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Die Erfindung betrifft eine enzymhaltige Waschmittelmischung.
Die Herstellung von Enzymen, die für eine Verwendung in Waschmitteln vorgesehen sind, ist im allgemeinen mit einer grossen Zahl von Problemen verbunden. Beispielsweise ist es schwierig, ein Enzym in einer so reinen Form herzustellen, dass es nicht in wesentlichem Ausmass die Ausbildung eines Geruches hervorruft, der in gewissem Umfang bei der Waschmittelmischung als unangenehm empfunden wird. Ferner bewirkt die Farbe der Enzyme, dass die Waschmittel weniger ansehnlich aussehen.
Die Erfindung zielt daher darauf ab, enzymhaltige Waschmittelmischungen unter Verwendung von in Form von Enzymzusammensetzungen vorliegenden Enzymen zu schaffen, welche die oben erwähnten Nachteile nicht aufweisen und zusätzlich eine hohe Stabilität haben, so dass eine geringe Menge der Enzymzusammensetzung verwendet werden kann, um eine vorbestimmte Wirkung zu erreichen, und wobei diese Enzymzusammensetzungen und damit auch die sie enthaltenden Waschmittelmischungen vom gesundheitlichen Standpunkt aus betrachtet nochweniger beanstandbar sind als die üblichen.
Die Erfindung geht dabei von einer enzymhaltige Waschmittelmischung aus, die zusammen mit zumindest einem Waschmittel eine Enzymzusammensetzung enthält, die aus einem Komplex von einem Enzym und einem inwässerigemAlkaIi loslichen Polymeren aufgebaut ist, das eine gerade oder verzweigte Kohlenstoffkette mit entlang dieser angeordneten Carboxylgruppenhatundferner eine oder mehrere gegebenenfalls substituierte Kohlenwasserstoffgruppen aufweisen kann, wobei die Kohlenstoffkette und/oder die Kohlenwasserstoffgruppe oder Kohlenwasserstoffgruppen gewünschtenfalls durch Heteroatome, vorzugsweise Sauerstoffatome, unterbrochen sind und das Polymere ein durchschnittliches Molekulargewicht von mindestens 10000 hat.
Eine bekannte Enzymzusammensetzung dieser Art weist eine kovalente Bindung auf undwird durch Umsetzung des Enzyms mit einem Polycarbonsäureanhydrid oder einer aktivierten Polycarbonsäure bei einem praktisch neutralen pH-Wert bei niedriger Temperatur erhalten (CH-PS Nr. 493 630). Die verbesserte enzymhaltige Waschmittelmischung gemäss der Erfindung ist nun dadurch gekennzeichnet, dass die Enzymzusammensetzung aus einem ionisch gebundenen Komplex des Enzyms und des Polymeren aufgebaut Ist, der durch Ansäuern einer Mischung der wässerigen Enzymlösung und der Lösung des Polymeren, das in Form einer nichtaktivierten Polyearbonsäure verwendet wird, die vorzugsweise ein durchschnittliches Molekulargewicht von 20000 hat, bis zur Bildung eines Niederschlages und Abtrennung des Niederschlages erhalten wird.
Für die Gewinnung der erfindungsgemässen Enzymzusammensetzung wird ein Polymeres als eine nichtaktivierte Polycarbonsäure verwendet und in gelöster Form mit dem in Lösung vorliegenden Enzym bei Raumtemperatur umgesetzt, und die gebildete Lösung wird angesäuert, bis der gebildete Enzymkomplex voll- ständig ausgefällt ist.
Vorzugsweise werden in der Waschmittelmischung gemäss der Erfindung Enzymzusammensetzungen ver- wendet, derenPolymeres-CHXCY (COOH)-Gruppen enthält, in welchen X ein Wasserstoffatom oder eine Carboxylgruppe und Y ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe bedeuten, wobei das Polymere gegebenenfalls mit einem oder mehreren andern Monomeren oder deren partiellen Niederalkylestern oder partiellen Amiden interpolymerisiert ist. Beispielsweise kann das Polymere der Enzymzusammensetzung ein Carboxylpolymeres von Acryl- oder Methacrylsäure oder ein Carboxylinterpolymeres von Acryl-, Methacryloder Maleinsäure mit Comonomeren, wie Styrol, Äthylen oder Methylvinyläther. sein.
Die gemäss der Erfindung verwendeten Enzymkomplexe sind verhältnismässig rein, haben einen angenehmeren Geruch, eine angenehmere Farbe und eine höhere Aktivität, bezogen auf Gewichts-Gewichtsbasis, als die üblichen Enzyme. Überraschenderweise gehen diese wünschenswerten und günstigen Eigenschaften des Komplexes bei seiner Einarbeitung in Waschmittelmischungen nicht verloren und werden auch nicht verschlechter. Als weitere Vorteile dieser Enzymkomplexe gegenüber den üblichen Enzymen können eine niedrigere Toxizität und eine geringere allergische Wirkung, verbunden mit einer hohen Stabilität, erwähnt werden.
Die erfindungsgemässen Waschmittelmischungen, die einen Enzymkomplex der angeführten Art enthalten, haben eine Waschwirkung, die der einer äquivalenten Menge eines Waschmittels mit einem Gehalt an einer üblichen Type eines Enzyms mit der gleichen enzymatischen Aktivität, ausgedrückt in Delfteinheiten (Delfteinheiten = DU, bestimmt nach der im folgenden beschriebenen Methode), zumindest vergleichbar ist.
Ein weiterer Vorteil, der sich bei Verwendung dieser Enzymkomplexe ergibt, besteht darin, dass diese ausgehend von der filtriertenKulturbrühe bzw. dem Zellextrakt hergestelltwerden können, wodurch es überflüssig wird, das Enzym zuerst auf übliche Weise zu isolieren.
