wirkung, falls sie überhaupt vorhanden ist, nur nach V»knüpfung des Peptids mit einem Träg» von hohem Molekulargewicht, am häufigsten mit „KeyholeLimpet-Haemocyanin“-(KLH)-Träger, erzielt wird. 35 Die Angaben in d» WO/83 03 547 führen zu der Annahme, daß ein kleines Peptid in monomer» und nicht- cyclisiert» Form nicht in der Lage ist, einen Neutralisierungsindex hervorzurufen, der ausreichend ist, um viralen Schutz zu erzielen. Im spezielleren wird in der Veröffentlichung angegeben, daß ein Neutralisationsindex von etwa 1,5 od» mehr erford»lich ist, um ein Tier gegen das Virus zu schützen, und daß der Neutralisationsindex des monomeren, nicht konjugierten Peptids mit einer Sequenz, welche im wesentlichen d» Aminosäurerestsequenz in 40 den Stellungen von etwa 141 bis etwa 160 von OjK FMDV entspricht, annähernd 0,5 ist. Dieses Ergebnis ist mit Neutralisationsindices von etwa 3,7 bis etwa 3,9 zu vergleichen, welche für das gleiche Peptid, wenn es mit KLH konjugiert ist, angegeben werden.
Es istnunmehr eine Klasse neuer monomerer, nichtkonjugierter, kleiner Peptide entdeckt worden. DiesePeptide sind bei V»abreichung ohne irgendeinen Träger in der Lage, eine nicht vorhersehbare, deutlich »höhte 45 Neutralisationsreaktion gegenFMDV hervorzurufen. DiesePeptidehabenbeiRindviehmiteinereinzigen Vakzinierung einen noch nie dagewesenen Schutz induziert und einen vollständigen Schutz nach wiederholter Immunisierung. Bis zur vorliegend»i Entdeckung ist diese letztere Leistung nur mit Antigenen nachgewiesen worden, die annähernd fünfmal größ» sind als diese neu entdeckten Peptide.
Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung ein» neuen Peptid-V»bindung geschaffen, welche 50 eine Sequenz der Formel (I) enthält; X-A-Y-B-Z (I), in welch» A und B Aminosäurerestsequenzen sind, welche Sequenzen der Maul- und Klauenseuche-Virus-VPj-55 Capsidprotein-Serotypen enthalten, und von denen die eine 18 bis 24 Aminosäurereste enthält, und die Aminosäurerestsequenz in den Stellungen 141 bis 158 des O-Serotypus oder die äquivalente Sequenz ander» Serotypen umfaßt, und die andere davon 14 bis 20 Aminosäurereste enthält, und die Aminosäurerestsequenz in den -2-
AT 396 248 B
Stellung«! 200 bis 213 des O-Serotypus oder die äquivalente Sequenz anderer Serotypen umfaßt; X H, H-Cys oder H-Cys-Cys ist, wobei die Sulfhydryle davon geschützt oder frei sein können; Z OH, Cys-OH oder Pro-Cys-Gly-OH ist, wobei die Sulfhydryle davon geschützt oder frei sein können; und Y eine Sequenz von 2 bis 6 Aminosäureresten ist, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Wie angegeben, ist diese Erfindung auf eine Klasse synthetischer, immunogener Peptide der Formel (I):
X-A-Y-B-Z (D gerichtet
Die Gruppen A und B umfassen Aminosäuresequenzen, die ausgewählten Sequenzen entsprechen, welche in dem VP i -Capsidprotein vom FMDV-Serotypus 0, Subtypus 1, Stamm Kaufbeuren (OjK) und äquivalenten analogen Sequenzen, die in irgendwelchen anderen Maul- und Klauenseuche-Virusserotypen vorliegen, vorhanden sind.
Es ist bekannt daß sieben Serotypen von FMDV existieren. Die üblichsten sind europäische und tragen die Bezeichnungen A, O und C. Andere sind drei südafrikanische, SAT-1, SAT-2 und SAT-3; und eine asiatische, Asia-1. Jeder Serotypus ist zusätzlich dafür bekannt daß er eine Anzahl von Subtypen und assoziierten Subtypusstämmen hat Spezifische Beispiele sind Serotypus 0, Subtypus 1, Stamm Kaufbeuien (OjK); Serotypus 0, Subtypus 1, Stamm Campos (OjC); Serotypus 0, Subtypus 1, Stamm British Field Strain (OjBFS); Serotypus A, Subtypus 10, Stamm 61 (A10.61); Serotypus A, Subtypus 12, Stamm 119 (A12.119); Serotypus A, Subtypus 24, Stamm Cruzeiro (A24C); Serotypus A, Subtypus 27 (A27); Serotypus A, Subtypus 79 (A79); und Serotypus C, Subtypus 3, Stamm Indaial (C3I).
Die Aminosäurerestsequenzen in den Stellungen 141-158 und200-213 des O-Serotypus stellen den Brennpunkt der Definitionen der Gruppen A und B der Peptide dieser Erfindung dar. In irgendeinem spezifischen Fall umfaßt Gruppe A eine der Sequenzen und Gruppe B die andere. Zusätzlich sind die analogen, jedoch nicht notwendigerweise identischen Sequenzen, welche in irgendeinem der anderen Serotypen und in irgendeinem der anderen Serotypussubtypen vorlieg«!, von der Definition der Gruppen A und B eingeschlossen. In jenen Fällen, in welchen die Definition der Gruppen A und B eine Länge von Aminosäureresten umfaßt, die größer als 18 bzw. 14 Aminosäuren für die Sequenzen ist, die den Aminosäuren 141-158 bzw. 200-213 des O-Serotypus «itsprechen, können die übrigen Reste irgendeine Aminosäure sein.
Zum Zwecke der Veranschaulichung werden die folgenden als Beispiele der Sequenz 141-158 für OjK und analoger Sequenzen für andere virale Serotypen und Subtypen angegeben; 141 150 158
OjK ValProAsnLeuArgGlyAspLeuGlnValLeuAlaGlnLysValAlaArgThr
OjBFS ValProAsnLeuArgGlyAspLeuGlnValLeuAlaGlnLysValAlaArgThr
OjC ValProAsnValArgGlyAspLeuGlnValLeuAlaGlnLysValAlaAigThr A10.61 Ser - ArgSer - GlyAspLeuGlySerlleAlaAlaArgValAlaThrGln A12.119 SeiGly - ValArgGlyAspPheGlySerLeuAlaProArgVälAlaArgGln A24C SerGly - ArgArgGlyAspMetGlyThrLeuAlaAlaArgValValLysGln A27 Gin - - ArgAlaGlyAspMetGlySerLeuAlaAlaArgValAlaLysGln A79 SerGly - ArgArgGlyAspMetGlySerLeuAlaAlaArgValAlaLysGln C3I ---ArgArgGlyAspLeuValHisLeuAlaAlaAlaHisAlaArgHis
Die folgenden sind Beispiele der Sequenz 200-213 für OjK und analoger Sequenzen für andere virale Serotypen und Subtyp«i: 200 213
OjK ArgHisLysGlnLysIleValAlaProValLysGlnThrLeu
OjBFS ArgHisLysGlnLysIleValAlaProValLysGlnThrLeu A10.61 ArgTyrLysGlnLysIlelleAlaProAlaLysGlnLeuLeu A12.119 ArgHisLysGlnLysIlelleAlaProGlyLysGln - Leu A24C ArgHisLysGlnLysIlelleAlaProAlaLysGlnLeuLeu C3I ArgHisLysGlnProLeuIleAlaProAlaLysGlnLeuLeu
In d«i durch diese Erfindung geschaffenen Peptiden enthält eine der Gruppen A oder B eine Peptidsequenz 141-158u*ddieandereeinePeptidsequenz200-213. Vorzugsweise ist einederGruppenAoderBeine Peptidsequenz 141-158, und die andere ist eine Peptidsequenz 200-213. In höher bevorzugtem Maße ist die Gruppe A die Sequenz -3-
AT 396 248 B 200-213 und die Groppe B die Sequenz 141-158. In noch höher bevorzugtem Maße sind die Gruppen A und B der Peptide dieser Erfindung Peptidsequenzen, die vom gleichen FMDV-Serotypus stammen.
