TWI541023B - 在生理ｐｈ緩衝液中呈現增強之溶解度及穩定性之升糖激素類似物 - Google Patents

Description

在生理PH緩衝液中呈現增強之溶解度及穩定性之升糖激素類似物

本申請案主張以下各案之優先權：2008年6月17日申請之美國臨時專利申請案第61/073,193號、2008年7月3日申請之美國臨時專利申請案第61/078,165號及2008年8月20日申請之美國臨時專利申請案第61/090,415號。各申請案之揭示內容係以其全文引用的方式明確併入本文中。

前升糖激素原(Pre-proglucagon)為在不同組織中加工以形成許多不同升糖激素原來源肽之158個胺基酸前驅體多肽，該等升糖激素原來源肽包括升糖激素、升糖激素狀肽-1(GLP-1)、升糖激素狀肽-2(GLP-2)及調酸素(oxyntomodulin，OXM)，其涉及多種生理機能，包括葡萄糖穩定、胰島素分泌、胃排空及腸生長，以及調節食物攝取。升糖激素為對應於前升糖激素原之胺基酸33至61的29個胺基酸肽，而GLP-1係產生為對應於前升糖激素原之胺基酸72至108之37個胺基酸肽。

當血糖含量降得過低以致不能為身體活動提供足夠能量時出現低血糖症。在成年人或10歲以上兒童中，除作為糖尿病治療之副作用外，低血糖症為罕見的，但其可由其他藥物或疾病、激素或酶缺乏或腫瘤引起。當血糖開始下降時，由胰腺產生之激素-升糖激素向肝臟發送信號以分解肝糖且釋放葡萄糖，使得血糖含量向正常含量上升。因此，升糖激素在葡萄糖調節中之最認可作用為抵抗胰島素作用且維持血糖含量。然而對於糖尿病而言，對低血糖症之此升糖激素反應可被削弱，使得葡萄糖含量較難以回至正常範圍。

低血糖症為危及生命之事件，其需要緊急醫學照護。投與升糖激素為用於治療急性低血糖症之經確立藥療且其可在投與數分鐘內恢復葡萄糖之正常含量。當將升糖激素用於低血糖症之急性醫藥治療中時，以稀酸緩衝液溶解結晶形式升糖激素且肌肉內注射該溶液。儘管此治療為有效的，但該方法對於某些半意識者而言為麻煩且危險的。因此，需要維持母體分子之生物效能但在相關生理條件下足夠可溶且穩定之升糖激素類似物，其可預調配為備用於注射之溶液。

另外，促使糖尿病患者維持接近正常之血糖含量以延遲或預防微血管併發症。此目標之實現通常需要密集胰島素療法(intensive insulin therapy)。在爭取實現此目標中，醫師已遭遇其糖尿病患者之低血糖症之頻率及嚴重性的顯著增長。因此，需要誘發低血糖症之可能性小於當前胰島素療法之經改良醫藥及方法以便治療糖尿病。

如本文所述，提供高效能升糖激素促效劑，其在生理pH值下在適於商業用途之醫藥組合物中呈現增強之生物物理穩定性及水溶性。原生升糖激素在生理pH範圍內既不可溶亦不穩定，且由此必須製造為需要復水及即刻使用之乾燥產物。本文所述之升糖激素類似物具有增強之物理特性，使得其對用於當前醫學背景(目前採用原生激素)而言為優良的。可根據一個實施例來使用此等化合物以製備備用於注射以治療低血糖症之預調配溶液。或者，升糖激素促效劑可與胰島素共投與以緩衝胰島素之作用以允許更穩定地維持血糖含量。另外，下文詳細描述包含本文所揭示之經修飾升糖激素肽之組合物的其他有利用途。

本發明之一個實施例提供保持升糖激素受體活性且比原生升糖激素肽(SEQ ID NO:1)具有改良之溶解度之升糖激素肽。原生升糖激素在水溶液中，尤其在生理pH值下呈現不良溶解度，容易隨時間聚集及沈澱。反之，在pH值6與8之間或在6與9之間，例如在pH 7下，在25℃下24小時之後，本發明之一個實施例的升糖激素肽之溶解度為原生升糖激素之至少2倍、5倍或甚至5倍以上。

在一實施例中，升糖激素肽保持原生升糖激素活性之至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%活性、80%活性、85%活性或90%(由升糖激素肽相對於升糖激素之EC₅₀的反比計算，例如，如使用實例13中一般描述之檢定，由cAMP產量來量測)。在一實施例中，本發明之升糖激素肽具有與升糖激素相同或比其更大之活性(在本文中與術語「效能」為同義字使用)。在一些實施例中，升糖激素肽保持原生升糖激素活性達至高約100%、1000%、10,000%、100,000%或1,000,000%。

升糖激素對GLP-1受體之活性通常為原生GLP-1之活性的約1%。GLP-1(7-36)醯胺(SEQ ID NO:57)或GLP-1(7-37)酸(SEQ ID NO:58)為GLP-1之生物學上有效形式，此點證實其對GLP-1受體基本上具有等效活性。升糖激素對升糖激素受體之選擇性亦比GLP-1受體高10至20倍(以升糖激素對升糖激素受體相對於對GLP-1受體之EC₅₀的反比計算之選擇性)。舉例而言，若檢定中，升糖激素對升糖激素受體之EC₅₀為0.22nM，而升糖激素對GLP-1受體之EC₅₀為3.85nM時，計算出的選擇性為17.5倍。例如可使用在實例13中一般描述之檢定，藉由cAMP產量來量測活性。在一些實施例中，本發明之升糖激素肽對GLP-1受體之活性比原生GLP-1之活性小約5%、4%、3%、2%或1%及/或對升糖激素受體之選擇性比對GLP-1受體之選擇性高約5倍、10倍或15倍。舉例而言，在一些實施例中，本發明之升糖激素肽對GLP-1受體之活性比原生GLP-1之活性小約5%且GLP-1受體之選擇性比現對升糖激素受體之選擇性高5倍。

本發明之升糖激素肽中任一者亦可具有改良之穩定性及/或降低之降解性，例如在25℃下24小時之後保持原始肽之至少95%。在一些實施例中，本發明之升糖激素肽具有改良之穩定性，使得在至少20℃(例如21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、至少27.5℃、至少30℃、至少35℃、至少40℃、至少50℃)且小於100℃、小於85℃、小於75℃或小於70℃之溫度下的溶液中，在1週或1週以上(例如，2週、4週、1個月、2個月、4個月、6個月、8個月、10個月、12個月)之後，紫外線(UV)偵測器在280nm下可偵測到至少75%(例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、大於95%、至多100%)之肽濃度或小於約25%(例如小於20%、小於15%、小於10%、小於5%、4%、3%、2%、1%，直到0%)之降解肽。

根據一實施例，升糖激素肽具備經改良之溶解度，其中該肽係藉由胺基酸取代及/或添加來修飾，該等取代及/或添加將帶電胺基酸引入肽之C末端部分，且在一實施例中引入SEQ ID NO:1之位置27之C末端的位置。視情況，可將一個、兩個或三個帶電胺基酸引入C末端部分且在一實施例中引入位置27之C末端。根據一實施例，位置28及/或29之原生胺基酸係經帶電胺基酸取代，且/或將1至3個帶電胺基酸添加至位置29之後的肽之C末端。在例示性實施例中，帶電胺基酸中一者、兩者或所有者均帶負電。可對升糖激素肽進行仍允許其保持升糖激素活性之額外修飾，例如保守性取代。

根據一例示性實施例，升糖激素肽包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列，或其相對於原生升糖激素含有1至3個其他胺基酸修飾之類似物，或其升糖激素促效劑類似物。SEQ ID NO:11表示經修飾之升糖激素肽，其中原生蛋白質之位置28處之天冬醯胺殘基已被天冬胺酸取代。在另一例示性實施例中，升糖激素肽包含SEQ ID NO:38之胺基酸序列，其中原生蛋白質之位置28處之天冬醯胺殘基已被麩胺酸取代。其他例示性實施例包括SEQ ID NO:24、25、26、33、35、36及37之升糖激素肽。

根據另一實施例，提供在升糖激素受體處具有增強之效能的升糖激素肽，其中該等肽包含原生升糖激素(SEQ ID NO:1)之位置16處的胺基酸修飾。作為非限制性實例，此增強之效能可藉由以麩胺酸或以具有長度為4個原子之側鏈的另一帶負電胺基酸，或者以麩胺醯胺、高麩胺酸(homoglutamic acid)或高磺基丙胺酸(homocysteic acid)中任一者，或具有含有至少一個雜原子(例如N、O、S、P)之側鏈且側鏈長度為約4(或3-5)個原子的帶電胺基酸在位置16取代天然存在之絲胺酸來提供。以麩胺酸取代位置16之絲胺酸將升糖激素受體處之升糖激素活性增強至少2倍、4倍、5倍及多達10倍以上。在一些實施例中，升糖激素肽保持對升糖激素受體相對於GLP-1受體之選擇性，例如至少5倍、10倍或15倍選擇性。

前述化合物中任一者之溶解度可藉由使親水部分與肽連接來進一步改良。例如由循環中延長之半衰期所量測，引入此等基團亦增加作用之持續時間。在一實施例中，親水部分為聚乙二醇(PEG)鏈或其他水溶性聚合物，其係與該升糖激素肽之位置16、17、21、24、29、40中一或多處、在C末端延伸內或在C末端胺基酸處之胺基酸殘基的側鏈共價鍵聯。在一些實施例中，該位置處之原生胺基酸係經具有適於與親水部分交聯之側鏈的胺基酸取代以促進親水部分與肽鍵聯。例示性胺基酸包括Cys、Lys、Orn、高Cys或乙醯基苯丙胺酸(Ac-Phe)。在其他實施例中，將經修飾以包含親水基之胺基酸於C末端添加至肽中。根據一實施例之聚乙二醇鏈具有選自約500道爾頓(Dalton)至約40,000道爾頓之範圍的分子量。在一實施例中，聚乙二醇鏈具有選自約500道爾頓至約5,000道爾頓之範圍的分子量。在另一實施例中，聚乙二醇鏈具有約10,000道爾頓至約20,000道爾頓之分子量。在其他例示性實施例中，聚乙二醇鏈具有約20,000道爾頓至約40,000道爾頓之分子量。

根據一些實施例，本文所揭示之升糖激素肽係經修飾以包含醯基或烷基，例如對天然存在之胺基酸而言為非原生之醯基或烷基。醯化或烷基化作用可增大循環中升糖激素肽之半衰期，可有利地延遲作用之起始且/或延長在升糖激素及/或GLP-1受體處之作用持續時間，且/或改良對諸如DPP-IV之蛋白酶的抗性。醯化或烷基化作用亦可增強肽在中性pH值下之溶解度。如在本文中所示，升糖激素肽在升糖激素受體及GLP-1受體處之活性在醯化之後若非增強則維持。

在一些態樣中，升糖激素肽係經由間隔基(例如胺基酸、二肽、三肽、親水性雙官能間隔基或疏水性雙官能間隔基)與醯基或烷基共價連接。在某些態樣中，一旦以間隔基使肽醯化即觀察到在GLP-1及升糖激素受體處活性之增強。在所選態樣中，諸如當肽無分子內橋(例如共價分子內橋)時，一旦以間隔基使肽醯化即觀察到在GLP-1及升糖激素受體處活性如與醯化肽(其中醯基未經間隔基即與肽連接)相比進一步增強。根據一些實施例，間隔基為胺基酸或具有胺基酸之二肽，或長3至10個原子(例如6至10個原子)之肽主鏈結構。根據某些特定實施例，間隔基與醯基或烷基之總長為14至28個原子，例如17至28個、19至26個原子、19至21個原子。在本文中進一步描述為增強升糖激素活性之目的之合適間隔基。在一些實施例中，本文所述之醯化或烷基化肽進一步包含選擇性降低在GLP-1受體處活性之修飾，例如修飾位置7之Thr，諸如以無羥基之胺基酸(例如胺基丁酸，Abu)或Ile)取代位置7之Thr；刪除位置27或28處胺基酸C末端之胺基酸(例如，刪除位置28及29處胺基酸中一或兩者)，從而產生長為27或28個胺基酸之肽。

升糖激素肽可在鍵聯親水部分之相同胺基酸位置，或在不同胺基酸位置醯化或烷基化。在一些實施例中，本發明提供一種經修飾以包含與升糖激素肽之位置10的胺基酸共價鍵聯之醯基或烷基的升糖激素肽。升糖激素肽可進一步包含在升糖激素肽之位置10之胺基酸與醯基或烷基之間的間隔基。在一些實施例中，醯基為脂肪酸或膽汁酸(bile acid)或其鹽，例如C₄至C₃₀脂肪酸、C₈至C₂₄脂肪酸、膽酸(cholic acid)、C₄至C₃₀烷基、C₈至C₂₄烷基，或包含膽汁酸(bile acid)之類固醇部分的烷基。間隔基為具有連接醯基或烷基之合適反應性基團的任何部分。在例示性實施例中，間隔基包含胺基酸、二肽、三肽、親水性雙官能間隔基，例如胺基聚(烷氧基)羧酸酯，或疏水性雙官能間隔基。在一些實施例中，間隔基係選自由以下各物組成之群：Trp、Glu、Asp、Cys及包含NH₂(CH₂CH₂O)_n(CH₂)_mCOOH之間隔基，其中m為1至6之任何整數且n為2至12之任何整數。此等醯化或烷基化升糖激素肽亦可進一步包含親水部分，視情況聚乙二醇。前述升糖激素肽中任一者可包含兩個醯基或兩個烷基，或其組合。

本發明另外涵蓋該等升糖激素促效劑之醫藥學上可接受之鹽。

在其他例示性實施例中，可藉由將第二肽添加至升糖激素肽之羧基末端來進一步修飾前述化合物中任一者以改變其醫藥特性。在一實施例中，升糖激素肽經由肽鍵與第二肽共價結合，其中該第二肽包含選自由SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22組成之群的序列。

在一些實施例中，位置1或2之修飾可增加肽被二肽基肽酶IV(DPP IV)裂解之抗性。舉例而言，位置2之胺基酸可經D-絲胺酸、D-丙胺酸、纈胺酸、甘胺酸、N-甲基絲胺酸、N-甲基丙胺酸或胺基異丁酸取代。或者，或另外，位置1之胺基酸可經D-組胺酸(D-His)、去胺基組胺酸、羥基-組胺酸、乙醯基-組胺酸、高組胺酸、N-甲基組胺酸、α-甲基組胺酸、咪唑乙酸或α,α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)取代。

觀察到位置2之修飾(例如位置2之AIB)及在一些情況下位置1之修飾(例如位置1之DMIA)可(有時顯著)降低升糖激素活性；令人驚訝地，此升糖激素活性降低可藉由升糖激素之C末端部分(約胺基酸12-29)中α螺旋結構的穩定化而恢復。在一些實施例中，穩定化係經由位置「i」與「i+4」處胺基酸之間的共價鍵，其中i為12至25之任何整數。在一些特定實施例中，「i」與「i+4」為12與16，16與20，或20與24，或24與28。在一些實施例中，此共價鍵為位置16之麩胺酸與位置20之離胺酸之間的內醯胺橋。在例示性實施例中，橋或連接子長為約8(或約7-9)個原子。在其他實施例中，穩定化係經由位置「j」與「j+3」處胺基酸之間的共價鍵，其中j為介於12與27之間的任何整數。在例示性實施例中，橋或連接子長為約6(或約5-7)個原子。在其他實施例中，穩定化係經由位置「k」與「k+7」處胺基酸之間的共價鍵，其中k為在12與22之間的任何整數。在一些實施例中，此共價鍵為分子內橋而非內醯胺橋。舉例而言，合適共價結合方法(亦即形成共價分子內橋之手段)包括以下各方法中任一或多者：烯烴複分解、基於羊毛硫胺酸之環化、雙硫橋或經修飾含硫橋形成、使用α,ω-二胺基烷烴繫鏈(tether)、形成金屬原子橋，及肽環化之其他手段。

在其他實施例中，藉由非共價鍵(亦即非共價分子內橋)使螺旋穩定化，該等非共價鍵包括(但不限於)氫鍵結、離子相互作用及鹽橋。

在本發明之其他實施例中，升糖激素肽之C末端部分(約胺基酸12-29)中之α螺旋結構的穩定化係經由在保持所需活性之位置處有目的地引入一或多個α,α-二取代胺基酸來達成。在一些實施例中，升糖激素肽之位置16、17、18、19、20、21、24或29中一者、兩者、三者、四者或四者以上係經α,α-二取代胺基酸取代。舉例而言，以胺基異丁酸(AIB)取代升糖激素肽之位置16在不存在鹽橋或內醯胺之情況下提供穩定化α螺旋。在本文中將此等肽視作無分子內橋之肽。在特定態樣中，α螺旋之穩定化係藉由引入一或多個α,α-二取代胺基酸而未引入共價分子內橋(例如內醯胺橋、雙硫橋)來實現。在本文中將此等肽視作無共價分子內橋之肽。在一些實施例中，位置16、20、21或24中一者、兩者、三者或三者以上係經AIB取代。

因此，在一些實施例中，本發明提供一種具有升糖激素促效劑活性之升糖激素肽，其包含以下胺基酸序列：X1-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Z(SEQ ID NO:39)，其中具有1至3個胺基酸修飾，其中X1及/或X2為降低升糖激素肽被二肽基肽酶IV(DPP-IV)裂解之敏感性(或增加被該DPP-IV裂解之抗性)的非原生胺基酸，其中Z係選自由以下各物組成之群：-COOH(天然存在之C末端羧酸酯)、-Asn-COOH、Asn-Thr-COOH及Y-COOH，其中Y為1至2個胺基酸，且其中分子內橋(較佳為共價鍵)連接位置i之胺基酸與位置i+4之胺基酸的側鏈，其中i為12、16、20或24。

在一些實施例中，分子內橋為內醯胺橋。在一些實施例中，在SEQ ID NO:39之位置i及i+4處之胺基酸為Lys及Glu，例如Glu16及Lys20。在一些實施例中，X1係選自由以下各物組成之群：D-His、N-甲基-His、α-甲基-His、咪唑乙酸、去胺基-His、羥基-His、乙醯基-His、高碳His及α,α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)。在其他實施例中，X2係選自由以下各物組成之群：D-Ser、D-Ala、Gly、N-甲基-Ser、Val及α，胺基異丁酸(AIB)。在一些實施例中，升糖激素肽係與親水部分在胺基酸位置16、17、20、21、24、29、40中任一處、在C末端延伸內，或在C末端胺基酸處共價鍵聯。在例示性實施例中，此親水部分係與Lys、Cys、Orn、高半胱胺酸或乙醯基-苯丙胺酸殘基在此等位置中任一處共價鍵聯。例示性親水部分包括例如分子量為約1,000道爾頓至約40,000道爾頓或約20,000道爾頓至約40,000道爾頓之聚乙二醇(PEG)。

在其他實施例中，本發明提供一種具有升糖激素促效劑活性之升糖激素肽，其包含以下胺基酸序列：X1-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Z(SEQ ID NO:39)，其中X1及/或X2為降低升糖激素肽被二肽基肽酶IV(DPP-IV)裂解之敏感性(或增加被該DPP-IV裂解之抗性)的非原生胺基酸，其中升糖激素肽之位置16、20、21及24中一者、兩者、三者、四者或四者以上係經α,α-二取代胺基酸取代，且其中Z係選自由以下各物組成之群：-COOH(天然存在之C末端羧酸酯)、-Asn-COOH、Asn-Thr-COOH及Y-COOH，其中Y為1至2個胺基酸。

對前述升糖激素肽或類似物之例示性進一步胺基酸修飾包括以無羥基之胺基酸(例如Abu或Ile)取代位置7之Thr，視情況組合以包含(視情況經由間隔基)與醯基或烷基(該醯基或烷基對天然存在之胺基酸而言為非原生的)共價連接之側鏈的胺基酸之取代或添加，以Arg取代位置12之Lys；以Glu取代位置15之Asp；以Thr或AIB取代位置16之Ser；以Ser、Thr、Ala或AIB取代位置20之Gln；以Glu取代位置21之Asp；以Ser、Thr、Ala或AIB取代位置24之Gln；以Leu或Nle取代位置27之Met；以帶電胺基酸取代位置28之Asn；以選自由Lys、Arg、His、Asp、Glu、磺基丙胺酸及高磺基丙胺酸組成之群的帶電胺基酸取代位置28之Asn；在位置28用Asn、Asp或Glu取代；在位置28用Asp取代；在位置28用Glu取代；以帶電胺基酸取代位置29之Thr；以選自由Lys、Arg、His、Asp、Glu、磺基丙胺酸及高磺基丙胺酸組成之群的帶電胺基酸取代位置29之Thr；在位置29用Asp、Glu或Lys取代；在位置29用Glu取代；在位置29之後插入1-3個帶電胺基酸；在位置30(亦即在位置29之後)插入Glu或Lys；視情況在位置31插入Lys；將SEQ ID NO:20添加至C末端，視情況其中位置29之胺基酸為Thr或Gly；與親水部分共價連接之胺基酸之取代或添加；或其組合。

在其他例示性實施例中，前述肽中任一者可藉由修飾SEQ ID NO:1之位置15處之胺基酸而經進一步修飾以改良穩定性，從而降低肽隨時間流逝尤其在酸性或鹼性緩衝液中之降解。在例示性實施例中，位置15之Asp係經Glu、高Glu、磺基丙胺酸或高磺基丙胺酸取代。

或者，可藉由修飾SEQ ID NO:1之位置16之胺基酸來進一步修飾本文所述之升糖激素肽中任一者以改良穩定性。在例示性實施例中，位置16之Ser係經Thr或AIB，或增強升糖激素受體處效能之上述胺基酸取代中任一者取代。此等修飾降低肽鍵在Asp15-Ser16之間的裂解。

維持或增強之升糖激素受體處之活性可藉由以麩胺醯胺類似物修飾位置3之Gln來達成。舉例而言，在位置3包含麩胺醯胺類似物之升糖激素肽可呈現原生升糖激素(例如SEQ ID NO:1)在升糖激素受體處之活性的約5%、約10%、約20%、約50%或約85%或85%以上。在一些實施例中，在位置3包含麩胺醯胺類似物之升糖激素肽可呈現除在位置3處之經修飾胺基酸外與包含麩胺醯胺類似物之肽具有相同胺基酸序列之相應升糖激素肽(例如SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70)在升糖激素受體處之活性的約20%、約50%、約75%、約100%、約200%或約500%或500%以上。在一些實施例中，在位置3包含麩胺醯胺類似物之升糖激素肽呈現增強之在升糖激素受體處之活性，但該增強之活性不大於原生升糖激素或除位置3之經修飾胺基酸外與包含麩胺醯胺類似物之肽具有相同胺基酸序列之相應升糖激素肽的活性之1000%、10,000%、100,000%或1,000,000%。

在一些實施例中，麩胺醯胺類似物為包含結構I、II或III之側鏈的天然存在或非天然存在之胺基酸：

其中R¹為C_0-3烷基或C_0-3雜烷基；R²為NHR⁴或C_1-3烷基；R³為C_1-3烷基；R⁴為H或C_1-3烷基；X為NH、O或S；且Y為NHR⁴、SR³或OR³。在一些實施例中，X為NH或Y為NHR⁴。在一些實施例中，R¹為C_0-2烷基或C₁雜烷基。在一些實施例中，R²為NHR⁴或C₁烷基。在一些實施例中，R⁴為H或C₁烷基。在例示性實施例中，提供一種包含結構I之側鏈的胺基酸，其中R¹為CH₂-S，X為NH，且R²為CH₃(乙醯胺基甲基-半胱胺酸，C(Acm))；R¹為CH₂，X為NH，且R²為CH₃(乙醯基二胺基丁酸，Dab(Ac))；R¹為C₀烷基，X為NH，R²為NHR⁴，且R⁴為H(胺甲醯基二胺基丙酸，Dap(脲))；或R¹為CH₂-CH₂，X為NH，且R²為CH₃(乙醯鳥胺酸，Orn(Ac))。在例示性實施例中，提供一種包含結構II之側鏈的胺基酸，其中R¹為CH₂，Y為NHR⁴，且R⁴為CH₃(甲基麩胺醯胺，Q(Me))；在例示性實施例中，提供一種包含結構III之側鏈的胺基酸，其中R¹為CH₂且R⁴為H(甲硫胺酸-亞碸，M(O))；在特定實施例中，位置3之胺基酸係經Dab(Ac)取代。舉例而言，升糖激素促效劑可包含SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73及SEQ ID NO:74之胺基酸序列。

升糖激素肽在升糖激素受體處增強之活性亦可藉由使醯基或烷基(例如對天然存在之胺基酸而言為非原生之醯基或烷基，例如，C₄至C₃₀脂肪醯基，C₄至C₃₀烷基)與升糖激素肽之胺基酸的側鏈共價連接來達成。在一些實施例中，醯化或烷基化升糖激素肽無分子內橋，例如共價分子內橋(例如內醯胺)。在某些態樣中，使醯基或烷基經由間隔基(例如，長為3至10個原子之間隔基)與升糖激素肽之胺基酸的側鏈連接。在一些實施例中，使醯基或烷基經由間隔基與升糖激素肽之位置10的胺基酸之側鏈連接。在特定實施例中，醯化或烷基化升糖激素肽進一步包含選擇性降低GLP-1受體處肽活性之修飾。舉例而言，醯化或烷基化升糖激素肽可包含C末端α羧酸酯，以無羥基之胺基酸(例如Abu或Ile)取代位置7之Thr，刪除位置27或28處胺基酸C末端之胺基酸，從而產生27或28個胺基酸之肽，或其組合。

在一些實施例中，可藉由修飾位置20、21、24或27中任一者、兩者、三者或所有四者來進一步修飾本文所述之升糖激素肽中任一者以降低在各個胺基酸位置處之降解。例示性實施例包括以Ala或AIB取代位置20之Gln，以Glu取代位置21之Asp，以Ala或AIB取代位置24之Gln，以Leu或Nle取代位置27之Met。移除或取代甲硫胺酸可降低由甲硫胺酸氧化造成之降解。移除或取代Gln或Asn可降低由Gln或Asn之脫醯胺造成之降解。移除或取代Asp可降低經由Asp脫水形成環狀丁二醯亞胺中間物接著異構化為異天冬胺酸發生之降解。

在一些實施例中，可修飾本文所述之升糖激素肽中任一者，而不會不利地影響在升糖激素受體處之活性，同時保持至少部分升糖激素受體活性。舉例而言，可在位置2、5、7、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、24、27、28或29中任一處進行保守性或非保守性取代、添加或刪除。在例示性實施例中，位置12之Lys係經Arg取代。在其他例示性實施例中，刪除位置29及/或28及視情況位置27之胺基酸。

當例如使用實例13之檢定測試過度表現升糖激素受體之HEK293細胞中cAMP誘導時，本文所述之升糖激素肽中任一者可在人類升糖激素受體處呈現約100nM、75nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、5nM、1nM或1nM以下之EC₅₀。聚乙二醇化肽通常將呈現與非聚乙二醇化肽相比較高之EC₅₀。舉例而言，本文所述之升糖激素肽當未聚乙二醇化時可在升糖激素受體處呈現原生升糖激素(SEQ ID NO:1)在升糖激素受體處之活性的至少20%(例如，至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、100%、150%、200%、400%、500%或500%以上)之活性。在某些實施例中，本文所述之升糖激素肽當無親水部分時呈現原生升糖激素在升糖激素受體處之指定活性%，但當包含親水部分時呈現原生升糖激素在升糖激素受體處之降低之活性%。舉例而言，本文所述之升糖激素肽當經聚乙二醇化時可在升糖激素受體處呈現原生升糖激素之活性的至少2%(例如至少3%、至少4%、至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%或至少10%)之活性。在一些實施例中，本文所述之升糖激素肽可呈現上文指定活性中任一者，但不大於原生升糖激素在升糖激素受體處之活性的1000%、10,000%、100,000%或1,000,000%。