Die gemäss der Erfindung verwendeten Komplexe sind von Enzymen abgeleitet, die üblicherweise in Waschmittelmischungen verwendet werden, wie Proteasen, z. B. die von einer Bacillusspecies produzierten Proteasen, von welchen als Beispiele Maxatase (Handelsmarke) oder Alcalase (Handelsmarke) genannt werden können. Diese Proteasen oder deren Mischungen können vor oder nach der Herstellung des Komplexes mit Amylasen, Lipasen oder ähnlichen Enzymen vermischt werden. Ferner können mitunter Komplexe mit andern Enzymen, die nicht allgemein in Waschmitteln verwendet werden, wie besonderen Typen von Amylasen, Lipasen und ferner Alkoholdehydrogenasen, Carboxylasen u. dgl., benutzt werden.
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Besonders vorteilhaft ist die Verwendung von Enzymkomplexen, in welchen das Enzym mit einem Poly- meren kombiniert ist, dessen Kohlenstoffkette nur Kohlenwasserstoffgruppen, insbesondere Arylgruppen, als Substituenten neben den Carboxylgruppen trägt. Als Polymeren, die diesen Bedingungen entsprechen, sind insbesondere die Polymeren zu nennen, die von Maleinsäure als einem der Bausteine abgeleitet sind. Als Quellen für Arylgruppen als Substituenten werden Monoaryläthylene, insbesondere Styrol, bevorzugt. Vorzugsweise ist das Polymere von Maleinsäureeinheiten und Styroleinheiten gebildet. Das bevorzugte Verhältnis von Maleinsäure-zuStyroleinheiten liegt zwischen etwa 3 : 1 und 1 : 3. Ein noch mehr bevorzugtes Verhältnis ist 3 : 2 bis 2 : 3.
Ein besonders geeignetes Polymeres ist das Polymere, das in Form einer wässerigen Lösung unter der Bezeichnung G-942 (E. I. Du Pont de Nemours and Co.) imHandel erhältlich ist undin demdas Molekularverhältnis der Styroleinheiten zu den Maleinsäureeinheiten etwa l : l und das durchschnittliche Mo- lekulargewicht über 10 000 beträgt. Andere geeignete Bildungseinheiten bzw. Bildungsblöcke für Polymeren, die in den erfindungsgemäss eingesetzten Enzymkomplexen verwendet werden können, sind z. B. Acryl- und Methacrylsäure. Diese Bildungseinheiten können selbstverständlich auch für CopolymerenundInterpolymeren verwendet werden, in denen z. B. Styrol eingesetzt wird.
Es kann hier auf die US-PS Nr. 2, 205,882 (Graves) und Nr. 2, 205,901 (Kirk) verwiesen werden, in welchen Beispiele für geeignete Polymeren angegeben sind.
Die in dem Polymeren vorliegenden COOH-Gruppen können teilweise in Derivate wieAmide oder Ester übergeführt werden, im zuletzt genannten Fall vorzugsweise mit niederen aliphatischen Alkoholen, wobei einige Carboxylgruppen in dem Polymermolekül freibleiben sollen.
Vorzugsweise sollen Enzymzusammensetzungen mit einem Molekulargewicht von über 20 000 verwendet werden.
Die Erfindung bezieht sich ferner auf Waschmittelmischungen, die als Enzymzusammensetzung ein Umsetzungsprodukt einer Enzymzusammensetzung der erwähnten Arten mit Metallionen enthalten, wobei gleichzeitig eine Ausfällung und/oder eine Vernetzung der gebildeten Verbindung bewirkt wird. Geeignete Metallionen sind Ionen von dreiwertigen Metallen, wie Aluminium, Eisen und Chrom, doch können auch Metalle, die gewöhnlich andere Wertigkeiten haben, wie Zirkonium, eingesetzt werden.
Zur Herstellung der Komplexe von einem Enzym und einem Polymerenwird einewässerige Lösung des Enzyms mit dem gelösten Polymeren in Berührung gebracht. Vor oder nach dem Vermischen wird der pH-Wert auf einen Wert zwischen etwa 2 und etwa 9, vorzugsweise zwischen etwa 2 und etwa 6, eingestellt und dann wird der gebildete Niederschlag abgetrennt. Die Abtrennung wird auf eine auf diesem Gebiet übliche Weise durchgeführt, z. B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren, Waschen und Trocknendes Enzymkomplexniederschlages. Allgemeingesprochen sollen zum Zwecke des Waschens solche Lösungsmittel oder Lösungsmittelmischungen verwendet werden, die den Komplex während des Waschvorganges nicht wesentlich lösen oder zersetzen. Organische Medien, wie Aceton und Äthylalkohol, sind für diesen Zweck gewöhnlich geeignet.
Der getrocknete Niederschlag kann in Form eines freifliessenden Pulvers, das leicht in die Waschmittelmischungen eingebracht werden kann, erhalten werden.
Die Mengen an Polymerem, das zur Bildung des Enzymkomplexes verwendet werden soll, hängen von der Natur des Enzyms und dessen Konzentration und von der Art des angewendeten Polymeren ab. Ferner beeinflussen auch solche Faktoren wie der pH-Wert, die Anwesenheit von Salzen, elektrostatische Ladungen des Enzyms und des Polymeren usw. die Komplexbildung. Weiterhin ist die Menge an Polymerem, die für eine optimale Komplexbildung erforderlich ist, von diesen und andern Faktoren, z. B. der Konzentration der Enzymlösung, abhängig. Wenn beispielsweise eine G-942-Lösung verwendet wird, die etwa 25% des Polymeren enthält, werden vorzugsweise Mengen von etwa 0,5 bis 3% Gew. /Vol. für Maxatase, bezogen auf eine Enzymlösung von etwa 100 000 DU/g, angewendet. Für besondere Zwecke können auch andere Mengen eingesetzt werden.
Die erhaltenen Enzymkomplexe können, vorzugsweise nach Waschen wie dies oben erwähnt ist, ferner mit einem Metallion oder einer Komponente der oben beschriebenen Art umgesetzt werden.
