AT394577B - POLYDOM, METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF AND IMMUNODIAGNOSTIC METHOD - Google Patents
POLYDOM, METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF AND IMMUNODIAGNOSTIC METHOD Download PDFInfo
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Description
AT 394 577 BAT 394 577 B
Diese Erfindung bezieht sich auf Antikörper, die doppelte Spezifitäten aufweisen. Nach einem anderen Aspekt bezieht sie sich auf immunodiagnostische und immunotherapeutische Verfahren. Nach einem weiteren Aspekt bezieht sie sich auf Hybridome und verwandte monoklonale Antikörpertechnologie.This invention relates to antibodies that have double specificities. In another aspect, it relates to immunodiagnostic and immunotherapeutic procedures. In another aspect, it relates to hybridomas and related monoclonal antibody technology.
Die Antigen-Antikörperreaktion wird bereits routinemäßig in verschiedenen praktischen Anwendungen ausgewertet und wirdinweitemUmfange untersucht, um deren Wertauf anderen,bishernichterprobten Anwendungsgebieten festzustellen. Beispielsweise können Serumantikörper, die bei einer Immunantwort eines Wirtstieres auf ein Immunogen gebildet werden, in Affinitätsreinigungsverfahren benützt werden, um das Immunogen aus Lösungen zu isolieren, in welchen es in nur geringfügigen Mengen vorhanden ist.The antigen-antibody response is already routinely evaluated in various practical applications and is being extensively studied to determine its value in other previously untested fields of application. For example, serum antibodies raised in an immune response of a host animal to an immunogen can be used in affinity purification procedures to isolate the immunogen from solutions in which it is present in only minor amounts.
Unter anderen Umständen, falls das Immunogen ein krankheitsassoziiertes Antigen ist, kann dessen Anwesenheit in dem Serum eines Patienten oder in anderer Körperflüssigkeit unter Anwendung von Immunoassay oder immunometrischen Methoden festgestellt werden. Beispielsweise ist die Ermittlung von HBsAg unter Verwendung einer radioimmunometrischen Methode die derzeitige Methode der Wahl. Auf einem anderen Gebiet ist über S erumantikörper gegen Ferritin, die aus weißen Neu Seeland-Kaninchen erhalten wurden und mit ^11 markiert wurden, berichtet worden, daß sie sich bei der Behandlung von Lebertumoren als aussichtsreich zeigen. (Siehe Order und Mitarbeiter, International Journal of Radiation Oncology, Biology and Physics, 6,703 (1980)).In other circumstances, if the immunogen is a disease-associated antigen, its presence in a patient's serum or other body fluid can be determined using immunoassay or immunometric methods. For example, the determination of HBsAg using a radioimmunometric method is the current method of choice. In another area, serum antibodies to ferritin obtained from white New Zealand rabbits and marked with ^ 11 have been reported to be promising in the treatment of liver tumors. (See Order et al., International Journal of Radiation Oncology, Biology and Physics, 6,703 (1980)).
Serumantikörper, beispielsweise solche, die aus Kaninchen, Mäusespezies oder anderen Säugetieren erhalten wurden, sind „polyklonaler“ Art, da das Immunsystem des Wirtes zur Produktion eines Gemisches spezifischer Antikörper, die gegen die verschiedenen antigenischen Determinanten oder Epitopen an dem Immunogen, auf welches der Wirt anspricht, gerichtet sind, stimuliert ist. Die einzelnen, das Gemisch bildenden Antikörper sind jeweils das Produkt eines B-Zellenklons; ferner sondert jede B-Zelle nur eine Antikörperspezies ab. Der Antikörper, der durch einen Klon produziert wird, unterscheidet sich von einem Antikörper gegen dasselbe Antigen, welcher durch einen anderen Klon produziert worden ist, dadurch, daß er wenigstens einen feinen Unterschied zwischen seiner Peptidsequenz und jener des anderen Antikörpers aufweist. Im Ergebnis ist daher jede Antikörperspezies ein bestimmtes Molekül und die Unterschiede in der Peptidsequenz zwischen verschiedenen Spezies beeinflussen deren allgemeine Spezifitäten sowie die speziellen Epitopen, die sie erkennen, und deren Affinitäten für das Antigen.Serum antibodies, such as those obtained from rabbits, mouse species or other mammals, are "polyclonal" in nature because the host's immune system is required to produce a mixture of specific antibodies against the various antigenic determinants or epitopes on the immunogen on which the host is located responds, is directed, is stimulated. The individual antibodies forming the mixture are each the product of a B cell clone; furthermore, each B cell secretes only one antibody species. The antibody produced by a clone differs from an antibody to the same antigen which has been produced by another clone in that it has at least a subtle difference between its peptide sequence and that of the other antibody. As a result, each antibody species is a particular molecule, and the differences in peptide sequence between different species affect their general specificities, as well as the particular epitopes they recognize and their affinities for the antigen.
Eine individuelle B-Zelle kann unter Verwendung derzeit verfügbarer Gewebekulturtechniken nicht unbegrenzt unter Erzielung der Antikörperspezies, die sie als eine reine Verbindung absondert, gezüchtet werden. In relativ neuerer Zeit haben Köhler und Milstein ein Verfahren entdeckt und über dieses berichtet, durch welches ein monoklonaler Antikörper in zweckmäßiger Weise als das Absonderungsprodukt einer Hybridzelle, die als ein „Hybridoma“ bezeichnet wird, erhalten werden kann (G. Köhler und C. Milstein, Nature, 256, 495 (1975)). Grundsätzlich umfaßt das Verfahren die Fusion von aus einer immunisierten Maus entnommenen Milzzellen mit Mäusemyelomazellen unter Bildung der Hybridoma. Myelomazellen, welche ihr eigenes Immunoglobulin oder Teile davon nicht produzieren oder wenigstens nicht absondem, werden bevorzugt Kulturen von Zellen, die durch Klonen eines einzelnen Hybridoms erhalten worden sind, werden identische Antikörpermoleküle absondem, die in der Folge leicht als eine reine chemische Verbindung erhalten werden können. Dies steht im Gegensatz zu der üblichen Antikörperherstellung aus beispielsweise Serum, in welchem irgendein Antikörper nur eine der Komponenten eines im wesentlichen untrennbaren Antikörpergemisches verwandter, aber dennoch unterschiedlicher chemischer Verbindungen istAn individual B cell cannot be grown indefinitely using currently available tissue culture techniques to achieve the antibody species that it secretes as a pure compound. More recently, Koehler and Milstein have discovered and reported a process by which a monoclonal antibody can conveniently be obtained as the secretion product of a hybrid cell called a "hybridoma" (G. Koehler and C. Milstein , Nature, 256, 495 (1975)). Basically, the method comprises the fusion of spleen cells taken from an immunized mouse with mouse myeloma cells to form the hybridoma. Myeloma cells that do not produce, or at least do not secrete, their own immunoglobulin or portions thereof are preferred. Cultures of cells obtained by cloning a single hybridoma will secrete identical antibody molecules that can subsequently be easily obtained as a pure chemical compound . This is in contrast to the usual antibody production from, for example, serum, in which any antibody is only one of the components of an essentially inseparable antibody mixture of related but nevertheless different chemical compounds
Da es sich um eine reine Verbindung handelt, wird ein monoklonaler Antikörper eine konstante Spezifität für eine einzige Stelle an den Antigenmolekülen und eine gut definierte Affinität haben. Somit können Klone verschiedener Hybridomen getrennt werden, um den einen auszuwählen, der den monoklonalen Antikörper mit den am meisten erwünschten Eigenschaften füreine gegebene Anwendungproduziert. Die Unsteiblichkeitdes Hybridoms garantiert eine fast unbeschränkte Versorgung mit dem Antikörper, den es absondert, und mildert Probleme, die mit Schwankungen im Antikörpertiter und der Gesamtaffinität von Tier zu Tier, das zur Produktion von Serum-antikörpem benutzt wird, verbunden sind. Monoklonale Antikörper, die aus Hybridomen erhalten wurden, sind zum Beispiel bei der praktischen Anwendung in Diagnosebestecken eingesetzt worden. Eine Auswahl solcher Bestecke ist von der Firma Hybritech, Inc., auf die diese Anmeldung übertragen worden ist, erhältlich.Because it is a pure compound, a monoclonal antibody will have constant specificity for a single site on the antigen molecules and a well-defined affinity. Thus, clones of different hybridomas can be separated to select the one that produces the monoclonal antibody with the most desirable properties for a given application. The immunity of the hybridoma guarantees an almost unlimited supply of the antibody that it secretes and alleviates problems associated with fluctuations in the antibody titer and overall animal-to-animal affinity used to produce serum antibodies. Monoclonal antibodies obtained from hybridomas have been used, for example, in practical use in diagnostic kits. A selection of such cutlery is available from Hybritech, Inc., to which this application has been assigned.
Ein Antikörpermolekül kann allgemein derart betrachtet werden, daß es eine einzelne Spezifität ausdrückt, welche gegen das Immunogen gerichtet ist, auf das das Immunsystem des Wirtes durch Produktion des Antikörpers antwortete. Der Antikörper ist aus zwei identischen Hälften zusammengesetzt, von denen jede ein schweres und leichtes Kettenpaar enthält und von denen jede dieselbe antigenische Determinante wie die andere erkennt.An antibody molecule can generally be considered to express a single specificity directed against the immunogen to which the host's immune system responded by producing the antibody. The antibody is composed of two identical halves, each containing a heavy and light chain pair, each of which recognizes the same antigenic determinant as the other.
(s- -2-(s- -2-
AT 394 577 BAT 394 577 B
Die -S-S-Disulfidbrücken, welche die beiden (H)-Ketten miteinander an der Stelle der Cysteinabschnitte verbinden, können üblicherweise selektiv in vitro durch eine milde Reduktion gespalten und die Halbmoleküle durch nachfolgende Ansäuerung entassoziiert werden. Die Halbmoleküle können dann erneut in vitro bei neutralem pH rekombiniert (renaturiert) werden, wobei die Reassoziierung durch nicht-covalente Wechselwirkung erfolgt.The -S-S-disulfide bridges, which connect the two (H) chains to each other at the site of the cysteine sections, can usually be split selectively in vitro by a mild reduction and the half-molecules can be deassociated by subsequent acidification. The half-molecules can then be recombined (renatured) in vitro at neutral pH, the reassociation taking place through non-covalent interaction.
Falls Antikörper von verschiedenen Spezifitäten einer selektiven Spaltung der Disulfidbrücken zwischen den schweren Ketten unterworfen und nachfolgend Bedingungen für die Renaturierung eingestellt werden, kann die Reassoziierung zwischen Halbmolekülen willkürlich Unterproduktion einer Population von Antikörpern erfolgen, von denen wenigstens einige insofern Hybride sind, als sich eine Hälfte eines Antikörpermoleküls einer Spezifität mit einer Hälfte eines Antikörpermoleküls einer unterschiedlichen Spezifität verbindet. Beispielsweise haben Nisonoff und Mitarbeiter in „The Antibody Molecule“, Academic Press, New York (1975), auf den Seiten 260-261 eine in vitro-Erzeugung eines polyklonalen Antikörperhybrids von Kaninchenantiovalbumin- und Anti-BGG-Antikörpem beschrieben. Monoklonale Hybrid-Antikörper sind auch unter Anwendung eines analogen Verfahrens erhalten worden. Siehe D. M. Kranz und Mitarbeiter, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78, 5807 (1981). Der Hybrid-Antikörper wird wenigstens theoretisch eine Doppelspezifität insofeme zeigen, als eine Hälfte des Antikörpers eine antigenische Determinante oder ein antigenisches Epitop erkennen und sich an diese(s) binden wird, wohingegen die andere Hälfte ein verschiedenes Epitop an demselben oder einem verschiedenen Antigen erkennen wird.If antibodies of different specificities are subjected to selective cleavage of the heavy chain disulfide bridges and conditions are subsequently set for renaturation, the reassociation between half-molecules can be arbitrarily underproduced from a population of antibodies, at least some of which are hybrids in that one half are one Antibody molecule of a specificity connects with half of an antibody molecule of a different specificity. For example, on pages 260-261, Nisonoff and co-workers in The Antibody Molecule, Academic Press, New York (1975), described an in vitro generation of a polyclonal antibody hybrid of rabbit antiovalbumin and anti-BGG antibodies. Monoclonal hybrid antibodies have also been obtained using an analogous procedure. See D. M. Kranz and co-workers, Proc. Natl. Acad. Be. USA, 78, 5807 (1981). The hybrid antibody will, at least theoretically, show double specificity in that one half of the antibody will recognize and bind to an antigenic determinant or epitope, while the other half will recognize a different epitope from the same or a different antigen .
Obgleich Hybrid-Antikörper in der oben beschriebenen Weise erhalten werden können, sind die Ausbeuten oft sehr niedrig, die zur Herstellung derselben angewendeten Reaktionen schwierig zu reproduzieren und die Hybrid-Antikörper unterliegen üblicherweise signifikanter, irreversibler Denaturierung. Eine solche Denaturierung kann die Immunoreaktivität verringern, und es istzu erwarten, daß sie in vivo zu unterschiedlichen Stoffwechselkennmeikmalen führt. Als Ergebnis davon bleibt der Hybrid-Antikörper derzeit größtenteils eine Laboratoriumskuriosität, die schwierig erhältlich ist.Although hybrid antibodies can be obtained in the manner described above, the yields are often very low, the reactions used to produce the same are difficult to reproduce, and the hybrid antibodies are usually subject to significant, irreversible denaturation. Such denaturation can reduce immunoreactivity and is expected to result in different metabolic characteristics in vivo. As a result, the hybrid antibody currently remains largely a laboratory curiosity that is difficult to obtain.
Antikörper, die Doppelspezifität aufweisen, können auch durch Konjugieren von Paaren intakter Antikörper, monoklonaler oder sonstiger, hergestellt werden, wobei verschiedene Kupplungs- oder Vemetzungsmittel, wie Protein A (aus Staphylococcus aureus), Carbodiimid und bifunktionelle Verbindungen, wie N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat, verwendet werden, um dimere und höhere Antikörpermultimere zu erhalten, zu denen jedes Glied des Antikörperpaares seine Spezifität beiträgt Beispielsweise haben Mandoche und Mitarbeiter über die Bildung von multivalenten Antikörpern mit Doppelspezifität berichtet, wobei eine Folgereaktion von Antikörpern mit Protein A erfolgte, welche Antikörper, wie gezeigt wurde, befähigt sind, Zelloberflächenantigene in vitro festzustellen. Siehe J. Immunological Methods, 42,355 (1981). Nach ihrer Methode binden sich Antikörper einer Spezifität an das Oberflächenantigen und die anderen an einen Rest, der die Ermittlung erlaubtAntibodies that have double specificity can also be made by conjugating pairs of intact antibodies, monoclonal or otherwise, using various coupling or cross-linking agents such as Protein A (from Staphylococcus aureus), carbodiimide and bifunctional compounds such as N-succinimidyl-3. (2-pyridyldithio) propionate can be used to obtain dimeric and higher antibody multimers, to which each member of the antibody pair contributes its specificity. For example, Mandoche and co-workers have reported the formation of multivalent antibodies with double specificity, a subsequent reaction of antibodies with protein A was carried out which antibodies, as has been shown, are capable of detecting cell surface antigens in vitro. See J. Immunological Methods, 42, 355 (1981). According to their method, antibodies of a specificity bind to the surface antigen and the others to a residue that allows the determination
Die Synthese von Doppelspezifitätsantikörpem nach der vorstehenden Methode ist kompliziert und bisher ist keine kommerzielle Anwendung derselben erfolgtThe synthesis of double specificity antibodies by the above method is complicated and so far no commercial use thereof has been made
Durch die vorliegende Erfindung wird unter anderem ein neues, zur Gänze biologisches Verfahren zur verläßlichen Gewinnung von monoklonalen Hybrid-Antikörpem in guten Ausbeuten ohne Denaturierung geschaffen. Im Rahmen dieser Beschreibung wird der Ausdruck „Hybrid-Antikörper“ verwendet, um ein einziges Antikörpermolekül zu bezeichnen, das zwei verschiedene Spezifitäten aufweist Die einzelnen Spezifitäten können auf antigenische Determinanten an zwei verschiedenen Antigenen oder auf verschiedene antigenische Determinanten (Epitope) an demselben Antigen gerichtet sein. Ferner umfaßt der Ausdruck „Antigen“, soweit nichts anderes angegeben ist, auch Haptene.The present invention provides, among other things, a new, entirely biological process for the reliable production of monoclonal hybrid antibodies in good yields without denaturation. For the purposes of this description, the term "hybrid antibody" is used to refer to a single antibody molecule that has two different specificities. The individual specificities can be directed to antigenic determinants on two different antigens or to different antigenic determinants (epitopes) on the same antigen . Unless otherwise specified, the term “antigen” also includes haptens.
