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Verfahren zur Trennung von Stoffen verschiedener Molekülgrösse
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Zweckmässig wird die Trennung so durchgeführt, dass man eine wässerige Lösung der zu trennenden Stoffe mit unterschiedlichen Molekülgrössen oben auf eine Schicht aus gequollenen Gelkörnern der beschriebenen Art, die sich in einer in ein wässeriges Medium getauchten Säule befinden, aufbringt. Aus der Säule wird Flüssigkeit abgezogen, um die Lösung mit der Gelkörnerschicht in Berührung zu bringen.
Hiebei verteilen sich die in der Lösung befindlichen Stoffe verschiedener Molekülgrösse infolge ihrer je nach ihrer Molekülgrösse unterschiedlichen Fähigkeit, in die Gelkörner einzudringen, unterschiedlich zwischen den Gelkörnern und der umgebenden Lösung, worauf anschliessend zwecks Verdrängung der Flüssigkeit aus der Schicht eine wässerige Flüssigkeit (Eluierungsflüssigkeit) in die Schicht gebracht wird und die aufeinanderfolgenden Fraktionen der verdrängten, aus der Schicht herausfliessenden Flüssigkeit (des Ausflusses) aufgefangen werden, wodurch man eine Fraktion erhält, die einen grösseren Teil der Stoffe mit grösserer Molekulargrösse und danach eine Fraktion gewinnt, die einen grösseren Teil des Stoffes mit kleinerer Molekülgrösse enthält.
Mit den Bezeichnungen wässerige Lösung", "wässeriges Medium" und" wässerige Flüssigkeit" ist hiebei gemeint, dass das Wasser den Hauptbestandteil des Lösungsmittels ausmacht ; es kann aber natürlich auch eine bestimmte Menge eines wasserlöslichen organischen Lösungsmittels, wie Alkohole und Ketone, z. B. niedere aliphatische Alkohole und Ketone, enthalten. Auch braucht das "wässerige Medium" bzw. "die wässerige Flüssigkeit" nicht nur aus dem wasserhaltigen Lösungsmittel zu bestehen, sondern sie kann auch eine bestimmte Menge gelöster Stoffe, z. B. Salze enthalten, um in der Flüssigkeit eine geeignete Ionenkonzentration herzustellen und aufrechtzuerhalten, oder Puffersubstanzen, um einen geeigneten pH-Wert zu erzielen.
Beispiele der erstgenannten Art von Substanzen sind Natriumchlorid und Ammoniumsulfat, Beispiele der zweitgenannten Art sind wasserlösliche Acetate, Phosphate, Chlorate, Essigsäure, Chloressigsäure, Salzsäure und Pyridin.
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Die Fähigkeit der beschriebenen Gelprodukte, in einem wässerigen Medium zu quellen, beruht auf der Gegenwart von Hydroxyl-Gruppen und Ätherbrücken. Diese Quellfähigkeit lässt sich durch die in Gramm angegebene Menge Wasser ausdrücken, die durch ein Gramm des trockenen Gels absorbiert wird, was auch als Wasserwiedergewinn" (WW) bekannt ist. Der Wasserwiedergewinn der erfindungsgemäss verwendeten Gelprodukte liegt bei etwa 1-50 g je Gramm des trockenen Gelproduktes, im allgemeinen bei etwa 1, 0-20 g/g des trockenen Gelproduktes.
Gelprodukte der beschriebenen Art können durch Kondensation organischer, Hydroxylgruppen enthaltender Stoffe, die keine ionogenen Bindungen enthalten, mit bifunktionellen organischen Stoffen, die Halogenatome undjoder Epoxy-Gruppen enthalten, hergestellt werden. Beispiele von für diese Umsetzung geeigneten, Hydroxyl-Gruppen enthaltenden Stoffen sind : Polysaccharide, z. B.
Dextran, Stärke, Dextrin, Cellulose, Polyglukose oder Hydroxylgruppen enthaltende Derivate dieser Stoffe, wie Äthyloxyäthylcellulose oder durch eine teilweise Depolymerisation derselben erhaltende Produkte sowie deren Fraktionen, ferner Polyvinylalkohol, Zuckeralkohole, z. B. Sorbit und Kohlehydrate, z. B. Rohrzucker.
Beispiele von für diese Umsetzung geeigneten bifunktionellen Verbindungen sind : Epichlor-
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Die Mischpolymerisation dieser organischen Hydroxyl-Gruppen enthaltender Stoffe und der bifunktionellen Substanzen geht leicht vor sich, wenn man die Komponenten in wässeriger Lösung in Gegenwart eines alkalisch reagierenden Stoffes als Katalysator umsetzt.