Die Erfindung bezieht sich nun aufwaschmittelmischungen, die einen oder mehrere der erwähntenKomplexe zusammen mit zumindest einem Waschmittel bzw. Detergens enthalten. In Waschmittelmischungen liegt der Enzymkomplex in Mengen vor, die ausreichend sind, eine gute enzymatische Aktivität zu erhalten, und die bevorzugte enzymatische Aktivität in den Waschmittelmischungen gemäss der Erfindung beträgt etwa 1000 bis etwa 3000 DU/g.
Waschmittel, die in denWaschmittelmischungen gemäss der Erfindung brauchbar sind, sind jene, die im allgemeinen in Wascbmittelmischungen mit einer enzymatischen Wirkung verwendet werden. Im allgemeinen
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Besondere Beispiele dieser Klasse von Waschmitteln sind die Natrium- oder Kaliumsalze der Mischungen von Fettsäuren, die von Kokosnussöl und Talg abgeleitet sind.
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Beispiele für anionische Waschmittel sind die wasserlöslichen Salze, z. B. die Alkalisalze, von organischen Schwefelsäurereaktionsprodukten, die in ihrem Molekül einen Alkylrest mit etwa 8 bis etwa 22 Kohlenstoffatomen und einen Rest, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sulfonsäure- und Schwefelsäureestergruppen, enthalten, wobei unter der Bezeichnung "Alkyl" der Alkylteil von höheren Säureresten
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fonate, insbesondere Äther der hoheren Alkohole, die von Talg und Kokosnussöl abgeleitet sind ; Natrium- kokosnussölfettsäure-monoglyceridsulfate und-sulfonate ; Natrium-oder Kaliumsalzevon Schwefelsäureestern des Reaktionsproduktes von 1 Mol eines höheren Fettalkohols (z. B.
Talg- oder Kokosnussölalkohole) und etwa 1 bis 6 Mol Äthylenoxyd ; Natrium- oder Kaliumsalze von Alkylphenol-äthylenoxydäthersulfat mit etwa 1 bis 10 Einheiten Äthylenoxyd pro Molekül, in welchen die Alkylgruppen etwa 8 bis etwa 12 Kohlenstoffatome enthalten ; das Reaktionsprodukt von mit Isäthionsäure veresterten und mit Natriumhydroxydneutralisierten Fett- säuren, z. B. Fettsäuren, die von Kokosnussöl abgeleitet sind ; Natrium-oder Kaliumsalze des Fettsäureamids eines Methyltaurids, wobei die Fettsäuren z. B. von Kokosnussöl abgeleitet sind, und Natrium- und Kaliumsalze von sulfonierten Ci0 -C24 -Olefinen.
Beispiele von nichtionischen Waschmitteln sind Verbindungen, die durch Kondensation von Alkylenoxydgruppen, die ihrer Natur nach hydrophil sind, mit einer organischen hydrophoben Verbindung, die eine allphatische oder alkylaromatische Verbindung sein kann, erhalten werden. Die Länge des hydrophilen Restes oder Polyoxyalkylenrestes, der mit einer besonderen hydrophoben Gruppe kondensiert wird, kann leicht so eingestellt werden, dass eine wasserlösliche Verbindung erhalten wird, die den gewünschten Grad an Gleichgewicht zwischen hydrophilen und hydrophoben Elementen aufweist. Eine andere Klasse hat semipolare Eigen- schaften. Besondere Beispiele dieser Klasse von nichtionischen Detergentien sind die folgenden :
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ben werden.
Diese Verbindungen werden durch Kondensation von Äthylenoxyd mit einer hydrophoben Base, die durch Kondensation von Propylenoxyd mit Propylenglykol gewonnen wird, erhalten. Der hydrophobe Anteil des Moleküls, der die Wasserunlöslichkeit bewirkt, hat ein Molekulargewicht von etwa 1500 bis 1800.
Der Zusatz von Polyoxyäthylenresten zu diesem hydrophoben Teil hat die Neigung, die Wasser löslichkeit der Moleküle insgesamt zu erhöhen, und der Flüssigkeitscharakter des Produktes bleibt bis zu dem Punkt erhalten, an dem der Polyoxyäthylengehalt etwa 50% des Gesamtgewichtes des Kondensationsproduktes beträgt.
2. Die Polyäthylenoxydkondensate von Alkylphenolen, z. B. die Kondensationsprodukte von Alkylphenolen mit einer Alkylgruppe, die etwa 6 bis 12 Kohlenstoffatome in einer geraden oder verzweigten Kettenkonfigu- ration enthält, mit Äthylenoxyd, wobei das Äthylenoxyd in Mengen vorliegt, die 5 bis 25 Mol Äthylenoxyd pro Mol Alkylphenol entsprechen. Der Alkylsubstituent in solchen Verbindungen kann z. B. von polymerisiertem Propylen, Diisobuten, Octen oder Nonen abgeleitet sein.
3. Die nichtionischen Detergentien, die bei der Kondensation von Äthylenoxyd mit dem Produkt erhalten werden, das bei der Umsetzung von Propylenoxyd mit Äthylendiamin gewonnen wird. Beispielsweise sind Verbindungen mit einen Gehalt von etwa 40 bis etwa 80 Gew.-% Polyäthylenoxyd und einem Molekulargewicht von etwa 5000 bis etwa 11000, die durch Umsetzung von Äthylenoxydgruppen mit einer hydrophoben Base erhalten werden, die aus dem Umsetzungsprodukt von Äthylendiamin mit einem Überschuss Propylenoxyd gebildet ist, wobei diese Base ein Molekulargewicht in der Grössenordnung von 2500 bis 3000 hat, zufriedenstellend.
4. Das Kondensationsprodukt von aliphatischen Alkoholen mit 8 bis 22 Kohlenstoffatomen in einer geraden oder verzweigten Kohlenstoffkette mit Äthylenoxyd, z. B. ein Kokosnussalkohol-Äthylenoxyd-Kondensat mit 5 bis 30 Mol Äthylenoxyd pro Mol Kokosnussöl, wobei die Kokosnussalkoholfraktion 10 bis 14 Kohlenstoffatome aufweist.