在一些特定實施例中，升糖激素肽包含(a)賦予DPP-IV抗性之在位置1及/或2之胺基酸修飾，例如在位置1以DMIA取代，或在位置2以AIB取代，(b)在位置12-29內，例如在位置16及20之分子內橋，或以α,α二取代胺基酸一或多次取代位置16、20、21及24處之胺基酸，視情況(c)例如經由在位置24、29或在C末端胺基酸之Cys與諸如PEG之親水部分鍵聯，視情況(d)位置27之胺基酸修飾，其以(例如)Nle取代Met，視情況(e)位置20、21及24之降低降解的胺基酸修飾，及視情況(f)與SEQ ID NO:20鍵聯。當升糖激素肽與SEQ ID NO:20鍵聯時，位置29之胺基酸在某些實施例中為Thr或Gly。在其他特定實施例中，升糖激素肽包含(a)Asp28Glu29，或Glu28Glu29，或Glu29Glu30，或Glu28Glu30或Asp28Glu30，及視情況(b)位置16之胺基酸修飾，其以(例如)Thr或AIB取代Ser，及視情況(c)位置27之胺基酸修飾，其以(例如)Nle取代Met，及視情況(d)位置20、21及24之降低降解的胺基酸修飾。在一特定實施例中，升糖激素肽為T16、A20、E21、A24、Nle27、D28、E29。

升糖激素肽可為包含至少兩個、三個或三個以上經由連接子結合之肽的二聚體、三聚物或更高級多聚體(其中至少一或兩個肽為升糖激素肽)之部分。二聚體可為均二聚體或雜二聚體。在一些實施例中，連接子係選自由雙官能硫醇交聯劑及雙官能胺交聯劑組成之群。在某些實施例中，連接子為PEG，例如5kDa PEG、20kDa PEG。在一些實施例中，連接子為雙硫鍵。舉例而言，二聚體之各單體可包含Cys殘基(例如，末端或內部定位之Cys)且各Cys殘基之硫原子參與雙硫鍵形成。在本發明之一些態樣中，單體係經由末端胺基酸(例如N末端或C末端)，經由內部胺基酸，或經由至少一個單體之末端胺基酸及至少另一個單體之內部胺基酸來連接。在特定態樣中，單體並未經由N末端胺基酸來連接。在一些態樣中，多聚體之單體係以「尾接尾(tail-to-tail)」方向連接在一起，其中將各單體之C末端胺基酸連接在一起。

可使接合部分與本文所述之升糖激素肽(包括二聚體、三聚物或更高級多聚體)中任一者共價鍵聯。亦涵蓋包含SEQ ID NO:20至22中任一者之胺基酸序列的融合肽。

增加升糖激素受體活性，保持部分升糖激素受體活性，改良溶解度，增加穩定性，或降低降解之上述修飾中任一者可個別地或以組合方式應用於升糖激素肽。因此，可製備保持原生升糖激素在升糖激素受體處之活性的至少20%且在6與8之間或在6與9之間的pH值(例如pH 7)下以至少1mg/mL之濃度可溶，且視情況在25℃下24小時之後保留至少95%原始肽(例如5%或5%以下原始肽係經降解或裂解)之升糖激素肽。或者，可製備高效能升糖激素肽，其呈現原生升糖激素在升糖激素受體處之活性的至少約100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、600%、700%、800%、900%或10倍或10倍以上，且視情況在6與8之間或在6與9之間的pH值(例如pH 7)下以至少1mg/mL之濃度可溶，且視情況在25℃下24小時之後保留至少95%原始肽(例如5%或5%以下原始肽係經降解或裂解)。在某些實施例中，本文所述之升糖激素肽當無親水部分時呈現原生升糖激素在升糖激素受體處之指定活性%，但當包含親水部分時呈現原生升糖激素在升糖激素受體處之降低之活性%。在一些實施例中，本文所述之升糖激素肽可呈現在升糖激素受體處活性之上文指定相對水準中至少任一者，但不大於原生升糖激素在升糖激素受體處之活性的10,000%、100,000%或1,000,000%。

根據一實施例，提供一種醫藥組合物，其包含較佳無菌且較佳地純度水準為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之本文所揭示之新穎升糖激素肽中任一者，及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑。此等組合物可含有濃度為至少A之升糖激素肽，其中A為0.001mg/ml、0.01mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14mg/ml、15mg/ml、16mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、19mg/ml、20mg/ml、21mg/ml、22mg/ml、23mg/ml、24mg/ml、25mg/ml或25mg/ml以上。在其他實施例中，此等組合物可含有濃度為至多B之升糖激素肽，其中B為30mg/ml、25mg/ml、24mg/ml、23、mg/ml、22mg/ml、2lmg/ml、20mg/ml、19mg/ml、18mg/ml、17mg/ml、16mg/ml、15mg/ml、14mg/ml、13mg/ml、12mg/ml、11mg/ml 10mg/ml、9mg/ml、8mg/ml、7mg/ml、6mg/ml、5mg/ml、4mg/ml、3mg/ml、2mg/ml、1mg/ml或0.1mg/ml。在一些實施例中，組合物可含有在A mg/ml至B mg/ml(例如0.001mg/ml至30.0mg/ml)之濃度範圍內的升糖激素肽。在一實施例中，醫藥組合物包含經殺菌且視情況儲存於各種容器內之水溶液。可根據一實施例使用此等溶液以製備備用於注射之預調配溶液。在其他實施例中，醫藥組合物包含凍乾散劑。可將醫藥組合物進一步包裝為套組之部分，該套組包括用於向患者投與組合物之拋棄式器件。器件可包括注射器及針，或預填充注射器。可將該等容器或套組加標籤以便儲存在環境室溫下或冷凍溫度下。

根據一實施例，提供一種使用本發明之升糖激素肽的預調配水性組合物來迅速提高葡萄糖含量、正常化血糖含量、穩定化血糖含量或預防或治療低血糖症之方法。該方法包含投與有效量之包含本揭示案之新穎經修飾升糖激素肽的水溶液之步驟。在一些實施例中，將水性組合物預包裝於用以向患者投與組合物之器件中。在另一實施例中，提供一種誘導腸道暫時性麻痹之方法。該方法包含向有需要之患者投與本文所揭示之升糖激素肽中一或多者的步驟。

在又一實施例中，提供一種減少體重增加或誘導體重減輕之方法，其包括投與有效量之包含本發明之升糖激素肽的水溶液。預期減少體重增加或誘導體重減輕之方法適用於治療各種病因之肥胖症(包括藥物誘導肥胖症)，及減少與肥胖症相關之併發症，包括血管病(冠狀動脈疾病、中風、末稍血管疾病、缺血再灌注等)、高血壓、II型糖尿病發作、高脂質血症及肌肉骨骼疾病。

在其他實施例中，提供治療高血糖症或糖尿病之方法，其包括共投與胰島素與本發明之升糖激素肽。高血糖症包括糖尿病、I型糖尿病、II型糖尿病或妊娠期糖尿病(胰島素依賴性或非胰島素依賴性)，及減少糖尿病之併發症，包括腎病、視網膜病及血管病。共投與胰島素與本發明之升糖激素肽可減輕夜間低血糖且/或緩衝胰島素之低血糖作用，從而允許投與相同或較高劑量之短效(short-acting)或長效胰島素而具有較少的不利低血糖作用。亦提供包含胰島素連同本發明之升糖激素肽的組合物。

根據一實施例，提供一種調節胰島素依賴性患者體內血糖含量之改良方法。該方法包含投與對於控制糖尿病治療有效之量的胰島素及投與對於預防低血糖症治療有效之量的本揭示案之新穎經修飾升糖激素肽的步驟，其中該等投與步驟係在彼此之十二小時內進行。在一實施例中，升糖激素肽與胰島素係以單一組合物之形式共投與。

本文所述之所有治療方法、醫藥組合物、套組及其他類似實施例均涵蓋術語升糖激素肽、升糖激素促效劑類似物、升糖激素促效劑或升糖激素類似物之使用包括其所有醫藥學上可接受之鹽或酯。

例示性升糖激素肽係選自由以下各物組成之群：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:33，其中升糖激素肽之胺基酸29係經由肽鍵與第二肽結合，且該第二肽包含SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22之序列。在一實施例中，升糖激素肽係經聚乙二醇化。在一實施例中，方法包含投與包含SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25及SEQ ID NO:26之序列之肽的步驟，其中聚乙烯鏈係在胺基酸位置21或在位置24處共價鍵聯。

調酸素為含有升糖激素(亦即SEQ ID NO:1)之29個胺基酸序列，接著SEQ ID NO:21之8個胺基酸羧基末端延伸(KRNRNNIA)的37個胺基酸肽。儘管本發明涵蓋本文所述之升糖激素類似物可視情況與此8個胺基酸羧基末端延伸(SEQ ID NO:21)接合，但本發明在一些實施例中亦特定涵蓋無SEQ ID NO:21之8個鄰近羧基胺基酸的升糖激素類似物及升糖激素類似物之用途。

前述概括並不意欲界定本發明之每一態樣，且額外實施例係描述於其他部分(諸如實施方式)中。整個文件意欲以統一揭示案之形式敍述，且應瞭解可涵蓋本文所述之特徵的所有可能組合，即便並未發現該特徵組合一起在此文獻之相同句子或段落或部分中。

此外，本發明包括任一或所有比在本文中特定段落定義之變體在任何方面範疇更窄的本發明之實施例。舉例而言，當將本發明之某些態樣描述為一類時，應瞭解一類之每一成員個別地為本發明之一實施例，且該類之兩個或兩個以上成員之組合為本發明之實施例。

定義

在描述及主張本發明中，將根據下文闡述之定義使用以下術語。

如本文中所用，術語「醫藥學上可接受之載劑」包括標準醫藥載劑中任一者，諸如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳液，諸如油/水或水/油乳液，及各種類型之濕潤劑。該術語亦涵蓋經美國聯邦政府(US Federal government)之管理機構批准或列於用於動物(包括人類)之美國藥典(US Pharmacopeia)中之藥劑中任一者。

如本文中所用，術語「醫藥學上可接受之鹽」係指保持母體化合物之生物活性且並不生物學上或另外不合需要的化合物之鹽。藉助於胺基及/或羧基或與其類似之基團的存在，許多本文中所揭示之化合物能夠形成酸式鹽及/或鹼式鹽。

醫藥學上可接受之鹼加成鹽可自無機及有機鹼製備。衍生自無機鹼之鹽包括(僅舉例而言)鈉、鉀、鋰、銨、鈣及鎂鹽。衍生自有機鹼之鹽包括(但不限於)第一胺、第二胺及第三胺之鹽。

醫藥學上可接受之酸加成鹽可自無機及有機酸製備。衍生自無機酸之鹽包括鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸鹽及其類似物。衍生自有機酸之鹽包括乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乙二酸、蘋果酸、丙二酸、丁二酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸鹽及其類似物。

如本文中所用，術語「治療」包括預防特定病症或病狀，或減輕與特定病症或病狀相關之症狀，及/或預防或消除該等症狀。舉例而言，如本文中所用，術語「治療糖尿病」將通常係指朝正常含量之方向改變血糖含量且可包括視給定情形而定來提高或降低血糖含量。

如本文中所用，「有效」量或「治療有效量」之升糖激素肽係指提供所需作用之無毒性但足量之肽。舉例而言，一種所需作用將為預防或治療低血糖症，其係例如藉由血糖含量提高來量測。視個體之年齡及一般病狀、投與模式及其類似因素而定，「有效」之量將在個體之間不同。因此，並非總可能指定精確之「有效量」。然而，在任何個別情況下之適當「有效」量均可由一般技術者使用常規實驗來測定。

術語「非經腸」意謂並不經由消化道但藉由一些其他途徑，諸如皮下、肌肉內、脊柱內或靜脈內。

如本文中所用，術語「純化」及類似術語係關於以大體上不含通常與原生或天然環境中之分子或化合物締合之污染物的形式分離分子或化合物。

如本文中所用，術語「純化」並不需要絕對純度；確切言之，其意欲作為相對定義。術語「經純化多肽」在本文中用以描述已自包括(但不限於)核酸分子、脂質及碳水化合物之其他化合物分離之多肽。

術語「分離」需要所提及之物質自其原始環境(例如，若其天然存在，則為天然環境)移除。舉例而言，存在於活動物中之天然存在之聚核苷酸未經分離，但與天然系統中之一些或所有共存物質分開之相同聚核苷酸係經分離。

如本文中所用，術語「原生升糖激素」係指由SEQ ID NO:1之序列組成之肽，且術語「原生GLP-1」為指定GLP-1(7-36)醯胺(由SEQ ID NO:57之序列組成)、GLP-1(7-37)酸(由SEQ ID NO:58之序列組成)或彼兩種化合物之混合物的通用術語。如本文中所用，在不存在任何進一步指定之情況下一般提及「升糖激素」或「GLP-1」意欲分別意謂原生升糖激素或原生GLP-1。

如本文中所用，「升糖激素肽」包括任何包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列或SEQ ID NO:1之胺基酸序列之任何類似物的肽，該類似物包括肽之胺基酸取代、添加或刪除，或轉譯後修飾(例如甲基化、醯化、泛素化及其類似作用)，其中類似物刺激升糖激素或GLP-1受體活性，例如使用實例13中所述之檢定由cAMP產量來量測。

術語「升糖激素促效劑」係指包含刺激升糖激素受體活性(例如使用實例13中所述之檢定由cAMP產量來量測)之升糖激素肽的複合物。

如本文中所用，「升糖激素促效劑類似物」為包含選自由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:13組成之群的序列，或已被修飾以在位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29包括一或多個保守性胺基酸取代之此序列的類似物之升糖激素肽。

如本文中所用，胺基酸「修飾」係指胺基酸之取代、添加或刪除，且包括以通常可見於人類蛋白質中之20種胺基酸中任一者以及非典型或非天然存在之胺基酸進行取代或添加該等胺基酸。在整個申請案中，以數字(例如位置28)對特定胺基酸位置之所有提及均係指在原生升糖激素(SEQ ID NO:1)中該位置或在任何其類似物中相應胺基酸位置之胺基酸。舉例而言，在本文中提及「位置28」將意謂已刪除SEQ ID NO:1之第一胺基酸的升糖激素類似物之相應位置27。類似地，在本文中提及「位置28」將意謂已在SEQ ID NO:1之N末端之前添加一個胺基酸的升糖激素類似物之相應位置29。

如本文中所用，胺基酸「取代」係指以不同胺基酸殘基置換一個胺基酸殘基。

如本文中所用，術語「保守性胺基酸取代」在本文中係定義為在以下五組中一者內之交換：

I.小脂族非極性或稍微極性殘基：

Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；

II.極性帶負電殘基及其醯胺：

Asp、Asn、Glu、Gln、磺基丙胺酸及高磺基丙胺酸；

III.極性帶正電殘基：

His、Arg、Lys；鳥胺酸(Orn)

IV.大型脂族非極性殘基：

Met、Leu、Ile、Val、Cys、正白胺酸(Nle)、高半胱胺酸

V.大型芳族殘基：

Phe、Tyr、Trp、乙醯基苯丙胺酸

如本文中所用，通用術語「聚乙二醇」或「PEG」係指氧化乙烯與水之縮合聚合物(呈分支鏈或直鏈，以通式H(OCH₂CH₂)_nOH表示，其中n為至少9)之混合物。在不存在任何進一步表徵之情況下，該術語意欲包括平均總分子量選自500道爾頓至40,000道爾頓之範圍之乙二醇的聚合物。「聚乙二醇」或「PEG」係與數字字尾組合使用以指示其近似平均分子量。舉例而言，PEG-5,000係指總平均分子量為約5,000之聚乙二醇。

如本文中所用，術語「聚乙二醇化」及類似術語係指化合物已藉由使聚乙二醇聚合物連接該化合物從而自其原生狀態經修飾。「聚乙二醇化升糖激素肽」為具有與升糖激素肽共價結合之PEG鏈的升糖激素肽。

如本文中所用，一般提及肽意欲涵蓋具有經修飾胺基及羧基末端之肽。舉例而言，指定標準胺基酸之胺基酸序列意欲涵蓋包含醯胺基代替末端羧酸的胺基酸鏈。

如本文中所用，「連接子」為使兩個獨立實體彼此結合之鍵、分子或分子之基團。連接子可提供兩個實體之最佳間距或可進一步提供允許兩個實體彼此分離之不穩定鍵。不穩定鍵包括光可裂解基團、酸不穩定部分、鹼不穩定部分及酶可裂解基團。

如本文中所用，「二聚體」為包含兩個經由連接子彼此共價結合之次單元的複合物。術語二聚體當不存在任何限定語言來使用時涵蓋均二聚體及雜二聚體。均二聚體包含兩個相同次單元，而雜二聚體包含兩個不同次單元，但兩個次單元大體上彼此類似。

如本文中所用，術語「pH穩定化升糖激素肽」係指相對於原生升糖激素在用於藥理學目的之在最寬pH範圍內之水性緩衝液中呈現優良穩定性及溶解度之升糖激素促效劑類似物。

如本文中所用，術語「帶電胺基酸」係指在生理pH值下之水溶液中包含帶負電(亦即去質子化)或帶正電(亦即質子化)側鏈之胺基酸。舉例而言，帶負電胺基酸包括天冬胺酸、麩胺酸、磺基丙胺酸、高磺基丙胺酸及高麩胺酸，而帶正電胺基酸包括精胺酸、離胺酸及組胺酸。帶電胺基酸包括在20種通常可見於人類蛋白質中之胺基酸以及非典型或非天然存在之胺基酸中之帶電胺基酸。

非天然存在之胺基酸係指並不活體內天然存在然而可併入本文所述之肽結構中之胺基酸。非典型胺基酸之商業來源包括Sigma-Aldrich(Milwaukee,WI)、ChemPep Inc.(Miami,FL)及Genzyme Pharmaceuticals(Cambridge,MA)。非典型胺基酸可購自商業供應商，重新合成或自其他胺基酸化學修飾或衍生。

如本文中所用，術語「酸性胺基酸」係指包含第二酸性部分(例如包括羧酸或磺酸基)之胺基酸。

術語「烷基」係指含有指定碳原子數之線性或分支鏈烴。例示性烷基包括甲基、乙基及線性丙基。

術語「雜烷基」係指含有指定碳原子數及至少一個結構主鏈中之雜原子的線性或分支鏈烴。用於本文目的之合適雜原子包括(但不限於)N、S及O。

實施例

增強之溶解度

申請者已發現原生升糖激素可藉由在其羧基末端引入電荷來修飾以增強肽之溶解度，同時保持肽之促效劑特性。增強之溶解度允許在接近中性之pH值下製備及儲存升糖激素溶液。在相對中性pH值(例如約6.0至約8.0之pH值)下調配升糖激素溶液可改良升糖激素肽之長期穩定性。

因此，本發明之一實施例係關於相對於His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-ASp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(SEQ ID NO:1)之野生型肽已經修飾以改良肽在水溶液中之溶解度(尤其在介於約5.5至約8.0範圍內之pH值下)同時保持原生肽之生物活性的升糖激素促效劑。在一實施例中，藉由以選自由離胺酸、精胺酸、組胺酸、天冬胺酸及麩胺酸組成之群的帶電胺基酸取代原生不帶電胺基酸或藉由將帶電胺基酸添加至肽之胺基或羧基末端，從而將電荷添加至肽中。令人驚訝地，申請者已發現以帶電胺基酸取代位置28及/或29通常存在之胺基酸，及/或在升糖激素肽之羧基末端添加一至兩個帶電胺基酸將升糖激素肽在生理學上相關pH值(亦即約6.5至約7.5之pH值)下之水溶液中之溶解度及穩定性增強至少5倍及多達30倍。

因此，相對於原生升糖激素，在約5.5與8之間的給定pH值(例如pH 7)下，當在25℃下24小時之後量測時，本發明之一實施例之升糖激素肽保持升糖激素活性且呈現至少2倍、5倍、10倍、15倍、25倍、30倍或30倍以上之溶解度。本文所揭示之升糖激素肽中任一者在5.5至8範圍內之pH值下可另外呈現改良之穩定性，例如在25℃下24小時之後保持原始肽之至少75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。在一些實施例中，本發明之升糖激素肽呈現經改良之穩定性，使得在約1週或多於1週(例如，約2週、約4週、約1個月、約2個月、約4個月、約6個月、約8個月、約10個月、約12個月)之後，在至少20℃(例如21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、至少27.5℃、至少30℃、至少35℃、至少40℃、至少50℃)且小於100℃、小於85℃、小於75℃或小於70℃之溫度下的溶液中，至少75%(例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、大於95%、至多100%)之肽濃度或小於約25%(例如小於20%、小於15%、小於10%、小於5%、4%、3%、2%、1%，直到0%)之降解肽係藉由紫外線(UV)偵測器在280nm下可偵測。升糖激素肽可包括改變其醫藥特性，例如提高效能、延長循環中半衰期、增加存放期、降低沈澱或聚集，及/或降低降解，例如降低儲存之後的裂解或化學修飾發生的額外修飾。

在一實施例中，可(例如)藉由將一個、兩個、三個或三個以上帶電胺基酸引入原生升糖激素之C末端部分且在一實施例中引入位置27C末端之位置來製備具有改良溶解度之升糖激素肽。可(例如)藉由例如在位置28或29以帶電胺基酸取代原生胺基酸，或者藉由例如在位置27、28或29之後添加帶電胺基酸來引入此帶電胺基酸。在例示性實施例中，帶電胺基酸中一者、兩者、三者或所有者均帶負電。在其他實施例中，帶電胺基酸中一者、兩者、三者或所有者均帶正電。在特定例示性實施例中，升糖激素肽可包含以下修飾中任一者或兩者：以E取代N28；以D取代N28；以D取代T29；以E取代T29；在位置27、28或29之後插入E；在位置27、28或29之後插入D。例如D28E29、E28E29、E29E30、E28E30、D28E30。

進一步修飾及組合

可對升糖激素肽進行額外修飾，其可進一步增大溶解度及/或穩定性及/或升糖激素活性。升糖激素肽或者可包含並不實質上影響溶解度或穩定性且並不實質上降低升糖激素活性之其他修飾。在例示性實施例中，相對於原生升糖激素序列，升糖激素肽可包含總共1個、至多2個、至多3個、至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個，或至多10個，或至多11個，或至多12個，或至多13個，或至多14個胺基酸修飾。在一些實施例中，此等升糖激素類似物保留在原生升糖激素中相應位置之天然存在之胺基酸中至少22、23、24、25、26、27或28者(例如相對於天然存在之升糖激素具有1-7、1-5或1-3個修飾)。

在一些實施例中，在位置2、5、7、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、24、27、28或29中任一處進行1、2、3、4或5個非保守性取代，且在此等位置中任一處進行至多5個進一步保守性取代。在一些實施例中，在位置1-16之胺基酸內進行1、2或3個胺基酸修飾，且在位置17-26之胺基酸內進行1、2或3個胺基酸修飾。

例示性修飾包括(但不限於)：

(a)非保守性取代、保守性取代、添加或刪除，同時保持至少部分升糖激素促效劑活性，舉例而言，在位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29中一或多處之保守性取代，以Val或Phe取代位置10之Tyr，以Arg取代位置12之Lys，以Ala取代此等位置中一或多者；

(b)在位置29及/或28及視情況位置27刪除胺基酸，同時保持至少部分升糖激素促效劑活性；

(c)修飾位置15之天冬胺酸，例如藉由以麩胺酸、高麩胺酸、磺基丙胺酸或高磺基丙胺酸取代，其可降低降解；或修飾位置16之絲胺酸，例如藉由以蘇胺酸、AIB、麩胺酸或以另一具有長度為4個原子之側鏈的帶負電胺基酸或者以麩胺醯胺、高麩胺酸或高磺基丙胺酸中任一者取代，其同樣可降低由Asp15-Ser16鍵裂解造成之降解；

(d)如本文所述，例如在位置16、17、20、21、24、29、40或在C末端胺基酸處添加諸如水溶性聚合物聚乙二醇之親水部分，其可增大溶解度及/或半衰期；

(e)例如藉由以白胺酸或正白胺酸取代來修飾位置27之甲硫胺酸以降低氧化降解；

(f)例如藉由以Ser、Thr、Ala或AIB取代來修飾位置20或24之Gln以降低經由Gln之脫醯胺而發生之降解；

(g)例如藉由以Glu取代來修飾位置21之Asp以降低經由Asp脫水形成環狀丁二醯亞胺中間物接著異構化為異天冬胺酸而發生之降解；

(h)改良對DPP-IV裂解之抗性的如本文所述之在位置1或2之修飾，視情況組合以分子內橋，諸如在位置「i」與「i＋4」之間的內醯胺橋，其中i為12至25之整數，例如12、16、20、24；

(i)如本文所述將升糖激素肽醯化或烷基化，其可增大在升糖激素及GLP-1受體處之活性，增大循環中半衰期且/或延長作用持續時間且/或延遲作用之起始，視情況組合以添加親水部分，另外或替代性地，視情況組合以選擇性降低在GLP-1肽處之活性的修飾，例如修飾位置7之Thr，諸如以無羥基之胺基酸(例如Abu或Ile)取代位置7之Thr；刪除位置27胺基酸C末端之胺基酸(例如刪除位置28及29中之一或兩個胺基酸，從而產生長為27或28個胺基酸之肽)；或其組合。

(j)如本文所述之C末端延伸；

(k)如本文所述之均二聚化或雜二聚化；及以上之組合。

例示性修飾包括至少一個選自A組之胺基酸修飾及一或多個選自B組及/或C組之胺基酸修飾，其中A組為：以帶電胺基酸取代位置28之Asn；以選自由Lys、Arg、His、Asp、Glu、磺基丙胺酸及高磺基丙胺酸組成之群的帶電胺基酸取代位置28之Asn；在位置28用Asn、Asp或Glu取代；在位置28用Asp取代；在位置28用Glu取代；以帶電胺基酸取代位置29之Thr；以選自由Lys、Arg、His、Asp、Glu、磺基丙胺酸及高磺基丙胺酸組成之群的帶電胺基酸取代位置29之Thr；在位置29用Asp、Glu或Lys取代；在位置29用Glu取代；在位置29之後插入1-3個帶電胺基酸；在位置29之後插入Glu或Lys；在位置29之後插入Gly-Lys或Lys-Lys；或其組合；其中B組為：以Glu取代位置15之Asp；以Thr或AIB取代位置16之Ser；且其中C組為：以降低升糖激素肽被二肽基肽酶IV(DPP-IV)裂解之敏感性的非原生胺基酸取代位置1之His，以降低升糖激素肽被二肽基肽酶IV(DPP-IV)裂解之敏感性的非原生胺基酸取代位置2之Ser，以Arg取代位置12之Lys；以Ala或AIB取代位置20之Gln；以Glu取代位置21之Asp；以Ala或AIB取代位置24之Gln；以Leu或Nle取代位置27之Met；刪除位置27-29之胺基酸；刪除位置28-29之胺基酸；刪除位置29之胺基酸；或其組合。

位置3之修飾

升糖激素受體活性可藉由位置3之胺基酸修飾，例如以酸性、鹼性或疏水性胺基酸取代位置3之天然存在之麩胺醯胺來降低。舉例而言，在位置3以麩胺酸、鳥胺酸或正白胺酸取代實質上可降低或破壞升糖激素受體活性。