Die Gruppe X stellt den Abschnitt der Peptide dieser Erfindung mit endständiger Aminogruppe dar. X kann der Wasserstoff des Aminoterminus oder eine Mono-cysteinyl- oder Di-cysteinylfortsetzung sein. Falls X Mono- oder Di-cysteinyl ist, können die Cysteinsulfhydryle geschützt oder frei sein. Irgendeine eines umfassenden Bereiches von Schutzgroppen, die dem Fachmann geläufig sind, kann verwendet werden. Beispiele für diese sind Sulfonat, Carboxymethyl, Carboxamidomethyl, Aminoethyl u. dgl. Vorzugsweise ist X jedoch Wasserstoff.
Die Gruppe Z definiert das endständige Carboxyl der Peptide dieser Erfindung. Z ist somit ein Hydroxyl odereine Cystein enthaltende Fortsetzung, nämlich Cystein oder das Tripeptid Pro-Cys-Gly-OH. Auch hier kann das Cystein wieder geschützt oder frei sein, und falls es geschützt ist, kann es derart blockiert sein, daß irgendeine der gleichen Schutzgruppen, wie sie oben beschrieben sind, verwendet wird.
Die Groppe Y verbindet die Groppen A und B und stellt einen Aminosäurerest oder eine Sequenz dar, die 2 bis 6 Aminosäurereste aufweist. Vorzugsweise ist Y eine Aminosäuresequenz mit 2 bis 4 Aminosäureresten. Die Sequenz kann irgendeinen aus einem umfassenden Bereich von Aminosäureresten umfassen, wobei Prolin ein Aminosäurerest der Wahl ist, und wobei Sequenzen, die Pro-Pro enthalten, besonders bevorzugt sind. Speziell bevorzugte Sequenzen können Pro-Pro-Ser oder Leu-Pro-Pro-Thr sein.
Von den Verbindungen dieser Erfindung sind deren pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze und deren pharmazeutisch annehmbare Carbonsäuresalze mit umfaßt. „Pharmazeutisch annehmbare Salze“ bezieht sich auf jene Salze, die in der Chemotherapie eines warmblütigen Tieres nützlich sind.
Der Ausdruck „pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze“ umfaßt sowohl organische als auch anorganische Säureadditionssalze, darunter z. B. jene, die aus Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Fluorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Sulfonsäure, Weinsäure, Fumarsäure, Bromwasserstoffsäure, Glykolsäure, Zitronensäure, Maleinsäure,Phosphorsäure, Bemsteinsäure, Essigsäure, Salpetersäure, Benzoesäure, Ascorbinsäure, p-Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure oder Propionsäure, hergestellt sind. Vorzugsweise sind die Säureadditionssalze jene, die aus Chlorwasserstoffsäure, Essigsäure oder Bernsteinsäure hergestellt sind. Die obigen Salze werden nach üblichen, dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt.
Der Ausdruck „Carbonsäuresalze“ umfaßt z. B. Ammoniumsalze und Alkalimetallsalze, wie Natrium-, Kalium-und Lithiumsalze.
Aus Zweckmäßigkeitsgründen werden die jeweiligen Aminosäuren unter Anwendung ihr»- anerkannten Dreibuchstabenabkürzungen bezeichnet
Diese Bezeichnungen sind wie folgt: 3-Buchstabenabkürzune Alanin Ala Arginin Arg Asparagin Asn Asparaginsäure Asp Cystein Cys Glutaminsäure Glu Glutamin Gin Glycin Gly Histidin His Isoleucin Ile Leucin Leu Lysin Lys Phenylalanin Phe Prolin Pro Serin Ser Threonin Thr Tryptophan Tip Tyrosin Tyr Valin Val -4-
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Beispiele für Verbindungen dieser Erfindung sind: VPi(OiK) νΡχίΟχΚ) νΡχίΟχΚ) VPiiOjK) VPj(OjBFS) νΡιίΑιο,βΐ) ^1^12,119) VPxiA^C) νΡι(0χΟ VPi(C3I) VPjiOjK) H[(200-213)ProProSer(141-158)]ProCysGly-OH; H-Cys[(200-213)ProProSer(141-158)]Cys-OH; H-CysCyst(200-213)ProProSer(141-158)]ProCysGly-OH; H[(200-213)PraProSer(141-158)]OH; H[(141-158)ProPro(200-213)]OH; H[(141-158)LeuProProSer(200-213)]OH; H-Cyst(200-213)LeuProProSer(141-158)]OH; H[(200-213)ValProProThrArg(141-158)]OH; H-CysCys[(141-158)ProPro(200-213)]Cys-OH; H[(200-213)ProProSer(141-158)]OH; H-Cys-[ArgTyrAsnArgAsnAla(141-158)]LeuProProThr[GluAla(200-213)]OH.
Die Verbindungen dieser Erfindung können nach irgendeiner einer Vielfalt von anerkannten Peptidsynthese-methoden hergestellt werden, darunter klassischen (Lösungs-)Verfahren, Festphasenverfahren und die in neuerer Zeit verfügbaren Rekombinations-DNS-Verfahren.
Eines der Hauptverfahren zur Herstellung der Verbindungen dieser Erfindung ist die Festphasenmethode, bei der die Aminosäuresequenz stufenweise, ausgehend von einer anfänglichen unlöslichen, harzgetragenen, C-endständigen Aminosäure, aufgebaut wird. Methoden für das Festphasenverfahren sind von J. Stewart und Mitarbeitern in Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, 1984, beschrieben worden.
Spezifische Beispiele für die Festphasenpeptidsynthese nach dem Stande der Technik, die bei der Herstellung dieser synthetischen FMDV-Immunogene verwendet werden können, finden sich in Berichten von RD. DiMarchi, J.P. Tarn, R.B. Merrifield, Int. J. Pep. Prot. Res. 19,270-279 (1982); R.B. Merrifield, L.D. Vizioli, H.G. Boman, Biochem. 21, 5020-5031 (1982); und S. Mojsov, R.B. Merrifield, Eur. J. Biochem. 145, 601-605 (1984). Die wichtigeren Merkmale sind die folgenden: 1. Verwendung von Copoly(styrol - 1 % Divinylbenzol)harz, Kügelchen mit einer Größe von 200 bis 400 Maschen, verfügbar von der Firma Bio-Rad Laboratories. 2. Funktionalisierung des Harzträgers zum Aminomethylharz nach dem Verfahren von Mitchell und Mitarbeitern, 1978 (siehe unten). 3. Amidierung der Aminosäure mit endständigem Carboxyl mit dem Aminomethylharz als dessen tert.Butyloxycarbonylaminoacyl-[4-(oxymethyl)phenyl]essigsäurederivat. 4. Abspaltung der Amino-schützenden tert.Butyloxycarbonyl-(Boc)-gruppe in 50 % TFA/CH2CI2 und Neutralisation des Amins in 5 % DIEA/CH2CI2. 5. Es wird eine Doppelkupplung an jedem Rest angewendet. Mit Ausnahme von Asn, Gin und Arg erfolgt die eiste Kupplung durch vorgebildetes, symmetrisches Anhydrid. Die zweite Kupplung erfolgt in allen Fällen durch vorgebildeten HOBt-Ester. Die erste Kupplung für die vorerwähnten Ausnahmen ist der zweiten Kupplung analog. 6. Das Peptid wird von dem Harzträger abgespalten, indem es einer Säure in Gegenwart eines Carbonium-ionenfängers ausgesetzt wird. 7. Die folgenden Seitenkettenschutzgruppen werden bevorzugt angewendet: Arginin (Tosyl), Asparaginsäure (O-Cyclopentyl, Cystein (4-Methoxybenzyl), Glutaminsäure (O-Cyclopentyl), Histidin (Benzyloxymethyl), Lysin (2-Chlorbenzyloxycarbonyl), Serin (Benzyl), Threonin (Benzyl), Tryptophan (Formyl) und Tyrosin (2-Brombenzyloxycarbonyl).
Die bevorzugten Peptidylharzspaltungsbedingungen umfassen die Exponierung des Peptidylharzes gegenüber wasserfreier HF bei einer Temperatur von -10 °C bis +15 °C. Der bevorzugte Carboniumionenfänger ist p-Kresol.