5. Die Ammoniak-, Monoäthanol- und Diäthanolamide von Fettsäuren, die einen Säurerest von etwa 8 bis etwa 18 Kohlenstoffatomen aufweisen. Diese Acylreste sind normalerweise von natürlich vorkommenden Glyceriden, z. B. Kokosnussöl, Palmöl, Sojabohnenöl und Talg, abgeleitet, können jedoch auch auf synthetischem Wege, z. B. durch Oxydation von Erdöl oder durch Hydrieren von Kohlenmonoxyd nach dem FischerTropsch-Prozess, erhalten werden.
6. Langkettige tertiäre Aminoxyde, die der allgemeinen Formel
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aminoxyd.
7. Langkettige tertiäre Phosphinoxyde entsprechend der folgenden allgemeinen Formel
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in derR5 eineAlkyl-, Alkenyl- oder Monohydroxyalkylgruppe mit 10 bis 24 Kohlenstoffatomen in der Kettenlänge darstellt und R6 und R7 jeweils Alkyl- oder Monohydroxyalkylgruppen mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen bedeuten. Beispiele für diese Klasse von Verbindungen sind Dimethyldodeeylphosphinoxyd und Dimethyl- - (2-hydroxydodecyl} -phosphinoxyd.
8. Langkettige Sulfoxyde der Formel
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3 Kohlenstoffatomen und 1 bis 2 Hydroxylgruppen darstellt. Als Beispiele für diese Sulfoxyde sind Dodecylmethylsulfoxyd und 3-Hydroxy-tridecylmethylsulfoxyd zu nennen.
Beispiele für ampholytische Waschmittel sind Derivate von aliphatischen, sekundären und tertiären Aminen, in welchen der aliphatische Rest geradkettig oder verzweigt ist und einer der aliphatischen Substituenten etwa 8 bis 18 Kohlenstoffatome aufweist und einer der Substituenten eine anionische, wasserlöslichmachende Gruppe, z. B. eine Carboy-, Sulfo-, Sulfat-, Phosphat- oder Phosphongruppe, enthält. Beispiele dieser Klasse von Verbindungen sind Natrium-3-dodecyl-amïnopropionat und Natrium-3-dodecyl-aminopro- pansulfonat.
Als Beispiele für Zwitterionendetergentien sind Derivate von aliphatischen, quaternären Ammonium-, Phosphonium- und Sulfoniumverbindungen zu nennen, in welchen der allphatische Rest geradkettig oder verzweigt sein kann und einer der aliphatischen Substituenten etwa 8 bis 24 Kohlenstoffatome und der andere eine anionische, wasserlöslichmachende Gruppe, z. B. eine Carboy-, Sulfo-, Sulfat-, Phosphat- oder Phosphongruppe, enthält. Beispiele für Verbindungen, die dieser Definition entsprechen, sind 3- (N, N-Dimethyl- - N-hexadecylammonio)-propan-l-sulfonat und 3- (N, N-Dimethyl-N-hexadecylammonio)-2-hydroxy-propan- -1-sulfonat, die auf Grund ihrer Detergenseigenschaften in kaltem Wasser bevorzugt werden.
Diese anionischen, nichtionischen, ampholytischen und zwitterionischen Seifen-und Nichtseifen-Waschmittelverbindungen können einzeln oder in Kombination verwendet werden. Die oben erwähnten Beispiele sind lediglich Illustrationen der zahlreichen geeigneten Detergentien. Es können ferner auch andere organische Waschmittelverbindungen verwendet werden. Üblicherweise sind die Waschmittel in Mengen von etwa 4 bis 20% der Waschmittelmischung vorhanden.
Die Waschmittelmischungen gemäss der Erfindung können zusätzlich noch weitere Verbindungen enthalten, die gewöhnlich in Waschmittelmischungen verwendet werden, wie komplexe Phosphate, z. B. Natriumtripolyphosphat und Natriumpyrophosphat, die vorzugsweise in Mengen von etwa 40 bis 50 Gew.-% der Waschmittelmischung verwendet werden. Ferner können auch Verbindungen wie Natriumcyanotriacetat und Natriumcitrat eingesetzt werden. Ihre bedeutendste Wirkung ist die als Wasserweichmacher. Andere Verbindungen, die einverleibt werden können, sind z. B. wasserfreies Natriumsilikat, gewöhnlich in Mengen von 1 bis 10 Gew.-%, schwach alkalische Verbindungen, z. B.
Natriumbicarbonat, üblicherweise in Mengen bis zu 20 Gew.-%, Füllmittel, beispielsweise Natriumsulfat, und andere Verbindungen, wie Carboxymethylcellulose, Riechstoffe und optische Aufheller.
Die Waschmittelmischungen können auf übliche Weise hergestellt werden, beispielsweise durch Vermischen der Komponenten miteinander oder dadurch, dass zuerst eine Vormischung erzeugt wird, die mit den weiteren Verbindungen vermischt wird. Vorzugsweise wird der Enzym-Polymer-Komplex oder sein Reaktionsprodukt mit Metallionen oder einer ähnlichen Komponente mit einer oder mehreren andern Verbindungen, z. B. dem Füllmittel, das üblicherweise Natriumsulfat ist, vermischt, um ein Konzentrat mit einer vorbestimmten Enzymaktivität zu gewinnen, das dann mit den andern gewünschten Komponenten vermischt werden kann.
Die oben erwähnte Enzymaktivität wird auf folgende Weise gemessen : Die Aktivität eines Enzyms wird
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in Einheiten angegeben. Eine Einheit des Enzyms ist eine Menge des Enzyms, die imstande ist, eine spezifische chemische Umsetzung in einem bestimmten Zeitraum zu bewirken. Die Reaktionsbedingungen beeinflussen in hohem Masse die Bestimmung der Aktivität. Vorzugsweise wird die Aktivität unter solchen Bedingungen, wie sie in Waschflüssigkeiten erwartet werden können, gemessen, weil gewisse Proteasen häufig in Waschpulver verwendet werden. Aus diesem Grund wird die Bestimmung in Gegenwart von Natriumtripolyphosphat durchgeführt, weil dieses Salz in den meisten Waschpulvern vorhanden ist.