維持或增強之在升糖激素受體處之活性可藉由以麩胺醯胺類似物修飾位置3之Gln來達成。舉例而言，在位置3包含麩胺醯胺類似物之升糖激素肽可呈現原生升糖激素(SEQ ID NO:1)在升糖激素受體處之活性的約5%、約10%、約20%、約50%或約85%或85%以上。在一些實施例中，在位置3包含麩胺醯胺類似物之升糖激素肽可呈現除在位置3之經修飾胺基酸外與包含麩胺醯胺類似物之肽具有相同胺基酸序列之相應升糖激素肽(例如SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70)之活性的約20%、約50%、約75%、約100%、約200%或約500%或500%以上。在一些實施例中，在位置3包含麩胺醯胺類似物之升糖激素肽呈現增強之在升糖激素受體處之活性，但該增強之活性不大於原生升糖激素或除位置3之經修飾胺基酸外與包含麩胺醯胺類似物之肽具有相同胺基酸序列之相應升糖激素肽的活性之1000%、10,000%、100,000%或1,000,000%。

在一些實施例中，麩胺醯胺類似物為包含結構I、II或III之側鏈的天然存在或非天然存在之胺基酸：

其中R¹為C_0-3烷基或C_0-3雜烷基；R²為NHR⁴或C_1-3烷基；R³為C_1-3烷基；R⁴為H或C_1-3烷基；X為NH、O或S；且Y為NHR⁴、SR³或OR³。在一些實施例中，X為NH或Y為NHR⁴。在一些實施例中，R¹為C_0-2烷基或C₁雜烷基。在一些實施例中，R²為NHR⁴或C₁烷基。在一些實施例中，R⁴為H或C₁烷基。在例示性實施例中，提供一種包含結構I之側鏈的胺基酸，其中R¹為CH₂-S，X為NH且R²為CH₃(乙醯胺基甲基-半胱胺酸，C(Acm))；R¹為CH₂，X為NH且R²為CH₃(乙醯基二胺基丁酸，Dab(Ac))；R¹為C₀烷基，X為NH，R²為NHR⁴且R⁴為H(胺甲醯基二胺基丙酸，Dap(脲))；或R¹為CH₂-CH₂，X為NH且R²為CH₃(乙醯基鳥胺酸，Orn(Ac))。在例示性實施例中，提供一種包含結構II之側鏈的胺基酸，其中R¹為CH₂，Y為NHR⁴且R⁴為CH₃(甲基麩胺醯胺，Q(Me))；在例示性實施例中，提供一種包含結構III之側鏈的胺基酸，其中R¹為CH₂且R⁴為H(甲硫胺酸-亞碸，M(O))；在特定實施例中，位置3之胺基酸係經Dab(Ac)取代。舉例而言，升糖激素促效劑可包含SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73及SEQ ID NO:74之胺基酸序列。

藉由以電荷中性基團(諸如醯胺或酯)置換C末端胺基酸之羧酸來提供增強之在GLP-1受體處之活性。相反地，保留肽之C末端的原生羧酸可維持升糖激素肽對升糖激素受體相對於GLP-1受體相對較大之選擇性(例如大於約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20倍)。

DPP-IV抗性

在一些實施例中，將本文所揭示之升糖激素肽在位置1或2進一步修飾以降低被二肽基肽酶IV裂解的敏感性。更特定言之，在一些實施例中，類似物肽之位置1係經選自由以下各物組成之群的胺基酸取代：D-組胺酸、α,α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)、N-甲基組胺酸、α-甲基組胺酸、咪唑乙酸、去胺基組胺酸、羥基-組胺酸、乙醯基-組胺酸及高組胺酸。

更特定言之，在一些實施例中，類似物肽之位置2係經選自由D-絲胺酸、D-丙胺酸、纈胺酸、胺基正丁酸、甘胺酸、N-甲基絲胺酸及胺基異丁酸組成之群的胺基酸取代。在一實施例中，類似物肽之位置2係經選自由以下各物組成之群的胺基酸取代：D-絲胺酸、D-丙胺酸、甘胺酸、N-甲基絲胺酸及胺基異丁酸。在另一實施例中，類似物肽之位置2係經選自由以下各物組成之群的胺基酸取代：D-絲胺酸、甘胺酸及胺基異丁酸。

當位置1或2之取代或修飾或衍生作用降低在升糖激素受體處之活性時，肽之C末端部分(胺基酸12-29)中之分子內橋(例如，位置「i」與「i+4」之胺基酸的側鏈之間的內醯胺橋，其中i為12至25之整數)可改良在升糖激素受體處之升糖激素活性。

添加親水部分

可在任何用以使蛋白質與活化聚合物分子反應之合適條件下使諸如PEG基團之親水部分與升糖激素肽連接。可使用在此項技術中已知之任何手段，包括經由醯化作用、還原性烷基化作用、邁克爾加成(Michael addition)、硫醇烷基化作用，或其他經由PEG部分上之反應性基團(例如，醛、胺基、酯、硫醇、α-鹵乙醯基、馬來醯亞胺基或肼基)與目標化合物上之反應性基團(例如，醛、胺基、酯、硫醇、α-鹵乙醯基、馬來醯亞胺基或肼基)之化學選擇性接合/連接方法。可用以使水溶性聚合物連接一或多種蛋白質之活化基團包括(但不限於)碸、馬來醯亞胺、硫氫基、硫醇、三氟甲磺酸酯、三氟乙磺酸酯、吖丙啶(azidirine)、氧、5-吡啶基及α-鹵化醯基(例如α-碘乙酸、α-溴乙酸、α-氯乙酸)。若藉由還原性烷基化與肽連接，則所選聚合物應具有單一反應性醛以便控制聚合度。例如參看Kinstler等人，Adv. Drug. Delivery Rev. 54:477-485(2002)；Roberts等人，Adv. Drug Delivery Rev. 54:459-476(2002)；及Zalipsky等人，Adv. Drug Delivery Rev. 16:157-182(1995)。

在本發明之一特定態樣中，以諸如PEG之親水部分修飾具有硫醇之升糖激素肽上之胺基酸殘基。在一些實施例中，在邁克爾加成反應中以馬來醯亞胺活化PEG修飾硫醇以產生包含下文所示硫醚鍵之聚乙二醇化肽：

在一些實施例中，在親核取代反應中以鹵乙醯基活化PEG修飾硫醇以產生包含下文所示硫醚鍵之聚乙二醇化肽：

合適親水部分包括聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚乙氧基化多元醇(例如POG)、聚乙氧基化山梨糖醇、聚乙氧基化葡萄糖、聚乙氧基化甘油(POG)、聚氧化烯、聚乙二醇丙醛、乙二醇/丙二醇之共聚物、單甲氧基-聚乙二醇、單-(C₁-C₁₀)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇、羧甲基纖維素、聚縮醛、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噪烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚(β-胺基酸)(均聚物或無規共聚物)、聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物(PPG)及其他聚伸烷基氧化物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、結腸酸(colonic acid)或其他多醣聚合物、聚蔗糖(Ficoll)或葡聚糖及其混合物。

根據一些實施例之聚乙二醇鏈具有選自約500道爾頓至約40,000道爾頓之範圍的分子量。在一實施例中，聚乙二醇鏈具有選自約500道爾頓至約5,000道爾頓或約1,000道爾頓至約5,000道爾頓之範圍的分子量。在另一實施例中，聚乙二醇鏈具有約10,000道爾頓至約20,000道爾頓之分子量。在其他例示性實施例中，聚乙二醇鏈具有約20,000道爾頓至約40,000道爾頓之分子量。

葡聚糖為主要藉由α1-6鍵所鍵聯之葡萄糖次單元之多醣聚合物。葡聚糖係在許多分子量範圍內可得，例如約1kD至約100kD，或約5、10、15或20kD至約20、30、40、50、60、70、80或90kD。

涵蓋線性或分支鏈聚合物。接合物之所得製劑可大體上為單分散或多分散，且每個肽可具有約0.5、0.7、1、1.2、1.5或2個聚合物部分。

醯化作用

根據一實施例，將升糖激素肽修飾以包含醯基，例如並不天然存在於胺基酸上之醯基(例如對天然存在之胺基酸而言為非原生之醯基)。添加醯基使得肽具有以下各現象中一或多者：延長循環中半衰期、延遲作用起始、延長作用持續時間、改良對諸如DPP-IV之蛋白酶的抗性且提高在GLP-1及升糖激素受體處之效能。如在本文中所示，升糖激素肽之醯化作用不會引起在升糖激素及GLP-1受體處之活性降低。確切言之，在一些情況下，醯化作用實際上提高在GLP-1及升糖激素受體處之活性。因此，醯化類似物之效能若非增強則可與未醯化型升糖激素共促效劑類似物相當。

根據一實施例，將升糖激素肽修飾以包含醯基，該醯基係經由酯、硫酯或醯胺鍵與升糖激素肽連接以達成延長循環中半衰期及/或延遲作用起始及/或延長作用持續時間及/或改良對諸如DPP-IV之蛋白酶的抗性之目的。

醯化作用可在升糖激素肽內任何位置進行，該任何位置包括位置1-29中任一處、在C末端延伸內之位置或C末端胺基酸，其限制條件為升糖激素及/或GLP-1活性若非增強則保持。非限制性實例包括位置5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29。在特定實施例中，醯化作用發生於升糖激素肽之位置10且升糖激素肽無分子內橋，例如共價分子內橋(例如內醯胺橋)。此等無分子內橋之醯化肽如與無共價分子內橋之相應非醯化肽相比且與無分子內橋的在除位置10外之位置醯化之相應肽相比顯示增強之在GLP-1及升糖激素受體處之活性。如在本文中所示，位置10之醯化作用甚至可將在升糖激素受體處具有極小活性之升糖激素類似物轉化為在升糖激素及GLP-1受體處均具有活性之升糖激素類似物。因此，發生醯化作用之位置可改變升糖激素類似物之總體活性概況。

升糖激素肽可在鍵聯親水部分之相同胺基酸位置，或在不同胺基酸位置醯化。非限制性實例包括在位置10醯化及在升糖激素肽之C末端部分中一或多個位置(例如位置24、28或29)、在C末端延伸內或在C末端聚乙二醇化(例如經由添加C末端Cys)。

醯基可與升糖激素肽之胺基酸直接共價鍵聯，或經由間隔基與升糖激素肽之胺基酸間接共價鍵聯，其中該間隔基係位於升糖激素肽之胺基酸與醯基之間。

在本發明之一特定態樣中，藉由使升糖激素肽之胺基酸之側鏈的胺、羥基或硫醇直接醯化，將升糖激素肽修飾以包含醯基。在一些實施例中，經由胺基酸之側鏈胺、羥基或硫醇將升糖激素肽直接醯化。在一些實施例中，醯化作用係在位置10、20、24或29。就此而言，醯化升糖激素肽可包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列，或其包含本文所述之胺基酸修飾中一或多者之經修飾胺基酸序列，其中位置10、20、24及29之胺基酸中至少一者係經修飾為任何包含側鏈胺、羥基或硫醇之胺基酸。在本發明之一些特定實施例中，升糖激素肽之直接醯化作用係經由位置10之胺基酸之側鏈胺、羥基或硫醇來發生。

在一些實施例中，包含側鏈胺之胺基酸為式I之胺基酸：

在一些例示性實施例中，式I之胺基酸為其中n為4(Lys)或n為3(Orn)之胺基酸。

在其他實施例中，包含側鏈羥基之胺基酸為式II之胺基酸：

在一些例示性實施例中，式II之胺基酸為其中n為1之胺基酸(Ser)。

在其他實施例中，包含側鏈硫醇之胺基酸為式III之胺基酸：

在一些例示性實施例中，式III之胺基酸為其中n為1之胺基酸(Cys)。

在其他實施例中，包含側鏈胺、羥基或硫醇之胺基酸為包含式I、式II或式III之相同結構但與式I、式II或式III之胺基酸之α碳鍵結的氫係經第二側鏈置換之二取代胺基酸。

在本發明之一實施例中，醯化升糖激素肽包含介於肽與醯基之間的間隔基。在一些實施例中，升糖激素肽係與間隔基共價結合，該間隔基又與醯基共價結合。

間隔基所連接之胺基酸可為包含允許與間隔基鍵聯之部分的任何胺基酸(例如，單一α-取代胺基酸或α,α-二取代胺基酸)。舉例而言，包含側鏈NH₂、-OH或-COOH之胺基酸(例如Lys、Orn、Ser、Asp或Glu)為合適的。就此而言，醯化升糖激素肽可包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列，或其包含本文所述之胺基酸修飾中一或多者之經修飾胺基酸序列，其中位置10、20、24及29之胺基酸中至少一者係經修飾為任何包含側鏈胺、羥基或羧酸酯之胺基酸。

在一些實施例中，間隔基為包含側鏈胺、羥基或硫醇之胺基酸，或包含含有側鏈胺、羥基或硫醇之胺基酸的二肽或三肽。

當經由間隔基之胺基發生醯化時，可經由胺基酸之α胺或側鏈胺發生該醯化。在α胺經醯化之情況下，間隔基之胺基酸可為任何胺基酸。舉例而言，間隔基之胺基酸可為疏水性胺基酸，例如Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyr、6-胺基己酸、5-胺基戊酸、7-胺基庚酸、8-胺基辛酸。或者，間隔基之胺基酸可為酸性殘基，例如Asp及Glu。

在間隔基之胺基酸之側鏈胺經醯化之情況下，間隔基之胺基酸為包含側鏈胺之胺基酸，例如式I之胺基酸(例如Lys或Orn)。在此情況下，間隔基之胺基酸之α胺及側鏈胺均可醯化，使得升糖激素肽二醯化。本發明之實施例包括此等二醯化分子。

當經由間隔基之羥基發生醯化時，胺基酸或二肽或三肽之胺基酸中一者可為式II之胺基酸。在一特定例示性實施例中，胺基酸為Ser。

當經由間隔基之硫醇基發生醯化時，胺基酸或二肽或三肽之胺基酸中一者可為式III之胺基酸。在一特定例示性實施例中，胺基酸為Cys。

在一些實施例中，間隔基為親水性雙官能間隔基。在某些實施例中，親水性雙官能間隔基包含兩個或兩個以上反應性基團，例如胺、羥基、硫醇及羧基或其任何組合。在某些實施例中，親水性雙官能間隔基包含羥基及羧酸酯。在其他實施例中，親水性雙官能間隔基包含胺基及羧酸酯。在其他實施例中，親水性雙官能間隔基包含硫醇基及羧酸酯。在特定實施例中，間隔基包含胺基聚(烷氧基)羧酸酯。就此而言，間隔基可包含(例如)NH₂(CH₂CH₂O)_n(CH₂)_mCOOH，其中m為1至6之任何整數且n為2至12之任何整數，諸如8-胺基-3,6-二氧雜辛酸，其可購自Peptides International,Inc.(Louisville,KY)。

在一些實施例中，間隔基為疏水性雙官能間隔基。在此項技術中已知疏水性雙官能間隔基。例如參看Bioconjugate Techniques,G. T. Hermanson(Academic Press,San Diego,CA,1996)，其係以其全文引用的方式經併入。在某些實施例中，疏水性雙官能間隔基包含兩個或兩個以上反應性基團，例如胺、羥基、硫醇及羧基或其任何組合。在某些實施例中，疏水性雙官能間隔基包含羥基及羧酸酯。在其他實施例中，疏水性雙官能間隔基包含胺基及羧酸酯。在其他實施例中，疏水性雙官能間隔基包含硫醇基及羧酸酯。包含羧酸酯及羥基或硫醇基之合適疏水性雙官能間隔基在此項技術中為已知且包括(例如)8-羥基辛酸及8-巰基辛酸。

在一些實施例中，雙官能間隔基不為在羧酸酯基團之間包含1-7個碳原子之非分支鏈亞甲基的二羧酸。在一些實施例中，雙官能間隔基為在羧酸酯基團之間包含1-7個碳原子之非分支鏈亞甲基的二羧酸。

在特定實施例中，間隔基(例如，胺基酸、二肽、三肽、親水性或疏水性雙官能間隔基)長為3至10個原子(例如6至10個原子(例如6、7、8、9或10個原子))。在更特定實施例中，間隔基長為約3至10個原子(例如6至10個原子)且醯基為C₁₂至C₁₈脂肪醯基，例如C₁₄脂肪醯基、C₁₆脂肪醯基，使得間隔基與醯基之總長為14至28個原子，例如約14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28個原子。在一些實施例中，間隔基與醯基之長度為17至28(例如，19至26，19至21)個原子。

根據某些前述實施例，雙官能間隔基可為包含長3至10個原子之胺基酸主鏈的合成或天然存在之胺基酸(包括(但不限於)本文所述之胺基酸中任一者)(例如，6-胺基己酸、5-胺基戊酸、7-胺基庚酸及8-胺基辛酸)。或者，間隔基可為具有長3至10個原子(例如6至10個原子)之肽主鏈的二肽或三肽間隔基。二肽或三肽間隔基之各胺基酸可與二肽或三肽之其他胺基酸相同或不同且可獨立地選自由以下各物組成之群：天然存在及/或非天然存在之胺基酸，其包括(例如)天然存在之胺基酸(Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr)之D或L異構體中任一者，或選自由以下各物組成之群的非天然存在之胺基酸的任何D或L異構體：β-丙胺酸(β-Ala)、N-α-甲基-丙胺酸(Me-Ala)、胺基丁酸(Abu)、γ-胺基丁酸(γ-Abu)、胺基己酸(ε-Ahx)、胺基異丁酸(Aib)、胺基甲基吡咯甲酸、胺基哌啶甲酸、胺基絲胺酸(Ams)、胺基四氫哌喃-4-甲酸、精胺酸N-甲氧基-N-甲基醯胺、β-天冬胺酸(β-Asp)、吖丁啶甲酸、3-(2-苯并噻唑基)丙胺酸、α-第三丁基甘胺酸、2-胺基-5-脲基-正戊酸(瓜胺酸，Cit)、β-環己基丙胺酸(Cha)、乙醯胺基甲基-半胱胺酸、二胺基丁酸(Dab)、二胺基丙酸(Dpr)、二羥基苯丙胺酸(DOPA)、二甲基噻唑啶(DMTA)、γ-麩胺酸(γ-Glu)、高絲胺酸(Hse)、羥脯胺酸(Hyp)、異白胺酸N-甲氧基-N-甲基醯胺、甲基-異白胺酸(MeIle)、異哌啶甲酸(Isn)、甲基-白胺酸(MeLeu)、甲基-離胺酸、二甲基-離胺酸、三甲基-離胺酸、甲醇基脯胺酸(methanoproline)、甲硫胺酸-亞碸(Met(O))、甲硫胺酸-碸(Met(O₂))、正白胺酸(Nle)、甲基-正白胺酸(Me-Nle)、正纈胺酸(Nva)、鳥胺酸(Orn)、對胺基苯甲酸(PABA)、青黴胺(penicillamine，Pen)、甲基苯丙胺酸(MePhe)、4-氯苯丙胺酸(Phe(4-Cl))、4-氟苯丙胺酸(Phe(4-F))、4-硝基苯丙胺酸(Phe(4-NO₂))、4-氰基苯丙胺酸((Phe(4-CN))、苯基甘胺酸(Phg)、哌啶基丙胺酸、哌啶基甘胺酸、3,4-脫氫脯胺酸、吡咯啶基丙胺酸、肌胺酸(Sar)、硒代半胱胺酸(selenocysteine，Sec)、O-苯甲基-磷酸絲胺酸、4-胺基-3-羥基-6-甲基庚酸(Sta)、4-胺基-5-環己基-3-羥基戊酸(ACHPA)、4-胺基-3-羥基-5-苯基戊酸(AHPPA)、1,2,3,4,-四氫-異喹啉-3-甲酸(Tic)、四氫哌喃甘胺酸、噻吩丙胺酸(Thi)、O-苯甲基-磷酸酪胺酸、O-磷酸酪胺酸、甲氧基酪胺酸、乙氧基酪胺酸、O-(雙-二甲胺基-膦酸基)-酪胺酸、酪胺酸硫酸四丁胺、甲基-纈胺酸(MeVal)及烷基化3-巰基丙酸。

在一些實施例中，間隔基包含總負電荷，例如包含一或兩個帶負電之胺基酸。在一些實施例中，二肽不為通用結構A-B之二肽中任一者，其中A係選自由Gly、Gln、Ala、Arg、Asp、Asn、Ile、Leu、Val、Phe及Pro組成之群，其中B係選自由Lys、His、Trp組成之群。在一些實施例中，二肽間隔基係選自由以下各物組成之群：Ala-Ala、β-Ala-β-Ala、Leu-Leu、Pro-Pro、γ-胺基丁酸-γ-胺基丁酸及γ-Glu-γ-Glu。

在一些例示性實施例中，藉由使間隔基之胺、羥基或硫醇醯化將升糖激素肽修飾以包含醯基，該間隔基係與升糖激素肽之位置10、20、24或29處或C末端胺基酸處的胺基酸之側鏈連接。

在更特定實施例中，醯基係與升糖激素肽之位置10的胺基酸連接且間隔基與醯基之長度為14至28個原子。在一些態樣中，位置10之胺基酸為式I之胺基酸，例如Lys，或與式I有關之二取代胺基酸。在更特定實施例中，升糖激素肽無分子內橋，例如共價分子內橋。升糖激素肽(例如)可為包含一或多個α,α-二取代胺基酸(例如AIB)以使肽之α螺旋穩定的肽。如在本文中所示，此等包含與位置10之胺基酸之側鏈共價連接的醯化間隔基的肽呈現增強之在GLP-1及升糖激素受體處之效能。

在此項技術中已知經由胺、羥基及硫醇使肽醯化之合適方法。例如參看實例19(關於經由胺醯化之方法)，Miller,Biochem Biophys Res Commun 218:377-382(1996)；Shimohigashi及Stammer,Int J Pept Protein Res 19:54-62(1982)；及Previero等人，Biochim Biophys Acta 263:7-13(1972)(關於經由羥基醯化之方法)；及San及Silvius,J Pept Res 66:169-180(2005)(關於經由硫醇醯化之方法)；Bioconjugate Chem.「Chemical Modifications of Proteins:History and Applications」第1、2-12頁(1990)；Hashimoto等人，Pharmacuetical Res.「synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity」第6卷，第2期，第171-176頁(1989)。

醯化升糖激素肽之醯基可為任何大小，例如任何長度之碳鏈，且可為線性或分支鏈。在本發明之一些特定實施例中，醯基為C₄至C₃₀脂肪酸。舉例而言，醯基可為C₄脂肪酸、C₆脂肪酸、C₈脂肪酸、C₁₀脂肪酸、C₁₂脂肪酸、C₁₄脂肪酸、C₁₆脂肪酸、C₁₈脂肪酸、C₂₀脂肪酸、C₂₂脂肪酸、C₂₄脂肪酸、C₂₆脂肪酸、C₂₈脂肪酸或C₃₀脂肪酸中任一者。在一些實施例中，醯基為C₈至C₂₀脂肪酸，例如C₁₄脂肪酸或C₁₆脂肪酸。

在一替代性實施例中，醯基為膽汁酸。膽汁酸可為任何合適膽汁酸，包括(但不限於)膽酸、鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid)、去氧膽酸、石膽酸、牛磺膽酸、甘胺膽酸及膽固醇酸。

在本發明之一些實施例中，藉由以升糖激素肽將長鏈烷烴醯化從而將升糖激素肽修飾以包含醯基。在特定態樣中，長鏈烷烴包含與升糖激素肽之羧基或其活化型反應之胺、羥基或硫醇基(例如十八胺、十四醇及十六烷硫醇)。升糖激素肽之羧基或其活化型可為升糖激素肽之胺基酸(例如麩胺酸、天冬胺酸)之側鏈的部分或可為肽主鏈之部分。

在某些實施例中，藉由與升糖激素肽連接之間隔基使長鏈烷烴醯化從而將升糖激素肽修飾以包含醯基。在特定態樣中，長鏈烷烴包含與間隔基之羧基或其活化型反應之胺、羥基或硫醇基。包含羧基或其活化型之合適間隔基係描述於本文中且包括(例如)胺基酸、二肽、三肽、親水性雙官能間隔基及疏水性雙官能間隔基。

如本文中所用，術語「羧基之活化型」係指具有通式R(C=O)X之羧基，其中X為脫離基且R為升糖激素肽或間隔基。舉例而言，羧基之活化型可包括(但不限於)醯基氯、酸酐及酯。在一些實施例中，活化羧基為具有N-羥基丁二醯亞胺酯(NHS)脫離基之酯。

關於本發明之此等態樣(其中藉由升糖激素肽或間隔基使長鏈烷烴醯化)，長鏈烷烴可為任何大小且可包含任何碳鏈長度。長鏈烷烴可為線性或分支鏈的。在某些態樣中，長鏈烷烴為C₄至C₃₀烷烴。舉例而言，長鏈烷烴可為C₄烷烴、C₆烷烴、C₈烷烴、C₁₀烷烴、C₁₂烷烴、C₁₄烷烴、C₁₆烷烴、C₁₈烷烴、C₂₀烷烴、C₂₂烷烴、C₂₄烷烴、C₂₆烷烴、C₂₈烷烴或C₃₀烷烴中任一者。在一些實施例中，長鏈烷烴包含C₈至C₂₀烷烴，例如C₁₄烷烴、C₁₆烷烴或C₁₈烷烴。

又，在一些實施例中，升糖激素肽之胺、羥基或硫醇基係用膽固醇酸來醯化。在一特定實施例中，升糖激素肽係經由烷基化去胺基Cys間隔基(亦即烷基化3-巰基丙酸間隔基)與膽固醇酸鍵聯。

本文所述之醯化升糖激素肽可經進一步修飾以包含親水部分。在一些特定實施例中，親水部分可包含聚乙二醇(PEG)鏈。可經由任何合適手段，諸如本文所述之方法中任一者實現親水部分之併入。就此而言，醯化升糖激素肽可包含SEQ ID NO:1，包括本文所述之修飾中任一者，其中位置10、20、24及29之胺基酸中至少一者包含醯基且位置16、17、21、24或29、C末端延伸內位置，或C末端胺基酸之胺基酸中至少一者係經修飾為Cys、Lys、Orn、高Cys或Ac-Phe，且胺基酸之側鏈係與親水部分(例如PEG)共價結合。在一些實施例中，使醯基視情況經由包含Cys、Lys、Orn、高Cys或Ac-Phe之間隔基與位置10連接，且將親水部分併入位置24之Cys殘基處。

或者，醯化升糖激素肽可包含間隔基，其中該間隔基係經醯化及修飾以包含親水部分。合適間隔基之非限制性實例包括包含一或多個選自由Cys、Lys、Orn、高Cys及Ac-Phe組成之群的胺基酸之間隔基。

烷基化作用

根據一些實施例，將升糖激素肽修飾以包含烷基，例如並不天然存在於胺基酸上之烷基(例如對天然存在之胺基酸而言為非原生之烷基)。不固守於任何特定理論，咸信升糖激素肽之烷基化作用將達成與升糖激素肽之醯化作用類似(若不相同)之作用，例如延長循環中半衰期、延遲作用起始、延長作用持續時間、改良對諸如DPP-IV之蛋白酶的抗性及提高在GLP-1及升糖激素受體處之效能。

可在升糖激素肽內任何位置進行烷基化，該任何位置包括位置1-29中任一處、C末端延伸內之位置或C末端胺基酸處，其限制條件為保持升糖激素活性。非限制性實例包括位置5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29。烷基可與升糖激素肽之胺基酸直接共價鍵聯，或經由間隔基與升糖激素肽之胺基酸間接共價鍵聯，其中該間隔基係位於升糖激素肽之胺基酸與烷基之間。升糖激素肽可在鍵聯親水部分之相同胺基酸位置，或在不同胺基酸位置處烷基化。非限制性實例包括在位置10烷基化及在升糖激素肽之C末端部分中一或多個位置(例如位置24、28或29)、在C末端延伸內或在C末端處聚乙二醇化(例如經由添加C末端Cys)。