Beispielsweise erhält man ein äusserst brauchbares Gelprodukt dadurch, dass man Dextran (ein aus Glukoseresten aufgebautes Polysaccharid) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 5000 bis 100. 000 mit Epichlorhydrin zu einem ein dreidimensionales hochmolekulares Netzwerk darstellenden Kondensationsprodukt umsetzt, das aus Ketten von hauptsächlich oc-1, 6-g1ycosidisch
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Gel hat einen Gehalt an Hydroxylgruppen von mindestens 15% des Gewichtes des trockenen Gels und einen Wasserwiedergewinn von etwa 1-50 glg bezogen auf trockenes Gelprodukt.
Ein weiteres Beispiel ist ein Gel, das durch Umsetzung von handelsüblichem weissem Dextrin mit Epichlorhydrin gewonnen wird. Dabei erhält man ein aus einem dreidimensionalen hochmolekularen Netzwerk bestehendes Kondensationsprodukt, das aus Ketten von hauptsächlich
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sind. Dieses Gel weist einen Gehalt an HydroxylGruppen von midestens 15% des Gewichtes des trockenen Gels und einen verhältnismässig niedrigen Wasserwiedergewinn von im wesentlichen 1 bis 20 g/g bezogen auf trockenes Gelprodukt auf.
Auf ähnliche Weise kann weiter ein Gelprodukt der gleichen Grundstruktur aus Kartoffelstärke und Epichlorhydrin hergestellt werden. Dieses Gel hat einen höheren Wasserwiedergewinn, d. h.
10-50 g/g des trockenen Gelproduktes.
Weiterhin kann ein geeignetes Gelprodukt durch Umsetzung von Sorbit mit Epichlorhydrin hergestellt werden. Dabei erhält man ein Kondensationsprodukt aus einem dreidimensionalen hochmolekularen Netzwerk aus Sorbitresten, die über Atherbrücken-0-CHa. CH (OH). CH -O- miteinander verbunden sind und einen Gehalt an Hydroxyl-Gruppen von etwa 15% des Gewichtes des trockenen Gels und einen Wasserwiedergewinn von etwa 1 bis 30 g/g aufweisen.
Dieses Kondensationsprodukt eignet sich besonders für Fälle, in denen das Gel mit einer Flüssigkeit von verhältnismässig hoher Acidität, z. B. bei Verwendung von Salzsäure, in Berührung kommt.
Die vorgenannten Gelprodukte, die erfindunggemäss zur Herstellung der Gelschicht verwendet werden, werden bis zu einer Teilchengrösse von 0, 01 bis 2, 0 mm, z. B. von etwa 0, 05 bis 0, 5 mm, u. zw. vorzugsweise so klein, gemahlen, dass sie in nicht gequollenem Zustand ein Sieb mit einer Maschenweite von 56 bis 6560 Maschen je cm2 passieren.
Die Trennwirkung der Gelkörper hängt einerseits von der Molekülgrösse der zu trennenden Stoffe und anderseits von der Porengrösse des dreidimensionalen Netzwerkes des Gelproduktes ab. Die in der wässerigen Lösung befindlichen Stoffe, deren Molekülgrösse zu gross ist, um ein Eindringen in die Gelkörner zu gestatten, verbleiben in der Lösung und passieren die Schicht ausserhalb der Gelkörner. Sie werden in der ersten Fraktion oder den ersten Fraktionen aufgefangen, während die Stoffe, deren Molekülgrösse klein genug ist, um ein Eindringen in die Gelkörner zu gestatten, zeitweilig von den Körnern aufgenommen werden, so dass eine Trennung von den grösseren Molekülen möglich wird und sie in den nachfolgenden Fraktionen aufgefangen werden können.
Die Gelkörnerschicht findet vorzugsweise als Säule Anwendung.
Die Apparatur besteht zweckmässig aus einem zylindrischen Rohr, das unten durch eine poröse Scheibe oder Platte, z. B. eine Sinterglasplatte, die als Halt für die Gelschicht dient, abgeschlossen ist und oben mit Zuleitungsvorrichtungen für die zu behandelnde Lösung der Stoffe verschiedener Molekulargrösse und für die Flüssigkeit der Verdrängung dieser Lösung durch die Säule hindurch (Eluierungsflüssigkeit) versehen ist. Die Gelteilchen, deren Grösse und Wasserwiedergewinn im Hinblick auf die vorzunehmende Trennung gewählt werden, sollen in der Säule so dicht wie möglich und in solcher Menge gepackt werden, dass sie den grössten Teil des gesamten Packvolu-
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mens einnehmen. Der Rest des Packvolumens ist der sogenannte Leerraum, d. h. der gesamte zwischen den Gelkörnern befindliche Raum.
Das kann z. B. folgendermassen erreicht werden : Man lässt die berechnete Menge an Gel mit enger Korngrössenverteilung so lange im Wasser quellen, bis ein Gleichgewicht erreicht ist. Dann wird gerührt, bis eine gleichmässige Suspension erreicht ist. Diese Suspension wird in das Rohr geschüttet, das bereits teilweise mit Wasser gefüllt worden ist. Während des Packens lässt man das Wasser mit gleichmässiger Geschwindigkeit aus der Säule herausfliessen. Dabei kann man beobachten, dass die Packschicht mit scharf abgegrenztem oberem Spiegel nach oben wächst, oberhalb dessen sich die Gelkörner durch Konvektion in ständiger Bewegung befinden.