Ferner werdender pH-Wert und die Temperatur auf Waschbedingungen eingestellt. Die Bestimmung der Aktivität, die in Delfteinheiten (DU) angegeben wird, erfolgt durch Messung der Reaktion des Enzyms auf Casein. Die Stabilität von wässerigen Lösungen des Enzyms wird durch Messung der Aktivität der Lösung von Zeit zu Zeit festgestellt.
Zur Bestimmung der Aktivität des Enzyms werden die folgenden Reagentien verwendet :
Reagens 1 : 130 g CaCl . 6 H20 gelöst in destilliertem Wasser auf 3000 ml.
Reagens 2 : 42 g MgCl2. 6 H20 gelöst in destilliertem Wasser auf 3000 ml.
Reagens 3 : 63 g NaHCO gelöst in destilliertem Wasser auf 3000 ml.
Reagens 4 : Eine Mischung von 100 ml Reagens 1
100 ml Reagens 2
100 ml Reagens 3 in 9700 ml destilliertem Wasser.
Die Lösung hat eine deutsche Härte von 150.
Reagens 5 : 36, 34 g Tris-hydroxymethylaminomethan gelöst in Reagens 4 auf 1000 ml.
Reagens 6 : Eine Mischung von 1000 g Natriumtripolyphosphat
500 ml Reagens 1
500 ml Reagens 2
500 ml Reagens 3 in 48, 5 l destilliertem Wasser.
Der pH-Wert wird durch Zusatz einer ausreichenden Menge einer 1Oigen HCI-Lösung auf
8, 5 eingestellt.
Reagens 7 : 540 g Trichloressigsäure in destilliertem Wasser auf 3000 ml.
Reagens 8 : 900 g Natriumacetat. 3 H20 gelöst in destilliertem Wasser auf 3000 ml.
Reagens 9 : 900 ml Essigsäure gelöst in destilliertem Wasser auf 3000 ml.
Reagens 10 : 2, 5 ml Tween-80 gelöst in destilliertem Wasser auf 50 ml.
Reagens 11 : 100 ml Reagens 7
100 ml Reagens 8
100 ml Reagens 9 und
4 ml Reagens 10 werden in der angeführten Reihenfolge zusammengebracht und mit destilliertem Wasser auf
1000 ml verdünnt.
Reagens 12 : Casein-Substrat-Lösung. Diese Lösung wird auf folgende Weise hergestellt : 36, 0 g Casein (Merck, für biochemische Zwecke) werden in 2, 5 1 Reagens 4 unter Rühren gelöst. Das Rühren wird 10 min fortgesetzt, dann werden 300 ml Reagens 5 zugesetzt und hierauf wird die Mischung weitere 10 min gerührt. Dann wird sie auf einem Wasserbad auf 700C erhitzt, wobei bis zum Erreichen einer Temperatur von 40 C weitergerührt wird. Bei dieser Temperatur wird der pH-Wert mit n-NaOH-Lösung auf 8, 5 eingestellt. Nach Abküh- len auf Raumtemperatur wird die Mischung mit Reagens 4 auf ein Volumen von 3 l gebracht und die Lösung neuerlich gerührt.
Diese Lösung ist für eine eintägige Verwendung geeignet, vorausgesetzt, dass sie in einem Kühlschrank aufbewahrt wird.
Die Proteaseaktivität wird auf folgende Weise bestimmt :
Eine gewogene Menge eines homogenen Enzympräparates wird in einer geeigneten Menge Reagens 6 gelöst. Durch Zusatz von n-Natronlauge oder n-Chlorwasserstoffsäure wird der pH-Wert dieser Lösung bei Raumtemperatur auf 8, 5 eingestellt. Die Enzymkonzentration der Lösung muss so gewählt werden, dass die Aktivität der Lösung etwa 20 bis 30 DU Protease/ml beträgt. Diese Lösung darf nicht länger als 2 h gehalten werden. Die Enzymlösung, das Caseinsubstrat und einige Zentrifugengläser werden auf einem Wasserbad auf 40 ¯0,1 C erhitzt. 1 ml der Enzymlösung wird in ein Zentrifugenglas pipettiert.
Wenn diese Lösung die gewünschte Temperatur von 400C erreicht hat, werden 5 ml Casein-Substrat-Lösung in das Zentrifugenglas pipettiert und mit der Enzymlösung gründlich vermischt. Die Umsetzungszeit beträgt genau 40 min. Dann werden 5 ml Reagens 11 in das Glas eingebracht und mit der Lösung vermischt. Das Glas wird 30 min in einem Wasserbad gehalten, um ein Koagulieren des Niederschlages zu ermöglichen. Hierauf wird das Glas 15 min lang zentrifugiert.
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Für jede Enzymlösung wird ein Blindversuch durchgeführt, indem 5 ml Reagens 11 in ein Zentrifugenglas pipettiert werden, die Lösung auf 400C erhitzt und dann mit 1 ml Enzymlösung und 5 ml Casein-Substrat-Lösung versetzt wird. Der Inhalt der Zentrifugengläser wird gründlich vermischt und dann wird das Glas 30 min in ein Wasserbad eingebracht und hierauf 15 min lang zentrifugiert. Anschliessend wird die opti- sche Dichte der klaren Lösung bei 275 m ; n gegen destilliertes Wasser in einem UV-Spektrophotometer ge- messen. Der Unterschied zwischen der optischen Dichte der Testlösung und der Blindlösung (A OD) soll etwa
0,4 bis 0,6 betragen. Wenn die Differenz zu hoch oder zu niedrig ist, soll ein neuer Versuch mit einer verdünnteren oder konzentrierteren Enzymlösung durchgeführt werden.
