AT359981B - Verfahren zur herstellung von neuen vernetzten hydrophilen affinitaetschromatographie-gelen - Google Patents

Description

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   Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen vernetzten hydrophilen Polymer-Gelen mit chelatbildenden Gruppen, die sich insbesondere zur spezifischen Anlagerung von Metallionen aus wässeriger Lösung eignen. 



   Dreidimensional vernetzte und damit unlösliche, nur noch quellbare Polymer-Gele mit reaktiven Gruppen bieten als Reaktionspartner bei chemischen Umsetzungen eine Reihe bedeutender Vorteile ; der wichtigste liegt in der völligen Unlöslichkeit solcher Gele sowohl in Wasser als auch in allen organischen Lösungsmitteln. Dadurch sind sie einfach und quantitativ von den Umsetzungprodukten abtrennbar, die so ohne Ausbeuteverluste in reiner Form isolierbar sind. Solche Gele können daher-ohne dass Aufarbeitungsschwierigkeiten resultieren-in beliebigem Überschuss eingesetzt werden, wodurch wieder weitgehend quantitative Umsetzungen zu erzielen sind.

   Als praktische Beispiele für den vielseitigen erfolgreichen Einsatz von Polymer-Gelen dieser Art kann man unter anderem die Ionenaustauscherharze, die Merrifield'sche Polypeptidsynthese, die Immobilisierung von Enzymen, aber auch die "Polymeren Reagentien" sowie die Affinitätschromatographie-Gele anführen. 



   Die Bedeutung der Affinitätschromatographie-Gele nimmt nicht zuletzt im Zusammenhang mit Problemen des Umweltschutzes laufend an Bedeutung zu. Dabei ist es grundsätzlich von grossem Vorteil, dass man den Quellungsgrad solcher Gele sehr einfach durch die Menge an Vernetzermole-   külen-gegebenenfalls   in Gegenwart von Extendern, welche die mittlere   Porengrösse   festlegenin sehr weiten Grenzen variieren kann. Die schwach vernetzten und damit stark quellenden Gele eignen sich naturgemäss besonders für das batch-Verfahren, die stark vernetzten und damit nur noch schwach quellenden festen Gele - insbesondere auch die mit Hilfe von Extendern erhältlichen makroporösen Gele - eigenen sich dagegen besonders für den Einsatz in Durchlaufsäulen.

   Von entscheidender Bedeutung für die praktische Gebrauchstüchtigkeit von solchen Gelen ist einmal die Kapazität, zum andern die Zugänglichkeit der reaktiven Gruppen, die dafür verantwortlich ist, in welchem Zeitraum die gewünschte Umsetzung abläuft. 



   Bisher sind Polymer-Gele mit chelatbildenden Gruppen nur auf Basis von Styrol-DivinylbenzolCopolymeren und Cellulosefasern bekanntgeworden (R. Hering, Chelatbildende Ionenaustauscher, 
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   ;64   [1977],   197). Beide Systeme haben jedoch gravierende Nachteile. So sind die Styrol-DivinylbenzolGele völlig hydrophob und quellen dementsprechend nicht in Wasser. Das bedeutet, dass beim Arbeiten mit Metallsalzlösungen in Wasser, das ein ganz bevorzugtes Reaktionsmedium bei der Ausbildung von Chelaten ist, sehr lange Reaktionszeiten erforderlich sind,   d. h. dass   nur sehr langsame Austauschgeschwindigkeiten erzielt werden können. 



   Entsprechend gering sind deshalb innerhalb vernünftiger Reaktionszeiten die erzielbaren Umsetzungsgrade. Im Gegensatz hiezu quellen die durch chelatbildende Gruppen substituierten Cellulosefasern zwar in Wasser, innerhalb der kristallinen Bereiche jedoch nur in begrenztem Umfang. 



  Selbst für den Fall, dass sich dort chelatbildende Gruppen befinden, sind diese nur schwer oder gar nicht für die Metallionen zugänglich. Daraus resultieren zwar kurze Reaktionszeiten, allerdings bei nur relativ geringen Kapazitäten von 0, 3 bis 0, 9 mval/g. Die zudem nur schwer in Säulen einsetzbaren faserigen Celluloseträger, deren Kapazitäten und Porenstrukturen vorgegeben sind und daher nicht variiert werden können, sind ausserdem chemisch, biochemisch und auch photochemisch relativ leicht abbaubar, was zur Zerstörung der Faserstruktur und damit des Trägers führt. Dies spielt besonders beim üblichen Aufbewahren in gequollenem Zustand und beim mehrmaligen Regenerieren der mit Metallionen beladenen Gele eine Rolle, vor allem dann, wenn man dazu im sauren Milieu arbeiten muss, was häufig der Fall ist. 



   Es war daher Aufgabe der Erfindung, vernetzte hydrophile Polymer-Gele mit spezifischen chelatbildenden Gruppen zu entwickeln, deren Quellungsgrad in Wasser innerhalb weiter Bereiche variierbar ist und die bei Umsetzungen mit wässerigen Metallsalzlösungen hohe Austauschgeschwindigkeiten bei gleichzeitig hohen Kapazitäten ermöglichen und gegenüber chemischen, biochemischen und photochemischen Einflüssen möglichst inert sind. 