在本發明之一特定態樣中，藉由使升糖激素肽之胺基酸之側鏈的胺、羥基或硫醇直接烷基化，將升糖激素肽修飾以包含烷基。在一些實施例中，烷基化係在位置10、20、24或29。就此而言，烷基化升糖激素肽可包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列，或其包含本文所述之胺基酸修飾中一或多者之經修飾胺基酸序列，其中位置10、20、24及29之胺基酸中至少一者係經修飾為任何包含側鏈胺、羥基或硫醇之胺基酸。在本發明之一些特定實施例中，升糖激素肽之直接烷基化係經由位置10之胺基酸之側鏈胺、羥基或硫醇來發生。

在一些實施例中，包含側鏈胺之胺基酸為式I之胺基酸。在一些例示性實施例中，式I之胺基酸為其中n為4(Lys)或n為3(Orn)之胺基酸。

在其他實施例中，包含側鏈羥基之胺基酸為式II之胺基酸。在一些例示性實施例中，式II之胺基酸為其中n為1之胺基酸(Ser)。

在其他實施例中，包含側鏈硫醇之胺基酸為式III之胺基酸。在一些例示性實施例中，式III之胺基酸為其中n為1之胺基酸(Cys)。

在其他實施例中，包含側鏈胺、羥基或硫醇之胺基酸為包含式I、式II或式III之相同結構但與式I、式II或式III之胺基酸之α碳鍵結的氫係經第二側鏈置換之二取代胺基酸。

在本發明之一實施例中，烷基化升糖激素肽包含介於肽與烷基之間的間隔基。在一些實施例中，升糖激素肽係與間隔基共價結合，該間隔基又與烷基共價結合。在一些例示性實施例中，藉由使間隔基之胺、羥基或硫醇烷基化將升糖激素肽修飾以包含烷基，該間隔基係與升糖激素肽之位置10、20、24或29之胺基酸的側鏈連接。間隔基所連接之胺基酸可為包含允許與間隔基鍵聯之部分的任何胺基酸(例如，單一α-取代胺基酸或α,α-二取代胺基酸)。舉例而言，包含側鏈NH₂、-OH或-COOH之胺基酸(例如Lys、Orn、Ser、Asp或Glu)為合適的。就此而言，烷基化升糖激素肽可包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列，或其包含本文所述之胺基酸修飾中一或多者之經修飾胺基酸序列，其中位置10、20、24及29之胺基酸中至少一者係經修飾為任何包含側鏈胺、羥基或羧酸酯之胺基酸。

在一些實施例中，間隔基為包含側鏈胺、羥基或硫醇之胺基酸，或包含含有側鏈胺、羥基或硫醇之胺基酸的二肽或三肽。

當烷基化作用經由間隔基之胺基發生時，烷基化可經由胺基酸之α胺或側鏈胺來發生。在α胺經烷基化之情況下，間隔基之胺基酸可為任何胺基酸。舉例而言，間隔基之胺基酸可為疏水性胺基酸，例如Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyr、6-胺基己酸、5-胺基戊酸、7-胺基庚酸、8-胺基辛酸。或者，間隔基之胺基酸可為酸性殘基，例如Asp及Glu，其限制條件為烷基化作用係在酸性殘基之α胺上發生。在間隔基之胺基酸之側鏈胺經烷基化之情況下，間隔基之胺基酸為包含側鏈胺之胺基酸，例如式I之胺基酸(例如Lys或Orn)。在此情況下，間隔基之胺基酸之α胺及側鏈胺均可烷基化，使得升糖激素肽二烷基化。本發明之實施例包括此等二烷基化分子。

當經由間隔基之羥基發生烷基化時，胺基酸或二肽或三肽之胺基酸中一者可為式II之胺基酸。在一特定例示性實施例中，胺基酸為Ser。

當經由間隔基之硫醇基發生烷基化時，胺基酸或二肽或三肽之胺基酸中一者可為式III之胺基酸。在一特定例示性實施例中，胺基酸為Cys。

在一些實施例中，間隔基為親水性雙官能間隔基。在某些實施例中，親水性雙官能間隔基包含兩個或兩個以上反應性基團，例如胺、羥基、硫醇及羧基或其任何組合。在某些實施例中，親水性雙官能間隔基包含羥基及羧酸酯。在其他實施例中，親水性雙官能間隔基包含胺基及羧酸酯。在其他實施例中，親水性雙官能間隔基包含硫醇基及羧酸酯。在一特定實施例中，間隔基包含胺基聚(烷氧基)羧酸酯。就此而言，間隔基可包含(例如)NH₂(CH₂CH₂O)_n(CH₂)_mCOOH，其中m為1至6之任何整數且n為2至12之任何整數，諸如8-胺基-3,6-二氧雜辛酸，其可購自Peptides International,Inc.(Louisville,KY)。

在一些實施例中，間隔基為疏水性雙官能間隔基。在某些實施例中，疏水性雙官能間隔基包含兩個或兩個以上反應性基團，例如胺、羥基、硫醇及羧基或其任何組合。在某些實施例中，疏水性雙官能間隔基包含羥基及羧酸酯。在其他實施例中，疏水性雙官能間隔基包含胺基及羧酸酯。在其他實施例中，疏水性雙官能間隔基包含硫醇基及羧酸酯。包含羧酸酯及羥基或硫醇基之合適疏水性雙官能間隔基在此項技術中為已知且包括(例如)8-羥基辛酸及8-巰基辛酸。

在特定實施例中，間隔基(例如，胺基酸、二肽、三肽、親水性或疏水性雙官能間隔基)長為3至10個原子(例如6至10個原子(例如6、7、8、9或10個原子))。在更特定實施例中，間隔基長為約3至10個原子(例如6至10個原子)且烷基為C₁₂至C₁₈烷基，例如C₁₄烷基、C₁₆烷基，使得間隔基與烷基之總長為14至28個原子，例如約14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28個原子。在一些實施例中，間隔基與烷基之長度為17至28(例如，19至26，19至21)個原子。

根據某些前述實施例，雙官能間隔基可為包含長3至10個原子之胺基酸主鏈的合成或非天然存在之胺基酸(例如，6-胺基己酸、5-胺基戊酸、7-胺基庚酸及8-胺基辛酸)。或者，間隔基可為具有長3至10個原子(例如6至10個原子)之肽主鏈的二肽或三肽間隔基。二肽或三肽間隔基可由天然存在及/或非天然存在之胺基酸構成，該等胺基酸包括(例如)在本文中教示之胺基酸中任一者。在一些實施例中，間隔基包含總負電荷，例如包含一或兩個帶負電之胺基酸。在一些實施例中，二肽間隔基係選自由以下各物組成之群：Ala-Ala、β-Ala-β-Ala、Leu-Leu、Pro-Pro、γ-胺基丁酸-γ-胺基丁酸及γ-Glu-γ-Glu。

在此項技術中已知經由胺、羥基及硫醇使肽烷基化之合適方法。舉例而言，可將威廉森醚合成(Williamson ether synthesis)用以在升糖激素肽之羥基與烷基之間形成醚鍵。又，以烷基鹵進行之肽的親核取代反應可產生醚、硫醚或胺基鍵中任一者。

烷基化升糖激素肽之烷基可為任何大小，例如任何長度之碳鏈，且可為線性或分支鏈。在本發明之一些實施例中，烷基為C₄至C₃₀烷基。舉例而言，烷基可為C₄烷基、C₆烷基、C₈烷基、C₁₀烷基、C₁₂烷基、C₁₄烷基、C₁₆烷基、C₁₈烷基、C₂₀烷基、C₂₂烷基、C₂₄烷基、C₂₆烷基、C₂₈烷基或C₃₀烷基中任一者。在一些實施例中，烷基為C₈至C₂₀烷基，例如C₁₄烷基或C₁₆烷基。

在一些特定實施例，烷基包含膽汁酸(bile acid)(例如膽酸(cholic acid)、鵝去氧膽酸、去氧膽酸、石膽酸、牛磺膽酸、甘胺膽酸及膽固醇酸)之類固醇部分。

在本發明之一些實施例中，藉由使親核長鏈烷烴與升糖激素肽反應將升糖激素肽修飾以包含烷基，其中升糖激素肽包含適於親核取代之脫離基。在特定態樣中，長鏈烷烴之親核基團包含胺、羥基或硫醇基(例如十八胺、十四醇及十六烷硫醇)。升糖激素肽之脫離基可為胺基酸之側鏈之部分或可為肽主鏈之部分。合適脫離基包括(例如)N-羥基丁二醯亞胺、鹵素及磺酸酯。

在某些實施例中，藉由使親核長鏈烷烴與連接升糖激素肽之間隔基反應將升糖激素肽修飾以包含烷基，其中該間隔基包含脫離基。在特定態樣中，長鏈烷烴包含胺、羥基或硫醇基。在某些實施例中，包含脫離基之間隔基可為任何在本文中討論之間隔基，例如進一步包含合適脫離基之胺基酸、二肽、三肽、親水性雙官能間隔基及疏水性雙官能間隔基。

關於本發明之此等態樣(其中藉由升糖激素肽或間隔基使長鏈烷烴烷基化)，長鏈烷烴可為任何大小且可包含任何碳鏈長度。長鏈烷烴可為線性或分支鏈的。在某些態樣中，長鏈烷烴為C₄至C₃₀烷烴。舉例而言，長鏈烷烴可為C₄烷烴、C₆烷烴、C₈烷烴、C₁₀烷烴、C₁₂烷烴、C₁₄烷烴、C₁₆烷烴、C₁₈烷烴、C₂₀烷烴、C₂₂烷烴、C₂₄烷烴、C₂₆烷烴、C₂₈烷烴或C₃₀烷烴中任一者。在一些實施例中，長鏈烷烴包含C₈至C₂₀烷烴，例如C₁₄烷烴、C₁₆烷烴或C₁₈烷烴。

又，在一些實施例中，烷基化可在升糖激素肽與膽固醇部分之間發生。舉例而言，膽固醇之羥基可置換長鏈烷烴上之脫離基以形成膽固醇-升糖激素肽產物。

本文所述之烷基化升糖激素肽可經進一步修飾以包含親水部分。在一些特定實施例中，親水部分可包含聚乙二醇(PEG)鏈。可經由任何合適手段，諸如本文所述之方法中任一者實現親水部分之併入。就此而言，烷基化升糖激素肽可包含SEQ ID NO:1或其包含本文所述之胺基酸修飾中一或多者之經修飾胺基酸序列，其中在位置10、20、24及29之胺基酸中至少一者包含烷基且位置16、17、21、24及29、C末端延伸內之位置或C末端胺基酸之胺基酸中至少一者係經修飾為Cys、Lys、Orn、高Cys或Ac-Phe，且胺基酸之側鏈係與親水部分(例如PEG)共價結合。在一些實施例中，使烷基視情況經由包含Cys、Lys、Orn、高Cys或Ac-Phe之間隔基與位置10連接，且將親水部分併入位置24之Cys殘基處。

或者，烷基化升糖激素肽可包含間隔基，其中該間隔基係經烷基化及修飾以包含親水部分。合適間隔基之非限制性實例包括包含一或多個選自由Cys、Lys、Orn、高Cys及Ac-Phe組成之群的胺基酸之間隔基。

降低GLP-1活性之修飾

在某些實施例中，升糖激素肽或其類似物包含選擇性降低GLP-1活性之胺基酸修飾。舉例而言，醯化或烷基化升糖激素肽，或其類似物包含C末端α羧酸酯基團；以無羥基之胺基酸(例如Abu或Ile)取代位置7之Thr；刪除位置27或28處胺基酸之C末端之胺基酸(例如刪除28之胺基酸、刪除位置28及29之胺基酸)以產生長27或28個胺基酸之肽，或其組合。

接合物

本揭示案亦涵蓋其他接合物，其中本發明之升糖激素肽視情況經由共價鍵且視情況經由連接子與接合部分鍵聯。鍵聯可藉由共價化學鍵、物理力(諸如靜電力、氫力、離子力、凡得瓦爾力(van der Waals)，或疏水性或親水性相互作用)來實現。可使用各種非共價偶合系統，包括生物素-抗生物素蛋白、配位體/受體、酶/受質、核酸/核酸結合蛋白、脂質/脂質結合蛋白、細胞黏著分子搭配物；或任何結合搭配物或彼此具有親和性之其片段。

可經由直接共價鍵藉由使肽之靶向胺基酸殘基與能夠與此等靶向胺基酸之所選側鏈或N末端或C末端殘基反應之有機衍生劑反應使肽與接合部分鍵聯。肽或接合部分上之反應性基團包括(例如)醛、胺基、酯、硫醇、α-鹵乙醯基、馬來醯亞胺基或肼基。衍生劑包括(例如)馬來醯亞胺基苯甲醯基磺基丁二醯亞胺酯(經由半胱胺酸殘基接合)、N-羥基丁二醯亞胺(經由離胺酸殘基)、戊二醛、丁二酸酐或在此項技術中已知之其他藥劑。或者，接合部分可經由諸如多醣或多肽載劑之中間載劑與肽間接鍵聯。多醣載劑之實例包括胺基葡聚糖。合適多肽載劑之實例包括聚離胺酸、聚麩胺酸、聚天冬胺酸、其共聚物，及此等胺基酸與其他者(例如絲胺酸)之混合聚合物，以對所得負載載劑賦予所需溶解特性。

半胱胺醯基殘基最通常係與α-鹵基乙酸鹽(及相應胺)(諸如氯乙酸、氯乙醯胺)反應以得到羧甲基或羧基醯胺基甲基衍生物。半胱胺醯基殘基亦藉由與以下各物反應而衍生：溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙醯磷酸(chloroacetyl phosphate)、N-烷基馬來醯亞胺、二硫化3-硝基2-吡啶基、二硫化甲基2-吡啶基、對氯汞苯甲酸鹽、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-噁-1,3-二唑。

因為焦碳酸二乙酯對組胺醯基側鏈具有相對特異性，所以組胺醯基殘基係藉由與焦碳酸二乙酯在pH 5.5-7.0下反應而衍生。對溴苯甲醯甲基溴亦為適用的；反應較佳在0.1M二甲胂酸鈉中在pH 6.0下進行。

使離胺醯基(Lysinyl)及胺基-末端殘基與丁二酸或其他羧酸酐反應。用此等藥劑進行衍生作用具有逆轉離胺醯基殘基之電荷的作用。用於衍生含α-胺基之殘基的其他合適試劑包括醯亞胺酯，諸如吡啶甲醯亞胺酸甲酯、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氫硼化氯(chloroborohydride)、三硝基苯磺酸、O-甲基異脲、2,4-戊二酮，及用乙醛酸酯(glyoxylate)進行轉胺酶催化反應。

精胺醯基殘基係藉由與一或若干種習知試劑(其中，苯基乙二醛(phenylglyoxal)、2,3-丁二酮、1,2-環己二酮及茚滿三酮)反應而經修飾。因為胍官能基之高pK_a，所以精胺酸殘基之衍生作用需要反應在鹼性條件中進行。此外，此等試劑可與離胺酸以及精胺酸ε-胺基之基團反應。

可進行酪胺醯基殘基之特異性修飾，特定關注於藉由與芳族重氮化合物或四硝基甲烷反應將光譜標籤引入至酪胺醯基殘基中。最通常地，將N-乙醯基咪唑及四硝基甲烷用以分別形成O-乙醯基酪胺醯基物質及3-硝基衍生物。

羧基側基(天冬胺醯基或麩胺醯基)係藉由與碳化二亞胺(R-N=C=N-R')反應而經選擇性修飾，其中R及R'為不同烷基，諸如1-環己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳化二亞胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲基戊基)碳化二亞胺。此外，天冬胺醯基及麩胺醯基殘基係藉由與銨離子反應而轉化為天冬醯胺醯基及麩醯胺醯基。

其他修飾包括脯胺酸及離胺酸之羥基化作用、絲胺醯基或蘇胺醯基殘基之羥基的磷酸化作用、離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基的甲基化作用(T. E. Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H. Freeman 及Co.,San Francisco，第79-86頁(1983))、天冬醯胺或麩胺醯胺之脫醯胺作用、N末端胺之乙醯化作用及/或C末端羧酸基之醯胺化或酯化作用。

另一類型之共價修飾包括使醣苷與肽化學或酶促偶合。糖可連接(a)精胺酸及組胺酸、(b)游離羧基、(c)游離硫氫基，諸如半胱胺酸之游離硫氫基、(d)游離羥基，諸如絲胺酸、蘇胺酸或羥脯胺酸之游離羥基、(e)芳族殘基，諸如酪胺酸或色胺酸之芳族殘基，或(f)麩胺醯胺之醯胺基。此等方法係描述於1987年9月11日公開之WO 87/05330及Aplin及Wriston,CRC Crit. Rev. Biochem. ，第259-306頁(1981)中。

可與本文所述之升糖激素肽中任一者鍵聯之例示性接合部分包括(但不限於)異源肽或多肽(例如包括血漿蛋白質)、靶向劑、免疫球蛋白或其部分(例如可變區、CDR或Fc區)、諸如放射性同位素、螢光團或酶促標籤之診斷性標籤、包括水溶性聚合物之聚合物，或其他治療或診斷劑。在一實施例中，提供一種包含本發明之升糖激素肽及血漿蛋白質的接合物，其中該血漿蛋白質係選自由白蛋白、轉鐵蛋白、血纖維蛋白原及球蛋白組成之群。在一實施例中，接合物之血漿蛋白質部分為白蛋白或轉鐵蛋白。在一些實施例中，連接子包含長1至約60個，或1至30個原子或30個原子以上、2至5個原子、2至10個原子、5至10個原子或10至20個原子之原子鏈。在一些實施例中，鏈原子所有皆為碳原子。在一些實施例中，連接子之主鏈中之鏈原子係選自由C、O、N及S組成之群。鏈原子及連接子可根據其預期溶解度(親水性)來選擇以便提供較為可溶之接合物。在一些實施例中，連接子提供可受到酶或其他催化劑或可見於目標組織或器官或細胞中之水解條件的裂解之官能基。在一些實施例中，連接子長度足以降低位阻之潛力。若連接子為共價鍵或肽鍵且接合物為多肽，則整個接合物可為融合蛋白。此等肽基連接子可為任何長度。例示性連接子長為約1至50個胺基酸、長5至50個、3至5個、5至10個、5至15個或10至30個胺基酸。此等融合蛋白或者可藉由一般技術者已知之重組遺傳工程方法來製造。

如上所述，在一些實施例中，升糖激素肽係與免疫球蛋白或其部分(例如可變區、CDR或Fc區)接合，例如稠合。已知類型之免疫球蛋白(Ig)包括IgG、IgA、IgE、IgD或IgM。Fc區為Ig重鏈之C末端區域，其負責與進行諸如再循環(其引起半衰期延長)、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)之活動的Fc受體結合。

舉例而言，根據一些定義，人類IgG重鏈Fc區係自重鏈之Cys226延伸至C末端。「鉸鏈區」一般自人類IgG1之Glu216延伸至Pro230(可藉由比對涉及半胱胺酸鍵結之半胱胺酸使其他IgG同型之鉸鏈區與IgG1序列比對)。IgG之Fc區包括兩個恆定域，CH2及CH3。人類IgG Fc區之CH2域通常自胺基酸231延伸至胺基酸341。人類IgG Fc區之CH3域通常自胺基酸342延伸至447。對免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或區域之胺基酸編號的提及所有均基於Kabat等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S. Department of Public Health,Bethesda,Md。在一相關實施例中，Fc區可包含一或多個原生恆定區或自免疫球蛋白重鏈修飾之恆定區(除CH1之外，例如IgG及IgA之CH2及CH3區域，或IgE之CH3及CH4區域)。

合適接合部分包括免疫球蛋白序列之包括FcRn結合位點之部分。補救受體FcRn負責將免疫球蛋白再循環且使其返回至血液循環中。已基於X射線結晶學描述與FcRn受體結合之IgG的Fc部分之區域(Burmeister等人，1994,Nature 372:37a)。Fc與FcRn之主要接觸區域係靠近CH2與CH3域之接面。Fc-FcRn接觸點所有均在單一Ig重鏈內。主要接觸位點包括CH2域之胺基酸殘基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311及314，及CH3域之胺基酸殘基385-387、428及433-436。

一些接合部分可能包括或可能不包括FcγR結合位點。FcγR負責ADCC及CDC。使得與FcγR直接接觸之Fc區內位置之實例為胺基酸234-239(較低鉸鏈區)、胺基酸265-269(B/C環)、胺基酸297-299(C'/E環)及胺基酸327-332(F/G)環(Sondermann等人，Nature 406:267-273,2000)。IgE之較低鉸鏈區亦已與FcRI結合有關(Henry等人，Biochemistry 36,15568-15578,1997)。與IgA受體結合有關之殘基係描述於Lewis等人(J Immunol. 175:6694-701,2005)中。與IgE受體結合有關之胺基酸殘基係描述於Sayers等人(J Biol Chem. 279(34):35320-5,2004)中。

可對免疫球蛋白之Fc區進行胺基酸修飾。此等變體Fc區在Fc區之CH3域(殘基342-447)中包含至少一個胺基酸修飾及/或在Fc區之CH2域(殘基231-341)中包含至少一個胺基酸修飾。咸信賦予增加之對FcRn之親和性的突變包括T256A、T307A、E380A及N434A(Shields等人2001,J. Biol. Chem. 276:6591)。其他突變可在不顯著降低對FcRn之親和性的情況下降低Fc區與FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB及/或FcγRIIIA之結合。舉例而言，以Ala或另一胺基酸取代Fc區之位置297之Asn會移除高度保守之N-糖基化位點且可引起Fc區免疫原性降低，與半衰期延長，以及與FcγR之結合降低(Routledge等人，1995,Transplantation 60:847；Friend等人，1999,Transplantation 68:1632；Shields等人1995,J. Biol. Chem. 276:6591)。已進行IgG1之位置233-236的胺基酸修飾，其會降低與FcγR之結合(Ward及Ghetie 1995,Therapeutic Immunology 2:77及Armour等人1999,Eur. J. Immunol. 29:2613)。一些例示性胺基酸取代係描述於各自以全文引用的方式併入本文中之美國專利7,355,008及7,381,408中。

本揭示案亦涵蓋升糖激素融合肽或蛋白質，其中第二肽或多肽已與升糖激素肽之末端(例如羧基末端)融合。用於C末端融合之例示性候選物包括與升糖激素肽之胺基酸29鍵聯之SEQ ID NO:20(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO:21(KRNRNNIA)或SEQ ID NO:22(KRNR)。

α螺旋結構之穩定化作用

在修飾升糖激素肽之位置1及/或位置2之胺基酸後升糖激素活性之降低可藉由升糖激素肽之C末端部分(約胺基酸12-29)中α螺旋結構之穩定化作用而恢復。α螺旋結構可藉由(例如)形成共價或非共價分子內橋、大約在位置12-29以α螺旋穩定化胺基酸(例如α,α-二取代胺基酸)取代及/或插入胺基酸來穩定化。

在一些實施例中，在兩條胺基酸側鏈之間形成分子內橋以穩定化升糖激素肽之羧基末端部分(例如胺基酸12-29)之三維結構。兩條胺基酸側鏈可經由非共價鍵(例如氫鍵結、離子相互作用，諸如形成鹽橋)或藉由共價鍵而彼此鍵聯。當兩條胺基酸側鏈經由一或多個共價鍵彼此鍵聯時，在本文中可將肽視為包含共價分子內橋。當兩條胺基酸側鏈經由非共價鍵(例如氫鍵、離子相互作用)彼此鍵聯時，在本文中可將肽視為包含非共價分子內橋。

在一些實施例中，在相隔3個胺基酸之兩個胺基酸，例如在位置i與i+4之胺基酸之間形成分子內橋，其中i為介於12與25之間的任何整數(例如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24及25)。更特定言之，胺基酸對12與16、16與20、20與24或24與28(i=12、16、20或24之胺基酸對)之側鏈彼此鍵聯且因此使升糖激素α螺旋穩定化。或者，i可為17。

在位置i與i+4之胺基酸藉由分子內橋接合之一些特定實施例中，連接子之大小為約8個原子，或約7-9個原子。

在其他實施例中，在相隔兩個胺基酸之兩個胺基酸，例如在位置j與j+3之胺基酸之間形成分子內橋，其中j為介於12與26之間的任何整數(例如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25及26)。在一些特定實施例中，j為17。

在位置j與j+3之胺基酸藉由分子內橋接合之一些特定實施例中，連接子之大小為約6個原子，或約5至7個原子。

在其他實施例中，在相隔6個胺基酸之兩個胺基酸，例如在位置k與k+7之胺基酸之間形成分子內橋，其中k為介於12與22之間的任何整數(例如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21及22)。在一些特定實施例中，k為12、13或17。在一例示性實施例中，k為17。

能夠共價鍵結以形成6原子鍵聯橋之胺基酸對之實例包括Orn與Asp、Glu與式I(其中n為2)之胺基，及高麩胺酸與式I(其中n為1)之胺基酸，其中式I為：

能夠共價鍵結以形成7原子鍵聯橋之胺基酸對之實例包括Orn-Glu(內醯胺環)；Lys-Asp(內醯胺)；或高ser-高glu(內酯)。可形成8原子連接子之胺基酸對之實例包括Lys-Glu(內醯胺)；高lys-Asp(內醯胺)；Orn-高glu(內醯胺)；4-胺基Phe-Asp(內醯胺)；或Tyr-Asp(內酯)。可形成9原子連接子之胺基酸對之實例包括高lys-Glu(內醯胺)；Lys-高glu(內醯胺)；4-胺基Phe-Glu(內醯胺)；或Tyr-Glu(內酯)。此等胺基酸上之側鏈中任一者可另外經其他化學基團取代，只要α螺旋之三維結構不受到破壞。一般技術者可預想將產生具有類似大小及所需作用之穩定化結構的替代性對或替代性胺基酸類似物，包括經化學修飾之衍生物。舉例而言，高半胱胺酸-高半胱胺酸雙硫橋長為6個原子且可經進一步修飾以提供所需作用。甚至在無共價鍵之情況下，上述胺基酸對或一般技術者可預想之類似對亦可經由非共價鍵，例如經由形成鹽橋或氫鍵結相互作用向α螺旋提供附加之穩定性。

內醯胺環之大小可視胺基酸側鏈長度而變化，且在一實施例中內醯胺係藉由離胺酸性胺基酸之側鏈與麩胺酸側鏈鍵聯來形成。其他例示性實施例包括視情況具有內醯胺橋之以下對：位置12之Glu與位置16之Lys；位置12之原生Lys與位置16之Glu；位置16之Glu與位置20之Lys；位置16之Lys與位置20之Glu；位置20之Glu與位置24之Lys；位置20之Lys與位置24之Glu；位置24之Glu與位置28之Lys；位置24之Lys與位置28之Glu。或者，可逆轉內醯胺環中醯胺鍵之順序(例如，內醯胺環可在Lys12與Glu16之側鏈之間或者在Glu 12與Lys16之間形成)。

除內醯胺橋外之分子內橋可用以穩定化升糖激素類似物肽之α螺旋。在一實施例中，分子內橋為疏水橋。在此情況下，分子內橋視情況係在兩個胺基酸之側鏈之間，該兩個胺基酸為升糖激素類似物肽之α螺旋之疏水面的部分。舉例而言，藉由疏水橋接合之胺基酸中之一者可為在位置10、14及18之胺基酸。