Die Aktivität des Enzyms, ausgedrückt in DU/g enzymhaltige Material, kann wie folgt berechnet werden : A OD x11 xVerdünnungsfaktor x4, 545 worin 11 die Verdünnung der Enzymlösung durch das Substrat und das Reagens 11 bedeutet ; der Verdünnungsfaktor ist der Quotient aus der Gesamtzahl der ml Enzymlösung und dem Gewicht der Probe in g, und die Zahl 4,545 ist ein Umwandlungsfaktor.
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert : Beispiel l : Einerohe Protease, die durch Fermentation eines Bacillus subtilis erhalten wurde, wurde in Wasser auf eine Konzentration von etwa 100 000 DU/ml gelost. Der pH-Wert wurde auf 7 eingestellt.
Dann wurden der Enzymlösung 10 Vol.-% einer 15%igen Gew. -Vol. verdünnten Lösung der Polymerlösung G-942 (Handelsmarke) (24 bis 26% wässerige Lösung eines Maleinsäure-Styrol-Copolymeren l : l) in Wasser zugesetzt. Es bildete sich eine kleine Menge eines Niederschlages. Die Mischung wurde gerührt und der pH-Wert durch Zusatz von verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf 5 gebracht. Es bildete sich eine grosse Menge Niederschlag, der der Komplex von Protease und dem Polymeren war. Die erhaltene Suspension wurde 1 h lang gerührt. Hierauf wurde der Niederschlag abfiltriert und mit Aceton gewaschen, indem er in einer geeigneten Menge Aceton suspendiert und filtriert wurde. Dann wurde der Niederschlag getrocknet.
Es wurde ein komplexes Proteasepräparat erhalten, das eine 2-bis 4mal höhere Reinheit als das rohe Ausgangsmaterial hatte.
Die unterschiedlichen Eigenschaften des auf diese Weise erhaltenen Proteasekomplexes und eines auf übliche Weise gewonnenen Proteasepräparates können durch die folgenden Versuche gezeigt werden :
Jedes der Präparate wurde in Wasser gelöst, um eine Konzentration zu ergeben, die einer Enzymaktivität von 100 000 DU/ml entspricht, wobei durch gleichzeitigen Zusatz von verdünnter Natriumhydroxydlösung der pH-Wert auf 9 gehalten wurde. Dann wurde eine verdünnte Lösung von Hyamine 1622 (Handelsmarke für p-tert. Octylphenoxyäthoxyäthyl-dimethylbenzylammoniumchlorid) zugesetzt. In der Lösung des Komplexes, der gemäss dem vorliegenden Beispiel erhalten wurde, bildete sich ein Niederschlag, wogegen in der Lösung des andern Enzympräparates keine Niederschlagsbildung erfolgte.
Ein Blindversuch, der mit einer verdünnten Lösung des Gerbstoffes ohne das Enzym durchgeführt wurde, ergab bei Zusatz von Hyamine 1622 gleichfalls einen Niederschlag. Daraus kann geschlossen werden, dass der Gerbstoff einen Teil des gemäss diesem Beispiel erhaltenen Proteasekomplexes bildet.
Bei einem weiteren Versuch wurde der gemäss diesem Beispiel gewonnene Proteasekomplex mit einem auf übliche Weise erhaltenen Präparat in einem Elektrofokussiertest nach H. Haglund, Science Tools, 14 Nr. 2, S. 17 [1967], verglichen. Beim Versuch mit dem Komplex gemäss dem vorliegenden Beispiel zeigte sich eine Bildung einer Zone von festem Stoff im niederen pH-Bereich, und dieser Stoff ergab nach Abtrennen und Lösen im Wasser bei einem hohen pH-Wert mit Hyamine 1622 einen Niederschlag. Das UV-Spektrum dieser Lösung war identisch mit dem UV-Spektrum einer verdünnten Lösung von G-942. Der Versuch mit dem gewöhnlichen Enzympräparat zeigte, dass eine solche Zone von Feststoff in dem angegebenen pH-Bereich nicht gebildet wurde und ein Zusatz von Hyamine 1622 keine Niederschlagsbildung verursachte.
Dieser Versuch weist gleichfalls auf den Umstand hin, dass das Präparat, das gemäss dem vorliegenden Beispiel erhalten wurde, sich von auf übliche Weise erhaltenen Enzympräparaten dadurch unterscheidet, dass das Enzym mit dem Polymeren in einem Komplex gebunden ist.
Der nach dem vorliegenden Beispiel erhaltene Enzym-Polymer-Komplex wurde für die Herstellungder folgenden Waschmittelmischung verwendet :
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<tb>
<tb> Substanz <SEP> Gew.-Teile
<tb> Wasserfreies <SEP> Natriumsulfat <SEP> 54
<tb> Natriumtripolyphosphat <SEP> 24
<tb> Natriumpyrophosphat <SEP> 6
<tb> Natriumbicarbonat <SEP> 10
<tb> Carboxymethylcellulose <SEP> 2
<tb> Dialkylphenoxypoly <SEP> (äthylenoxy) <SEP> äthanol <SEP> 4
<tb> Enzymkomplex <SEP> gemäss <SEP> Beispiel <SEP> 2000 <SEP> DU/g
<tb>
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<tb>
<tb> Probe <SEP> des <SEP> Enzym- <SEP> Probe <SEP> des <SEP> üblichen
<tb> DU/g <SEP> der <SEP> Probe <SEP> komplexes <SEP> Enzyms
<tb> 0 <SEP> 45 <SEP> 45
<tb> 250 <SEP> 58 <SEP> 59
<tb> 500 <SEP> 66 <SEP> 66
<tb> 1000 <SEP> 69 <SEP> 70
<tb> 2000 <SEP> 75 <SEP> 73
<tb>
Die Tabelle zeigt,
dass dier emissionswerte nicht augenscheinlich verschieden sind, woraus geschlossen werden kann, dass die Waschaktivität der Proben mit dem Enzymkomplex die gleiche ist wie die der Proben mit dem auf übliche Weise hergestellten Enzym.