Ist die Säule gepackt, so sollte dafür Sorge getragen werden, dass der obere Spiegel der Schicht so gleichmässig wie möglich ist. Dann lässt man das Wasser so lange durch die Schicht fliessen, bis der obere Flüssigkeitsspiegel praktisch in der Schicht verschwindet. Darauf wird der Zufluss abgestellt und die zu trennende wässerige Lösung wird sorgfältig von oben auf die Gelschicht geschüttet, worauf das Durchfliessen durch die Schicht durch Absieden von Flüssigkeit erreicht wird. Von diesem Zeitpunkt an wird die aus der Säule ausfliessende Flüssigkeit-im folgenden als Ausfluss bezeichnet-in Fraktionen gesammelt.
Nach dem Eindringen der Lösung wird die Eluierungsflüssigkeit, die im allgemeinen aus Wasser oder eventuell auch aus Puffersubstanzen enthaltendem Wasser besteht, als eine Schicht von oben auf die Gelschicht geschüttet und durch diese hindurchgeschickt. Der erste Ausfluss bei diesem Verfahren besteht aus Wasser, so lange, bis ein dem Leerraum praktisch entsprechendes Volumen verdrängt worden ist. Dann erscheinen in dem Ausfluss die grösseren Moleküle, die nicht in die Gelkörner eindringen können. Diese werden in einer oder mehreren Fraktionen aufgefangen. Anschliessend-z. B. nach einer Zwischenzeit, während der der Ausfluss aus Wasser besteht-erscheinen in dem Ausfluss die kleineren Moleküle, die zeitweilig physikalisch von den Gelkörnern aufgenommen worden sind. Diese werden in einer oder mehreren Fraktionen aufgefangen.
Schliesslich besteht der Ausfluss wiederum aus Wasser. Dann befindet sich die Schicht wieder in ihrem ursprünglichen Zustand und die Trennung einer neuen Menge Lösung kann sofort beginnen.
Auf diese Weise kann man Fraktionen erhalten, die vorwiegend Stoffe mit höherem Molekulargewicht enthalten, oder nur aus solchen bestehen, und andere Fraktionen, die vorwiegend Stoffe mit kleinerer Molekulargrösse enthalten oder nur aus solchen bestehen.
Um eine wirksame Trennung zu erreichen, ist es wichtig, dass das Volumen der wässerigen Lösung der zu trennenden Stoffe, die auf die Gelschicht gebracht wird, nicht das Wasservolumen übersteigt, das durch die gequollenen Gel- körner absorbiert wird. Diese Wassermenge kann durch eine Formel a. WW ausgedrückt werden, in der a das Gewicht der trockenen Gelkörner und WW den Wasserwiedergewinn bedeuten. Die Menge wässeriger Lösung, die die zu trennenden Substanzen enthält, sollte also höchstens a. WW, vorzugsweise kleiner, sein.
Weiterhin ist es wichtig, dass die Fliessgeschwindigkeit der Lösung durch die Gelkörnerschicht nicht zu gross ist. Je nach den Arbeitsbedingungen kann die lineare Fliessgeschwindigkeit bis zu 10 cm/min, vorzugsweise jedoch nicht mehr als 7 cm/min, betragen.
Bisher wurde nur ein diskontinuierlicher Betrieb des Apparates beschrieben, doch lässt sich das Verfahren in geeigneter Weise auch in kontinuierlichen Zyklusstufen durchführen, was z. B. in folgender Weise erfolgen kann :
Sobald noch eine volumenmässig dem Leerraum entsprechende Fraktion, die die kleineren Moleküle enthält, in der Säule ist, wird die wässerige Lösung der im nächsten Zyklus zu trennenden Stoffe von oben auf die Schicht aufgebracht.
Z. B. wird eine Wassersäule kontinuierlich auf der Schicht gehalten und die wässerige Lösung mit den zu trennenden Stoffen in dem unteren Teil der Wassersäule direkt über dem oberen Spiegel der Gelkörnerschicht eingeführt, wo sie eine Schicht bildet, die auf Grund des grösseren spezifischen Gewichtes der wässerigen Lösung das Wasser nach oben verdrängt.
Es hat sich gezeigt, dass Gelkörnerschichten, wie die beschriebenen, auch nach jahrelangem Gebrauch keine Zeichen einer Degeneration aufweisen.