在一特定態樣中，將烯烴複分解用以使用全烴交聯系統(all-hydrocarbon cross-linking system)來交聯升糖激素肽之α螺旋之一或兩個旋(turn)。在此情況下，升糖激素肽可包含帶有具有不同長度之烯系側鏈且在i及i+4或i+7位置組態有R或S立體化學的α-甲基化胺基酸。舉例而言，烯系側可包含(CH₂)_n，其中n為介於1與6之間的任何整數。在一實施例中，對於8個原子之交聯長度而言，n為3。在此項技術中描述形成此等分子內橋之合適方法。例如參看Schafmeister等人，J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892(2000)及Walensky等人，Science 305:1466-1470(2004)。或者，升糖激素肽可包含位於相鄰螺旋(helical turn)上之O-烯丙基Ser殘基，其經由釕催化閉環複分解而橋聯在一起。此等交聯程序係描述於(例如)Blackwell等人，Angew,Chem.,Int. Ed. 37:3281-3284(1998)中。

在另一特定態樣中，已廣泛用作胱胺酸之肽模擬物的非天然硫代二丙胺酸性胺基酸，即羊毛硫胺酸之用途係經用以交聯α螺旋之一個旋。在此項技術中已知基於羊毛硫胺酸之環化的合適方法。例如參看Matteucci等人，Tetrahedron Letters 45:1399-1401(2004)；Mayer等人，J. Peptide Res. 51:432-436(1998)；Polinsky等人，J. Med. Chem. 35:4185-4194(1992)；Osapay等人，J. Med. Chem.40:2241-2251(1997)；Fukase等人，Bull. Chem. Soc. Jpn.65:2227-2240(1992)；Harpp等人，J. Org. Chem. 36:73-80(1971)；Goodman及Shao,Pure Appl. Chem. 68:1303-1308(1996)；及Osapay及Goodman,J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1599-1600(1993)。

在一些實施例中，將位置i與i+7之兩個Glu殘基之間的α,ω-二胺基烷烴繫鏈(例如1,4-二胺基丙烷及1,5-二胺基戊烷)用以穩定化升糖激素肽之α螺旋。視二胺基烷烴繫鏈之長度而定，此等繫鏈使得形成長9個原子或9個原子以上之橋。在此項技術中描述製造與此等繫鏈交聯之肽的合適方法。例如參看Phelan等人，J. Am. Chem. Soc. 119:455-460(1997)。

在本發明之又一實施例中，將雙硫橋用以交聯升糖激素肽之α螺旋之一或兩個旋。或者，將一或兩個硫原子經亞甲基置換從而引起等排巨環化之經修飾雙硫橋用以穩定化升糖激素肽之α螺旋。以雙硫橋或基於硫之環化來修飾肽的合適方法係描述於(例如)Jackson等人，J. Am. Chem. Soc. 113:9391-9392(1991)及Rudinger及Jost,Experientia 20:570-571(1964)中。

在又一實施例中，升糖激素肽之α螺旋係經由位於i及i+4處之兩個His殘基或His及Cys對結合金屬原子而穩定化。金屬原子可為(例如)Ru(III)、Cu(II)、Zn(II)或Cd(II)。在此項技術中已知基於金屬結合之α螺旋穩定化的此等方法。例如參看Andrews及Tabor,Tetrahedron 55:11711-11743(1999)；Ghadiri等人，J. Am. Chem. Soc. 112:1630-1632(1990)；及Ghadiri等人，J. Am. Chem. Soc. 119:9063-9064(1997)。

升糖激素肽之α螺旋或者可經由其他肽環化手段來穩定化，該等手段係回顧於Davies,J. Peptide. Sci. 9:471-501(2003)中。α螺旋可經由形成醯胺橋、硫醚橋、硫酯橋、脲橋、胺基甲酸酯橋、磺醯胺橋及其類似物而穩定化。舉例而言，可在C末端與Cys殘基之側鏈之間形成硫酯橋。或者，可經由具有硫醇(Cys)及羧酸(例如Asp、Glu)之胺基酸的側鏈來形成硫酯。在另一方法中，交聯劑，諸如二羧酸，例如辛二酸(suberic acid，octanedioic acid)等可在胺基酸側鏈之兩個官能基(諸如游離胺基、羥基、硫醇基及其組合)之間引入鍵聯。

根據一實施例，升糖激素肽之α螺旋係經由在位置i及i+4併有疏水性胺基酸來穩定化。舉例而言，i可為Tyr且i+4可為Val或Leu；i可為Phe且i+4可為Cys或Met；i可為Cys且i+4可為Met；或i可為Phe且i+4可為Ile。應瞭解，出於本文中之目的，可逆轉上述胺基酸對，使得在位置i處之指定胺基酸或者可位於i+4處，同時i+4胺基酸可位於i位置。

根據本發明之其他實施例，α螺旋係經由在升糖激素肽之C末端部分(約胺基酸12-29)併有(藉由胺基酸取代或插入)一或多個α螺旋穩定化胺基酸來穩定化。在一特定實施例中，α螺旋穩定化胺基酸為α,α-二取代胺基酸，包括(但不限於)以下各物中任一者：胺基異丁酸(AIB)，以選自甲基、乙基、丙基及正丁基之相同或不同基團二取代之胺基酸或以環辛烷或環庚烷二取代之胺基酸(例如，1-胺基環辛烷-1-甲酸)。在一些實施例中，升糖激素肽之位置16、17、18、19、20、21、24或29中一者、兩者、三者、四者或四者以上係經α,α-二取代胺基酸取代。在一特定實施例中，位置16、20、21及24中一者、兩者、三者或所有者係經AIB取代。舉例而言，升糖激素肽可包含在不存在分子內橋，例如非共價分子內橋(例如鹽橋)或共價分子內橋(例如內醯胺)之情況下以AIB取代位置16。此等無分子內橋之肽係有利地易於製備。

根據一些實施例，無分子內橋之升糖激素肽在胺基酸位置12-29內包含一或多個用α,α-二取代胺基酸及與升糖激素肽之胺基酸(例如在升糖激素肽之位置10之胺基酸)之側鏈共價連接的醯基或烷基進行之取代。在特定實施例中，醯基或烷基對天然存在之胺基酸而言為非原生的。在某些態樣中，醯基或烷基對位置10之胺基酸而言為非原生的。此等無分子內橋之醯化或烷基化升糖激素肽在GLP-1及升糖激素受體處呈現如與非醯化對應物肽相比增強之活性。在GLP-1及升糖激素受體處活性之進一步增強可藉由在醯基或烷基與在肽之位置10處胺基酸側鏈之間併入間隔基藉由無分子內橋之醯化升糖激素肽來達成。本文進一步描述併有或不併有間隔基之醯化及烷基化作用。

在特定實施例中，醯化或烷基化升糖激素肽，或其類似物進一步包含選擇性降低在GLP-1受體處活性之修飾。舉例而言，醯化或烷基化升糖激素肽，或其類似物包含以下各項之一或組合：C末端α羧酸酯、刪除位置27或28胺基酸C末端之胺基酸(例如刪除位置29之胺基酸、刪除位置28及29之胺基酸)、以無羥基之胺基酸(例如Abu或Ile)取代位置7之Thr。

實施例之實例

根據一實施例，SEQ ID NO:1之原生升糖激素肽係藉由以帶負電之胺基酸(例如天冬胺酸或麩胺酸)取代位置28及/或29之原生胺基酸且視情況將帶負電之胺基酸(例如天冬胺酸或麩胺酸)添加至肽之羧基末端而經修飾。在一替代性實施例中，SEQ ID NO:1之原生升糖激素肽係藉由以帶正電之胺基酸(例如離胺酸、精胺酸或組胺酸)取代位置29之原生胺基酸且視情況將一或兩個帶正電之胺基酸(例如離胺酸、精胺酸或組胺酸)添加於肽之羧基末端上而經修飾。根據一實施例，提供一種具有改良之溶解度及穩定性的升糖激素類似物，其中該類似物包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列，限制條件為至少一個位置28或29之胺基酸係經酸性胺基酸取代且/或將另一酸性胺基酸添加於SEQ ID NO:34之羧基末端。在一實施例中，酸性胺基酸係獨立地選自由Asp、Glu、磺基丙胺酸及高磺基丙胺酸組成之群。

根據一實施例，提供一種具有改良之溶解度及穩定性的升糖激素促效劑，其中該促效劑包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列，其中位置27、28或29之胺基酸中至少一者係經非原生胺基酸殘基取代(亦即至少一個存在於類似物之位置27、28或29之胺基酸為不同於存在於SEQ ID NO:1中相應位置之胺基酸的酸性胺基酸)。根據一實施例，提供一種包含SEQ ID NO:33之序列的升糖激素促效劑，限制條件為當位置28之胺基酸為天冬醯胺且位置29之胺基酸為蘇胺酸時，肽進一步包含一至兩個添加至升糖激素肽之羧基末端的獨立地選自由Lys、Arg、His、Asp或Glu組成之群的胺基酸。

已報導可在保持親本肽之至少一些活性的同時修飾原生升糖激素肽之某些位置。因此，申請者預期位於SEQ ID NO:11之肽的位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29之位置處的胺基酸中一或多者可經不同於存在於原生升糖激素肽中之胺基酸的胺基酸取代，且仍保持親本升糖激素肽之增強之效能、生理pH值穩定性及生物活性。舉例而言，根據一實施例，將存在於原生肽之位置27處的甲硫胺酸殘基變為白胺酸或正白胺酸以防止肽氧化降解。

在一實施例中，提供一種SEQ ID NO:33之升糖激素類似物，其中1至6個選自類似物之位置1、2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21或24之胺基酸不同於SEQ ID NO:1之相應胺基酸。根據另一實施例，提供一種SEQ ID NO:33之升糖激素類似物，其中1至3個選自類似物之位置1、2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21或24之胺基酸不同於SEQ ID NO:1之相應胺基酸。在另一實施例中，提供一種SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:34之升糖激素類似物，其中1至2個選自類似物之位置1、2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21或24之胺基酸不同於SEQ ID NO:1之相應胺基酸，且另一實施例在中，彼等一至兩個不同胺基酸相對於存在於原生序列(SEQ ID NO:1)中之胺基酸呈現保守性胺基酸取代。在一實施例中，提供一種SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13之升糖激素肽，其中升糖激素肽進一步包含一個、兩個或三個在選自位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27或29之位置的胺基酸取代。在一實施例中，在位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、27或29之取代為保守性胺基酸取代。

在一實施例中，提供一種包含SEQ ID NO:1之類似物肽的升糖激素促效劑，其中該類似物不同於SEQ ID NO:1之處在於在位置2具有不為絲胺酸之胺基酸且使酸性胺基酸取代位置28或29之原生胺基酸，或將酸性胺基酸添加至SEQ ID NO:1之肽的羧基末端。在一實施例中，酸性胺基酸為天冬胺酸或麩胺酸。在一實施例中，提供一種SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:32之升糖激素類似物，其中該類似物不同於母體分子之處在於位置2處之取代。更特定言之，類似物肽之位置2係經選自由D-絲胺酸、丙胺酸、D-丙胺酸、甘胺酸、N-甲基絲胺酸及胺基異丁酸組成之群的胺基酸取代。

在另一實施例中，提供一種包含SEQ ID NO:1之類似物肽的升糖激素促效劑，其中該類似物不同於SEQ ID NO:1之處在於在位置1處具有不為組胺酸之胺基酸且使酸性胺基酸取代位置28或29之原生胺基酸，或將酸性胺基酸添加至SEQ ID NO:1之肽的羧基末端。在一實施例中，酸性胺基酸為天冬胺酸或麩胺酸。在一實施例中，提供一種SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:32之升糖激素類似物，其中該類似物不同於母體分子之處在於位置1處之取代。更特定言之，類似物肽之位置1係經選自由DMIA、D-組胺酸、去胺基組胺酸、羥基-組胺酸、乙醯基-組胺酸及高組胺酸組成之群的胺基酸取代。

根據一實施例，經修飾升糖激素肽包含選自由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:32組成之群的序列。在另一實施例中，提供一種包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:32之序列的升糖激素肽，其進一步包含一至兩個添加至SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:32之C末端的胺基酸，其中額外胺基酸係獨立地選自由Lys、Arg、His、Asp、Glu、磺基丙胺酸或高磺基丙胺酸組成之群。在一實施例中，添加至羧基末端之額外胺基酸選自由Lys、Arg、His、Asp或Glu組成之群，或在另一實施例中額外胺基酸為Asp或Glu。

在另一實施例中，升糖激素肽包含SEQ ID NO:7之序列或其升糖激素促效劑類似物。在一實施例中，肽包含選自由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:13組成之群的序列。在另一實施例中，肽包含選自由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:11組成之群的序列。在一實施例中，升糖激素肽包含進一步包含添加至升糖激素肽之C末端的選自由Asp及Glu組成之群的額外胺基酸之SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:11之序列。在一實施例中，升糖激素肽包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13之序列，且在另一實施例中，升糖激素肽包含SEQ ID NO:11之序列。

根據一實施例，提供一種包含選自由以下各物組成之群的經修飾升糖激素肽之升糖激素促效劑：NH₂-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-R(SEQ ID NO:34)、NH₂-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asp-Thr-R(SEQ ID NO:11)及NH₂-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Xaa-Tyr-Leu-Glu-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asp-Thr-R(SEQ ID NO:13)

其中位置15之Xaa為Asp、G1u、磺基丙胺酸、高麩胺酸或高磺基丙胺酸，位置28之Xaa為Asn或酸性胺基酸，且位置29之Xaa為Thr或酸性胺基酸，且R為酸性胺基酸、COOH或CONH₂，限制條件為酸性酸殘基存在於位置28、29或30中一處。在一實施例中，R為COOH，且在另一實施例中，R為CONH₂。

本揭示案亦涵蓋第二肽已與升糖激素肽之C末端融合以增強升糖激素肽之穩定性及溶解度的升糖激素融合肽。更特定言之，融合升糖激素肽可包含升糖激素促效劑類似物，該升糖激素促效劑類似物包含升糖激素肽NH₂-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-R(SEQ ID NO:34)，其中R為與升糖激素肽之羧基末端胺基酸鍵聯之酸性胺基酸或鍵及SEQ ID NO:20(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO:21(KRNRNNIA)或SEQ ID NO:22(KRNR)之胺基酸序列。在一實施例中，升糖激素肽係選自由SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8(進一步包含與升糖激素肽之羧基末端胺基酸鍵聯之SEQ ID NO:20(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO:21(KRNRNNIA)或SEQ ID NO:22(KRNR)之胺基酸序列)組成之群。在一實施例中，升糖激素融合肽包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6或其升糖激素促效劑類似物，其進一步包含與升糖激素肽之胺基酸29鍵聯之SEQ ID NO:20(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO:21(KRNRNNIA)或SEQ ID NO:22(KRNR)之胺基酸序列。根據一實施例，融合肽進一步包含與在位置16、17、21、24、29、在C末端延伸內或在C末端胺基酸之胺基酸鍵聯之PEG鏈，其中PEG鏈係選自500道爾頓至40,000道爾頓之範圍。在一實施例中，SEQ ID NO:20(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO:21(KRNRNNIA)或SEQ ID NO:22(KRNR)之胺基酸序列係經由肽鍵與升糖激素肽之胺基酸29結合。在一實施例中，升糖激素融合肽之升糖激素肽部分包含選自由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:13組成之群的序列。在一實施例中，升糖激素融合肽之升糖激素肽部分包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13之序列，其中分別在位置21、24、29、在C末端延伸內或在C末端胺基酸處鍵聯PEG鏈。

在另一實施例中，融合肽之升糖激素肽序列包含SEQ ID NO:11之序列，其進一步包含與升糖激素肽之胺基酸29鍵聯之SEQ ID NO:20(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO:21(KRNRNNIA)或SEQ ID NO:22(KRNR)之胺基酸序列。在一實施例中，升糖激素融合肽包含選自由SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25及SEQ ID NO:26組成之群的序列。本發明之融合肽通常將具有具備標準羧酸基之C末端胺基酸。然而，亦涵蓋C末端胺基酸具有取代羧酸之醯胺的彼等序列之類似物作為實施例。根據一實施例，融合升糖激素肽包含選自由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:13(進一步包含與升糖激素肽之胺基酸29鍵聯的SEQ ID NO:23之胺基酸序列(GPSSGAPPPS-CONH₂))組成之群的升糖激素促效劑類似物。

本發明之升糖激素促效劑可進一步經修飾以在保持升糖激素肽之生物活性的同時改良肽在水溶液中之溶解度及穩定性。根據一實施例，預期在選自SEQ ID NO:11之肽或其升糖激素促效劑類似物的位置16、17、20、21、24及29之一或多個位置引入親水基改良pH值穩定化升糖激素類似物之溶解度及穩定性。更特定言之，在一實施例中，SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:32之升糖激素肽係經修飾以包含一或多個與存在於升糖激素肽之位置21及24的胺基酸之側鏈共價鍵聯之親水基。

根據一實施例，將SEQ ID NO:11之升糖激素肽修飾以含有一或多個在位置16、17、20、21、24及/或29之胺基酸取代，其中原生胺基酸係經具有適於與親水部分(例如包括PEG)交聯之側鏈的胺基酸取代。原生肽可經天然存在之胺基酸或合成(非天然存在)胺基酸取代。合成或非天然存在之胺基酸係指並非活體內天然存在然而可併入本文所述之肽結構中的胺基酸。

在一實施例中，提供一種EQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13之升糖激素促效劑，其中原生升糖激素肽序列已在原生序列之位置16、17、21、24、29中至少一處、C末端延伸內或C末端胺基酸處係經修飾以含有天然存在或合成之胺基酸，其中胺基酸取代基進一步包含親水部分。在一實施例中，取代係在位置21或24，且在另一實施例中，親水部分為PEG鏈。在一實施例中，SEQ ID NO:11之升糖激素肽係經至少一個半胱胺酸殘基取代，其中半胱胺酸殘基之側鏈係以硫醇反應性試劑(例如包括馬來醯亞胺基、乙烯碸、2-吡啶基硫基、鹵烷基及鹵醯基)進一步修飾。此等硫醇反應性試劑可含有羧基、酮基、羥基及醚基以及其他親水部分，諸如聚乙二醇單元。在一替代性實施例中，原生升糖激素肽係經離胺酸取代，且使用諸如羧酸之活性酯(丁二醯亞胺基、酸酐等)之胺反應性試劑或諸如聚乙二醇之親水部分之醛來進一步修飾取代性離胺酸殘基之側鏈。在一實施例中，升糖激素肽係選自由SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:19組成之群。

根據一實施例，聚乙二醇化升糖激素肽包含兩條或兩條以上與升糖激素肽共價鍵結之聚乙烯鏈，其中升糖激素鏈之總分子量為約1,000道爾頓至約5,000道爾頓。在一實施例中，聚乙二醇化升糖激素促效劑包含SEQ ID NO:6之肽，其中PEG鏈係與位置21及位置24之胺基酸殘基共價鍵聯，且其中兩條PEG鏈之組合分子量為約1,000道爾頓至約5,000道爾頓。在另一實施例中，聚乙二醇化升糖激素促效劑包含SEQ ID NO:6之肽，其中PEG鏈係與位置21及位置24之胺基酸殘基共價鍵聯，且其中兩條PEG鏈之組合分子量為約5,000道爾頓至約20,000道爾頓。

聚乙二醇鏈可呈直鏈之形式或其可為分支鏈。根據一實施例，聚乙二醇鏈具有選自約500道爾頓至約40,000道爾頓之範圍的平均分子量。在一實施例中，聚乙二醇鏈具有選自約500道爾頓至約5,000道爾頓之範圍的分子量。在另一實施例中，聚乙二醇鏈具有約20,000道爾頓至約40,000道爾頓之分子量。

上述升糖激素肽中任一者可經進一步修飾以在升糖激素肽之C末端部分(胺基酸位置12-29)中包括共價或非共價分子內橋或α螺旋穩定化胺基酸。根據一實施例，升糖激素肽包含除在位置16、20、21或24(或其組合)用α,α-二取代胺基酸(例如AIB)進行胺基酸取代外的上文所討論之修飾中任一或多者。根據另一實施例，升糖激素肽包含除在升糖激素肽之位置16與20之胺基酸的側鏈之間的分子內橋，例如內醯胺外的上文所討論之修飾中任一或多者。

根據一些實施例，升糖激素肽包含SEQ ID NO:77之胺基酸序列，其中位置3之Xaa為包含結構I、II或III之側鏈的胺基酸:

其中R¹為C_0-3烷基或C_0-3雜烷基；R²為NHR⁴或C_1-3烷基；R³為C_1-3烷基；R⁴為H或C_1-3烷基；X為NH、O或S；且Y為NHR⁴、SR³或OR³。在一些實施例中，X為NH或Y為NHR⁴。在一些實施例中，R¹為C_0-2烷基或C₁雜烷基。在一些實施例中，R²為NHR⁴或C₁烷基。在一些實施例中，R⁴為H或C₁烷基。在例示性實施例中，提供一種包含結構I之側鏈的胺基酸，其中R¹為CH₂-S，X為NH，且R²為CH₃(乙醯胺基甲基-半胱胺酸，C(Acm))；R¹為CH₂，X為NH，且R²為CH₃(乙醯基二胺基丁酸，Dab(Ac))；R¹為C₀烷基，X為NH，R²為NHR⁴，且R⁴為H(胺甲醯基二胺基丙酸，Dap(脲))；或R¹為CH₂-CH₂，X為NH，且R²為CH₃(乙醯鳥胺酸，Orn(Ac))。在例示性實施例中，提供一種包含結構II之側鏈的胺基酸，其中R¹為CH₂，Y為NHR⁴且R⁴為CH₃(甲基麩胺醯胺，Q(Me))；在例示性實施例中，提供一種包含結構III之側鏈的胺基酸，其中R¹為CH₂且R⁴為H(甲硫胺酸-亞碸，M(O))；在特定實施例中，位置3之胺基酸係經Dab(Ac)取代。舉例而言，升糖激素促效劑可包含SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73及SEQ ID NO:74之胺基酸序列。

在某些實施例中，升糖激素肽為SEQ ID NO:77之升糖激素肽之類似物。在特定態樣中，類似物包含本文所述之胺基酸修飾中任一者，其包括(但不限於)：以帶電胺基酸取代位置28之Asn；以選自由Lys、Arg、His、Asp、Glu、磺基丙胺酸及高磺基丙胺酸組成之群的帶電胺基酸取代位置28之Asn；在位置28用Asn、Asp或Glu取代；在位置28用Asp取代；在位置28用Glu取代；以帶電胺基酸取代位置29之Thr；以選自由Lys、Arg、His、Asp、Glu、磺基丙胺酸及高磺基丙胺酸組成之群的帶電胺基酸取代位置29之Thr；在位置29用Asp、Glu或Lys取代；在位置29用Glu取代；在位置29之後插入1-3個帶電胺基酸；在位置29之後插入Glu或Lys；在位置29之後插入Gly-Lys或Lys-Lys；及其組合。

在某些實施例中，SEQ ID NO:77之升糖激素肽之類似物在位置16、20、21及24中一者、兩者、三者或所有位置均包含α,α-二取代胺基酸，諸如AIB。

在某些實施例中，SEQ ID NO:77之升糖激素肽之類似物包含以下各物中一或多者：以降低升糖激素肽被二肽基肽酶IV(DPP-IV)裂解之敏感性的非原生胺基酸取代位置1之His，以降低升糖激素肽被二肽基肽酶IV(DPP-IV)裂解之敏感性的非原生胺基酸取代位置2之Ser，以無羥基之胺基酸(例如Abu或Ile)取代位置7之Thr；以Phe或Val取代位置10之Tyr；以Arg取代位置12之Lys；以Glu取代位置15之Asp；以Thr或AIB取代位置16之Ser；以Ala或AIB取代位置20之Gln；以Glu取代位置21之Asp；以Ala或AIB取代位置24之Gln；以Leu或Nle取代位置27之Met；刪除位置27-29之胺基酸；刪除位置28-29之胺基酸；刪除位置29之胺基酸；將SEQ ID NO:20之胺基酸序列添加至C末端，其中位置29之胺基酸為Thr或Gly，或其組合。

根據特定實施例，升糖激素肽包含SEQ ID NO:62-67及69-74中任一者之胺基酸序列。

在某些實施例中，包含SEQ ID NO:77之升糖激素肽之類似物包含與在位置16、17、20、21、24及29中任一處或在C末端胺基酸之胺基酸共價鍵聯的例如PEG之親水部分。

在某些實施例中，包含SEQ ID NO:77之升糖激素肽之類似物包含含有視情況經由間隔基與醯基或烷基共價連接之側鏈的胺基酸，該醯基或烷基對天然存在之胺基酸而言為非原生的。在一些實施例中，醯基為C₄至C₃₀脂肪醯基。在其他實施例中，烷基為C₄至C₃₀烷基。在特定態樣中，醯基或烷基係係與位置10之胺基酸之側鏈共價連接。在一些實施例中，位置7之胺基酸為Ile或Abu。

用途

如在實例中詳細描述，本發明之升糖激素促效劑在生理pH值之溶液中具有增強之生物物理學穩定性及水溶性，同時相對於原生肽保持生物活性或顯示增強之生物活性。因此，咸信本發明之升糖激素促效劑適於先前已關於原生升糖激素肽所述之任何用途。因此，本文所述之經修飾升糖激素肽可用以治療低血糖症，提高血糖含量，誘導腸管暫時性麻痹以用於放射性用途，降低且維持體重，作為胰島素之輔助療法，或治療由升糖激素之低血液含量引起的其他代謝疾病。

亦預期本文所述之升糖激素肽用以降低或維持體重，或治療高血糖症，或降低血糖含量，或使血糖含量正常化，且/或使血糖含量穩定化。使血液含量「正常化」意謂使血糖含量恢復正常(例如，若血糖含量高於正常值，則將其降低，或若血糖含量低於正常值，則將其提高)。使血糖含量「穩定化」意謂降低血糖含量歷經例如8小時、16小時、24小時、2天、3天、4天、5天、6天或1週之時間段的最大變化。舉例而言，投與升糖激素肽使得血糖含量隨時間流逝比不投與升糖激素肽情況下之血糖含量維持更接近於葡萄糖值之正常範圍。

本發明之升糖激素肽可單獨或與其他抗糖尿病或抗肥胖症藥劑組合投與。在此項技術中已知或在研究中之抗糖尿病藥劑包括胰島素、磺醯脲，諸如甲苯磺丁脲(山地酶(Orinase))、乙醯苯磺醯環己脲(acetohexamide)(Dymelor)、妥拉磺脲(tolazamide)(甲磺吖庚脲(Tolinase))、氯磺丙脲(chlorpropamide)(特泌胰(Diabinese))、格列吡嗪(glipizide)(Glucotrol)、格列本脲(glyburide)(Diabeta,Micronase,Glynase)、格列美脲(glimepiride)(Amaryl)或格列齊特(gliclazide)(Diamicron)；美格替奈(meglitinides)，諸如瑞格列奈(repaglinide)(Prandin)或那格列奈(nateglinide)(Starlix)；雙胍，諸如二甲雙胍(Glucophage)或苯乙雙胍；噻唑啶二酮，諸如羅格列酮(rosiglitazone)(Avandia)、吡格列酮(pioglitazone)(Actos)或曲格列酮(troglitazone)(Rezulin)，或其他PPARγ抑制劑；抑制碳水化合物消化之α葡糖苷酶抑制劑，諸如米格列醇(miglitol)(Glyset)、醣祿(acarbose)(Precose/Glucobay)；艾塞那肽(exenatide)(Byetta)或普蘭林肽(pramlintide)；二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制劑，諸如維達列汀(vildagliptin)或斯他裏普汀(sitagliptin)；SGLT(鈉依賴性葡萄糖轉運體1)抑制劑；葡糖激酶活化劑(GKA)；升糖激素受體拮抗劑(GRA)；或FBPase(果糖1,6-雙磷酸酶)抑制劑。