Nachdem VerfahrendervorliegendenErfmdungwerdenHybrid-Antikörper.dieeineDoppelspezifitätaufweisen, durch Fusion eines Hybridoms, vorzugsweise eines selektiv zerstörbaren Hybridoms, welches einen Antikörper gegen eine vorgewählte antigenische Determinante absondert, mit einem fusionierbaren B-Lymphozyten oder einem zweiten Hybridom, wobei der B-Lymphozyt oder das zweite Hybridom einen zweiten Antikörper gegen eine unterschiedliche antigenische Determinante absondem, unter Bildung eines Hybridoms der zweiten Generation (nachstehend „Polydom“ genannt) erhalten. Im Rahmen der Erfindung bedeutet der Ausdruck „selektiv zerstörbares Hybridom“ ein Hybridom, dem dio Fähigkeit des Überlebens in dem Medium, in welchem das Polydom gezüchtet wird, fehlt oder wenigstens im wesentlichen fehlt. Wir haben unerwarteterweise gefunden, daß zum Unterschied von dem Ausgangshybridom oder dem B-Lymphozyten, von dem es sich ableitet und von denen jede(r) eine Population identischer Antikörper, die eine einzige Spezifität haben, absondert, das Polydom zusätzlich einen hohen Prozentsatz eines monoklonalen Hybrid-Antikörpers absondert, der eine Doppelspezifität hat, d. h. eine Fähigkeit, entweder mit der einen von den beiden antigenisehen Determinanten, die durch die individuellen, von den Ausgangszeilen produzierten Antikörper erkannt werden, oder mit beiden Determinanten gleichzeitig, eine Bindung einzugehen. Der in dieser Weise erhaltene monoklonale Hybrid-Antikörper unterlag nicht der unerwünschten Denaturierung, welche Hybride charakterisiert, die aus dem Verfahren chemischer Rekombination von Antikörperhalbmolekülen erhalten werden. Ferner gestattet es das Verfahren der Erfindung, die Hybride zuverlässig und in großen Mengen zu erhalten.According to methods of the present invention, hybrid antibodies will have dual specificity by fusing a hybridoma, preferably a selectively destructible hybridoma, which secretes an antibody against a preselected antigenic determinant, with a fusible B lymphocyte or a second hybridoma, the B lymphocyte or the second hybridoma Obtain antibodies against a different antigenic determinant, with the formation of a hybridoma of the second generation (hereinafter referred to as "polydome"). In the context of the invention, the term “selectively destroyable hybridoma” means a hybridoma which lacks or at least essentially lacks the ability to survive in the medium in which the polydome is grown. We have unexpectedly found that, unlike the parent hybridoma or B lymphocyte from which it is derived and each of which secretes a population of identical antibodies with a single specificity, the polydome additionally contains a high percentage of a monoclonal Secretes hybrid antibody that has a double specificity, d. H. an ability to bind either to one of the two antigenic determinants recognized by the individual antibodies produced by the parent lines or to both determinants simultaneously. The hybrid monoclonal antibody thus obtained was not subject to the undesirable denaturation which characterizes hybrids obtained from the chemical recombination process of antibody half-molecules. Furthermore, the method of the invention allows the hybrids to be obtained reliably and in large quantities.
Gleichfalls gemäß der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Immunodiagnose und Immunotherapie -3-According to the present invention, methods for immunodiagnosis and immunotherapy -3-
AT 394 577 B geschaffen, bei welchen Antikörper mit Doppelspezifität angewendet werden. Im allgemeinen gelangen bei diesen Verfahren ein monoklonaler Antikörper oder polyklonale Antikörper zur Anwendung, die eine erste Spezifität gegen ein Targetantigen und eine zweite Spezifität gegen eine Substanz, zum Beispiel ein anderes Antigen oder Hapten, haben, welche Spezifitäten es gestatten, eine Diagnose des Targetantigens zu machen, oder welche die Freisetzung eines Mittels ermöglichen, oder dieses selbst sind, welches für das Targetantigen oder das Gewebe, mit dem es assoziiert ist, letal istAT 394 577 B created, in which antibodies with double specificity are used. In general, these methods use a monoclonal antibody or polyclonal antibody which has a first specificity against a target antigen and a second specificity against a substance, for example another antigen or hapten, which specificities allow a diagnosis of the target antigen or which allow the release of, or are themselves, an agent which is lethal to the target antigen or the tissue to which it is associated
Somit kann durch eine entsprechende Auswahl der Ausgangszeilen eine Polydoma nach der vorliegenden Erfindung erhalten werden, welche einen Antikörper absondert, der eine Spezifität für ein Targetantigen und eine zweite Spezifität für einen in der Diagnose oder Therapie nützlichen Rest aufweist. Alternativ können Antikörperhalbmoleküle in vitro unter Verwendung chemischer Mittel rekombiniert werden, oder einzelne intakte monospezifische Antikörper können durch chemische Mittel gekuppelt oder vernetzt werden, um An tikörpermul timere (die ein Dimer, Trimer oder höheres Multimer sein können) mit einer Doppelspezifität und mit der gleichen oder einer ähnlichen Brauchbarkeit wie ein monoklonaler Hybrid-Antikörper zu erhalten, welcher die gleiche Doppelspezifität, die nach der vorliegenden Erfindung erhalten worden ist, hat.Thus, by appropriate selection of the starting lines, a polydoma according to the present invention can be obtained which secretes an antibody which has a specificity for a target antigen and a second specificity for a residue useful in diagnosis or therapy. Alternatively, antibody half-molecules can be recombined in vitro using chemical means, or single intact monospecific antibodies can be coupled or cross-linked by chemical means to antibody multiples (which may be a dimer, trimer, or higher multimer) with a double specificity and with the same or of similar utility as a monoclonal hybrid antibody which has the same double specificity obtained according to the present invention.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfaßt der Ausdruck „Antikörper“ Antikörperffagmente, die immuno-chemische Eigenschaften haben, wie Fab oder F(ab)2-Fragmente.In the context of the present invention, the term “antibody” includes antibody fragments which have immunochemical properties, such as Fab or F (ab) 2 fragments.
Demgemäß ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, monoklonale Hybrid-Antikörper zuverlässig und in guter Ausbeute zu erhalten, die beim Verfahren ihrer Herstellung nicht denaturiert worden sind.Accordingly, it is an object of the present invention to reliably and in good yield obtain hybrid monoclonal antibodies which have not been denatured in the process of their production.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur Gewinnung von monoklonalen Hybrid-Antikörpem.Another object of the present invention is an improved method for obtaining hybrid monoclonal antibodies.
Noch ein anderes Ziel dieser Erfindung ist die Schaffung immunodiagnostischer und immunotherapeutischer Verfahren, bei welchen Antikörper angewendet werden, die eine Doppelspezifität aufweisen.Yet another object of this invention is to provide immunodiagnostic and immunotherapeutic methods using antibodies that have dual specificity.
Die Art und Weise, in welcher diese und andere Ziele erreicht werden können, wird bei einer Betrachtung der folgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen ersichtlich.The manner in which these and other goals can be achieved will become apparent upon review of the following description of preferred embodiments.
Wie oben angegeben, erfordert das Verfahren zur Gewinnung eines monoklonalen Hybrid-Antikörpers gemäß der vorliegenden Erfindung als ein Ausgangsmaterial ein Hybridom, und vorzugsweise ein selektiv zerstörbares Hybridom, welches einen monoklonalen Antikörper gegen eine vorgewählte antigenische Determinante oder ein vorgewähltes antigenisches Epitop absondert. Die Verwendung eines selektiv zerstörbaren Hybridoms als ein Ausgangsmaterial hat den Vorteil, zu verhindern, daß die Zellen, welche durch Fusion des selektiv zerstörbaren Hybridoms miteinem B-Lymphozyten odereinem zweiten Hybridom erhalten werden, d. h. das Polydom, durch eine Population des Ausgangshybridoms überwachsen werden, wenn die beim Fusionsverfahren erhaltenen Zellen gezüchtet werden, und es hat den (weiteren) Vorteil, ein Mittel zur Verfügung zu stellen, durch das die Polydomzellen von Ausgangshybridomzellen isoliert werden können.As indicated above, the method for obtaining a hybrid monoclonal antibody according to the present invention requires a hybridoma as a starting material, and preferably a selectively destructible hybridoma, which secretes a monoclonal antibody against a preselected antigenic determinant or antigenic epitope. The use of a selectively destroyable hybridoma as a starting material has the advantage of preventing the cells obtained by fusing the selectively destroyable hybridoma with a B-lymphocyte or a second hybridoma, i. H. the polydome is overgrown by a population of the parent hybridoma when the cells obtained from the fusion process are grown, and has the (further) advantage of providing a means by which the polydome cells can be isolated from parent hybridoma cells.
Wir haben gefunden, daß selektiv zerstörbare Hybridome, die im Rahmen unserer Erfindung nützlich sind, aus Hybridomen erhalten werden können, welche einen Antikörper mit einer der gewünschten Spezifitäten absondem und welche nach dem klassischen Kohler-Milstein-Verfahren hergestellt worden sind, d. h. aus Hybridomen, die durch Fusion einer Myelomazelle und eines B-Lymphozyten, wie jenem, der in den Milzzellen einer Maus gefunden wird, erhalten werden. Nach einer Ausführungsform der Erfindung wird ein solches Hybridom einem Rückselektionsverfahren unterworfen, um das Hybridom zu erhalten, das selektiv zerstörbar ist.We have found that selectively destructible hybridomas useful in the context of our invention can be obtained from hybridomas which secrete an antibody with one of the desired specificities and which have been prepared by the classic Kohler-Milstein method, i.e. H. from hybridomas obtained by fusion of a myeloma cell and a B lymphocyte such as that found in mouse spleen cells. In one embodiment of the invention, such a hybridoma is subjected to a re-selection process to obtain the hybridoma which is selectively destructible.
Im allgemeinen kann selektive Zerstörbarkeit durch Rückselektion zu einem Hybridom erhalten werden, welchem eine genetische Komponente fehlt, die für sein Überleben in einem Medium der Wahl notwendig ist, in welchem das durch die Fusion erzeugte Polydom gezüchtet werden kann, und zwar aufgrund eines genetischen Beitrages aus dem Fusionspartner des selektiv zerstörbaren Hybridoms, d. h. des B-Lymphozyten oder des zweiten Hybridoms.In general, selective destructibility can be obtained by back-selection to a hybridoma that lacks a genetic component necessary for its survival in a medium of choice in which the fusion-generated polydome can be grown based on a genetic contribution the fusion partner of the selectively destroyable hybridoma, d. H. of the B lymphocyte or the second hybridoma.
Das im vorliegenden Fall bevorzugte Rückselektionsverfahren umfaßt die Züchtung eines dem Hybrid-Antikörper einzuverleibenden Hybridoms, welches einen Antikörper absondert, der eine der gewünschten Spezifitäten hat, in einem 8-Azaguanin enthaltenden Nährmedium. In einem solchen Medium können beliebige solcher Zellen wachsen, in welche 8-Azaguanin ein verleibt wird, und welchen daher das Enzym Hypoxanthin-guaninphosphoribosy 1-transferase (HPRT) fehlt. Klone von Zellen, denen dieses Enzym fehlt, können in einem Medium, welches Hypoxanthin-aminopterin-thymidin (HAT) enthält, nicht wachsen. Somit können sie nunmehr selektiv in diesem Medium zerstört werden.The preferred re-selection method in the present case comprises culturing a hybridoma to be incorporated into the hybrid antibody, which secretes an antibody which has one of the desired specificities, in a nutrient medium containing 8-azaguanine. Any such cells in which 8-azaguanine is incorporated and which therefore lack the enzyme hypoxanthine guanine phosphoribosy 1-transferase (HPRT) can grow in such a medium. Clones of cells lacking this enzyme cannot grow in a medium containing hypoxanthine aminopterin thymidine (HAT). They can now be selectively destroyed in this medium.
Ein sehr ähnliches Verfahren zurP ackselektion umfaßt das Züchten der den gewünschten Antikörper absondemden Hybridome in einem Medium, das 6-Thioguanin enthält, ein anderes Analogon von Guanin, das für die Zelle toxisch ist, wenn es der DNA einverleibt wird. Wieder fehlt bestimmten Zellen, welche in diesem Medium wachsen werden, das HPRT-Enzym, und Klone dieser Zellen werden notwendigerweise gegenüber HAT-Medium empfindlich sein.A very similar method of pack selection involves culturing the hybridomas that secrete the desired antibody in a medium containing 6-thioguanine, another analogue of guanine that is toxic to the cell when incorporated into the DNA. Again, certain cells that will grow in this medium lack the HPRT enzyme, and clones of these cells will necessarily be sensitive to HAT medium.
Noch ein anderes Verfahren zur Rückselektion, das im Rahmen der Erfindung angewendet werden kann, umfaßt das Züchten von Zellen der selektierten Hybridomzellinie in einem Medium, das eines der beiden Thyminanaloga -4-Yet another method of re-selection that can be used in the invention involves growing cells of the selected hybridoma cell line in a medium that is one of the two thymine analogues -4-
AT 394 577 B 5-Bromuracyldeoxyribose(BUdR)oder2-Aminopurinenthält.Nursolche Zellen, denen dasEnzymThymidinkinase (TK) fehlt, können in einem Medium wachsen, welches einen dieser zwei Inhibitoren enthält. Wie im Fall von Zellen, denen das Enzym HPRT fehlt, werden Zellen, denen TK fehlt, in HAT-Medium nicht wachsen.AT 394 577 B contains 5-bromouracyldeoxyribose (BUdR) or 2-aminopurine. Only such cells lacking the enzyme thymidine kinase (TK) can grow in a medium containing one of these two inhibitors. As in the case of cells lacking the HPRT enzyme, cells lacking TK will not grow in HAT medium.
Ein unterschiedliches Verfahren zur Gewinnung eines selektiv zerstörbaren Ausgangshybridoms umfaßt die irreversible Enzymhemmungunter Verwendung von Stoffwechselinhibitoren. Unter diesen werden die sogenannten Kcat-Inhibitoren bevorzugt Diese Inhibitoren sind Analoga eines Enzymsubstrats, welche durch das Targetenzym in ein hoch reaktives Molekül umgewandelt werden, das mit dem Enzym an seiner Aktivstelle unter irreversibler Hemmung des Enzyms reagiert. Zum Beispiel hemmt die Behandlung des selektierten Hybridoms mit einem Analogem von Glutamin, wie Azaserin oder 5-Diazo-5-oxa-L-norleucin (DON), das Enzym Formylglycinamid-ribonucleotidamidotransferase unter Bildung einer kovalenten Bindung mit einem Cysteinrest an der Aktivstelle des Enzyms irreversibel. Diese Hemmung wird letztlich zum Zelltod führen. Das Hybridom kann jedoch durch Fusion mit dem zweiten Ausgangsmaterial des Polydoms, welches das erforderliche Enzym liefert, gerettet werden.A different method for obtaining a selectively destructible starting hybridoma involves irreversible enzyme inhibition using metabolic inhibitors. Among these, the so-called Kcat inhibitors are preferred. These inhibitors are analogues of an enzyme substrate, which are converted into a highly reactive molecule by the target enzyme, which reacts with the enzyme at its active site with irreversible inhibition of the enzyme. For example, treatment of the selected hybridoma with an analog of glutamine, such as azaserine or 5-diazo-5-oxa-L-norleucine (DON), inhibits the enzyme formylglycinamide ribonucleotide amidotransferase to form a covalent bond with a cysteine residue at the active site of the enzyme irreversible. This inhibition will ultimately lead to cell death. However, the hybridoma can be saved by fusion with the second starting material of the polydome, which provides the required enzyme.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das selektiv zerstörbare Hybridom mit komplementären B-Lymphozyten fusioniert, typischerweise solchen, die als Milzzellen einem Wirt entnommen wurden, der vorher mit einem Antigen immunisiert worden ist, welches ein an ein Trägerprotein gebundenes Hapten sein kann, das ausgewählt wurde, um den Wirt zu veranlassen, eine Immunantwort hervorzurufen, welche Antikörper erzeugt, die die in dem Hybrid-Antikörper erwünschte zweite Spezifität haben. Der Wirt ist üblicherweise eine Maus, doch können Spezies von Kaninchen, Menschen und andere Tiere ebenfalls verwendet werden, obgleich eine Interspeziesfusion eine Stabilität niedriger Ordnung ergeben kann. Das Verfahren zur Immunisierung eines solchen Wirtes ist selbstverständlich wohlbekannt und es brauchen keine Einzelheiten hier angegeben werden.In a preferred embodiment, the selectively destructible hybridoma is fused to complementary B-lymphocytes, typically those taken as spleen cells from a host that has been previously immunized with an antigen, which may be a hapten bound to a carrier protein, which has been selected to cause the host to elicit an immune response that produces antibodies that have the second specificity desired in the hybrid antibody. The host is usually a mouse, but species of rabbits, humans and other animals can also be used, although an interspecies fusion can give low order stability. The method of immunizing such a host is of course well known and no details need be given here.
Die Fusion des selektiv zerstörbaren Hybridoms mit den B-Lymphozyten zur Gewinnung des Polydoms kann durch Vereinigung der zwei Gruppen von Zellen in einem Medium bewirkt werden, welches ein Mittel enthält, das dafür bekannt ist, daß es die Zellfusion nach bekannten Verfahren begünstigt, wie Polyethylenglykol oder Sendi virus.Fusion of the selectively destructible hybridoma with the B lymphocytes to obtain the polydome can be accomplished by combining the two groups of cells in a medium containing an agent known to promote cell fusion by known methods, such as polyethylene glycol or Sendi virus.