Wird das Verfahren in technischem Massstab durchgeführt, so kann es vorteilhaft sein, wenn in jedem Zyklus nur eine teilweise Trennung bewirkt wird und nur die Fraktionen herausgenommen werden, die einen reinen Stoff, d. h. nur einen der zu trennenden Stoffe enthält, während die andern Fraktionen, die ein Gemisch der Stoffe enthalten, in die Säule zurückgeführt werden, um zusammen mit einer weiteren Menge der Lösung in einem späteren Zyklus wiedereingeführt zu werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann zur Trennung von Stoffen mit sehr verschiedenen Molekülgrössen angewendet werden, wobei als Unterschied der Molekülgrösse ein Unterschied des Molekulargewichtes von mindestens 100 gelten soll. Das für die Trennung verwendete Gel wird im Hinblick auf den im einzelnen angestrebten Zweck, d. h. der zu trennenden Stoffe, des verlangten Trennvermögens und der Fliessgeschwindigkeit durch die Gelkörnerschicht gewählt.
Das vorliegende Verfahren eignet sich insbesondere zur Trennung von kolloiden Stoffen und kristalloiden Stoffen, z. B. zur Abtrennung von Salzen, wie Natriumchlorid oder Ammoniumsulfat, aus Lösungen, die Kolloide, auch unbeständige Kolloide, z. B. Kolloide biologischen Ursprungs, wie Proteine, z. B. Encyme oder
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Viren, enthalten. Weitere Beispiele von Stoffen, die auf diese Art gereinigt, d. h. von Verunreinigungen mit verschiedenen Molekülgrössen getrennt werden können, sind anorganische Kolloide, kolloide Pigmente und Farbstoffe sowie wässerige Dispersionen von Polymerisaten, die durch sogenannte Emulsionspolymerisation hergestellt worden sind.
Besonders geeignet ist das Verfahren zur Abscheidung von Stoffen mit Molekulargewichten von über 500, z. B. über 1000, da sich solche Stoffe oft nur sehr schwer nach andern Verfahren abtrennen lassen.
Das Verfahren kann auch zur Fraktionierung einer Reihe von polymeren Homologen, d. h. zur Trennung von polymeren Homologen mit verschiedenen Molekulargewichten, z. B. zur Fraktionierung von wasserlöslichen Polymeren, wie Dextran oder teilweise depolymerisiertem Dextran, Stärke und Dextrinen, Pektin, Polyäthylenglykolen oder Derivaten solcher Polymerisate angewendet werden.
Oft kann das Verfahren mit Vorteil auch auf die Behandlung von Proteinen oder Polypeptiden, z. B. Plasma-Proteinen, Enzymen, wie Pepsin oder eines Bauchspeicheldrüsenenzyms, oder Hormonen, wie Insulin, oder Gemischen, die Polysaccharide, z. B. bakterielle Polysaccharide, wie Dextran und tierische Polysaccharide, z. B. Heparin, ferner bei Vitaminen, Antibiotica und Alkaloiden angewendet werden.
Wird das Verfahren auf die Trennung sehr komplizierter Gemische, z. B. von Lösungen, die aus biologischen Stoffen erhalten werden, angewendet, so kann man unter Umständen nur eine Gruppentrennung erreichen, wonach zur weiteren Trennung und Reinigung andere Verfahren angewendet werden müssen.
Um die anschliessende Reinigung des jeweiligen Stoffes oder der Stoffe zu erleichtern, kann es in manchen Fällen zweckmässig sein, das Ionenmedium für Stoffe zu wechseln, die nicht in die Gelkörner einzudringen vermögen. So ist es beispielsweise möglich, den pH-Wert und die Ionenkonzentration für eine Proteinlösung, die für die Reinigung und Trennung solcher Stoffe von grosser Bedeutung sind, rasch zu wechseln.
Dies kann dadurch erreicht werden, dass man die Proteinlösung durch eine Gelschicht führt, in der das wässerige Medium die für den Wechsel des pH-Wertes erforderlichen Puffersubstanzen enthält.
Beispiel l : Ein Rohr mit einem Durchmesser von 3, 5 cm und einer Höhe von 50 cm wurde mit 100 g (Trockengewicht) von im Wasser gequollenen Gelkörnern (mit einer Teilchengrösse nach Vermahlung in trockenem Zustand derart, dass sie ein Sieb mit einer Maschenweite zwischen 1650 und 1760 bis 6560 je cm2 passieren ; Wasserwiedergewinn : 2, 6 g/g des trockenen Gels = = WW 2, 6) gefüllt. Die Gelkörner waren durch Umsetzung von 100 g Dextran (mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 40. 000) und 35 g Epichlorhydrin hergestellt. Das Rohr wurde teilweise mit Wasser gefüllt, bevor die Gelkörner eingebracht wurden, u. zw. so, dass letztere mit Wasser bedeckt waren.
