JP2015147791A - 生理学的ｐＨの緩衝液中で向上した溶解性及び安定性を示すグルカゴン類縁体 - Google Patents

生理学的ｐＨの緩衝液中で向上した溶解性及び安定性を示すグルカゴン類縁体 Download PDF

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Abstract

【課題】低血糖症を治療するために用いるグルカゴン受容体活性を保持し、且つ天然グルカゴンペプチドと比べて向上した溶解性を示す、グルカゴンペプチドの提供。【解決手段】グルカゴンアゴニスト活性を有するグルカゴンペプチドであって、（ｉ）α，α−二置換アミノ酸により１６、２０、２１、及び２４位のうちの１、２、３個又は全てのアミノ酸が置換されている特定のアミノ酸配列、を含む、グルカゴンペプチド。グルカゴンアゴニスト活性を保持しながら、向上した溶解性及び／又は半減期を有する。【選択図】なし

Description

プレプログルカゴンは、１５８アミノ酸前駆体ポリペプチドであり、異なる組織においてプロセシングされて、グルコースホメオスタシス、インスリン分泌、胃排出及び腸管成長、並びに食物摂取の調節を含む多種多様な生理学的機能に関わる、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）及びオキシントモジュリン（ＯＸＭ）を含む多数の異なるプログルカゴン誘導ペプチドを形成する。グルカゴンは、プレプログルカゴンのアミノ酸３３から６１に対応する２９アミノ酸ペプチドであり、一方、ＧＬＰ−１は、プレプログルカゴンのアミノ酸７２から１０８に対応する３７アミノ酸ペプチドとして産生される。
低血糖症は、血中グルコースレベルが体の活動にとって十分なエネルギーを提供するには低すぎるほど低下したときに生じる。成人又は１０歳を超える小児において、低血糖症は、糖尿病治療の副作用以外ではまれであるが、他の薬物療法又は疾患、ホルモン若しくは酵素欠乏又は腫瘍によってもたらされる可能性がある。血中グルコースが下降し始めると、膵臓により産生されるホルモンであるグルカゴンは、肝臓にグリコーゲンを分解し、グルコースを放出するようにシグナルを送り、血中グルコースレベルを正常なレベルに上昇させる。したがって、グルコース調節におけるグルカゴンの最も認識されている役割は、インスリンの作用に対抗し、血中グルコースレベルを維持することである。しかし、糖尿病患者では、低血糖に対するグルカゴン反応は損なわれている場合があり、グルコースレベルを正常な範囲に戻すことが難しくなっている。
低血糖症は、速やかな医学的配慮を必要とする生命を脅かす事象である。グルカゴンの投与は、急性低血糖症を治療する確立された薬物療法であり、投与の数分内にグルコースの正常レベルを回復することができる。グルカゴンが低血糖症の急性医学治療に使用される場合、結晶形態のグルカゴンは希釈酸緩衝液により溶解化され、溶液が筋肉内に注射される。この治療は効果的であるが、その方法論は煩わしく、意識が完全でなくなった人にとっては危険である。したがって、母体となる分子の生物学的機能を維持するが、生理学的な条件下で十分に可溶性で安定であり、注射用の液剤として予備処方することができるような、グルカゴンの類縁体の必要性が存在する。
加えて、糖尿病患者は、微小血管合併症を遅延又は予防するために、ほぼ正常な血中グルコースレベルを維持することを勧められている。この目標の達成には、通常、集中的なインスリン治療を必要とする。この目的を達成しようという努力において、医者は糖尿病患者における低血糖症の頻度及び重篤度の顕著な増加に遭遇する。したがって、現行のインスリン療法よりも低血糖症を誘発する可能性が低い改善された医薬び方法論が、糖尿病の治療のために必要である。
本明細書に記載されているように、商業的用途に適している医薬組成物に含まれ、生理学的ｐＨにおいて増強された生物物理学的安定性及び水溶性を示す、高い効力のグルカゴン類縁体が提供される。天然のグルカゴンは、生理学的ｐＨ範囲で溶解性も安定性もなく、したがって再構成及び即時利用を必要とする乾燥生成物として製造されなければならない。本明細書に記載されるグルカゴン類縁体は、天然ホルモンが現在利用されている現行の治療設定においてそれらをより有用なものとするような、増強された物理的特性を有する。これらの化合物を一つの実施態様に従って使用して、、低血糖症を治療するための、注射用の予備処方液剤を調製することができる。あるいは、グルカゴン類縁体をインスリンと同時投与してインスリンの効果を緩衝し、血中グルコースレベルのより安定的な維持を可能にすることができる。加えて、本明細書に開示されている修飾グルカゴンペプチドを含む組成物の有益な使用が、下記に詳細に記載されている。
本発明の一つの実施態様は、グルカゴン受容体活性を保持し、且つ天然グルカゴンペプチド（配列番号１）と比べて向上した溶解性を示す、グルカゴンペプチドを提供する。天然グルカゴンは、特に生理学的ｐＨで水溶液中で不十分な溶解性しか示さず、経時的に凝集及び沈殿する傾向がある。対照的に、本発明の一つの実施態様のグルカゴンペプチドは、６〜８又は６〜９のｐＨ、例えばｐＨ７において２５℃で２４時間経過後に、天然グルカゴンと比較して少なくとも２倍、５倍、又はそれよりもさらに高い溶解性を示す。
一つの実施態様において、グルカゴンペプチドは、天然グルカゴンの活性の、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％の活性、８０％の活性、８５％の活性、又は９０％の活性を保持する（例えば実施例１３に一般的に記載されているアッセイを使用するｃＡＭＰ産生により測定した場合の、グルカゴンペプチド対グルカゴンのＥＣ５０の逆比として計算）。一つの実施態様において、本発明のグルカゴンペプチドは、グルカゴンと同じ又はそれを超える活性（本明細書において、用語「効力」と同義的に使用される）を有する。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、天然グルカゴンの約１００％、１０００％、１０，０００％、１００，０００％、又は１，０００，０００％までの活性を保持する。
グルカゴンは、通常、ＧＬＰ−１受容体に対して天然ＧＬＰ−１の活性の約１％の活性を有する。ＧＬＰ−１（７〜３６）アミド（配列番号５７）やＧＬＰ−１（７〜３７）酸（配列番号５８）は、ＧＬＰ−１受容体に対して実質的に同等の活性を示す、生物学的に活性型のＧＬＰ−１である。グルカゴンは、また、ＧＬＰ−１受容体と比較してグルカゴン受容体に対して１０倍から２０倍より選択性がある（選択性はグルカゴンのグルカゴン受容体・対・ＧＬＰ−１受容体に対するＥＣ５０の逆比として計算）。例えば、グルカゴン受容体に対するグルカゴンのＥＣ５０が０．２２nMであり、ＧＬＰ−１受容体に対するグルカゴンのＥＣ５０が３．８５nMであるアッセイでは、計算された選択性は１７．５倍である。活性は、例えば実施例１３に一般的に記載されているアッセイを使用してｃＡＭＰ産生により測定することができる。幾つかの実施態様において、本発明のグルカゴンペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１の活性の、約５％、４％、３％、２％若しくは１％未満の活性を示す、及び／又は、ＧＬＰ−１受容体と比較してグルカゴン受容体に対し約５倍、１０倍若しくは１５倍を超える選択性を示す。例えば、幾つかの実施態様において、本発明のグルカゴンペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対して天然ＧＬＰ−１の活性の５％未満の活性を示し、ＧＬＰ−１受容体と比較してグルカゴン受容体に５倍を超える選択性を示す。
本発明の任意のグルカゴンペプチドは、追加的に、例えば２５℃で２４時間経過後に、元のペプチドの少なくとも９５％を保持するような、向上した安定性及び／又は低減された分解を示すことができる。幾つかの実施態様において、本発明のグルカゴンペプチドは、紫外線（ＵＶ）検出器により２８０nmで検出した場合、少なくとも７５％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９５％超、１００％まで）の濃度のペプチド、又は、約２５％未満（例えば、２０％未満、１５％未満、１０％未軟、５％、４％、３％、２％、１％未満、０％まで）の分解ペプチドが、少なくとも２０℃（例えば２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、少なくとも２７．５℃、少なくとも３０℃、少なくとも３５℃、少なくとも４０℃、少なくとも５０℃）及び１００℃未満、８５℃未満、７５℃未満又は７０℃未満の温度の溶液中で、１週間以上（例えば、２週間、４週間、１か月、２か月、４か月、６か月、８か月、１０か月、１２か月）経過後に検出可能であるような、向上した安定性を示す。
一つの実施態様によると、向上した溶解性を有するグルカゴンペプチドであって、荷電アミノ酸を、ペプチドのＣ末端部分一つの実施態様では配列番号１のＣ末端から２７位までの位置、に導入する、アミノ酸置換及び／又は付加により修飾されている、グルカゴンペプチドが提供される。更に、１、２又は３個の荷電アミノ酸を、Ｃ末端部分の範囲内、一つの実施態様では２７位のＣ末端、に導入してもよい。一つの実施態様によると、２８位及び／又は２９位の天然アミノ酸が荷電アミノ酸で置換されており、且つ／或いは、１〜３個の荷電アミノ酸がペプチドのＣ末端、２９位の後ろ、に付加されている。例示的な実施態様において、１、２個、又は全ての荷電アミノ酸は、負に荷電されている。グルカゴン活性を保持しながら、更なる修飾、例えば保存的置換をグルカゴンペプチドに行うことが可能である。
一つの例示的な実施態様によると、グルカゴンペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列、又は、天然グルカゴン若しくはそのグルカゴンアゴニスト類縁体に対して１〜３個の更なるアミノ酸修飾を含有するような、その類縁体を含む。配列番号１１は、天然タンパク質の２８位のアスパラギン残基がアスパラギン酸で置換されている修飾されたグルカゴンペプチドを表す。別の例示的な実施態様において、グルカゴンペプチドは、天然タンパク質の２８位のアスパラギン残基がグルタミン酸で置換されている配列番号３８のアミノ酸配列を含む。他の例示的な実施態様には、配列番号２４、２５、２６、３３、３５、３６、及び３７のグルカゴンペプチドが含まれる。
別の実施態様によると、天然グルカゴン（配列番号１）の１６位にアミノ酸修飾を含む、グルカゴン受容体に対して増強された効力を有するグルカゴンペプチドが提供される。非限定例によると、そのような増強された効力は、１６位の天然型のセリンを、グルタミン酸により又は４原子の長さの側鎖を有する別の負荷電アミノ酸により置換することによって、あるいは、グルタミン、ホモグルタミン酸若しくはホモシステイン酸のいずれかにより、又は少なくとも１個のヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ）を含有し約４（若しくは３〜５）原子の長さを有する側鎖を含有する荷電アミノにより置換することによって、もたらすことができる。グルタミン酸による１６位のセリンの置換は、グルカゴン活性を、グルカゴン受容体に対して少なくとも２倍、４倍、５倍及び１０倍を超えるまで増強する。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、ＧＬＰ−１受容体よりもグルカゴン受容体に対して選択性を保持し、例えば少なくとも５倍、１０倍、又は１５倍の選択性である。
前述の化合物のいずれの溶解性も、ペプチドへの親水性部分の結合により更に改善することができる。そのような基の導入も、例えば延長された循環半減期により測定すると、作用の持続時間を増加する。一つの実施態様において、親水性部分は、Ｃ末端延長部内又はＣ末端のアミノ酸において、前記グルカゴンペプチドの１６、１７、２１、２４、２９、４０位のうちの１つ以上のアミノ酸残基の側鎖と共有結合している、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖又は他の水溶性ポリマーである。幾つかの実施態様において、その位置の天然アミノ酸は、ペプチドへの親水性部分の結合を促進するために、親水性部分との架橋に適した側鎖を有するアミノ酸で置換されている。例示的なアミノ酸には、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ、又はアセチルフェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）が含まれる。他の実施態様において、親水性基を含むように修飾されているアミノ酸が、ペプチドのＣ末端に付加される。一つの実施態様によると、ポリエチレングリコール鎖は、約５００〜約４０，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有する。一つの実施態様において、ポリエチレングリコール鎖は、約５００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有する。別の実施態様において、ポリエチレングリコール鎖は、約１０，０００〜約２０，０００ダルトンの分子量を有する。さらに他の例示的な実施態様において、ポリエチレングリコール鎖は、約２０，０００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する。
幾つかの実施態様によると、本明細書に開示されているグルカゴンペプチドは、アシル基又はアルキル基、例えば天然型のアミノ酸に対して非天然型であるアシル又はアルキル基、を含むように修飾される。アシル化又はアルキル化は、循環中のグルカゴンペプチドの半減期を増加することができ、有利なことには、グルカゴン受容体及び／若しくはＧＬＰ−１受容体に対する作用開始を遅延する及び／若しくは作用の持続時間を延長する、並びに／又はＤＰＰ−ＩＶのようなプロテアーゼに対する耐性を改善することができる。アシル化又はアルキル化は、中性のｐＨにおいてペプチドの溶解性を増強することもできる。本明細書において示されているように、グルカゴンペプチドのグルカゴン受容体及びＧＬＰ−１受容体に対する活性は、アシル化されると、増強されるとまでいかなくても少なくとも維持される。
幾つかの態様において、グルカゴンペプチドは、スペーサー、例えばアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能スペーサー又は疎水性二官能スペーサー、を介して、アシル又はアルキル基に共有結合している。特定の態様において、ＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体に対する活性の増強は、スペーサーを有するペプチドのアシル化の際に観察される。例えばペプチド分内架橋（例えば、共有分子内架橋）を欠いている場合のような選択された態様において、ＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体に対する活性の更なる増強が、アシル基がスペーサーのないペプチドに結合しているアシル化ペプチドと比較して、スペーサーのあるペプチドのアシル化の際に観察される。幾つかの実施態様によると、スペーサーは、アミノ酸、アミノ酸を有するジペプチド、又は、長さが３〜１０個の原子（例えば６〜１０個の原子）のペプチド主鎖構造である。ある特定の実施態様によると、スペーサー及びアシル又はアルキル基の全長は、１４〜２８個の原子、例えば、１７〜２８個、１９〜２６個の原子、１９〜２１個の原子である。グルカゴン活性を増強する目的に適したスペーサーが、本明細書に更に記載されている。幾つかの実施態様において、本明細書に記載されているアシル化又はアルキル化ペプチドは、更に、ＧＬＰ−１受容体に対する活性を選択的に減少する修飾、例えば、ヒドロキシル基を欠いているアミノ酸、例えばアミノ酪酸（Ａｂｕ）又はＩｌｅ、による７位のＴｈｒの置換のような、７位のＴｈｒの修飾；又は、Ｃ末端から２７又は２８位のアミノ酸までの１個又は複数のアミノ酸の欠失（例えば長さがアミノ酸２７又は２８個のペプチドを生じるような、２８及び２９位のアミノ酸の一方又は両方の欠失）、を含む。
グルカゴンペプチドを、親水性部分が結合しているのと同じアミノ酸の位置又は異なるアミノ酸の位置で、アシル化又はアルキル化することができる。
幾つかの実施態様において、本発明は、１０位のアミノ酸に共有結合しているアシル基又はアルキル基を含むように修飾されている、グルカゴンペプチドを提供する。グルカゴンペプチドは、１０位のアミノ酸とアシル基又はアルキル基との間にスペーサーを更に含むことができる。幾つかの実施態様において、アシル基は、脂肪酸若しくは胆汁酸又はこれらの塩であり、例えばＣ４０〜Ｃ３０脂肪酸、Ｃ８〜Ｃ２４脂肪酸、コール酸、Ｃ４〜Ｃ３０アルキル、Ｃ８〜Ｃ２４アルキル、又は胆汁酸のステロイド部分を含むアルキルである。スペーサーは、アシル又はアルキル基を結合するのに適した反応性基を有する、任意の部分である。例示的な実施態様において、スペーサーは、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能基、例えばアミノポリ（アルキルオキシ）カルボキシレート、又は疎水性二官能スペーサーを含む。幾つかの実施態様において、スペーサーは、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、及び、ＮＨ2（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎ（ＣＨ2）ｍＣＯＯＨを含むスペーサーからなる群より選択され、ここでｍは、１〜６の任意の整数であり、そしてｎは、２〜１２の任意の整数である。そのようなアシル化又はアルキル化グルカゴンペプチドは、親水性部分を含んでもよく、これは場合によりポリエチレングリコールであってもよい。前述のグルカゴンペプチドのいずれも、２つのアシル基若しくは２つのアルキル基、又はそれらの組み合わせを含むことができる。
本発明は、更に、前記グルカゴンアゴニストの薬学的に許容される塩も包含する。
他の例示的な実施態様において、前述の化合物のいずれかを、グルカゴンペプチドのカルボキシ末端に第２ペプチドを付加することによって更に修飾して、薬学的特性を変えることができる。一つの実施態様において、グルカゴンペプチドは、ペプチド結合を介して第２ペプチドと共有結合しており、ここで第２ペプチドは、配列番号２０、配列番号２１、及び配列番号２２からなる群より選択される配列を含む。
幾つかの実施態様において、１又は２位での修飾は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）切断に対するペプチドの耐性を増加することができる。例えば、２位のアミノ酸は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン、又はアミノイソ酪酸で置換されていることができる。代替的に又は追加的に、１位のアミノ酸は、Ｄ−ヒスチジン（Ｄ−Ｈｉｓ）、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、ホモ−ヒスチジン、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、又はアルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）で置換されていることができる。
２位での修飾（例えば、２位でのＡＩＢ）、及び、幾つかの場合においては、１位での修飾（例えば、１位でのＤＭＩＡ）は、グルカゴン活性を（時には顕著に）低減することがあるが、驚くべきことに、このグルカゴン活性の低減は、グルカゴンのＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９あたり）におけるアルファ−へリックス構造を安定化することによって、回復できることが観察された。幾つかの実施態様において、安定化は、「ｉ」と「ｉ＋４」位のアミノ酸の間の共有結合を介しており、ここで「ｉ」は１２〜２５の任意の整数である。幾つかの特定の実施態様において、「ｉ」と「ｉ＋４」は、１２と１６、１６と２０、又は２０と２４、又は２４と２８である。幾つかの実施態様において、この共有結合は、１６位のグルタミン酸と２０位のリシンとの間のラクタム架橋である。例示的な実施態様において、架橋又はリンカーは、長さが約８個（又は７〜９個）の原子である。他の実施態様において、安定化は、「ｊ」と「ｊ＋３」位のアミノ酸の間の共有結合を介しており、ここで「ｊ」は１２〜２７の任意の整数である。例示的な実施態様において、架橋又はリンカーは、長さが約６個（又は５〜７個）の原子である。さらに他の実施態様において、安定化は、「ｋ」と「ｋ＋７」位のアミノ酸の間の共有結合を介しており、ここで「ｋ」は１２〜２２の任意の整数である。幾つかの実施態様において、この共有結合は、ラクタム架橋以外の分子内架橋である。適切な共有結合方法（すなわち、共有分子内架橋を形成する方法）には、例えば、オレフィンメタセシス、ランチオニンに基づいた環化、ジスルフィド架橋又は改質硫黄含有架橋形成、α，ω−ジアミノアルカン鎖の使用、金属原子架橋の形成、及びペプチド環化の他の方法、のいずれかの１つ以上が含まれる。
さらに他の実施態様において、へリックスは、水素結合、イオン相互作用、及び塩架橋が含まれるが、但しこれらに限定されない、非共有結合（すなわち、非共有分子内架橋）により、安定化される。
本発明の他の実施態様において、グルカゴンペプチドのＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９あたり）のアルファ−へリックス構造の安定化は、所望の活性を保持する位置への１個以上のα，α−二置換アミノ酸の意図的な導入を介して、達成される。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドの１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、又は２９位のうちの１、２、３、４つ又はそれ以上は、α，α−二置換アミノ酸で置換されている。例えば、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）によるグルカゴンペプチドの１６位の置換は、塩架橋又はラクタムの不在下で、安定化されたアルファ−へリックスをもたらす。そのようなペプチドは、本明細書において、分子内架橋を欠いているペプチドとして考慮される。特定の態様において、アルファ−へリックスの安定化は、共有分子内架橋、例えばラクタム架橋やジスルフィド架橋、を導入することなく、１個以上のα，α−二置換アミノ酸を導入することにより達成される。そのようなペプチドは、本明細書において共有分子内架橋を欠いているペプチドと考慮される。幾つかの実施態様において、１６、２０、２１又は２４位のうちの１、２、３つ、又はそれ以上は、ＡＩＢで置換されている。
したがって、幾つかの実施態様において、本発明は、グルカゴンアゴニスト活性を有するグルカゴンペプチドであって、１〜３個のアミノ酸修飾を含む以下のアミノ酸配列：
Ｘ１−Ｘ２−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｚ（配列番号３９）
を含むグルカゴンペプチドを提供し、
ここで、Ｘ１及びＸ２は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する（又は耐性を増加する）、非天然アミノ酸であり、
Ｚは、−ＣＯＯＨ（天然型のＣ−末端カルボキシレート）、−Ａｓｎ−ＣＯＯＨ、Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＣＯＯＨ、及びＹ−ＣＯＯＨからなる群より選択され、Ｙは１〜２個のアミノ酸であり、
分子内架橋（好ましくは共有結合）は、ｉの位置のアミノ酸の側鎖と、ｉ＋４の位置のアミノ酸の側鎖とを連結し、ここで、ｉは、１２、１６、２０又は２４である。
幾つかの実施態様において、分子内架橋はラクタム架橋である。幾つかの実施態様において、配列番号３９のｉ及びｉ＋４の位置のアミノ酸は、Ｌｙｓ及びＧｌｕ、例えばＧｌｕ１６及びＬｙｓ２０、である。幾つかの実施態様において、Ｘ１は、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｎ−メチル−Ｈｉｓ、アルファ−メチル−Ｈｉ、イミダゾール酢酸、デス−アミノ−Ｈｉｓ、ヒドロキシル−Ｈｉｓ、アセチル−Ｈｉｓ、ホモ−Ｈｉｓ、及びアルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）からなる群より選択される。他の実施態様において、Ｘ２は、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、Ｖａｌ、及びアルファ，アルファイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群より選択される。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、アミノ酸位置１６、１７、２０、２１、２４、２９、４０のいずれか、Ｃ末端延長部の範囲内、又はＣ末端アミノ酸において、親水性部分と共有結合している。例示的な実施態様において、この親水性部分は、これらの位置のいずれかにおけるＬｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン、又はアセチル−フェニルアラニン残基と共有結合している。例示的な親水性部分には、例えば１，０００ダルトンから約４０，０００ダルトン又は約２０，０００ダルトンから約４０，０００ダルトンの分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。
他の実施態様において、本発明は、グルカゴンアゴニスト活性を有するグルカゴンペプチドであって、アミノ酸配列：
Ｘ１−Ｘ２−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｚ（配列番号３９）
を含むグルカゴンペプチドを提供し、
ここで、Ｘ１及びＸ２は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する（又は耐性を増加する）、非天然アミノ酸であり、
