DE2940952C2

DE2940952C2 -

Info

Publication number: DE2940952C2
Application number: DE19792940952
Authority: DE
Inventors: Gerhard Bad Voeslau At Greber; Heinrich Wien At Gruber
Original assignee: Evidenzbuero Oesterreichischer Zuckerfabriken Wien At GmbH
Current assignee: Evidenzbuero Oesterreichischer Zuckerfabriken Wien At GmbH
Priority date: 1978-10-10
Filing date: 1979-10-09
Publication date: 1989-01-26
Also published as: DE2940952A1

Description

Die Erfindung betrifft vernetzte hydrophile Polymer-Gele mit kupplungsfähigen Diazoniumgruppen und deren bevorzugte Verwendung in der Affinitätschromatographie.

Dreidimensional vernetzte und damit unlösliche, nur noch quellbare Polymer-Gele mit reaktiven Gruppen bieten als Reaktionspartner bei chemischen Umsetzungen eine Reihe bedeutender Vorteile; der wichtigste liegt in der völligen Unlöslichkeit solcher Gele sowohl in Wasser als auch in allen organischen Lösungsmitteln. Dadurch sind sie einfach und quantitativ von den Umsetzungsprodukten abtrennbar, die so ohne Ausbeuteverluste in reiner Form isolierbar sind. Solche Gele können daher - ohne daß Aufarbeitungsschwierigkeiten resultieren - in beliebigem Überschuß eingesetzt werden, wodurch wiederum weitgehend quantitative Umsetzungen zu erzielen sind. Als praktische Beispiele für den vielseitigen erfolgreichen Einsatz von Polymer-Gelen dieser Art kann man u. a. die Ionenaustauscherharze, die Merrifield'sche Polypeptidsynthese, die Immobilisierung von Enzymen, aber auch die "polymeren Reagentien" sowie die Affinitätschromatographie- Gele anführen.

Aus "Affinity Chromatographie" Verlag Elsevier, 1978 Seite 153 bis 156 sind für die Affinitätschromatographie Cellulosen bekannt, die lineare Ketten von β-1,4-D-Glucoseeinheiten darstellen. Diese Cellulosen sind z. B. mit Chlorepoxypropan vernetzt, jedoch ist die glycosidische Bindung im sauren Milieu einer Hydrolyse, unter extremen Bedingungen einer quantitativen Zersetzung zu kristalliner Glucose unterworfen. Darüber können Cellulosen durch Mikroorganismen abgebaut werden. In dieser Druckschrift werden dann verschiedene Bindungsmechanismen von Proteinen an diesen Cellulosen untersucht.

Die Bedeutung der Affinitätschromatographie-Gele nimmt nicht zuletzt in Zusammenhang mit Problemen des Umweltschutzes laufend zu. Dabei wäre es von großem Vorteil, wenn man den Quellungsgrad der Gele durch die Menge an Vernetzermolekülen - gegebenenfalls in Gegenwart von Extendern, welche die mittlere Porengröße festlegen - in sehr weiten Grenzen variieren und genau einstellen könnte. Die wenig vernetzten und damit stark quellenden Gele eignen sich besonders für das batch-Verfahren, die stark vernetzten und damit nur noch schwach quellenden festen Gele - insbesondere auch die mit Hilfe von Extendern erhältlichen makroporösen Gele - eignen sich besonders für den Einsatz in Durchlaufsäulen. Von entscheidender Bedeutung für die praktische Gebrauchstüchtigkeit von solchen Gelen ist zum einen die Kapazität und zum anderen die Zugänglichkeit der reaktiven Gruppen, die dafür verantwortlich ist, in welchem Zeitraum die gewünschte Umsetzung abläuft.