Verbindungen dieser Erfindung können auch über die Rekombinations-DNS-Methodik hergestellt werden. Bei deren Herstellung wird eine Nukleotidsequenz, die für das gewünschte Peptid codiert, unter Anwendung von nunmehrigen Routineverfahren für eine solche Synthese hergestellt. Diese Verfahren umfassen im allgemeinen die Herstellung von Oligonukleotiden, die sowohl für Fragmente der gewünschten codierenden Sequenz als auch für die komplementäre Sequenz davon codieren. Die Oligonukleotide werden so ausgelegt, daß sie ein Überlappen eines Fragments der Codierungssequenz mit zwei Fragmenten der komplementären Sequenz ergeben, und vice versa. Die Oligonukleotide werden gepaart und vereinigt, wobei letztlich die gewünschte Gensequenz gebildet wird.
Die Sequenz wird in einen Clonungsvektor an einer Stelle eingeführt, die die Expression des Peptidprodukts, für das sie codiert, gestattet. Ein geeigneter Clonungsvektor enthält wenigstens einen Abschnitt einer Expressions-kontrollsequenz eines Gens. -5-
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Eine typischeExpressionskontrollsequenz kann anhand von fünf Elementen beschrieb«! weiden. Die Elemente sind in der Reihenfolge, in der sie in dem Gen aufscheinen, wie folgt* (a) Der Promotorbereich; (b) der unübersetzte S-Bereich; (c) die Proteincodierungssequenz; (d) der unübersetzte 3'-Bereich; und (e) die Transkriptionsbeendigungsstelle. 5 Die Funktion jedes dieser Elemente in Gensystemen ist wohlbekannt. Der Promotorbereich vermittelt die
Initiierung der Messenger-RNS (mRNS)-Produktion (Transkription). Der Promotor kann (1) frei von externer Kontrolle sein (konstitutiv), (2) unter der Kontrolle eines Repressors, einer Substanz, die, falls vorhanden, die Genfunktion unterdrückt, stehen, oder (3) unter der Kontrolle eines Auslösers, einer Substanz, die zur Herbeiführung der Genfunktion erforderlich ist, stehen. Das Lipoprotein (lpp)-Gen ist z. B. von äußerer Kontrolle frei und wird somit 10 als „konstitutiv” bezeichnet.
Aufgrund ihrer Lage am oder in der Nähe des Promotors ist die „Transkriptionsinitiierungsstelle“ ein Punkt, an welchem RNS Polymerase bindet, um die Transkription von mRNS zu initiieren. Sobald die Transkription initiiert ist, wird mRNS gebildet Die Struktur der entstandenen mRNS wird durch die DNS-Sequenzen der obigen Genelemente (b) bis (d) bestimmt IS Die entstandene mRNS trägt eine Sequenz, die in Proteinprodukt übersetzbar ist Die übersetzbare Sequenz ist abwärts von dem unübersetzten 5'-Bereich und aufwärts von dem unübersetzten 3'-Bereich angeordnet Die Translation wird durch die Bindung von Ribosomen an eine Sequenz in dem unübersetzten mRNS S'-Beieich vermittelt, die als die Ribosomenbindungsstelle bezeichnet wird, und wird an dem Übersetzungsausgangscodon (AUG) initiiert, das als das erste Codon der Produktgensequenz aufscheint und auch für die Aminosäuremethionin 20 (Met) codiert Die Übersetzung wird an einem oder mehreren Beendigungscodonen beendet die am Ende des Übersetzungsbereiches aufscheinen.
Durch die Methoden der Rekombinations-DNS ist es möglich geworden, Gonungsvektoren herzustellen, die für die Erzeugung ausgewählter Fremd-(exogener)-proteine durch Einfügung einer Expressionskontrollsequenz in solche Vektoren nützlich sind, nämlich einer Sequenz von Nukleotiden, die die Expression von Strukturgenen unter 25 Erzeugung ναι exogenem Protein kontrolliert und regelt, wenn eine operative Verknüpfung mit jenen Genen erfolgt
Im Zusammenhang mit dem Vorstehenden umfaßt der Ausdruck „Expressionskontrollsequenz“ die obigen Elemente (a), (b), (d) und (e).
DieRekombinations-DNS-Methodik kann angewendet werden, um Verbindungen dieser Erfindung entweder als Teil eines größeren „Hybrid“-Moleküls oder durch direkte Expression auszudrücken. Bei der Ausführungsform der 30 direkten Expression wird der Clonungsvektor so ausgelegt, daß das Expressionsprodukt zur Gänze aus dem gewünschten Produkt zusammengesetzt ist, dem ein Methionin-(Met)-rest vorausgeht, welcher auf das Vorliegen des wesentlichen Ausgangscodons zurückzuführen ist. Der überflüssige Met-Rest kann durch Behandlung des Produktes mit Bromcyan oder mit Phenylisothiocyanat und anschließend mit ein« starken, wasserfreien Säure, wie Trifluoressigsäure, entfernt werden. 35 Bei der Hybridmolekülexpressionsausführungsform wird eine DNS-Sequenz, die für das gewünschte Produkt codiert, in die Expressionskontrollsequenz eines Oonungsvektors an einem solchen Punkt eingefügt, daß das zur Expression gelangende Produkt ein Hybridprotein enthält. „Hybridprotein“ bedeutet ein Rekombinations-DNS-Produkt, das ein Fremdprotein, im allgemeinen das gesamte oder einen Teil des natürlichen (endogenen) Proteins, welches durch die Expressionskontrollsequenz (z. B. Lipoprotein in dem Lipoproteingen) «zeugt wird, enthält, an 40 welches das gewünschte Protein gebunden ist.
Das richtig ausgebildete, nach der Rekombinations-DNS-Methodik erzeugte Hybridprotein wird eine Spaltungsstelle an der Vereinigung des endogenen Proteinabschnittes und des gewünschten Produktes aufweisen. Die Spaltungsstelle ermöglicht die Erzeugung von reifem Produkt durch chemische oder enzymatische Behandlung des Hybridproteinproduktes. In hohem Maße nützliche, selektive Spaltungsstellen umfassen eine DNS-Sequenz, 45 welche für eine Aminosäure codiert, oder eine Sequenz von Aminosäuren, die an ihrem C-Ende chemisch od« enzymatisch gespalten werden kann.
Beispiele für chemische Mittel, die zur Spaltung,von Proteinen nützlich sind, sind Bromcyan, BNPS-Skatol und Hydroxylamin. Bromcyan spaltet die Proteine an der C-Endstelle eines Methioninrestes. Die selektive Spaltungsstelle ist daher ein Methioninrest als solcher. 50 Hydroxylamin spaltet an der C-Endstelle des Abschnittes -Asn-Z-, in welchem Z Gly, Leu oder Ala ist. BNPS-Skatol spaltet an der C-Endstelle eines Tryptophanrestes.
Beispiele für enzymatische Mittel, die für die Spaltung nützlich sind, sind Trypsin, Papain, Pepsin, Plasmin, ThrombinundEnteiokinase.JedesbewirktdieSpaltung an ein«besonderen Aminosäuresequenz,welche es «kennt. Beispielsweise ist die selektive Spaltungsstelle, die Enterokinase erkennt, die Aminosäuresequenz -(Asp)n-Lys-, in 55 welch« ndne ganze Zahl ναι 2 bis 4 ist
Eine in höchstem Maße bevorzugte, selektive Spaltungsstelle, insbesondere für jene Verbindungen dieser Erfindung, in den«! Methionin fehlt, ist ein Methioninrest. Dieser Rest wird, wenn er an die N-Endstelle des -6-
AT 396 248 B gewünschten Produktes gebunden ist, mittels bekannter Verfahren bei Anwendung von Bromcyan unter Bildung des gewünschten, reifen Produktes bequem abgespalten.
Bei der Konstruktion nützlicher Clonungsvektoren sind verschiedene Elemente erforderlich. Zwei der erforderlichen Elemente sind allen nützlichen Clonungsvektoren gemeinsam. Erstens muß der Vektor ein DNS-Segmentaufweisen, 5 das einen funktionellen Ursprung der Replikation (Replicon) enthält Plasmide und Phagen-DNS enthalten aufgrund ihrer eigenen Natur Replicone, welche die Replikation in einer Wirtszelle «‘leichtem.