グルカゴンペプチドの１６、２０、２１、及び２４位のうちの１、２、３、４つ又はそれ以上は、α，α−二置換アミノ酸で置換されており、
Ｚは、−ＣＯＯＨ（天然型のＣ−末端カルボキシレート）、−Ａｓｎ−ＣＯＯＨ、Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＣＯＯＨ及びＹ−ＣＯＯＨからなる群より選択され、Ｙは１〜２個のアミノ酸である。
前述のグルカゴンペプチド又は類縁体への例示的な更なるアミノ酸修飾には、以下のものが含まれる：ヒドロキシル基を欠いているアミノ酸、例えばＡｂｕ又はＩｌｅ、による、７位のＴｈｒの置換（これは更に、アシル又はアルキル基が天然型のアミノ酸に対して非天然型であるアシル又はアルキル基に（場合によりスペーサーを介して）共有結合している側鎖を含むアミノ酸の置換又は付加と組み合わされてもよい）；Ａｒｇによる１２位のＬｙｓの置換；Ｇｌｕによる１５位のＡｓｐの置換；Ｔｈｒ又はＡＩＢによる１６位のＳｅｒの置換；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ又はＡＩＢによる２０位のＧｌｎの置換；Ｇｌｕによる２１位のＡｓｐの置換；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ又はＡＩＢによる２４位のＧｌｎの置換；Ｌｅｕ又はＮｌｅによる２７位のＭｅｔの置換；荷電アミノ酸による２８位のＡｓｎの置換；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸及びホモシステイン酸からなる群より選択される荷電アミノ酸による２８位のＡｓｎの置換；Ａｓｎ、Ａｓｐ又はＧｌｕによる２８位での置換；Ａｓｐによる２８位での置換；Ｇｌｕによる２８位での置換；荷電アミノ酸による２９位のＴｈｒの置換；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸及びホモシステイン酸からなる群より選択される荷電アミノ酸による２９位のＴｈｒの置換；Ａｓｐ、Ｇｌｕ又はＬｙｓによる２９位での置換；Ｇｌｕによる２９位での置換；２９位の後への１〜３個の荷電アミノ酸の挿入；Ｇｌｕ又はＬｙｓの３０位（すなわち、２９位の後）への挿入；場合によりＬｙｓの３１位への挿入；場合により２９位のアミノ酸がＴｈｒ又はＧｌｙであるＣ末端への配列番号２０の付加；親水性部分に共有結合しているアミノ酸の置換又は付加；或いはこれらの組み合わせ。
なお更なる例示的な実施態様において、前述のペプチドのいずれも、その安定性を改善するために、配列番号１の１５位のアミノ酸を修飾して、特に酸性又はアルカリ性の緩衝液におけるペプチドの経時的な分解を低減させる更なる修飾を加えることができる。例示的な実施態様において、１５位のＡｓｐは、Ｇｌｕ、ホモ−Ｇｌｕ、システイン酸、又はホモ−システイン酸で置換されている。
あるいは、本明細書に記載されているグルカゴンペプチドのいずれかを、配列番号１の１６位のアミノ酸を修飾することより更に修飾して、安定性を改善することができる。例示的な実施態様において、１６位のＳｅｒは、Ｔｈｒ若しくはＡＩＢにより、又はグルカゴン受容体に対する効力を増強するような上記に記載されたアミノ酸置換のいずれかにより、置換されている。そのような修飾は、Ａｓｐ１５−Ｓｅｒ１６のペプチド結合の切断を低減する。
グルカゴン受容体に対して維持又は増強された活性は、グルタミン類縁体により３位のＧｌｎを修飾することによって達成することができる。例えば、３位にグルタミン類縁体を含むグルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体に対して天然グルカゴン（配列番号１）の活性の約５％、約１０％、約２０％、約５０％、若しくは約８５％又はそれ以上の活性を示すことができる。幾つかの実施態様において、３位にグルタミン類縁体を含むグルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体に対して、３位の修飾アミノ酸（例えば、配列番号６９又は配列番号７０）以外は、グルタミン類縁体を含むペプチドと同じアミノ酸配列を有するような対応するグルカゴンペプチドの活性の、約２０％、約５０％、約７５％、約１００％、約２００％、若しくは約５００％又はそれ以上の活性示すことができる。幾つかの実施態様において、３位にグルタミン類縁体を含むグルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体に対して増強された活性を示すが、増強された活性は、天然グルカゴンの又は３位の修飾アミノ酸以外は、グルタミン類縁体を含むペプチドと同じアミノ酸配列を有するような対応するグルカゴンペプチドの活性の、１０００％、１０，０００％、１００，０００％、又は１，０００，０００％以下の活性である。
幾つかの実施態様において、グルタミン類縁体は、下記の構造Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩ：
Figure 2015147791
 〔式中、Ｒ1は、Ｃ0-3アルキル又はＣ0-3ヘテロアルキルであり；Ｒ2は、ＮＨＲ4又はＣ1-3アルキルであり；Ｒ3は、Ｃ1-3アルキルであり；Ｒ4は、Ｈ又はＣ1-3アルキルであり；Ｘは、ＮＨ、Ｏ、又はＳであり；そしてＹは、ＮＨＲ4、ＳＲ3、又はＯＲ3である〕で示される側鎖を含む、天然型の又は非天然型のアミノ酸である。幾つかの実施態様において、Ｘは、ＮＨであるか、又はＹは、ＮＨＲ4である。幾つかの実施態様において、Ｒ1は、Ｃ0-2アルキル又はＣ1ヘテロアルキルである。幾つかの実施態様において、Ｒ2は、ＮＨＲ4又はＣ1アルキルである。幾つかの実施態様において、Ｒ4は、Ｈ又はＣ1アルキルである。例示的な実施態様において、構造Ｉの側鎖を含み、以下のいずれかが成り立つアミノ酸が提供される：Ｒ1はＣＨ2−Ｓであり、ＸはＮＨであり、そしてＲ2はＣＨ3である（アセトアミドメチル−システイン、Ｃ（Ａｃｍ））；Ｒ1はＣＨ2であり、ＸはＮＨであり、そしてＲ2はＣＨ3である（アセチルジアミノブタン酸、Ｄａｂ（Ａｃ））；Ｒ1はＣ0アルキルであり、ＸはＮＨであり、Ｒ2はＮＨＲ4であり、そしてＲ4はＨである（カルバモイルジアミノプロパン酸、Ｄａｐ（尿素））；又は、Ｒ1はＣＨ2−ＣＨ2であり、ＸはＮＨであり、そしてＲ2はＣＨ3である（アセチルオルニチン、Ｏｍ（Ａｃ））。例示的な実施態様において、構造ＩＩの側鎖を含むアミノ酸が提供され、ここで、Ｒ1はＣＨ2であり、Ｙは、ＮＨＲ4であり、そしてＲ4は、ＣＨ3である（メチルグルタミン、Ｑ（Ｍｅ））。例示的な実施態様において、構造ＩＩＩの側鎖を含むアミノ酸が提供され、ここで、Ｒ1はＣＨ2であり、そしてＲ4は、Ｈである（メチオニン−スルホキシド、Ｍ（Ｏ））。特定の実施態様において、３位のアミノ酸はＤａｂ（Ａｃ）により置換されている。例えば、グルカゴンアゴニストは、配列番号６３、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、及び配列番号７４のアミノ酸配列を含むことができる。
グルカゴンペプチドのグルカゴン受容体に対する増強された活性は、アシル又はアルキル基、例えば天然型のアミノ酸に対して非天然型であるアシル又はアルキル基（例えば、Ｃ４〜Ｃ３０脂肪アシル基、Ｃ４〜Ｃ３０アルキル基）を、グルカゴンペプチドのアミノ酸側鎖に共有結合することによって、達成することもできる。幾つかの実施態様において、アシル化又はアルキル化グルカゴンペプチドは、分子内架橋、例えば共有分子内架橋（例えば、ラクタム）を欠いている。特定の態様において、アシル又はアルキル基は、スペーサー、例えば長さが３〜１０個の原子であるスペーサーを介してグルカゴンペプチドのアミノ酸の側鎖に結合している。幾つかの実施態様において、アシル又はアルキル基は、スペーサーを介してグルカゴンペプチドの１０位のアミノ酸の側鎖に結合している。特定の実施態様において、アシル化又はアルキル化グルカゴンペプチドは、更に、ＧＬＰ−１受容体に対するペプチドの活性を選択的に減少する修飾を含む。例えば、アシル化又はアルキル化グルカゴンペプチドは、Ｃ末端アルファカルボキシレート、ヒドロキシル基を欠いているアミノ酸（例えばＡｂｕ若しくはＩｌｅ）による７位のＴｈｒの置換、２７若しくは２８アミノ酸ペプチドを生じるような２７若しくは２８位のアミノ酸のＣ末端のアミノ酸の欠失、又はこれらの組み合わせ、のいずれかを含むことができる。
幾つかの実施態様において、本明細書に記載されているグルカゴペプチドのいずれかを、２０、２１、２４又は２７の位置のうちの１、２、３つのいずれか又は４つを全て修飾することより更に修飾して、多様なアミノ酸位置での分解を低減することができる。例示的な実施態様には、Ａｌａ又はＡＩＢによる２０位のＧｌｎの置換、Ｇｌｕによる２１位のＡｓｐの置換、Ａｌａ又はＡＩＢによる２４位のＧｌｎの置換、Ｌｅｕ又はＮｌｅによる２７位のＭｅｔの置換、が含まれる。メチオニンの除去又は置換は、メチオニンの酸化に起因するような分解を低減する。Ｇｌｎ又はＡｓｎの除去又は置換は、Ｇｌｎ又はＡｓｎの脱アミド化に起因するような分解を低減する。Ａｓｐの除去又は置換は、Ａｓｐの脱水により環状スクシンイミド中間体を形成し、続く異性化によりイソアスパラギン酸塩を形成することにより生じるような分解を低減する。
幾つかの実施態様において、本明細書に記載されているグルカゴペプチドのいずれかを、少なくとも部分的なグルカゴン受容体活性を保持しつつ、グルカゴン受容体に対する活性に有害な影響を与えることなく、修飾することができる。例えば、保存的又は非保存的置換、付加又は欠失を、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８又は２９位のいずれかにおいて実施することができる。例示的な実施態様において、１２位のＬｙｓはＡｒｇで置換されている。別の例示的な実施態様において、２９及び／又は２８位のアミノ酸（そして場合により２７位のアミノ酸も）は欠失している。
本明細書に記載されている任意のグルカゴンペプチドは、例えば実施例１３のアッセイを使用して、グルカゴン受容体を過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞におけるｃＡＭＰ誘導について試験したとき、約１００nM、７５nM、５０nM、４０nM、３０nM、２０nM、１０nM、５nM、１nM又はそれ以下のＥＣ５０をヒトグルカゴン受容体に対して示すことができる。典型的なペグ化ペプチドは、非ペグ化ペプチドと比較するとより高いＥＣ５０を示す。例えば、本明細書に記載されているグルカゴンペプチドは、非ペグ化された場合、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴン（配列番号１）活性の、少なくとも２０％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、１００％、１５０％、２００％、４００％、５００％又はそれ以上）である活性を、グルカゴン受容体に対して示すことができる。特定の実施態様において、本明細書に記載されているグルカゴンペプチドは、親水性部分を欠いている場合、グルカゴン受容体に対して天然グルカゴンの示されている活性％を示すが、親水性部分を含む場合、グルカゴン受容体に対して天然グルカゴンの減少した活性％を示す。例えば、本明細書に記載されているグルカゴンペプチドは、ペグ化された場合、天然グルカゴンの活性の少なくとも２％（例えば、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％又は少なくとも１０％）である活性を、グルカゴン受容体に対して示すことができる。幾つかの実施態様において、本明細書に記載されているグルカゴンペプチドは、上記に示されている活性のいずれかを示すことができるが、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの活性の１０００％、１０，０００％、１００，０００％、又は１，０００，０００％以下である。
幾つかの特定の実施態様において、グルカゴンペプチドは、以下を含む：（ａ）ＤＰＰ−ＩＶ耐性を付与する１及び／又は２位でのアミノ酸修飾、例えば１位でのＤＭＩＡによる置換又は２位でのＡＩＢによる置換、（ｂ）１２〜２９位の範囲内、例えば１６及び２０位の分子内架橋又はα，α二置換アミノ酸による１６，２０、２１及び２４位のアミノ酸の１個以上の置換、そして更に以下を含んでもよい：（ｃ）場合により、例えば２４、２９位又はＣ末端アミノ酸のＣｙｓを介したＰＥＧのような親水性部分への結合、（ｄ）場合により、例えばＮｌｅでＭｅｔを置換する２７位でのアミノ酸修飾、（ｅ）場合により、分解を低減する２０、２１、及び２４位でのアミノ酸修飾、並びに、（ｆ）場合により、配列番号２０への結合。グルカゴンペプチドが配列番号２０に結合している場合、２９位のアミノ酸は、特定の実施態様において、Ｔｈ又はＧｌｙである。別の特定の実施態様において、グルカゴンペプチドは、（ａ）Ａｓｐ２８Ｇｌｕ２９又はＧｌｕ２８Ｇｌｕ２９又はＧｌｕ２９Ｇｌｕ３０又はＧｌｕ２８Ｇｌｕ３０又はＡｓｐ２８Ｇｌｕ３０、を含み、更に以下を含んでもよい：（ｂ）場合により、例えばＴｈｒ又はＡＩＢでＳｅｒを置換する１６位でのアミノ酸修飾、（ｃ）場合により、例えばＮｌｅでＭｅｔを置換する２７位でのアミノ酸修飾、並びに場合により分解を低減する２０、２１及び２４位でのアミノ酸修飾。特定の実施態様において、グルカゴンペプチドは、Ｔ１６，Ａ２０，Ｅ２１，Ａ２４，Ｎｌｅ２７，Ｄ２８，Ｅ２９である。
グルカゴンペプチドは、リンカーを介して結合している少なくとも２、３つ、又はそれ以上のペプチドを含む二量体、三量体、又はより高次な多量体の一部であることができ、ここで少なくとも１つ又は両方のペプチドはグルカゴンペプチドである。二量体は、ホモ二量体又はヘテロ二量体であることができる。幾つかの実施態様において、リンカーは、二官能チオール架橋剤及び二官能アミン架橋剤からなる群より選択される。特定の実施態様において、リンカーは、ＰＥＧ、例えば５kDaのＰＥＧ、２０kDaのＰＥＧである。幾つかの実施態様において、リンカーはジスルフィド結合である。例えば、二量体のそれぞれのモノマーは、Ｃｙｓ残基（例えば、末端又は内部に位置したＣｙｓ）を含むことができ、それぞれのＣｙｓ残基の硫黄原子はジスルフィド結合の形成に参加する。本発明の幾つかの態様において、複数のモノマーは、複数の末端アミノ酸（例えば、Ｎ末端若しくはＣ末端）同士を介して、又は複数の内部アミノ酸同士を介して、又は少なくとも一方のモノマーの末端アミノ酸と少なくとももう一方のモノマーの内部アミノ酸とを介して、連結している。特定の態様において、複数のモノマーはＮ末端アミノ酸を介して連結してはいない。幾つかの態様において、多量体のモノマーは、各モノマーのＣ末端アミノ酸が互いに結合している「尾−尾」配向で互いに結合している。
結合体部分は、二量体、三量体、又はより高次な多量体を含む、本明細書に記載されているグルカゴンペプチドのいずれかに対して共有結合することができる。配列番号２０〜２２のいずれかのアミノ酸配列を含む融合ペプチドも考慮される。
グルカゴン受容体活性を増加する、部分的なグルカゴン受容体活性を保持する、溶解性を改善する、安定性を増加する、又は分解を低減するような、上記に記載された修飾のいずれかを、個別に又は組み合わせて、グルカゴンペプチドに適用することができる。したがって、グルカゴン受容体に対して天然グルカゴンの活性の少なくとも２０％の活性を保持し、６〜８又は６〜９のｐＨ（例えば、ｐＨ７）で少なくとも１mg/mLの濃度で溶解性であり、場合により２５℃で２４時間後、元のペプチドの少なくとも９５％を保持する（例えば、元のペプチドの５％以下しか分解又は切断されない）、グルカゴンペプチドを調製することができる。あるいは、グルカゴン受容体に対して天然グルカゴンの活性の少なくとも約１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％又は１０倍以上の活性を示し、場合により６〜８又は６〜９のｐＨ（例えば、ｐＨ７）で少なくとも１mg/mLの濃度で溶解性であり、場合により２５℃で２４時間後、元のペプチドの少なくとも９５％を保持する（例えば、元のペプチドの５％以下しか分解又は切断されない）、高い効力のグルカゴンペプチドを調製することができる。特定の実施態様において、本明細書に記載されているグルカゴンペプチドは、親水性部分を欠いている場合、グルカゴン受容体に対して天然グルカゴンの示されている活性％を示すが、親水性部分を含む場合、グルカゴン受容体に対して天然グルカゴンの減少した活性％を示す。幾つかの実施態様において、本明細書に記載されているグルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体に対して上記に示された相対活性レベルのの少なくともいずれかを示すことができるが、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの活性の１０，０００％、１００，０００％、又は１，０００，０００％以下である。
一つの実施態様によると、好ましくは滅菌され、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の純度レベルを有する、本明細書に開示されている任意の新規グルカゴンペプチドと、薬学的に許容される希釈剤、担体、又は賦形剤とを含む、医薬組成物が提供される。そのような組成物は、少なくともＡの濃度でグルカゴンペプチドを含有することができ、ここでＡは、０．００１mg/ml、０．０１mg/ml、０．１mg/ml、０．５mg/ml、１mg/ml、２mg/ml、３mg/ml、４mg/ml、５mg/ml、６mg/ml、７mg/ml、８mg/ml、９mg/ml、１０mg/ml、１１mg/ml、１２mg/ml、１３mg/ml、１４mg/ml、１５mg/ml、１６mg/ml、１７mg/ml、１８mg/ml、１９mg/ml、２０mg/ml、２１mg/ml、２２mg/ml、２３mg/ml、２４mg/ml、２５mg/ml、又はそれ以上である。他の実施態様において、そのような組成物は、最大でもＢの濃度でグルカゴンペプチドを含有することができ、ここでＢは、３０mg/ml、２５mg/ml、２４mg/ml、２３mg/ml、２２mg/ml、２１mg/ml、２０mg/ml、１９mg/ml、１８mg/ml、１７mg/ml、１６mg/ml、１５mg/ml、１４mg/ml、１３mg/ml、１２mg/ml、１１mg/ml、１０mg/ml、９mg/ml、８mg/ml、７mg/ml、６mg/ml、５mg/ml、４mg/ml、３mg/ml、２mg/ml、１mg/ml、又は０．１mg/mlである。幾つかの実施態様において、組成物はＡ〜Ｂのmg/ml、例えば０．００１〜３０．０mg/mlの濃度範囲でグルカゴンペプチドを含有することができる。一つの実施態様において、医薬組成物は、滅菌され場合より多様な容器に保存されている水性液剤を含む。そのような液剤を一つの実施態様に従って使用して、注射用の予備処方液剤を調製することができる。別の実施態様において、医薬組成物は凍結乾燥粉末剤を含む。医薬組成物を、患者に組成物を投与する使い捨て装置を含むキットの一部として更に包装することができる。装置は、シリンジ及び針又は充填済シリンジを含むことができる。容器又はキットにラベルを付けて周囲温度又は冷蔵温度で保存することができる。
一つの実施態様によると、本発明のグルカゴンペプチドの予備処方水性組成物を使用して、グルコースレベルを急速に増加する、血中グルコースレベルを正常化する、血中グルコースレベルを安定化する、又は低血糖症を予防若しくは治療する方法が提供される。この方法は、本開示の新規修飾グルカゴンペプチドを含む水性液剤の有効量を投与する工程を含む。幾つかの実施態様において、水性組成物は、組成物を患者に投与するのに使用される装置に予め包装されている。別の実施態様において、腸管の一過性麻痺を誘導する方法が提供される。この方法は、本明細書に開示されている１つ以上のグルカゴンペプチドを、それを必要とする患者に投与する工程を含む。
なお別の実施態様において、本発明のグルカゴンペプチドを含む水性液剤の有効量を投与することを含む、体重増加を低減する又は減量を誘導する方法が提供される。体重増加を低減する又は減量を誘導する方法は、薬剤誘導肥満を含む多様な原因の肥満の治療、並びに血管疾患（冠動脈疾患、発作、末梢血管疾患、虚血再灌流など）、高血圧、ＩＩ型糖尿病の発症、高脂血症及び筋骨格系疾患を含む肥満に関連する合併症の低減、に有用であることが予想される。
更なる実施態様において、インスリンと本発明のグルカゴンペプチドとを同時投与することを含む、高血糖症又は糖尿病の治療方法が提供される。高血糖症には、インスリン依存性又はインスリン非依存性のいずれかの、糖尿病、Ｉ型糖尿病、ＩＩ糖尿病又は妊娠糖尿病を含み、腎障害、網膜症、及び血管疾患を含む糖尿病の合併症を低減すること。インスリンと本発明のグルカゴンペプチドの同時投与は、夜間低血糖症を低減すること及び／又はインスリンの低血糖効果を緩衝することができ、同じ又は多い用量の短期作用又は長期作用インスリンを、より少ない有害低血糖効果で投与することを可能にする。本発明のグルカゴンペプチドと一緒にインスリンを含む組成物も提供される。
一つの実施態様によると、インスリン依存性患者において血中グルコースレベルを調節する改善された方法が提供される。この方法は、糖尿病を制御するのに治療上有効な量でインスリンを投与する工程及び低血糖症の予防に治療上有効な量で本開示の新規修飾グルカゴンペプチドを投与する工程を含み、前記投与工程は、互いに１２時間以内に実施される。一つの実施態様において、グルカゴンペプチド及びインスリンは単一組成物として同時投与される。
本明細書に記載されている全ての治療方法、医薬組成物、キット、及び他の同様の実施態様においては、グルカゴンペプチド、グルカゴンアゴニスト類縁体、グルカゴンアゴニスト、又はグルカゴン類縁体という用語の使用には、その薬学的に許容される塩又はエステルが全て含まれることを考慮する。
例示的なグルカゴンペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号３３からなる群より選択され、ここで、グルカゴンペプチドのアミノ酸２９は、ペプチド結合を介して第２ペプチドに結合し、前記第２ペプチドは、配列番号２０、配列番号２１、又は配列番号２２の配列を含む。一つの実施態様において、グルカゴンペプチドはペグ化されている。一つの実施態様において、本方法は、配列番号２４、配列番号２５、及び配列番号２６の配列を含む、一つのペプチドを投与する工程を含み、ここで２１位又は２４位のアミノ酸にはポリエチレン鎖が共有結合している。
オキシントモジュリンは、グルカゴン（すなわち、配列番号１）の２９アミノ酸配列を含有し、その後に配列番号２１（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）の８アミノ酸カルボキシ末端延長部が続く、３７アミノ酸ペプチドである。本発明は、本明細書に記載されているグルカゴン類縁体が、場合によりこの８アミノ酸カルボキシ末端延長部（配列番号２１）と結合しうることを考慮するが、本発明は、幾つかの実施態様において、配列番号２１の８個の連続するカルボキシアミノ酸を欠いているグルカゴン類縁体及びグルカゴン類縁体の使用を特に考慮する。
前述の概要は、本発明の全ての態様を定義することを意図せず、追加の実施態様が発明を実施するための形態のような他の章に記載されている。この文書は全体として統一された開示として関連し、本明細書に記載されている特徴の全ての可能な組み合わせは、たとえそのような特徴の組み合わせがこの文書の同じ行、段落又は章において一緒に見あたらないとしても、本明細書に記載されていると理解されるべきである。
更に、本発明は、本明細書の特定の段落により定義された変形よりも多少なりとも狭い範囲である本発明の実施態様のうちの１つ又は全てを含む。例えば、本発明の特定の態様が概念として記載される場合、概念の全ての構成要素が個別に本発明の実施態様であること及び概念の２つ以上の構成要素の組み合わせが本発明の実施態様であることを理解するべきである。
（関連出願の相互参照）
本出願は、以下の優先権を請求する：米国仮出願第６１／０７３，１９３号（２００８年６月１７日出願）、米国仮出願第６１／０７８，１６５号（２００８年７月３日出願）及び米国仮出願第６１／０９０，４１５号（２００８年８月２０日出願）。それぞれの出願の開示は、その全体が参照として本明細書に明確に組み込まれる。
３７℃でそれぞれ２４、４８、７２、９６、１４４、及び１６６時間インキュベートしたグルカゴンＣｙｓ21マレイミドＰＥＧ5Kの安定性を表す棒グラフである。 ３７℃でそれぞれ２４、７２、又は１４４時間インキュベートしたグルカゴンＣｙｓ21マレイミドＰＥＧ5KのｐＨ５でのＨＰＬＣ分析から生成したデータを表す。 それぞれ２、４、５．５、７、及び８のｐＨにより２５℃で６０時間経過後の、天然グルカゴンに対するグルカゴン類縁体（Ｄ２８、Ｅ２９、Ｅ３０）の溶解度を示すデータを表す。 それぞれ２、４、５．５、及び７のｐＨにより２５℃で２４時間経過後、次に４℃で２４時間経過後の、天然グルカゴンに対するグルカゴン類縁体（Ｅ１５Ｄ２８、Ｄ２８Ｅ２９及びＤ２８Ｅ３０）の溶解度を示すデータを表す。 ｐＨ７、４℃で２４時間後の、グルカゴン類縁体のＤ２８、Ｄ２８Ｅ３０及びＥ１５，Ｄ２８の最大溶解度を表す。 天然グルカゴン■に対するグルカゴン類縁体（Ｋ２９▲、Ｋ３０▼、及びＫ２９Ｋ３０◆）によるグルカゴン受容体仲介ｃＡＭＰ誘導を示すデータを表す。 天然グルカゴン■に対するグルカゴン類縁体（Ｄ２８□、Ｋ２９△、Ｅ３０▽、Ｋ３０Ｋ３１◇、及びＫ３０▼）によるグルカゴン受容体仲介ｃＡＭＰ誘導を示すデータを表す。 天然グルカゴン■に対するグルカゴン類縁体（（Ｄ２８□、Ｅ２８（黒色五角形）、及びＫ２９▲）によるグルカゴン受容体仲介ｃＡＭＰ誘導を示すデータを表す。 天然グルカゴン■に対するグルカゴン類縁体（Ｄ２８Ｅ２９＋、Ｄ２８Ｅ３０×、Ｅ１９Ｄ２８＊、及びＥ２９▲）によるグルカゴン受容体仲介ｃＡＭＰ誘導を示すデータを表す。 グルカゴン及びグルカゴン類縁体を筋肉内投与した後のビーグル犬における血清グルコース濃度の変化を示すデータを表す。動物には、グルカゴン、グルカゴンのカルボキシ末端に結合した配列番号３１の配列を有するグルカゴンを含むグルカゴン類縁体（グルカゴン−ＣＥＸ）、又は配列番号１１のアミノ酸２８にアスパラギン酸置換を含むグルカゴン類縁体（グルカゴン−Ａｓｐ２８）のいずれかの０．００５mg/kg用量を投与した。 図１１Ａ及び１１Ｂはそれぞれ、複数の置換を有するグルカゴン類縁体：Ｔ１６，Ａ２０，Ｅ２１，Ａ２４，Ｎｌｅ２７，Ｄ２８，Ｅ２９による、グルカゴン受容体仲介ｃＡＭＰ誘導及びＧＬＰ−１受容体仲介ｃＡＭＰ誘導を示すデータを表す。 時間（月）の関数としての、配列番号７１のペプチドを含む製剤の２８０nmでのＵＶ吸収の曲線下面積のグラフである。 時間（月）の関数としての、配列番号７６のペプチドを含む製剤の２８０nmでのＵＶ吸収の曲線下面積のグラフである。 時間（月）の関数としの、配列番号７８のペプチドを含む製剤の２８０nmでのＵＶ吸収の曲線下面積のグラフである。 ビヒクル対照、リラグルチド、（Ｃ１６）グルカゴンアミド、γＥ−γＥ−Ｃ１６グルカゴンアミド、ＡＡ−Ｃ１６グルカゴンアミド、又はβＡβＡ−Ｃ１６グルカゴンアミドを示された用量で注射されたマウスの体重の総変化（％）のグラフを表す。 ビヒクル対照、リラグルチド、（Ｃ１６）グルカゴンアミド、γＥ−γＥ−Ｃ１６グルカゴンアミド、ＡＡ−Ｃ１６グルカゴンアミド、又はβＡβＡ−Ｃ１６グルカゴンアミドを示された用量で注射されたマウスの、分析の７日目に測定した脂肪量（ｇ）のグラフを表す。 ビヒクル対照、リラグルチド、（Ｃ１６）グルカゴンアミド、γＥ−γＥ−Ｃ１６グルカゴンアミド、ＡＡ−Ｃ１６グルカゴンアミド、又はβＡβＡ−Ｃ１６グルカゴンアミドを示された用量で注射されたマウスの、血中グルコースの変化（mg/dL）のグラフを表す。