   Gegenstand der Erfindung ist nunmehr ein Verfahren zur Herstellung von neuen vernetzten hydrophilen Affinitätschromatographie-Gelen auf der Basis von   Polyacrylsäure- oder   Polymethacrylsäureestern der Glucose, ihrer Glucoside oder der Saccharose, das dadurch gekennzeichnet ist, 

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 dass man Diazoniumgruppen enthaltende vernetzte hydrophile Polymer-Gele der allgemeinen Formel 
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 worin X2 für X, CH3, C2 H oder 
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 Gruppen enthaltenden Kupplungskomponenten auf der Basis von aromatischen Aminen oder Phenolen umsetzt. 



   Als chelatbildende Gruppen enthaltende aromatische Amine und Phenole werden bevorzugt Verbindungen der allgemeinen Formel 
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 verwendet, worin beispielsweise
R4 = H R1 = COOH,   R'=   OH,   Rus =   H (Salicylsäure)
R4 = H R'= COOH, R2 = NH2, R3 = H (Anthranilsäure) 
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   In den folgenden Beispielen wird die gesamte Herstellung der neuen AffinitätschromatographieGele sowie die Anwendung der Gele näher illustriert. 



   Herstellung der Monomeren :
1. Herstellung von Saccharosemethacrylat durch Umsetzung mit Methacrylsäureanhydrid
17 g (0, 05 Mol) Saccharose werden in 500 ml wasserfreiem Pyridin gelöst und bei Zimmer- temperatur mit 15, 4 g (0, 1 Mol) Methacrylsäureanhydrid versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 15 bis 20 h stehen gelassen, das Pyridin im Vakuum abdestilliert und der Rück- stand direkt zur Polymerisation eingesetzt. Das   Molverhältnis Saccharose :   Methacrylsäure- anhydrid kann innerhalb eines weiten Bereiches variiert werden. Im erhaltenen Reaktions- gemisch liegen 21, 3% nicht umgesetzte Saccharose, 44, 2% Monoester und 34, 4% höhere Ester vor. 



   2. Herstellung von Saccharosemethacrylat durch Umesterung
In einem Rundkolben mit Rührer, Thermometer und 25 cm-Vigreux-Kolonne werden 34 g
Saccharose in 150 ml wasserfreiem Dimethylformamid suspendiert und mit 50 g Methylmetha- crylat,   0, 5   g geglühtem Kaliumcarbonat und 0, 1 g Hydrochinon versetzt. Die Apparatur wird bis zu einem Vakuum von etwa 130 mbar evakuiert und das Reaktionsgemisch wird unter Rühren auf   80 C   erhitzt. Dabei löst sich die Saccharose langsam auf und über die
Kolonne destilliert ein Gemisch von Methanol, Methylmethacrylat und Dimethylformamid ab. Nach 6 h Reaktionszeit wird mit Essigsäure neutralisiert und das Dimethylformamid wird bei 20 mbar abdestilliert.

   Der Rückstand besteht aus einem Gemisch von 11, 8% nicht umgesetzter Saccharose,   30, 5% Saccharosemethacrylat   und 57, 7% höheren Saccharosemetha- crylaten. Dieser Rückstand kann direkt zur Polymerisation eingesetzt werden. 



   Herstellung der Gele :
A : Polymerisation
Der nach 1. oder 2. erhaltene Rückstand wird in zirka 500 ml Äthanol gelöst und nach
Zugabe von   0, 2 bis 0, 5 ml   Azoisobutyronitril oder Dibenzoylperoxyd bei 70 bis   80 C   unter
Rühren 8 h lang polymerisiert. Das so erhaltene Gel wird abfiltriert, mit Alkohol, Wasser und Aceton gewaschen und im Vakuum bei 50 bis   600C   getrocknet. 



   Je nach dem Vernetzergehalt im Monomerengemisch erhält man Gele mit verschiedenen Quel- lungsgraden in Wasser. Der Quellfaktor des Saccharose-Gels aus 1. beträgt 2, 5 bis   2, 7.   



   B-1 : Umsetzung mit 4-Nitrophenylglycidyläther a) mit alkalischem Katalysator
2 g Saccharosemethacrylat-Gel,   2, 9   g 4-Nitrophenylglycidyläther und 0, 5 ml 25%ige
Tetraäthylammoniumhydroxyd-Lösung werden in 40 ml Dimethylformamid unter Rühren 
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 mit saurem Katalysator b) 2 g Saccharosemethacrylat-Gel,   4, 7   g 4-Nitrophenylglycidyläther und 0, 5 ml Bortri- 
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 der Stickstoffanalyse ergibt sich ein Substitutionsgrad an 4-NitrophenylgTuppen von   2, 4.    