Zweitens muß der Vektor ein DNS-Segmentaufweisen, das an eine transformierbare Wiitszelle eine Eigenschaft überträgt, welchezur Auswahl transformierterZellenaus nicht transformiertenZellennützlich ist. FürSelektionszwecke kann irgendeine aus einem umfassenden Bereich von Eigenschaften angewendet werden. Eine der am häufigsten 10 angewendeten Eigenschaften ist antibiotische Resistenz, z. B. Tetracyclinresistenz oder Ampicillinresistenz.
Die vorstehenden zwei Elemente sind im allgemeinen in bequem verfügbaren und anerkannten Clonungsvektoren vorhanden. Beispiele für geeignete Clonungsvektoren sind bakterielle Plasmide, wie Plasmide aus E. coli, darunter pBR322, pMB9, ColEl, pCRl; Plasmide mit weiterem Wirtsbereich, darunter RP4; Phagen-DNSn, wie Lambda u. dgl. Die meisten, wenn nicht alle, der obigen anerkannten Vektoren tragen bereits die vorbeschriebenen zwei IS Elemente.
Ein drittes Element ist die Expressionskontrollsequenz. Es kann irgendeine aus einem umfassenden Bereich solcher Kontrollsequenzenangewendetwerden.darunterz.B.solcheausdemLipoproteingen,dem ß-Galactosidasegen, dem Tryptophangen, dem ß-Lactamasegen oder Phagenlambda.
Bei der Erzeugung eines geeigneten Clonungsvektors durch Einsatz derausgewähltenExpressionskontrollsequenz 20 werden Routineverfahren angewendet. Innerhalb von Clonungsvektoren gibt es verschiedene Stellen, an welchen unter Verwendung einer für eine solche Stelle spezifischen Restriktionsendonuklease-Trennungen vorgenommen werden können. Irgendeine dieser Stellen kann für die Einfügung der Expressionskontrollsequenz ausgewählt weiden. Beispielsweise gibt es in dem wohlbekannten und dokumentierten Plasmid pBR322 verschiedene geeignete Restriktionsstellen, von denen beliebige als Einfügungsstellen angewendet werden können. Eine Pstl-Stelle liegt 25 innerhalb des Gens für ß-Lactamase vor. Andere Stellen außerhalb irgendeines spezifischen Codierungsbereiches sind EcoRI und PvuII. Diese und andere Stellen sind dem Fachmann wohlbekannt
Unter Ausnützung der Vorteile irgendeiner dieser Stellen oder anderer kann die Einfügung einer Expressionskontrollsequenz oder des wesentlichen Teils davon bei der Eizeugung von durch diese Erfindung definierten Vektoren bequem vorgenommen werden. 30 Ein viertes Element ist selbstverständlich die DNS-Sequenz, die für das gewünschte Produkt codiert Wie vorstehend erwähnt, kann diese DNS-Sequenz synthetisch aufgebaut werden, z. B. unter Anwendung des anerkannten Phosphotriesterverfahrens oder anderer wohlbekannter Verfahren.
Geeignete Clonungsvektoren können in einem umfassenden Bereich von Wirtsorganismen benutzt werden, z. B. gram-negative, prokaiyotische Organismen, wie Escherichia coli, Serratia, Pseudomonas u. dgl; gram-positive, 35 prokaryotische Organismen, wie Bacillus, Streptomyces u. dgl.; und eukaryotischeOrganismen, wie Saccharomyces u. dgl. Vorzugsweise ist der Wirtsorganismus ein gram-negativer, prokaryotischer Organismus. Von gram-negativen, prokaryotischen Organismen wird E.coli besonders bevorzugt z. B. E. coli K-12-Stämme, wie RV308.
Unter Anwendung wohlbekannter Methodik werden die entsprechend hergestellten Clonungsvektoren zur Transformierung geeigneter Wirtsorganismen verwendet, in solchen Organismen verstärkt und exogenes Pro-40 teinprodukt wird unter Anwendung von Standardfermentationsbedingungen zur Expression gebracht Das exogene
Proteinprodukt wird durch Routineverfahren aus der entstandenen Fermentationsbrühe isoliert
Somit wird gemäß derErfindung ein Verfahren zur Herstellung einer synthetischen Maul- und Klauenseuchevakzine geschaffen, welche eine Sequenz der Formel (Ί): 45 X-A-Y-B-Z (I) enthält in welch«' X, A, Y, B und Z wie oben definiert sind, welches Verfahren umfaßt: (a) Das Abspalten einer Schutzgruppe aus einer entsprechend geschützten Verbindung der Formel (I); oder 50 (b) das Züchten eines Mikroorganismus, der durch einen Expressionstransfervektor transformiert ist welcher eine DNS-Sequenz enthält die für eine Verbindung der Formel (I) codiert unter Bedingungen, die für die Expression der für die Verbindung der Formel (I) codierenden DNS Sequenz geeignet sind; und das Reinigen der Verbindung der Formel (I) aus dem Lysat oder Kulturmedium des genannten Mikroorganismus; und (c) gewünschtenfalls das Bilden eines Salzes einer freien Verbindung unter Bildung eines entsprechenden 55 pharmazeutisch annehmbaren Salzes.
Die Verbindungen dieser Erfindung, die bei der Behandlung von Maul- und Klauenseuche wirksam sind, können -7-
AT 396 248 B in einer Vielfalt von pharmazeutischen Zusammensetzungen und Formulierungen verwendet werden, und können auf einer Vielfalt üblicher Wege, wie intranasal, intramuskulär, intravenös, subkutan und intraperitoneal, verabreicht werden.
Bei d»Verabreichung derVerbindungen dieser Erfindung umfassen diepharmazeutischen, für Injektionszwecke geeigneten Formen sterile, wässerige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver zur Rekonstitution zu sterilen, injizierbaren Lösungen oder Dispersionen. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder Dispergiermedium sein, das z. B. Wasser, Ethanol, Polyol (z. B. Glycerin, Propylenglykol, flüssiges Polyethylenglykol), geeignete Mischungen davon und pflanzliche öle enthält Eine entsprechende Fließfähigkeit kann z. B. durch die Anwendung eines Überzuges, wie Lecithin, durch die Aufrechterhaltung der erforderlichen Teilchengröße im Falle der Dispersion und durch die Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln aufrecht erhalten werden. Der Wirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und Antifungusmittel vorgebeugt werden, beispielsweise mittels Paraben, Chlorbutanol, Phenol, m-Kresol oder Sorbinsäure. In vielen Fällen wird es wünschenswert sein, isotonische Mittel, z.B.Zuck»od»Natriumchlorid,einzuv»leiben.Eine längerdauernde Absorption derinjizierbaren pharmazeutischen Form kann durch Verwendung von die Absorption verzögernden Mitteln, z. B. Aluminiummonostearat und Gelatine, bewirkt werden.
Sterile, injizierbare Lösungen können durch Einverleibung der Verbindungen dieser Erfindung in die erforderliche Menge des geeigneten Lösungsmittels mit verschiedenen der anderen Bestandteile nach Wunsch hergestellt werden.
Falls erwünscht und zwecks wirksamerer Verteilung können die Verbindungen Systemen mit langsamer Freisetzung oder gezielter Freisetzung, wie Polymermatrices, Liposomen und Mikrokügelchen, einverleibt werden.
Dosen der Verbindungen dieser Erfindung werden dem Empfänger während eines Zeitraumes verabfolgt, während welchem eine prophylaktische oder therapeutische Behandlung wegen Maul- und Klauenseuche »wünscht ist. Das Gewicht des Empfängers und die Art der Verabreichung werden auf die Größe der Dosis, die zur Induktion ein» speziellen Reaktion erforderlich ist, Einfluß haben.