Während des Einfüllens der Körner liess man Wasser mit gleichmässiger Geschwindigkeit aus dem Rohr ausfliessen, bis der obere Wasserspiegel in der gepackten Gelschicht praktisch verschwand. Das Gesamtvolumen der gepackten Gelschicht betrug 390 cm 3 und der Leerraum 130 cm3. Anschliessend wurden 5 cm3 einer wässerigen Lösung, die 10 Gew.-% eines für klinische Zwecke bestimmten Dextrans (Molekulargewicht = 75. 000) und 10 Gew.-% Glukose enthielt, auf die Schicht gebracht, wonach diese mit Wasser mit einer Geschwindigkeit von 84 cm S pro Stunde eluiert wurde. Der Ausfluss wurde mittels eines Fraktionensammlers in Fraktionen von etwa 7 cm3 aufgefangen, die dann jede für sich analysiert wurden. Die ersten 130 cm3 des Ausflusses, die dem Leerraum entsprachen, enthielten Wasser.
Die zwischen 130 und 170 cm3 liegende Menge des Ausflusses enthielt das Dextran und die zwischen 240 und 330 cm3 liegende Menge die Glukose. Es wurde eine quantitative Ausbeute erzielt.
Beispiel 2 : Auf eine Säule samt Füllung, die der im Beispiel 1 verwendeten entsprach, wurden 15 cm3 einer wässerigen Lösung gebracht, die 0, 18 g Hämoglobin und 4, 5 g Ammoniumsulfat enthielt. Anschliessend wurde mit Wasser mit einer Geschwindigkeit von 66 cm3 je Stunde eluiert. Die zwischen 130 und 230 cm3 liegende Menge des Ausflusses enthielt das Hämoglobin und die zwischen 230 und 340 cm3 liegende Menge das Ammoniumsulfat. Es wurde eine quantitative Ausbeute erzielt.
Beispiel 3 : Eine rohrförmige Säule mit einem Durchmesser von 7, 2 cm und einer Höhe von 50 cm wurde wie in Beispiel 1 mit 300 g (Trockengewicht) von in Wasser gequollenen Gelkörnern (die in trockenem Zustand eine solche Teilchengrösse aufweisen, dass sie ein Sieb mit einer Maschenweite von 400 bis zwischen 1600 und 1760 je cm2 passieren ; WW = 4, 9) gepackt. Die Körner waren durch Umsetzung von 100 g Dextran (Molekulargewicht = 40. 000) mit 18 g Epichlorhydrin hergestellt worden. Das Gesamtvolumen der aus der Gelsubstanz gebildeten Schicht betrug 2000 cm, der Leerraum 650 cm3.
Auf die Schicht wurden 100 cm3 einer 10%igen wässerigen Lösung eines Dextrangemisches mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 4000 gebracht, wonach mit Wasser mit einer Geschwindigkeit von 240 ces je Stunde eluiert wurde. Die ersten 650 cm3 des Ausflusses, die dem Leerraum entsprachen, wurden weggegossen, wonach mittels eines Fraktionensammlers 100 Fraktionen von je 17 cm3 aufgefangen wurden. Durch Umsetzung mit Anthron wurde die in jeder einzelnen Fraktion enthaltene Menge an Kohlehydrat bestimmt. Die Fraktionen 8 bis einschliesslich 95 enthielten Kohlehydrat. Das durchschnittliche Molekulargewicht wurde für jede 5. Fraktion bestimmt, in der der Gehalt an Substanzen genügend hoch war.
Hiefür wurden nacheinander
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folgende Werte erhalten : 5000, 4600,4300, 4300, 3100,2900, 2200,1700, 1600,1300, 950,610, 400 und 180.
Beispiel 4 : Eine rohrförmige Säule mit einem Durchmesser von 2 cm und einer Höhe von 40 cm wurde wie in Beispiel 1 mit 7 g (Trockengewicht) Gelkörnern (WW = 10, 0) gepackt. Die Gelkörner liess man zuvor in als Puffersubstanz verwendetem 0, 1-molarem Natriumphosphat mit einem pH-Wert von 7 quellen. Die Gelsubstanz wurde durch Umsetzung von 100 g Äthoxyäthylcellulose mit 75 g Äthylenglykol-bis-epoxypropyl- äther hergestellt. Das Gesamtvolumen der Gelschicht betrug 105 cm und das des Leerraumes 38 cm3. Auf die Schicht wurden 5 cms einer wässerigen Lösung von 60 mg Hämoglobin und 1, 5 g Ammoniumsulfat in einem Phosphat-Puffer gebracht, wonach mit einer Phosphat-Pufferlösung (0, 1 molar, pH-Wert = 7) eluiert wurde.
In dem Eluat erschienen Hämoglobin in PhosphatPufferlösung zwischen 40 und 55 cm und Ammoniumsulfat in Phosphat-Puffersubstanz zwischen 55 und 105 cm3.