Beispiel 2 : Einem konz. Kulturfiltrat, das durch Fermentation eines Bacillus subtilis erhalten worden war, mit einem pH-Wert von 7 und einer Aktivität von etwa 100 000 DU/ml wurden 10 Vol.-% einer verdünnten Lösung von 20% Gew. /Vol. der 25% lgen Polymerlosung G-942 in Wasser zugesetzt. Es bildete sich eine geringe Menge Niederschlag. Der PH-Wert wurde durch Zusatz von verdünnter Schwefelsäure zu der Mischung unter Rühren auf 4 eingestellt. Es bildete sich eine grosse Menge Niederschlag, der der ProteasePolymer-Komplex ist. Dieser Niederschlag wurde auf die gleiche Weise, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist, abgetrennt.
Das erhaltene Proteasepräparat hatte eine 2-bis 4mal höhere Reinheit als auf übliche Art gewonnene Präparate. Ausbeute : 90%, bezogen auf die Proteaseaktivität der Ausgangslösung.
Unter Verwendung dieses Enzymkomplexes wurde eine Waschmittelmischung hergestellt, die die gleichen
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Wascheigenschaften wie eine ähnliche Waschmittelmischung aufwies, die mit einer vergleichbaren Menge eines üblichen Präparates des gleichen Enzyms erhalten worden war.
Beispiel 3 : Es wurden Herstellungsversuche mit verschiedenen Polymeren durch Zusatz einerwässerigen Lösung des zu untersuchenden Polymeren zu einer Proteaselösung mit einem Gehalt von 80 000 bis 100 000 DU/ml und Einstellen des PH-Wertes auf 4 durchgeführt. Die Niederschläge wurden jeweils durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt und auf die oben beschriebene Weise gewaschen und getrocknet.
Die Ergebnisse sind aus der folgenden Tabelle zu ersehen :
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<tb>
<tb> Molekularge-Dosis <SEP> Ausbeute <SEP> Aktivität
<tb> Polymeres <SEP> wicht <SEP> % <SEP> 1) <SEP> % <SEP> DU/g
<tb> Polyacrylsäure <SEP> 0,5 <SEP> 38 <SEP> 3 <SEP> 520 <SEP> 000 <SEP>
<tb> Acrylsäure-Styrol-Copolymeres <SEP> 2 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 21000 <SEP> 0,5 <SEP> 67 <SEP> 4740000
<tb> Polymethacrylsäure <SEP> 50000 <SEP> 0,75 <SEP> 75 <SEP> 4560000
<tb> Methacrylsäure-StyrolCopolymeres <SEP> 2 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 26000 <SEP> 1, <SEP> 25 <SEP> 66 <SEP> 4480000
<tb> Maleinsäure-Styrol-Copolymeres <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 21 <SEP> 000 <SEP> 0,5 <SEP> 83 <SEP> 4220000
<tb> Maleins <SEP> äure-Styrol-Co- <SEP>
<tb> polymeres <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 44000 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> 83 <SEP> 4200000
<tb> Maleinsäure-Styrol-Copolymeres <SEP> 3 <SEP> :
<SEP> 2 <SEP> 31000 <SEP> 0,5 <SEP> 79 <SEP> 3 <SEP> 850 <SEP> 000 <SEP>
<tb> Äthylen-Maleinsäure-Copolymeres <SEP> 1 <SEP> : <SEP> l <SEP> quer <SEP>
<tb> vernetzt <SEP> 44000 <SEP> 0, <SEP> 16 <SEP> 57 <SEP> 4860000
<tb> äthylen-malins <SEP> äure-Copolymeres <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 15 <SEP> 55 <SEP> 4700000
<tb> l <SEP> : <SEP> l <SEP> Mischung <SEP> von <SEP> Äthylen
<tb> -Maleinsäure- <SEP> und <SEP> Malein- <SEP>
<tb> säure-Styrol <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 1-Copoly- <SEP>
<tb> meren <SEP> 0,5 <SEP> 98 <SEP> 3 <SEP> 320 <SEP> 000 <SEP>
<tb> Maleins <SEP> äure-Styrol-C <SEP> o- <SEP>
<tb> polymeres <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 0,5 <SEP> 95 <SEP> 4320000
<tb> 1 <SEP> :
<SEP> 1 <SEP> Copolymeres <SEP> von <SEP> Maleinsäure-Butylmonoester <SEP> und
<tb> Methylvinyläther <SEP> 0,6 <SEP> 30 <SEP> 3 <SEP> 780 <SEP> 000 <SEP>
<tb>
1) % Gew./Vol., bezogen auf die Trockensubstanzgehalte Beispiel 4 : Der Einfluss der Menge der Polymerlösung G-942 wurde mit Hilfe von Fällungsversuchen bestimmt, bei denen eine Bacillus subtilis-Protease-Lösung mit einem Gehalt von etwa 70 000 DU/ml verwendet wurde. Die Mengen an Niederschlag wurden durch Lösen der nassen Niederschläge und Feststellung der proteolytischen Aktivität bestimmt. Die Niederschläge wurden auf die oben beschriebene Weise gewaschen und getrocknet. Der Polymergehalt der trockenen Niederschläge wurde gemessen.
Die Ergebnisse sind der folgenden Tabelle zu entnehmen :
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EMI9.1
<tb>
<tb> G-942-PolymergeDosis, <SEP> % <SEP> der <SEP> handelsüblichen <SEP> Niederschlag, <SEP> halt <SEP> in <SEP> TrockenG-942-Lösung <SEP> Ausbeute <SEP> in <SEP> % <SEP> präparaten <SEP> in <SEP> % <SEP>
<tb> 0, <SEP> 25 <SEP> 31 <SEP> 10
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> 63
<tb> 1 <SEP> 80
<tb> 2 <SEP> 85 <SEP> 18
<tb> 4 <SEP> 89 <SEP> 25, <SEP> 5 <SEP>
<tb> 8 <SEP> 89
<tb> 16 <SEP> 17
<tb>
Die Tabelle zeigt, dass eine optimale Niederschlagsausbeute bei einer Dosierung von 4 bis 8% derhandelsüblichen G-942-Lösung erhalten wird.