＜定義＞
本発明を記載し、請求するに際し、以下の用語を下記に記載した定義に従って使用する。
本明細書で使用されるとき、用語「薬学的に許容される担体」には、リン酸緩衝食塩水、水、油／水又は水／油乳剤のような乳剤、並びに多様な種類の湿潤剤のような任意の標準的な医薬担体が含まれる。この用語は、また、ヒトを含む動物における使用が米国連邦政府の規制当局により承認されているか又は米国薬局方に記載されている作用物質のいずれかを包含する。
本明細書で使用されるとき、用語「薬学的に許容される塩」は、母体化合物の生物学的活性を保持し、生物学的にも非生物学的にも有害ではないような、化合物の塩を意味する。本明細書に開示されている化合物の多くは、アミノ及び／若しくはカルボキシル基又は同様の基の存在によって酸性及び／又は塩基性の塩を形成することができる。
薬学的に許容される塩基性付加塩は、無機又は有機塩基から調製することができる。無機塩基から誘導される塩には、単なる例として、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム及びマグネシウム塩が含まれる。有機塩基から誘導される塩には、第一級、第二級及び第三級アミンの塩が含まれるが、これらに限定されない。
薬学的に許容される酸性付加塩は、無機又は有機塩基から調製することができる。無機酸から誘導される塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などが含まれる。有機酸から誘導される塩には、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などが含まれる。
本明細書で使用されるとき、用語「治療する」には、特定の障害若しくは状態を予防すること、又は特定の障害若しくは状態に関連する症状を緩和すること、及び／又は前記症状を防止若しくは排除することが含まれる。例えば、本明細書で使用されるとき、用語「糖尿病を治療する」は、一般に血中グルコースレベルを正常なレベルの方向に変えることを意味し、所定の状態に応じて血中グルコースレベルを増加又は減少することを含むことができる。
本明細書で使用されるとき、グルカゴンペプチドの「有効」量又は「治療有効量」は、所望の効果をもたらすペプチドの非毒性であるが十分な量を意味する。例えば、一つの所望の効果は、例えば血中グルコースレベルの増加により測定される、低血糖症の予防又は治療である。「有効」である量は、個人の年齢及び全身状態、投与様式などによって被験者毎に変わる。したがって、正確な「有効量」を規定することがいつも可能というわけではない。しかし、個別の症例における適切な「有効」量は、慣用的な実験を使用して当業者によって決定することができる。
用語「非経口的」は、消化管を介するのではなく、皮下、筋肉内、脊髄内又は静脈内のような他の経路によることを意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「精製された」又は同様の用語は、通常、天然又は自然環境において分子又は化合物と関連する汚染物質を実質的に無含有の形態で分子又は化合物を単離することを意味する。本明細書で使用されるとき、用語「精製された」は、絶対的な純度を必要とせず、むしろ相対的な定義として意図される。用語「精製ポリペプチド」は、他の化合物（核酸分子、脂質、及び炭水化物が含まれるが、これらに限定されない）から分離されているポリペプチドのことを記載するために本明細書において使用される。
用語「単離された」は、参照された物質が元の環境（例えば、天然型の場合は、自然環境）から除去されていることを必要とする。例えば、生きている動物に存在する天然型のポリヌクレオチドは単離されていないが、同じポリヌクレオチドが天然系で共存している物質の一部又は全てから分離していればは、単離されている。
本明細書で使用されるとき、用語「天然グルカゴン」は、配列番号１の配列から構成されるペプチドを意味し、用語「天然ＧＬＰ−１」は、ＧＬＰ−１（７〜３６）アミド（配列番号５７の配列から構成される）、ＧＬＰ−１（７〜３７）酸（配列番号５８の配列から構成される）、又はこの２つの化合物の混合物を示す総称である。本明細書で使用されるとき、更なる名称が不在なときの「グルカゴン」又は「ＧＬＰ−１」への一般的な参照は、それぞれ天然グルカゴン又は天然ＧＬＰ−１を意味することが意図される。
本明細書で使用するとき、「グルカゴンペプチド」には、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、又は、ペプチドに対するアミノ酸置換、付加、若しくは欠失、又は翻訳後修飾（例えば、メチル化、アシル化、ユビキチン化など）を含む配列番号１のアミノ酸配列の任意の類縁体であって、例えば実施例１３に記載されているアッセイを使用してｃＡＭＰ産生により測定された場合、グルカゴン又はＧＬＰ−１受容体活性を刺激するような類縁体を含む、任意のペプチドが含まれる。
用語「グルカゴンアゴニスト」は、例えば実施例１３に記載されているアッセイを使用してｃＡＭＰ産生により測定された場合、グルカゴン受容体活性を刺激するようなグルカゴンペプチドを含む、複合体を意味する。
本明細書で使用されるとき、「グルカゴンアゴニスト類縁体」は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１３からなる群より選択される配列、又は、これらの配列の２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、若しくは２９位に１つ以上の保存的アミノ酸置換を含むように修飾された類縁体、を含むグルカゴンペプチドである。
本明細書で使用されるとき、アミノ酸「修飾」は、アミノ酸の置換、付加、又は欠失を意味し、ヒトタンパク質において一般的に見出される２０個のアミノ酸によるものに加え、異形又は非天然型のアミノ酸のいずれかによる、置換又は付加が含まれる。本出願の全体を通して、番号による特定のアミノ酸位置（例えば、２８位）に対する全ての参照は、天然グルカゴン（配列番号１）におけるその位置のアミノ酸、又は任意の類縁体における対応するアミノ酸位置を意味する。例えば、本明細書において「２８位」に対する参照は、配列番号１の第１アミノ酸が欠失しているグルカゴン類縁体の場合は、対応する２７位を意味する。同様に、本明細書において「２８位」に対する参照は、１個のアミノ酸が配列番号１のＮ末端の前に付加されているグルカゴン類縁体の場合は、対応する２９位を意味する。
本明細書で使用されるとき、アミノ酸「置換」は、１個のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に代えることを意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「保存的アミノ酸置換」は、以下の５つの群の１つの範囲内の交換として本明細書において定義される：
Ｉ．小型で脂肪族の非極性又は僅かに極性の残基：
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
ＩＩ．極性の負荷電残基及びそれらのアミド：
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、システイン酸及びホモシステイン酸；
ＩＩＩ．極性の正荷電残基：
Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、オルニチン（Ｏｒｎ）；
ＩＶ．大型で脂肪族の非極性残基：
Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモシステイン；
Ｖ．大型の芳香族残基：
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、アセチルフェニルアラニン。
本明細書で使用されるとき、総称「ポリエチレングリコール」又は「ＰＥＧ」は、一般式：Ｈ（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＨ（ｎは９以上）により表される、分岐鎖又は直鎖の、エチレンオキシドと水の縮合ポリマーの混合物を意味する。更なる特定がない限り、この用語は、５００〜４０，０００ダルトンの範囲から選択される平均総分子量を有するエチレングリコールのポリマーを含むことが意図される。「ポリエチレングリコール」又は「ＰＥＧ」は、およその平均分子量を示す数字の接尾辞と組み合わせて使用。例えば、ＰＥＧ−５，０００は、平均約５，０００の総分子量を有するポリエチレングリコールを意味する。
本明細書で使用するとき、用語「ペグ化」及び同様の用語は、ポリエチレングリコールポリマーを化合物に結合することにより天然の状態が修飾された化合物を意味する。「ペグ化グルカゴンペプチド」は、共有結合しているＰＥＧ鎖を有するグルカゴンペプチドである。
本明細書で使用されるとき、ペプチドに対する一般的な参照は、修飾されたアミノ及びカルボキシ末端を有するペプチドを包含することが意図される。例えば、末端カルボン酸の代わりにアミド基を含むアミノ酸鎖は、標準的なアミノ酸を示すアミノ酸配列に包含されることが意図される。
本明細書で使用されるとき、「リンカー」は、２つの別々の実体を互いに結合する結合、分子、又は分子群である。リンカーは、２つの実体に最適な間隔をもたらしてもよいし、更に２つの実体が互いに分離することを可能にする不安定な結合を提供してもよい。不安定な結合には、光切断基、酸不安定部分、塩基不安定部分及び酵素切断基が含まれる。
本明細書で使用されるとき「二量体」は、リンカーを介して互いに共有結合している２つのサブユニットを含む複合体である。二量体という用語は、意味を限定する言葉無しに使用される場合、ホモ二量体とヘテロ二量体の両方を包含する。ホモ二量体は、２つの同一のサブユニットを含み、一方、ヘテロ二量体は、異なる２つのサブユニットを含むが、２つのサブユニットは、実質的に互いに類似している。
本明細書で使用されるとき、用語「ｐＨ安定化グルカゴンペプチド」は、薬理学的な目的に使用される最も広いｐＨ範囲の水性緩衝液中で、天然グルカゴンに比べてより優れた安定性及び溶解性を示すグルカゴンアゴニスト類縁体を意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「荷電アミノ酸」は、生理学的ｐＨの水溶液において負に帯電（すなわち、脱プロトン化）している、又は正に帯電（すなわち、プロトン化）してている側鎖を含むアミノ酸を意味する。例えば、負荷電アミノ酸には、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸、ホモシステイン酸、及びホモグルタミン酸が含まれ、一方、正荷電アミノ酸には、アルギニン、リシン、及びヒスチジンが含まれる。荷電アミノ酸には、ヒトタンパク質において一般的に見出される２０個のアミノ酸に加え、また異形又は非天然型のアミノ酸のうちの荷電アミノ酸も含まれる。
非天然型のアミノ酸とは、インビボで天然に生じないが、それでも、本明細書に記載されるペプチド構造に組み込むことができるようなアミノ酸を意味する。異形アミノ酸の商業供給源には、Sigma-Aldrich（Milwaukee, WI）、ChemPep Inc.（Miami, FL）及びGenzyme Pharmaceuticals（Cambridge, MA）が含まれる。異形アミノ酸は、商業供給者から購入することも、新規に合成することも、他のアミノ酸から化学的に修飾する若しくは誘導体化することもできる。
本明細書で使用されるとき、用語「酸性アミノ酸」は、例えばカルボン酸又はスルホン酸基のような第２の酸性部分を含むアミノ酸を意味する。
用語「アルキル」は、示された数の炭素原子を含有する、直鎖又は分岐鎖の炭化水素を意味する。例示的アルキルには、メチル、エチル及び直鎖プロピル基が含まれる。
用語「ヘテロアルキル」は、構造の主鎖に示された数の炭素原子、及び少なくとも１つのヘテロ原子を含有する、直鎖又は分岐鎖の炭化水素を意味する。本明細書の目的に適したヘテロ原子には、Ｎ、Ｓ及びＯが含まれるが、これらに限定されない。
〔実施態様〕
＜増強された溶解性＞
出願者たちは、天然グルカゴンが、そのカルボキシ末端に電荷を導入することにより、ペプチドのアゴニスト特性を保持しつつ溶解性を増強するように修飾されうることを発見した。増強された溶解性は、ほぼ中性のｐＨでのグルカゴン溶液の調製及び保存を可能にする。比較的中性のｐＨ（例えば、約６．０〜約８．０のｐＨ）でのグルカゴン溶液の配合は、グルカゴンペプチドの長期安定性を改善する。
したがって、本発明の一つの実施態様は、Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ（配列番号１）の野生型ペプチドに対して修飾されて、天然ペプチドの生物学的活性を保持しながら、特に約５．５〜約８．０のｐＨ範囲で水溶液におけるペプチドの溶解性を改善するグルカゴンアゴニストを対象とする。一つの実施態様において、ペプチドに対して、天然の非荷電アミノ酸を、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群より選択される荷電アミノ酸で置換することにより、又は、アミノ若しくはカルボキシ末端へ荷電アミノ酸を付加することにより、電荷が付加される。驚くべきことに、出願者たちは、２８及び／若しくは２９位において通常に生じるアミノ酸を荷電アミノ酸で置換すること並びに／又はグルカゴンペプチドのカルボキシ末端に１〜２個の荷電アミノ酸を付加することは、生理学的なｐＨ（すなわち、約６．５〜約７．５のｐＨ）の水溶液におけるグルカゴンペプチドの溶解性及び安定性を、少なくとも５倍増強し、３０倍まで増強することを発見した。
したがって、本発明の一つの実施態様のグルカゴンペプチドは、グルカゴン活性を保持し、且つ、２５℃で２４時間経過後に測定したとき、約５．５〜８の所定のｐＨ、例えばｐＨ７で、天然グルカゴンの溶解性に対して少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２５倍、３０倍、又はそれ以上の溶解性を示す。本明細書に開示される任意のグルカゴンペプチドは更に、５．５〜８の範囲内のｐＨにおいて２５℃で２４時間経過後に、例えば元のペプチドの少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％を保持するような、向上した安定性を示してもよい。幾つかの実施態様において、本発明のグルカゴンペプチドは、少なくとも２０℃（例えば２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、少なくとも２７．５℃、少なくとも３０℃、少なくとも３５℃、少なくとも４０℃、少なくとも５０℃）及び１００℃未満、８５℃未満、７５℃未満又は７０℃未満の温度の溶液中で、１週間以上（例えば、約２週間、約４週間、約１か月、約２か月、約４か月、約６か月、約８か月、約１０か月、約１２か月）経過後に、紫外線（ＵＶ）検出器により２８０nmで検出した場合、少なくとも７５％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９５％超、１００％まで）の濃度のペプチドが検出可能であるような、又は約２５％未満（例えば、２０％未満、１５％未満、１０％未軟、５％、４％、３％、２％、１％未満、０％まで）の分解ペプチドしか検出されないような、向上した安定性を示す。グルカゴンペプチドは、その薬学的特性を変える追加的な修飾、例えば、効力の増加、循環半減期の延長、保存寿命の増加、沈殿若しくは凝集の低減及び／又は分解の低減、例えば保存後の切断若しくは化学修飾の発生の低減、をもたらすような修飾も含むことができる。
一つの実施態様において、向上した溶解性を有するグルカゴンペプチドは、例えば、天然グルカゴンのＣ末端部分、一つの実施態様ではＣ末端から２７位までの位置、への１、２、３個又はそれ以上の荷電アミノ酸の導入により、調製することができる。例えばそのような荷電アミノ酸は、例えば２８又は２９位で天然アミノ酸を荷電アミノ酸で置換する、あるいは２７、２８又は２９位の後に荷電アミノ酸を付加することによって導入することができる。例示的な実施態様において、１、２、３個又は全ての荷電アミノ酸は、負に荷電されている。他の実施態様において、１、２、３個又は全ての荷電アミノ酸は、正に荷電されている。特定の例示的な実施態様において、グルカゴンペプチドは、以下の修飾の任意の１又は２個を含むことができる：ＥによるＮ２８の置換；ＤによるＮ２８の置換；ＤによるＴ２９の置換；ＥによるＴ２９の置換；２７、２８又は２９位の後ろへのＥの挿入；２７、２８又は２９位の後ろへのＤの挿入。例えば、Ｄ２８Ｅ２９、Ｅ２８Ｅ２９、Ｅ２９Ｅ３０、Ｅ２８Ｅ３０、Ｄ２８Ｅ３０である。
＜更なる修飾及び組み合わせ＞
追加的な修飾をグルカゴンペプチドに行うことができ、これは溶解性及び／又は安定性及び／又はグルカゴン活性を更に増加することができる。あるいはまたグルカゴンペプチドは、溶解性又は安定性に実質的に影響を与えない及びグルカゴン活性を実質的に減少しないような、他の修飾を含むことができる。例示的な実施態様において、グルカゴンペプチドは、天然グルカゴン配列に対して合計１個、２個まで、３個まで、４個まで、５個まで、６個まで、７個まで、８個まで、９個まで、１０個まで、１１個まで、１２個まで、１３個まで、又は１４個までのアミノ酸修飾を含むことができる。幾つかの実施態様において、そのようなグルカゴン類縁体は、天然グルカゴンの対応する位置に少なくとも２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個の天然型のアミノ酸を保持する（例えば、天然型のグルカゴンに対して１〜７、１〜５、又は１〜３個の修飾を有する）。
幾つかの実施態様において、１、２、３、４、又は５個の非保存的置換が、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、又は２９のいずれかの位置において実施され、５個までの更なる保存的置換が、これらの位置のいずれかにおいて実施される。幾つかの実施態様において、１、２、又は３個のアミノ酸修飾が１〜１６の位置の範囲内のアミノ酸で実施され、１、２、又は３個のアミノ酸修飾が１７〜２６の位置の範囲内のアミノ酸で実施される。
例示的な修飾には以下が含まれるが、これらに限定されない：
（ａ）少なくとも部分的なグルカゴンアゴニスト活性を保持しながらの非保存的置換、保存的置換、付加、又は欠失、例えば、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８又は２９位の１つ以上での保存的置換、Ｖａｌ又はＰｈｅによる１０位のＴｙｒの置換、Ａｒｇによる１２位のＬｙｓの置換、Ａｌａによるこれらの位置の１つ以上での置換；
（ｂ）少なくとも部分的なグルカゴンアゴニスト活性を保持しながらの、２９及び／又は２８位のアミノ酸（場合により２７位のアミノ酸も）の欠失；
（ｃ）分解を低減しうる、１５位のアスパラギン酸の修飾、例えばグルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸、若しくはホモシステイン酸での置換による修飾；又は、Ａｓｐ１５−Ｓｅｒ１６結合の切断による分解を同様に低減しうる、１６位のセリンの修飾、例えばトレオニン、ＡＩＢ、グルタミン酸での置換、若しくは４原子の長さの側鎖を有する別の負荷電アミノ酸での置換、あるいはグルタミン、ホモグルタミン酸若しくはホモシステイン酸のいずれかでの置換による修飾；
（ｄ）溶解性及び／又は半減期を増加しうる、例えば１６、１７、２０、２１、２４、２９、４０位又はＣ末端アミノ酸への、本明細書に記載されている親水性部分、例えば水溶性ポリマーであるポリエチレングリコール、の付加；
（ｅ）酸化分解を低減するための、例えばロイシン又はノルロイシンでの置換による、２７位のメチオニンの修飾；
（ｆ）Ｇｌｎの脱アミド化を介して生じる分解を低減するための、例えばＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ又はＡＩＢでの置換による２０又は２４位のＧｌｎの修飾；
（ｇ）Ａｓｐの脱水により環状スクシンイミド中間体を形成し、続いて異性化によりイソアスパラギン酸塩を形成することにより生じる分解を低減するための、例えばＧｌｕでの置換による、２１位のＡｓｐの修飾；
（ｈ）ＤＰＰ−ＩＶ切断への耐性を改善するための、本明細書に記載されている１又は２位での修飾、これは場合により、「ｉ」と「ｉ＋４」（ここでｉは、１２〜２５の整数、例えば１２，１６、２０、２４である）の位置の間のラクタム架橋のような、分子内架橋と組み合わせてもよい；
（ｉ）、グルカゴン及びＧＬＰ−１受容体に対する活性を増加しうる、循環半減期を増加しうる、及び／又は作用の持続時間を延長しうる、及び／又は作用の開始を遅延しうるような、本明細書に記載されているグルカゴンペプチドのアシル化又はアルキル化（これは更に、親水性部分の付加と組み合わせてもよく、更に又はその代わりに、以下のいずれかと組み合わせてもよい：ＧＬＰ−１ペプチドでの活性を選択的に低減する修飾、例えばヒドロキシル基を欠いているアミノ酸、例えばＡｂｕ若しくはＩｌｅ、による７位のＴｈｒの置換のような、７位のＴｈｒの修飾；Ｃ末端から２７位までのアミノ酸の欠失（例えば、長さがアミノ酸２７若しくは２８個のペプチドを生じるような、２８位及び２９位のアミノ酸の一方若しくは両方の欠失）；、又はこれらの組み合わせ）；
（ｊ）本明細書に記載されているＣ末端延長部；
（ｋ）本明細書に記載されているホモ二量体化又はヘテロ二量体化；並びに
上記の組み合わせ。
例示的な修飾には、Ａ群から選択される少なくとも１個のアミノ酸修飾とＢ群及び／又はＣ群から選択される１個以上のアミノ酸修飾とが含まれるが、ここで、
Ａ群は、
荷電アミノ酸による２８位のＡｓｎの置換；
Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸及びホモシステイン酸からなる群より選択される荷電アミノ酸による２８位のＡｓｎの置換；
Ａｓｎ、Ａｓｐ又はＧｌｕによる２８位での置換；
Ａｓｐによる２８位での置換；
Ｇｌｕによる２８位での置換；
荷電アミノ酸による２９位のＴｈｒの置換；
Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸及びホモシステイン酸からなる群より選択される荷電アミノ酸による２９位のＴｈｒの置換；
Ａｓｐ、Ｇｌｕ又はＬｙｓによる２９位での置換；
Ｇｌｕによる２９位での置換；
２９位の後への１〜３個の荷電アミノ酸の挿入；
２９位の後へのＧｌｕ又はＬｙｓの挿入；
２９位の後へのＧｌｕ−Ｌｙｓ又はＬｙｓ−Ｌｙｓの挿入；或いは
これらの組み合わせであり、
Ｂ群は、
Ｇｌｕによる１５位のＡｓｐの置換；
Ｔｈｒ又はＡＩＢによる１６位のＳｅｒの置換、であり、
Ｃ群は、
ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する、非天然アミノ酸による１位のＨｉｓの置換；
ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する、非天然アミノ酸による２位のＳｅｒの置換；
Ａｒｇによる１２位のＬｙｓの置換；
Ａｌａ又はＡＩＢによる２０位のＧｌｎの置換；
Ｇｌｕによる２１位のＡｓｐの置換；
Ａｌａ又はＡＩＢによる２４位のＧｌｎの置換；
Ｌｅｕ又はＮｌｅによる２７位のＭｅｔの置換；
２７〜２９位のアミノ酸の欠失；
２８〜２９位のアミノ酸の欠失；
２９位のアミノ酸の欠失；或いは
これらの組み合わせ、である。
＜３位での修飾＞
グルカゴン受容体活性は、３位のアミノ酸修飾、例えば酸性、塩基性又は疎水性のアミノ酸による３位の天然型のグルタミンの置換、により低減することができる。例えば、グルタミン酸、オルチニン又はノルロイシンによる３位での置換は、グルカゴン受容体活性を実質的に低減又は破壊する。
グルカゴン受容体に対する活性の維持又は増強は、グルタミンの類縁体により３位のＧｌｎを修飾することによって達成することができる。例えば、３位にグルタミン類縁体を含むグルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体に対して天然グルカゴン（配列番号１）の活性の約５％、約１０％、約２０％、約５０％、若しくは約８５％又はそれ以上の活性を示すことができる。幾つかの実施態様において、３位にグルタミン類縁体を含むグルカゴンペプチドは、３位の修飾アミノ酸（例えば、配列番号６９又は配列番号７０）以外は、グルタミン類縁体を含むペプチドと同じアミノ酸配列を有するような対応するグルカゴンペプチドの活性の、約２０％、約５０％、約７５％、約１００％、約２００％若しくは約５００％又はそれ以上の活性を示すことができる。幾つかの実施態様において、３位にグルタミン類縁体を含むグルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体に対して増強された活性を示すが、この増強された活性は、天然グルカゴンの又は３位の修飾アミノ酸以外はグルタミン類縁体を含むペプチドと同じアミノ酸配列を有するような対応するグルカゴンペプチドの活性の、１０００％、１０，０００％、１００，０００％又は１，０００，０００％以下の活性である。