Beispiel 5 : Eine Säule mit einem Durchmesser von 4 cm wurde mit 32 g (Trockengewicht) Gelkörnern (die in trockenem Zustand eine solche Teilchengrösse besitzen, dass sie ein Sieb mit einer Maschenweite von zwischen 1600-1760 und 6560 je cm 2 passieren ; WW = 6) gepackt. Die Gelkörner waren durch Umsetzung von 100 g Stärke mit 70 g Glyzerin-1, 3-dichlorhydrin hergestellt worden. Die Gesamtmenge der Gelschicht betrug 314 cm3. In die Säule wurden 5 cm3 einer wässerigen Lösung eingebracht, die 200 mg menschliches Serum-Albumin und 200mg Natriumchlorid enthielt. Die Schicht wurde mit Wasser mit einer Geschwindigkeit von 120 cm3 je Stunde eluiert und Fraktionen von 5, 5 cm3 wurden aufgefangen. Das Albumin erschien in dem Eluat zwischen 95 und 140 cm3 und das Salz zwischen 270 und 330 cm3.
Beispiel 6 : Eine Säule mit einem Durchmesser von 3 cm wurde bis zu einer Höhe von 45 cm mit gequollenem pulverförmigem Gel (mit einer solchen Teilchengrösse, dass dieses ein Sieb mit einer Maschenweite von 6560 bis 22. 500 je cm2 passiert ; WW = 4, 9) gefüllt. Dieses Gel wurde zuvor durch Umsetzung von 100 g Dextran (Molekulargewicht = 40. 000) mit 18 g Epichlorhydrin hergestellt. Die Schicht aus der Gelsubstanz wurde mit Phosphatpuffer (Ionenkonzentration = 0, 03 ; pH-Wert = 7, 03) gewaschen, bis ein Gleichgewicht erreicht wurde. Dann führte man 25 cm3 frisches menschliches Serum und anschliessend Phosphat-Puffer in die Schicht ein.
Der Ausfluss wurde in einem Fraktionssammler, in dem die Rohre alle 15 min gewechselt wurden, so dass man eine Fliessgeschwindigkeit von 28 cm3 je Stunde erzielte, in Fraktionen von 7 cm3 aufgefangen. In jeder Fraktion wurde Protein (nach Folin-Lowry), Aminosäuren, Peptide und nukleotides Material ermittelt (die Peptide durch Ninhydrin und das nukleotide Material durch Ultraviolett-Absorption). Das Protein erhielt man in den Fraktionen 5-12, die Peptide und die Aminosäuren in den Fraktionen 20-40 und das nukleotide Material in den Fraktionen 42-60.
Beispiel 7 : Eine zylindrische Schicht mit einem Durchmesser von 3 cm und einer Höhe von 22 cm wurde mit gequollenen Gelkörnern (WW = 4, 5), die durch Umsetzung von 100 g Dextran mit 22 g Epichlorhydrin hergestellt worden waren, gepackt. Zwei Versuche wurden angestellt, um den Einfluss des Assoziationsgrades von Insulin auf dessen Adsorption an und in den Gelkörnern und dessen Verdrängung und Eluierung von den Körnern zu ermitteln : a) Die Schicht wurde in ein Gleichgewicht mit einer l-molaren Acetatpuffersubstanz (pH-Wert = = 3, 95) gebracht. Dann wurde 1 cm3 einer 0,51%gen Insulinlösung in einer solchen Puffersubstanz in die Schicht eingeführt und diese mit der Puffersubstanz eluiert.
Da das Insulin bei dem erwähnten pH-Wert assoziiert ist und deshalb nicht in die Gelkörner hineindringen kann, erschien es in dem Ausfluss zwischen 55 und 65 cm3. b) Die Schicht wurde in ein Gleichgewicht mit 1% figer Dichloressigsäure in Wasser gebracht (pH-Wert = 1, 5). 1 cm3 einer 0,42%gen Insulinlösung wurde in die Schicht eingeführt und diese mit der Dichloressigsäure-Lösung eluiert. Da das Insulin bei diesem pH-Wert monomer ist und deshalb in die Gelkörner eindringen kann, war es erst in dem Ausfluss zwischen 80 und 100 cm3 enthalten.
Beispiel 8 : Eine zylindrische Schicht mit einem Durchmesser von 4 cm und einer Höhe von 37 cm wurde mit trockenen Gelkörnern einer solchen Teilchengrösse, dass sie ein Sieb mit einer Maschenweite von zwischen 1600 und 1760 bis 6560 je cm2 passieren (WW = 4, 2) gefüllt. Diese Gelkörner waren durch Umsetzung von 100 g Dextran (Molekulargewicht = 20. 000) mit 27 g Epichlorhydrin hergestellt worden. Die Schicht wurde mit 0, 1 molarem Phosphat-Puffer (pH-Wert = 7, 0) gewaschen. Dann wurden 5cm3 einer wässerigen Lösung, die 0, 11% der antibiotischen Substanz Polymyxin B (Biochem.