    B-2 : Umsetzung   mit   N- (4-Nitrophenyl)-acrylamid  
1 g Saccharosemethacrylat-Gel,   4,   7   g N- (4-Nitrophenyl)-acrylamid   und 0, 2 g Natriummethy- 
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    2.C-l :   Reduktion
2 g des nach B-1 erhaltenen Saccharosemethacrylat-Gels mit 4-Nitrophenylgruppen werden in 20 ml Pyridin suspendiert und eine Lösung von 10 g Natriumdithionit in 20 ml Was- ser wird zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 3 h lang unter Rühren und Rückfluss er- 
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   Auf Grund der Titration der Amino-Gruppen mit 1/10 n Natriumnitrit-Lösung ergibt sich, dass mehr als 90% der Nitrogruppen zu Aminogruppen reduziert worden sind. 



  C-2 : Reduktion
2 g des nach   B-2   erhaltenen Gels werden in 20 ml Pyridin suspendiert und eine Lösung von 10 g Natriumdithionit in 20 ml Wasser wird zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird
3 h lang unter Rühren und Rückfluss erhitzt und das erhaltene Gel mit   4-Aminophenylgrup-   pen wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum bei   60 C   getrocknet. Auf Grund der Titration der Aminogruppen mit 1/10 n Natriumnitritlösung ergibt sich, dass mehr als 90% der Nitrogruppen zu Aminogruppen reduziert worden sind. 



  D : Diazotierung
1 g des nach   C-l   oder C-2 erhaltenen Gels mit 3-Aminophenylgruppen wird in 10 ml
1 n Salzsäure suspendiert. Das Reaktionsgemisch wird auf 0 bis   5 C   abgekühlt und unter
Rühren mit 5%iger wässeriger Natriumnitrit-Lösung diazotiert. Die Nitrit-Lösung wird so lange zugetropft, bis kein Nitrit mehr verbraucht wird. Dies ist dann der Fall, wenn
15 min nach der letzten Nitrat-Zugabe Kaliumjodid-Stärkepapier noch immer blau gefärbt wird. Das so erhaltene Gel mit Diazoniumgruppen wird abfiltriert, mit Eiswasser gewa- schen und kann direkt für weitere Reaktionen eingesetzt werden. 



   Der quantitative Verlauf der Diazotierung kann dadurch gezeigt werden, dass man eine
Probe des Aminophenylgruppen enthaltenden Gels mit 1/10 molarer Natriumnitritlösung titriert. 



    E-l :   Kupplung
Das gemäss B-la,   C-l   und D erhaltene Diazonium-Gel wird abfiltriert und in eine auf
5 bis   10 C   gekühlte Lösung von 2 g 8-Hydroxychinolin in 20 ml Eisessig gegeben. Das
Reaktionsgemisch wird 24 h gerührt, das Gel wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum bei   60 C   getrocknet. 



   Die Kapazität des so erhaltenen Hydroxychinolin-Gels beträgt   z. B.   für Kupfer 1, 4 mval   Cu/g.   



  E-2 : Kupplung
Das gemäss B-2, C-2 und D erhaltene Diazonium-Gel wird abfiltriert und in eine auf 5 bis   10 C   gekühlte Lösung von 4 g 8-Hydroxychinolin in 20 ml Eisessig gegeben. Das Reak- tionsgemisch wird 24 h gerührt, das Gel wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im
Vakuum bei   60 C   getrocknet. 



   Die Kapazität des so erhaltenen Hydroxychinolin-Gels beträgt   z. B.   für Kupfer 2, 6 mval   Cu/g.   



    E-3 :   Kupplung mit Salicylsäure
1 g des nach B-lb),   C-l   und D hergestellten Diazonium-Gels wird in eine Lösung von
2 g Salicylsäure in 50 ml Wasser gebracht, deren PH-Wert mit Natriumcarbonat auf 8 
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 : 2, 11 g des nach B-la),   C-l   und D hergestellten Diazonium-Gels wird in eine Lösung von 2 g Brenzcatechin in 50 ml Pyridin gebracht und 24 h bei 5 bis   10 C   gerührt. Das erhaltene Gel wird abfiltriert, mit Wasser, 3%iger Salzsäure und Wasser gewaschen und   im Vakuum bei 60. C getrocknet, Kapazität für Eisen : 1, 1 mval Fe/g Gel.   

Claims (1)

1. PATENTANSPRÜCHE : 1. Verfahren zur Herstellung von neuen vernetzten hydrophilen Affinitätschromatographie-Gelen auf der Basis von Polyacrylsäure-oder Polymethacrylsäureestern der Glucose, ihrer Glucoside oder der Saccharose, dadurch gekennzeichnet, dass man Diazoniumgruppen enthaltende vernetzte hydrophile Polymer-Gele der allgemeinen Formel EMI6.1 worin X1 für X, CH3, C2H5 oder EMI6.2 EMI6.3 (RY- Cl- oder HSO4- darstellt, und die restlichen X für Wasserstoff stehen, mit chelatbildende Gruppen enthaltenden Kupplungskomponenten auf der Basis von aromatischen Aminen oder Phenolen umsetzt.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Kupplungskomponente Salicylsäure, Anthranilsäure, Brenzcatechin, Pyrogallol, Dithizon, 8-Hydroxychinolin, Alizarin oder Chinalizarin einsetzt.