Nach der Fusion werden die Zellen in ein Medium, wie HAT-Medium, zur Züchtung überführt. Die B-Lymphozyten werden nur einen kurzen Zeitraum überleben und die Ausgangshybridomzellen können in dem Medium nicht wachsen. Die Population des Polydoms, das als Ergebnis der Fusion gebildet wird, kann jedoch wegen der Komplementierung des Ausgangshybridoms durch den B-Lymphozyten, zum Beispiel durch einen genetischen Beitrag der Fähigkeit zur Herstellung eines fehlenden Enzyms, wie HPRT oder TK, oder durch einen direkten Beitrag eines in dem Ausgangs-Hybridom inhibierten Enzyms, in dem Medium gezüchtet werden. Klone der einzelnen Polydome werden gezüchtet und ausgesondert, um solche zu selektieren, welche Antikörper mit der gewünschten Doppelspezifität absondem. Klone von Polydomen, deren Antikörper die gewünschte Doppelspezifität zeigen, werden weiterhin getrennt, um solche auszuwählen, deren zweite Spezifität, d. h. jene, die von den B-Lymphozyten erhalten wurde, und Affinität am meisten erwünscht sind.After the fusion, the cells are transferred to a medium such as HAT medium for cultivation. The B lymphocytes will only survive for a short period of time and the starting hybridoma cells cannot grow in the medium. However, the population of the polydome formed as a result of the fusion can be due to the complementation of the starting hybridoma by the B lymphocyte, for example by a genetic contribution to the ability to produce a missing enzyme such as HPRT or TK, or by a direct contribution of an enzyme inhibited in the starting hybridoma in which medium is grown. Clones of the individual polydomes are grown and screened out in order to select those which separate antibodies with the desired double specificity. Clones of polydomes whose antibodies show the desired double specificity continue to be separated to select those whose second specificity, i. H. those obtained from the B lymphocytes and affinity most desirable.
In einer weiteren Ausführungsform wird das Polydom durch Fusionierung des selektiv zerstörbaren Hybridoms, unter Verwendung eines geeigneten Fusionsmittels, mit einem zweiten Hybridom, das ebenfalls selektiv zerstörbar ist, erhalten. Das zweite Ausgangshybridom wird in der gleichen Weise wie das erste erhalten, d. h. durch ein Verfahren von Rückselektion, irreversible Enzymhemmung oder durch irgendwelche andere geeignete Methoden. In einem solchen Fall muß das zweite Hybridom befähigt sein, das erste zu komplementieren. Wenn zum Beispiel dem ersten selektiv zerstörbaren Hybridom das Enzym HPRT fehlt, muß das zweite dazu befähigt sein, dem Polydom ein Gen beizusteuem, welches das Polydom befähigt, HPRT zur Expression zu bringen. In ähnlicherWeise muß, falls dem zweiten selektiv zerstörbaren Hybridom das Enzym TK fehlt, das erste ein Gen für TK des Polydoms beisteuern. Eine ähnliche Komplementarität zwischen den zwei Hybridomen muß vorhanden sein, falls eine irreversible Hemmung eines Enzyms bewirkt worden ist, um denselben selektive Zerstörbarkeit zu verleihen. Es ist auch möglich, als ein Hybridomausgangsmaterial ein Hybridom zu verwenden, das einem Rückselektionsverfahren unterworfen worden ist, und als das andere ein Hybridom, das einem Verfahren zur Enzymhemmung unterworfen worden ist.In a further embodiment, the polydome is obtained by fusing the selectively destroyable hybridoma, using a suitable fusion agent, with a second hybridoma, which is also selectively destroyable. The second starting hybridoma is obtained in the same way as the first, i.e. H. by a process of re-selection, irreversible enzyme inhibition, or by any other suitable method. In such a case, the second hybridoma must be able to complement the first. For example, if the first selectively destroyable hybridoma lacks the HPRT enzyme, the second must be capable of contributing a gene to the polydome that enables the polydome to express HPRT. Similarly, if the second selectively destroyable hybridoma lacks the TK enzyme, the first must contribute a TK gene to the polydome. Similar complementarity must exist between the two hybridomas if irreversible inhibition of an enzyme has been effected to confer selective destructibility on them. It is also possible to use as a hybridoma starting material a hybridoma which has been subjected to a re-selection process and as the other a hybridoma which has been subjected to an enzyme inhibition process.
Die Verwendung von komplementären, selektiv zerstörbaren Hybridomen als Ausgangsmaterialien für das Polydom hat den Vorteil, daß beide Ausgangsmaterialien auf der Basis der Spezifitäten und Affinitäten des monoklonalen Antikörpers, den sie bilden, ausgewählt werden können, wohingegen im Falle von Fusion eines einzelnen Hybridoms mit B-Lymphozyten keine Prefusionsselektion unter den B-Lymphozyten zur Gewinnung solcher, die einen Antikörper der gewünschten Spezifität und Affinität produzieren, vorgenommen werden kann.The use of complementary, selectively destructible hybridomas as starting materials for the polydome has the advantage that both starting materials can be selected on the basis of the specificities and affinities of the monoclonal antibody they form, whereas in the case of fusion of a single hybridoma with B- Lymphocytes cannot be prefused for selection among B lymphocytes to obtain those that produce an antibody of the desired specificity and affinity.
Die Fusion der zwei selektiv zerstörbaren Hybridomen kann unter Verwendung von Polyethylenglykol oder unter Verwendung anderer Fusionierungsmittel, wiederum gemäß bekannten Methoden, bewirkt werden. Nach der Fusion werden die Zellen in ein Wachstumsmedium überführt, in welchem die zwei Ausgangsmaterialien nicht wachsen können, aber in welchem die aus der Fusion entstandenen Polydome wegen der komplementären Beiträge der Ausgangsmaterialien zu wachsen in der Lage sind. -5-The fusion of the two selectively destructible hybridomas can be effected using polyethylene glycol or using other fusion agents, again according to known methods. After the fusion, the cells are transferred to a growth medium in which the two starting materials cannot grow, but in which the polydomes resulting from the fusion are able to grow because of the complementary contributions of the starting materials. -5-
AT 394 577 BAT 394 577 B
Bisher haben wir Selektionsverfahren zur Gewinnung selektiv zerstörbarer Hybridome für die Verwendung als beide Hybridompartner in einer Hybridom-Hybridom-Fusion zur Bildung eines Polydoms erörtert. Das Erfordernis für das zweite Hybridomausgangsmaterial, selektiv zerstörbar zu sein, kann jedoch vermieden werden, indem dem ersten Hybridomausgangsmaterial sowohl eine dominante als auch eine rezessive Markierung verliehen wird. Ein derzeit bevorzugtes Verfahren ist die HAT-Ouabain-Selektion. Das Arzneimittel Ouabain ist ein spezifischer Inhibitor der Na+-K+-aktivierten ATPase der Plasmamembran. Jenes Enzym ist für die Einführung von K+ in eine Zelle und den Austritt von Na+ aus der Zelle verantwortlich. Zellen eines Hybridoms, das vorher rückselektiert wurde, um ihr selektive Zerstörbarkeit, zum Beispiel HAT-Empfindlichkeit,zu verleihen, werden in Ouabainmedium gezüchtet, um Ouabain-resistente Zellen zu selektieren. Klone dieser Zellen worden HAT-empfindlich, aber Ouabain-resistent sein. Im Gegensatz dazu wird das Hybridom, das zur Fusion damit selektiert worden ist, Ouabainempfindlich sein, kann aber in HAT überleben und wachsen. Alternativ kann eine Selektion hinsichtlich Ouabain-Resistenz zuerst entweder an der Ausgangsmyelomalinie oder der daraus stammenden Hybridom erfolgen, worauf eine Rückselektion oder andere Methode angewendet wird, um selektive Zerstörbarkeit zu verleihen.So far, we have discussed selection methods for obtaining selectively destructible hybridomas for use as both hybridoma partners in a hybridoma-hybridoma fusion to form a polydome. However, the need for the second hybridoma starting material to be selectively destructible can be avoided by giving the first hybridoma starting material both a dominant and a recessive label. A currently preferred method is HAT-ouabain selection. The drug Ouabain is a specific inhibitor of the Na + -K + -activated ATPase of the plasma membrane. That enzyme is responsible for the introduction of K + into a cell and the exit of Na + from the cell. Cells of a hybridoma that has been preselected back to confer selective destructibility, e.g., HAT sensitivity, are grown in ouabain medium to select ouabain resistant cells. Clones of these cells have been HAT-sensitive, but ouabain-resistant. In contrast, the hybridoma selected for fusion with it will be sensitive to ouabain, but can survive and grow in HAT. Alternatively, selection for ouabain resistance can first be made either on the parent myeloma line or the hybridoma derived therefrom, after which a re-selection or other method is used to confer selective destructibility.
Zellen, die durch Fusion der zwei Hybridomen in Polyethylenglykol oder einem anderen Fusionsmittel erhalten worden sind, werden in das HAT-Medium überführt, das Ouabain in einer Konzentration enthält, welche für das zweite Hybridomausgangsmaterial letal ist. Das selektiv zerstörbare Hybridomausgangsmaterial kann in dem HAT-Medium, selbst wenn es Ouabainresistent ist, nicht überleben, weil ihm entweder zum Beispiel das HPRT- oder ein anderes Enzym fehlt. Die Polydomzellen können jedoch in dem Medium wachsen, da sie die für das Überleben erforderlichen Enzyme und Ouabain-Resistenz besitzen. Das vorstehende Verfahren hat den Vorteil, daß es möglich ist, ein Polydom durch direkte Fusionierung eines selektiv zerstörbaren Hybridomausgangsmaterials, das einen Antikörper absondert, der eine der in dem Hybrid erwünschten Spezifitäten hat, mit einem zweiten „Außerbord“-Hybridom, die einen Antikörper mit der anderen, in dem Hybrid erwünschten Spezifität absondert, zu erhalten, und daß keine Anwendung von Methoden erforderlich ist, um selektive Zerstörbarkeit auf das zweite Hybridomausgangsmaterial zu übertragen.Cells obtained by fusing the two hybridomas in polyethylene glycol or other fusion agent are transferred to the HAT medium containing ouabain in a concentration that is lethal for the second hybridoma starting material. The selectively destructible hybridoma starting material cannot survive in the HAT medium, even if it is ouabain resistant, because it lacks, for example, either the HPRT or other enzyme. However, the polydome cells can grow in the medium because they have the enzymes and ouabain resistance necessary for survival. The above method has the advantage that it is possible to fuse a polydome by directly fusing a selectively destroyable hybridoma starting material that secretes an antibody that has one of the specificities desired in the hybrid with a second “outboard” hybridoma that has an antibody of the other specificity desired in the hybrid, and that no methodology is required to impart selective destructibility to the second hybridoma starting material.
Noch eine andere Methode zur Gewinnung eines Polydoms, die ein universelles Ausgangsmaterial anwendet, d. h. ein solches, das sowohl eine positive als auch eine negative Markierung aufweist, und das mit irgendeinem „ Außerbord“-Hybridom fusioniert werden kann, umfaßt die Verwendung von Rekombinations-DNA-Vektoren, die verschiedene Arzneimittelresistenzmaikierungen tragen. Zum Beispiel kann S V40, das ein Gen für Neomycinresistenz trägt, verwendet werden.Yet another method of obtaining a polydome that uses a universal starting material, i. H. one that has both a positive and a negative label and that can be fused to any "outboard" hybridoma involves the use of recombination DNA vectors bearing various drug resistance masks. For example, S V40, which carries a gene for neomycin resistance, can be used.
Ein derzeit bevorzugtes universelles Ausgangsmaterial ist ein solches, das HAT-empfindlich-Neomycin-resistent ist Das gewählte Ausgangsmaterial wird auf HAT-Empfindlichkeitrückselektiertunddann mitSV40-Vektor, der ein Gen für Neomycinresistenz trägt, transfiziert. Diese Verfahrensweise kann auch umgekehrt werden, wobei die Transfizierung zuerst erfolgt. Die entstehende Hybridoma kann in Gegenwart von Neomycin, welches normalerweise für Säugetierzellen toxisch ist, wachsen, wird aber in Gegenwart von HAT absterben. Außerbord-Hybridome jedoch wachsen in HAT, sterben aber in Gegenwart von Neomycin ab. Produkte der Fusion der Ausgangsmaterialien überleben daher in Gegenwart von HAT und Neomycin. Während die Verwendung von Vektoren zur Übertragung von Resistenz gegen Neomycin derzeit bevorzugt wird, können auch Vektoren, die Gene tragen, welche an Säugetierzellen Resistenz gegen andere Arzneimittel übertragen, verwendet werden.A currently preferred universal starting material is one that is HAT sensitive neomycin resistant. The selected starting material is re-selected for HAT sensitivity and then transfected with SV40 vector carrying a neomycin resistance gene. This procedure can also be reversed, with the transfection taking place first. The resulting hybridoma can grow in the presence of neomycin, which is normally toxic to mammalian cells, but will die in the presence of HAT. Outboard hybridomas, however, grow in HAT, but die in the presence of neomycin. Products of the fusion of the starting materials therefore survive in the presence of HAT and neomycin. While the use of vectors to confer resistance to neomycin is currently preferred, vectors bearing genes that confer resistance to other drugs on mammalian cells can also be used.
Obgleich es derzeit bevorzugt wird, ist es für unser Verfahren zur Gewinnung von Polydomen aus Paaren von Hybridomen nicht wesentlich, daß wenigstens eine der Ausgangszellinien selektiv zerstörbar ist. Es liegt im Rahmen unserer Erfindung, ein Paar von Hybridomen zu fusionieren, von denen keines selektiv zerstörbar ist, welches Paar aber einen Antikörper mit einer der in dem Hybrid gewünschten Spezifitäten absondert, in Gegenwart eines geeigneten Fusionierungsmittels zu fusionieren, worauf die S ubklonierung aller Zellen erfolgt, bevor die Population der unfusionierten Ausgangshybridome in einem Ausmaß zunimmt, daßdieTrennungder Subklonen zur Identifizierung von Polydomen nicht praktisch ist. Die Subklone werden anschließend ausgesondert, um festzustellen, welche von ihnen Antikörper mit einer Doppelspezifität absondem.Although it is currently preferred, it is not essential to our method of obtaining polydomes from pairs of hybridomas that at least one of the parent cell lines is selectively destructible. It is within the scope of our invention to fuse a pair of hybridomas, none of which is selectively destructible, but which pair secretes an antibody with one of the specificities desired in the hybrid, in the presence of a suitable fusion agent, followed by subcloning of all cells occurs before the population of the initial unfused hybridomas increases to such an extent that the separation of the subclones for the identification of polydomes is not practical. The subclones are then discarded to determine which of them secrete antibodies with a double specificity.
Dieses Verfahren ist bestens geeignet, um Polydomezu erhalten, wenn dieFusionsfrequenz der Ausgangszellinien hoch ist. In jedwedem Falle und insbesondere, wenn die Zellfusionsfrequenz niedrig ist, können die bei der Fusion von Hybridomen, deren monoklonale Antikörper gegen verschiedene Antigene gerichtet sind, erhaltenen Zellen unter Verwendung eines Cytofluorographen zur Identifizierung der Polydome ausgesondert werden. Um dies zu bewirken, werden Proben der zwei Antigene mit verschiedenen fluoreszierenden Resten etikettiert, deren Fluoreszenz bei verschiedenen Wellenlängen auftritt. Beispielsweise kann man eines mit Fluorescin und das andere mit Rhodamin etikettieren. Die Population von Zellen aus der Fusion, die vorzugsweise über Nacht oder während irgendeines anderen geeigneten Zeitraumes für die Erhöhung ihrer Zahl gezüchtet worden ist, wird mit den zwei etikettierten Antigenen bebrütet Die Zellen werden dann unter Verwendung des Cytofluorographen ausgesondert. Solche Zellen mit Fluoreszenz bei nur einer der zwei Wellenlängen werden aus Zellinien der Ausgangshybridome stammen. Zellen jedoch, die Fluoreszenz bei beiden Wellenlängen zeigen, werden Polydomen sein, die isoliert und -6-This method is most suitable for obtaining polydomes when the starting cell line fusion frequency is high. In any event, and particularly when the cell fusion frequency is low, the cells obtained from the fusion of hybridomas whose monoclonal antibodies are directed to various antigens can be screened using a cytofluorograph to identify the polydomes. To do this, samples of the two antigens are labeled with different fluorescent residues, the fluorescence of which occurs at different wavelengths. For example, one can be labeled with fluorescine and the other with rhodamine. The population of cells from the fusion, which has preferably been grown overnight or during any other suitable period to increase their number, is incubated with the two labeled antigens. The cells are then screened using the cytofluorograph. Such cells with fluorescence at only one of the two wavelengths will come from cell lines of the starting hybridomas. However, cells that show fluorescence at both wavelengths will be polydomes that are isolated and -6-
AT 394 577 B subkloniert werden können.AT 394 577 B can be subcloned.