Taschenbuch, Springer Verlag 1956, Seite 474) enthielt, auf die Schicht gebracht und anschliessend wurde 0, 1 molarer Phosphatpuffer mit einer Geschwindigkeit von 101 cm3 je Stunde eingeführt.
Bei dieser ersten Versuchsvariante ist vorausgesetzt, dass die Lösung des Polymyxins auch hochmolekulare Verunreinigungen enthält. Bei der Eluierung gehen die hochmolekularen Verunreinigungen ausserhalb der Gelkörner vorbei und erscheinen deshalb in dem ersten Ausfluss, während das Polymyxin in die Gelkörner hineindringt und deshalb erst in dem späteren Ausfluss zwischen 300 und 400 cm3 enthalten ist. Das Polymyxin wird in dieser Weise von den hochmolekularen Verunreinigungen befreit.
In einem andern Versuch wurden 5 cm einer Lösung, die 0, 15% Polymyxin und 1% Natrium- salz des Schwefelsäureesters des Dextrans (Molekulargewicht = 1, 000. 000) auf die Schicht ge-
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bracht. Anschliessend wurden 0, 1% Phosphatpuffer mit einer Geschwindigkeit von 100 cm3 je
Stunde eingeführt. Bei der zweiten Versuchsvariante ist vorausgesetzt, dass die Lösung des Polymyxins sowohl hochmolekulare als auch niedrigmolekulare Verunreinigungen enthält.
Da das Polymyxin hier mit dem Dextransulfat zu einem Assoziationskomplex hohen Molekulargewichtes zusammengekuppelt ist, geht dieser Komplex bei der Eluierung ausserhalb der Gelkörner vorbei und erscheint bereits im Ausfluss zwischen 250 und 300 cm3. Das Polymyxin wird in dieser Weise von den niedrigmolekularen Verunreinigungen befreit, die in die Gelkörner hineindringen können und deshalb erst in einem späteren Ausfluss erscheinen.
Nach der Eluierung wird der zusammen mit den hochmolekularen Verunreinigungen erhaltene Komplex durch Abänderung des pH-Wertes zersetzt. Von diesen hochmolekularen Verunreinigungen wird das Polymyxin dann durch Eluierung nach der ersten Versuchsvariante befreit. In letzterem Fall handelt es sich also um eine Zweistufenreinigung des Polymyxins.
Beispiel 9 : Eine Säule mit einem Durchmesser von 1, 5 cm und einer Höhe von 22 cm wurde mit im Wasser gequollenen Gelkörnern (mit einer solchen Teilchengrösse in trockenem Zustand, dass sie ein Sieb mit einer Maschenweite von zwischen 1600 und 1760 bis 6560 je cm2 pas- sieren ; WW = 2, 7) gepackt. Die Gelkörner waren zuvor durch Umsetzung von 100 g Dextran (Molekulargewicht = 40. 000) mit 28 g bis-Epoxypropyläther hergestellt worden. Das Gesamtvolumen der Gelschicht betrug 36 cm3. In die Schicht wurde 1 cm3 einer wässerigen Lösung, die 10 mg menschliches Serum-Albumin und 100mg Natriumchlorid enthielt, eingeführt. Die Schicht wurde mit Wasser mit einer Geschwindigkeit von 95 cm3 je Stunde eluiert und Fraktionen von jeweils 3 cm in einem Fraktionensammler aufgefangen.
Das Albumin erschien in den Fraktionen 5 und 6, und das Salz in den Fraktionen 8-10.
Beispiel 10 : Die Säule des Beispieles 9 wurde mit gequollenen Gelkörnern (mit einer solchen Teilchengrösse in trockenem Zustand, dass sie ein Sieb mit einer Maschenweite von zwischen 1600 und 1760 bis 6560 je cm2 passieren ; WW = = 1, 3) gefüllt, die durch Umsetzung von 100 g Dextrin mit 30 g Epichlorhydrin hergestellt worden waren ; das Gesamtvolumen der Schicht betrug 35 cm3. In die Säule wurde 1 cm3 einer wässerigen Lösung, die 10 mg menschliches Serum-Albumin und 100 mg Natriumchlorid enthielt, eingeführt. Die Schicht wurde mit Wasser mit einer Geschwindigkeit von 36 cm3 je Stunde eluiert und Fraktionen von jeweils 3 cm3 aufgefangen. Das Albumin erschien in den Fraktionen 4-6 und das Salz in der Fraktion 8 bis 10.