Bisher sind Polymer-Gele mit Diazonium-Gruppen nur auf Basis von Styrol/Divinylbenzol-Copolymeren und Cellulosefasern bekannt geworden (R. Hering, Chelatbildende Ionenaustauscher, Akademie-Verlag Berlin, 1967; P. Burka, K.A. Lieser, Angew. Makrom. Chem. 50 (1976), 151; ibid. 64 (1977), 197). Beide Systeme haben jedoch gravierende Nachteile. So sind die Styrol/Divinylbenzol-Gele hydrophob und quellen dementsprechend nicht in Wasser. Das bedeutet, daß beim Arbeiten in wässerigem Reaktionsmedium, wie es bei Umsetzungen von Diazoniumsalzen ganz bevorzugt üblich ist, sehr lange Reaktionszeiten erforderlich sind und außerdem keine hohen Umsetzungsgrade zu erzielen sind. Die diazotierten Cellulosefasern quellen zwar in Wasser innerhalb der kristallinen Bereiche jedoch nur in begrenztem Umfang. Daraus ergeben sich zwar kurze Reaktionszeiten, jedoch nur geringe Kapazitäten um etwa 0,5 mval/g. Die zudem nur schwer in Säulen einsetzbaren faserigen Celluloseträger, deren Kapazitäten und Porenstrukturen vorgegeben sind und daher nicht variiert werden können, sind außerdem chemisch, biochemisch und auch photochemisch relativ leicht abbaubar, was zur Zerstörung der Faserstruktur führt.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, vernetzte hydrophile Polymer-Gele mit kupplungsfähigen Diazoniumgruppen zu schaffen, deren Quellungsgrad in Wasser innerhalb weiter Bereiche variierbar ist und die bei Umsetzungen kurze Reaktionszeiten bei gleichzeitig hohen Kapazitäten ermöglichen und gegenüber chemischen, biochemischen und photochemischen Einflüssen relativ inert sind.

Diese Aufgabe wird von den in den Patentansprüchen angegebenen Polymer-Gelen gelöst.

Bekannt waren bisher nur die monofunktionellen reinen stellungsisomeren (Meth)acrylester der Glucose und Saccharose, die durch Veresterung der entsprechend geschützten Derivate mit nachfolgender Abspaltung der Schutzgruppen erhalten worden waren.

Die Einführung der ungesättigten Methacryloxy- und/oder Acryloxy-Gruppen geschieht durch sauer oder alkalisch katalysierte Veresterung von Glucose, Glucosiden oder von Saccharose mit (Meth)acrylsäure, mit Estern der (Meth)acrylsäure, deren Anhydrid oder Chlorid und zwar zweckmäßigerweise in Gegenwart von Inhibitoren der radikalischen Polymerisation, z. B. Hydrochinon oder Schwefel. Überraschenderweise entstehen auch bei einem relativ großen Überschuß an Kohlenhydrat von bis zu 300% immer Gemische von ein- und mehrfach (meth)acryloylierten Derivaten - neben der entsprechenden Menge an nicht-umgesetzter(m) Glucose, Glucosid oder Saccharose. Diese Gemische eignen sich ohne Trennung oder Reinigung direkt für eine anschließende vernetzende Polymerisation mit radikalischen Initiatoren.

Je nach der in den eingesetzten Gemischen enthaltenen Menge an mehrfach ungesättigten Derivaten - die wiederum durch das Molverhältnis von Kohlenhydrat zu (Meth)acrylsäure- Derivat in sehr weiten Grenzen eingestellt werden kann - entstehen bei der Polymerisation wenig vernetzte und daher stark quellende und wenig feste Gele, die sich für den Einsatz im batch-Verfahren eignen, bzw. ab einem Gehalt von etwa 15% an mehrfach ungesättigten Derivaten - und gegebenenfalls im Gegenwart eines Extenders, beispielsweise Ethanol oder Methanol - ergeben sich dagegen stark vernetzte und daher wenig quellende und feste Gele mit gegebenenfalls makroporöser Struktur, die sich besonders für den Einsatz in Durchlaufsäulen anbieten. Zwischen diesen beiden Extremen sind alle anderen Möglichkeiten realisierbar, so daß nach der Erfindung in Wasser leicht quellbare Gele mit Quellungsgraden von 1,5 bis 50 zur Verfügung gestellt werden können, wobei insbesondere die Quellungsgrade von 1,5 bis 30 für weitere Umsetzungen besonders geeignet sind. Im Gegensatz zu üblichen Estern sind insbesondere die Polymethacrylsäureester gegen saure und alkalische Hydrolyse extrem beständig; dies zeigt sich auch bei den erfindungsgemäßen Gelen, die bei pH-Werten von 1 bis 10 nicht zerstört werden und auch keine Gewichtsabnahme erleiden.