Es ist besonders vorteilhaft, die Verbindungen dieser Erfindung in Einheitsdosierungsform zur leichteren Verabreichung und gleichmäßigen Dosierung zu formulieren. Der Ausdruck „Einheitsdosierungsform“ bezieht sich auf eine physikalisch diskrete Einheit, die zur Schaffung einer Einzeldosis für das zu behandelnde Individuum geeignet ist. Jede Einheit enthält eine vorbestimmte Menge der Verbindung, die so berechn» ist, daß sie die gewünschte therapeutische oder prophylaktische Wirkung gemeinsam mit dem pharmazeutisch annehmbaren Träg» »gibt. Die spezifische Einheitsdosierungsform wird bestimmt durch (a) die besonderen K»mmeikmale der speziellen Zusammensetzung und (b) die besondere, zu erzielende Wirkung, und ist unmittelbar davon abhängig.
Die folgend»i, nicht beschränkenden Beispiele dienen der weiteren Veranschaulichung d» Erfindung.
Beispiele I. Herstellung von synthetischen FMD-Vakzinen.
Alle Peptide wurden unt» Verwendung des Beckman 990B-Festphasenpeptid-Synthesizers synthetisiert, wobei einehalbautomatisierteProgrammi»ungangewendet wurde. Das anfänglicheinfunktionsetzen durch dieBeschickung mitder ersten Aminosäure,undallederZugabe der letzten Aminosäurefolgenden Stufen wurden manuell ausgeführt. Alle Reagenzien waren, soweit nichts anderes angegeben ist, von höchster, im Handel v»fügbar» Reinheit. Dimethylformamid (DMF) wurde über 0,4 nm (4Ä)-Molekularsieben eine Woche lang vor d» Verwendung gelagert. Dichlormethan (CH2CI2) war solches von HPLC-Qualität Diisopropylethylamin (DIEA) wurde vor der Verwendung aus Ninhydrin destilliert Copoly-(styrol-l % Divinylbenzol)-harz, Kügelchen mit einer Größe von 200-400Masch»i, wurde von der Firma Bio-Rad Laboratories bezogen. Die Qualität der geschützten Aminosäuren, bezogen von der Firma Peninsula Laboratories and Bachem, wurde vor der Verwendung mittels Dünnschichtchromatographie, optischer Drehung, Aminosäureanalyse und Massenspektralanalyse bewertet A. Herstellung von Aminomethvl-harz
Die Herstellung von Aminomethyl-harz erfolgte in der von A.R. Mitchell, S.B.H. Kent, M. Engelhard, R3. Merrifield, J. Org. Chem.43,2845-2852 (1978), beschriebenen Weise,mitder Abänderung, daß diegewünschte Funktionalisi»ung die vierfache der berichteten war. Zu 100 g sorgfältig gewaschenem Harz wurden in einem Dreihalsrundkolben 16 g (81 mMol) N-(Hydroxymethyl)phthalimid und 21 Trifluoressigsäure/Methylenchlorid (1:1, VoL/Vol.) zugesetzt Unter raschem, von oben vorgenommenem Rühren wurde langsam Trifluormethan-Sulfonsäure (40 ml, 0,44 Mol) zugegeben. Nach 6 Stunden Umsetzung bei 22 °C wurde die Lösung filtriert und ausgedehnt mit je 4 1 von Trifluoressigsäure/Methylenchlorid (1:1, V0I./V0I.), Methylenchlorid, Ethanol und schließlich Methylenchlorid gewaschen. Das Harz wurde, nach Trocknen unter Vakuum, 16 Stunden lang in 21 Ethanol, das 5 % Hydrazin enthielt, unter Rückfluß erhitzt. Das Harz wurde warm abfiltriert und mit siedendem -8-
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Ethanol (4x21), Methanol (4x21) und Methylenchlorid (4x21) gewaschen. Das Produkt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei eine Aminfunktionalisierung von0,836mMol/g gemäß Ninhydrinanalyse [V. Sarin, S.B.H. Kent, J.P. Tarn, RJB. Merrifield, Anal. Biochem. 117,147-151 (1981)] «halten wurde. B. Herstellung von Boc-Glvcin-M-foxvmethvlDhenvniessigsäure
Die Synthese von Boc-Glycin-[4-(oxymethylphenyl)]essigsäure «folgte genauso, wie dies von JP. Tarn, S.B.H. Kent, T.W. Wong, R.B. Merrifield, Synthesis, 955-957 (1979), beschrieben worden ist, bei einer Ausbeute von 45%. C. Bindung von derivatisiertem Glvcin an Aminomethvlharz
Boc-Gly-[4-(oxymethylphenyl)]essigsäure (1,4 mMol) wurde in 20 ml DMF/Methylenchlorid (1:3, VolTVol.) bei 0 °C in Gegenwart von 1,4 mMol l-Hydroxybenzotriazol(HOBt) aufgelöst Eine äquivalente Menge (1,4 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) wurde zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei 0 °C gerührt worauf DicyclohexylharnstoffdurchFiltration abgetrennt und dieüberstehendeFlüssigkeitzu4gAminomethylharz, das in 20 ml Methylenchlorid suspendiert war, zugesetzt wurde. Nach zwei Stunden wurde das Harz abfiltriert dreimal mit 40 ml Methylenchlorid gewaschen und dann in 40 ml 0,5M Essigsäureanhydrid/0,1M DIEA/Methylenchlorid suspendiert. Nach weiteren 2 Stunden war das Harz Ninhydrin-negativ. Das Harz wurde dreimal mit 40 ml Methylenchlorid gewaschen, und anschließend wurdedie tertButyloxycarbonylschutzgruppe von Glycin in 40 ml Trifluoressigsäure/Methylenchlorid (1:1, Vol/Vol.) entfernt D. Wiederholtes stufenweises Svntheseprotokoll
In jedemFallwurdeeinedoppelte Kupplung jeder Aminosäure,in dreifachem Üb«schue zum Amin,angewendet Während Asn, Gin und Arg zweimal als deren vorgebildete HOBt-Est« gekuppelt wurden, wurd«i die übrigen Aminosäuren zuerst als deren vorgebildete symmetrische Anhydride gekuppelt und die Kupplung wurde mit deren vorgebildeten HOBt-Estem wiederholt Die Neutralisation, Schutzgruppenabspaltung und alle Waschvorgänge waren gemäß dem folgenden Protokoll vollautomatisiert, bei 15 ml Lösungsmittel/Gramm Ausgangsharz. 1. 5 % DffiA/CH2Cl2 (2x2 Minuten) 2. CH2C12 (6x1 Minute) 3. Erste Kupplung (1 x 120 Minuten) 4. CH2C12 (6x1 Minute) 5. 5 % DffiA/CH2Cl2 (2x2 Minuten) 6. CH2C12 (6x1 Minute) 7. Zweite Kupplung (1 x 120 Minuten) 8. CH2C12 (6x1 Minute) 9. 50 % TFA/CH2C12 (1x2 Minuten; 1 x 20 Minuten) 10. CH2C12 (6x1 Minute) Währenddes Syntheseablaufes wurden aliquote Anteiledes Harzes zur Herstellung vonverkürzten Immunogenen entnommen. E. Herstellung von OjK. ΥΡχ n41-1581ProCvsGlv - - [Peptid mit 21 Resten!
Annähernd drei Gramm Peptidylharz, die 1,34 g geschütztes ΟχΚ, VPj (141-158)-ProCysGly repräsentieren, wurden mit 30 ml HF/p-Kresol (9:1) bei 0 °C 60 Minuten lang behandelt. Nach Beendigung d« Spaltung wurde das Harz unter Vakuum bei 0 °C zur Trockne eingedampft und anschließend mit 5 x 50 ml Diethylether gewaschen. Das von Schutzgruppen befreite Peptidwurde unter Anwendungfolgend«aufeinanderfolgenderEssigsäurebehandlungen aufgelöst: 10 % HOAc (3 x 30 ml), 50 % HOAc (1 x 30 ml), und schließlich 10 % HOAc (3 x 30 ml). Das Peptid wurde gefriergetrocknet, wobei eine Ausbeute von 76 % erhalten wurde. Die Titration nach Ellman ergab einen Mindestgehalt an freien Sulfhydrylgruppen von 70 %. Das Peptid wurde mittels Sephadex-G-25-Gelpermeationschromatographie in 10 %ig« HOAc gereinigt, nachdem eine Dithiothreitol (DTT)-Reduktion erfolgte, die, wie durch analytische HPLC ermittelt, eine in hohem Maße homogene monomere Fraktion lieferte. F. Herstellung von OtK. VPt ILeuProProSer(141-158)1 ProCvsGlv - - iPeotid mit 25 Restenl.