Bei noch einer anderen Ausfuhrungsform kann ein Polydom unmittelbar durch Entfernen des Nukleus aus einem ersten Hybridom, welches einen monoklonalen Antikörper mit einer der in dem Hybrid erwünschten Spezifitäten absondert, und Einsetzen desselben in das Cytoplasma eines zweiten Hybridoms, welches einen monoklonalen Antikörper mit der zweiten erwünschten Spezifität absondert, erhalten werden. Selbstverständlich braucht keine der Ausgangshybridome selektiv zerstörbar zu sein, um bei diesem Verfahren verwendet zu werden. Nach Einsetzen des Kemmaterials wird die Zelle geklont, um eine Population des Polydoms zu erhalten.In yet another embodiment, a polydome can be removed immediately by removing the nucleus from a first hybridoma that secretes a monoclonal antibody with one of the specificities desired in the hybrid and inserting it into the cytoplasm of a second hybridoma that has a monoclonal antibody with the second desired Specificity secreted. Of course, none of the starting hybridomas need to be selectively destructible to be used in this method. After inserting the core material, the cell is cloned to obtain a population of the polydome.
Wir haben gefunden, daß zum Unterschied von den Ausgangshybridomen oder B-Lymphozyten, welche einen einzigen Antikörper absondem, nach unserer Erfindung erhaltene Polydomzellen ein Gemisch von Antikörpern absondem, von denen wenigstens einer ein Hybrid-Antikörper mit Doppelspezifität ist. Durch das Polydom werden auch relativ kleinere Mengen von Antikörpern der gleichen Spezifität produziert, wie sie durch die bei der Gewinnung des Polydoms verwendeten Ausgangszeilen produziert werden. Das Verhältnis von Hybride zu monospezifischen Antikörpern scheint etwa 2:1:1 zu sein, welches das erwartete ist, wenn die Polydoma gleiche Mengen aller möglichen, durch die Ausgangszeilen synthetisierten (H)-Ketten produziert, welche in dem Polydom selbst willkürlich kombiniert sind.We have found that, unlike the starting hybridomas or B-lymphocytes which secrete a single antibody, polydome cells obtained according to our invention secrete a mixture of antibodies, at least one of which is a hybrid antibody with double specificity. The polydome also produces relatively smaller amounts of antibodies of the same specificity as those produced by the starting lines used in the extraction of the polydome. The hybrid to monospecific antibody ratio appears to be about 2: 1: 1, which is what is expected when the polydoma produces equal amounts of all possible (H) chains synthesized from the parent lines, which are arbitrarily combined in the polydome itself.
Die Polydome können in vitro kultiviert oder in vivo in entweder genetisch kompatiblen Tieren oder Nacktmäusen gezüchtet werden, um große Mengen des Hybrid-Antikörpers zu erhalten, der aus dem Kulturmedium oder der ascitischen Flüssigkeit des Tieres unter Anwendung bekannter Verfahrensweisen gewonnen wird. Siehe zum Beispiel die Protokolle in „Monoclonal Antibodies“, herausgegeben von Kennen und Mitarbeitern, Plenum Press, New York (1980), auf den Seiten 363 - 418.The polydomes can be cultured in vitro or grown in vivo in either genetically compatible animals or nude mice to obtain large amounts of the hybrid antibody derived from the animal's culture medium or ascitic fluid using known procedures. See, for example, the protocols in "Monoclonal Antibodies," edited by Kennen and coworkers, Plenum Press, New York (1980), pages 363-418.
Das Gemisch der durch das Poly dom produzierten Antikörper kann zur Gewinnung des Hybrids getrennt werden. Beispielsweise gestattet aufeinanderfolgende Affinitätschromatographie gegen zuerst das eine und dann das andere Antigen, für welche das Hybrid spezifisch ist, deren Abtrennung von den monospezifischen Antikörperverunreinigungen. Wir haben auch gefunden, daß einfache Ionenaustauschchromatographie und elektrophoretische Methoden ebensogut unter wenigstens bestimmten Umständen angewendet werden können. Erforderlichenfalls könnte der Ladungsunterschied für Ionenaustausch eines der Kennmerkmale des Antikörpers sein, der bei der Auswahl der Ausgangslinien berücksichtigt wird.The mixture of antibodies produced by the poly dom can be separated to obtain the hybrid. For example, successive affinity chromatography against first one and then the other antigen for which the hybrid is specific allows them to be separated from the monospecific antibody contaminants. We have also found that simple ion exchange chromatography and electrophoretic methods can equally well be used in at least certain circumstances. If necessary, the charge difference for ion exchange could be one of the characteristics of the antibody that is taken into account when selecting the starting lines.
Beispiel 1:Example 1:
Ein monoklonaler Hybrid-Antikörper, der eine Doppelspezifität für Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg) und Prostatinsäurephosphatase (PAP) aufweist, wurde gemäß der vorliegenden Erfindung in folgender Weise hergestellt:A hybrid monoclonal antibody that has dual specificity for hepatitis B surface antigen (HBsAg) and prostatic acid phosphatase (PAP) was prepared according to the present invention in the following manner:
Ein Hybridom, das einen monoklonalen Antikörper gegen PAP absondert, wurde in HAT-Medium eine Woche gezüchtet und dann in ein nicht-selektives Medium übertragen und in diesem gezüchtet. Nach verschiedenen Zeiträumen des Wachstums unter nicht-selektiven Bedingungen wurden aliquote Anteile von 2 ml der Zellen in ein 10"^ M 8-Azaguanin enthaltendes Medium gebracht, welches die Zellen am Wachstum, durch Einverleibung von 8-Azaguanin in deren DNA anstelle von Guanin, hinderte. Zellen, denen das HPRT-Enzym fehlt, überlebten und wuchsen in diesem Medium, und diese Zellen überlebten notwendigerweise in HAT nicht.A hybridoma that secretes a monoclonal antibody to PAP was grown in HAT medium for one week and then transferred to and grown in a non-selective medium. After various periods of growth under non-selective conditions, 2 ml aliquots of the cells were placed in a medium containing 10 "^ M 8-azaguanine, which allowed the cells to grow by incorporating 8-azaguanine in their DNA instead of guanine, prevented. Cells lacking the HPRT enzyme survived and grew in this medium, and these cells did not necessarily survive in HAT.
Klone, die in dem 8-Azaguanin enthaltenden Medium wuchsen, wurden auf Empfindlichkeit gegen HAT und Anti-PAP-Produktion geprüft. Ein Klon, der noch Anti-PAP produzierte und HAT-Empfindlichkeit bei einer Umkehrfrequenz von weniger als 4 x 10"® zeigte, wurde subkloniert. Alle Subklone verhielten sich ähnlich wie der Ausgangsklon.Clones grown in the medium containing 8-azaguanine were tested for sensitivity to HAT and anti-PAP production. A clone that still produced anti-PAP and showed HAT sensitivity at an inversion frequency of less than 4 x 10 "was subcloned. All subclones behaved similarly to the original clone.
Zellen aus einem der HAT-empfindlichen Subklone wurden in Polyethylenglykol mit Milzzellen fusioniert, die aus mit HBsAg hyperimmunisierten Balb/c-Mäusen erhalten wurden, um Polydome unter Anwendung der Fusionsmethode von Gerhard zu gewinnen. Siehe „Monoclonal Antibodies“, oben, auf Seite 370. Die Fusion lieferte 220 Polydome, die ausgesondert wurden, um festzustellen, welche abgesonderten Antikörper Spezifität für sowohl PAP als auch HBsAg zeigen. Bei Klonen von zweien solcher Polydome wurde festgestellt, daß sie Antikörper und in der Folge Asciten produzieren, welche beide Spezifitäten zeigen.Cells from one of the HAT sensitive subclones were fused in polyethylene glycol with spleen cells obtained from Balb / c mice hyperimmunized with HBsAg to obtain polydomes using Gerhard's fusion method. See “Monoclonal Antibodies,” above, on page 370. The fusion yielded 220 polydomes that were screened to determine which secreted antibodies were specific for both PAP and HBsAg. Clones of two such polydomes have been found to produce antibodies and subsequently ascites, both of which show specificities.
Subklone von beiden Polydomen setzten die Produktion von Asciten fort, welche beide Spezifitäten zeigten, und ergaben an Orstein-Davis-PAGE Dreifachbanden, die ähnlich jenen der Ausgangsklone sind. In Radioimmunotests zeigten die Asciten aus beiden Klonen die Bindung von ^I-HBsAg und ^I-PAP und ergaben Ka-Werte von je annähernd 10^, was die Annahme der Bildung von Antikörpern mit zwei Spezifitäten zuläßt.Subclones from both polydomes continued to produce ascites showing both specificities and gave triple bands on Orstein-Davis-PAGE similar to those of the parent clones. In radioimmunoassays, the ascites from both clones showed the binding of ^ I-HBsAg and ^ I-PAP and gave Ka values of approximately 10 ^ each, which allows the assumption of the formation of antibodies with two specificities.
Die Daten in der folgenden Tabelle I zeigen die Ergebnisse, die bei Immunotests unter Verwendung der Asciten erhalten wurden, die aus einem Klon des einen der Polydome erhalten wurden, im Vergleich mit Asciten, die von Hybridomen erhalten wurden, welche monoklonale Antikörper gegen IgE (als Kontrolle verwendet), PAP bzw. HBsAg absondem, unter Verwendung von immobilisiertem HBsAg als feste Phase und verschiedenen radio- -7-The data in Table I below show the results obtained in immunoassays using the ascites obtained from a clone of one of the polydomes compared to ascites obtained from hybridomas which have monoclonal antibodies to IgE (as Control used), PAP or HBsAg separately, using immobilized HBsAg as solid phase and various radio -7-
AT 394 577 B markierten Antigenen als Lösungsphase.AT 394 577 B marked antigens as the solution phase.
Eine 200 μΙ-Probe der Asciten aus dem Polydom und jedem der drei Hybridome wurde jeweils über Nacht mit 12Polystyrolkugeln,an welche HBsAg gebunden war,bebrütet. Die HBsAg-Kugeln wurden von AbbottLaboratories, North Chicago, Illinois, erhalten. Nach dem Waschen wurden Dreifachproben 4 Stunden mit 100.000 cpm des angegebenen I-markierten Antigens bebrütet. Nach einer zweiten Wäsche wurden die Kugeln einem Zähl Vorgang unterworfen, um die Menge an markiertem Antigen, das an die Kugeln gebunden ist, zu bestimmen. Bei einem Testsatz unter Verwendung von radiomarkiertem PAP als Lösungsphasenantigen wurde Anti-PAP dem Antigen vor seiner Bebrütung mit der Kugel zugesetzt. Der Antikörper gegen PAP, der für diesen Zweck verwendet wurde, ist der monoklonalen Antikörper, der durch das zur Herstellung des Polydoms verwendete Ausgangshybridom produziert wird, und ist daher gegen das gleiche PAP-Epitop gerichtet, wie jenes, gegen das erwarteterweise auch der Hybrid-Antikörper gerichtet ist.A 200 μΙ sample of the ascites from the polydome and each of the three hybridomas was incubated overnight with 12 polystyrene balls to which HBsAg was bound. The HBsAg spheres were obtained from Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois. After washing, triplicate samples were incubated for 4 hours with 100,000 cpm of the indicated I-labeled antigen. After a second wash, the balls were counted to determine the amount of labeled antigen bound to the balls. In a test set using radiolabeled PAP as the solution phase antigen, Anti-PAP was added to the antigen before it was incubated with the ball. The antibody against PAP used for this purpose is the monoclonal antibody produced by the starting hybridoma used to make the polydome and is therefore directed against the same PAP epitope as that against which the hybrid is expected to be. Antibody is targeted.
Tabelle ITable I
Ergebnisse von Radiotests, welche das Vorliegen von Hybrid-Antikörper mit Doppelspezifität in Polydomasciten zeigenResults of radio tests showing the presence of hybrid antibodies with double specificity in polydomascites
Spezifität von Asciten cpm *HBsAg cpm *PAP cpm *PAP + Anti-PAP cpm * IgE Anti-IgE 15.340 2.145 2.930 3.290 Anti-PAP 16.280 2.956 3.128 3.180 Anti-HBsAg 73.020 2.973 2.870 3.330 erwartete Doppelspezifität 78.900 82.533 2.936 3.143 * I-markiertes AntigenSpecificity of ascites cpm * HBsAg cpm * PAP cpm * PAP + Anti-PAP cpm * IgE Anti-IgE 15,340 2,145 2,930 3,290 Anti-PAP 16,280 2,956 3,128 3,180 Anti-HBsAg 73,020 2,973 2,870 3,330 expected double specificity 78,900 82,533 2,936 3,143 * I-labeled antigen
Die Daten in Tabelle I zeigen, daß nur die aus nicht-spezifischer Bindung erwartete Strahlung für die Anti-PAP-Asciten im Vergleich zu jener für die IgE-Kontrolle gemessen wurde. Die Asciten, welche den HBsAg-Antikörper enthalten, banden anderseits das markierte HBsAg-Antigen in der erwarteten Weise, zeigten aber unspezifische Bindung, wenn die anderen markierten Antigene getestet wurden. Die Asciten aus dem Polydomklon banden jedoch sowohl markiertes HBsAg als auch markiertes PAP, wobei das erstere dem Vorliegen von etwas nicht-hybridischem, monospezifischem Antikörper gegen HBsAg in den Asciten zuzuschreiben ist, und das letztere einem Hybrid zuzuschreiben ist, das das HBsAg an der Kugel und die Spur markierter PAP in Lösung binden und überbrücken kann. Der Versuch unter Verwendung eines Gemisches aus markiertem PAP und Anti-PAP aus dem Ausgangshybridom bestätigt, daß die Anti-PAP-Spezifitätdes Hybrids für dasselbe Epitop wie beim vom Ausgangsmaterial abgesonderten Antikörper gegeben ist, da aufgrund der Hemmung, durch den Ausgangsantikörper, von Bindung von markiertem PAP an den Hybrid-Antikörper nur die Hintergrundstrahlung beobachtet wird.The data in Table I show that only the radiation expected from non-specific binding was measured for the anti-PAP ascites compared to that for the IgE control. The ascites containing the HBsAg antibody, on the other hand, bound the labeled HBsAg antigen in the expected manner, but showed non-specific binding when the other labeled antigens were tested. However, the ascites from the polydomone clone bound both labeled HBsAg and labeled PAP, the former attributed to the presence of some non-hybrid, monospecific antibody to HBsAg in the ascites, and the latter attributed to a hybrid, the HBsAg on the ball and can bind and bridge the trace of marked PAP in solution. The experiment using a mixture of labeled PAP and anti-PAP from the starting hybridoma confirms that the anti-PAP specificity of the hybrid is given for the same epitope as for the antibody secreted from the starting material, because of the inhibition by the starting antibody of binding of labeled PAP on the hybrid antibody only the background radiation is observed.
Die Analyse der Asciten aus dem in den Vergleichsradiotests verwendeten Polydomklon wurde unter Anwendung von Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE) und Immunoelektrophorese (IEP) ausgeführt. Beide zeigten das Vorliegen von wenigstens drei Antikörperspezies an. Im präparativen Maßstab ausgeführte DEAE-Ionenaus-tauschchromatographie ergab drei gut getrennte Spitzen,von denen die mittlere eine Schulter hatte. Jede der Spitzen war gemäß Analyse durch PAGE und IEP homogen, und jede entsprach einer der Banden in den ursprünglichen Asciten.Analysis of the ascites from the polydomclone used in the comparative radio tests was performed using polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and immunoelectrophoresis (IEP). Both indicated the presence of at least three antibody species. Preparative-scale DEAE ion exchange chromatography revealed three well-separated peaks, the middle one of which had a shoulder. Each of the peaks was homogeneous as analyzed by PAGE and IEP, and each corresponded to one of the bands in the original ascites.