在此項技術中已知或在研究中之抗肥胖症藥劑包括食慾抑制劑，其包括苯乙胺型刺激劑、苯丁胺(視情況具有氟苯丙胺或右旋氟苯丙胺)、安非拉酮(diethylpropion)(Tenuate)、苯甲曲秦(phendimetrazine)(Prelu-2，Bontril)、苄非他明(benzphetamine)(Didrex)、諾美婷(Meridia，Reductil)；利莫納班(rimonabant)(Acomplia)、其他大麻鹼受體拮抗劑；調酸素(oxyntomodulin)；氟西汀鹽酸鹽(fluoxetine hydrochloride)(Prozac)；Qnexa(托吡酯(topiramate)及苯丁胺)、Excalia(安非他酮(bupropion)及唑尼沙胺(zonisamide))或Contrave(安非他酮及納曲酮(naltrexone))；或脂肪酶抑制劑，其類似於羅氏鮮(xenical)(Orlistat)或西替利司他(Cetilistat)(亦稱為ATL-962)，或GT 389-255。

本揭示案之一個態樣係關於目前所揭示用於治療低血糖症之升糖激素促效劑之預調配水溶液。本文所述之促效劑組合物的經改良穩定性及/或溶解度允許製備升糖激素之預調配水溶液以便快速投與及治療低血糖症。因此，在一實施例中，提供一種包含本發明之升糖激素促效劑的溶液以便向患有低血糖症之患者投與。在一實施例中，提供一種包含如本文所揭示之聚乙二醇化升糖激素促效劑之溶液以便向患有低血糖症之患者投與，其中與聚乙二醇化升糖激素促效劑鍵聯之PEG鏈之總分子量係介於約500道爾頓至約5,000道爾頓之間。在一實施例中，聚乙二醇化升糖激素促效劑包含選自由SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:19組成之群的肽，及其升糖激素促效劑類似物，其中在該升糖激素肽之位置16、17、21、24或29、在C末端延伸內或在C末端胺基酸處之胺基酸殘基側鏈係與聚乙二醇鏈共價鍵結。在一實施例中，聚乙二醇化升糖激素促效劑包含SEQ ID NO:16之肽，其中在肽之位置21處的胺基酸殘基係與聚乙二醇共價鍵聯。在一實施例中，聚乙二醇化升糖激素促效劑包含SEQ ID NO:17之肽，其中在肽之位置24處的胺基酸殘基係與聚乙二醇共價鍵聯。

包括(但不限於)治療低血糖症之根據本發明之治療方法可包含使用任何標準投藥途徑，包括非經腸，諸如靜脈內、腹膜內、皮下或肌肉內、鞘內、經皮、經直腸、經口、經鼻或藉由吸入向患者投與本發明所揭示之升糖激素促效劑的步驟。在一實施例中，以皮下或肌肉內方式投與該組合物。在一實施例中，以非經腸方式投與組合物且將升糖激素組合物預包裝於注射器中。在另一實施例中，將組合物預包裝於吸入器或其他霧化藥物傳遞器件中。有利地，相對於原生升糖激素，本文所揭示之水性穩定升糖激素類似物在用於藥理學目的之最寬廣pH值範圍之水性緩衝液中呈現優良之穩定性及溶解度。使用本文所揭示之穩定化升糖激素類似物允許在生理pH值下製備及儲存升糖激素促效劑溶液歷時長時間段。

申請者已發現可製備保持親本肽之生物活性及特異性的聚乙二醇化升糖激素肽。然而，增大PEG鏈之長度，或使多個PEG鏈與肽連接，使得鍵聯PEG之總分子量大於5,000道爾頓，其開始延遲經修飾升糖激素之作用時間。根據一實施例，提供SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13之升糖激素肽，或其升糖激素促效劑類似物，其中肽包含一或多條聚乙二醇鏈，其中鍵聯PEG之總分子量大於5,000道爾頓，且在一實施例中大於10,000道爾頓，但小於40,000道爾頓。此等經修飾升糖激素肽具有延遲之活性時間但並不損失生物活性。因此，可預防性地投與此等化合物以延長所投與升糖激素肽之作用。

已修飾為與分子量大於10,000道爾頓之PEG鏈共價鍵結之升糖激素肽可與胰島素結合投與以緩衝胰島素之作用且有助於維持糖尿病患者體內之穩定血糖含量。本揭示案之經修飾升糖激素肽可與胰島素以單一組合物形式共投與，同時以獨立溶液之形式投與，或者，胰島素及經修飾升糖激素肽可相對於彼此在不同時間投與。在一實施例中，包含胰島素之組合物及包含經修飾升糖激素肽之組合物係彼此在12小時內投與。經修飾升糖激素肽相對於所投與胰島素之精確比率將部分地視患者之升糖激素含量測定而定，且可經由常規實驗來測定。

根據一實施例，提供一種組合物，其包含胰島素及選自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5組成之群的經修飾升糖激素肽及其升糖激素促效劑類似物，其中經修飾升糖激素肽進一步包含與在位置16、17、21、24、29、在C末端延伸內或在C末端胺基酸處之胺基酸側鏈共價鍵結之聚乙二醇鏈。在一實施例中，組合物為包含胰島素及升糖激素類似物之水溶液。在升糖激素肽包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13之序列的實施例中，肽可進一步包含與在位置16、17、21、24、29、在C末端延伸內或在C末端胺基酸處之胺基酸側鏈共價鍵結之聚乙二醇鏈。在一實施例中，經修飾升糖激素肽之PEG鏈之分子量大於10,000道爾頓。在一實施例中，聚乙二醇化升糖激素肽包含選自由SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:13組成之群的肽，其中在該升糖激素肽之位置21或24之胺基酸殘基的側鏈係與聚乙二醇鏈共價鍵結。在一實施例中，聚乙二醇鏈具有約10,000至約40,000之分子量。

根據一實施例，將本文所揭示之經修飾升糖激素肽用以誘導腸道暫時性麻痹。此方法具有用於放射性目的之效用且包含投與有效量之醫藥組合物的步驟，該醫藥組合物包含聚乙二醇化升糖激素肽、包含C末端延伸之升糖激素肽，或此等肽之二聚體。在一實施例中，升糖激素肽包含選自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:13組成之群的序列。在一實施例中，升糖激素肽進一步包含約1,000道爾頓至40,000道爾頓之PEG鏈，該PEG鏈係與在位置21、24或29、在C末端延伸內或在C末端胺基酸處之胺基酸殘基共價鍵結。在一實施例中，升糖激素肽係選自由SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:17組成之群。在一實施例中，PEG鏈具有約500道爾頓至約5,000道爾頓之分子量。

在另一實施例中，用以誘導腸道暫時性麻痹之組合物包含第一經修飾升糖激素肽及第二經修飾升糖激素肽，其中該第一經修飾肽包含視情況與約500道爾頓至約5,000道爾頓之PEG鏈鍵聯選自由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:13組成之群的序列，且第二肽包含約10,000道爾頓至約40,000道爾頓之共價鍵聯PEG鏈。在此實施例中，各肽之PEG鏈係與各別肽之位置21、24或29，C末端延伸內或C末端胺基酸處之胺基酸殘基共價鍵結，且彼此獨立。

已報導可見於小腸中之天然存在之消化激素(調酸素)當向大鼠或人類投與時引起體重減輕(參看Diabetes 2005；54:2390-2395)。調酸素為含有升糖激素(亦即SEQ ID NO:1)之29個胺基酸序列接著SEQ ID NO:23之8個胺基酸羧基末端延伸(KRNRNNIA)的37個胺基酸肽。因此，申請者咸信藉由以本文所揭示之經修飾升糖激素肽取代調酸素之升糖激素肽部分，可保持調酸素之生物活性(亦即食慾抑制及誘導體重減輕/體重維持)，同時改良化合物之溶解度及穩定性且改良藥物動力學。另外，申請者亦相信包含本發明之升糖激素肽的經截斷調酸素分子(具有經移除調酸素之末端四個胺基酸)在抑制食慾及誘導體重減輕/體重維持方面亦將為有效的。

因此，本發明亦涵蓋具有SEQ ID NO:21(KRNRNNIA)或SEQ ID NO:22之羧基末端延伸的本發明之經修飾升糖激素肽。根據一實施例，向個體投與進一步包含與升糖激素肽之胺基酸29鍵聯之SEQ ID NO:21(KRNRNNIA)或SEQ ID NO:22之胺基酸序列的SEQ ID NO:33之升糖激素促效劑類似物以誘導體重減輕或預防體重增加。根據一實施例，向個體投與進一步包含與升糖激素肽之胺基酸29鍵聯之SEQ ID NO:21(KRNRNNIA)或SEQ ID NO:22之胺基酸序列的SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13之升糖激素促效劑類似物以誘導體重減輕或預防體重增加。在另一實施例中，在個體中減少體重增加或誘導體重減輕之方法包含投與有效量之包含升糖激素促效劑之組合物，該升糖激素促效劑包含選自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5組成之群的升糖激素肽，其中升糖激素肽之胺基酸29係經由肽鍵與第二肽鍵結，且該第二肽包含SEQ ID NO:24(KRNRNNIA)或SEQ ID NO:25之序列，且其中約1,000道爾頓至40,000道爾頓之PEG鏈係與位置21及/或24之胺基酸殘基共價鍵結。在一實施例中，升糖激素促效劑之升糖激素肽區段係選自由SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:19組成之群，其中約1,000道爾頓至40,000道爾頓之PEG鏈係與在位置16、17、21、24或29、在C末端延伸內或在C末端胺基酸處之胺基酸殘基共價鍵結。

艾生丁-4(Exendin-4)為由39個胺基酸組成之肽。其為稱為GLP-1之受體之強大刺激劑。亦已報導此肽抑制食慾且誘導體重減輕。申請者已發現艾生丁-4之末端序列當添加於升糖激素之羧基末端時改良升糖激素之溶解度及穩定性而未損害升糖激素之生物活性。在一實施例中，艾生丁-4之末端十個胺基酸(亦即SEQ ID NO:20之序列(GPSSGAPPPS))係與本揭示案之升糖激素肽之羧基末端鍵聯。在特定態樣中，SEQ ID NO:20之序列係與升糖激素肽之C末端鍵聯且位置29之胺基酸為Thr或Gly。預期此等融合蛋白對於抑制食慾及誘導體重減輕/體重維持而言具有藥理學活性。在一實施例中，SEQ ID NO:20延伸之末端胺基酸包含代替羧基之醯胺基(亦即SEQ ID NO:23)且此序列係與本揭示案之升糖激素肽之羧基末端鍵聯。

在一實施例中，在個體中減少體重增加或誘導體重減輕之方法包含投與有效量之包含升糖激素促效劑之組合物，該升糖激素促效劑包含SEQ ID NO:33之升糖激素肽，其中升糖激素肽之胺基酸29係經由肽鍵與第二肽鍵結，且該第二肽包含SEQ ID NO:20(GPSSGAPPPS)或SEQ ID NO:23之序列。在一實施例中，升糖激素肽係選自由以下各物組成之群：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:13，其中升糖激素肽之胺基酸29係經由肽鍵與第二肽結合，且該第二肽包含SEQ ID NO:20(GPSSGAPPPS)或SEQ ID NO:23之序列。在一實施例中，升糖激素促效劑之升糖激素肽係選自由SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:13組成之群。在一實施例中，融合肽之升糖激素肽區段係選自由SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:17組成之群，其中PEG鏈之分子量係選自500道爾頓至40,000道爾頓之範圍。更特定言之，在一實施例中，融合肽之升糖激素肽係選自由SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:17組成之群，其中PEG鏈之分子量係選自1,000至5,000之範圍。

在另一實施例中，藉由投與包含第一聚乙二醇化升糖激素肽及第二聚乙二醇化升糖激素肽之醫藥組合物，向患者投與組合物以抑制食慾、預防體重增加及/或誘導體重減輕，其中第一及第二肽為包含含有SEQ ID NO:20(GPSSGAPPPS)或SEQ ID NO:23之C末端肽延伸的融合肽。第一聚乙二醇化升糖激素肽包含約500道爾頓至約10,000道爾頓之共價鍵聯PEG，且第二聚乙二醇化升糖激素肽包含約10,000道爾頓至約40,000道爾頓之共價鍵聯PEG鏈。

本揭示案亦涵蓋本文所揭示之經修飾升糖激素肽之多聚體。可使用熟習此項技術者已知之標準鍵聯劑及程序使經修飾升糖激素肽中兩者或兩者以上鍵聯在一起。舉例而言，尤其對於已被半胱胺酸、離胺酸、鳥胺酸、高半胱胺酸或乙醯基苯丙胺酸殘基(例如SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:5)取代之升糖激素肽而言，可經由使用雙官能硫醇交聯劑及雙官能胺交聯劑在兩個經修飾升糖激素肽之間形成二聚體。二聚體可為均二聚體或者可為雜二聚體。在一實施例中，二聚體包含升糖激素融合肽之均二聚體，其中升糖激素肽部分包含SEQ ID NO:11之促效劑類似物，及與升糖激素肽之胺基酸29鍵聯的SEQ ID NO:20(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO:21(KRNRNNIA)或SEQ ID NO:22(KRNR)之胺基酸序列。在另一實施例中，二聚體包含SEQ ID NO:11之升糖激素促效劑類似物之均二聚體，其中升糖激素肽進一步包含與升糖激素肽之位置21、24、29，在C末端延伸內或在C末端胺基酸處共價鍵結之聚乙二醇鏈。

根據一實施例，提供一種二聚體，其包含經由連接子與第二升糖激素肽鍵結之第一升糖激素肽，其中第一升糖激素肽包含選自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:11組成之群的肽，且第二升糖激素肽包含SEQ ID NO:33。此外，關於第二升糖激素肽，當位置28之胺基酸為天冬醯胺且位置29之胺基酸為蘇胺酸時，第二升糖激素肽進一步包含一至兩個添加至第二升糖激素肽之羧基末端的胺基酸(獨立地選自由Lys、Arg、His、Asp或Glu組成之群)，及該等升糖激素多肽之醫藥學上可接受之鹽。

根據另一實施例，提供一種二聚體，其包含經由連接子與第二升糖激素肽鍵結之第一升糖激素肽，其中該第一升糖激素肽係選自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:13組成之群，且第二升糖激素肽係獨立地選自由SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:13組成之群，及該等升糖激素多肽之醫藥學上可接受之鹽。在一實施例中，第一升糖激素肽係選自由SEQ ID NO:7組成之群且第二升糖激素肽係獨立地選自由SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:13組成之群。在一實施例中，在兩個肽之間形成二聚體，其中各肽包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列。

根據一實施例，提供一種醫藥組合物，其中該組合物包含本揭示案之升糖激素促效劑類似物，或其醫藥學上可接受之鹽，及醫藥學上可接受之載劑。該醫藥組合物可包含任何醫藥學上可接受之成份，例如包括酸化劑、添加劑、吸附劑、推噴劑(aerosol propellant)、排氣劑、鹼化劑、防結塊劑、抗凝劑、抗微生物防腐劑、抗氧化劑、防腐劑、基劑、黏合劑、緩衝劑、螯合劑、塗布劑、著色劑、乾燥劑、清潔劑、稀釋劑、消毒劑、崩解劑、分散劑、溶解增強劑、染料、潤膚劑、乳化劑、乳液穩定劑、填充劑、成膜劑、風味增強劑(flavor enhancer)、調味劑、流動增強劑(flow enhancer)、膠凝劑、成粒劑、保濕劑、潤滑劑、黏膜黏著劑(mucoadhesive)、軟膏基劑、軟膏、油性媒劑、有機基劑、片劑基劑、顏料、增塑劑、拋光劑、防腐劑、螯合劑、皮膚浸透劑、助溶劑、溶劑、穩定劑、栓劑基劑、表面活性劑、界面活性劑、懸浮劑、甜味劑、治療劑、增稠劑、滲透劑、毒性劑、增黏劑、吸水劑、水可混溶共溶劑、軟水劑或濕潤劑。

在一些實施例中，醫藥組合物包含以下組份之任一者或組合：阿拉伯膠、乙醯磺胺酸鉀、檸檬酸乙醯三丁酯、檸檬酸乙醯三乙酯、瓊脂、白蛋白、酒精、脫水酒精、變性酒精、稀釋酒精、油桐酸、海藻酸、脂族聚酯、氧化鋁、氫氧化鋁、硬脂酸鋁、支鏈澱粉、α-直鏈澱粉、抗壞血酸、抗壞血酸棕櫚酸酯、阿斯巴甜糖(aspartame)、注射用抑菌水、膨潤土、皂黏土乳(bentonite magma)、氯化苯甲烴銨、苄索氯銨(benzethonium chloride)、苯甲酸、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、溴硝丙二醇、丁基化羥基甲氧苯、丁基化羥基甲苯、對羥基苯甲酸丁酯、對羥基苯甲酸丁酯鈉、海藻酸鈣、抗壞血酸鈣、碳酸鈣、環己胺基磺酸鈣、無水磷酸氫二鈣、脫水磷酸氫二鈣、磷酸三鈣、丙酸鈣、矽酸鈣、山梨酸鈣、硬脂酸鈣、硫酸鈣、半水合硫酸鈣、菜籽油、卡波姆(carbomer)、二氧化碳、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、β-胡蘿蔔素、角叉菜膠、蓖麻油、氫化蓖麻油、陽離子乳化蠟、乙酸纖維素、酞酸乙酸纖維素、乙基纖維素、微晶纖維素、粉末纖維素、矽化微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉、十六醇硬脂醇、西曲溴銨(cetrimide)、十六醇、氯己定、氯丁醇、氯甲酚、膽固醇、乙酸氯己定、葡糖酸氯己定、鹽酸氯己定、氯二氟乙烷(HCFC)、氯二氟甲烷、氯氟碳化物(CFC)、氯苯氧基乙醇、氯二甲苯酚、玉米糖漿固體、無水檸檬酸、單水合檸檬酸、可可脂、著色劑、玉米油、棉籽油、甲酚、間甲酚、鄰甲酚、對甲酚、交聯羧甲纖維素鈉、交聯聚乙烯吡咯酮、環己胺磺酸(cyclamic acid)、環糊精、葡萄糖結合劑、糊精、右旋糖、無水右旋糖、重氮利定脲、鄰苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、二乙醇胺、鄰苯二甲酸二乙酯、二氟乙烷(HFC)、二甲基-β-環糊精、環糊精型化合物(諸如Captisol)、二甲醚、鄰苯二甲酸二甲酯、依地酸二鉀(disodium edentate)、依地酸二鈉、磷酸氫二鈉、多庫酯鈣(docusate calcium)、多庫酯鉀、多庫酯鈉、沒食子酸十二酯、溴化十二基三甲銨、依地酸鈣二鈉(edentate calcium disodium)、依地酸、乙葡胺(eglumine)、乙醇、乙基纖維素、沒食子酸乙酯、月桂酸乙酯、乙麥芽醇、油酸乙酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸乙酯鉀、對羥基苯甲酸乙酯鈉、乙香草醛、果糖、果糖液體、經研磨果糖、無熱原質果糖、粉末果糖、反丁烯二酸、明膠、葡萄糖、液體葡萄糖、飽和植物脂肪酸之甘油酯混合物、甘油、蘿酸甘油酯、單油酸甘油酯、單硬脂酸甘油酯、自乳化單硬脂酸甘油酯、棕櫚基硬脂酸甘油酯、甘胺酸、二醇、聚乙二醇四氫呋喃甲基醚(glycofurol)、瓜爾膠(guar gum)、七氟丙烷(HFC)、溴化十六基三甲銨、高果糖糖漿、人血清白蛋白、烴(HC)、稀鹽酸、氫化植物油、II型、羥乙基纖維素、2-羥乙基-β-環糊精、羥丙基纖維素、低取代羥丙基纖維素、2-羥丙基-β-環糊精、羥丙基甲基纖維素、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素、咪唑啶基脲、靛卡紅(indigo carmine)、離子交換劑、氧化鐵、異丙醇、十四烷酸異丙酯、棕櫚酸異丙酯、等張鹽水、高嶺土、乳酸、乳糖醇、乳糖、羊毛脂、羊毛脂醇、無水羊毛脂、卵磷脂、矽酸鎂鋁、碳酸鎂、碳酸鎂正鹽(normal magnesium carbonate)、無水碳酸鎂、氫氧化碳酸鎂、氫氧化鎂、月桂基硫酸鎂、氧化鎂、矽酸鎂、硬脂酸鎂、三矽酸鎂、無水三矽酸鎂、蘋果酸、麥芽、麥芽糖醇、麥芽糖醇溶液、麥芽糊精、麥芽酚、麥芽糖、甘露糖醇、中鏈三酸甘油酯、葡甲胺、薄荷腦、甲基纖維素、甲基丙烯酸甲酯、油酸甲酯、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸甲酯鉀、對羥基苯甲酸甲酯鈉、微晶纖維素及羧甲基纖維素鈉、礦物油、輕質礦物油、礦物油及羊毛脂醇、油、橄欖油、單乙醇胺、蒙脫石(montmorillonite)、沒食子酸辛酯、油酸、棕櫚酸、石蠟、花生油、石蠟脂、石蠟脂及羊毛脂醇、醫藥釉料(pharmaceutical glaze)、酚、液化酚、苯氧乙醇、苯氧基丙醇、苯乙醇、乙酸苯汞、硼酸苯汞、硝酸苯汞、泊拉可林(polacrilin)、泊拉可林鉀(polacrilin potassium)、泊洛沙姆(poloxamer)、聚右旋糖、聚乙二醇、聚氧化乙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯-聚氧化丙烯-嵌段聚合物、聚甲基丙烯酸酯、聚氧化乙烯烷基醚、聚氧化乙烯蓖麻油衍生物、聚氧化乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、海藻酸鉀、苯甲酸鉀、碳酸氫鉀、亞硫酸氫鉀、氯化鉀、檸檬酸鉀、無水檸檬酸鉀、磷酸氫鉀、偏亞硫酸氫鉀、磷酸二氫鉀、丙酸鉀、山梨酸鉀、聚乙烯吡咯酮、丙醇、丙酸、碳酸丙二酯、丙二醇、海藻酸丙二酯、沒食子酸丙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丙酯鉀、對羥基苯甲酸丙酯鈉、硫酸魚精蛋白、菜籽油、林格氏溶液(Ringer's solution)、糖精、糖精銨、糖精鈣、糖精鈉、紅花油、皂石、血清蛋白、芝麻油、膠體矽石、膠體二氧化矽、海藻酸鈉、抗壞血酸鈉、苯甲酸鈉、碳酸氫鈉、亞硫酸氫鈉、氯化鈉、無水檸檬酸鈉、脫水檸檬酸鈉、氯化鈉、環己胺基磺酸鈉、依地酸鈉、十二烷基硫酸鈉、月桂基硫酸鈉、偏亞硫酸氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸三鈉、無水丙酸三鈉、丙酸鈉、山梨酸鈉、羥基乙酸澱粉鈉、硬脂醯反丁烯二酸鈉、亞硫酸鈉、山梨酸、脫水山梨糖醇酯(脫水山梨糖醇脂肪酸酯)、山梨糖醇、70%山梨糖醇溶液、大豆油、鯨蠟、澱粉、玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、預膠凝化澱粉、可殺菌玉米澱粉、硬脂酸、經純化硬脂酸、十八烷醇、蔗糖、糖、可壓縮糖、糖粉(confectioner's sugar)、糖球、轉化糖、Sugartab、晚霞黃(Sunset Yellow)FCF、合成石蠟、滑石、酒石酸、酒石黃、四氟乙烷(HFC)、可可油(theobroma oil)、硫柳汞(thimerosal)、二氧化鈦、α生育酚、乙酸生育酚酯、α酸式丁二酸生育酚酯、β-生育酚、δ-生育酚、γ-生育酚、黃蓍、三乙酸甘油酯、檸檬酸三丁酯、三乙醇胺、檸檬酸三乙酯、三甲基-β-環糊精、溴化三甲基十四基銨、tris緩衝液、依地酸三鈉、香蘭素、I型氫化植物油、水、軟水、硬水、無二氧化碳水、無熱原質水、注射用水、吸入用無菌水、注射用無菌水、灌洗用無菌水、蠟、陰離子乳化蠟、巴西棕櫚蠟(carnauba wax)、陽離子乳化蠟、十六基酯蠟、微晶蠟、非離子乳化蠟、栓劑蠟、白蠟、黃蠟、白石蠟脂、羊毛脂、三仙膠、木糖醇、玉米蛋白、丙酸鋅、鋅鹽、硬脂酸鋅，或在以全文引用的方式經併入之Handbook of Pharmaceutical Excipients，第三版，A. H. Kibbe(Pharmaceutical Press,London,UK,2000)中之任何賦形劑。以全文引用的方式經併入之Remington's Pharmaceutical Sciences，第十六版，E. W. Martin(Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1980)揭示用於調配醫藥學上可接受之組合物之各種組份及用於其製備之已知技術。除非任何習知藥劑均與醫藥組合物不相容，否則涵蓋其在醫藥組合物中之用途。補充活性成份亦可併入該等組合物中。

如下所述，可將本文所揭示之醫藥調配物設計為短效、快速釋放、長效或持續釋放。亦可調配醫藥調配物用於即刻釋放、受控釋放或緩慢釋放。本發明之組合物可進一步包含(例如)微胞或脂質體，或一些其他囊封形式，或可以延長釋放之形式投與以提供長久儲存及/或傳遞作用。所揭示之醫藥調配物可根據任何方案來投與，例如包括每天(每天1次、每天2次、每天3次、每天4次、每天5次、每天6次)、每兩天、每三天、每四天、每五天、每六天、每週、每兩週、每三週、每月或每兩月投與。

在一些實施例中，前述組份可以諸如至少A之任何濃度存在於醫藥組合物中，其中A為0.0001% w/v、0.001% w/v、0.01% w/v、0.1% w/v、1% w/v、2% w/v、5% w/v、10% w/v、20% w/v、30% w/v、40% w/v、50% w/v、60% w/v、70% w/v、80% w/v或90% w/v。在一些實施例中，前述組份可以諸如至多B之任何濃度存在於醫藥組合物中，其中B為90% w/v、80% w/v、70% w/v、60% w/v、50% w/v、40% w/v、30% w/v、20% w/v、10% w/v、5% w/v、2% w/v、1% w/v、0.1% w/v、0.001% w/v或0.0001%。在其他實施例中，前述組份可以諸如約A至約B之任何濃度範圍存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，A為0.0001%且B為90%。

可將醫藥組合物調配為達成生理學上相容pH值。在一些實施例中，視調配物及投藥途徑而定，醫藥組合物之pH值可為至少5、至少5.5、至少6、至少6.5、至少7、至少7.5、至少8、至少8.5、至少9、至少9.5、至少10或至少10.5一直到包括pH 11。在某些實施例中，醫藥組合物可包含一或多種緩衝劑以達成生理相容pH值。緩衝劑可包括任何能夠在所需pH值下進行緩衝之化合物，諸如磷酸鹽緩衝劑(例如PBS)、三乙醇胺、Tris、N,N-二(羥乙基)甘胺酸(bicine)、TAPS、三(羥甲基)甲基甘胺酸(tricine)、HEPES、TES、MOPS、PIPES、二甲胂酸鹽、MES及其他。在某些實施例中，緩衝劑之濃度(strength)為至少0.5mM、至少1mM、至少5mM、至少10mM、至少20mM、至少30mM、至少40mM、至少50mM、至少60mM、至少70mM、至少80mM、至少90mM、至少100mM、至少120mM、至少150mM或至少200mM。在一些實施例中，緩衝劑之濃度不大於300mM(例如至多200mM、至多100mM、至多90mM、至多80mM、至多70mM、至多60mM、至多50mM、至多40mM、至多30mM、至多20mM、至多10mM、至多5mM、至多1mM)。