Annähernd 1,1 g Peptidylharz, welche 0,532 g geschütztes ΟχΚ, VPj [LeuProProS«(141-158)]ProCysGly repräsentieren, wurden wie in TeilE behandelt, wobei das gewünschte Peptid in 84 %iger Ausbeute «halten wurde. -9-
AT 396 248 B G. Herstellung von C^K. VPt r(200-213)ProProSera41-158)1 ProCvsGlv - - fPeptid mit 38 Resten!. Annähemd2,4 gPeptidylhaiz, welche 1,29 g geschütztes O^K, VPj [(200-213)ProProSer(141-158)] ProCysGly repräsentieren, wurden wie in Teil E behandelt, wobei das gewünschte Peptid in 97 %iger Ausbeute erhalten wurde. H. Herstellung von OjK. VPt rCvsCvs('200-213tProProSern41-15^ProCvsGlv - - [Pentid mit 40 Restenl. Annähernd 2,5 g Peptidylharz, welchel,39 g geschütztes OjK, VPj [CysCys(200-213)ProProSer(141-158)]
ProCysGly repräsentieren, wurden wie in Teil E behandelt, wobei das gewünschte Peptid in 97 %iger Ausbeute erhalten wurde. I. Herstellung von C^K. νΡχ H-Cvs-rArgTvrAsnArgAsnAlafl41 -15811 LeuProProThr fGluAlaf200-213)l-OH - - fPeptid mit 45 Restenl.
Geschütztes O jK, VP j H-Cys-[ArgTyrAsnArgAsnAla(141-158)] LeuProProThr [GluAla(200-213)] -peptidylharz wurde wie in Teil E unter Bildung des in der Überschrift angegebenen Peptids behandelt.
Die Aminosäureanalyse dieser fünf Peptide ist in Tabelle 1 angegeben:
Tabelle 1
Aminosäurezusammensetzung von synthetischen FMDV-Antigenen 21-Restea 25-Restea 38-Restea 40-Reste^ 45-Reste*1 2 3 4 5 Lys 1,09(1) 1,12(1) 3,68(4) 3,74(4) 3,99(4) His 0,91(1) 0,90(1) 1,13(1) Arg 2,00(2) 1,99(2) 2,69(3) 2,88(3) 4,45(5) Asp 1,08(1) 1,94(2) 2,19(2) 2,09(2) 3,78(4) Thr 1,05(1) 1,04(1) 2,09(2) 2,27(2)6 3,03(3) Ser 0,87(1) 1,03(1) 1,18(1)6 -- Glu 2,08(2) 2,13(2) 4,18(4) 4,14(4) 5,22(5) Pro N.D.C N.D.C N.D.C 5,16(5) 4,46(4) Gly 2,07(2) 2,12(2) 2,27(2) 2,38(2) 1,22(1) Ala 2,14(2) 2,17(2) 3,22(3) 2,99(3) 5,12(5) Cys N.D.d N.D.d N.D.d 2,52(3)8 N.D.d Val 2,91(3) 2,98(3) 4,83(5) 5,20(5/ 4,69(5) Ile -- 0,60(1) 0,87(l)f 0,73(1) Leu 2,82(3) 3,97(4) 4,34(4) 4,24(4) 53(5) Tyr -- -- -- 0,86(1) a 24 Stunden Hydrolyse in 6N HCl. b Durchschnitts-Hydrolyse nach 24,48 und 72 Stunden in 6N HC1/DMSO. c Durch Cysteinoxydationsprodukt maskiert. d Im Laufe der Hydrolyse zerstört. e Durch Extrapolation auf die Nullzeit der Hydrolyse bestimmt f Durch Extrapolation auf 100 Stunden Hydrolyse bestimmt 8 Als dessen Cysteinsäurederivat bestimmt h 21 Stunden Hydrolyse in 6N HCl. N.D. = nicht bestimmt -10- 1
Chemische Bindung von Peptiden an KLH durch SPDP. 2
Die nachstehend für das kleinste untersuchte Peptid beschriebene Verfahrensweise war im wesentlichen für alle Peptide, die chemisch an KLH gebunden waren, die gleiche. Die maximal empfehlenswerte Beladungsmenge von 3 SPDP [N-Succinimidyl-3(2-pyridylthio)propionat] an KLH wurde durch das Ausmaß der Fällung des Komplexes, 4 das Währendeiner 60 Minuten-Reaktion auftrat, bestimmt. Es wurde beobachtet daß ein250-molarer Überschuß von 5 SPDP an KLH optimal war. Ein halbes Gramm KLH (~ 1 x 10"^ mMol) wurde in 25 ml 0,1M Na2HP04, pH 7,2, 6 unter mäßiger Beschallung aufgelöst Es wurde eine kleine Menge unlöslichen Materials durch Zentrifugieren
AT 396 248 B entfemt,und der überstehenden Flüssigkeit wurden 7,81 mg SPDP (2,5 x 10'^ mMol) in 625 μΐ DMF zugesetzt. Nachdem die Alkaliaufnahme aufhörte, wurde die Probe zentrifugiert, wobei die überstehende Flüssigkeit mittels G-25-Sephadex-Chromatographie in 0,1M Na2HPC>4-Puffer von pH 7,2 bei 20 cm/h entsalzt wurde. Der Beladungswert, der bei der Derivatbildung erreicht wurde, wurde mittels DTT-Reduktion mit annähernd 40 % bestimmt.
Zu 100 mg des funktionalisierten KLH (2 x 10'^ Mol Liganden) in 25 ml 0,1M Na2HP04, pH 7,2, wurde ein zehnfacher Überschuß (44 mg, 2 x 10~5 Mol) des (141-158)ProCysGly-reduzierten Peptids in600μΐ O.lMTrispuffer bei pH 7,4 zugegeben. Die Reaktion wurde anhand der Freisetzung des Liganden überwacht, wobei gefunden wurde, daß sie in 60 Minuten bei 22 °C nahezu quantitativ war. Die Probe wurde an Sephacryl S-200 in 0,1M NH4HCO3, pH 7,5, entsalzt und lyophilisiert. Die Ausbeuten bei der Kupplung der Peptide mit 21,25 bzw. 38 Resten, bezogen auf begrenzten Reaktionsteilnehmer, betrugen 84 %, 85 % bzw. 68 %. J, Formulierung von Peptiden,
Alle Peptide und Peptid-KLH-Konjugate wurden in 10 mM Tris von pH 8,0 in der gewünschten Konzentration aufgelöst und dann mit Freund’s komplettem Adjuvans im Verhältnis von 1:1 verdünnt das Gesamtvolumen sowie die jedem Tier verabreichte Antigenkonzentration wird für jeden Versuch beschrieben. II. Biologisches Protokoll A. Meerschweinchenvakzinierung
Bei allen Versuchen wurden weibliche Duncan Hartly-Meerschweinchen mit einem Gewicht von 450 - 500 g eingesetzt die in geschlossener Kolonie willkürlich gezüchtet worden sind. Jede Vakzinzubereitung wurde in der vorgeschriebenen Dosierung durch subkutane Injektion in einem Volumen von 0,15 ml an jedes Tier ein» Gruppe von fünf Meerschweinchen verabreicht. Die einzige Ausnahme bei der Dosierung mit einem Gesamtvolum»! von 0,15 ml war eine 0,45 ml-Dosis, die bei der Antigendosistitration verwendet wurde, um die höchste angegebene Konzentration freizusetzen. Die Kontrollvakzine wurde aus dem Oj-Kaufbeuren-Stamm hergestellt welcher derjenige war, aus dem die veröffentlichten Sequenzdaten stammten. Die Vakzine wurde mit Aluminiumhydroxidgel hergestellt und enthielt 1,66 mg Saponin je Dosis. Jedem von fünf Meerschweinchen wurde ein ml Vakzin durch subkutane Injektion gegeben. Das infizi»ende Virus stammte von dem oben beschriebenen Oi-Kaufbeuren-Stamm. Es wurde an Meerschweinchen durch Reihenpassage von Vesicularlymphe adaptiert und für Infektionszwecke im Zustand der fünften Meerschweinchenpassage verwendet Nach der Virustitration wurde eine 1/20-Verdünnung hergestellt um eine Infektionsdosis von 10^ Meerschweinchen ID50, d. h. 3000 Infektionsdosen je Tier, zu erhalten. Allen Testtieren wurde das infizierende Virus durch intradermale Beimpfung der linken Hinterfußpfote verabreicht - Volumen 0,02 ml. Jedes infizierte Meerschweinchen wurde während der nachfolgenden 7 Tage bezüglich der Entwicklung von sekundären oder verallgemeinerten Läsionen an dem anderen Hinterfuß oder an d»i Vorderfüßen, oder am Maul, beobachtet Das Kriterium des Schutzes war das Fehlen irgendwelcher sekundärer Läsionen. B. Rindervakzinierung
Bei all»i Versuchen wurden 6 bis 8 Monate alte Jungkühe von Mischrassen mit einem Gewicht von annäh»nd 150 -180kg, die für Maul- und Klauenseuche empfänglich waren, verwendet Jede Väkzinzubereitung wurde in der beschriebenen Dosierung durch subkutane Injektion in einem Volumen von 3 ml jedem Ti» ein» Gruppe von 3 Rindern verabreicht Bei jedem Test war eine Gruppe von 3 Rindern nicht vakziniert und diente als positive Versuchskontrolle. Alle Tiere wurden durch intradermolinguale Injektion von lO^H^QfrischtitriertenOjBFS 1860-Virus in einer 0,1 ml Dosis an 10 Stellen der Zunge infiziert. Die Ti»e wurden täglich nach d» Infektion auf Anzeichen von erhöhter Körpertemperatur und Läsionsentwicklung an der Zunge und an den Beinen geprüft Die Tiere wurden dann als geschützt angesehen, wenn sich während 7 Tagen nach der Infektion keine sekundären Läsionen entwickelten. Jedwede Tierprüfung und Serenbewertung wurde beim Animal Viral Research Institute, United Kingdom, vorgenommen.