Zur Einführung von esterartig gebundenen Nitrophenylgruppen werden bevorzugt die Nitrobenzoesäuren, ihre aktivierten Ester, Säurechloride oder Anhydride sowie das 3- oder 4- Nitrophthalsäureanhydrid bzw. das Isomergemisch verwendet. Zweckmäßigerweise arbeitet man hierbei in Gegenwart von Pyridin als Reaktionsmedium. Zur Einführung von etherartig gebundenen Nitrophenylgruppen werden bevorzugt Nitrophenylglycidylether bzw. N-Nitrophenylacrylamid verwendet. Diese etherartigen Verknüpfung sind bei allen Folgereaktionen gegen saure und alkalische Hydrolyse - auch unter Extrembedingungen - völlig beständig. Der Veresterungs- bzw. Veretherungsgrad ist bevorzugt so, daß jede Einheit im Mittel mindestens eine Nitrophenyl-Gruppe aufweist, höchstens jedoch soviel, daß bei den Glucose-Gelen noch mindestens 2, bei den Saccharose-Gelen noch mindestens 3 freie Hydroxyl- Gruppen übrig bleiben, welche die notwendige Hydrophilie gewährleisten.

Die Nitrophenylgruppen können zu Aminophenylgruppen - vorzugsweise nach Quellung in Wasser - reduziert werden, beispielsweise mit Natriumdithionit oder Wasserstoff in Gegenwart von üblichen Hydrierkatalysatoren als Reduktionsmittel. Überraschenderweise erfolgt hierbei keine Hydrolyse der Nitrophenyl-Gruppen.

Nach Auswaschen mit Wasser werden die Gele anschließend unter den üblichen Bedingungen mit Gemischen aus salpetriger Säure und Salzsäure oder Schwefelsäure diazotiert, wobei überraschenderweise keine Spaltung der Aminophenyl- Gruppen oder Phenyldiazonium-Gruppen erfolgt. Dies zeigt ein Vergleich der Stickstoffwerte der eingesetzten, Aminophenyl- Gruppen enthaltenden Gele mit dem Gehalt an Diazoniumgruppen, der durch Titration mit einer 0,1-molaren NaNO₂-Lösung erhalten wurde. Der Vergleich dieser Werte läßt auch erkennen, daß die Diazotierung der Aminophenyl-Gruppen praktisch quantitativ ist.

Die erfindungsgemäßen vernetzten hydrophilen Polymer-Gele können Quellungsgrade von 1,5, bis 50 (in Wasser) und einen Gehalt an kupplungsfähigen Diazonium-Gruppen von 1,1 bis 3,2 mval/g bei etherartig gebundenen Phenyldiazonium-Gruppen aufweisen. Die erfindungsgemäßen Gele können quellen auch in polaren Lösungsmitteln wie Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid oder Methanol, nicht jedoch in unpolaren Lösungsmitteln.

In den nachfolgenden Beispielen wird die Erfindung näher erläutert.

Beispiele für Zwischenstufen

A) 18 g (0,1 mol) D-Glucose wurden in 400 ml wasserfreiem Pyridin unter Rühren gelöst und auf 0 bis 5°C abgekühlt. Dann wurden unter Rühren 10,5 g (0,1 mol) Methacrylsäurechlorid langsam zugetropft und die Temperatur bei nicht über 5°C gehalten. Dann wurde noch 2 h bei 0 bis 5°C gerührt und schließlich 15 bis 20 h bei Raumtemperatur stehen gelassen. Es wurde dann im Vakuum bei möglichst niedriger Temperatur Pyridin abdestilliert und der Rückstand zur Polymerisation gebracht.

Die Zusammensetzung, insbesondere die Molverhältnisse Glucose : Methacrylsäurechlorid des Reaktionsgemisches wurde durch gaschromatographische Analyse der Trimethylsilylether ermittelt und ist in Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1

B) 17 g (0,05 mol) Saccharose wurden in 500 ml wasserfreiem Pyridin gelöst und bei Raumtemperatur mit 15,4 g (0,1 mol) Methacrylsäureanhydrid versetzt, das Reaktionsgemisch wurde 15 bis 20 h stehen gelassen, dann Pyridin im Vakuum abdestilliert und der Rückstand zur Polymerisation eingesetzt. Das Molverhältnis Saccharose: Methacrylsäureanhydrid kann analog wie bei der Umsetzung mit Glucose variiert werden.