在一實施例中，醫藥組合物包含1mg/ml濃度之升糖激素促效劑類似物及10-50mM三乙醇胺(pH值為7.0-8.5，或6-9，或7-9)。在一實施例中，醫藥組合物包含1mg/ml濃度之升糖激素促效劑類似物及20mM三乙醇胺(pH值為8.5)。

根據一實施例，可以套組之部分的形式提供本發明之經修飾升糖激素肽。在一實施例中，提供一種用於向有需要之患者投與升糖激素促效劑的套組，其中該套組包含在水溶液中之本發明之任一升糖激素肽。包含於此等套組中之例示性升糖激素肽包括選自由以下各物組成之群的升糖激素肽：1)包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:33之序列的升糖激素肽；2)包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:33之升糖激素促效劑類似物及與升糖激素肽之胺基酸29鍵聯之SEQ ID NO:20(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO:21(KRNRNNIA)或SEQ ID NO:22(KRNR)之胺基酸序列的升糖激素融合肽；及3)SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:33之聚乙二醇化升糖激素肽，其進一步包含與升糖激素肽之胺基酸29鍵聯之SEQ ID NO:20(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO:21(KRNRNNIA)或SEQ ID NO:22(KRNR)之胺基酸序列，其中與位置16、17、21、24或29、在C末端延伸內或在C末端胺基酸處共價鍵結之PEG鏈具有約500道爾頓至約40,000道爾頓之分子量。在一實施例中，套組具備向患者投與升糖激素組合物之器件，例如針筒針、筆式器件、噴射器或其他無針注射器。套組可替代性地或另外包括各種容器中一或多者，例如小瓶、管子、瓶、單腔室或多腔室預填充針筒、藥筒、輸注泵(外部或可植入型)、噴射器、預填充筆式器件及其類似物，其視情況含有呈凍乾形式或在水溶液中之升糖激素肽。套組較佳亦將包括使用說明書。根據一實施例，套組之器件為霧劑分配器件，其中將組合物預包裝在霧劑器件內。在另一實施例中，套組包含針筒及針，且在一實施例中，將無菌升糖激素組合物預包裝在針筒內。

本發明之化合物可藉由標準合成方法、重組DNA技術或任何其他製備肽及融合蛋白之方法來製備。儘管某些非天然胺基酸不可由標準重組DNA技術來表現，但在此項技術中已知其製備技術。除標準肽化學反應之外，當適用時，可藉由標準有機化學反應來合成涵蓋非肽部分之本發明之化合物。

實例

通用合成法：

自0.2毫莫耳Boc Thr(OBzl)Pam樹脂起始，使用HBTU活化「Fast Boc」單一偶合法，在改質之應用生物系統430 A肽合成器(modified Applied Biosystem 430 A peptide synthesizer)上合成升糖激素類似物。自Midwest Biotech(Fishers,IN)獲得Boc胺基酸及HBTU。所用側鏈保護基為：Arg(Tos)、Asn(Xan)、Asp(OcHex)、Cys(pMeBzl)、His(Bom)、Lys(2Cl-Z)、Ser(OBzl)、Thr(OBzl)、Tyr(2Br-Z)及Trp(CHO)。N末端His上之側鏈保護基為Boc。

以20%哌啶於二甲基甲醯胺中之溶液處理各完成之肽基樹脂，以移除色胺酸之甲醯基。在對甲酚及二甲硫存在下進行液體氟氫酸裂解。使用HF裝置(Penninsula Labs)，在冰浴中裂解1小時。在蒸發HF之後，將殘餘物懸浮於乙醚中，且過濾固體物質。將各肽萃取至30-70ml乙酸水溶液中，且藉由HPLC[Beckman System Gold，0.46×5cm Zorbax C8，1ml/min，45C，214nm，緩衝液A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/90%乙腈，梯度為10%至80%B，歷經10min]分析稀釋之等分試樣。

在2.2×25cm Kromasil C18管柱FPLC上進行純化，同時在214nm之UV下監測且收集溶離份5分鐘。合併均勻溶離份且凍乾，得到>95%之產物純度。使用MALDI-質譜分析來確定正確分子質量及純度。

通用聚乙二醇化法：(Cys-馬來醯亞胺基)

一般而言，將升糖激素Cys類似物溶解於磷酸鹽緩衝生理食鹽水(5-10mg/ml)中，且添加0.01M乙二胺四乙酸(總體積之10-15%)。添加過量(2倍)馬來醯亞胺基甲氧基PEG試劑(Nektar)且在室溫下攪拌反應，同時藉由HPLC監測反應進度。在8-24hr之後，將反應混合物酸化且裝載至製備型逆相管柱上，使用0.1%TFA/乙腈梯度純化。將適當溶離份合併且凍乾，得到所需聚乙二醇化類似物。

實例1

合成升糖激素Cys¹⁷(1-29)及類似MonoCys類似物

將0.2毫莫耳Boc Thr(OBzl)Pam樹脂(SynChem Inc)置於60ml反應容器中，且在使用FastBoc HBTU活化單一偶合之改質之應用生物系統430A肽合成器上輸入以下序列並運作。

HSQGTFTSDYSKYLDSCRAQDFVQWLMNT(SEQ ID NO:27)

使用以下側鏈保護基：Arg(Tos)、Asp(OcHex)、Asn(Xan)、Cys(pMeBzl)、Glu(OcHex)、His(Boc)、Lys(2Cl-Z)、Ser(Bzl)、Thr(Bzl)、Trp(CHO)及Tyr(Br-Z)。以20%哌啶/二甲基甲醯胺處理完成之肽基樹脂以移除Trp甲醯基保護，接著將其轉移至HF反應容器中且在真空中乾燥。添加1.0ml對甲酚及0.5ml二甲硫連同磁性攪拌棒進行攪拌。使容器與HF裝置(Pennisula Labs)連接，在乾冰/甲醇浴中冷卻，排氣，且使約10ml液體氟氫酸冷凝於其中。將反應在冰浴中攪拌1hr，接著在真空中移除HF。將殘餘物懸浮於乙醚中；將固體過濾，以乙醚洗滌，且將肽萃取至50ml乙酸水溶液中。以裂解萃取物之小樣本進行分析性HPLC[0.46×5cm Zorbax C8，1ml/min，45C，214nm，0.1%TFA之緩衝液A，0.1%TFA/90%ACN之緩衝液B，梯度=10%B至80%B，歷經10min]。將剩餘萃取物負載於2.2×25cm Kromasil C18製備型逆相管柱上且使用Pharmacia FPLC系統運作乙腈梯度。收集5min之溶離份，同時監測在214nm(2.0A)下之UV。A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/50%乙腈。梯度=30%B至100%B，歷經450min。

將含有最純產物(48-52)之溶離份冷凍合併，且凍乾以得到30.1mg。產物之HPLC分析顯示>90%之純度且MALDI質譜分析顯示3429.7之所需質量。類似地製備升糖激素Cys²¹、升糖激素Cys²⁴及升糖激素Cys²⁹。

實例2

合成升糖激素-Cex及其他C末端延長類似物。

將285mg(0.2毫莫耳)甲氧基二苯甲基胺樹脂(Midwest Biotech)置於60ml反應容器中，且在使用FastBoc HBTU活化單一偶合之改質之應用生物系統430A肽合成器上輸入以下序列並運作。

HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTGPSSGAPPPS(SEQ ID NO:28)

使用以下側鏈保護基：Arg(Tos)、Asp(OcHex)、Asn(Xan)、Cys(pMeBzl)、Glu(OcHex)、His(Boc)、Lys(2Cl-Z)、ser(Bzl)、Thr(Bzl)、Trp(CHO)及Tyr(Br-Z)。以20%哌啶/二甲基甲醯胺處理完成之肽基樹脂以移除Trp甲醯基保護，接著將其轉移至HF反應容器中且在真空中乾燥。添加1.0ml對甲酚及0.5ml二甲硫連同磁性攪拌棒進行攪拌。使容器與HF裝置(Pennisula Labs)連接，在乾冰/甲醇浴中冷卻，排氣，且使約10ml液體氟氫酸冷凝於其中。將反應在冰浴中攪拌1hr，接著在真空中移除HF。將殘餘物懸浮於乙醚中；將固體過濾，以乙醚洗滌，且將肽萃取至50ml乙酸水溶液中。對裂解萃取物之等分試樣進行分析性HPLC[0.46×5cm Zorbax C8，1ml/min，45C，214nm，0.1%TFA之緩衝液A，0.1%TFA/90%ACN之緩衝液B，梯度=10%B至80%B，歷經10min]。將萃取物負載於2.2×25cm Kromasil C18製備型逆相管柱上且使用Pharmacia FPLC系統運作乙腈梯度以便溶離。收集5min之溶離份，同時監測在214nm(2.0A)下之UV。A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/50%乙腈。梯度=30%B至100%B，歷經450min。將溶離份58-65合併、冷凍且凍乾以得到198.1mg。

產物之HPLC分析展示大於95%之純度。MALDI質譜分析展示對於呈C末端醯胺形式之產物存在4316.7之所需理論質量。與C末端羧酸類似地以適當負載之PAM-樹脂起始來製備調酸素及調酸素-KRNR。

實例3

升糖激素Cys¹⁷Mal-PEG-5K

將15.1mg升糖激素Cys¹⁷(1-29)及27.3mg甲氧基聚(乙二醇)馬來醯亞胺(平均分子量5000)(mPEG-Mal-5000,Nektar Therapeutics)溶解於3.5ml磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中且添加0.5ml 0.01M乙二胺四乙酸(EDTA)。在室溫下攪拌反應且藉由HPLC分析[0.46×5cm Zorbax C8，1ml/min，45C，214nm(0.5A)，A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/90%ACN，梯度=10%B至80%B，歷經10min]監測反應進展。在5小時之後，將反應混合物負載於2.2×25cm Kromasil C18製備型逆相管柱上。在Pharmacia FPLC上運作乙腈梯度，同時監測在214nm下之UV波長且收集5min之溶離份。A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/50%乙腈，梯度=30%B至100%B，歷經450min。將對應於產物之溶離份合併、冷凍且凍乾以得到25.9mg。

在HPLC[0.46×5cm Zorbax C8，1ml/min，45C，214nm(0.5A)，A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/90%ACN，梯度=10%B至80%B，歷經10min]上分析此產物，其展示約90%之純度。MALDI(基質輔助雷射解吸附電離)質譜分析展示8700至9500之寬質量範圍(代表PEG衍生物)。此展示起始升糖激素肽之質量(3429)增加約5,000a.m.u。

實例4

升糖激素Cys²¹Mal-PEG-5K

將21.6mg升糖激素Cys²¹(1-29)及24mg mPEG-MAL-5000(Nektar Therapeutics)溶解於3.5ml磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中且添加0.5ml 0.01M乙二胺四乙酸(EDTA)。在室溫下攪拌反應。在2hr之後，再添加12.7mg mPEG-MAL-5000。在8hr之後，將反應混合物負載於2.2×25cm Vydac C18製備型逆相管柱上且在Pharmacia FPLC上在4ml/min下運作乙腈梯度，同時收集5min之溶離份。A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/50%ACN。梯度=20%至80%B，歷經450min。

將對應於產物出現之溶離份合併、冷凍且凍乾以得到34mg。藉由分析性HPLC[0.46×5cm Zorbax C8，1ml/min，45C，214nm(0.5A),A=0.1%TFA,B=0.1%TFA/90%ACN,梯度=10%B至80%B，歷經10min]分析產物展示不同於起始升糖激素肽之均質產物。MALDI(基質輔助雷射解吸附電離)質譜分析展示8700至9700之寬質量範圍(代表PEG類似物)。此展示起始升糖激素肽之質量(3470)增加約5,000a.m.u。

實例5

升糖激素Cys²⁴Mal-PEG-5K

將20.1mg升糖激素Cys²⁴(1-29)及39.5mg mPEG-Mal-5000(Nektar Therapeutics)在攪拌下溶解於3.5ml PBS中且添加0.5ml 0.01M EDTA。將反應在室溫下攪拌7hr，接著再添加40mg mPEG-Mal-5000。在約15hr之後，將反應混合物負載於2.2×25cm Vydac C18製備型逆相管柱上且使用Pharmacia FPLC運作乙腈梯度。收集5min之溶離份，同時監測在214nm(2.0A)下之UV。緩衝液A=0.1%TFA，緩衝液B=0.1%TFA/50%ACN，梯度=30%B至100%B，歷經450min。將對應於產物之溶離份合併、冷凍且凍乾以得到45.8mg。MALDI質譜分析展示典型PEG寬信號，最大值為9175.2，其比升糖激素Cys²⁴(3457.8)大約5,000a.m.u.。

實例6

升糖激素Cys²⁴Mal-PEG-20K

將25.7mg升糖激素Cys²⁴(1-29)及40.7mg mPEG-Mal-20K(Nektar Therapeutics)在攪拌下在室溫下溶解於3.5ml PBS中且添加0.5ml 0.01M EDTA。在6hr之後，如藉由HPLC測定，起始物質與產物之比率為約60:40。再添加25.1mg mPEG-Mal-20K且允許反應再攪拌16hr。產物比率未顯著改良，因此將反應混合物負載於2.2×25cm Kromasil C18製備型逆相管柱上且在使用30%B至100%B之梯度的Pharmacia FPLC上純化450min。緩衝液A=0.1%TFA，緩衝液B=0.1%TFA/50%ACN，流量=4ml/min，且收集5min之溶離份，同時監測在214nm(2.0A)下之UV。將含有均質產物之溶離份冷凍合併且凍乾以得到25.7mg。如藉由分析性HPLC測定之純度為約90%。MALDI質譜分析展示23,000至27,000之寬峰，其比起始升糖激素Cys²⁴(3457.8)大約20,000a.m.u.。

實例7

升糖激素Cys²⁹Mal-PEG-5K

將20.0mg升糖激素Cys²⁹(1-29)及24.7mg mPEG-Mal-5000(Nektar Therapeutics)在攪拌下在室溫下溶解於3.5ml PBS中且添加0.5ml 0.01M EDTA。在4hr之後，再添加15.6mg mPEG-Mal-5000以推動反應完成。在約8hr之後，將反應混合物負載於2.2×25cm Vydac C18製備型逆相管柱上且在Pharmacia FPLC系統上運作乙腈梯度。收集5min之溶離份，同時監測在214nm(2.0A)下之UV。A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/50%ACN。將溶離份75-97冷凍合併且凍乾以得到40.0mg產物，其不同於在HPLC上回收之起始物質(溶離份58-63)。藉由分析性HPLC[0.46×5cm Zorbax C8，1ml/min，45C，214nm(0.5A)，A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/90%ACN，梯度=10%B至80%B，歷經10min]分析產物展示大於95%之純度。MALDI質譜分析展示存在質量範圍為8,000至10,000(最大值為9025.3)之PEG組份，其比起始物質(3484.8)大5,540a.m.u.。

實例8

升糖激素Cys²⁴(2-丁內酯)

向24.7mg升糖激素Cys²⁴(1-29)中添加4ml 0.05M碳酸氫銨/50%乙腈及2-溴-4-羥丁酸-γ-內酯之5.5μl溶液(100μl於900μl乙腈中)。在室溫下攪拌3hr之後，再將105μl內酯溶液添加至反應混合物中，將其再攪拌15hr。將反應混合物以10%乙酸水溶液稀釋至10ml且負載於2.2×25cm Kromasil C18製備型逆相管柱上。在Pharmacia FPLC上運作乙腈梯度(20%B至80%B，歷經450min)，同時收集5min之溶離份且監測在214nm(2.0A)下之UV。流量=4ml/min，A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/50%ACN。將溶離份74-77冷凍合併且凍乾以得到7.5mg。HPLC分析展示95%之純度且MALDI質譜分析展示3540.7或比起始物質大84質量單位之質量。此結果係與單一丁內酯部分之添加一致。

實例9

升糖激素Cys²⁴(S-羧甲基)

將18.1mg升糖激素Cys²⁴(1-29)溶解於9.4ml 0.1M磷酸鈉緩衝液(pH=9.2)中且添加0.6ml溴乙酸溶液(1.3mg/ml於乙腈中)。在室溫下攪拌反應且藉由分析性HPLC跟蹤反應進展。在1hr之後，再添加0.1ml溴乙酸溶液。將反應再攪拌60min，接著以乙酸水溶液酸化且負載於2.2×25cm Kromasil C18製備型逆相管柱上以便純化。在Pharmacia FPLC(流量=4ml/min)上運作乙腈梯度，同時收集5min之溶離份且監測在214nm(2.0A)下之UV。A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/50%ACN。將溶離份26-29冷凍合併且凍乾以得到若干毫克之產物。分析性HPLC展示90%之純度且MALDI質譜分析確定所需產物之質量為3515。

實例10

升糖激素Cys²⁴馬來醯亞胺，PEG-3.4K-二聚體

將16mg升糖激素CyS²⁴及1.02mg Mal-PEG-Mal-3400、聚(乙二醇)-雙馬來醯亞胺(平均分子量3400)(Nektar Therpeutics)溶解於3.5ml磷酸鹽緩衝鹽水及0.5ml 0.01M EDTA中且在室溫下攪拌反應。在16hr之後，再添加16mg升糖激素Cys²⁴且繼續攪拌。在約40hr之後，將反應混合物負載於Pharmcia PepRPC 16/10管柱上且在Pharmacia FPLC上運作乙腈梯度，同時收集2min之溶離份且監測在214nm(2.0A)下之UV。流量=2ml/min，A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/50%ACN。將溶離份69-74冷凍合併且凍乾以得到10.4mg。分析性HPLC展示90%之純度且MALDI質譜分析展示在9500-11,000範圍內之組份，其係與所需二聚體一致。

實例11

升糖激素溶解度檢定：

在0.01N HCl中製備升糖激素(或類似物)之溶液(1mg/ml或3mg/ml)。將100μl儲備溶液以0.01N HCl稀釋至1ml且測定UV吸收率(276nm)。使用200-250μl 0.1M Na₂HPO₄(pH9.2)將剩餘儲備溶液之pH值調節至pH 7。允許溶液在4℃下靜置隔夜，接著離心。接著以0.01N HCl將100μl上清液稀釋至1ml，且測定UV吸收率(一式兩份)。

初始吸收率讀數係補償體積增加且使用以下計算建立溶解度百分比：

在表1中展示結果，其中升糖激素-Cex呈現野生型升糖激素(SEQ ID NO:1)外加SEQ ID NO:20之羧基末端添加，且升糖激素-Cex R¹²呈現SEQ ID NO:1，其中位置12之Lys係經Arg取代且SEQ ID NO:20之肽係添加至羧基末端。

使用用於表1中所列之化合物的相同檢定來研究升糖激素促效劑類似物D28、E29、E30、E15D28、D28E30、D28E29之溶解度。資料(圖3及圖4中所示)顯示在5.5及7.0之pH值下D28、E29、E30、E15D28、D28E30、D28E29類似物相對於原生升糖激素之優良溶解度。圖3中所示之資料呈現在25℃下60小時之後量測到之溶解度，而圖4中所示之資料呈現在25℃下24小時且接著在4℃下24小時之後量測到之溶解度。圖5呈現關於升糖激素類似物D28、D28E30及E15D28之最大溶解度的資料。

實例12

升糖激素受體結合檢定

在競爭結合檢定中利用閃爍鄰近檢定技術(scintillation proximity assay technology)來量測肽與升糖激素受體之親和性。使在閃爍鄰近檢定緩衝液(0.05M Tris-HCl，pH 7.5，0.15M NaCl，0.1% w/v牛血清白蛋白)中製得之肽的連續3倍稀釋物與0.05nM(3-[¹²⁵I]-碘酪胺醯基)Tyr10升糖激素(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)(每孔1-6微克)、自過度表現人類升糖激素受體之細胞製備之質膜片段及1毫克/孔聚乙二亞胺處理A型麥胚凝集素閃爍鄰近檢定珠粒(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)在96孔白色/透明底板(Corning Inc.,Acton,MA)中混合。在旋轉震盪器上在800rpm下震盪5min後，將該板在室溫下培育12h且接著在MicroBeta1450液體閃爍計數器(Perkin-Elmer,Wellesley,MA)上讀數。在具有比試樣中最高濃度大4倍之濃度的「冷」原生配位體之孔中量測非特異性結合(NSB)放射性，且在無競爭者之孔中偵測總結合放射性。如下來計算特異性結合百分比：特異性結合%=((結合-NSB)/(總結合-NSB))×100。藉由使用Origin軟體(OriginLab,Northampton,MA)測定IC₅₀值。

實例13

功能檢定-cAMP合成

在基於螢光蟲螢光素酶之報導檢定(reporter assay)中量測升糖激素類似物誘導cAMP之能力。以升糖激素受體或GLP-1受體與螢光素酶基因(與cAMP反應性元件鍵聯)共轉染之HEK293細胞係藉由在補充有0.25%牛生長血清(Bovine Growth Serum)(HyClone,Logan,UT)之DMEM(Invitrogen,Carlsbad,CA)中培養16h且接著與升糖激素、GLP-1或新穎升糖激素類似物之連續稀釋物一起在37℃下，在96孔聚D-離胺酸塗布「Biocoat」板(BD Biosciences,San Jose,CA)中5% CO₂之情況下培育5h而除去血清。在培育結束時，將100微升LucLite發光基質試劑(Perkin-Elmer,Wellesley,MA)添加至各孔中。將該板短暫震盪，在黑暗中培育10min且在MicroBeta-1450液體閃爍計數器(Perkin-Elmer,Wellesley,MA)上量測光輸出。發光之光輸出表明螢光素酶報導基因之活化，其又為受體活化之度量。藉由使用Origin軟體(OriginLab,Northampton,MA)計算有效50%濃度(「EC₅₀」)。結果展示於表2及表3中。EC₅₀為產生50%之肽在指定受體處之最大活化反應的肽濃度。相對較低EC₅₀表明肽在受體處相對更有效，而較高EC₅₀表明肽有效性較小。

其他升糖激素類似物之資料係呈現於圖6-9及表4中

圖11顯示關於具有以下修飾之升糖激素類似物在升糖激素受體及GLP-1受體處產生的cAMP誘導之資料：T16、A20、E21、A24、Nle27、D28及E29(SEQ ID NO:56)。資料展示含有多個修飾(七個取代)之升糖激素類似物保持大體上升糖激素活性。

實例14

升糖激素Cys-馬來醯亞胺基PEG類似物之穩定性檢定

將各升糖激素類似物溶解於水或PBS中且進行初始HPLC分析。在調節pH值(4、5、6、7)之後，將樣本在37℃下培育指定時間段且藉由HPLC再分析以測定肽之完整性。測定所關注特異性肽之濃度且相對於初始分析來計算剩餘完整物百分比。將升糖激素Cys²¹-馬來醯亞胺基PEG_5K之結果展示於圖1及圖2中。

實例15

合成升糖激素內醯胺

將285mg(0.2毫莫耳)甲氧基二苯甲基胺樹脂(Midwest Biotech)添加至60mL反應容器中，且在使用Boc DEPBT活化單一偶合之改質之應用生物系統430A肽合成器上組裝以下序列。

使用以下側鏈保護基：Arg(Tos)、Asp(OcHx)、Asn(Xan)、Glu(OFm)、His(BOM)、Lys(Fmoc)、Ser(Bzl)、Thr(Bzl)、Trp(CHO)、Tyr(Br-Z)。舉例而言，若內醯胺係自16-20、20-24或24-28構築，則將Lys(Cl-Z)用以保護位置12之原生Lys。在旋轉下以20%哌啶/二甲基甲醯胺處理完成之肽基樹脂歷時一小時以自Lys12及Glu16移除Trp甲醯基以及Fmoc及OFm保護。在藉由陽性茚滿三酮測試(positive ninhydrin test)確認移除後，以二甲基甲醯胺洗滌樹脂，接著以二氯甲烷且接著再次以二甲基甲醯胺洗滌。以在二甲基甲醯胺及二異丙基乙胺(DIEA)中之520mg(1毫莫耳)六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-參-N-吡咯啶基-鏻(PyBOP)處理樹脂。將反應進行8-10小時且藉由陰性茚滿三酮反應確定環化。以二甲基甲醯胺接著以二氯甲烷洗滌樹脂，且隨後以三氟乙酸處理10分鐘。藉由陽性茚滿三酮反應確定移除Boc基團。以二甲基甲醯胺及二氯甲烷洗滌樹脂，且乾燥，隨後轉移至氫氟酸(HF)反應容器中。添加500μL對甲酚，連同磁性攪拌棒進行攪拌。使容器與HF裝置(Peninsula Labs)連接，在乾冰/甲醇浴中冷卻，排氣，且使約10mL液體氫氟酸冷凝於容器中。將反應在冰浴中攪拌1小時，且隨後在真空中移除HF。將殘餘物懸浮於乙醚中；將固體過濾，以乙醚洗滌，且以150mL 20%乙腈/1%乙酸溶解肽。

在以下條件下[4.6×30mm Xterra C8，1.50mL/min，220nm，緩衝液A 0.1% TFA/10% ACN，緩衝液B 0.1% TFA/100% ACN，梯度5-95%B，歷經15分鐘]對所溶解之粗肽進行分析性HPLC分析。將萃取物以水稀釋兩倍且負載於2.2×25cm Vydac C4製備型逆相管柱上，且在Waters HPLC系統(0.1% TFA/10% ACN之緩衝液A，0.1% TFA/10% CAN之緩衝液B，及0-100% B之梯度，在15.00ml/min之流量下歷經120分鐘)上使用乙腈梯度來溶離。純化肽之HPLC分析顯示大於95%之純度且電噴霧電離質譜分析確定12-16內醯胺之3506Da之質量。類似地自16-20、20-24及24-28製備內醯胺。

實例16

例示性肽

一般如本文所述來構築具有以下序列之升糖激素肽：XSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFVC*WLMNT(內醯胺，在16-20)(SEQ ID NO:40)

其中X=DMIA，C*為與PEG鍵聯之Cys XSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFVAWLMNC*(內醯胺，在16-20)(SEQ ID NO:41)

其中X=DMIA、Q24A，C*為與PEG鍵聯之CysX1SQGTFTSDYSKYLDERRAKDFVC*WLX2NT(內醯胺，在16-20)(SEQ ID NO:42)

其中X1=DMIA，X2為Nle或Leu，C*為與PEG鍵聯之CysX1SQGTFTSDYSKYLDERRAKDFVAWLX2NC*(內醯胺，在16-20)(SEQ ID NO:43)

其中X1=DMIA、Q24A，X2為Nle或Leu，C*為與PEG鍵聯之Cys

一般如本文所述自SEQ ID NO:1構築具有以下修飾的升糖激素肽:

A20、A24、Nle27、D28(SEQ ID NO:44)

A20、A24、Nle27、D28、E29(SEQ ID NO:45)

A20、A24、Nle27、D28、E30(SEQ ID NO:46)

A20、A24、Nle27、E28、E29(SEQ ID NO:47)

A20、A24、Nle27、E28、E30(SEQ ID NO:48)

A20、A24、Nle27、E29、E30(SEQ ID NO:49)

A20、E21、A24、Nle27、D28(SEQ ID NO:50)

A20、E21、A24、Nle27、D28、E29(SEQ ID NO:51)

A20、E21、A24、Nle27、D28、E30(SEQ ID NO:52)

A20、E21、A24、Nle27、E28、E29(SEQ ID NO:53)

A20、E21、A24、Nle27、E28、E30(SEQ ID NO:54)