C. Bestimmung von Serumneutralisationstitem (SNTI
Das zur Quantifizierung von Serumneutralisationstitem angewendete Verfahren war jenes, das von Golding, S.M. Hedg», R.S. Talbot, T. Watson, J. Research in Veterinary Science 40,142-147 (1976), beschrieben worden ist Alle ELISA-Antikörpertiter sind als gegen das Peptid 140-160 gerichtet definiert. Bei allen Vakzinierungen, die unterVerwendung der beschriebenenPeptidedurchgeführtwurden, wurdeeineextrem enge Korrelation vonELISA-Bestimmungen und Serumneutralisationstitem erhalten. -11- 10
AT 396 248 B m. Biologische Ergebnisse. 15
Das überzeugendste Verfahren zur Ermittlung der relativen Stärke einer Reihe von potentiellen, synthetischen Peptidvakzinen besteht in der Bestimmung ihrer minimalen molaren Schutzdosis. In Tabelle 2 sind Dosistitrationseigebnisse angegeben, die in Meerschweinchen mit vier unterschiedlichen Immunogenen erhalten wurden. Obgleich die Daten in verschiedener Hinsicht aufschlußreich sind, ist der bedeutendste Aspekt die ausgeprägte Erhöhung bezüglich der Serumneutralisationstiter (SNT) und des durch die Peptide mit 38 und 40 Resten erzielten Schutzes, verglichen mit jenem der Peptide mit 21 Resten. Diese Ergebnisse zeigen deutlich die unerwarteten vorteilhaften Eigenschaften der Verbindungen dieser Erfindung, welche nach viraler Infektion optimalen Schutz ergeben. Die Peptide mit 38 und 40 Resten scheinen innerhalb des Versuchsfehlers äquivalent zu sein und setzen dadurch irgendeine Bedeutung der Amino-endständigen CysCys-Reste in den letzteren auf ein Minimum herab. Diese zwei Peptide scheinen vollständig» Schutz bei weniger als einem Zehntel bis einem Hundertstel der Dosis des antigenen Peptids mit 21 Resten zu verleihen. Die beispiellose Eignung zum Schutz von Meerschweinchen gegen FMDV ohne irgendeinen angegeben» Träg» vereinfacht die Anwendung jedoch signifikant und beseitigt eine Hauptquelle der Variabilität Das wünschenswerteste synthetische Mittel, das zur Schaffung von vollständigem Schutz befähigt ist, istj»es, welches die minimale virale Strukturinformation in einem streng definiert» und reinen Zustand beinhaltet Die Eliminierung von KLH oder irgendeinem ähnlichen Träger, währenddennoch Schutz geschaffen wird, markierteinen signifikanten Fortschritt auf dem Gebiete derVakzinierung auf synthetischem Wege. 20
Tabelle 2
Dosistritationsvergleich von synthetischem FMDV in Meerschweinch» 25 SNT OjKtSNT OjBFS3 (Anzahl geschützter Meerschweinch»: Anzahl infizierter Meerschweinchen) 30 35
Peptid-Gew.b Volumen0 21-Reste 21-Reste-KLH 38-Reste 40-Reste 1. 150 nMol 450 μΐ 1/178:1/256(5:5) 1/6:1/6(0:5) 1/708:1/1024(5:5) 1/4096:1/4096(5:5) 2. 50nMol 150 μΐ 1/6:1/32(1:5) 1/6:1/6(0:5) 1/1400:1/1400(5:5) 1/1400:1/1400(5:5) 3. 17 nMol 150 μΐ 1/8:1/6(2:5) 1/6:1/6(0:5) 1/1024:1/1400(5:5) 1/1400:1/2048(5:5) 4. 6 nMol 150 μΐ 1/6:1/6(0:5) 1/6:1/6(0:5) 1/708:1/708(4:4) 1/128:1/90(5:5) 5. 2 nMol 150 μΐ 1/6:1/6(0:5) 1/6:1/6(0:5) 1/128:1/256(3:4) 1/178:1/64(4:5) 6. 0.6 nMol 150 μΐ 1/6:1/6(0:5) 1/6:1/6(0:5) 1/11:1/90(5:5) 1/128:1/178(3:5) 7. 0.2 nMol 150 μΐ 1/6:1/6(0:5) 1/6:1/6(0:5) 1/16:1/22(1:5) 1/64:1/22(1:5) 40 45 a Bestimmt 28 Tage nach Vakzinierung in vereinigten Seren aller Tiere, die mit dem angegeben» Peptid immunisiert worden sind. b Peptidgewicht für 21-Reste-KLH ist als die Menge des in dem Konjugat vorliegenden synthetischen Peptids ausgedrückt. c Die Hälfte des Volumens bestand aus Fieund’s komplettem Adjuvans.