Material, das jede der DEAE-Spitzen repräsentiert, wurde unter Anwendung von radiomarkiertem HBsAg und PAP auf Antigenbindung geprüft. Die erste Spitze band HBsAg, doch nicht PAP. Die mittlere Spitze und deren Schulter banden sowohl HBsAg als auch PAP, und die letzte Spitze band nur PAP. Somit ist die mittlere Spitze ein Hybrid-Antikörper mit Doppelspezifität gegen HBsAg und PAP, der wenigstens zwei Subspezies enthält. -8-Material representing each of the DEAE tips was tested for antigen binding using radiolabeled HBsAg and PAP. HBsAg tied the first tip, but not PAP. The middle tip and its shoulder bound both HBsAg and PAP, and the last tip bound only PAP. Thus the middle tip is a hybrid antibody with double specificity against HBsAg and PAP, which contains at least two subspecies. -8th-
AT 394 577 BAT 394 577 B
Der als mittlere Spitze der DEAE-Chromatographie erhaltene Hybrid- Antikörper wurde mit ^1 radiomarkiert. Nach der Markierung waren 85 % des markierten Antikörpers zur Bindung anPAP, und 88 % zur Bindung an HBsAg, befähigt. Die Affinität des Hybrids für PAP war, wie gefunden wurde, etwas niedriger als jene des durch die Ausgangslinie produzierten monoklonalen Antikörpers gegen PAP. Dieser Unterschied in der Affinität war etwa der gleiche wie jener, der von uns zwischen einem monoklonalen Antikörper und seinem Fab-Fragment beobachtet wurde. DEAE-Chromatographie zeigte, daß der Hybrid-Antikörper mehr als 50 % der durch das Polydom produzierten Antikörper enthielt und sich grob dem Verhältnis2:1:1 näherte, das aus statistischen Gründen vorausgesagt wurde, falls das Polydom in der Lage wäre, alle die möglichen schweren Antikörperketten zu synthetisieren, d. h. solche, die entweder PAP- oder HBsAg-Spezifität zeigen, und die innerhalb der Zelle auf willkürlicher Basis, unter Bildung von Hybrid-Antikörper, im Gemisch mit kleineren Mengen der zwei monospezifischen Antikörper kombiniert sind, welche die gleiche Spezifität wie solche, die durch die Ausgangszeilen produziert sind, haben. Die Existenz an Subspezies von Hybrid-Antikörper legt nahe, daß sie sich in derZusammensetzung ihrer leichten Kette unterscheiden können.The hybrid antibody obtained as the middle tip of DEAE chromatography was radiolabeled with ^ 1. After labeling, 85% of the labeled antibody was capable of binding to PAP and 88% of binding to HBsAg. The affinity of the hybrid for PAP was found to be slightly lower than that of the monoclonal antibody against PAP produced by the parent line. This difference in affinity was about the same as that we observed between a monoclonal antibody and its Fab fragment. DEAE chromatography showed that the hybrid antibody contained more than 50% of the antibodies produced by the polydome and roughly approximated the 2: 1: 1 ratio that was predicted for statistical reasons if the polydome was able to do all of the possible synthesize heavy antibody chains, d. H. those which show either PAP or HBsAg specificity and which are combined within the cell on an arbitrary basis, with the formation of hybrid antibodies, in a mixture with smaller amounts of the two monospecific antibodies, which have the same specificity as those caused by the Output lines are produced. The existence of subspecies of hybrid antibodies suggests that they can differ in their light chain composition.
Beispiel 2:Example 2:
Monoklonale Hybrid-Antikörper, die Doppelspezifität für Human IgD und Prolactin aufweisen, wurden gemäß der vorliegenden Erfindung durch Fusion von zwei Hybridomen hergestellt, wobei eines davon so aufgebaut war, daß es zwei selektible genetische Markierungen enthält: Empfindlichkeit gegenüber HAT-Medium und Resistenz gegen Ouabain. Dieses doppelt markierte Hybridom oder dieses sogenannte „Universalausgangsmaterial“ könnte dann mit irgendeiner anderen Hybridoma fusioniert werden. Die entstandenen Polydome wachsen in Gegenwart von HAT und Ouabain, während etwaige unfusionierte Ausgangszeilen absterben. Die Vorteile der Verwendung solch eines „Universalausgangsmaterials“ sind hier bereits beschrieben worden.Monoclonal hybrid antibodies that have dual specificity for human IgD and prolactin were made according to the present invention by fusing two hybridomas, one of which was designed to contain two selectable genetic labels: sensitivity to HAT medium and resistance to ouabain . This double-labeled hybridoma or this so-called “universal starting material” could then be fused with any other hybridoma. The resulting polydomes grow in the presence of HAT and ouabain, while any unfused output lines die. The advantages of using such a “universal raw material” have already been described here.
Zur Konstruktion solch eines universellen Ausgangsmaterials wurden beide selektierbaren Markierungen während der Anfangskonstruktion des Hybridoms eingeführt. Zur Gewinnung dieser Ausgangszellinie wurde die verbreitet verfügbare, HAT-empfindliche Mäusemyeloma P3.653 für eine zweite genetische Markierung, Ouabain-Resistenz, durch Einführung von 1 mM Ouabain in das Wuchsmedium selektiert Während die meisten Zellen abstarben, hatte annähernd 1/100.000 der Zellen durch zufällige Mutation Resistenz gegen das Arzneimittel erworben und so überlebt und sich unter Bildung der neuen Myelomapopulation vermehrt, die HAT-empfindlich und Ouabain-resistent war.To select such a universal starting material, both selectable markers were introduced during the initial construction of the hybridoma. To obtain this starting cell line, the widely available, HAT-sensitive mouse myeloma P3.653 was selected for a second genetic marker, ouabain resistance, by introducing 1 mM ouabain into the growth medium. While most cells died, approximately 1 / 100,000 of the cells had passed through Random mutation Acquired resistance to the drug and survived and multiplied to form a new myeloma population that was sensitive to HAT and ouabain.
Diese HAT-empfindliche, Ouabain-resistente Myeloma wurde dann mit Milzzellen fusioniert, die aus mit IgD hyperimmunisierten Balb/c-Mäusen, unter Anwendung der oben zitierten Methode von Gerhard, erhalten wurden. Hybride wurden in HAT-Medium (ohne Ouabain) selektiert und Klone wurden hinsichtlich einer Produktion von monoklonalem, gegen IgD gerichteten Antikörper ausgesondert. Aus den positiven Klonen wurde einer, der einen IgG gegen IgD produzierte, zur weiteren Untersuchung ausgewählt. Dieser Klon wurde hinsichtlich Retention des Charakters von Ouabain-Resistenz durch Zugabe von 1 mM Ouabain zu dem Wachstumsmedium getestet. Annähernd ein Drittel der Zellen behielt diese genetische Markierung bei. Wenn die Kultur in Ouabain exponentiell wuchs, wurden die Zellen subkloniert. Ouabain-resistente Subklone wurden hinsichtlich fortgesetzter Produktion des monoklonalen Anti-IgD-Antikörpers geprüft Einer der Subklone wurde weiterhin nach der Verfahrens weise des Beispiels 1 rückselektiert, um eine Population von Zellen zu erhalten, die gegen HAT empfindlich ist Dieser Subklon wurde zwei Wochen lang unter nicht-selektiven Bedingungen gezüchtet und dann in ein 6-Thioguanin enthaltendes Medium gebracht. Wie oben angegeben, ist der Mechanismus der Wirkung von 6-Thioguanin ähnlich dem von 8-Azaguanin. Zellen, die 6-Thioguanin anstelle von Guanin in ihre DNA einverleiben, werden nicht wachsen. Zellen, welchen HPRT-Enzym fehlt, werden 6-Thioguanin aus dem Medium nicht verwerten und können daher wachsen, sind aber als Folge davon gegen HAT empfindlich. Diese Population des rückselektierten Subklons wurde dann selbst in 6-Thioguanin- und Ouabain-hältigem Medium subkloniert. Subklone wurden hinsichtlich fortgesetzter Produktion des monoklonalen Anti-IgD-Antiköipers getestet. Ein Klon, der all die gewünschten Kennmerkmale aufwies - Wachstum in Ouabain und 6-Thioguanin sowie Produktion von monoklonalem Anti-IgD - wurde zu einem sogenannten „Universalausgangsmaterial“ selektiert Dieses Universalausgangsmaterial könnte dann mit irgend einem anderen HAT-resistenten, Ouabain-empfindlichen Hybridom, unter Bildung eines Polydoms, fusioniert werden, welche einen Hybrid-Antikörper zur Expression bringen würde, von dem eine Spezifität Anti-IgD sein würde. Für diesen Zweck haben wir anfänglich ein Mäuse-Hybridom selektiert, welches einen monoklonalen, gegen Prolactin gerichteten Antikörper absondert Der monoklonale Antiprolactinantikörper gehört der gleichen Unterklasse (IgGj) an wie das Anti-IgD, das durch die Ausgangslinie zur Expression gebracht wird, und es wird leicht an Omstein-Davis-Gelen von jenem Antikörper separiert Eine solche Separation ist ein Anzeichen für eine in hohem Maße unterschiedliche Ladung an den Antikörpern und sollte somit eine leichte Isolierung eines Hybrid-Antikörpers durch DEAE-Sephadex-Chromatographie ermöglichen. -9-This HAT-sensitive, ouabain-resistant myeloma was then fused to spleen cells obtained from Balb / c mice hyperimmunized using IgD using Gerhard's method cited above. Hybrids were selected in HAT medium (without ouabain) and clones were screened for the production of monoclonal anti-IgD antibodies. From the positive clones, one that produced an IgG against IgD was selected for further investigation. This clone was tested for retention of the character of ouabain resistance by adding 1 mM ouabain to the growth medium. Almost a third of the cells retained this genetic label. When the culture in Ouabain grew exponentially, the cells were subcloned. Ouabain-resistant subclones were tested for continued production of the anti-IgD monoclonal antibody. One of the subclones was further re-selected according to the procedure of Example 1 to obtain a population of cells sensitive to HAT. This subclone was under for two weeks grown non-selective conditions and then placed in a medium containing 6-thioguanine. As indicated above, the mechanism of action of 6-thioguanine is similar to that of 8-azaguanine. Cells that incorporate 6-thioguanine in their DNA instead of guanine will not grow. Cells lacking the HPRT enzyme will not utilize 6-thioguanine from the medium and can therefore grow, but as a result are sensitive to HAT. This population of the back-selected subclone was then subcloned even in 6-thioguanine and ouabain-containing medium. Subclones were tested for continued production of the anti-IgD monoclonal antibody. A clone that had all the desired characteristics - growth in ouabain and 6-thioguanine and production of monoclonal anti-IgD - was selected to be a so-called “universal starting material”. This universal starting material could then be combined with any other HAT-resistant, ouabain-sensitive hybridoma, to form a polydome, which would express a hybrid antibody, one specificity of which would be anti-IgD. For this purpose, we initially selected a mouse hybridoma that secretes a monoclonal anti-prolactin antibody. The anti-prolactin monoclonal antibody belongs to the same subclass (IgGj) as the anti-IgD that is expressed by the parent line and is easily separated from that antibody on Omstein-Davis gels. Such a separation is an indication of a highly different charge on the antibodies and should therefore enable easy isolation of a hybrid antibody by DEAE-Sephadex chromatography. -9-
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10^-Zellen der HAT-empfindlichen, Ouabain-resistenten Zellinie wurden in Polyethylenglykol mit 10^-Zellen, die Antiprolactin produzieren, fusioniert. Die fusionierten Zellen wurden zuerst drei Tage lang in HAT-Medium gezüchtet, dann drei Tage lang wieder mit HAT+Ouabain-Medium ernährt und schließlich erneut in HAT-Medium gebracht Mehr als 600 Klone entstanden aus dieser Fusion: 66 Klone wurden zur Analyse willkürlich selektiert. Von diesen Klonen zeigten 36 sowohl Anti-IgD- als auch AntiprolactinaktivitäL10 ^ cells of the HAT-sensitive, ouabain-resistant cell line were fused in polyethylene glycol with 10 ^ cells that produce antiprolactin. The fused cells were first cultured in HAT medium for three days, then re-nourished with HAT + ouabain medium for three days and finally brought back into HAT medium. More than 600 clones resulted from this fusion: 66 clones were randomly selected for analysis . Of these clones, 36 showed both anti-IgD and anti-prolactin activity
Diese höherwertigen („supematant“) Klone wurden bezüglich des Vorliegens von Hybrid-Antikörper nach folgendem Test untersucht Ein Polystyrolkügelchen, das mit einem anderen monoklonalen Antiprolactinantikörper überzogen war, wurde 5 Stunden mit 200 μΐ einer 100 ng/ml-Prolactinlösung bebrütet. Der verwendete Antikörper bindet Prolactin an einer unterschiedlichen Stelle von jener des Antikörpers, der durch die fusionierte Hybridomzellinie produziert wurde. Das Kügelchen wurde gewaschen und dann über Nacht mit den höherwertigen Klonen bebrütet. Am nächsten Tag wurde nach verschiedenen Waschvorgängen ^I-maritiertes IgD zugegeben. Hybrid-Antikörper, der an das Kügelchen durch einen funktionellen Arm gebunden ist, könnte das radiomarkierte IgD mit der freien Anti-IgD-Funktionalitätbinden,wohingegenkeinerder Ausgangsmaterialtypusantikörper IgD-IgDoderProlactin-Prolactin diese Brücke zwischen dem Prolactinkügelchen und der ^I-IgD-Markierung bilden konnte. Die Ergebnisse eines typischen Tests für Klone, die hybride, bifunktionelle Antikörper produzieren, sind in der nachstehenden Tabelle 2 angegeben:These higher-quality ("supematant") clones were examined for the presence of hybrid antibodies according to the following test. A polystyrene bead coated with another monoclonal antiprolactin antibody was incubated with 200 μl of a 100 ng / ml prolactin solution for 5 hours. The antibody used binds prolactin at a different site from that of the antibody produced by the fused hybridoma cell line. The bead was washed and then incubated with the higher quality clones overnight. The next day, after various washes, ^ I-marinated IgD was added. Hybrid antibody bound to the bead by a functional arm could bind the radiolabeled IgD with the free anti-IgD functionality, whereas none of the source type antibody IgD-IgD or prolactin-prolactin could bridge this gap between the prolactin bead and the ^ I-IgD label . The results of a typical test for clones that produce hybrid bifunctional antibodies are given in Table 2 below:
Tabelle 2Table 2
Ergebnisse von immunometrischen Tests, die das Vorliegen von Hybrid-Antikörper demonstrieren, welcher Doppelspezifität für IgD und Prolactin in ausgewählten, höherwertigen Polydomen und Asciten hat.Results of immunometric tests demonstrating the presence of hybrid antibodies, which have dual specificity for IgD and prolactin in selected, higher quality polydomes and ascites.
Klonat Nr.Clonate No.
IOC cpm 'T-IgD-Markierungsbindung 1 15339 2 16337 3 22886 4 23356 5 24434 Anti-IgD 9357 Anti-Prolactin 8721IOC cpm 'T-IgD label binding 1 15339 2 16337 3 22886 4 23356 5 24434 Anti-IgD 9357 Anti-Prolactin 8721
Nach diesem Test zeigten 21 von 36 Klonen signifikante bifunktionelle Aktivität. Asciten, die von 2 derzeit verfügbaren Klonen erzeugt wurden, haben sich in dem bifunktionellen Test als reaktionsfähig erwiesen. Diese Asciten enthalten Antikörper, welche an Omstein-Davis-Gelen in drei unterschiedliche Banden getrennt werden: zwei Banden fallen genau mit Antikörpern zusammen, die durch die Ausgangshybridomen (Anti-IgD und Anti-Prolactin) produziert werden. Die dritte Bande wandert mittwegs zwischen den monoklonalen Ausgangsantiköiperbanden, wie für den Hybrid-Antikörper zu erwarten.After this test, 21 out of 36 clones showed significant bifunctional activity. Ascites generated by 2 currently available clones have been shown to be reactive in the bifunctional test. These ascites contain antibodies that are separated into three different bands on Omstein-Davis gels: two bands coincide exactly with antibodies that are produced by the starting hybridomas (anti-IgD and anti-prolactin). The third band is moving between the starting monoclonal antibody bands as expected for the hybrid antibody.
Daß ein monoklonaler Hybrid-Antikörper gegen IgD und Prolactin eine Dosisantwort zeigt, wenn die Menge an Prolactin in dem zur Gewinnung der Daten der Tabelle 2 angewendeten Versuch variiert wird, wird durch die Daten der Tabelle 3 gezeigt, woder Antikörper des Klonats Nr. 2 und, als Kontrollen, Antikörper aus den Ausgangszellinien (Anti-IgD und Anti-Prolactin) verwendet wurden. -10- 5That a monoclonal hybrid antibody to IgD and prolactin exhibits a dose response when the amount of prolactin is varied in the experiment used to obtain the data in Table 2 is shown by the data in Table 3, or antibodies of clonate # 2 and , as controls, antibodies from the starting cell lines (anti-IgD and anti-prolactin) were used. -10- 5
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Tabelle 3Table 3
Ergebnisse von Versuchen unter Anwendung von Hybrid-Antikörper und variierenden Mengen von ProlactinResults of experiments using hybrid antibodies and varying amounts of prolactin
Prolactin ng/ml Hybrid- Antikörper1 Anti- IgD1 Anti- Prolactin 0 8010 6847 8020 10 9169 7982 7405 50 13558 7783 8314 100 17599 7654 7844 20 * cpm der ^I-IgE-Bindung 25 Diese Daten zeigen, daß die Menge von durch den Hybrid-Antikörper gebundenem Prolactin dosisabhängig ist, da die Menge von markierter IgD-Bindung zunimmt, wenn die Dosis von Prolactin erhöht wird. Im Gegensatz dazu wird keine Dosisantwort beobachtet, wenn die Ausgangsantikörper gegen IgD und Prolactin verwendet werden, da sie die Brücke zwischen dem an das Kügelchen gebundenen Prolactin und dem markierten IgD nicht bilden können. Somit kann der Hybrid-Antikörper als eine Komponente eines Tests für Prolactin verwendet werden. Maß-30 geschneiderte andere Hybrid-Antikörper bieten ähnliche Möglichkeiten für andere Tests.Prolactin ng / ml hybrid antibody1 anti-IgD1 anti-prolactin 0 8010 6847 8020 10 9169 7982 7405 50 13558 7783 8314 100 17599 7654 7844 20 * cpm of the ^ I-IgE binding 25 These data show that the amount of by the Hybrid antibody bound prolactin is dose dependent since the amount of labeled IgD binding increases as the dose of prolactin is increased. In contrast, no dose response is observed when starting antibodies against IgD and prolactin are used because they cannot bridge the bead-bound prolactin with the labeled IgD. Thus, the hybrid antibody can be used as a component of an assay for prolactin. Custom-made other hybrid antibodies offer similar possibilities for other tests.