A20、E21、A24、Nle27、E29、E30(SEQ ID NO:55)

或者，此等肽中任一者可包含AIB20及/或AIB24以代替A20及/或A24取代。

此等肽中任一者可進一步包含T16或AIB16胺基酸取代。舉例而言，構築T16、A20、E21、A24、Nle27、D28、E29(SEQ ID NO:56)。

一般如本文所述自SEQ ID NO:1構築具有以下修飾的升糖激素肽：DMIA1、E16、K20-升糖激素-COOH(C24-PEG，E16至K20內醯胺)。下文闡述其序列：DMIA-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Cys*-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-COOH，其中位置24之Cys*為與約40,000道爾頓分子量之PEG連接的Cys，且其中位置16之Glu及位置20之Lys係經由內醯胺橋(SEQ ID NO:40)來鍵聯。一般根據實例13來測試此肽在升糖激素及GLP-1受體處之活性。肽呈現原生升糖激素之效能的27.7%及原生GLP-1之效能的1.1%。

實例17

醯化及/或聚乙二醇化肽之製備

醯化及/或聚乙二醇化肽係如下製備。使用CS Bio 4886肽合成器或應用生物系統430A肽合成器，在固體支撐樹脂上合成肽。如Schnolzer等人，Int. J. Peptide Protein Res. 40:180-193(1992)所述，使用原位中和化學(In situ neutralization chemistry)。對於醯化肽而言，待醯化(例如位置10)之目標胺基酸殘基係經Nε-FMOC離胺酸殘基取代。以在DMF中之20%哌啶將完成之N-末端BOC保護肽處理30分鐘移除FMOC/甲醯基。與游離ε-胺基Lys殘基之偶合係藉由在DMF/DIEA中偶合十倍莫耳過量之FMOC保護間隔基胺基酸(例如FMOC-(N-BOC)-色胺酸-OH)或醯基鏈(例如C₁₇-COOH)與PyBOP或DEPBT偶合試劑來達成。隨後移除間隔基胺基酸之FMOC基團，接著以醯基鏈重複偶合。以100% TFA進行最終處理使得移除任何側鏈保護基及N末端BOC基團。將肽樹脂以5% DIEA/DMF中和，乾燥，且接著使用95:5 HF/對甲酚在0℃下使其自支撐物裂解歷時一小時。在乙醚萃取之後，將5% HOAc溶液用以使粗肽溶劑化。接著藉由ESI-MS檢驗溶液之樣本以含有正確分子量肽。藉由使用10% CH₃CN/0.1% TFA至0.1% TFA於100% CH₃CN中之線性梯度的RP-HPLC純化正確肽。將Vydac C18 22mm×250mm蛋白質管柱用於純化。醯化肽類似物一般藉由20:80之緩衝比來完成溶離。將各部分彙集在一起且在分析性RP-HPLC上檢查純度。將純溶離份凍乾，產生白色固體肽。

若肽包含內醯胺橋及待醯化之目標殘基，則在將該胺基酸添加至肽主鏈後如上所述進行醯化。

對於肽聚乙二醇化而言，使用最小量之將肽及PEG溶解為透明溶液所需之溶劑(對於使用2-3mg肽之反應而言一般小於2mL)，使40kDa甲氧基聚(乙二醇)馬來醯亞胺基-丙醯胺(Chirotech Technology Ltd.)在7M尿素、50mM Tris-HCl緩衝液中與莫耳當量之肽反應。開始在室溫下劇烈攪拌4-6小時且藉由分析性RP-HPLC分析反應。聚乙二醇化產物自起始物質清楚地出現，其中滯留時間減少。在條件類似於初始肽純化所用條件之Vydac C4管柱上進行純化。溶離通常發生在50:50之緩衝比附近。收集純聚乙二醇化肽之溶離份及將其凍乾。

如上在實例13中所述檢定肽之生物活性。

實例18

在投與升糖激素類似物之後米格魯犬體內血清葡萄糖濃度之變化

將8-12kg、8-16個月齡且身體健康之犬/米格魯犬用以測定升糖激素作用之藥物動力學及藥效學。使每一動物禁食隔夜且在各劑量之後的以下時點放血：0hr(預劑量)、給藥後5、10、20、30、45、60、90、120、240分鐘。將六隻動物用於各劑量組且在各時點抽出約1-2ml全血。將約1.0ml全血添加至含有足夠體積Trasylol(抗蛋白酶)之K₂ EDTA管中以產生至少500KIU/mL全血。在冷凍離心機中以約1,500-3,000×g將樣本離心10-15min之後收集約500μL血漿。將樣本轉移至塑膠小瓶中且在-70℃或-70℃以下冷凍儲存。藉由將血液樣本置於空管中，使得保持在環境溫度下15-20min，接著在冷凍離心機中以1,500-3,000×g離心10-15min，從而將剩餘1.0mL全血轉化為血清。將樣本轉移至塑膠小瓶中且在-70℃或-70℃以下冷凍儲存。將升糖激素及類似物以0.1667mg/ml之濃度溶解於0.01N HCl中且以0.03ml/kg對動物給藥。

向動物肌肉內投與0.005mg/kg劑量之升糖激素、包含具有與升糖激素(升糖激素-CEX)之羧基末端鍵聯之SEQ ID NO:31之序列的升糖激素之升糖激素類似物，或在胺基酸28處包含天冬胺酸取代之升糖激素類似物(升糖激素-Asp28，SEQ ID NO:11)。圖10中呈現所得資料。

實例19

如上文大體所述來製造以下肽：

(A)包含在位置16以AIB進行胺基酸取代之SEQ ID NO:1之胺基酸序列的肽(「AIB 16升糖激素」)；

(B)包含在位置19以AIB進行胺基酸取代之SEQ ID NO:1之胺基酸序列的肽(「AIB 19升糖激素」)；

(C)包含在位置20以AIB進行胺基酸取代之SEQ ID NO:1之胺基酸序列的肽(「AIB 20升糖激素」)；

(D)包含在位置21以AIB進行胺基酸取代之SEQ ID NO:1之胺基酸序列的肽(「AIB 21升糖激素」)；

(E)包含在位置24以AIB進行胺基酸取代之SEQ ID NO:1之胺基酸序列的肽(「AIB 24升糖激素」)；

(F)包含在位置16及20以AIB進行胺基酸取代之SEQ ID NO:1之胺基酸序列的肽(「AIB 16、20升糖激素」)；

(G)包含在位置16及24以AIB進行胺基酸取代之SEQ ID NO:1之胺基酸序列的肽(「AIB 16、24升糖激素」)；

(H)包含在位置20及24以AIB進行胺基酸取代之SEQ ID NO:1之胺基酸序列的肽(「AIB 20、24升糖激素」)；及

(I)包含在位置16、20及24以AIB進行胺基酸取代之SEQ ID NO:1之胺基酸序列的肽(「AIB 16、20、24升糖激素」)。

如實例13中大體所述來檢定肽且將結果展示於表5中。

實例20

如本文大體所述來製造以下升糖激素類似物肽：「D28/E29升糖激素」包含經修飾以包含位置28之Asp及位置29之Glu的SEQ ID NO:1之胺基酸序列：HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMDE(SEQ ID NO:75)；及「AIB16/D28/E29升糖激素」包含經進一步修飾以包含位置16之Aib的SEQ ID NO:75之胺基酸序列：HSQGTFTSDYSKYLDAibRRAQDFVQWLMDE(SEQ ID NO:76)。

如在實例13中所述測試各肽在升糖激素受體處之活體外活性。D28/E29升糖激素肽之EC₅₀為0.06nM，而AIB16/D28/E29升糖激素肽之EC₅₀為0.08nM。

實例21

如本文大體所述來製造各自包含具有表6中所列之修飾的SEQ ID NO:1之胺基酸序列的A組之肽。

第二組(B組)肽係製造為與A組肽具有相同結構，但B組肽在位置24包含Cys，其中Cys殘基係與40 kDa PEG共價連接。

如實例13中大體所述來測試A組及B組肽在升糖激素受體處之活體外活性。

實例22

包含肽J

HS-X-GTFTSDYSKYLDTRRAAEFVAWL(Nle)DE(SEQ ID NO:59)

或肽K

HS-X-GTFTSDYSKYLD(Aib)RRAADFVAWLMDE(SEQ ID NO:60)

之主鏈且在位置3具有額外修飾之以下升糖激素類似物肽係藉由如本文大體所述之固相肽合成來製造。如實例13中大體所述來測試肽在升糖激素受體處之活體外活性。各肽之EC₅₀(nM)展示於表7中。

如表7中所示，多個胺基酸可位於位置3，而並不實質上損失在升糖激素受體處之活性，且在一些情況下，修飾實際上增加活性，例如肽K主鏈上之Dab(Ac)及Q(Me)。

實例23

如本文大體所述來製造在各種升糖激素類似物主鏈上在位置3包含Dab(Ac)之升糖激素類似物肽，且測試在升糖激素受體處之活體外活性。將各肽之結構及活性展示於表8中。

實例24

如本文大體所述來製造包含具有表9中所示之修飾的SEQ ID NO:1之胺基酸序列的第一組(A組)之肽：

如本文大體所述來製造包含A組之相同結構但醯基為C₁₆或C₁₈脂肪醯基之肽。包含C₁₆脂肪醯基之肽構成B組肽，而包含C₁₈脂肪醯基之肽構成C組肽。

如本文所述來製造包含A、B及C組肽之相同結構但脂肪醯基係經由以下間隔基中一者與指定位置之Lys殘基之側鏈共價連接的D組肽：γ-Glu-γ-Glu；β-Ala-β-Ala、Ala-Ala、6-胺基己酸、Leu-Leu及Pro-Pro。

如在實例13中所述來測試A-D組肽在升糖激素受體處之活體外活性，且將各自之EC₅₀與原生升糖激素在升糖激素受體處之活性進行比較。

實例25

如本文大體所述來製造無共價分子內橋且包含位置2之AIB、位置16之AIB及經由間隔基與位置10之Lys殘基連接之脂肪醯基的若干升糖激素類似物。醯化升糖激素類似物不同之處在於間隔基類型、存在或不存在聚乙二醇化，及/或醯基大小。如實例13中大體所述，測試醯化升糖激素類似物在升糖激素受體及GLP-1受體處之活體外活性。將各肽之結構及在升糖激素受體及GLP-1受體處之活體外活性的概括展示於表10及11中。

如表10及11中所示，包含經由間隔基連接之脂肪醯基的肽如與包含與肽主鏈直接連接之脂肪醯基的肽相比顯著提高其效能。

實例26

檢定SEQ ID NO:71、76及78之升糖激素類似物肽之穩定性。所有肽包含位置28之Asp且SEQ ID NO:71及76之肽均進一步包含位置29之Glu。儘管SEQ ID NO:78之肽並不包含任何額外修飾，但SEQ ID NO:71及76之肽均包含位置16之AIB。SEQ ID NO:71之肽此外包含位置3之Dab(Ac)、位置20及24之Ala，及位置27之Leu。

肽係在溶液中以1mg/mL之肽濃度調配。以一種肽溶液填充針筒且將其調節以最小化與空氣之接觸。將針筒維持在4、25、30或40攝氏度。以UV偵測器在280nm下使用分析性RP-HPLC(逆相-高效液相層析)監測在0、1、2、4及6個月之潛在化學降解。以UV偵測器在280nm下使用SEC(尺寸排阻層析)評估在0、1、2、4及6個月之任何聚集體之形成。

圖12-14中分別展示隨時間而變之基於SEQ ID NO:71、76及78之肽的UV吸收之峰的積分面積。如此等圖中所示，肽之穩定性對於SEQ ID NO:71之肽而言為最大且對於SEQ ID NO:78之肽而言為最小，儘管在30℃下2個月時間之後仍偵測到90%之肽。對於SEQ ID NO:71，未觀察到峰面積顯著損失，表明肽之良好化學及生物物理穩定性。

實例27

每日僅以媒劑、以30nmol/kg或100nmol/kg醯化升糖激素類似物肽，或以長效GLP-1類似物利拉魯肽(Liraglutide，Novo Nordisk,Denmark)對食源性肥胖(DIO)小鼠(每組8個小鼠)(各自具有48.7g之平均體重)皮下注射歷時七天。醯化升糖激素類似物係如下：「(C₁₆)升糖激素醯胺」包含位置10之Tyr經修飾為醯化Lys殘基之野生型升糖激素之胺基酸序列(SEQ ID NO:1)，其中醯化Lys包含C₁₆脂肪醯基，且C末端羧酸酯經醯胺基置換；「γE-γE-C₁₆升糖激素醯胺」包含C₁₆升糖激素醯胺之相同結構，但C₁₆脂肪醯基係經由γ-Glu-γ-Glu二肽間隔基與位置10之Lys連接(參看下文醯化Lys之結構)；

「AA-C₁₆升糖激素醯胺」包含C₁₆升糖激素醯胺之相同結構，但C₁₆脂肪醯基係經由Ala-Ala二肽間隔基與位置10之Lys連接；且「βAβA-C₁₆升糖激素醯胺」包含C₁₆升糖激素醯胺之相同結構，但C₁₆脂肪醯基係經由β-Ala-β-Ala二肽間隔基與位置10之Lys連接。

每日監測小鼠體重且將體重總變化(%)展示於圖15中。如圖15中所示，各劑量之醯化升糖激素肽中大多數引起體重減輕。儘管利拉魯肽顯示體重減輕約12%，但升糖激素類似物肽γE-γE-C₁₆升糖激素醯胺在匹配劑量下呈現引起小鼠體重減輕之最大能力。甚至較低劑量之γE-γE-C₁₆升糖激素醯胺亦引起體重之實質減輕。

在研究之第7天量測小鼠之脂肪質量。如圖16中所示，經投與100nmol/kg γE-γE-C₁₆升糖激素醯胺之小鼠呈現最低脂肪質量。

在檢定過程期間亦監測小鼠之血糖含量。如圖17中所示，升糖激素類似物肽γE-γE-C₁₆升糖激素醯胺在較高劑量下係像利拉魯肽一樣地工作以降低小鼠之血糖含量。

實例28

升糖激素類似物肽係藉由如本文所述之固相肽合成來製造且在肽之位置10或30醯化。肽及其結構係如下：「肽dS2E16K20K30-C₁₄ Gluc醯胺」包含胺基酸序列HXQGTFTSDYSKYLDERRARDFVQWLMNTK-醯胺(SEQ ID NO:79)，其中位置2之X為d-Ser，其中位置30之Lys係以C₁₄脂肪醯基來醯化，且C末端羧酸酯係經醯胺置換；「肽dS2K10(C₁₄)E16K20-Gluc醯胺」包含胺基酸序列HXQGTFTSDKSKYLDERRAKDFVQWLMNT-醯胺(SEQ ID NO:80)；其中位置2之X為d-Ser，其中位置10之Lys係以C₁₄脂肪醯基來醯化，且C末端羧酸酯係經醯胺置換；「肽dS2E16K20K30-C₁₆ Gluc醯胺」包含胺基酸序列HXQGTFTSDYSKYLDERRAKDFVQWLMNTK-醯胺(SEQ ID NO:81)，其中位置2之X為d-Ser，其中位置30之Lys係以C₁₆脂肪醯基來醯化，且C末端羧酸酯係經醯胺置換；「肽dS2K10(C₁₆)E16K20-Gluc醯胺」包含胺基酸序列HXQGTFTSDKSKYLDERRAKDFVQWLMNT-醯胺(SEQ ID NO:82)；其中位置2之X為d-Ser，其中位置10之Lys係以C₁₆脂肪醯基來醯化，且C末端羧酸酯係經醯胺置換；「肽嵌合體2-AIB2-K10-醯化」包含胺基酸序列HXQGTFTSDKSKYLDEQAAKEFICWLMNT-醯胺(SEQ ID NO:83)；其中位置2之X為AIB，位置10之K係以C₁₈脂肪醯基來醯化，位置24之Cys包含40kDa PEG分子，且C末端羧酸酯係經醯胺置換；且「肽嵌合體2-AIB2-K30-醯化」包含胺基酸序列HXQGTFTSDYSKYLDEQAAKEFICWLMNTK-醯胺(SEQ ID NO:84)；其中位置2之X為AIB，位置30之K係以C₁₈脂肪醯基來醯化，位置24之Cys包含40kDa PEG分子，且C末端羧酸酯係經醯胺置換。

如在實例13中大體所述來測試各肽在GLP-1受體及升糖激素受體處之活體外活性。在表12中展示結果。

在本文中所引用之所有參考文獻，包括公開案、專利申請案及專利均以引用的方式併入本文中，該引用的程度就如同已個別地及特定地將各個公開案、專利案或專利申請案之整體揭示內容以引用的方式併入一般。

除非在本文中另外規定或上下文明顯抵觸，否則在描述本發明之上下文中(尤其在以下申請專利範圍之上下文中)的術語「一」及「該」及類似指示語之使用應被視為涵蓋單數及複數。除非另作說明，否則將術語「包含」、「具有」、「包括」及「含有」視為開放式術語(亦即，意謂「包括(但不限於)」)。

除非在本文中另外規定，否則在本文中數值範圍之陳述僅意欲充當個別地提及屬於範圍中之各獨立值及各端點的速記方法，且各獨立值及端點係經併入說明書中，如同其個別地陳述於本文中。

除非在本文中另外規定或上下文另有明顯抵觸，否則所有本文所述之方法均可以任何合適順序來進行。除非另外主張，否則提供於本文中之任何及所有實例或例示性語言(例如「諸如」)的使用均僅意欲更好地闡明本發明且不造成對本發明之範疇的限制。不應將說明書中之語言視為指示如對實踐本發明必不可少之任何非主張要素。

本文描述本發明之較佳實施例，包括發明者已知之用於進行本發明之最佳方式。在閱讀前述說明書後，彼等較佳實施例之變化可變得對一般技術者顯而易見。發明者預期熟習此項技術者適當時採用此等變化，且發明者意欲使本發明以除本文中特定所述之方式外來實踐。因此，當適用法律允許時，本發明包括隨附於本文之申請專利範圍中所陳述之標的物的所有修改及等效物。此外，除非在本文中另外規定或上下文另有明顯抵觸，否則本發明涵蓋在其所有可能變化中之上述因素的任何組合。

圖1為呈現在37℃下分別培育24、48、72、96、144及166小時之升糖激素Cys²¹馬來醯亞胺PEG_5K之穩定性的條形圖；

圖2呈現由在pH 5下在37℃下分別培育24、72或144小時之升糖激素Cys²¹馬來醯亞胺基PEG_5K之HPLC分析產生的資料；

圖3呈現展示在25℃下分別在pH 2、4、5.5、7及8下60小時之後升糖激素類似物(D28、E29、E30)相對於原生升糖激素之溶解度的資料；

圖4呈現展示分別在pH 2、4、5.5及7下在25℃下24小時且接著在4℃下24小時之後，升糖激素類似物(E15D28、D28E29及D28E30)相對於原生升糖激素之溶解度的資料；

圖5呈現升糖激素類似物D28、D28E30及E15,D28在4℃下24小時(pH 7)之後的最大溶解度；

圖6呈現展示藉由升糖激素類似物(K29▲、K30▼及K29K30◆)相對於原生升糖激素■之升糖激素受體介導之cAMP誘導的資料；

圖7呈現展示藉由升糖激素類似物(D28□、E29△、E30▽、K30K31 ◇及K30 ▼)相對於原生升糖激素■之升糖激素受體介導之cAMP誘導的資料；

圖8呈現展示藉由升糖激素類似物(D28 □、E28 及K29 ▲)相對於原生升糖激素■之升糖激素受體介導之cAMP誘導的資料；

圖9呈現展示藉由升糖激素類似物(D28E29 +、D28E30×、E15D28 及E29 △)相對於原生升糖激素■之升糖激素受體介導之cAMP誘導的資料；

圖10呈現展示在肌肉內投與升糖激素及升糖激素類似物之後米格魯犬(beagle dog)體內血清葡萄糖濃度變化之資料。向該等動物投與0.005mg/kg劑量之升糖激素、包含具有與升糖激素(升糖激素-CEX)之羧基末端鍵聯之SEQ ID NO:31之序列的升糖激素之升糖激素類似物，或在胺基酸28處包含天冬胺酸取代之升糖激素類似物(升糖激素-Asp28，SEQ ID NO:11)；

圖11A及11B分別呈現展示藉由具有多個取代：T16、A20、E21、A24、Nle27、D28、E29之升糖激素類似物，升糖激素受體介導之cAMP誘導及GLP-1受體介導之cAMP誘導的資料；

圖12為包含SEQ ID NO:71之肽之調配物在280nm下的UV吸收之曲線下面積隨時間(月)而變之圖；

圖13為包含SEQ ID NO:76之肽之調配物在280nm下的UV吸收之曲線下面積隨時間(月)而變之圖；

圖14為包含SEQ ID NO:78之肽之調配物在280nm下的UV吸收之曲線下面積隨時間(月)而變之圖；

圖15呈現經注射指定劑量媒劑對照物、利拉魯肽(Liraglutide)、(C16)升糖激素醯胺、γE-γE-C16升糖激素醯胺、AA-C16升糖激素醯胺或βAβA-C16升糖激素醯胺之小鼠的體重總變化(%)之圖；

圖16呈現經注射指定劑量媒劑對照物、利拉魯肽、(C16)升糖激素醯胺、γE-γE-C16升糖激素醯胺、AA-C16升糖激素醯胺或βAβA-C16升糖激素醯胺之小鼠如在研究之第7天量測到的脂肪質量(g)之圖；及

圖17呈現經注射指定劑量媒劑對照物、利拉魯肽、(C16)升糖激素醯胺、γE-γE-C16升糖激素醯胺、AA-C16升糖激素醯胺或βAβA-C16升糖激素醯胺之小鼠的血糖變化(mg/dL)之圖。

(無元件符號說明)

Claims (26)

1. 一種具有升糖激素促效劑活性之升糖激素肽，其包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列，具有至多8個胺基酸修飾，其中位置3之麩胺醯胺被包含結構I、II或III之側鏈的不同胺基酸取代： 其中R¹為C_0-3烷基或C_0-3雜烷基；R²為NHR⁴或C_1-3烷基；R³為C_1-3烷基；R⁴為H或C_1-3烷基；X為NH、O或S；且Y為NHR⁴、SR³或OR³；其中該升糖激素肽包含(i)連接位置i之胺基酸與位置i+4之胺基酸的側鏈之分子內橋，其中i為12、16、20或24，(ii)在位置16、20、21及24中一者、兩者、三者或所有位置之胺基異丁酸(AIB)，或(iii)(i)與(ii)兩者；其中該至多8個胺基酸修飾係選自由以下組成之群：a. 以降低該升糖激素肽被二肽基肽酶IV(DPP-IV)裂解之敏感性的非原生胺基酸(non-native amino acid)取代位置1之His， b. 以降低該升糖激素肽被二肽基肽酶IV(DPP-IV)裂解之敏感性的非原生胺基酸取代位置2之Ser，c. 以無羥基之胺基酸取代位置7之Thr；d. 以Phe或Val取代位置10之Tyr；e. 以Arg取代位置12之Lys；f. 以Glu取代位置15之Asp；g. 以Thr或AIB取代位置16之Ser；h. 以Ala或AIB取代位置20之Gln；i. 以Glu取代位置21之Asp；j. 以Ala或AIB取代位置24之Gln；k. 以Leu或Nle取代位置27之Met；l. 刪除位置27-29之胺基酸；m. 刪除位置28-29之胺基酸；n. 刪除位置29之胺基酸；o. 將SEQ ID NO：20之胺基酸序列添加至C末端，其中位置29之胺基酸為Thr或Gly；p. 以包含與醯基或烷基共價連接之側鏈的胺基酸進行取代或添加，該醯基或烷基對天然存在之胺基酸而言為非原生；q. 以帶電胺基酸取代位置28之Asn；r. 以帶電胺基酸取代位置29之Thr；s. 在位置29之後插入1-3個帶電胺基酸；t. 或a至s之組合。
2. 如請求項1之升糖激素肽，其中： a. X為NH或Y為NHR⁴；b. R¹為C_0-2烷基或C₁雜烷基；c. R²為NHR⁴或C₁烷基；d. R⁴為H或C₁烷基；或e. a至d之組合。
3. 如請求項1之升糖激素肽，其中位置3之胺基酸包含下列側鏈：(i)結構I且R¹為CH₂-S，X為NH，且R²為CH₃；(ii)結構I且R¹為CH₂，X為NH，R²為CH₃；(iii)結構I且R¹為C₀烷基，X為NH，R²為NHR⁴，且R⁴為H；(iv)結構II且R¹為CH₂，Y為NHR⁴，且R⁴為CH₃；(v)結構III且R¹為CH₂且結構III之R⁴為H；或(vi)結構I且R¹為CH₂-CH₂，X為NH，且R²為CH₃。
4. 如請求項1之升糖激素肽，其中該胺基異丁酸係在該升糖激素肽之位置16處。
5. 如請求項1之升糖激素肽，其中該無羥基之胺基酸為Abu或Ile。
6. 如請求項1之升糖激素肽，其中該帶電胺基酸係選自由Lys、Arg、His、Asp、Glu、磺基丙胺酸(cysteic acid)及高磺基丙胺酸(homocysteic acid)組成之群。
7. 如請求項1之升糖激素肽，其中該插入胺基酸包含Glu或Lys。
8. 如請求項1之升糖激素肽，其中該升糖激素肽包含SEQ ID NO：62-67及69-74中任一者之胺基酸序列。
9. 如請求項8之升糖激素肽，其包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列。
10. 如請求項1之升糖激素肽，其中a. 一親水部分係共價連接至位置16、17、20、21、24及29中任一處或在C末端胺基酸處之胺基酸；b. 醯基或烷基係共價連接至位置10之胺基酸或該C末端胺基酸的側鏈；或c. a及b之組合。
11. 如請求項10之升糖激素肽，其中該親水部分為PEG。
12. 如請求項10之升糖激素肽，其中該醯基為C₄至C₃₀脂肪醯基或該烷基為C₄至C₃₀烷基。
13. 如請求項10之升糖激素肽，其中該醯基或烷基係經由間隔基與該胺基酸之側鏈連接。
14. 如請求項1之升糖激素肽，其中當該升糖激素肽無親水部分時，則該升糖激素肽對升糖激素受體之活性為原生升糖激素之活性的至少約20%。
15. 一種二聚體，其包含如請求項1至14中任一項之升糖激素肽。
16. 如請求項15之二聚體，其中該二聚體為均二聚體。
17. 一種接合物，其包含如請求項1至14中任一項之升糖激素肽。
18. 一種融合肽，其包含如請求項1至14中任一項之升糖激素肽。
19. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至14中任一項之升糖激素肽，如請求項15或16之二聚體，如請求項17之接合物，如請求項18之融合肽，或其組合，及醫藥學上可接受之載劑。
20. 如請求項19之醫藥組合物，其中該醫藥組合物進一步包含胰島素。
21. 一種套組，其用於向有需要之患者投與升糖激素促效劑，該套組包含如請求項19或20之醫藥組合物及用於向該患者投與該醫藥組合物之器件。
22. 如請求項21之套組，其中該器件包含針筒及針，其中該醫藥組合物係預包裝在該針筒內。
23. 如請求項1之升糖激素肽，其係用於在有需要之患者中治療或預防低血糖症。
24. 如請求項1之升糖激素肽，其係用於穩定有需要之患者之血糖濃度。
25. 一種如請求項1至13中任一項之升糖激素肽之用途，其係用於製備在有需要之患者中治療或預防低血糖症之藥物。
26. 一種如請求項1至13中任一項之升糖激素肽之用途，其係用於製備穩定有需要之患者之血糖濃度之藥物。