幾つかの実施態様において、グルタミン類縁体は、下記の構造Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩ：
Figure 2015147791
 〔式中、Ｒ1は、Ｃ0-3アルキル又はＣ0-3ヘテロアルキルであり；Ｒ2は、ＮＨＲ4又はＣ1-3アルキルであり；Ｒ3は、Ｃ1-3アルキルであり；Ｒ4は、Ｈ又はＣ1-3アルキルであり；Ｘは、ＮＨ、Ｏ、又はＳであり；そしてＹは、ＮＨＲ4、ＳＲ3、又はＯＲ3である〕で示される側鎖を含む、天然型の又は非天然型のアミノ酸である。幾つかの実施態様において、Ｘは、ＮＨであるか、又はＹは、ＮＨＲ4である。幾つかの実施態様において、Ｒ1は、Ｃ0-2アルキル又はＣ1ヘテロアルキルである。幾つかの実施態様において、Ｒ2は、ＮＨＲ4又はＣ1アルキルである。幾つかの実施態様において、Ｒ4は、Ｈ又はＣ1アルキルである。例示的な実施態様において、構造Ｉの側鎖を含み、以下のいずれかが成り立つアミノ酸が提供される：Ｒ1はＣＨ2−Ｓであり、ＸはＮＨであり、そしてＲ2はＣＨ3である（アセトアミドメチル−システイン、Ｃ（Ａｃｍ））；Ｒ1はＣＨ2であり、ＸはＮＨであり、そしてＲ2はＣＨ3である（アセチルジアミノブタン酸、Ｄａｂ（Ａｃ））；Ｒ1はＣ0アルキルであり、ＸはＮＨであり、Ｒ2はＮＨＲ4であり、そしてＲ4はＨである（カルバモイルジアミノプロパン酸、Ｄａｐ（尿素））；又は、Ｒ1はＣＨ2−ＣＨ2であり、ＸはＮＨであり、そしてＲ2はＣＨ3である（アセチルオルニチン、Ｏｍ（Ａｃ））。例示的な実施態様において、構造ＩＩの側鎖を含むアミノ酸が提供され、ここで、Ｒ1はＣＨ2であり、Ｙは、ＮＨＲ4であり、そしてＲ4は、ＣＨ3である（メチルグルタミン、Ｑ（Ｍｅ））。例示的な実施態様において、構造ＩＩＩの側鎖を含むアミノ酸が提供され、ここで、Ｒ1はＣＨ2であり、そしてＲ4は、Ｈである（メチオニン−スルホキシド、Ｍ（Ｏ））。特定の実施態様において、３位のアミノ酸はＤａｂ（Ａｃ）により置換されている。例えば、グルカゴンアゴニストは、配列番号６３、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３及び配列番号７４のアミノ酸配列を含むことができる。
ＧＬＰ−１受容体に対する活性の増強は、Ｃ末端アミノ酸のカルボン酸を、アミド又はエステルのような電荷中性基に代えることによってもたらされる。逆に、ペプチドのＣ末端の天然カルボン酸の保持は、グルカゴンペプチドの、ＧＬＰ−１受容体よりもグルカゴン受容体に対するより高い選択性（例えば、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０倍を超える）を維持する。
＜ＤＰＰ−ＩＶ耐性＞
幾つかの実施態様において、本明細書に開示されているグルカゴンペプチドは、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性を低減するために、１又は２位において更に修飾されている。より詳細には、幾つかの実施態様において、類縁体ペプチドの１位は、Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、及びホモ−ヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸で置換されている。
より詳細には、幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドの２位は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、アミノＮ−酪酸、グリシン、Ｎ−メチルセリン、及びアミノイソ酪酸からなる群より選択されるアミノ酸で置換されている。一つの実施態様において、類縁体ペプチドの２位は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、及びアミノイソ酪酸からなる群より選択されるアミノ酸で置換されている。別の実施態様において、類縁体ペプチドの２位は、Ｄ−セリン、グリシン、及びアミノイソ酪酸からなる群より選択されるアミノ酸で置換されている。
ペプチドの１又は２位での置換又は修飾又は誘導体化がグルカゴン受容体に対する活性を低減する場合、Ｃ末端部分（アミノ酸１２〜２９）の分子内架橋（例えば、「ｉ」と「ｉ＋４」の位置のアミノ酸の側鎖の間のラクタム架橋、ここでｉは１２〜２５の整数である）は、グルカゴン受容体に対するグルカゴン活性を改善することができる。
＜親水性部分の付加＞
ＰＥＧ基のような親水性部分を、タンパク質と活性化ポリマー分子との反応に使用される任意の適切な条件下でグルカゴンペプチドに結合することができる。アシル化、還元的アルキル化、マイケル付加、チオールアルキル化、又はその他の、ＰＥＧ部分の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α−ハロアセチル、マレイミド又はヒドラジノ基）と標的化合物の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α−ハロアセチル、マレイミド又はヒドラジノ基）との化学選択的結合／連結方法を含む、当該技術において既知のあらゆる方法を使用することができる。水溶性ポリマーを１つ以上のタンパク質に結合するのに使用できる活性化基には、スルホン、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフレート、トレシレート、アジリジン、オキシラン、５−ピリジル、及びアルファ−ハロゲン化アシル基（例えば、アルファ−ヨード酢酸、アルファ−ブロモ酢酸、アルファ−クロロ酢酸）が含まれるが、これらに限定されない。還元的アルキル化によりペプチドに結合する場合、選択されるポリマーは、重合の程度が制御されるように、単一の反応性アルデヒドを有するべきである。例えば、Kinstler et al., Adv. Drug. Delivery Rev. 54: 477-485 (2002); Roberts et al., Adv. Drug Delivery Rev. 54: 459-476 (2002)及びZalipsky et al., Adv. Drug Delivery Rev. 16: 157-182 (1995)を参照すること。
本発明の特定の態様において、チオールを有するグルカゴンペプチドのアミノ酸残基は、ＰＥＧのような親水性部分で修飾されている。幾つかの実施態様において、チオールはマイケル付加反応においてマレイミド活性化ＰＥＧで修飾され、下記に示されるチオエーテル結合を含むペグ化ペプチドをもたらす：
Figure 2015147791
幾つかの実施態様において、チオールは核酸置換反応においてハロアセチル活性化ＰＥＧで修飾され、下記に示されるチオエーテル結合を含むペグ化ペプチドをもたらす：
Figure 2015147791
適切な親水性部分には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール（例えば、ＰＯＧ）、ポリオキシエチレン化ソルビトール、ポリオキシエチレン化グルコース、ポリオキシエチレン化グリセロール（ＰＯＧ）、ポリオキシアルキレン、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、モノ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−又はアリールオキシ−ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリアセタール、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリ（β−アミノ酸）（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー（ＰＰＧ）及び他のポリアルキレンオキシド、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、コロン酸又は他の多糖ポリマー、フィコール又はデキストラン、並びにこれらの混合物が含まれる。
幾つかの実施態様によると、ポリエチレングリコール鎖は、約５００〜約４０，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有する。一つの実施態様において、ポリエチレングリコール鎖は、約５０００〜約５，０００ダルトン又は約１，０００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有する。別の実施態様において、ポリエチレングリコール鎖は、約１０，０００〜約２０，０００ダルトンの分子量を有する。さらに他の例示的な実施態様において、ポリエチレングリコール鎖は、約２０，０００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する。
デキストランは、主にα１−６結合により結合しているグルコースサブユニットの多糖ポリマーである。デキストランは、多くの分子量範囲、例えば１kDから約１００kDの範囲、又は、約５、１０、１５、若しくは２０kDから約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、若しくは９０kDの範囲、で入手することができる。
直鎖又は分岐鎖ポリマーが考慮される。得られる結合体の調製物は、実質的に単分散又は多分散であることができ、ペプチド１個あたり約０．５、０．７、１、１．２、１．５、又は２個のポリマー部分を有することができる。
＜アシル化＞
一つの実施態様によると、グルカゴンペプチドは、アシル基、例えばアミノ酸において天然に生じてはいないアシル基（例えば、天然型のアミノ酸に対して非天然型であるアシル基）を含むように修飾される。アシル基の付加は、ペプチドが、循環半減期の延長、作用開始の遅延、作用の持続時間の延長、ＤＰＰ−ＩＶのようなプロテアーゼに対する耐性の改善、並びにＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体に対する効力の増加の１つ以上を有する原因となる。本明細書に示されているように、グルカゴンペプチドのアシル化は、グルカゴン及びＧＬＰ−１受容体に対する効力の減少をもたらさない。むしろ、幾つかの場合では、アシル化は、実際にはＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体に対する活性を増加する。したがって、アシル化されたグルカゴンコアゴニスト類縁体の効力は、非アシル化型の類縁体と比べて、より増強されないとしても、少なくともそれに匹敵する。
一つの実施態様によると、グルカゴンペプチドは、循環の半減期を延長する、並びに／又は作用の開始を遅延する及び／若しくは持続時間を延長する、並びに／又はＤＰＰ−ＩＶのようなプロテアーゼに対する耐性を改善する目的で、エステル、チオエーテル又はアミド結合を介してグルカゴンペプチドに結合しているアシル基を含むように修飾される。
アシル化は、グルカゴン及び／又はＧＬＰ−１活性が増強されないまでも少なくとも保持される限り、１〜２９位のいずれか、Ｃ末端延長部内の位置、又はＣ末端アミノ酸を含む、グルカゴンペプチド内の任意の位置で、実施することができる。非限定例には、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、又は２９位が挙げられる。特定の実施態様において、アシル化は、グルカゴンペプチドの１０位で生じ、グルカゴンペプチドは、分子内架橋、例えば共有分子内架橋（例えば、ラクタム架橋）を欠いている。分子内架橋を欠いているそのようなアシル化ペプチドは、共有分子内架橋を欠いている対応する非アシル化ペプチドと比較して及び１０位以外の位置でアシル化されている分子内架橋を欠いている対応するペプチドと比較して、ＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体に対して増強された活性を示す。本明細書において示されているように、１０位のアシル化は、グルカゴン受容体に対してほとんど活性を有さないグルカゴン類縁体を、グルカゴンとＧＬＰ−１の両方の受容体に対して活性を有するグルカゴンに変換することさえできる。したがって、アシル化が生じる位置は、グルカゴン類縁体の全体的な活性プロフィールを変えることができる。
グルカゴンペプチドを、親水性部分が結合している同じアミノ酸の位置又は異なるアミノ酸の位置でアシル化することができる。非限定例には、１０位でのアシル化、及びグルカゴンペプチドのＣ末端部分における１つ以上の位置、例えば２４、２８若しくは２９位、Ｃ末端延長部内、又はＣ末端（例えば、Ｃ末端Ｃｙｓの付加を介する）でのペグ化が挙げられる。
アシル基を、グルカゴンペプチドのアミノ基に直接的に共有結合させることもできるし、グルカゴンペプチドのアミノ基にスペーサーを介して間接的に共有結合させることもでき、この場合スペーサーは、グルカゴンペプチドのアミノ基とアシル基との間に位置している。
本発明の特定の態様において、グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドのアミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシル、又はチオールの直接的なアシル化により、アシル基を含むように修飾される。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、アミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル、又はチオールを介して直接アシル化される。幾つかの実施態様において、アシル化は１０、２０、２４、又は２９位においてである。この点において、アシル化グルカゴンペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含んでもよいし、１０、２０、２４、及び２９位のアミノ酸の少なくとも１個が修飾されて側鎖アミン、ヒドロキシル、若しくはチオールを含む任意のアミノ酸となる、本明細書に記載されている１個以上のアミノ酸修飾を含むような、配列番号１の修飾アミノ酸配列を含んでもよい。本発明の幾つかの特定の実施態様において、グルカゴンペプチドの直接アシル化は、１０位のアミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル又はチオールを介して生じる。
幾つかの実施態様において、側鎖アミンを含むアミノ酸は、式Ｉ：
Figure 2015147791
 で示されるアミノ酸である。幾つかの例示的な実施態様において、式Ｉのアミノ酸は、ｎが４（Ｌｙｓ）であるか又はｎが３であるアミノ酸（Ｏｒｎ）である。
他の実施態様において、側鎖ヒドロキシルを含むアミノ酸は、式ＩＩ：
Figure 2015147791
 で示されるアミノ酸である。幾つかの例示的な実施態様において、式ＩＩのアミノ酸は、ｎが１であるアミノ酸（Ｓｅｒ）である。
さらに他の実施態様において、側鎖チオールを含むアミノ酸は、式ＩＩＩ：
Figure 2015147791
 で示されるアミノ酸である。幾つかの例示的な実施態様において、式ＩＩＩのアミノ酸は、ｎが１であるアミノ酸（Ｃｙｓ）である。
さらに他の実施態様において、側鎖アミン、ヒドロキシル、又はチオールを含むアミノ酸は、式Ｉ、式ＩＩ、又は式ＩＩＩのアミノ酸のアルファ炭素に結合している水素が第２側鎖に代えられていること以外は、式Ｉ、式ＩＩ、又は式ＩＩＩと同じ構造を含む、二置換アミノ酸である。
本発明の一つの実施態様において、アシル化グルカゴンペプチドは、ペプチドとアシル基との間にスペーサーを含む。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、アシル基と共有結合しているスペーサーと共有結合する。
スペーサーが結合しているアミノ酸は、スペーサーへの結合を可能とする部分を含むような任意のアミノ酸（例えば、一置換型のα−置換アミノ酸、又はα，α−二置換アミノ酸）であることができる。例えば、側鎖ＮＨ2、−ＯＨ、又は−ＣＯＯＨを含むアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕ）が適している。この点に関して、アシル化グルカゴンペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含んでもよいし、１０、２０、２４、及び２９位のアミノ酸の少なくとも１個が側鎖アミン、ヒドロキシル、若しくはカルボキシレートを含む任意のアミノ酸となるように修飾された、本明細書に記載されている１個以上のアミノ酸修飾を含む、修飾された配列番号１のアミノ酸配列を含んでもい。
幾つかの実施態様において、スペーサーは、側鎖アミン、ヒドロキシル、若しくはチオールを含むアミノ酸であるか、又は、側鎖アミン、ヒドロキシル、若しくはチオールを含むアミノ酸を含む、ジペプチド若しくはトリペプチドである。
アシル化がスペーサーのアミン基を介して生じる場合、アシル化は、アミノ酸のアルファアミン又は側鎖アミンを介して生じることができる。アルファアミンがアシル化される場合、スペーサーのアミノ酸は、任意のアミノ酸であることができる。例えば、スペーサーのアミノ酸は、疎水性アミノ酸、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノオクタン酸、であることができる。あるいは、スペーサーのアミノ酸は、酸性残基、例えばＡｓｐ及びＧｌｕ、であることができる。
スペーサーのアミノ酸の側鎖アミンがアシル化される場合、スペーサーのアミノ酸は、側鎖アミンを含むアミノ酸、例えば式Ｉのアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ又はＯｒｎ）である。この場合、スペーサーのアミノ酸のアルファアミンと側鎖アミンの両方ともアシル化されることが可能であり、それによりグルカゴンペプチドがジアシル化される。本発明の実施態様はそのようなジアシル化分子を含む。
アシル化がスペーサーのヒドロキシル基を介して生じる場合、アミノ酸又はジペプチド若しくはトリペプチドのアミノ酸のうちの１個は、式ＩＩのアミノ酸であることができる。特定の例示的な実施態様において、アミノ酸はＳｅｒである。
アシル化がスペーサーのチオール基を介して生じる場合、アミノ酸又はジペプチド若しくはトリペプチドのアミノ酸のうちの１個は、式ＩＩＩのアミノ酸であることができる。特定の例示的な実施態様において、アミノ酸はＣｙｓである。
幾つかの実施態様において、スペーサーは、親水性二官能スペーサーである。特定の実施態様において、親水性二官能スペーサーは、２つ以上の反応性基、例えば、アミン、ヒドロキシル、チオール、及びカルボキシル基、又はこれらの任意の組み合わせ、を含む。特定の実施態様において、親水性二官能スペーサーは、ヒドロキシル基及びカルボキシレートを含む。他の実施態様において、親水性二官能スペーサーは、アミン基及びカルボキシレートを含む。他の実施態様において、親水性二官能スペーサーは、チオール基及びカルボキシレートを含む。特定の実施態様において、スペーサーは、アミノポリ（アルキルオキシ）カルボキシレートを含む。この点において、スペーサーは、例えばＮＨ2（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n（ＣＨ2）mＣＯＯＨを含むことができ（式中、ｍは、１〜６の任意の整数であり、そしてｎは、２〜１２の任意の整数である）、例えば、Peptides International, Inc. (Louisville, KY)により販売されている、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸であってもよい。
幾つかの実施態様において、スペーサーは、疎水性二官能スペーサーである。疎水性二官能スペーサーは当該技術において知られている。例えば、Bioconjugate Techniques, G. T. Hermanson (Academic Press, San Diego, CA, 1996)（その全体が参照として本明細書に組み込まれる）を参照すること。特定の実施態様において、疎水性二官能スペーサーは、２つ以上の反応性基、例えば、アミン、ヒドロキシル、チオール、及びカルボキシル基、又はこれらの任意の組み合わせ、を含む。特定の実施態様において、疎水性二官能スペーサーは、ヒドロキシル基及びカルボキシレートを含む。他の実施態様において、疎水性二官能スペーサーは、アミン基及びカルボキシレートを含む。他の実施態様において、疎水性二官能スペーサーは、チオール基及びカルボキシレートを含む。カルボキシレートとヒドロキシル基又はチオール基を含む適切な疎水性二官能スペーサーは、当該技術において知られており、例えば８−ヒドロキシオクタン酸及び８−メルカプトオクタン酸が含まれる。
幾つかの実施態様において、二官能スペーサーは、カルボキシレート基の間に１〜７個の炭素を持つ非分岐鎖メチレンを含むジカルボンサンではない。幾つかの実施態様において、二官能スペーサーは、カルボキシレート基の間に１〜７個の炭素を持つ非分岐鎖メチレンを含むジカルボンサンである。
スペーサー（例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性又は疎水性二官能スペーサー）は、特定の実施態様において、３〜１０個の原子（例えば、６〜１０個の原子（例えば、６、７、８、９又は１０個の原子））の長さを有する。より特定の実施態様において、スペーサーは、約３〜１０個の原子（例えば、６〜１０個の原子）の長さであり、アシル基はＣ１２〜Ｃ１８脂肪アシル基、例えばＣ１４脂肪アシル基、Ｃ１６脂肪アシル基、であり、これによりスペーサーとアシル基の全長は、１４〜２８個の原子、例えば約１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８個の原子の長さとなる。幾つかの実施態様において、スペーサーとアシル基の長さは、１７〜２８個（例えば、１９〜２６個、１９〜２１個）の原子の長さである。
特定の前述の実施態様によると、二官能スペーサーは、長さが３〜１０個の原子のアミノ酸主鎖（例えば、６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸、及び８−アミノオクタン酸）を含む、合成又は天然型のアミノ酸（本明細書に記載されているいずれかが含まれるが、これらに限定されない）であることができる。あるいは、スペーサーは、長さが３〜１０個の原子（例えば、６〜１０個の原子）のペプチド主鎖を有する、ジペプチド又はトリペプチドスペーサーであることができる。ジペプチド又はトリペプチドスペーサーのそれぞれのアミノ酸は、ジペプチド又はトリペプチドの他のアミノ酸と同一でもよいし異なっていてもよく、以下からなる群より独立して選択することができる：天然型のアミノ酸（Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）のＤ若しくはＬ異性体のいずれか、又は、以下からなる群より選択される非天然型のアミノ酸のＤ若しくはＬ異性体のいずれかを含む、天然型の及び／又は非天然型のアミノ酸：β−アラニン（β−Ａｌａ）、Ｎ−α−メチル−アラニン（Ｍｅ−Ａｌａ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、γ−アミノ酪酸（γ−Ａｂｕ）、アミノヘキサン酸（ε−Ａｈｘ）、アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、アミノメチルピロールカルボン酸、アミノピペリジンカルボン酸、アミノセリン（Ａｍｓ）、アミノテトラヒドロピラン−４−カルボン酸、アルギニンＮ−メトキシ−Ｎ−メチルアミド、β−アスパラギン酸（β−Ａｓｐ）、アゼチジンカルボン酸、３−（２−ベンゾチアゾリル）アラニン、α−tert−ブチルグリシン、２−アミノ−５−ウレイド−ｎ−吉草酸（シトルリン、Ｃｉｔ）、β−シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、アセトアミドメチル−システイン、ジアミノブタン酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）、ジメチルチアゾリジン（ＤＭＴＡ）、γ−グルタミン酸（γ−Ｇｌｕ）、ホモセリン（Ｈｓｅ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、イソロイシンＮ−メトキシ−Ｎ−メチルアミド、メチル−イソロイシン（ＭｅＩｌｅ）、イソニペコ酸（Ｉｓｎ）、メチル−ロイシン（ＭｅＬｅｕ）、メチル−リシン、ジメチル−ロイシン、トリメチル−リシン、メタノプロリン、メチオニン−スルホキシド（Ｍｅｔ（Ｏ））、メチオニン−スルホン（Ｍｅｔ（Ｏ2））、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、メチル−ノルロイシン（Ｍｅ−Ｎｌｅ）、ノルバリン、（Ｎｖａ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、パラ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、ペニシラミン（Ｐｅｎ）、メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、４−クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｃｌ））、４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｆ））、４−ニトロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−ＮＯ2））、４−シアノフェニルアラニン（（Ｐｈｅ（４−ＣＮ））、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、ピペリジニルアラニン、ピペリジニルグリシン、３，４−デヒドロプロリン、ピロリジニルアラニン、サルコシン（Ｓａｒ）、セレノシステイン（Ｓｅｃ）、Ｏ−ベンジル−ホスホセリン、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸（Ｓｔａ）、４−アミノ−５−シクロヘキシル−３−ヒドロキシペンタン酸（ＡＣＨＰＡ）、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸（ＡＨＰＰＡ）、１，２，３，４，−テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）、テトラヒドロピラングリシン、チエニルアラニン（Ｔｈｉ）、Ｏ−ベンジル−ホスホチロシン、Ｏ−ホスホチロシン、メトキシチロシン、エトキシチロシン、Ｏ−（ビス−ジメチルアミノ−ホスホノ）−チロシン、チロシンスルフェートテトラブチルアミン、メチル−バリン（ＭｅＶａｌ）、及びアルキル化３−メルカプトプロピオン酸。