Beispiel 11 : Eine Säule mit einem Durchmesser von 1, 5 cm und einer Höhe von 20 cm wurde mit Gelkörnern (mit einer solchen Teilchengrösse, dass sie ein Sieb mit einer Maschenweite von 108 bis zwischen 1600 und 1760 je cm2 passieren, WW = 2, 2) gepackt, die durch Umsetzung von 100 g Stärke mit 60 g bis-Epoxypropyläther hergestellt worden waren ; das Gesamtvolumen der Schicht betrug 36 cm3. In die Schicht wurde 1 cm einer wässerigen Lösung, die 10 mg menschliches Serum-Albumin und 100 mg Natriumchlorid enthielt, eingeführt. Die Schicht wurde mit Wasser mit einer Geschwindigkeit von 120 cm3 je Stunde eluiert und Fraktionen von jeweils 3 cm aufgefangen. Das Albumin erschien in den Fraktionen 4-6 und das Salz in den Fraktionen 8-10.
Beispiel 12 : Die Säule des Beispieles 11 wurde mit Gelkörnern (mit einer solchen Teilchengrösse, dass sie ein Sieb mit einer Weite von 400 bis 11. 500 Maschen je cm2 passieren ; WW = 1, 6) gefüllt, die durch Umsetzung von 100 g Dextran mit 29 g 1, 2, 3, 4-Diepoxybutan hergestellt worden waren ; das Gesamtvolumen der Gelschicht betrug 35 cm3. In die Schicht wurde 1 cm3 einer wässerigen Lösung eingeführt, die 10 mg menschliches Serum-Albumin und 100 mg Natriumchlorid enthielt. Die Schicht wurde mit Wasser mit einer Geschwindigkeit von 7 cm3 je Stunde eluiert und Fraktionen von jeweils 3, 5 cm3 aufgefangen. Das Albumin erschien in den Fraktionen 4 und 5 und das Salz in den Fraktionen 8 bis 10.
Beispiel 13 : Eine Säule mit einem Durchmesser von 3 cm wurde mit Gelkörnern (einer solchen Teilchengrösse in trockenem Zustande, dass sie ein Sieb mit einer Weite von zwischen 1600 und 1760 bis 6560 Maschen je cm2 passieren ; WW = 2, 1) gepackt, die durch Umsetzung von 100 g Dextran mit 50 g 1, 4-Butandiol-diepoxypro- pyläther hergestellt worden waren ; das Gesamt-
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Versuchsbeginn wurde die Schicht mit einer 10% igen Lösung von Äthanol in Wasser gewaschen. In die Schicht wurden 3 cm3 einer Lösung von 30 mg Dextran (Molekulargewicht = = 40. 000) und 30 mg Glukose in 10%igen wässerigen Äthanol eingeführt. Dann wurde mit 10%gem wässerigem Äthanol mit einer Geschwindigkeit von 180 cm3 je Stunde eluiert und der Ausfluss in Fraktionen von 5, 5 cm3 aufgefangen.
In dem Ausfluss erschien das Dextran zwischen 103 und 120 cm3 und die Glukose zwischen 180 und 213 cm3.
Beispiel 15 : Eine Säule mit einem Durchmesser von 3, 5 cm wurde mit Gelkörnern (einer solchen Teilchengrösse in trockenem Zustand, dass sie ein Sieb mit einer Weite von 400 bis zwischen 1600 und 1760 Maschen je cm2 passieren ; WW = = 9, 0) gepackt, die durch Umsetzung von 100 g Sorbit mit 110 g Epichlorhydrin hergestellt worden waren. Das Schichtvolumen betrug 219 cm3.
In die Schicht wurden 5 cm3 einer Lösung eingeführt, die 200 mg menschliches Serum-Albumin und 100 mg Natriumchlorid enthielt. Anschlie- ssend wurde die Schicht mit Wasser mit einer Ge- schwindigkeit von 100 cm3 je Stunde eluiert.
In dem Ausfluss erschien das Albumin zwischen 75
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und 110cm3 und das Natriumchlorid zwischen 190 und 225 cm3.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Trennung von Stoffen verschiedener Molekülgrösse, bei dem eine Lösung der Stoffgemische mit einer Schicht aus Gelkörnern, welche die Stoffe in Abhängigkeit von ihrer Molekülgrösse selektiv aus der Lösung zu adsorbieren vermögen, in Berührung gebracht wird und bei dem Fraktionen der getrennten Stoffe durch Eluierung mit einer oder mehreren Flüssigkeiten nacheinander aus der Schicht gewonnen werden, dadurch gekennzeichnet, dass in den verwendeten Lösungsmitteln unlösliche, jedoch darin quellbare Gelkörner verwendet werden, die aus einem dreidimensional vernetzten hochmolekularen Kondensationsprodukt ohne ionogene Bindungen bestehen, in welchem natürliche oder synthetische organische Polyhydroxylverbindungen durch kovalente Bindungen in Form von Ätherbrücken, vorzugsweise solchen der allgemeinen Formel :
-0-X-0-, worin X einen aliphatischen, 3-10 Kohlenstoffatome enthaltenden Rest mit Hydroxylgruppen bedeutet, miteinander verbunden sind und dessen Gehalt an Hydroxylgruppen mindestens 12% des Gewichtes des Gels beträgt.