Beispiel 3:Example 3:
Nach einer ähnlichen Methode wie jener des Beispiels 2 wurde ein Universalausgangshybridom erzeugt, das einen monoklonalen Antikörper absondert, welcher gegen das Haptenarsenatarsenatdimer gerichtet und sowohl 35 gegen Ouabain resistent als auch gegen HAT empfindlich ist. Dieses Hybridom wurde mit einem Hybridom fusioniert, welches einen monoklonalen Antikörper mit Spezifität für carcinoembryonisches Antigen (CEA) absondert, ein Antigen, das sowohl von embryonischen Geweben als auch von verschiedenen Carcinomtypen zur Expression gebracht wird. Wieder entstanden bei der Fusion mehr als 600 Klone. Von 72 Klonen, die auf die Fähigkeit, sowohl CEA als auch Arsenat zu binden, geprüft wurden, hatten 69 beide Bindungsaktivitäten. Solche 40 Klone, die die größte Bindung zeigten, wurden für enzymgebundenen Immunoabsorbent-(ELIS A)-Test von Hybrid-A method similar to that of Example 2 was used to generate a universal starting hybridoma which secretes a monoclonal antibody which is directed against the hapten arsenate arsenate dimer and is both resistant to ouabain and sensitive to HAT. This hybridoma was fused to a hybridoma that secretes a monoclonal antibody specific for carcinoembryonic antigen (CEA), an antigen that is expressed by both embryonic tissues and various types of carcinoma. Again, more than 600 clones were created during the merger. Of 72 clones tested for the ability to bind both CEA and arsenate, 69 had both binding activities. Such 40 clones that showed the greatest binding were used for enzyme-linked immunoabsorbent (ELIS A) test by hybrid
Antikörper selektiert. Für jeden Test wurde eine CEA-Lösung (600 ng oder 250 ng) über Nacht an jeden Napf einer Kunststoffmikrotiterplatte mit 96 Näpfen adsorbieren gelassen. Am nächsten Tag wurde unadsorbiertes Material aus den Näpfen mit PBS-Tween 20 ausgewaschen. Höherwertige Klone wurden zugegeben und 2 1/2 Stunden bei 35 °C bebrütet und dann von der Platte 45 abgewaschen. CEA-CEA- und CEA-Arsenatantikörper wird an die Platte über das adsorbierte Antigen gebunden verbleiben. Das zweite Antigen, Arsenylsäure, die an das Enzym Alkaliphosphatase gekuppelt ist, wurde den Näpfen während 3 Stunden bei 35 °C zugegeben. Nach einem weiteren Waschen mitPSB-Tween wurde ein Chromagensubstrat für Alkaliphosphatase; p-Nitrophenylphosphat den Näpfen zugesetzt und während 48 Stunden Farbe entwickelt Die Absorption in jedem Napf wurde bei 410 nm gemessen. Falls in einem höherwertigen Klon vorhanden, band Hybrid-50 Antikörper die an der Platte adsorbierte CEA über eine Funktionalität wobei die andere frei blieb, um an Alkaliphosphatase gekuppelte Arsenylsäure zu binden. Farbe aus dem Chromagensubstrat entwickelte sich nur, wenn die an Arsenylsäure gekuppelte Alkaliphosphatasegebunden worden ist In diesem Test zeigten 3 von 12 höherwertigen Klonen Hybrid-Antikörperaktivität wie in Tabelle 4 angegeben. -11- 55Antibody selected. For each test, a CEA solution (600 ng or 250 ng) was allowed to adsorb overnight on each well of a 96-well plastic microtiter plate. The next day, non-adsorbed material was washed out of the wells with PBS-Tween 20. Higher quality clones were added and incubated for 2 1/2 hours at 35 ° C and then washed off the plate 45. CEA-CEA and CEA arsenate antibodies will remain bound to the plate via the adsorbed antigen. The second antigen, arsenic acid, coupled to the enzyme alkali phosphatase, was added to the wells at 35 ° C for 3 hours. After a further wash with PSB-Tween, a chromagen substrate for alkali phosphatase; p-Nitrophenylphosphate added to the wells and color developed for 48 hours. The absorption in each well was measured at 410 nm. If present in a higher quality clone, Hybrid-50 antibody bound the CEA adsorbed on the plate via one functionality, leaving the other free to bind arsenic acid coupled to alkali phosphatase. Color from the chromagen substrate developed only when the alkali phosphatase coupled to arsenic acid was bound. In this test, 3 out of 12 higher quality clones showed hybrid antibody activity as shown in Table 4. -11- 55
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Tabelle 4Table 4
Demonstration von Hybrid-Antikörper mit Doppelspezifität durch enzymgebundenen Immunoabsorptions (ELISA)-TestDemonstration of hybrid antibodies with double specificity by enzyme-linked immunoabsorption (ELISA) test
Absorption bei 490 nm Absorption bei 490 nmAbsorbance at 490 nm Absorption at 490 nm
Klon 600 ng CEA/Napf 250 ng CEA/Napf 1 0,087 0,105 0,022 0,060 2 0,082 0,054 0,023 0,033 3 0,011 0,017 0,041 0,036 Antiarsenat 0,010 0,006 0,006 0,005Clone 600ng CEA / well 250ng CEA / well 1 0.087 0.105 0.022 0.060 2 0.082 0.054 0.023 0.033 3 0.011 0.017 0.041 0.036 Antiarsenate 0.010 0.006 0.006 0.005
Durch die vorliegende Erfindung werden auch Verfahren zur Immunodiagnose und Immunotherapie unter Verwendung von Antikörpern geschaffen, die eine Doppelspezifität aufweisen, zum Beispiel Hybrid-Antikörper, wie oben beschrieben oder aus Antikörperhalbmolekülen nach der üblichen Methode von Nisonoff und Mitarbeitern, oben, erhalten, oder Antikörpermultimere, die durch Kupplung oder Vernetzung einzelner monospezifischer Antikörper erhalten wurden. Vorzugsweise ist der bei diesen Verfahren verwendete Antikörper mit einer Doppelspezifität ein Hybrid-Antikörper, der gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt ist, da ein solcher Antikörper verläßlich als eine im wesentlichen reine Verbindung erhalten werden kann, die keine Denaturierung erfahren hat und die eine gleichmäßige Spezifität und Affinität für das Antigen hat.The present invention also provides methods for immunodiagnosis and immunotherapy using antibodies which have a double specificity, for example hybrid antibodies as described above or obtained from antibody half-molecules by the customary method of Nisonoff and co-workers, above, or antibody multimers, obtained by coupling or cross-linking individual monospecific antibodies. Preferably, the antibody of dual specificity used in these methods is a hybrid antibody made in accordance with the present invention because such an antibody can be reliably obtained as a substantially pure compound that has not undergone denaturation and which has uniform specificity and Has affinity for the antigen.
Im Fall von immunodiagnostischen Anwendungen wird eine der zwei Spezifitäten des Hybrid- oder anderen Antikörpers m it doppelter Spezifität wieder gegen das Targetantigen gerichtet sein, dessen Ermittlung erwünscht ist, und die andere gegen ein anderes Antigen, das ein Hapten oder eine andere Molekularspezies, welche die Diagnose gestattet, sein kann. Zum Beispiel würde ein in der Immunohistologie nützlicher Antikörper eine erste Spezifität für ein vermutetes Antigen haben, zum Beispiel ein tumorassoziiertes Antigen, wie CEA, PAP oder Ferritin, und eine zweite Spezifität gegen ein Hapten oder Antigen, welches an einer Farbreaktion teilnimmt, wie ein Enzym, welches eine Farbreaktion in Gegenwart eines geeigneten Substrates hervorruft. Zu geeigneten Enzymen, gegen die die zweite Spezifität des Antikörpers gerichtet sein kann, gehören Prostatinsäurephosphatase (PAP), Meerrettichperoxidase, Glucoseoxidase und Alkaliphosphatase.In the case of immunodiagnostic applications, one of the two specificities of the hybrid or other antibody with double specificity will again be directed against the target antigen whose detection is desired and the other against another antigen which is a hapten or other molecular species which the Diagnosis allowed, can be. For example, an antibody useful in immunohistology would have a first specificity for a suspected antigen, for example a tumor associated antigen such as CEA, PAP or ferritin, and a second specificity for a hapten or antigen that participates in a color reaction, such as an enzyme , which causes a color reaction in the presence of a suitable substrate. Suitable enzymes against which the second specificity of the antibody can be directed include prostatic acid phosphatase (PAP), horseradish peroxidase, glucose oxidase and alkali phosphatase.
Zur Ausführung der histologischen Prüfung wird ein Gewebeabschnitt zuerst mit dem Antikörper mit Doppelspezifität behandelt Vor diesem Vorgang kann man das Hybrid bereits das Enzym binden gelassen haben, welches die Farbreaktion katalysiert. Falls dies nicht der Fall ist, wird der Abschnitt dann mit einer zweiten Lösung behandelt, die das Enzym enthält und nach einer entsprechenden Bebrütung abgespült und dann mit dem Substrat behandelt, welches eine Farbänderung in Gegenwart des Enzyms eingeht Die Bildung der von dem Enzym und Substrat in der Gewebeprobe erzeugten Farbe ist eine positive Anzeige für das Vorhandensein des Targetantigens in dem Gewebe. Der Hybrid-Antikörper gegen HBsAg und PAP, dessen Herstellung hier beschrieben ist, bindet wie gefunden wurde, an HBsAg auf einem Testsubstrat (Polystyiolkugeln), und an PAP in einem simulierten Farb-experiment, unter Verwendung von p-Nitrophenylphosphat als Enzymsubstrat. Nach Bebrütung des Hybrid-Antikörpers mit PAP und dem HBsAg ergibt die Zugabe des p-Nitrophenylphosphats in den Kugeln das Auftreten der charakteristischen Gelb- zu Braunfarbänderung.To perform the histological test, a tissue section is first treated with the antibody with double specificity. Before this process, the hybrid may have already had the enzyme bound, which catalyzes the color reaction. If not, the section is then treated with a second solution containing the enzyme and rinsed after appropriate incubation and then treated with the substrate that undergoes a color change in the presence of the enzyme. The formation of the enzyme and substrate Color generated in the tissue sample is a positive indicator of the presence of the target antigen in the tissue. The hybrid antibody against HBsAg and PAP, the production of which is described here, binds as found to HBsAg on a test substrate (polystyrene balls), and to PAP in a simulated color experiment, using p-nitrophenyl phosphate as the enzyme substrate. After incubation of the hybrid antibody with PAP and the HBsAg, the addition of p-nitrophenyl phosphate in the spheres results in the appearance of the characteristic yellow to brown color change.
Wie in Beispiel 2 angegeben, kann ein Antikörper mit Doppelspezifität auch in Immunotests und immuno-metrischen Tests verwendet werden. Unter Verwendung des Hybrid-Antikörpers gegen HBsAg und PAP, dessen Herstellung oben beschrieben ist kann ein immunometrischerTestfürHBsAgunterVerwendung eines immobilisierten monoklonalen Antikörpers gegen HBsAg als eine feste Phase ausgeführt werden, um HBsAg aus einem Serum oder einer anderen flüssigen Probe, worin der Antigengehalt vermutet wird, zu extrahieren. Die Probe wird mit einer Kugel, mit Kügelchen, Teströhrchen oder anderem Substrat, welches das Anti-HBsAg an seiner Oberfläche gebunden oder als Überzug aufweist, bebrütet. Im Anschluß an die Bebrütung mit der Serumprobe, gleichzeitig damit oder vorhergehend, kann eine Bebrütung mit einer Lösung des Hybrids vorgenommen werden. In jedem Fall wird, falls in der Probe HBsAg vorhanden ist, das Ergebnis die Bildung eines Sandwiches aus dem immobilisierten Antikörper, HBsAg, falls in der Probe vorhanden, und dem Hybrid-Antikörper sein. Als einen Teil des T ests läßt man PAP an den Hybrid-Antikörper binden. Dies kann während oder nach der Bildung des Sandwiches erfolgen, oder als Alternative kann der Antikörper-PAP-Komplex vorgebildet werden. Nach Bildung des Sandwiches wird die feste -12-As indicated in Example 2, an antibody with double specificity can also be used in immunoassays and immunometric tests. Using the hybrid antibody to HBsAg and PAP, the preparation of which is described above, an immunometric test for HBsAg can be carried out using an immobilized monoclonal antibody to HBsAg as a solid phase to remove HBsAg from a serum or other liquid sample suspected of having antigen content extract. The sample is incubated with a ball, beads, test tube or other substrate which has the anti-HBsAg bound to its surface or coated. After the incubation with the serum sample, simultaneously with or before, an incubation with a solution of the hybrid can be carried out. In any event, if HBsAg is present in the sample, the result will be a sandwich of the immobilized antibody, HBsAg, if present in the sample, and the hybrid antibody. As part of the test, PAP is allowed to bind to the hybrid antibody. This can be done during or after the sandwich is formed, or alternatively the antibody-PAP complex can be pre-formed. After the sandwich has been formed, the solid -12-
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Phase gewaschen, um einen Proberückstand und ungebundenen Hybrid-Antikörper zu entfernen, und dann mit einer Lösung in Berührung gebracht, die ein Substrat, wie p-Nitrophenylphosphat oder α-Naphtholphosphat, enthält, welches in Gegenwart von PAP eine Farbänderung erfährt. Das Auftreten der Farbänderung bestätigt das Vorliegen von Targetantigen in der Probe.Phase washed to remove a sample residue and unbound hybrid antibody, and then contacted with a solution containing a substrate, such as p-nitrophenyl phosphate or α-naphthol phosphate, which undergoes a color change in the presence of PAP. The appearance of the color change confirms the presence of target antigen in the sample.
In einem solchen Test, unter Verwendung der polyklonalen Anti-HBsAg-Kügelchen eines im Handel erhältlichen Diagnosebestecks fürHBsAg, hergestellt von AbbottLaboratories of North Chicago, Illinois (unter dem Namen „Aushia“ im Handel), wurden Proben, die verschiedene Mengen von HBsAg enthielten, mit den Kügelchen bebrütet. Die verwendeten Proben waren die posiüven und negativen Kontrollen aus dem im Handel erhältlichen Besteck und zwei Proben, die durch Verdünnung der positiven Kontrolle mit negativer Kontrolle in den Verhältnissen von entweder 1 Teil negativer Kontrolle: 2 Teilen positiver Kontrolle oder 2 Teilen negativer Kontrolle: 1 Teil positiver Kontrolle erhalten wurden.In one such test, using the anti-HBsAg polyclonal beads of a commercially available HBsAg diagnostic kit, manufactured by Abbott Laboratories of North Chicago, Illinois (commercially known as "Aushia"), samples containing various amounts of HBsAg were incubated with the beads. The samples used were the positive and negative controls from the commercially available cutlery and two samples, by diluting the positive control with negative control in the proportions of either 1 part negative control: 2 parts positive control or 2 parts negative control: 1 part positive control were obtained.
Nach Bebrütung der Proben mit dem Kügelchen, um HBsAg zu binden, wurde das Kügelchen gewaschen und mit dem Hybrid Antikörper bebrütet, der sowohl gegenüber HBsAg als auch PAP reaktionsfähig ist Dies gestattet die Bildung eines Sandwiches von immobilisierten Antikörpern: Antigen: und Hybrid-Antikörper. Das Kügelchen wurde erneut gewaschen und mit einer Lösung von PAP bebrütet. Dieser Bebrütung folgte eine weitere Wäsche und das Kügelchen wurde mit einem Substrat von α-Naphtholphosphat bebrütet PAP entfernt Phosphat enzymatisch. Nach einer entsprechenden Bebrütung wurde das Substrat vom Kügelchen entfernt und es wurde ihm ein IndikatorfarbstoffFastGametGBC-Salz,4-Amino-2,3-dimethylazol, zugesetzt welcher von klar zu einem rötlichen Purpur in Gegenwart desProduktes der enzymatischen Reaktion umschlägt. Es wurdeeineFarbänderungbeobachtet, die das Vorliegen von HBsAg in den Proben bestätigt Die Absorption bei 570 nm wurde an den Proben gemessen und diese Daten sind in der folgenden Tabelle 5 angegeben.After incubation of the samples with the bead to bind HBsAg, the bead was washed and incubated with the hybrid antibody, which is reactive with both HBsAg and PAP. This allows the formation of a sandwich of immobilized antibodies: antigen: and hybrid antibodies. The bead was washed again and incubated with a solution of PAP. This incubation was followed by another wash and the bead was incubated with a substrate of α-naphthol phosphate. PAP enzymatically removed phosphate. After appropriate incubation, the substrate was removed from the bead and an indicator dye, FastGametGBC salt, 4-amino-2,3-dimethylazole, was added to it, which changes from clear to a reddish purple in the presence of the product of the enzymatic reaction. A color change was observed to confirm the presence of HBsAg in the samples. The absorbance at 570 nm was measured on the samples and this data is shown in Table 5 below.