幾つかの実施態様において、スペーサーは、全体として負の電荷を含み、例えば１又は２個の負荷電アミノ酸を含む。幾つかの実施態様において、ジペプチドは、一般構造Ａ−Ｂのジペプチドのいずれでもなく、ここで、Ａは、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ及びＰｒｏからなる群より選択され、Ｂは、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐからなる群より選択される。幾つかの実施態様において、ジペプチドスペーサーは、Ａｌａ−Ａｌａ、β−Ａｌａ−β−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、γ−アミノ酪酸−γ−アミノ酪酸、及びγ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕからなる群より選択される。
幾つかの例示的な実施態様において、グルカゴンペプチドは、スペーサーのアミン、ヒドロキシル、又はチオールのアシル化により、アシル基を含むように修飾され、ここでスペーサーは、グルカゴンペプチドの１０、２０、２４、若しくは２９位のアミノ酸又はＣ末端アミノ酸の側鎖に結合している。
さらに特定の実施態様において、アシル基は、グルカゴンペプチドの１０位のアミノ酸に結合しており、スペーサーとアシル基の長さは、１４〜２８個の原子である。１０位のアミノ酸は、幾つかの態様において、式Ｉのアミノ酸、例えばＬｙｓであるか、又は式Ｉに関連する、二置換アミノ酸である。より特定の実施態様において、グルカゴンペプチドは、分子内架橋、例えば共有分子内架橋、を欠いている。グルカゴンペプチドは、例えば、ペプチドのアルファ−へリックスの安定化のために、１個以上のアルファ，アルファ−二置換アミノ酸、例えばＡＩＢ、を含むペプチドであることができる。本明細書に示されているように、１０位のアミノ酸の側鎖に共有結合しているアシル化スペーサーを含むそのようなペプチドは、ＧＬＰ−１とグルカゴンの両方の受容体に対して増強した効力を示す。
アミン、ヒドロキシル、及びチオールを介したペプチドアシル化に適した方法は、当該技術において知られている。例えば、実施例１９（アミンを介したアシル化の方法）、Miller, Biochem Biophys Res Commun 218: 377-382 (1996); Shimohigashi and Stammer, lnt J Pept Protein Res 19: 54-62 (1982);及びPreviero et al., Biochim Biophys Acta 263: 7-13 (1972)（ヒドロキシルを介したアシル化の方法）;並びにSan and Silvius, J Pept Res 66: 169-180 (2005)（チオールを介したアシル化の方法）; Bioconjugate Chem. "Chemical Modifications of Proteins: History and Applications" pages 1, 2-12 (1990); Hashimoto et al., Pharmacuetical Res. "Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity" Vol. 6, No: 2 pp.171-176 (1989)を参照すること。
アシル化グルカゴンペプチドのアシル基は、任意の大きさ、例えば任意の長さの炭素鎖であることができ、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。本発明の幾つかの特定の実施態様において、アシル基は、Ｃ４〜Ｃ３０脂肪酸である。例えば、アシル基は、Ｃ４脂肪酸、Ｃ６脂肪酸、Ｃ８脂肪酸、Ｃ１０脂肪酸、Ｃ１２脂肪酸、Ｃ１４脂肪酸、Ｃ１６脂肪酸、Ｃ１８脂肪酸、Ｃ２０脂肪酸、Ｃ２２脂肪酸、Ｃ２４脂肪酸、Ｃ２６脂肪酸、Ｃ２８脂肪酸、又はＣ３０脂肪酸のいずれかであることができる。幾つかの実施態様において、アシル基は、Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸、例えばＣ１４脂肪酸又はＣ１６脂肪酸、である。
代替的な実施態様において、アシル基は胆汁酸である。胆汁酸は、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロコール酸、グリココール酸及びコレステロール酸が含まれるが、これらに限定されない任意の適切な胆汁酸であることができる。
本発明の幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、長鎖アルカンをアシル化することによって、アシル基を含むよう修飾される。特定の実施態様において、長鎖アルカンは、グルカゴンペプチドのカルボキシル基又はその活性化形態と反応するような、アミン、ヒドロキシル、又はチオール基（例えば、オクタデシルアミン、テトラデカノール及びヘキサデカンチオール）を含む。グルカゴンペプチドのカルボキシル基又はその活性化形態は、グルカゴンペプチドのアミノ酸（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）の側鎖の一部であってもよいし、ペプチド主鎖の一部であってもよい。
特定の実施態様において、グルカゴンペプチドは、それに結合しているスペーサーで長鎖アルカンをアシル化することによって、アシル基を含むように修飾される。特定の実施態様において、長鎖アルカンは、スペーサーのカルボキシル基又はその活性化形態と反応するような、アミン、ヒドロキシル、又はチオール基を含む。カルボキシル基又はその活性化形態を含む適切なスペーサーは、本明細書に記載されており、例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能スペーサー、又は疎水性二官能スペーサーが含まれる。
本明細書で使用されるとき、用語「カルボキシル基の活性化形態」は、一般式Ｒ（Ｃ＝Ｏ）Ｘのカルボキシル基を意味し、ここで、Ｘは離脱基であり、そしてＲはグルカゴンペプチド又はスペーサーである。例えば、カルボキシル基の活性化形態には、塩化アシル、アシル無水物、及びアシルエステルが含まれうるが、これらに限定されない。幾つかの実施態様において、活性化カルボキシル基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）離脱基のエステルである。
長鎖アルカンがグルカゴン又はスペーサーでアシル化されている本発明のこれらの態様に関して、長鎖アルカンは、任意の大きさであることができ、任意の長さの炭素鎖を含むことができる。長鎖アルカンは、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。特定の態様において、長鎖アルカンは、Ｃ４〜Ｃ３０アルカンである。例えば、長鎖アルカンは、Ｃ４アルカン、Ｃ６アルカン、Ｃ８アルカン、Ｃ１０アルカン、Ｃ１２アルカン、Ｃ１４アルカン、Ｃ１６アルカン、Ｃ１８アルカン、Ｃ２０アルカン、Ｃ２２アルカン、Ｃ２４アルカン、Ｃ２６アルカン、Ｃ２８アルカン、又はＣ３０アルカンのいずれかであることができる。幾つかの実施態様において、長鎖アルカンは、Ｃ８〜Ｃ２０アルカン、例えばＣ１４アルカン、Ｃ１６アルカン、又はＣ１８アルカン、を含む。
また、幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドのアミン、ヒドロキシル、又はチオール基は、コレステロール酸によりアシル化されている。特定の実施態様において、グルカゴンペプチドはアルキル化デス−アミノＣｙｓスペーサー、例えばアルキル化３−メルカプトプロピオン酸スペーサー、を介してコレステロール酸に結合している。
本明細書に記載されているアシル化グルカゴンペプチドは、親水性部分を含むように更に修飾されることができる。幾つかの特定の実施態様において、親水性部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含むことができる。親水性部分の組み込みは、本明細書に記載されたいずれかの方法のような任意の適切な手段によって達成することができる。この点において、アシル化グルカゴンペプチドは、本明細書に記載されている修飾のいずれかを含む配列番号１を含むことができ、ここで、１０、２０、２４、及び２９位の少なくとも１個のアミノ酸はアシル基を含み、１６、１７、２１、２４、若しくは２９位の少なくとも１個のアミノ酸、Ｃ末端延長部内の位置、又はＣ末端のアミノ酸は修飾されて、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ、又はＡｃ−Ｐｈｅとなり、アミノ酸の側鎖は、親水性部分（例えば、ＰＥＧ）に共有結合している。幾つかの実施態様において、アシル基は、１０位に結合しており（この結合は場合によりＣｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ、又はＡｃ−Ｐｈｅを含むスペーサーを介してであってもよい）、親水性部分は、２４位のＣｙｓ残基に組み込まれている。
あるいは、アシル化グルカゴンペプチドは、スペーサーを含むことができ、ここでスペーサーは、アシル化され、且つ、親水性部分を含むように修飾される。適切なスペーサーの非限定例には、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ、及びＡｃ−Ｐｈｅからなる群より選択される１個以上のアミノ酸を含むスペーサーが挙げられる。
＜アルキル化＞
幾つかの実施態様によると、グルカゴンペプチドは修飾されて、アルキル基、例えばアミノ酸において天然に生じてはいないアルキル基（例えば、天然型のアミノ酸に対して非天然型であるアルキル基）を含む。任意の特定の理論にとらわれることなく、グルカゴンペプチドのアルキル化は、グルカゴンペプチドのアシル化と比べて、もしも同一でないとしても少なくとも同様の効果、例えば、循環半減期の延長、作用開始の遅延、作用の持続時間の延長、ＤＰＰ−ＩＶのようなプロテアーゼに対する耐性の改善、並びにＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体に対する効力の増加、を達成すると考えられる。
アルキル化は、グルカゴン活性が保持される限り、１〜２９位のいずれか若しくはＣ末端延長部内の位置又はＣ末端アミノ酸を含む、グルカゴンペプチド内の任意の位置で実施することができる。非限定例には、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、又は２９位が挙げられる。アルキル基を、グルカゴンペプチドのアミノ基に直接的に共有結合することもできるし、グルカゴンペプチドのアミノ基にスペーサーを介して間接的に共有結合することもでき、この場合スペーサーは、グルカゴンペプチドのアミノ基とアルキル基との間に位置している。グルカゴンペプチドを、親水性部分が結合している位置と同じアミノ酸の位置でも、異なるアミノ酸の位置でも、アルキル化することができる。非限定例には、１０位でのアルキル化及びグルカゴンペプチドのＣ末端部分における１つ以上の位置、例えば２４、２８若しくは２９位、Ｃ末端延長部内、又はＣ末端（例えば、Ｃ末端Ｃｙｓの付加を介する）でのペグ化が挙げられる。
本発明の特定の態様において、グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドのアミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシル、又はチオールの直接的なアルキル化により、アルキル基を含むように修飾される。幾つかの実施態様において、アルキル化は１０、２０、２４又は２９位においてである。この点において、アルキル化グルカゴンペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含んでもよいし、１０、２０、２４、及び２９位のアミノ酸の少なくとも１個が修飾されて側鎖アミン、ヒドロキシル、又はチオールを含む任意のアミノ酸となる、本明細書に記載されている１個以上のアミノ酸修飾を含むような、配列番号１の修飾アミノ酸配列を含んでもよい。本発明の幾つかの特定の実施態様において、グルカゴンペプチドの直接アルキル化は、１０位のアミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル、又はチオールを介して生じる。
幾つかの実施態様において、側鎖アミンを含むアミノ酸は、式Ｉのアミノ酸である。幾つかの例示的な実施態様において、式Ｉのアミノ酸は、ｎが４であるアミノ酸（Ｌｙｓ）か又はｎが３（Ｏｒｎ）であるアミノ酸（Ｏｒｎ）である。
他の実施態様において、側鎖ヒドロキシルを含むアミノ酸は、式ＩＩのアミノ酸である。幾つかの例示的な実施態様において、式ＩＩのアミノ酸は、ｎが１であるアミノ酸（Ｓｅｒ）である。
さらに他の実施態様において、側鎖チオールを含むアミノ酸は、式ＩＩＩのアミノ酸である。幾つかの例示的な実施態様において、式ＩＩＩのアミノ酸は、ｎが１であるアミノ酸（Ｃｙｓ）である。
さらに他の実施態様において、側鎖アミン、ヒドロキシル又はチオールを含むアミノ酸は、式Ｉ、式ＩＩ、又は式ＩＩＩのアミノ酸のアルファ炭素に結合している水素が第２側鎖に代えられていること以外は、式Ｉ、式ＩＩ、又は式ＩＩＩと同じ構造を含む二置換アミノ酸である。
本発明の一つの実施態様において、アルキル化グルカゴンペプチドは、ペプチドとアルキル基との間にスペーサーを含む。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、アルキル基と共有結合しているスペーサーと共有結合する。幾つかの例示的な実施態様において、グルカゴンペプチドは、スペーサーのアミン、ヒドロキシル又はチオールのアルキル化により修飾されてアルキル基を含み、ここでスペーサーは、グルカゴンペプチドの１０、２０、２４又は２９位のアミノ酸の側鎖に結合している。スペーサーが結合しているアミノ酸は、スペーサーへの結合を可能とする部分を含むような、任意のアミノ酸（例えば、一置換型のα−置換アミノ酸、又はα，α−二置換アミノ酸）であることができる。例えば、側鎖ＮＨ2、−ＯＨ又は−ＣＯＯＨを含むアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕ）が適している。この点に関して、アルキル化グルカゴンペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含んでもよいし、１０、２０、２４、及び２９位のアミノ酸の少なくとも１個が修飾されて側鎖アミン、ヒドロキシル、若しくはカルボキシレートを含む任意のアミノ酸となる、本明細書に記載されている１個以上のアミノ酸修飾を含むような、配列番号１の修飾アミノ酸配列を含んでんもよい。
幾つかの実施態様において、スペーサーは、側鎖アミン、ヒドロキシル若しくはチオールを含むアミノ酸であるか又は側鎖アミン、ヒドロキシル若しくはチオールを含むアミノ酸を含むジペプチド若しくはトリペプチドである。
アルキル化がスペーサーのアミン基を介して生じる場合、アルキル化は、アミノ酸のアルファアミン又は側鎖アミンを介して生じることができる。アルファアミンがアルキル化される場合、スペーサーのアミノ酸は、任意のアミノ酸であることができる。例えば、スペーサーのアミノ酸は、疎水性アミノ酸、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノオクタン酸であることができる。あるいは、スペーサーのアミノ酸は、アルキル化が酸性残基のアルファアミンで生じる限り、酸性残基、例えばＡｓｐ及びＧｌｕであることができる。スペーサーのアミノ酸の側鎖アミンがアルキル化される場合、スペーサーのアミノ酸は、側鎖アミンを含むアミノ酸、例えば式Ｉのアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ又はＯｒｎ）である。この場合、スペーサーのアミノ酸のアルファアミンと側鎖アミンの両方ともアルキル化されることが可能であり、それによりグルカゴンペプチドがジアルキル化される。本発明の実施態様はそのようなジアルキル化分子を含む。
アルキル化がスペーサーのヒドロキシル基を介して生じる場合、アミノ酸又はジペプチド若しくはトリペプチドのアミノ酸のうちの１個は、式ＩＩのアミノ酸であることができる。特定の例示的な実施態様において、アミノ酸はＳｅｒである。
アルキル化がスペーサーのチオール基を介して生じる場合、アミノ酸又はジペプチド若しくはトリペプチドのアミノ酸のうちの１個は、式ＩＩＩのアミノ酸であることができる。特定の例示的な実施態様において、アミノ酸はＣｙｓである。
幾つかの実施態様において、スペーサーは、親水性二官能スペーサーである。特定の実施態様において、親水性二官能スペーサーは、２つ以上の反応性基、例えば、アミン、ヒドロキシル、チオール、及びカルボキシル基、又はこれらの任意の組み合わせ、を含む。特定の実施態様において、親水性二官能スペーサーは、ヒドロキシル基及びカルボキシレートを含む。他の実施態様において、親水性二官能スペーサーは、アミン基及びカルボキシレートを含む。他の実施態様において、親水性二官能スペーサーは、チオール基及びカルボキシレートを含む。特定の実施態様において、スペーサーは、アミノポリ（アルキルオキシ）カルボキシレートを含む。この点において、スペーサーは、例えばＮＨ2（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n（ＣＨ2）mＣＯＯＨを含むことができ(式中、ｍは、１〜６の任意の整数であり、そしてｎは、２〜１２の任意の整数である)、例えば、Peptides International, Inc. (Louisville, KY)により販売されている、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸であってもよい。
幾つかの実施態様において、スペーサーは、疎水性二官能スペーサーである。特定の実施態様において、疎水性二官能スペーサーは、２つ以上の反応性基、例えば、アミン、ヒドロキシル、チオール、及びカルボキシル基、又はこれらの任意の組み合わせ、を含む。特定の実施態様において、疎水性二官能スペーサーは、ヒドロキシル基及びカルボキシレートを含む。他の実施態様において、疎水性二官能スペーサーは、アミン基及びカルボキシレートを含む。他の実施態様において、疎水性二官能スペーサーは、チオール基及びカルボキシレートを含む。カルボキシレートとヒドロキシル基又はチオール基を含む適切な疎水性二官能スペーサーは、当該技術において知られており、例えば８−ヒドロキシオクタン酸及び８−メルカプトオクタン酸が含まれる。
スペーサー（例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性又は疎水性二官能スペーサー）は、特定の実施態様において、３〜１０個の原子（例えば、６〜１０個の原子（例えば、６、７、８、９、又は１０個の原子））の長さを有する。より特定の実施態様において、スペーサーは、約３〜１０個の原子（例えば、６〜１０個の原子）の長さであり、アルキルはＣ１２〜Ｃ１８アルキル基、例えばＣ１４アルキル基、Ｃ１６アルキル基であり、これによりスペーサーとアルキル基の全長は、１４〜２８個の原子、例えば約４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個の原子の長さとなる。幾つかの実施態様において、スペーサーとアルキルの長さは、１７〜２８個（例えば、１９〜２６個、１９〜２１個）の原子である。
特定の前述の実施態様によると、二官能スペーサーは、長さが３〜１０個の原子のアミノ酸主鎖（例えば、６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸及び８−アミノオクタン酸）を含む合成又は非天然型のアミノ酸であることができる。あるいは、スペーサーは、長さが３〜１０個の原子（例えば、６〜１０個の原子）のペプチド主鎖を有するジペプチド又はトリペプチドスペーサーであることができる。ジペプチド又はトリペプチドスペーサーは、例えば本明細書に教示されているアミノ酸のいずれかを含む天然型の及び／又は非天然型のアミノ酸から構成されうる。 幾つかの実施態様において、スペーサーは、全体として負の電荷を含み、例えば１又は２個の負荷電アミノ酸を含む。幾つかの実施態様において、ジペプチドスペーサーは、Ａｌａ−Ａｌａ、β−Ａｌａ−β−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、γ−アミノ酪酸−γ−アミノ酪酸、及びγ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕからなる群より選択される。
アミン、ヒドロキシル、及びチオールを介したペプチドアルキル化に適した方法は、当該技術において知られている。例えば、ウィリアムソンエーテル合成を使用して、グルカゴンペプチドのヒドロキシル基とアルキル基との間にエーテル結合を形成することができる。また、ハロゲン化アルキルによるペプチドの求核置換反応は、エーテル、チオエーテル又はアミノ結合のいずれかをもたらすことができる。
アルキル化グルカゴンペプチドのアルキル基は、任意の大きさ、例えば任意の長さの炭素鎖であることができ、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。本発明の幾つかの実施態様において、アルキル基は、Ｃ４〜Ｃ３０アルキルである。例えば、アルキル基は、Ｃ４アルキル、Ｃ６アルキル、Ｃ８アルキル、Ｃ１０アルキル、Ｃ１２アルキル、Ｃ１４アルキル、Ｃ１６アルキル、Ｃ１８アルキル、Ｃ２０アルキル、Ｃ２２アルキル、Ｃ２４アルキル、Ｃ２６アルキル、Ｃ２８アルキル、又はＣ３０アルキルのいずれかであることができる。幾つかの実施態様において、アルキル基は、Ｃ８〜Ｃ２０アルキル、例えばＣ１４アルキル又はＣ１６アルキルである。
幾つかの実施態様において、アルキル基は、胆汁酸のステロイド部分、例えば、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロコール酸、グリココール酸、及びコレステロール酸を含む。
本発明の幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、求核長鎖アルカンとグルカゴンペプチドとを反応させることにより、アルキル基を含むように修飾されて、ここでグルカゴンペプチドは、求核置換に適した離脱基を含む。特定の態様において、長鎖アルカンの求核基は、アミン、ヒドロキシル基、又はチオール基を含む（例えば、オクタデシルアミン、テトラデカノール、及びヘキサデカンチオールである）。グルカゴンペプチドの離脱基は、アミノ酸の側鎖の一部であってもよいし、ペプチド主鎖の一部であってもよい。適切な離脱基には、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ハロゲン、及びスルホネートエステルが含まれる。
特定の実施態様において、グルカゴンペプチドは、求核長鎖アルカンと、グルカゴンペプチドに結合しているスペーサーとを反応させることにより、アルキル基を含むように修飾され、ここでスペーサーは離脱基を含む。特定の態様において、長鎖アルカンは、アミン、ヒドロキシル、又はチオール基を含む。特定の実施態様において、離脱基を含むスペーサーは、本明細書において考察された任意のスペーサー、例えば、適切な離脱基を更に含む、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能スペーサー又は疎水性二官能スペーサー、であることができる。
長鎖アルカンがグルカゴン又はスペーサーでアルキル化されている本発明のこれらの態様に関して、長鎖アルカンは、任意の大きさであることができ、任意の長さの炭素鎖を含むことができる。長鎖アルカンは、直鎖であってもよいし、分岐鎖であってもよい。特定の態様において、長鎖アルカンは、Ｃ４〜Ｃ３０アルカンである。例えば、長鎖アルカンは、Ｃ４アルカン、Ｃ６アルカン、Ｃ８アルカン、Ｃ１０アルカン、Ｃ１２アルカン、Ｃ１４アルカン、Ｃ１６アルカン、Ｃ１８アルカン、Ｃ２０アルカン、Ｃ２２アルカン、Ｃ２４アルカン、Ｃ２６アルカン、Ｃ２８アルカン又はＣ３０アルカンのいずれかであることができる。幾つかの実施態様において、長鎖アルカンは、Ｃ８〜Ｃ２０アルカン、例えばＣ１４アルカン、Ｃ１６アルカン、又はＣ１８アルカン、を含む。
また、幾つかの実施態様において、アルキル化は、グルカゴンペプチドとコレステロール部分の間で生じることができる。例えば、コレステロール酸のヒドロキシル基が長鎖アルカンの離脱基を置換して、コレステロール−グルカゴンペプチド産物を形成することができる。