Beispiel 5 : Maleinsäure-Styrol-Komplex von Alcalase.
Einer Lösung von Alcalase (Handelsmarke für ein Enzym, das mit einem Bacillus subtilis erhaltenwurde) wurden 5 Vol.-% einer 1 : 5 verdünnten Lösung von G-942 zugesetzt. Der pH-Wert wurde mit 4n-Essigsäure auf 4, 2 gebracht. Der Niederschlag wurde durch Filtrieren abgetrennt, mit Aceton gewaschen und getrocknet. Das trockene Produkt hatte eine Aktivität von 2 420 000 DU/g. Ausbeute : 92%.
EMI9.2
: Maleinsäure-Styrol-Copolymerkomplex einer Protease.1 : 5-verdünnten Lösung der Polymerlösung G-942 zugesetzt. Der pH-Wert wurde mit 4 n Essigsäure auf 4, 2 gebracht. Der gebildete Niederschlag wurde abzentrifugiert, mit einer Mischung von Methylalkohol und Aceton im Verhältnis l : l gewaschen und getrocknet. Die proteolytische Aktivität betrug 10900000 DU/g.
Ausbeute : 86%.
Beispiel 7 : Maleinsäure-Styrol-Copolymerkomplex von Amylase.
200 ml einer Lösung von Amylase, die von einem Bacillus subtilis erzeugt worden war, wurden 20 ml einer 1: 5-verdünnten Lösung von G-942 zugesetzt. Der pH-Wert wurde mit n-Chlorwasserstoffsäure auf 4, 0 eingestellt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und in einer kleinen Menge Wasser suspendiert. Durch Zusatz von n-Natriumhydroxydlösung wurde der pH-Wert der Suspension auf 7 gebracht und dieser wurden dann 3 Vol.-Teile Aceton zugefügt. Nach Filtrieren, Waschen mit Aceton und Trocknen wurde ein Produkt erhalten, das 81% der ursprünglichen Amylaseaktivität aufwies.
Beispiel 8 : Maleinsäure-Styrol-Copolymerkomplex einer Lipase.
20 ml einer Lösung, die 600 mg eines Lipasepräparates (Lipase-My, hergestellt von der Firma Meito Sangyo Co., Ltd., Nagoya, Japan, aus einer Kulturbrühe von Candida cylindracaea nov. sp.) enthielt und einen pH-Wert von 4, 5 hatte, wurden mit 2 ml einer 1 : 5-verdünnten Lösung von G-942 versetzt. Durch Zusatz von n-Chlorwasserstoffsäure wurde der pH-Wert auf 3, 5 gebracht. Der gebildete Niederschlag wurde abzentrifugiert, mit Aceton gewaschen und getrocknet. Ausbeute : 263 mg eines Produktes mit etwa 90% der ursprünglichen Lipaseaktivität.
Beispiel 9 : Die toxische Wirkung von zwei Proben von proteolytischen Enzympräparaten wurde bestimmt. Eines der Präparate war eine Probe eines Enzyms, das auf üblichem Wege durch Fällung mit einem organischen Lösungsmittel erhalten worden war. Diese Probe wurde mit dem gemäss Beispiel 1 hergestellten Enzym-Polymer-Komplex verglichen. Die Proben wurden mit Natriumsulfat auf eine proteolytische Aktivität von etwa 30000 DU/g standardisiert, in Wasser gelöst und die erhaltenen Lösungen in einer Aussetzungskammer mit Hilfe eines Zerstäubers verteilt. In jeder Kammer befanden sich 5 männliche Mäuse mit einem Gewicht von jeweils 24 g, die aus Carworth Europe, Alconbury, Huntingdon, England, stammten. Die Enzymkonzentration in der Luft betrug beim ersten Versuch 5000 DU/l.
Die Einwirkungszeit war 5 h, und danach wurden die Tiere 7 Tage lang beobachtet. Die Ergebnisse waren wie folgt : Übliches Produkt : 2 Tiere getötet.
Enzym-Polymer-Komplex : keine Tiere getötet.
Bei einem zweiten Versuch wurden achtRatten (gleicher Herkunftsart, vier männliche und vier weibliche Ratten) einer Enzymaktivität von 800 DU/1 während 68 h ausgesetzt. Die Ergebnisse nach 3 Tagen Beobachtung waren die folgenden : Übliches Produkt : 6 Tiere getötet.
Enzym-Polymer-Komplex: keine Tiere getötet.
Bei einem dritten Versuch wurden acht Ratten während fünf aufeinanderfolgender Tage täglich 5 h der Enzymeinwirkung unterworfen. Enzymaktivität : 800 DU/l. Die Tiere wurden 14 Tage lang beobachtet, wobei folgende Ergebnisse erhalten wurden :
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Übliches Produkt : l Tier getötet.
Enzym-Polymer-Komplex : kein Tier getötet.
PATENTANSPRÜCHE : 1. Enzymhaltige Waschmittelmischung, die zusammen mit zumindest einem Waschmittel eine Enzymzusammensetzung enthält, die aus einem Komplex von einem Enzym und einem in wässerigem Alkali löslichen Polymeren aufgebaut ist, das eine gerade oder verzweigte Kohlenstoffkette mit entlang dieser angeordneten Carboxylgruppen hat und ferner eine oder mehrere gegebenenfalls substituierte Kohlenwasserstoffgruppen aufweisen kann, wobei die Kohlenstoffkette und/oder die Kohlenwasserstoffgruppe oder Kohlenwasserstoffgruppen gewünschtenfalls durch Heteroatome, vorzugsweise Sauerstoffatome, unterbrochen sind und das
EMI10.1
ren aufgebaut ist, der durchAnsäuern einer Mischung der wässerigen Enzymlösung und der Lösung des Polymeren, das in Form einer nicht aktivierten Polycarbonsäure verwendet wird,
die vorzugsweise eindurchschnittliches Molekulargewicht von 20 000 hat, bis zur Bildung eines Niederschlages und Abtrennung des Niederschlages erhalten wird.