Tabelle 5 HBsAg-Konzentration Absorption (% positiver Kontrolle) 570 nm 0 0,031 34 0,166 67 0,243 100 0,379Table 5 HBsAg concentration absorption (% positive control) 570 nm 0 0.031 34 0.166 67 0.243 100 0.379
Diese Daten zeigen eine Dosisantwort bei Variation der HBsAg-Konzentration, die zu erwarten war, falls der Hybrid-Antikörper eine Brücke zwischen dem an die Kugel gebundenen HBsAg undPAP büdet. Dies zeigt weiterhin die Brauchbarkeit eines Hybrid-Antikörpers in einem ImmunotestThese data show a dose response when the HBsAg concentration was varied, which was to be expected if the hybrid antibody bridges the ball-bound HBsAg and PAP. This further demonstrates the utility of a hybrid antibody in an immunoassay
Andere, von enzymatisch katalysierten Reaktionen verschiedene Feststellungsmittel sind auch möglich. Zum Beispiel kann die zweite Spezifität des Hybrids oder des anderen Antikörpers mit Doppelspezifität gegen ein Hapten oder Antigen gerichtet sein, das ra'.liomarkiert ist oder das ein Fluoreszenzstoff ist oder das in dem Sandwich durch irgendwelche andere geeignete Mittel feststellbar istOther detection means other than enzymatically catalyzed reactions are also possible. For example, the second specificity of the hybrid or other dual specific antibody may be directed against a hapten or antigen that is ra'.labeled or that is a fluorescent agent or that is detectable in the sandwich by any other suitable means
Ein bevorzugtes Verfahren, bei welchem ein Hybrid-Antikörperoderein anderer Antikörper mitDoppelspezifität in einem Immunotest benützt wird, wertet das Phänomen der Fluoreszenzlöschung aus. In einem solchen Test ist eine Spezifität des Antikörpers gegen ein Targetantigen gerichtet und das andere gegen beispielsweise ein Hapten, das einen fluoreszierenden Chromophor trägt. Der Chromophor ist entweder an das Hapten gebunden oder kann in entsprechenden Fällen das Hapten selbst sein.A preferred method in which a hybrid antibody or other antibody with double specificity is used in an immunoassay evaluates the phenomenon of fluorescence quenching. In such a test, one specificity of the antibody is directed against a target antigen and the other against, for example, a hapten which carries a fluorescent chromophore. The chromophore is either bound to the hapten or, in corresponding cases, can be the hapten itself.
Der Test wird durch Bebrüten des Antikörpers mit Serum oder einer anderen Probe ausgeführt, von dem bzw. der vermutet wird,daß es bzw.sietargetantigenhältigist, zu welchem(welcher)eine vorbestimmte Menge Targetantigen, die mit einem Löschchromophor markiert ist, zugegeben worden ist Das markierte Antigen konkurrenziert mit dem Targetantigen in der Probe, falb ein solches vorliegt, hinsichtlich der Antikörperbindungsstelle, die für das Targetantigen spezifisch ist. Vor. während oder nach dieser Bebrütung wird eine Menge des Haptens, das den fluoreszierenden Chromophor trag l, mit dem Antikörper bebrütet und wird an der anderen Bindungsstelle gebunden.The test is carried out by incubating the antibody with serum or another sample suspected of containing target antigen to which a predetermined amount of target antigen labeled with a quenching chromophore has been added labeled antigen competes with the target antigen in the sample, if there is one, for the antibody binding site specific for the target antigen. In front. during or after this incubation, an amount of the hapten carrying the fluorescent chromophore 1 is incubated with the antibody and bound at the other binding site.
Die zwei Chromophore werden so ausgewählt, daß der erste von diesen bei einer Wellenlänge fluoresziert, die durch den anderen absorbiert (gelöscht) werden kann, falls sie nahe genug zueinander angeordnet sind, so daß das durch den Fluoreszenzgeber emittiertePhotondurchden Löschereingefangen ^werden kann. Umdies zubewerkstelligen, sollen die zwei Chromophore innerhalb etwa 10 nm und vorzugsweise innerhalb etwa 5 nm zueinander liegen. Diese -13-The two chromophores are selected so that the first of them fluoresces at a wavelength that can be absorbed (erased) by the other if they are located close enough to one another so that the photon emitted by the fluorescent donor can be captured by the eraser. To accomplish this, the two chromophores should be within about 10 nm and preferably within about 5 nm of each other. This -13-
AT 394 577 BAT 394 577 B
Positionierung wird auftreten, wenn der fluoreszierende Chromophor an eine Antikörperbindungsstelle gebunden ist, und der Löschchromophor an das zugesetzte Antigen an der anderen Stelle gebunden ist. Ein geeignetes Paar von Chromophoren umfaßt Fluorescin als den fluoreszierenden Chromophor und Rhodamin als den Löschchromophor.Positioning will occur when the fluorescent chromophore is attached to an antibody binding site and the quenching chromophore is attached to the added antigen at the other site. A suitable pair of chromophores include fluorescin as the fluorescent chromophore and rhodamine as the quenching chromophore.
Die gemessene Fluoreszenz wird in umgekehrtem Verhältnis zu der Menge an nativem Antigen in der Probe variieren, da bei Fehlen von nativem Antigen das gesamte, an den Antikörper gebundene Antigen mit dem Löschchromophor markiert und so angeordnet sein wird, daß es die Fluoreszenz von dem durch das Hapten getragenen Chromophor absorbiert Ein Vergleich der gemessenen Fluoreszenz mit jener einer Kontrollprobe, die eine bekannte Menge Antigen enthält, gestattet eine qualitative und quantitative Bestimmung des Vorliegens von Antigen in der Probe.The fluorescence measured will vary in inverse proportion to the amount of native antigen in the sample since, in the absence of native antigen, all of the antigen bound to the antibody will be labeled with the quenching chromophore and arranged to separate the fluorescence from that by the Hapten-borne chromophore absorbed A comparison of the measured fluorescence with that of a control sample containing a known amount of antigen allows a qualitative and quantitative determination of the presence of antigen in the sample.
Diese Art von Immunotestkann zum Beispiel benutzt werden, um die Mengen an Arzneimittel, wie Dilantin, die streng überwacht werden müssen, im Serum zu bestimmen. In einem solchen Test würde das Targetantigen selbstverständlich Dilantin sein. Es ist für den Sachverständigen ersichtlich, daß dieses Verfahren verwendet werden kann, um auch andere Antigene zu ermitteln, einschließlich, im speziellen, tumorassoziierte Antigene.For example, this type of immunoassay can be used to determine the levels of drugs, such as dilantin, that need to be closely monitored in the serum. In such a test, the target antigen would of course be dilantin. It will be apparent to those skilled in the art that this method can be used to identify other antigens, including, in particular, tumor-associated antigens.
Ein anderes bevorzugtes Verfahren, bei welchem ein Hybrid-Antikörper oder anderer Antikörper mit einer Doppelspezifität in einem Immunotest benützt wird, beruht auf einer enzymatischen Reaktion. In einem derzeit bevorzugten Verfahren ist eine der Antikörperspezifitäten selbstverständlich auf das Targetantigen und die andere auf ein Enzym oder ein Hapten, an das ein Enzym gebunden ist, gerichtetAnother preferred method in which a hybrid antibody or other antibody with a double specificity is used in an immunoassay is based on an enzymatic reaction. In a currently preferred method, one of the antibody specificities is of course directed to the target antigen and the other to an enzyme or a hapten to which an enzyme is bound
Der Test wird durch Bebrüten des Antikörpers mit einer Probe ausgeführt, von der vermutet wird, daß sie das Targetantigen enthält, zu welcher eine vorbestimmte Menge des Targetantigens zugesetzt worden ist welches durch Bindung einer Substanz an dieses modifiziert worden ist, welche Substanz mit dem Enzym unter Bildung einer ermittelbaren Substanz oder in anderer Weise in Wechselwirkung tritt um die Feststellung der Bildung des Antigen-Antikörper-Komplexes zu gestatten. Die Ermittlung kann zum Beispiel durch Fluorimetrie, Lumineszenz, Spektrophotometrie od. dgl. erfolgen.The test is carried out by incubating the antibody with a sample suspected of containing the target antigen to which a predetermined amount of the target antigen has been added which has been modified by binding a substance thereto, which substance contains the enzyme beneath Formation of a detectable substance or otherwise interacts to allow detection of the formation of the antigen-antibody complex. The determination can be carried out, for example, by fluorimetry, luminescence, spectrophotometry or the like.
Bei einem alternativen Verfahren kann das zugesetzte Targetantigen das Enzym an dieses gebunden aufweisen, in welchem Falle der Antikörper eine seiner Spezifitäten gegen die Substanz gerichtet hat welche mit dem Enzym in Wechselwirkung tritt, oder gegen ein Hapten, an das die Substanz gebunden istIn an alternative method, the added target antigen may have the enzyme bound to it, in which case the antibody has directed one of its specificities against the substance that interacts with the enzyme, or against a hapten to which the substance is bound
Die Substanz, welche mit dem Enzym in Wechselwirkung tritt kann selbst ein anderes Enzym sein. In einem solchen Falle katalysiert eines der Enzyme die Produktion eines Produktes, das von dem anderen benötigt wird. Wenn somit der Antikörper sowohl das zugesetzte Targetantigen, an welches eines der Enzyme gebunden ist, als auch das andere Enzym bindet so wird das Produkt der ersten enzymatischen Reaktion in der Nähe des zweiten Enzyms gebildet und kann eine durch das letztere Enzym katalysierte Reaktion eingehen, bevor eine signifikante Diffusion des Produktes in das umgebende Medium erfolgen kann.The substance that interacts with the enzyme may itself be another enzyme. In such a case, one of the enzymes catalyzes the production of a product that is required by the other. Thus, when the antibody binds both the added target antigen to which one of the enzymes is bound and the other enzyme, the product of the first enzymatic reaction is formed in the vicinity of the second enzyme and can undergo a reaction catalyzed by the latter enzyme before significant diffusion of the product into the surrounding medium can occur.
Ein Beispiel für ein solches Verfahren unter Verwendung von zwei Enzymen, nämlich Hexokinase (HK) und Glucose-6-phosphatdehydrogenase (G-6-PDH), ist in dem folgenden Reaktionsschema angegeben. (1) Adenosintriphosphat + Glucose (ATP)An example of such a process using two enzymes, namely hexokinase (HK) and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G-6-PDH), is given in the following reaction scheme. (1) adenosine triphosphate + glucose (ATP)
Adenosindiphosphat + Glucose-6-phosphat (ADP) (2) Glucose-6-phosphat + f licotinamidadenindinucleotid (NAD+) —6-6-PDH— Gluconolacton-6-phosphat + Dihydronicotinamidadenindinucleotid (NADH)Adenosine diphosphate + glucose-6-phosphate (ADP) (2) glucose-6-phosphate + f licotinamidadenine dinucleotide (NAD +) —6-6-PDH— gluconolactone-6-phosphate + dihydronicotinamidadenine dinucleotide (NADH)
Zur Auswertung dieses Reaktions^chemas wird das zugesetzte Targetantigen entweder HK oder G-6-PDH an dieses gebunden aufweisen und der Hybrid-Antikörper wird eine seiner Spezifitäten gegen das andere (oder ein es tragendes Hapten) gerichtet haben. D e Probe weist außer dem Hybrid-Antikörper und der vorbestimmten Menge an enzymmarkiertem Antigen Glucose, ATP und das Coenzym NAD+ als Zusätze auf. Der Hybrid-Antikörper hat vorzugsweise das andere Enzym bereits an sich gebunden. Alternativ kann dieses Enzym der Probe mit den anderen Reagenzien zugesetzt werden. Während der Bebrütung wird das enzymmarkierte Antigen mit dem nativen Antigen in der Probe, falls ein solches -14-To evaluate this reaction chemistry, the added target antigen will have either HK or G-6-PDH bound to it and the hybrid antibody will have one of its specificities directed against the other (or a hapten carrying it). The sample has, in addition to the hybrid antibody and the predetermined amount of enzyme-labeled antigen, glucose, ATP and the coenzyme NAD + as additives. The hybrid antibody has preferably already bound the other enzyme to itself. Alternatively, this enzyme can be added to the sample with the other reagents. During incubation, the enzyme-labeled antigen is compared with the native antigen in the sample, if such a -14-
AT 394 577 B vorhanden ist, hinsichtlich einer der Hybrid-Antikörper-Bindungsstellen konkurrenzieren. Das andere Enzym ist oder wird an die zweite Bindungsstelle gebunden. Dies gestattet es, daß die durch HK katalysierte Bildung von Glucose-6-phosphat in nächster Nähe zu G-6-PDH erfolgt. Das letztere wandelt das Glucose-6-phosphat in Gluconolacton-6-phosphat um, ein Ergebnis, das von der Reduktion von N AD+ zu NADH begleitet ist. Das NADH absorbiert staik bei 340 nm und kann daher spektrophotometrisch ermittelt werden. Die Menge an gebildetem NADH variiert im umgekehrten Verhältnis mit der Menge an nativem Antigen in der Probe, d. h. seine maximale Bildung tritt auf, wenn kein Targetantigen in der zu prüfenden Probe enthalten ist Ein Vergleich der Menge des gebildeten NADH mit einer Kontrollprobe gestattet eine qualitative und quantitative Bestimmung des Vorliegens von Antigen in der Probe.AT 394 577 B is present to compete for one of the hybrid antibody binding sites. The other enzyme is or is bound to the second binding site. This allows the HK-catalyzed formation of glucose-6-phosphate to occur in close proximity to G-6-PDH. The latter converts the glucose-6-phosphate to gluconolactone-6-phosphate, a result that is accompanied by the reduction of N AD + to NADH. The NADH absorbs static at 340 nm and can therefore be determined spectrophotometrically. The amount of NADH formed varies inversely with the amount of native antigen in the sample, i. H. its maximum formation occurs when no target antigen is contained in the sample to be tested. A comparison of the amount of NADH formed with a control sample allows a qualitative and quantitative determination of the presence of antigen in the sample.
Diese Art von Test kann benützt werden, um die Menge von Dilantin oder anderen Arzneimitteln im Serum zu überwachen. In einem solchen Fall ist das Arzneimittel das Targetantigen. Ein solcher Testkann jedoch auch benützt werden, um andere Serumantigene zu ermitteln, wie solche, die mit Tumoren oder anderen Krankheiten im Zusammenhang stehen.This type of test can be used to monitor the amount of Dilantin or other medicinal products in the serum. In such a case, the drug is the target antigen. However, such a test can also be used to identify other serum antigens, such as those associated with tumors or other diseases.
Eine in vivo-Immunodiagnose kann auch unter Verwendung eines Hybrids oder eines anderen Antikörpers mit Doppelspezifität ausgeführt werden. Der Antikörper mit einer Spezifität gegen ein Targetantigen, wie ein tumorassoziiertes Antigen, und der zweiten, gegen ein Hapten, an welches ein geeignetes Radionuclid, vorzugsweise ein solches, das γ-Strahlung emittiert, gebunden ist, wird zuerst an den Wirt verabreicht. Nachdem eine genügend lange Zeit verstrichen ist, während welcher der Antikörper sich an der Targetstelle lokalisiert hat und ungebundener Antikörper aus gesundem Gewebe im Wirt hat austreten können, wird das das Radionuclid tragende Hapten verabreicht und bindet sich an den lokalisierten Antikörper. Nach einem geeigneten Zeitraum, der dazu dient, daß ungebundenes Hapten den Wirt verlassen kann, wird eine Abtastung des Wirtes mit einer geeigneten Kamera ausgeführt, um zu bestimmen, ob es Bereiche gibt, in welchen sich die Strahlung angereichert hat. Falls solche vorliegen, wird die Anwesenheit des Targetantigens in dem Wirt bestätigt und dessen Lage bestimmt.In vivo immunodiagnosis can also be performed using a hybrid or other antibody with double specificity. The antibody with a specificity against a target antigen, such as a tumor-associated antigen, and the second, against a hapten, to which a suitable radionuclide, preferably one which emits γ-radiation, is first administered to the host. After a sufficient time has passed during which the antibody has located itself at the target site and unbound antibody has been able to escape from healthy tissue in the host, the hapten carrying the radionuclide is administered and binds to the localized antibody. After an appropriate period of time to allow unbound hapten to leave the host, the host is scanned with an appropriate camera to determine if there are areas where the radiation has accumulated. If there are, the presence of the target antigen in the host is confirmed and its location is determined.