本明細書に記載されているアルキル化グルカゴンペプチドは、親水性部分を含むように更に修飾されてもよい。幾つかの特定の実施態様において、親水性部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含むことができる。親水性部分の組み込みは、本明細書に記載されたいずれかの方法のような任意の適切な手段によって達成することができる。この点において、アルキル化グルカゴンペプチドは、配列番号１又は本明細書に記載されている１個以上のアミノ酸修飾を含む配列番号１の修飾アミノ酸配列を含むことができ、ここで、１０、２０、２４、及び２９位の少なくとも１個のアミノ酸はアルキル基を含み、１６、１７、２１、２４、若しくは２９位、若しくはＣ末端延長部内の位置の少なくとも１個のアミノ酸、又はＣ末端アミノ酸は修飾されて、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ又はＡｃ−Ｐｈｅとなり、アミノ酸の側鎖は、親水性部分（例えば、ＰＥＧ）に共有結合している。幾つかの実施態様において、アルキル基は１０位に結合しており（この結合は、場合によりＣｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ又はＡｃ−Ｐｈｅを含むスペーサーを介してであってもよい）、親水性部分は、２４位のＣｙｓ残基に組み込まれている。
あるいは、アルキル化グルカゴンペプチドは、スペーサーを含むことができ、ここでスペーサーは、アルキル化され、且つ、親水性部分を含むように修飾もされる。適切なスペーサーの非限定例には、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ及びＡｃ−Ｐｈｅからなる群より選択される１個以上のアミノ酸を含むスペーサーが挙げられる。
＜ＧＬＰ−１活性を低減する修飾＞
特定の実施態様において、グルカゴンペプチド又はその類縁体は、ＧＬＰ−１活性を選択的に低減するアミノ酸修飾を含む。例えば、アシル化若しくはアルキル化グルカゴンペプチド又はその類縁体は、Ｃ末端アルファカルボキシレート基；ヒドロキシル基を欠いているアミノ酸、例えばＡｂｕ若しくはＩｌｅによる７位のＴｈｒの置換；長さが２７若しくは２８個のアミノ酸のペプチドを生じるような、２７若しくは２８位のアミノ酸のアミノ酸Ｃ末端の欠失（例えば、２８位のアミノ酸の欠失、２８及び２９位のアミノ酸の欠失）又はこれらの組み合わせ、を含む。
＜結合体＞
本開示は、本発明のグルカゴンペプチドが結合体部分に結合しているような他の結合体も包含し、この結合は、場合により共有結合を介してでもよく、場合によりリンカーを介してでもよい。結合は、共有化学結合、静電気、水素、イオン、ファンデルワールスのような物理的な力、又は疎水性若しくは親水性相互作用により達成することができる。ビオチン−アビジン、リガンド／受容体、酵素／基質、核酸／核酸結合タンパク質、脂質／脂質結合タンパク質、細胞付着分子パートナー、又は互いに親和性を有する任意の結合パートナー若しくはそのフラグメントを含む、多様な非共有結合系を使用することができる。
ペプチドを、ペプチドの標的アミノ酸残基と、これらの標的アミノ酸の選択された側鎖又はＮ若しくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤との反応により、直接共有結合を介して結合体部分に結合することができる。ペプチド又は結合体部分の反応性基には、例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α−ハロアセチル、マレイミド又はヒドラジノ基が含まれる。誘導体化剤には、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介して結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介して結合）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸又は当該技術に既知の他の作用物質が含まれる。あるいは、結合体部分を、多糖又はポリペプチド担体のような中間体担体を介してペプチドに間接的に結合することができる。多糖担体の例にはアミノデキストランが挙げられる。適切なポリペプチド担体の例には、ポリリシン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、それらのコポリマー及びこれらのアミノ酸の混合ポリマー、並びに得られる装填担体に望ましい溶解性の特性を付与する他のもの、例えばセリンが挙げられる。
システイニル残基は、最も一般的には、クロロ酢酸又はクロロアセトアミドのようなα−ハロアセテート（及び対応するアミン）と反応して、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を与える。システイニルン残基は、ブロモトリフルオロアセトン、アルファ−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀ベンゾエート、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール、又はクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールと反応させることによっても、誘導体化される。
ヒスチジル残基は、ジエチルピロカーボネートとｐＨ５．５〜７．０で反応させることによって誘導体化されるが、それはこの作用物質がヒスチジル側鎖に比較的特異性があるからである。パラ−ブロモフェナシルブロミドも有用であり、反応は、好ましくは０．１Mのカコジル酸ナトリウムによりｐＨ６．０で実施される。
リシニル及びアミノ末端残基は、無水コハク酸又は他のカルボン酸無水物と反応する。これらの作用物質による誘導体化は、リシニル残基の電荷を逆転する効果を有する。アルファ−アミノ含有残基を誘導体化するのに適した他の試薬には、メチルピコリンイミデート、ピリドキサールホスフェート、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオンのようなイミドエステル及びグリオキシレートとのトランスアミダーゼ触媒反応、が含まれる。
アルギニル残基は、１つ又は幾つかの従来の試薬、なかでもフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンによる反応で修飾される。アルギニン残基の誘導体化の反応は、グアニジン官能基のpKaが高いので、アルカリ条件下で実施される必要がある。更に、これらの試薬は、リシンの基、またアルギニン−イプシロン−アミノ基と反応することができる。
チロシル残基の特定の修飾は、スペクトル標識をチロシル残基に導入するのに特に興味深く、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンによる反応によって行うことができる。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミダゾール及びテトラニトロメタンを使用して、Ｏ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体がそれぞれ形成される。
カルボキシル側基（アスパルチル又はグルタミル）は、Ｒ及びＲ′が異なるアルキル基であるカルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ′）、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミド、との反応により選択的に修飾される。更に、アスパルチル又はグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル及びグルタミニル残基に変換される。
他の修飾には、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のアルファ−アミノ基のメチル化（T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)）、アスパラギン又はグルタミンの脱アミド化、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び／又はＣ末端カルボン酸基のアミド化若しくはエステル化、が含まれる。
別の種類の共有的修飾には、ペプチドへのグリコシドの化学的又は酵素的結合が含まれる。糖を、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのような遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニン若しくはヒドロキシプロリンのような遊離ヒドロキシル基、（ｅ）チロシン若しくはトリプトファンのような芳香族残基、又は（ｆ）グルタミンのアミド基、に結合することができる。これらの方法は、１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ８７／０５３３０及びAplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
本明細書に記載されているグルカゴンペプチドのいずれかに結合することができる例示的な結合体部分には、異種ペプチド又はポリペプチド（例えば、血漿タンパク質を含む）、標的作用物質、免疫グロブリン若しくはその一部（例えば、可変部領域、ＣＤＲ若しくはＦｃ領域）、放射性同位体、蛍光体若しくは酵素標識のような診断用標識、水溶性ポリマーを含むポリマー、又は他の治療若しくは診断剤、が含まれるが、これらに限定されない。一つの実施態様において、本発明のグルカゴンペプチド及び血漿タンパク質を含む結合体が提供され、ここで血漿タンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、フィブリノゲン、及びグロブリンからなる群より選択される。一つの実施態様において、結合体の血漿タンパク質部分は、アルブミン又はトランスフェリンである。幾つかの実施態様において、リンカーは、１〜約６０個、又は１〜３０個以上の原子長さ、２〜５個の原子、２〜１０個の原子、５〜１０個の原子又は１０〜２０個の原子長さの原子鎖を含む。幾つかの実施態様において、原子鎖は全て炭素原子である。幾つかの実施態様において、リンカーの主鎖の原子鎖は、Ｃ、Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群より選択される。原子鎖及びリンカーは、より溶解度の高い結合体をもたらすために、予想される溶解性（親水性）に従って選択することができる。幾つかの実施態様において、リンカーは、酵素若しくは他の触媒による切断、又は標的組織若しくは臓器若しくは細胞において見出される加水分解的条件による切断の対象となる官能基を提供する。幾つかの実施態様において、リンカーの長さは、立体障害の潜在性を低減するのに十分な長さである。リンカーが共有結合又はペプチジル結合であり、結合体がポリペプチドである場合、結合体は全体が融合タンパク質であることができる。そのようなペプチジルリンカーは任意の長さであることができる。例示的なリンカーは、約１〜５０個のアミノ酸長さ、５〜５０個、３〜５個、５〜１０個、５〜１５個又は１０〜３０個のアミノ酸長さである。そのような融合タンパク質は、代替的には当業者に既知の組み換え遺伝子操作法により産生することもできる。
上記に記述したように、幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、免疫グロブリン又はその一部（例えば、可変部領域、ＣＤＲ又はＦｃ領域）に結合、例えば融合している。既知の種類の免疫グロブリン（Ｉｇ）には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭが含まれる。Ｆｃ領域はＩｇ重鎖のＣ末端領域であり、これは、再循環（延長された半減期をもたらす）、抗体依存性細胞仲介細胞障害性（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）のような活性を実施するＦｃ受容体への結合に関与している。
例えば、幾つかの定義によると、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、重鎖のＣｙｓ２２６からＣ末端まで伸びている。「ヒンジ領域」は、一般に、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０まで伸びている（他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、システイン結合に関わるシステインを整列することによりＩｇＧ１配列と整列させることができる）。ＩｇＧのＦｃ領域には２つの定常部ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３、が含まれる。ヒトＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインは、通常、アミノ酸２３１からアミノ酸３４１まで伸びている。ヒトＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ３ドメインは、通常、アミノ酸３４２から酸４４７まで伸びている。免疫グロブリン又は免疫グロブリンのフラグメント若しくは領域のアミノ酸番号付けに関する参照は、全て、Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md.に基づいている。関連する実施態様において、Ｆｃ領域は、１つ以上の、ＣＨ１以外の免疫グロブリン重鎖の天然の又は修飾された定常部領域、例えばＩｇＧ及びＩｇＡのＣＨ２及びＣＨ３領域又はＩｇＥのＣＨ３及びＣＨ４領域、を含むことができる。
適切な結合体部分としては、ＦｃＲｎ結合部位を含む免疫グロブリン配列の一部が挙げられる。サルベージ受容体であるＦｃＲｎは、免疫グロブリンを再循環して、血液循環に戻すことに関与する。ＦｃＲｎ受容体に結合するＩｇＧのＦｃ部分の領域は、Ｘ線結晶構造解析に基づいて記載されている（Burmeister et al. 1994, Nature 372:379）。ＦｃＲｎへのＦｃの主な接触領域は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの接合部に近接している。Ｆｃ−ＦｃＲｎ接触点は、全て単一Ｉｇ重鎖の範囲内である。主な接触部位には、ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２４８、２５０〜２５７、２７２、２８５、２８８、２９０〜２９１、３０８〜３１１、及び３１４、並びにＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５〜３８７、４２８、及び４３３〜４３６が含まれる。
幾つかの結合体部分は、ＦｃγＲ結合部位を含んでもよいし含まなくてもよい。ＦｃγＲは、ＡＤＣＣ及びＣＤＣに関与する。ＦｃγＲと直接接触するＦｃ領域内の位置の例は、アミノ酸２３４〜２３９（低ヒンジ領域）、アミノ酸２６５〜２６９（Ｂ／Ｃループ）、アミノ酸２９７〜２９９（Ｃ′／Ｅループ）及びアミノ酸３２７〜３３２（Ｆ／Ｇ）ループである（Sondermann et al., Nature 406: 267-273, 2000）。ＩｇＥの低ヒンジ領域は、ＦｃＲＩ結合にも関わっている（Henry, et al., Biochemistry 36, 15568-15578, 1997）。ＩｇＡ受容体結合に関わる残基は、Lewisらにより記載されている（J Immunol. 175:6694-701, 2005）。ＩｇＥ受容体結合に関わるアミノ酸残基は、Sayers らにより記載されている（J Biol Chem. 279(34):35320-5, 2004）。
アミノ酸修飾を免疫グロブリンのＦｃ領域において行うことができる。そのようなＦｃ領域変異体は、Ｆｃ領域のＣＨ３ドメイン（残基３４２〜４４７）に少なくとも１つのアミノ酸修飾、及び／又はＦｃ領域のＣＨ２ドメイン（残基２３１〜３４１）に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。ＦｃＲｎに親和性の増加を付与すると考えられる突然変異には、Ｔ２５６Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ及びＮ４３４Ａが含まれる（Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591）。他の突然変異は、ＦｃＲｎの親和性を有意に低減することなく、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ及び／又はＦｃγＲＩＩＩＡへのＦｃ領域の結合を低減することができる。例えば、Ａｌａ又は他のアミノ酸によるＦｃ領域の２９７位のＡｓｎの置換は、高度に保存されたＮ−グリコシル化部位を除去し、Ｆｃ領域の延長された半減期を伴って免疫原性の低減、また、ＦｃγＲへの結合の低減をもたらすことができる（Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591）。ＦｃγＲへの結合を低減する、ＩｇＧ１の２３３〜２３６位でのアミノ酸の修飾が行われた（Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 and Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613）。幾つかの例示的なアミノ酸置換は、米国特許第７，３５５，００８号及び同第７，３８１，４０８号に記載されており、それぞれその全体が参照として本明細書に組み込まれる。
本開示は、第２のペプチド又はポリペプチドがグルカゴンペプチドの末端、例えばカルボキシ末端に融合しているような、グルカゴン融合ペプチド又はタンパク質も包含する。Ｃ末端縮合の例示的な候補には、グルカゴンペプチドのアミノ酸２９に結合している、配列番号２０（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号２１（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）又は配列番号２２（ＫＲＮＲ）が含まれる。
＜アルファ−へリックス構造の安定化＞
グルカゴンペプチドの１位及び／又は２位のアミノ酸の修飾によるグルカゴン活性の低減は、グルカゴンペプチドのＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９あたり）のアルファ−へリックス構造の安定化により回復することができる。アルファ−へリックス構造は、例えば、共有若しくは非共有分子内架橋の形成によって安定化するか、アルファ−へリックス安定化アミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸）による１２〜２９位あたりのアミノ酸の置換及び／又は挿入によって安定化することができる。
幾つかの実施態様において、分子内架橋が２つのアミノ酸側鎖の間に形成されて、グルカゴンペプチドのカルボキシ末端部分（例えば、アミノ酸１２〜２９）の三次元構造を安定化する。２つのアミノ酸側鎖は、非共有結合、例えば水素結合、塩架橋の形成のようなイオン相互作用を介して又は共有結合により互いに結合することができる。２つのアミノ酸側鎖が１つ以上の共有結合を介して互いに結合している場合、本明細書において、ペプチドは共有分子内架橋を含んでいると考慮することができる。２つのアミノ酸側鎖が非共有結合、例えば水素結合、イオン相互作用を介して互いに結合している場合、本明細書において、ペプチドは非共有分子内架橋を含んでいると考慮することができる。
幾つかの実施態様において、分子内架橋は、３個のアミノ酸で離れている２個のアミノ酸、例えばｉとｉ＋４の位置のアミノ酸の間に形成され、ここでｉは、１２〜２５の間（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４及び２５）の任意の整数である。より詳細には、アミノ酸対の１２と１６、１６と２０、２０と２４、又は、２４と２８（ｉ＝１２、１６、２０、又は２４のアミノ酸対）の側鎖は、互いに結合しており、したがってグルカゴンアルファ−へリックスを安定化する。代替的には、ｉは１７であることができる。
幾つかの特定の実施態様において、ｉとｉ＋４の位置のアミノ酸が分子内架橋で結合している場合、リンカーの大きさは、約８個の原子又は約７〜９個の原子である。
他の実施態様において、分子内架橋は、２個のアミノ酸で離れている２個のアミノ酸、例えばｊとｊ＋３の位置のアミノ酸の間に形成され、ここでｊは、１２〜２６の間（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、及び２６）の任意の整数である。幾つかの特定の実施態様において、ｊは１７である。
幾つかの特定の実施態様において、ｊ位とｊ＋３位のアミノ酸が分子内架橋で結合している場合、リンカーの大きさは、約６個の原子又は約５〜７個の原子である。
さらに他の実施態様において、分子内架橋は、６個のアミノ酸で離れている２個のアミノ酸、例えばｋとｋ＋７の位置のアミノ酸の間に形成され、ここでｋは、１２〜２２の間（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、及び２２）の任意の整数である。幾つかの特定の実施態様において、ｋは、１２、１３又は１７である。例示的な実施態様において、ｋは１７である。
共有結合して６原子結合架橋を形成することができるアミノ酸対形成の例には、ＯｒｎとＡｓｐ、Ｇｌｕと式Ｉ（式中、ｎは２である）のアミノ酸、及び、ホモグルタミン酸と式Ｉ（式中、ｎは１である）のアミノ酸、が挙げられ、ここで、式Ｉは下記である：
Figure 2015147791
共有結合して７原子結合架橋を形成することができるアミノ酸対形成の例には、Ｏｒｎ−Ｇｌｕ（ラクタム環）、Ｌｙｓ−Ａｓｐ（ラクタム）、又は、ホモＳｅｒ−ホモＧｌｕ（ラクトン）、が挙げられる。８原子リンカーを形成することができるアミノ酸対形成の例には、Ｌｙｓ−Ｇｌｕ（ラクタム）、ホモＬｙｓ−Ａｓｐ（ラクタム）、Ｏｒｎ−ホモＧｌｕ（ラクタム）、４−アミノＰｈｅ−Ａｓｐ（ラクタム）、又はＴｙｒ−Ａｓｐ（ラクトン）、が挙げられる。９原子リンカーを形成することができるアミノ酸対形成の例には、ホモＬｙｓ−Ｇｌｕ（ラクタム）、Ｌｙｓ−ホモＧｌｕ（ラクタム）、４−アミノＰｈｅ−Ｇｌｕ（ラクタム）、又はＴｙｒ−Ｇｌｕ（ラクトン）、が挙げられる。これらのアミノ酸の側鎖のいずれかも、アルファ−へリックスの三次元構造が妨げられない限り、追加的な化学基で更に置換することができる。当業者であれば、同様の大きさ及び所望の効果の構造の安定化を作り出すような、代替的な対形成又は化学的に修飾された誘導体を含む代替的なアミノ酸類縁体を着想することができる。例えば、ホモシステイン−ホモシステインジスルフィド架橋は、長さが６個の原子であり、更に修飾して所望の効果をもたらすことができる。共有結合がなくても、上記に記載されたアミノ酸対形成又は当業者が想像できる同様の対形成も、非共有結合を介して、例えば塩架橋の形成又は水素結合相互作用を介して、アルファ−へリックスに追加的な安定性をもたらすことができる。
ラクタム環の大きさは、アミノ酸の側鎖の長さに応じて変わることができ、一つの実施態様において、ラクタムは、リシンアミノ酸の側鎖をグルタミン酸の側鎖に結合することによって形成される。更なる例示的な実施態様は、以下の対形成を含み、更にラクタム架橋を含んでもよい：１２位のＧｌｕと１６位のＬｙｓ；１２位の天然Ｌｙｓと１６位のＧｌｕ；１６位のＧｌｕと２０位のＬｙｓ；１６位のＬｙｓと２０位のＧｌｕ；２０位のＧｌｕと２４位のＬｙｓ；２０位のＬｙｓと２４位のＧｌｕ；２４位のＧｌｕと２８位のＬｙｓ；２４位のＬｙｓと２８位のＧｌｕ。あるいは、ラクタム環におけるアミド結合の順番を逆転することができる（例えば、ラクタム環を、Ｌｙｓ１２とＧｌｕ１６の側鎖、あるいはＧｌｕ１２とＬｙｓ１６の側鎖の間に形成することができる）。
ラクタム架橋以外の分子内架橋を使用して、グルカゴン類縁体ペプチドのアルファ−へリックスを安定化することができる。一つの実施態様において、分子内架橋は疎水性架橋である。この場合、分子内架橋は、グルカゴン類縁体ペプチドのアルファ−へリックスの疎水性面の部分である２個のアミノ酸の側鎖の間にあってもよい。例えば、疎水性架橋により結合しているアミノ酸のうちの１個は、１０、１４、及び１８位のアミノ酸であることができる。
一つの特定の態様において、全炭化水素架橋系を使用してグルカゴンペプチドのアルファ−へリックスの１又は２ターンを架橋するために、オレフィンメタセシスが用いられる。この場合、グルカゴンペプチドは、多様な長さのオレフィン性側鎖を有し、Ｒ又はＳ立体化学のいずれかに配置されているα−メチル化アミノ酸を、ｉの位置とｉ＋４又はｉ＋７の位置とに含むことができる。例えば、オレフィン性側鎖は（ＣＨ2）ｎを含むことができ、ここでｎは、１〜６の任意の整数である。一つの実施態様において、架橋長さが８個の原子では、ｎは３である。そのような分子内架橋を形成する適切な方法は、当該技術において記載されている。例えば、Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122: 5891-5892 (2000)及びWalensky et al., Science 305: 1466-1470 (2004)を参照すること。あるいは、グルカゴンペプチドは、ヘリックスの隣接するターンに配置されている２つのＯ−アリルＳｅｒ残基を含むことができ、これらはルテニウム触媒閉環メタセシスを介して互いに架橋されている。そのような架橋の手順は、例えばBlackwell et al., Angew, Chem., Int. Ed. 37: 3281-3284 (1998)に記載されている。
別の特定の態様において、システインのペプチド模倣体として広く採用されている、非天然チオ−ジアラニンアミノ酸であるランチオニンを、アルファ−へリックスの１ターンを架橋するために使用する。ランチオニンに基づく環化の適切な方法は、当該技術において知られている。例えば、Matteucci et al., Tetrahedron Letters 45: 1399-1401 (2004); Mayer et al., J. Peptide Res. 51: 432-436 (1998); Polinsky et al., J. Med. Chem. 35: 4185-4194 (1992); Osapay et al., Ｊ. Med. Chem. 40: 2241-2251 (1997); Fukase et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 65: 2227-2240 (1992); Harpp et al., J. Org. Chem. 36: 73-80 (1971); Goodman and Shao, Pure Appl. Chem. 68: 1303-1308 (1996);及びOsapay and Goodman, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1599-1600 (1993)を参照すること。