C) In einem Rundkolben mit Rührer, Thermometer und 25 cm- Vigreux-Kolonne wurden 34 g Saccharose in 150 ml wasserfreiem Dimethylformamid suspendiert und mit 50 g Methylmethacrylat, 0,5 g geglühtem Kaliumcarbonat und 0,1 g Hydrochinon versetzt. Bei einem Vakuum von etwa 130 mbar und einer Temperatur von etwa 80°C löste sich unter Rühren die Saccharose langsam auf und Methanol, Methylmethacrylat und Dimethylformamid destillierten ab. Nach 6 h wurde mit Essigsäure neutralisiert. Der Rückstand bestand aus 11,8% nicht-umsetzbarer Saccharose, 30,5% Saccharosemonomethacrylat und 57,7% höherem Saccharosemethacrylat und kann direkt zur Polymerisation eingesetzt werden.

D) 19,4 g (0,1 mol) Methylglucosid wurden in 200 ml wasserfreiem Pyridin gelöst und bei 0 bis 5°C unter Rühren 10,5 g (0,1 mol) Methacrylsäurechlorid langsam zugetropft, so daß die Temperatur nicht über 5°C stieg. Dann wurde noch 2 h bei 0 bis 5°C gerührt und schließlich 15 bis 20 h bei Raumtemperatur stehen gelassen; das Pyridin im Vakuum bei möglichst niedriger Temperatur abdestilliert und der Rückstand zur Polymerisation eingesetzt.

E) Der aus A und B erhaltene Rückstand wurde in 500 ml Ethanol und nach Zugabe von 0,2 bis 0,5 Azoisobutyronitril oder Dibenzoylperoxid bei 70 bis 80°C unter Rühren 8 h polymerisiert, das erhaltene Gel abfiltriert, mit Alkohol, Wasser und Aceton gewaschen und im Vakuum bei 50 bis 60°C getrocknet. Ausbeute für A: 14,2 g.

Je nach dem Vernetzergehalt erhielt man Gele mit verschiedenen Quellungsgraden in Wasser. Der Quellungsfaktor des Gels aus A betrug in Wasser 2,8 bis 3 und aus B 2,5 bis 2,7.

F) Der nach A und B erhaltene Rückstand wurde mit 0,2 bis 0,5 g Azoisobutyronitril oder Dibenzoylperoxid versetzt und 8 h bei 70 bis 80°C in der Masse polymerisiert, das erhaltene Gel zerkleinert, mit Alkohol, Wasser und Aceton gewaschen und im Vakuum bei 50 bis 60°C getrocknet.

Der Quellfaktor des Gels aus A betrug 2,7 bis 2,9 und aus B 2,5 bis 2,7.

G) 5 g (etwa 0,02 mol) des aus D erhaltenen Glucose-Gels wurden in 70 ml wasserfreiem Pyridin suspendiert und 18,6 g (0,1 mol) 4-Nitrobenzoylchlorid zugegeben, das Reaktionsgemisch etwa 7 h unter Rückfluß und Rühren erhitzt, das Gel abfiltriert, mit Aceton, Wasser und Methanol gewaschen und im Vakuum bei 50 bis 60°C getrocknet. Ausbeute: 9,5 g modifiziertes Glucose-Gel. Aufgrund der Gewichtszunahme - vor allem aber des Stickstoffgehaltes von 4,1% - betrug der Substitutionsgrad etwa 1,5. Die Reaktion kann auch mit 2- oder 3-Nitrobenzoylchlorid oder einem Isomerengemisch durchgeführt werden.

H) In der Abwandlung von G wurden 5 g (etwa 0,02 mol) Glucose-Gel mit 14,8 g (0,08 mol) 4-Nitrobenzoylchlorid umgesetzt. Ausbeute: 7,6 g modifiziertes Glucose-Gel. Der Stickstoffgehalt von 2,7 entsprach einem Substitutionsgrad von etwa 0,8.