Die Notwendigkeit von Antigenoptimierung ist von höchster Bedeutung, da die Kommerzialisierung sehr wahrscheinlich die Verwendung eines Adjuvans rechtfertigen wird, das eine geringere Stärke als Freund’s komplettes Adjuvans hat. Tabelle 3 zeigt, daß bei einer molaren Dosis, die mit jener vergleichbar ist, welche ein» 50 Schutz mit dem Peptid mit 21 Resten in Freund’s komplettem Adjuvans ergab, das Peptid mit 40 Resten mit einem kommerziell annehmbaren Al(OH)3- Adjuvans einen vollständigen Schutz ergab. Das absolute Gewicht von Antigen, das einen voll» Schutz von Meerschweinchen mit dem letzteren Adjuvans bei einer einzigen Vakzinierung ergibt, ist geringer als 1mg. -12- 55
AT396248B
Adiuvansanswertung in Meerschweinchen bei Vakzinierung mit 40 Reste abweisendem Peptid
Peptidkonz. Adjuvans Anzahl geschützter Meerschweinchen/ Anzahl infiziert« Meerschweinchen 150 nMol Freund’s komplettes Adjuvans 5/5 17 nMol 1t 5/5 2 nMol 1t 4/5 0,2 nMol tt 0/5 150 nMol Al(OH)3 5/5 17 nMol tt 1/5 2 nMol tr 0/5 0,2 nMol tt 0/4
Wahrend sich Meerschweinchen als ein nützliches Modell zur Ausweitung von FMD-Vakzinen erwiesen haben, muß der letzte Erfolgstest beim Rind, dem kommerziellen Hauptzieltier, durchgeführt werden. Tabelle 4 gibt die Ergebnisse der Rindervakzinierung mit dem 40 Reste aufweisenden Peptid, gefolgt von der üblichen Infektion, die aus direkter viraler Infektion der Zunge jedes vakzinierten Tieres bestand, an. Die Serumneutralisationstiter nahmen rasch zu, bis am Tag 14 nahezu Maxima erreicht wurden, welche wenigstens bis zum Zeitpunkt der Infektion (Tag 32) beibehalten wurden. Zwei der neun Tiere, die am Tag 32 infiziert wurden, waren vollständig geschützt, indem sie keine Anzeichen von sekundären Läsionen zeigten. Diese Tiere stellen das erste Beispiel für erfolgreiche Rindereinzelvakzinierung gegen FMD mit einem synthetischen Peptid dar. Dies bescheinigt die Stärke des Immunogens dieser Erfindung. Durch serologische Bestimmung der Neutralisationsantikörperkonzentrationen unmittelbar vor der Infektion ist es weiterhin nicht möglich, Schutz vorherzusagen. Im Vergleich zu den bekannten Minimalwerten von Neutralisationsantikörperkonzentrationen, die bei einer üblichen FMD-Vakzine notwendig sind, sollten alle diese Tiere eindeutig geschützt sein. Demgemäß ist es in diesem Zeitpunkt nicht annehmbar, die Wirksamkeit einer Peptidvakzine auf Vergleichsbasis ihres SNT-Wertes mit einer üblichen Vakzine zu ermitteln. DieReimmunisierung der Tiere 1,2 und 3 führte zu vollständigem Schutz nach weiteren 14 Tagen vor der Infektion. In dies«i Tieren wurden nach Verstärkungsimmunisierung Antikörpertiter, gemessen durchELIS A, beobachtet, die annähernd um die Hälfte einer Log-Einheit erhöht waren. Dieses Peptid mit 40 Resten ist weniger als ein Fünftel so groß wie irgendein anderes synthetisches Antigen, das sich zum Rinderschutz als geeignet erwiesen hat Seine synthetischeNatur wird die Auswertungseiner inhärenten Aktivitätin Kombination mit verschiedenen Adjuvanzien, die von irgendeinem Potential einer Potenzierung eines niedrigen bakteriellen Niveaus frei sind, gestatt«!.
Tabelle 4
Bewertung synthetischer FMD-Vakzine bei Rindern
Tier Peptid- SNT-Tage nach Vakzinierung
Nr. Gewicht? 0 7 14 21 26 32 Infektions- ergebnis^ 1. 1 mg 1/6 1/16 1/708 1/1024 1/1024 1/>1400 geschützt 2. n 1/22 1/22 1/>1400 1/>1400 1/>1400 1/>1400 tt 3. tr 1/16 1/45 1/1024 1/1024 1/1024 1/1024 n 4. 02 mg 1/11 1/22 1/>1400 1/>1400 1/1024 if>im nicht geschützt 5. ft 1/6 1/22 1£1400 1£1400 1/>1400 1/>1400 tt 6. M 1/32 1/32 1£1400 1£1400 1£1400 1/1024 n -13-
Claims (9)
- AT 396 248 B Tabelle 4 (Fortsetzung) Tier Peptid- SNT-Tage nach Vakzinierung Nr. Gewicht? 0 7 14 21 26 32 Infektions- ergebnis^ 7. 1.0 mg 1/8 1/11 1/355 1/256 1/355 1/512 tt 8. w 1/32 1/22 1£1400 1£1400 1/1024 1/1024 ff 9. n 1/11 1/22 1/1024 1/708 1/1024 1/1024 ff 10. 5.0 mg 1/6 1/45 1/1024 1£1400 1£1400 1/>1400 geschützt 11. n 1/6 1/16 1/>1400 1£1400 1£1400 1/>1400 ff 12. n 1/11 1/22 1/355 1/512 1£1400 1/1024 nicht geschützt 13. keines 1/6 1/16 1/11 1/6 1/90 1/32 n 14. tf 1/11 1/11 1/11 1/11 1/11 1/22 ff 15. tf 1/11 1/8 1/11 1/8 1/11 1/16 ff 16. η 1/11 1/6 1/11 1/6 1/6 1/11 tf a Das verabreichte Peptid war CysCys [(200-213)ProProSer(141-158)]ProCysGly in Form von 3 ml einer wässerigen, gepufferten Suspension, die 50 % Freund’s komplettes Adjuvans enthielt, b Die Tiere 4-16 wurden am Tag 32 nach SNT-Bestimmung infiziert, während die ersten drei Tiere am Tag 38 mit 0,2 mg Peptid in einer 3 ml-Suspension von Freund’s unkomplettem Adjuvans revakziniert und am Tag 52 infiziert wurden. PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung einer neuen Peptid-Verbindung, welche eine Sequenz der Formel (0 enthält: X-A-Y-B-Z (I), in welcher A und B Aminosäurerestsequenzen sind, welche Sequenzen der Maul- und Klauenseuche-Virus-VPj- Capsidprotein-Serotypen enthalten, und von denen die eine 18 bis 24 Aminosäurereste enthält, und die Aminosäurerestsequenz in den Stellungen 141 und 158 des O-Serotypus oder die äquivalente Sequenz anderer Serotypen umfaßt, und die andere davon 14 bis 20 Aminosäurereste enthält, und die Aminosäurerestsequenz in den Stellungen 200 bis 213 des O-Serotypus oder die äquivalente Sequenz ander» Serotypen umfaßt; X H, H-Cys oder H-Cys-Cys ist, wobei die Sulfhydryle davon geschützt oder frei sein können; Z OH, Cys-OH oder Pro-Cys-Gly-OH ist, wobei die Sulfhydryle davon geschützt oder frei sein können; und Y eine Sequenz von 2 bis 6 Aminosäureresten ist, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon, gekennzeichnet durch: (a) das Abspalten ein» Schutzgruppe aus einer entsprechend geschützten Verbindung der Formel 00: oder (b) das Züchten eines Mikroorganismus, der durch einen Expressionstransfervektor transformiert ist, welcher eine DNS-Sequenz enthält, die für eine Verbindung der Formel (I) codiert, unter Bedingungen, die für die Expression der für die Verbindung der Formel (I) codierenden DNS-Sequenz geeignet sind; und das Reinigen der Verbindung der Formel (I) aus dem Lysat oder Kulturmedium des genannten Mikroorganismus; und (c) gewünschtenfalls das Bilden eines Salzes einer freien Verbindung unter Bildung eines entsprechenden pharmazeutisch annehmbaren Salzes. -14- AT 396 248 B
- 2. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X H oder H-CysCys- ist.
- 3. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Y eine Sequenz von 2 bis 4 Aminosäureresten ist
- 4. Verfahren zur Herstellung ein»' Verbindung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß Y die Sequenz -Pro-Pro- enthält
- 5. Verfahren zur Herstellung ein» Verbindung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß Y -Pro-Pro-Ser-od» Leu-Pro-Pro-Thr ist
- 6. Verfahren zur Herstellung ein» Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß Z -OH oder -Pro-Cys-Gly-OH ist.
- 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung VP1(01K)[Cys-Cys(200-213)-Pro-Pro-Ser(141-158)]-ProCysGly;VP1(01K)[(200-213)-Pro-Pro-S»-(141-158)]- ProCysGly; od» ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon hergestellt wird.
- 8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung VP! (OiK) H-Cys-[ArgTyrAsnArgAsnAla(141-158)]LeüProProThr[GluAla(200-213)]-OH od» ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon hergestellt wird.
- 9. Verfahren zur Behandlung oder zur Vorbeugung von Maul- und Klauenseuche in einem warmblütigen Tier, dadurch gekennzeichnet, daßeineVerbindung, enthaltend eineSequenz der Formel (I),wie in Anspruch 1 definiert, od» ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, an das genannte Tier verabreicht wird. -15-
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