幾つかの実施態様において、ｉ位とｉ＋７位の２つのＧｌｕ残基の間のα，ω−ジアミノアルカン鎖（例えば１，４−ジアミノプロパンや１，５−ジアミノペンタン）を使用して、グルカゴンペプチドのアルファ−へリックスを安定化する。そのような鎖は、ジアミノアルカン鎖の長さに応じて、９原子又はそれ以上の長さの架橋の形成をもたらす。そのような鎖で架橋されたペプチドを産生する適切な方法は、当該技術において記載されている。例えば、Phelan et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 455-460 (1997)を参照すること。
本発明の更に別の実施態様において、ジスルフィド架橋を使用して、グルカゴンペプチドのアルファ−へリックスの１又は２ターンを架橋する。あるいは、一方又は両方の硫黄原子がメチレン基に代えられて等配電子マクロ環化をもたらしている修飾ジスルフィド結合を使用して、グルカゴンペプチドのアルファ−へリックスを安定化する。ジスルフィド架橋又は硫黄に基づく環化により修飾する適切な方法は、例えば、Jackson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 9391-9392 (1991)及びRudinger and Jost, Experientia 20: 570-571 (1964)に記載されている。
更に別の実施態様において、グルカゴンペプチドのアルファ−へリックスは、ｉとｉ＋４に位置する２つのＨｉｓ残基又はＨｉｓとＣｙｓの対による、金属原子の結合を介して安定化される。金属原子は、例えば、Ｒｕ（ＩＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、又はＣｄ（ＩＩ）であることができる。そのような金属結合に基づいたアルファ−へリックス安定化の方法は、当該技術において知られている。例えば、Andrews and Tabor, Tetrahedron 55: 11711-11743 (1999); Ghadiri et al., Ｊ. Am. Chem. Soc. 112: 1630-1632 (1990);及びGhadiri et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 9063-9064 (1997)を参照すること。
グルカゴンペプチドのアルファ−へリックスは、代替的には他のペプチド環化の方法により安定化することもでき、その方法は、Davies, J. Peptide. Sci. 9: 471-501 (2003)により検討されている。アルファ−へリックスは、アミド架橋、チオエーテル架橋、チオエステル架橋、尿素架橋、カルバメート架橋、スルホンアミド架橋などの形成を介して、安定化することができる。例えば、チオエステル架橋を、Ｃ末端とＣｙｓ残基の側鎖との間に形成することができる。あるいは、チオエステルを、チオールを有するアミノ酸（Ｃｙｓ）及びカルボン酸を有するアミノ酸（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）の側鎖を介して形成することができる。別の方法において、ジカルボン酸、例えばスベリン酸（オクタン二酸）などのような架橋剤は、遊離アミン、ヒドロキシル、チオール基、及びこれらの組み合わせのような、アミノ酸側鎖の２つの官能基の間に結合を導入することができる。
一つの実施態様によると、グルカゴンペプチドのアルファ−へリックスは、ｉとｉ＋４の位置への疎水性アミノ酸の組み込みを介して安定化される。例えば、ｉはＴｙｒであることができ、そしてｉ＋４はＶａｌ又はＬｅｕであることができる；ｉはＰｈｅであることができ、そしてｉ＋４はＣｙｓ又はＭｅｔであることができる；ｉはＣｙｓであることができ、そしてｉ＋４はＭｅｔであることができる；或いはｉはＰｈｅであることができ、そしてｉ＋４はＩｌｅであることができる。本明細書の目的のために、上記のアミノ酸対形成を逆転することができ、これによりｉ位置の示されたアミノ酸を代替的にｉ＋４の位置に配置することができ、一方、ｉ＋４のアミノ酸をｉ位置に配置することができることが理解されるべきである。
本発明の他の実施態様によると、アルファ−へリックスは、グルカゴンペプチドのＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９あたり）に１個以上のアルファ−へリックス安定化アミノ酸を（アミノ酸の置換又は挿入のいずれかにより）組み込むことを介して安定化される。特定の実施態様において、アルファ−へリックス安定化アミノ酸は、α，α−二置換アミノ酸であり、その例として、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）や、メチル、エチル、プロピル、及びｎ−ブチルから選択される同一若しくは異なる基により二置換されているアミノ酸や、シクロオクタン若しくはシクロヘプタンにより二置換されているアミノ酸（例えば、１−アミノシクロオクタン−１−カルボン酸）のいずれかが含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドの１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、又は２９位のうちの１、２、３、４つ又はそれ以上は、α，α−二置換アミノ酸で置換されている。特定の実施態様において、１６、２０、２１及び２４位のうちの１、２、３つ又は全ては、ＡＩＢで置換されている。例えば、グルカゴンペプチドは、分子内架橋、例えば非共有分子内架橋（例えば、塩架橋）又は共有分子内架橋（例えば、ラクタム）の不在下で、ＡＩＢによる１６位での置換を含むことができる。有利なことに、分子内架橋を欠いているそのようなペプチドは調製が容易である。
幾つかの実施態様によると、分子内架橋を欠いているグルカゴンペプチドは、アミノ酸１２〜２９位の範囲において、α，α−二置換アミノ酸による１つ以上の置換と、グルカゴンペプチドのアミノ酸、例えばグルカゴンペプチドの１０位のアミノ酸、の側鎖に共有結合しているアシル又はアルキル基とを含む。特定の実施態様において、アシル又はアルキル基は、天然型のアミノ酸に対して非天然型である。特定の態様において、アシル又はアルキル基は、１０位のアミノ酸に対して非天然型である。分子内架橋を欠いているそのようなアシル化又はアルキル化グルカゴンペプチドは、非アシル化対応ペプチドの活性と比較して、ＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体に対して増強された活性を示す。ＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体に対する活性の更なる増強は、分子内架橋を欠いているアシル化グルカゴンペプチドにおいて、スペーサーをアシル又はアルキル基とペプチドの１０位のアミノ酸の側鎖との間に組み込むことによって達成することができる。アシル化及びアルキル化は、スペーサーの組み込みを伴う場合も伴わない場合も、本明細書において更に記載されている。
特定の実施態様において、アシル化若しくはアルキル化グルカゴンペプチド又はその類縁体は、更に、ＧＬＰ−１受容体に対する活性を選択的に減少する修飾を含む。例えば、アシル化若しくはアルキル化グルカゴンペプチド又はその類縁体は、以下のうちの１つ又は組み合わせを含む：Ｃ末端アルファカルボキシレート、Ｃ末端から２７又は２８位のアミノ酸までのアミノ酸の欠失（例えば、２９位のアミノ酸の欠失、２８及び２９位のアミノ酸の欠失）、ヒドロキシル基を欠いているアミノ酸、例えばＡｂｕ又はＩｌｅ、による７位のＴｈｒの置換。
＜実施態様の例＞
一つの実施態様によると、配列番号１の天然グルカゴンペプチドは、負荷電アミノ酸（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）による２８及び／又は２９位の天然アミノ酸の置換によって修飾されており、更に、ペプチドのカルボキシ末端への負荷電アミノ酸（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）の付加によって修飾されてもよい。代替的な実施態様において、配列番号１の天然グルカゴンペプチドは、正電荷アミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、又はヒスチジン）による２９位の天然アミノ酸の置換により修飾されており、更に、ペプチドのカルボキシ末端への１〜２個の正荷電アミノ酸（例えば、リシン、アルギニン又はヒスチジン）の付加により修飾されてもよい。一つの実施態様によると、配列番号３４のアミノ酸配列を含むが、但し、２８又は２９位の少なくとも１個のアミノ酸が酸性アミノ酸で置換されていること、及び／又は追加の酸性アミノ酸が配列番号３４カルボキシ末端に付加されていることを条件とする、向上した溶解性及び安定性を有するグルカゴン類縁体が提供される。一つの実施態様において、酸性アミノ酸は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸及びホモシステイン酸からなる群より独立して選択される。
一つの実施態様によると、アゴニストが配列番号３３のアミノ酸配列を含み、２７、２８又は２９位の少なくとも１個のアミノ酸が非天然アミノ酸残基で置換されている（すなわち、類縁体の２７、２８又は２９位に存在する少なくとも１個のアミノ酸が配列番号１の対応する位置に存在するアミノ酸と異なる酸性アミノ酸である）、向上した溶解性及び安定性を有するグルカゴンアゴニストが提供される。一つの実施態様によると、配列番号３３の配列を含むグルカゴンアゴニストが提供されるが、但し、２８位のアミノ酸がアスパラギンであり、２９位のアミノ酸がトレオニンである場合、このペプチドは、グルカゴンペプチドのカルボキシ末端に付加される、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、又はＧｌｕからなる群より独立して選択される１〜２個のアミノ酸を更に含むことを条件とする。
天然グルカゴンペプチドの特定の位置は、母体ペプチドの少なくとも幾つかの活性を保持しつつ修飾することができることが報告されている。したがって、出願者たちは、配列番号１１のペプチドの２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、又は２９位の位置に配置されている１個以上のアミノ酸を、天然グルカゴンペプチドに存在するものと異なるアミノ酸で置換し、依然として、増強された効力、生理学的ｐＨでの安定性及び親グルカゴンペプチドの生物学的活性を保持できると予測する。例えば、一つの実施態様によると、天然ペプチドの２７位に存在するメチオニン残基をロイシン又はノルロイシンに変えて、ペプチドの酸化分解を防止する。
一つの実施態様において、配列番号３３のグルカゴン類縁体であって、１、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２４位から選択される１〜６個のアミノ酸が配列番号１の対応するアミノ酸と異なる類縁体が提供される。別の実施態様によると、配列番号３３のグルカゴン類縁体であって、１、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２４位から選択される１〜３個のアミノ酸が配列番号１の対応するアミノ酸と異なる類縁体が提供される。別の実施態様において、配列番号７、配列番号８又は配列番号３４のグルカゴン類縁体であって、１、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２４位から選択される１〜２個のアミノ酸が配列番号１の対応するアミノ酸と異なる類縁体が提供され、更なる実施態様において、これら１〜２個の異なるアミノ酸は、天然配列（配列番号１）に存在するアミノ酸に対して保存的アミノ酸置換を表す。一つの実施態様において、、配列番号１１又は配列番号１３のグルカゴンペプチドであって、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、又は２９位から選択される位置で１、２又は３個のアミノ酸置換を更に含むグルカゴンペプチドが提供される。一つの実施態様において、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２７、又は２９位での置換は、保存的アミノ酸置換である。
一つの実施態様において、配列番号１の類縁体ペプチドを含むグルカゴンアゴニストであって、２位にセリン以外のアミノ酸を有すること及び２８若しくは２９位の天然アミノ酸の酸性アミノ酸置換を有することによって、又は配列番号１のペプチドのカルボキシ末端に酸性アミノ酸が付加されていることによって、配列番号１と異なる、グルカゴンアゴニストが提供される。一つの実施態様において、酸性アミノ酸は、アスパラギン酸又はグルタミン酸である。一つの実施態様において、２位での置換により母体分子と異なっていることを特徴とする、配列番号９、配列番号１２、配列番号１３又は配列番号３２のグルカゴン類縁体が提供される。より詳細には、類縁体ペプチドの２位は、Ｄ−セリン、アラニン、Ｄ−アラニン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、及びアミノイソ酪酸からなる群より選択されるアミノ酸で置換されている。
別の実施態様において、配列番号１の類縁体ペプチドを含むグルカゴンアゴニストであって、１位にヒスチジン以外のアミノ酸を有すること及び２８若しくは２９位の天然アミノ酸の酸性アミノ酸置換を有することによって、又は配列番号１のペプチドのカルボキシ末端に酸性アミノ酸が付加されていることによって、配列番号１と異なる、グルカゴンアゴニストが提供される。一つの実施態様において、酸性アミノ酸は、アスパラギン酸又はグルタミン酸である。一つの実施態様において、１位での置換により母体分子と異なっていることを特徴とする、配列番号９、配列番号１２、配列番号１３、又は配列番号３２のグルカゴン類縁体が提供される。より詳細には、類縁体ペプチドの１位は、ＤＭＩＡ、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、及びホモ−ヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸で置換されている。
一つの実施態様によると、修飾グルカゴンペプチドは、配列番号９、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号３２からなる群より選択される配列を含む。更なる実施態様において、配列番号９、配列番号１２、配列番号１３、又は配列番号３２の配列を含むグルカゴンペプチドであって、配列番号９、配列番号１２、配列番号１３、又は配列番号３２のＣ末端に１〜２個のアミノ酸が付加されており、付加されているアミノ酸がＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、又はホモシステイン酸からなる群より独立して選択される、グルカゴンペプチドが提供される。一つの実施態様において、カルボキシ末端に付加される追加のアミノ酸は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ又はＧｌｕからなる群より選択されるか、或いは更なる実施態様において、追加のアミノ酸は、Ａｓｐ又はＧｌｕである。
別の実施態様において、グルカゴンペプチドは、配列番号７又はそのグルカゴンアゴニスト類縁体の配列を含む。一つの実施態様において、ペプチドは、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１３からなる群より選択される配列を含む。別の実施態様において、ペプチドは、配列番号８、配列番号１０、及び配列番号１１からなる群より選択される配列を含む。一つの実施態様において、グルカゴンペプチドは、配列番号８、配列番号１０、及び配列番号１１の配列を含み、グルカゴンペプチドのＣ末端に付加される、Ａｓｐ及びＧｌｕからなる群より選択される追加のアミノ酸を更に含む。一つの実施態様において、グルカゴンペプチドは、配列番号１１又は配列番号１３の配列を含み、更なる実施態様において、グルカゴンペプチドは、配列番号１１の配列を含む。
一つの実施態様によると、下記：
ＮＨ2−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号３４）、
ＮＨ2−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｒ（配列番号１１）、及び
ＮＨ2−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｒ（配列番号１３）
からなる群より選択される修飾グルカゴンペプチドを含むグルカゴンアゴニストが提供され、
ここで、１５位のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸、又はホモシステイン酸であり、２８位のＸａａは、Ａｓｎ又は酸性アミノ酸であり、２９位のＸａａは、Ｔｈｒ又は酸性アミノ酸であり、そしてＲは、酸性アミノ酸、ＣＯＯＨ、又はＣＯＮＨ2であるが、但し、酸性酸残基は、２８、２９、又は３０位のうちの１つに存在する。一つの実施態様において、ＲはＣＯＯＨであり、別の実施態様において、ＲはＣＯＮＨ2である。
本開示は、第２ペプチドがグルカゴンペプチドのＣ末端に融合してグルカゴンペプチドの安定性及び溶解性を増強する、グルカゴン融合ペプチドも包含する。より詳細には、融合グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドを含むグルカゴンアゴニスト類縁体：ＮＨ2−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号３４）を含むことができ、ここでＲは、酸性アミノ酸又は結合及びグルカゴンペプチドのカルボキシ末端アミノ酸に結合している配列番号２０（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号２１（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）、又は配列番号２２（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列である。一つの実施態様において、グルカゴンペプチドは、配列番号３３、配列番号７、又は配列番号８からなる群より選択され、グルカゴンペプチドのカルボキシ末端アミノ酸に結合している配列番号配列２０（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号２１（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）、又は配列番号２２（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列を更に含む。一つの実施態様において、グルカゴン融合ペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６、又はそのグルカゴンアゴニスト類縁体を含み、グルカゴンペプチドのアミノ酸２９に結合している配列番号２０（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号２１（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）又は配列番号２２（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列を更に含む。一つの実施態様によると、融合ペプチドは、１６、１７、２１、２４、２９位、若しくはＣ末端延長部内のアミノ酸、又はＣ末端アミノ酸に結合しているＰＥＧ鎖を更に含み、ここでＰＥＧ鎖は、５００〜４０，０００ダルトンの範囲から選択される。一つの実施態様において、配列番号２０（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号２１（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）、又は配列番号２２（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列は、ペプチド結合を介してグルカゴンペプチドのアミノ酸２９に結合している。一つの実施態様において、グルカゴン融合ペプチドのグルカゴンペプチド部分は、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１３からなる群より選択される配列を含む。一つの実施態様において、グルカゴン融合ペプチドのグルカゴンペプチド部分は、配列番号１１又は配列番号１３の配列を含み、ここでＰＥＧ鎖は、２１、２４、２９位、Ｃ末端延長部内、又はＣ末端のアミノ酸にそれぞれ結合している。
別の実施態様において、融合ペプチドのグルカゴンペプチド配列は、配列番号１１の配列を含み、グルカゴンペプチドのアミノ酸２９に結合している配列番号２０（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号２１（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）、又は配列番号２２（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列を更に含む。一つの実施態様において、グルカゴン融合ペプチドは、配列番号２４、配列番号２５、及び配列番号２６からなる群より選択される配列を含む。典型的には、本発明の融合ペプチドは、標準的なカルボン酸基を有するＣ末端アミノ酸を有する。しかし、Ｃ末端アミノ酸がカルボン酸に対してアミド置換を有するような、これらの配列の類縁体も、実施態様として包含される。一つの実施態様によると、融合グルカゴンペプチドは、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１３からなる群より選択されるグルカゴンアゴニスト類縁体を含み、グルカゴンペプチドのアミノ酸２９に結合している配列番号２３（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＣＯＮＨ2）のアミノ酸配列を更に含む。
本発明のグルカゴンアゴニストを更に修飾して、生物学的活性を保持しながら、水溶液中でのペプチドの溶解性及び安定性を改善することができる。一つの実施態様によると、配列番号１１のペプチド又はそのグルカゴンアゴニスト類縁体の１６、１７、２０、２１、２４及び２９位から選択される１つ以上の位置への親水性基の導入は、ｐＨ安定化グルカゴン類縁体の溶解性及び安定性を改善すると予測される。より詳細には、一つの実施態様において、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、又は配列番号３２のグルカゴンペプチドは、２１及び２４位に存在するアミノ酸の側鎖に共有結合している１つ以上の親水性基を含むように修飾される。
一つの実施態様によると、配列番号１１のグルカゴンペプチドは、１６、１７、２０、２１、２４、及び／又は２９位に１個以上のアミノ酸置換を含有するように修飾されており、ここで天然アミノ酸は、例えばＰＥＧを含む親水性部分との架橋に適した側鎖を有するアミノ酸で置換されている。天然ペプチドを、天然型のアミノ酸又は合成（非天然型の）アミノ酸で置換することができる。合成又は非天然型のアミノ酸は、インビボで天然に生じないが、それでも、本明細書に記載されるペプチド構造に組み込むことができるアミノ酸を意味する。
一つの実施態様において、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１３のグルカゴンアゴニストであって、天然グルカゴンペプチド配列が、天然配列の１６，１７、２１、２４、２９位、Ｃ末端延長部内、又はＣ末端のアミノ酸のうちの少なくとも１つに天然又は合成アミノ酸を含むように修飾され、アミノ酸置換体が親水性部分を更に含む、グルカゴンアゴニストが提供される。一つの実施態様において、置換は２１又は２４位においてであり、更なる実施態様において、親水性部分はＰＥＧ鎖である。一つの実施態様において、配列番号１１のグルカゴンペプチドは少なくとも１つのシステイン残基で置換されており、ここでシステイン残基の側鎖は、例えばマレイミド、ビニルスルホン、２−ピリジルチオ、ハロアルキル、及びハロアシルを含むチオール反応性試薬により更に修飾される。これらのチオール反応試薬は、カルボキシ、ケト、ヒドロキシル、及び他のエーテル基を含有してもよいし、ポリエチレングリコール単位のような、他の親水性部分を含有してもよい。代替的な実施態様において、天然グルカゴンペプチドはリシンで置換されており、置換リシン残基の側鎖は、カルボン酸の活性エスエル（スクシンイミド、無水物など）のようなアミン反応性試薬を使用して、又はポリエチレングリコールのような親水性部分のアルデヒドを使用して、更に修飾される。一つの実施態様において、グルカゴンペプチドは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９からなる群より選択される。