Durch Änderung des Molverhältnisses von Gel : 4-Nitrobenzoylchlorid können die Substitutionsgrade eingestellt werden, und zwar bei Gelen aus Glucose bis etwa 1,7, bei Gelen aus Methylglucosid bis 1,5 und bei Gelen aus Saccharose bis etwa 2,5.

I) In Abwandlung von G wurden 5 g (0,019 mol) Methylglucosid- Gel mit 18,6 g (0,1 mol) 4-Nitrobenzoylchlorid umgesetzt. Ausbeute: 8,6 g modifiziertes Gel. Aufgrund des Stickstoffgehaltes von 3,7% berechnet sich der Substitutionsgrad zu etwa 1,3.

J) In Abwandlung von G wurden 5 g Glucose-Gel in 50 bis 100 ml wasserfreiem Pyridin suspendiert und 19,3 g (0,1 mol) 3-Nitrophthalsäureanhydrid zugegeben, das Reaktionsgemisch 24 h bei 50 bis 80°C gerührt, das Gel abfiltriert, mit Aceton, Wasser und Methanol gewaschen und im Vakuum bei 50 bis 60°C getrocknet. Ausbeute: 8,5 g modifiziertes Glucose- Gel. Bei einem Stickstoffgehalt von 3% entspricht dies einem Substitutionsgrad von etwa 1.

Die Umsetzung kann auch mit einem Isomerengemisch durchgeführt werden. Anstelle von Pyridin können auch protonenfreie Lösungsmittel in Gegenwart von katalytischen Mengen H⁺ verwendet werden.

K a) mit alkalischem Katalysator
2 g Saccharosemethacrylat-Gel, 2,9 g 4-Nitrophenylglycidyläther und 0,5 ml 25%ige Tetraäthylammoniumhydroxid-Lösung wurden in 40 ml Dimethylformamid unter Rühren 3 h auf 70°C erhitzt, das erhaltene Produkt wurde abfiltriert, gewaschen und im Vakuum bei 60°C getrocknet. Aus der Stickstoffanalyse ergibt sich ein Substitutionsgrad an 4- Nitrophenylgruppen von 1,5.

K b) mit saurem Katalysator
2 g Saccharosemethacrylat-Gel, 4,7 g 4-Nitrophenylglycidyläther und 0,5 ml Bortrifluorid-Äther-Komplex wurden in 50 ml Dioxan 3 h auf 80°C erhitzt, das erhaltene Produkt wurde abfiltriert, gewaschen und im Vakuum bei 60°C getrocknet. Aus der Stickstoffanalyse ergibt sich ein Substitutionsgrad an 4-Nitrophenylgruppen von 2,4.

L) 1 g Saccharosemethacrylat-Gel, 4,7 g N-(4-Nitrophenyl)- acrylamid und 0,2 g Natriummethylat wurden in 40 ml Dimethylformamid unter Rühren 3 h auf 70°C erhitzt. Das Produkt wurde abfiltriert, gewaschen und im Vakuum bei 60°C getrocknet. Aus der Stickstoffanalyse ergab sich ein Substitutionsgrad an 4-Nitrophenylgruppen von 3,2.

M) 11,3 g des aus G erhaltenen modifizierten Gels wurden in etwa 70 ml Pyridin suspendiert und 50 g Natriumdithionit in wäßriger Lösung zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde etwa 7 h unter Rückfluß und Rühren erhitzt; das Gel abfiltriert, mit Wasser und Aceton gewaschen und bei 50 bis 60°C im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 9,8 g.

Der Gehalt an Amino-Stickstoff wird durch Titration mit 0,1 n Natriumnitritlösung und Kaliumjodid-Stärkepapier als Indikator ermittelt. Es ergab sich ein Gehalt von 2,95 mmol Aminogruppen pro Gramm Gel, was einem Substitutionsgrad von etwa 1,3 entspricht; aus dem Gehalt an Amino-Stickstoff ergibt sich, daß zirka 90% der Nitrogruppen reduziert worden sind. Der Quellungsfaktor dieses Glucose-Gels mit Aminophenylgruppen beträgt in Wasser 1,7 bis 2.