Dieses Verfahren hat verschiedene Vorteile gegenüber jenem, bei dem monospezifischer Antikörper verwendet wird, der gegen das Targetantigen gerichtet ist, an welches das Radionuclid direkt gebunden ist. In solchen Fallen muß das Radionuclid eine genügend lange Halbwertszeit haben, damit nach Ablauf der für eine wesentliche Lokalisierung des Antikörpers an der Targetstelle notwendigen Zeit eine genügende Menge zurückbleibt. Ferner kann während dieses V erfahrens der Antikörper für einen Zeitraum in der Leberoder in anderen Nicht-Targetgeweben zurückgehalten werden, welche dann der vom Antikörper mitgeführten Strahlung unterworfen werden. Die vorliegende Erfindung gestattet anderseits die Verwendung von Radionucliden, die kürzere Halbwertszeiten als jene aufweisen, welche mit monospezifischen Antikörpern verwendet werden. Das das Radionuclid führende Hapten, das ein relativ kleines Teilchen ist, hat in vivo eine hohe Mobilität und wird rasch durch den Wirt wandern und entweder sich an den Antikörper binden, der sich an der Targetstelle lokalisiert hat, oder den Körper verlassen, ohne in Nicht-Targetgewebe nennenswerte Zeit zu verbleiben. Aus diesem Grunde können Isotopen mit kurzer Halbwertszeit in Mengen verabreicht werden, welche das minimale Risiko für gesundes Gewebe selbst dann ergeben, wenn die Verabreichung in wesentlichem Überschuß erfolgtThis method has several advantages over that using monospecific antibody directed against the target antigen to which the radionuclide is directly bound. In such cases, the radionuclide must have a sufficiently long half-life so that a sufficient amount remains after the time necessary for essential localization of the antibody at the target site. Furthermore, during this procedure, the antibody can be retained in the liver or other non-target tissues for a period of time, which are then subjected to the radiation carried by the antibody. The present invention, on the other hand, allows the use of radionuclides that have shorter half-lives than those used with monospecific antibodies. The radionuclide-bearing hapten, which is a relatively small particle, has high mobility in vivo and will migrate rapidly through the host and either bind to the antibody that is localized at the target site or leave the body without in none -Target tissue to stay for significant time. For this reason, isotopes with a short half-life can be administered in amounts which give the minimal risk to healthy tissue even when the administration is in a substantial excess
Vorzugsweise ist das Hapten ein Mittel, an das das Radionuclid direkt gebunden ist oder welches mit dem Radionuclid eine komplexe Bindung eingehen wird. Es kann ein chelatbildendes Mittel für das an ein Hapten gebundene Radionuclid zu dem letzteren Zweck verwendet werden. Für den Sachverständigen wird es ersichtlich sein, daß eine umfassende Vielfalt von chelatbildenden Mitteln und Radionucliden für diesen Zweck geeignet sind. Phenylarsenat, an welches Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) als ein chelatbildendes Mittel gebunden ist, ist ein geeignetes Hapten. Ein Radionuclid, das zur Verwendung mit diesem Hapten geeignet ist, ist11 *In.The hapten is preferably an agent to which the radionuclide is directly bound or which will form a complex bond with the radionuclide. A chelating agent can be used for the radionuclide bound to a hapten for the latter purpose. It will be apparent to those skilled in the art that a wide variety of chelating and radionuclides are suitable for this purpose. Phenylarsenate, to which ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) is bound as a chelating agent, is a suitable hapten. A radionuclide suitable for use with this hapten is 11 * In.
Der Antikörper mit Doppelspezifität kann auch in der Immunotherapie verwendet werden, indem er so aufgebaut wird, daß er eine Spezifität gegen ein mit einer Krankheit assoziiertes Antigen hat und die andere gegen ein Haptan hat, welches ein für das Antigen oder das erkrankte Gewebe, mit welchem das Antigen assoziiert ist und welches zu zerstören erwünscht ist, letales Mittel ist, oder an ein solches letales Mittel gebunden ist. Zum Beispiel kann der Antikörper eine Spezifität gegen ein tumorassoziiertes Antigen, wie PAP, carcinoembryonisches Antigen (CEA), Ferritin oder anderes solches Antigen aufweisen, und eine zweite Spezifität, die gegen ein Hapten gerichtet ist, an welches ein Radionuclid, vorzugsweise eines, welches a- oder ß-Strahlung emittiert, gebunden ist, oder welches Hapten eine Ricin A-Kette oder ein anderes Toxin oder Arzneimittel umfaßt. Unter solchen Arzneimitteln können Gelonin, α-Amanitin, Diphtherietoxin A, Methotrexat, Dichlormethatrexat, Dounomycin undChlorombucil erwähnt werden. Falls das Toxin oder Arzneimittel selbst als ein Hapten fungieren kann, braucht es selbstverständlich nicht an irgendeinen anderen Rest gebunden sein.The double specificity antibody can also be used in immunotherapy by being designed to have specificity against an antigen associated with a disease and the other against a haptan which is one for the antigen or diseased tissue with which the antigen is associated and which is desired to destroy, is a lethal agent, or is bound to such a lethal agent. For example, the antibody may have specificity against a tumor associated antigen such as PAP, carcinoembryonic antigen (CEA), ferritin or other such antigen and a second specificity directed against a hapten to which a radionuclide, preferably one which a - or ß-radiation is emitted, bound, or which hapten comprises a ricin A chain or another toxin or drug. Among such drugs, gelonin, α-amanitin, diphtheria toxin A, methotrexate, dichloromethate rexate, dounomycin and chloromucucil can be mentioned. Of course, if the toxin or drug itself can act as a hapten, it need not be bound to any other residue.
In dem Falle, wo ein Radionuclid als das letale Mittel zu verwenden ist, wie eben in der Situation, wo diese für in vivo-Immunodiagnose verwendet werden, kann das Hapten das Radionuclid direkt an dieses gebunden aufweisen oder das Hapten kann ein Mittel, wie ein chelatbildendes Mittel, sein oder an es gebunden aufweisen, welches mit dem Radionuclid einen Komplex bilden wird. In einem solchen Falle wird das Hybrid oder der andere Antikörper -15-In the case where a radionuclide is to be used as the lethal agent, as in the situation where they are used for in vivo immunodiagnosis, the hapten may have the radionuclide bound directly to it or the hapten may be an agent such as a chelating agent, or have bound to it, which will form a complex with the radionuclide. In such a case, the hybrid or the other antibody
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| US5292668A (en) * | 1981-12-21 | 1994-03-08 | Boston Biomedical Research Institute, Inc. | Bispecific antibody determinants |
| IL70686A (en) * | 1983-01-20 | 1988-07-31 | Suntory Ltd | Mutant tumor cell lines for use in the preparation of hybridomas and the hybridomas obtained therefrom |
| GB2148299B (en) * | 1983-09-01 | 1988-01-06 | Hybritech Inc | Antibody compositions of therapeutic agents having an extended serum half-life |
| EP0467416A1 (en) * | 1983-09-01 | 1992-01-22 | Hybritech Incorporated | Antibody compositions of therapeutic agents having an extended serum half-life |
| AU595159B2 (en) * | 1984-04-23 | 1990-03-29 | Boston Biomedical Research Institute Incorporated | Bispecific antibody determinants |
| NL8501219A (en) * | 1985-04-29 | 1986-11-17 | Stichting Vrienden Van De Stic | IMMUNOLOGICAL COMPLEX, ITS PREPARATION AND APPLICATION. |
| WO1987006240A1 (en) | 1986-04-14 | 1987-10-22 | The General Hospital Corporation | Heterobifunctional antibodies and method of use |
| US5453269A (en) * | 1986-04-14 | 1995-09-26 | The General Hospital Corporation | Heterobifunctional antibodies having dual specificity for fibrin and thrombolylic agents and methods of use |
| FR2604092B1 (en) * | 1986-09-19 | 1990-04-13 | Immunotech Sa | IMMUNOREACTIVES FOR TARGETING ANIMAL CELLS FOR VISUALIZATION OR DESTRUCTION IN VIVO |
| GB8626413D0 (en) * | 1986-11-05 | 1986-12-03 | Gilliland L K | Antibodies |
| GB8626412D0 (en) * | 1986-11-05 | 1986-12-03 | Clark M R | Antibodies |
| US5053226A (en) * | 1987-07-15 | 1991-10-01 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Monoclonal antibodies binding platinum complexes |
| DE3850542T2 (en) * | 1987-09-23 | 1994-11-24 | Bristol Myers Squibb Co | Antibody heteroconjugates for killing HIV-infected cells. |
| GB2218100A (en) * | 1988-03-02 | 1989-11-08 | Erling Sundrehagen | Conjugates for the detection and/or quantification of antigenic substances in body fluids |
| US4892824A (en) * | 1988-03-15 | 1990-01-09 | Synbiotics Corporation | Fast track method for producing monoclonal bi-specific immunoglobulins |
| US5582862A (en) * | 1988-04-04 | 1996-12-10 | General Hospital Corporation | Antibodies that bind to α2-antiplasmin crosslinked to fibrin which do not inhibit plasma α2-antiplasmin |
| US5372812A (en) * | 1988-04-04 | 1994-12-13 | The General Hospital Corporation | Composition and method for acceleration of clot lysis |
| JPH02196799A (en) * | 1988-04-08 | 1990-08-03 | Agency Of Ind Science & Technol | Complex of anti-human cancer protein |
| US5851527A (en) * | 1988-04-18 | 1998-12-22 | Immunomedics, Inc. | Method for antibody targeting of therapeutic agents |
| IT1235349B (en) * | 1988-12-23 | 1992-06-30 | Biodata Spa | IMMUNOLOGICAL TEST FOR HOMOGENEOUS DETERMINATIONS |
| CA2006408A1 (en) * | 1988-12-27 | 1990-06-27 | Susumu Iwasa | Bispecific monoclonal antibody, its production and use |
| US5217713A (en) * | 1988-12-27 | 1993-06-08 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Cytotoxic bispecific monoclonal antibody, its production and use |
| WO1990012109A1 (en) * | 1989-03-30 | 1990-10-18 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Monoclonal antibodies binding platinum complexes |
| FR2652004B1 (en) * | 1989-09-21 | 1994-10-28 | Immunotech Partners | NOVEL HYDROPHILIC DERIVATIVES, APPLICATION TO DIAGNOSIS AND THERAPEUTICS, DIAGNOSTIC OR THERAPEUTIC KITS AND IMMUNOLOGICAL REAGENTS. |
| WO1991012023A2 (en) * | 1990-02-16 | 1991-08-22 | Boston Biomedical Research Institute | Hybrid reagents capable of selectively releasing molecules into cells |
| TW212184B (en) * | 1990-04-02 | 1993-09-01 | Takeda Pharm Industry Co Ltd | |
| CA2108451A1 (en) * | 1991-04-26 | 1992-10-27 | Beverley J. Randle | Novel antibodies, and methods for their use |
| GB9316369D0 (en) * | 1993-08-06 | 1993-09-22 | Surface Active Ltd | Diagnostic method |
| US5541110A (en) | 1994-05-17 | 1996-07-30 | Bristol-Myers Squibb | Cloning and expression of a gene encoding bryodin 1 from Bryonia dioica |
| GB9421468D0 (en) * | 1994-10-18 | 1994-12-07 | Surface Active Ltd | Biosensor |
| JP2001515345A (en) * | 1996-09-20 | 2001-09-18 | ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレイション | Compositions and methods for enhancing fibrinolysis using antibodies to alpha-2-antiplasmin |
| US20020132274A1 (en) | 2001-01-17 | 2002-09-19 | Nevalainen Marja T. | Diagnostic and monitorings methods for cancer |
| DK1545613T3 (en) | 2002-07-31 | 2011-11-14 | Seattle Genetics Inc | Auristatin conjugates and their use in the treatment of cancer, an autoimmune disease or an infectious disease |
| NZ583292A (en) | 2003-11-06 | 2012-03-30 | Seattle Genetics Inc | Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands |
| CA2559187C (en) | 2004-03-16 | 2014-02-11 | Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Substituted phenoxy- and phenylthio- derivatives for treating proliferative disorders |
| ES2715776T3 (en) | 2004-11-12 | 2019-06-06 | Seattle Genetics Inc | Auristatins that have an aminobenzoic acid unit at the N-terminus |
| ES2477765T3 (en) | 2005-04-19 | 2014-07-17 | Seattle Genetics, Inc. | Binding agents to humanized anti-cd70 and their uses |
| PL1912671T3 (en) | 2005-07-18 | 2018-02-28 | Seattle Genetics, Inc. | Beta-glucuronide-linker drug conjugates |
| PL2099823T5 (en) | 2006-12-01 | 2023-02-20 | Seagen Inc. | Variant target binding agents and uses thereof |
| ZA200904482B (en) | 2007-01-22 | 2010-09-29 | Genentech Inc | Polyelectrolyte precipitation and purification of antibodies |
| AU2009242453B2 (en) | 2008-05-02 | 2014-12-04 | Seagen Inc. | Methods and compositions for making antibodies and antibody derivatives with reduced core fucosylation |
| WO2011133658A1 (en) | 2010-04-22 | 2011-10-27 | Boston Medical Center Corporation | Compositions and methods for targeting and delivering therapeutics into cells |
| WO2014089177A2 (en) | 2012-12-04 | 2014-06-12 | Massachusetts Institute Of Technology | Compounds, conjugates and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines |
| EP3590922A1 (en) | 2013-03-15 | 2020-01-08 | Zymeworks Inc. | Cytotoxic and anti-mitotic compounds, and methods of using the same |
| WO2015053381A1 (en) * | 2013-10-10 | 2015-04-16 | 幸成 加藤 | Anti-podoplanin antibody |
| CA2935077C (en) | 2013-12-27 | 2022-03-15 | Geoffrey C. Winters | Sulfonamide-containing linkage systems for drug conjugates |
| CN113416229A (en) | 2014-09-17 | 2021-09-21 | 酵活有限公司 | Cytotoxic and antimitotic compounds, and methods of use thereof |
| JP6412906B2 (en) | 2015-11-03 | 2018-10-24 | 財團法人工業技術研究院Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ | Compound, linker-drug and ligand-drug complex |
| KR20180134351A (en) | 2016-03-25 | 2018-12-18 | 시애틀 지네틱스, 인크. | Process for the preparation of pegylated drug-linkers and intermediates thereof |
| US10918627B2 (en) | 2016-05-11 | 2021-02-16 | Massachusetts Institute Of Technology | Convergent and enantioselective total synthesis of Communesin analogs |
| WO2018175994A1 (en) | 2017-03-24 | 2018-09-27 | Seattle Genetics, Inc. | Process for the preparation of glucuronide drug-linkers and intermediates thereof |
| WO2018209239A1 (en) | 2017-05-11 | 2018-11-15 | Massachusetts Institute Of Technology | Potent agelastatin derivatives as modulators for cancer invasion and metastasis |
| US10640508B2 (en) | 2017-10-13 | 2020-05-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Diazene directed modular synthesis of compounds with quaternary carbon centers |
| CA3110096A1 (en) * | 2018-08-30 | 2020-03-05 | Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. | Chimeric antigen receptor cells for treating solid tumor |
| WO2020229982A1 (en) | 2019-05-10 | 2020-11-19 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Antibody drug conjugates |
| TW202138388A (en) | 2019-12-30 | 2021-10-16 | 美商西根公司 | Methods of treating cancer with nonfucosylated anti-cd70 antibodies |
| CA3197167A1 (en) | 2020-11-09 | 2022-05-12 | He Xu | Antibody drug conjugates |
| AU2022304582A1 (en) | 2021-06-29 | 2024-02-01 | Seagen Inc. | Methods of treating cancer with a combination of a nonfucosylated anti-cd70 antibody and a cd47 antagonist |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4130634A (en) * | 1974-03-15 | 1978-12-19 | University Of Illinois Foundation | Method for detecting and quantifying antigens |
| US4331647A (en) * | 1980-03-03 | 1982-05-25 | Goldenberg Milton David | Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers |
| EP0068763A2 (en) * | 1981-07-01 | 1983-01-05 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Recombinant monoclonal antibodies |
| US4376110A (en) * | 1980-08-04 | 1983-03-08 | Hybritech, Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
-
1983
- 1983-04-11 CA CA000425558A patent/CA1213229A/en not_active Expired
- 1983-04-11 ES ES521370A patent/ES8504461A1/en not_active Expired
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- 1983-04-12 AT AT0901883A patent/AT394577B/en not_active IP Right Cessation
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- 1983-12-09 FI FI834529A patent/FI834529A/en not_active Application Discontinuation
- 1983-12-12 ES ES527963A patent/ES527963A0/en active Granted
-
1984
- 1984-07-02 ES ES533931A patent/ES8506091A1/en not_active Expired
- 1984-07-02 ES ES533930A patent/ES533930A0/en active Granted
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-
1985
- 1985-07-16 ES ES545247A patent/ES8607386A1/en not_active Expired
- 1985-12-09 GB GB08530309A patent/GB2169921B/en not_active Expired
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-
1987
- 1987-01-05 JP JP62000342A patent/JPH0753119B2/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-02-10 JP JP6016728A patent/JP2562002B2/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4130634A (en) * | 1974-03-15 | 1978-12-19 | University Of Illinois Foundation | Method for detecting and quantifying antigens |
| US4331647A (en) * | 1980-03-03 | 1982-05-25 | Goldenberg Milton David | Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers |
| US4376110A (en) * | 1980-08-04 | 1983-03-08 | Hybritech, Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
| EP0068763A2 (en) * | 1981-07-01 | 1983-01-05 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Recombinant monoclonal antibodies |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| CANCER RESEARCH, VOL. 41, 1981; S. 2073-2078 * |
| FEDERATION PROCEEDINGS, VOL. 37, 1978; S. 1350 * |
| HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, 1979; S.25.1-25.7 * |
| PRINCIPLES OF IMMUNOLOGY, 2. AUFL., 1979; S. 499-507 * |
| PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, VOL. 71, 1974, S. 2203-2207 * |
| PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, VOL. 78, 1981, S. 5807-5811 * |
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