N) In Abwandlung von M wurde ein mit Nitrophenylgruppen modifiziertes Saccharose-Gel reduziert. Dabei ergibt sich ein Gel mit 3,0 mmol Aminophenylgruppen/g, was einem Substitutionsgrad von zirka 1,9 entspricht.

O) In Abwandlung von M wurden in 10 g aus G erhaltenem modifiziertem Methylglucosid-Gel die Nitrogruppen mit 50 g Natriumdithionit reduziert. Ausbeute: 8,9 g, Substitutionsgrad etwa 1,1.

P) 2 g des aus K a) erhaltenen modifizierten Saccharosemethacrylat- Gels wurden in 20 ml Pyridin suspendiert und 10 g Natriumdithionit in 20 ml Wasser zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 3 h unter Rühren und Rückfluß erhitzt. Das Gel wird filtriert, mit Wasser gewaschen und im Wasserstrahlvakuum bei 60°C getrocknet.

Aus der Titration der Amino-Gruppen mit 1/10 n Natriumnitrit- Lösung ergab sich, daß mehr als 90% der Nitrogruppen zu Aminogruppen reduziert worden sind.

Q) 2 g des aus L erhaltenen modifizierten Gels wurden in 20 ml Pyridin suspendiert und 10 g Natriumdithionit in 20 ml Wasser zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 3 h unter Rühren und Rückfluß erhitzt und das erhaltene Gel abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum bei 60°C getrocknet. Aus der Titration der Aminogruppen mit 1/10 n Natriumnitritlösung ergab sich, daß mehr als 90% der Nitrogruppen zu Aminogruppen reduziert worden sind.

Beispiel 1

2 g des aus M erhaltenen modifizierten Gels mit primären aromatischen Aminogruppen wurden in 20 ml 1n- Schwefelsäure suspendiert und auf 0 bis 5°C abgekühlt. Dann wurde unter Rühren so lange eine wäßrige 10%ige Natriumnitritlösung zugetropft, bis kein Nitrit mehr verbraucht wurde. Dies ist dann der Fall, wenn 15 min nach der letzten Nitrit-Zugabe Kaliumjodid-Stärkepapier noch immer blau gefärbt wird. Das erhaltene diazotierte Gel wurde abgefiltert und mit Eiswasser gewaschen.

Der quantitative Verlauf der Diazotierung kann dadurch gezeigt werden, daß man eine Probe des Aminophenylgruppen enthaltenden Gels mit 1/10 molarer Natriumnitritlösung titriert, wobei sich der erwartete Wert ergibt (2,95 mmol Diazoniumgruppen/g Gel).

Beispiel 2

1 g des Gels aus P bzw. Q wurde in 10 ml 1n- Salzsäure suspendiert; das Reaktionsgemisch wurde auf 0 bis 5°C abgekühlt und unter Rühren mit 5%iger wäßriger Natriumnitritlösung diazotiert. Das diazotierte Gel wurde abgefiltert und mit Eiswasser gewaschen.

Claims

1. Vernetzte hydrophile Polymer-Gele mit kupplungsfähigen Diazonium-Gruppen aus Einheiten der allgemeinen Formel wobei X¹ = X, CH₃, C₂H₅ oder bedeutet und mehr als ein X für (R=H, CH₃) und mindestens ein X für eine -CO-C₆H₄-N₂⁺Y^--Gruppe, für eine -CO(COOH)C₆H₃-N₂⁺Y^--Gruppe, für eine oder für eine -CH₂-CH₂-CO-NH-C₆H₄-N₂⁺Y^--Gruppe steht, worin Y^- Cl^- oder HSO₄^- ist und die restlichen X für Wasserstoff stehen, herstellbar durch Diazotieren von vernetzten Polyacrylsäure- oder Polymethacrylsäureestern von Glucose, ihrer Glucoside, oder von Saccharose, die durch ester- bzw. etherartig gebundene Aminophenyl-Gruppen substituiert sind, mit Gemischen aus salpetriger Säure und Salzsäure oder Schwefelsäure.

2. Polymer-Gele nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen Quellungsgrad in Wasser von 1,5 bis 50 und durch einen Gehalt an kupplungsfähigen Diazonium-Gruppen von 1,1 bis 3,2 mval/g.