一つの実施態様によると、ペグ化グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドに共有結合している２つ以上のポリエチレン鎖を含み、ここでグルカゴン鎖の総分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。一つの実施態様において、ペグ化グルカゴンアゴニストは、配列番号６のペプチドを含み、ここで、ＰＥＧ鎖は２１位及び２４位のアミノ酸残基に共有結合しており、２つのＰＥＧ鎖の合わせた分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。別の実施態様において、ペグ化グルカゴンアゴニストは、配列番号６のペプチドを含み、ここで、ＰＥＧ鎖は２１位及び２４位のアミノ酸残基に共有結合しており、２つのＰＥＧ鎖の合わせた分子量は、約５，０００〜約２０，０００ダルトンである。
ポリエチレングリコール鎖は、直鎖の形態であってもよいし分岐鎖であってもよい。一つの実施態様によると、ポリエチレングリコール鎖は、約５００〜約４０，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。一つの実施態様において、ポリエチレングリコール鎖は、約５００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有する。別の実施態様において、ポリエチレングリコール鎖は、約２０，０００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する。
上記に記載されたグルカゴンペプチドのいずれも、Ｃ末端部分（アミノ酸１２〜２９位）内に、共有若しくは非共有分子内架橋又はアルファ−へリックス安定化アミノ酸を含むように、更に修飾することができる。一つの実施態様によると、グルカゴンペプチドは、α，α−二置換アミノ酸、例えばＡＩＢ、による１６、２０、２１、若しくは２４位（又はその組み合わせ）でのアミノ酸置換に加えて、上記において考察した修飾のうちの任意の１つ以上を含む。別の実施態様によると、グルカゴンペプチドは、１６及び２０位のアミノ酸の側鎖の間の分子内架橋、例えばラクタムに加えて、上記において考察した修飾のうちの任意の１つ以上を含む。
幾つかの実施態様によると、グルカゴンペプチドは、配列番号７７のアミノ酸配列を含み、ここで３位のＸａａは、下記の構造Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩ：
Figure 2015147791
 〔式中、Ｒ1は、Ｃ0-3アルキル又はＣ0-3ヘテロアルキルであり；Ｒ2は、ＮＨＲ4又はＣ1-3アルキルであり；Ｒ3は、Ｃ1-3アルキルであり；Ｒ4は、Ｈ又はＣ1-3アルキルであり；Ｘは、ＮＨ、Ｏ、又はＳであり；そしてＹは、ＮＨＲ4、ＳＲ3、又はＯＲ3である〕で示される側鎖を含む、アミノ酸である。幾つかの実施態様において、Ｘは、ＮＨであるか、又はＹは、ＮＨＲ4である。幾つかの実施態様において、Ｒ1は、Ｃ0-2アルキル又はＣ1ヘテロアルキルである。幾つかの実施態様において、Ｒ2は、ＮＨＲ4又はＣ1アルキルである。幾つかの実施態様において、Ｒ4は、Ｈ又はＣ1アルキルである。例示的な実施態様において、構造Ｉの側鎖を含み、以下のいずれかが成り立つアミノ酸が提供される：Ｒ1はＣＨ2−Ｓであり、ＸはＮＨであり、そしてＲ2はＣＨ3である（アセトアミドメチル−システイン、Ｃ（Ａｃｍ））；Ｒ1はＣＨ2であり、ＸはＮＨであり、そしてＲ2はＣＨ3であるか（アセチルジアミノブタン酸、Ｄａｂ（Ａｃ））；Ｒ1はＣ0アルキルであり、ＸはＮＨであり、Ｒ2はＮＨＲ4であり、そしてＲ4はＨである（カルバモイルジアミノプロパン酸、Ｄａｐ（尿素））；又は、Ｒ1はＣＨ2−ＣＨ2であり、ＸはＮＨであり、そしてＲ2はＣＨ3である（アセチルオルニチン、Ｏｍ（Ａｃ））。例示的な実施態様において、構造ＩＩの側鎖を含むアミノ酸が提供され、ここで、Ｒ1はＣＨ2であり、Ｙは、ＮＨＲ4であり、そしてＲ4は、ＣＨ3である（メチルグルタミン、Ｑ（Ｍｅ））。例示的な実施態様において、構造ＩＩＩの側鎖を含むアミノ酸が提供され、ここで、Ｒ1はＣＨ2であり、そしてＲ4は、Ｈである（メチオニン−スルホキシド、Ｍ（Ｏ））。特定の実施態様において、３位のアミノ酸はＤａｂ（Ａｃ）により置換されている。例えば、グルカゴンアゴニストは、配列番号６３、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３及び配列番号７４のアミノ酸配列を含むことができる。
特定の実施態様において、グルカゴンペプチドは、配列番号７７のグルカゴンペプチドの類縁体である。特定の態様において、類縁体は、以下を含むが、但しこれらに限定されない、本明細書に記載されているアミノ酸修飾のいずれかを含む：荷電アミノ酸による２８位のＡｓｎの置換；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸及びホモシステイン酸からなる群より選択される荷電アミノ酸による２８位にＡｓｎの置換；Ａｓｎ、Ａｓｐ又はＧｌｕによる２８位での置換；Ａｓｐによる２８位での置換；Ｇｌｕによる２８位での置換；電荷アミノ酸による２９位のＴｈｒの置換；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸及びホモシステイン酸からなる群より選択される荷電アミノ酸によるり２９位のＴｈｒの置換；Ａｓｐ、Ｇｌｕ又はＬｙｓによる２９位での置換；Ｇｌｕによる２９位での置換；２９位の後への１〜３個の荷電アミノ酸の挿入；２９位の後へのＧｌｕ又はＬｙｓの挿入；２９位の後へのＧｌｙ−Ｌｙｓ又はＬｙｓ−Ｌｙｓの挿入；並びにこれらの組み合わせ。
特定の実施態様において、配列番号７７のグルカゴンペプチドの類縁体は、１６、２０、２１、及び２４位のうちの１、２、３つ、又は全てにおいて、ＡＩＢのようなα，α−二置換アミノ酸を含む。
特定の実施態様において、配列番号７７のグルカゴンペプチドの類縁体は、以下の１つ以上を含む：ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する非天然アミノ酸による１位のＨｉｓの置換；ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する非天然アミノ酸による２位のＳｅｒの置換；ヒドロキシル基を欠いているアミノ酸、例えばＡｂｕ又はＩｌｅによる７位のＴｈｒの置換；Ｐｈｅ又はＶａｌによる１０位のＴｙｒの置換；Ａｒｇによる１２いのＬｙｓの置換；Ｇｌｕによる１５位のＡｓｐの置換；Ｔｈｒ又はＡＩＢによる１６位のＳｅｒの置換；Ａｌａ又はＡＩＢによる２０位のＧｌｎの置換；Ｇｌｕによる２１位のＡｓｐの置換；Ａｌａ又はＡＩＢによる２４位のＧｌｎの置換；Ｌｅｕ又はＮｌｅによる２７位のＭｅｔの置換；２７〜２９位のアミノ酸の欠失；２８〜２９位のアミノ酸の欠失；２９位のアミノ酸の欠失；２９位のアミノ酸がＴｈｒ又はＧｌｙであるＣ末端への配列番号２０のアミノ酸配列の付加；或いはこれらの組み合わせ。
特定の実施態様によると、グルカゴンペプチドは、配列番号６２〜６７及び６９〜７４のいずれかのアミノ酸配列を含む。
特定の実施態様において、配列番号７７を含むグルカゴンペプチドの類縁体は、１６、１７、２０、２１、２４、及び２９位のいずかのアミノ酸又はＣ末端アミノ酸に共有結合している親水性部分、例えばＰＥＧを含む。
特定の実施態様において、配列番号７７を含むグルカゴンペプチドの類縁体は、アシル基又はアルキル基に共有結合している側鎖を含むアミノ酸を含み（この結合はスペーサーを介してでもよい）、アシル基又はアルキル基は、天然型のアミノ酸に対して非天然型である。アシル基は、幾つかの実施態様において、Ｃ４〜Ｃ３０脂肪アシル基である。他の実施態様において、アルキル基はＣ４〜Ｃ３０アルキルである。特定の態様において、アシル基又はアルキル基は、１０位のアミノ酸の側鎖に共有結合している。幾つかの実施態様において、７位のアミノ酸はＩｌｅ又はＡｂｕである。
＜使用＞
実施例に詳細に記載されているように、本発明のグルカゴンアゴニストは、天然ペプチドと比べ、増強された生体活性を保持する又は示す一方で、生理学的ｐＨの溶液において増強された生物物理学的安定性及び水溶性を有する。したがって、本発明のグルカゴンアゴニストは、天然グルカゴンペプチドについて既に記載されてきたあらゆる使用に適していると考えられる。したがって、本明細書に記載されている修飾グルカゴンペプチドを、低血糖症を治療すること、血中グルコースレベルを増加すること、放射線用途において腸管に一過性麻痺を誘導すること、体重を低減及び維持すること、インスリンの補助療法として、又は、グルカゴンの低血中レベルによりもたらされる他の代謝疾患を治療すること、に使用できる。
本明細書に記載されているグルカゴンペプチドは、体重を低減若しくは維持すること、高血糖症を治療すること、血中グルコースレベルを低減すること、血中グルコースレベルを正常化すること、及び／又は、血中グルコースレベルを安定化すること、に使用されることも予測される。血中レベルを「正常化する」とは、血中グルコースレベルを正常に戻す（例えば、正常より高い場合は血中グルコースレベルを下げる、又は正常より低い場合は血中グルコースレベルを上げる）ことを意味する。血中グルコースレベルを「安定化する」とは、血中グルコースレベルの最大変動を、一定の期間にわたって、例えば８時間、１６時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、又は１週間にわたって、低減することを意味する。例えば、グルカゴンペプチドの投与は、グルカゴンペプチドの投与の不在の場合よりも、血中グルコースレベルをグルコース値の正常範囲の近くに経時的に維持させる。
本発明のグルカゴンペプチドを、単独で、又は他の抗糖尿病又は抗肥満剤と組み合わせて投与することができる。当該技術において既知であるか又は調査中の抗糖尿病剤としては、以下のものが挙げられる：インスリン；トルブタミド（Orinase）、アセトヘキサミド（Dymelor）、トラザミド（Tolinase）、クロルプロパミド（Diabinese）、グリピジド（Glucotrol）、グリブリド（Diabeta, Micronase, Glynase）、グリメピリド（Amaryl）又はグリクラジド（Diamicron）のようなスルホニル尿素；レパグリニド（Prandin）又はナテグリニド（Starlix）のようなメグリチニド；メトホルミン（Glucophage）又はフェンホルミンのようなビグアナイド；ロシグリタゾン（Avandia）、ピオグリタゾン（Actos）若しくはトログリタゾン（Rezulin）又は他のＰＰＡＲγインヒビターのようなチアゾリジンジオン；ミグリトール（Glyset）、アルカボース（Precose/Glucobay）のような炭水化物の消化を阻害するアルファグルコシダーゼインヒビター；エクセナチド（Byetta）又はプラムリンチド；ビルダグリプチン又はシタグリプチンのようなジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）インヒビター；ＳＧＬＴ（ナトリウム依存性グルコーストランスポーター１）インヒビター；グルコキナーゼアクチベーター（ＧＫＡ）；グルカゴン受容体アンタゴニスト（ＧＲＡ）；又はＦＢＰａｓｅ（フルクトース１，６−ビスホスファターゼ）インヒビター。
当該技術において既知であるか又は調査中の抗肥満剤としては、以下のものが挙げられる：フェネチルアミン型刺激薬、フェンテルミン、（場合により、フェンフルラミン又はデクスフェンフルラミンを伴う）、ジエチルプロピオン（Tenuate（登録商標））、フェンジメトラジン（Prelu-2（登録商標）、Bontril（登録商標））、ベンズフェタミン（Didrex（登録商標））、シブトラミン（Meridia（登録商標）、Reductil（登録商標））を含む食欲抑制薬；リモナバン（Acomplia（登録商標））、他のカンナビノイド受容体アンタゴニスト；オキシントモジュリン；塩酸フルオキセチン（Prozac）；Qnexa（トピラメート及びフェンテルミン）、Excalia（ブプロピオン及びゾニサミド）又はContrave（ブプロピオン及びナルトレキソン）；或いは、ゼニカル（Orlistat）若しくはCetilistat （ATL-962としても知られている）又はGT 389-255と類似しているリパーゼインヒビター類。
本開示の一つの態様は、低血糖症の治療に使用される本開示のグルカゴンアゴニストの予備処方水性液剤を対象とする。本明細書に記載されているアゴニスト組成物の向上した安定性及び／又は溶解は、迅速な投与及び低血糖症の治療のためのグルカゴンの予備処方水性液剤の調製を可能にする。したがって、一つの実施態様において、本発明のグルカゴンアゴニストを含む液剤が、低血糖症に罹患している患者に投与するために提供される。一つの実施態様において、本明細書に記載されているペグ化グルカゴンアゴニストを含む液剤が、低血糖症に罹患している患者に投与するために提供され、ここでペグ化グルカゴンアゴニストに結合しているＰＧＥ鎖の総分子量は、約５００〜約５，０００ダルトンである。一つの実施態様において、ペグ化グルカゴンアゴニストは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９、並びにそれらのグルカゴンアゴニスト類縁体、からなる群より選択されるペプチドを含み、ここで前記グルカゴンペプチドの１６、１７、２１，２４、若しくは２９位、若しくはＣ末端延長部内のアミノ酸残基の側鎖、又はＣ末端アミノ酸は、ポリエチレングリコール鎖に共有結合している。一つの実施態様において、ペグ化グルカゴンアゴニストは、配列番号１６のペプチドを含み、ここでペプチドの２１位のアミノ酸残基は、ポリエチレングリコールに共有結合している。一つの実施態様において、ペグ化グルカゴンアゴニストは、配列番号１７のペプチドを含み、ここでペプチドの２４位のアミノ酸残基は、ポリエチレングリコールに共有結合している。
低血糖症の治療が含まれるが、但しこれに限定されない、本発明による治療方法は、静脈内、腹腔内、皮下若しくは筋肉内のような非経口、鞘内、経皮、直腸内、経口、鼻腔内又は吸入を含む、任意の標準的投与経路を使用して、本開示のグルカゴンアゴニストを患者に投与する工程を含むことができる。一つの実施態様において、組成物は皮下又は筋肉内投与される。一つの実施態様において、組成物は非経口投与され、グルカゴン組成物はシリンジの中に包装される。別の実施態様において、組成物は、吸入器又は他のエアゾール化薬剤送達装置に予め包装されている。有利なことには、本明細書に開示されている水性安定化グルカゴン類縁体は、天然グルカゴンと比べて、薬理学的な目的に使用される最も広いｐＨ範囲の水性緩衝液中でより優れた安定性及び溶解性を示す。本明細書に開示されている安定化グルカゴン類縁体は、生理学的ｐＨでの長期間のグルカゴンアゴニスト溶液の調製及び保存を可能にする。
出願者たちは、親ペプチドの生体活性及び特異性を保持するペグ化グルカゴンペプチドを調製できることを発見していた。しかし、ＰＥＧ鎖の長さを増大して又は複数のＰＥＧ鎖をペプチドに結合して、結合ＰＥＧの総分子量が５，０００ダルトンを超えると、修飾グルカゴンの作用時間を遅延し始める。一つの実施態様によると、１つ以上のポリエチレングリコール鎖を含む、配列番号１１又は配列番号１３のグルカゴンペプチド又はそのグルカゴン類縁体が提供され、ここで結合ＰＥＧの総分子量は、５，０００ダルトンを超え、一つの実施態様では、１０，０００ダルトンを超えるが、４０，０００ダルトン未満である。そのような修飾グルカゴンペプチドは、活性の時間が遅くなるが、生体活性を失うことはない。したがって、そのような化合物を予防的に投与して、投与グルカゴンペプチドの効果を延ばすことができる。
１０，０００ダルトンを超える分子量を有するＰＥＧ鎖に共有結合するように修飾されたグルカゴンペプチドを、インスリンと一緒に投与して、糖尿病患者においてインスリン作用を緩衝すること、及び安定した血中グルコースレベルの維持を助けることができる。本開示の修飾グルカゴンペプチドは、インスリンと共に単一の組成物として同時投与することや、別々の液剤として同時に投与することもできるし、インスリンと修飾グルカゴンペプチドとを互いに異なる時点で投与することもできる。一つの実施態様において、インスリンを含む組成物及び修飾グルカゴンペプチドを含む組成物を、互いに１２時間以内に投与する。修飾グルカゴンペプチドと投与されたインスリンとの正確な比率は、部分的には患者のグルカゴンレベルを決定することによって決まり、慣用的な実験により決定することができる。
一つの実施態様によると、インスリンと、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、及びそれらのグルカゴンアゴニスト類縁体からなる群より選択される修飾グルカゴンペプチドとを含む組成物であって、修飾グルカゴンペプチドが、更に、１６、１７、２１、２４、２９位、若しくはＣ末端延長部内のアミノ酸、又はＣ末端アミノ酸の側鎖に共有結合しているポリエチレングリコール鎖を含む、組成物が提供される。一つの実施態様において、組成物は、インスリン及びグルカゴン類縁体を含む水性液剤である。グルカゴンペプチドが配列番号１１又は配列番号１３の配列を含む実施態様において、ペプチドは、更に、１６、１７、２１、２４、２９位、若しくはＣ末端延長部内のアミノ酸、又はＣ末端アミノ酸の側鎖に共有結合している、ポリエチレングリコール鎖を含む。一つの実施態様において、修飾グルカゴンペプチドのＰＥＧ鎖の分子量は、１０，０００ダルトンを超える。一つの実施態様において、ペグ化グルカゴンペプチドは、配列番号１１及び配列番号１３からなる群より選択されるペプチドを含み、前記グルカゴンペプチドの２１又は２４位のアミノ酸残基の側鎖は、ポリエチレングリコール鎖に共有結合している。一つの実施態様において、ポリエチレングリコール鎖は、約１０，０００〜約４０，０００の分子量を有する。
一つの実施態様によると、本明細書に開示されている修飾グルカゴンペプチドは、腸管の一過性麻痺の誘導に使用される。この方法は、放射線学の目的において有用性を有し、ペグ化グルカゴンペプチド、Ｃ末端延長部を含むグルカゴンペプチド、又はそのようなペプチドの二量体を含む医薬組成物の有効量を投与する工程を含む。一つの実施態様において、グルカゴンペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１３からなる群より選択される配列を含む。一つの実施態様において、グルカゴンペプチドは、更に、２１、２４若しくは２９位、若しくはＣ末端延長部内のアミノ酸残基、又はＣ末端アミノ酸に共有結合している、約１，０００〜４０，０００ダルトンのＰＥＧ鎖を含む。一つの実施態様において、グルカゴンペプチドは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７からなる群より選択される。一つの実施態様において、ＰＥＧ鎖は、約５００〜約５，０００ダルトンの分子量を有する。
更なる実施態様において、腸管の一過性麻痺を誘導するのに使用される組成物は、第１修飾グルカゴンペプチド及び第２修飾グルカゴンペプチドを含み、ここで、第１修飾ペプチドは、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１３からなる群より選択される配列を含み、更に、約５００〜約５，０００ダルトンのＰＥＧ鎖に結合していてもよく、第２ペプチドは、約１０，０００〜約４０，０００ダルトンの共有結合したＰＥＧ鎖を含む。この実施態様において、それぞれのペプチドのＰＥＧ鎖は、それぞれのペプチドの２１、２４若しくは２９位、若しくはＣ末端延長部内のアミノ酸残基、又はＣ末端アミノ酸に、互いに独立して、共有結合している。
小腸において見出された天然型の消化ホルモンであるオキシントモジュリンは、ラット又はヒトに投与されたときに減量を引き起こすことが報告されている（Diabetes 2005; 54:2390-2395を参照すること）。オキシントモジュリンは、グルカゴン（すなわち、配列番号１）の２９アミノ酸配列と、その後に続く配列番号２３（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）の８アミノ酸カルボキシ末端延長部とを有する、３７アミノ酸ペプチドである。したがって、出願者たちは、オキシントモジュリンのグルカゴンペプチド部分を本明細書に開示されている修飾グルカゴンペプチドで置換することによって、オキシントモジュリンの生体活性（すなわち、食欲抑制及び減量／体重維持の誘導）を保持しつつ、化合物の溶解性及び安定性を改善し、薬物動態を改善することができると考える。加えて、出願者たちは、また、本発明のグルカゴンペプチドを含み、オキシントモジュリンの４個の末端アミノ酸が除去されている、短縮型オキシントモジュリン分子もまた、食欲の抑制及び減量／体重維持の誘導に有効であると考える。
したがって、本発明は、配列番号２１（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）又は配列番号２２のカルボキシ末端延長部を有する本発明の修飾グルカゴンペプチドも包含する。一つの実施態様によると、グルカゴンペプチドのアミノ酸２９に結合している配列番号２１（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）又は配列番号２２のアミノ酸配列を更に含む、配列番号３３のグルカゴンアゴニスト類縁体は、減量を誘導する又は体重増加を予防するために個人に投与される。一つの実施態様によると、グルカゴンペプチドのアミノ酸２９に結合している配列番号２１（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）又は配列番号２２のアミノ酸配列を更に含む、配列番号１１又は配列番号１３のグルカゴンアゴニスト類縁体は、減量を誘導する又は体重増加を予防するために個人に投与される。別の実施態様において、個人において体重増加を低減する又は減量を誘導する方法は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５からなる群より選択されるグルカゴンペプチドを含むグルカゴンアゴニストを含む組成物の有効量を投与することを含み、ここで、グルカゴンペプチドのアミノ酸２９は、ペプチド結合を介して第２ペプチドに結合しており、前記第２ペプチドは、配列番号２４（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）又は配列番号２５の配列を含み、約１０，０００〜４０，０００ダルトンのＰＥＧ鎖は、２１及び／又は２４位のアミノ酸残基に共有結合している。一つの実施態様において、グルカゴンアゴニストのグルカゴンペプチドセグメンは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９からなる群より選択され、ここで約１，０００〜４０，０００ダルトンのＰＥＧ鎖は、１６、１７、２１、２４若しくは２９位、若しくはＣ末端延長部内のアミノ酸残基、又はＣ末端アミノ酸に共有結合している。
エキセンディン−４は、３９個のアミノ酸で構成されるペプチドである。これは、ＧＬＰ−１として知られている受容体に対する強力な刺激物質である。このペプチドもまた、食欲を抑制し、減量を誘導することが報告されている。出願者たちは、エキセンディン−４の末端配列が、グルカゴンのカルボキシ末端へ付加されたとき、グルカゴンの生体活性を損なうことなく、グルカゴンの溶解性及び安定性を改善することを見出した。一つの実施態様において、エキセンディン−４の１０個の末端アミノ酸（すなわち配列番号２０（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）の配列）は、本開示のグルカゴンペプチドのカルボキシ末端に結合している。特定の態様において、配列番号２０の配列は、グルカゴンペプチドのＣ末端に結合しており、２９位のアミノ酸は、Ｔｈｒ又はＧｌｙである。これらの融合タンパク質は、食欲を抑制し、減量／体重維持を誘導する薬理学的活性を有すると予測される。一つの実施態様において、配列番号２０延長部の末端アミノ酸は、カルボキシ基の代わりにアミド基を含み（すなわち、配列番号２３）、この配列は、本開示のグルカゴンペプチドのカルボキシ末端に結合している。
一つの実施態様において、個人において体重増加を低減する又は減量を誘導する方法は、配列番号３３のグルカゴンペプチドを含むグルカゴンアゴニストを含む組成物の有効量を投与することを含み、ここでグルカゴンペプチドのアミノ酸２９位は、ペプチド結合を介して第２ペプチドに結合しており、前記第２ペプチドは、配列番号２０（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）又は配列番号２３の配列を含む。一つの実施態様において、グルカゴンペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１３からなる群より選択され、ここで、グルカゴンペプチドのアミノ酸２９は、ペプチド結合を介して第２ペプチドに結合し、前記第２ペプチドは、配列番号２０（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）又は配列番号２３の配列を含む。一つの実施態様において、グルカゴンアゴニストのグルカゴンペプチドは、配列番号１１及び配列番号１３からなる群より選択される。一つの実施態様において、融合ペプチドのグルカゴンペプチドセグメントは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７からなる群より選択され、ここでＰＥＧ鎖の分子量は、５００〜４０，０００ダルトンの範囲から選択される。より詳細には、一つの実施態様において、融合ペプチドのグルカゴンペプチドは、配列番号１６及び配列番号１７からなる群より選択され、ここでＰＥＧ鎖の分子量は、１，０００〜５，０００の範囲から選択される。
別の実施態様において、食欲を抑制するため、体重増加を予防するため、及び／又は減量を誘導するために、第１ペグ化グルカゴン及び第２ペグ化グルカゴンペプチドを含む医薬組成物が患者に投与され、ここで第１及び第２ペプチドは、配列番号２０（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）又は配列番号２３を含むＣ末端ペプチド延長部を含む、融合ペプチドである。第１ペグ化グルカゴンペプチドは、約５００〜約１０，０００ダルトンの共有結合ＰＥＧを含み、第２ペグ化グルカゴンペプチドは、約１０，０００〜約４０，０００ダルトンの共有結合ＰＥＧ鎖を含む。
本開示は、本明細書に開示されている修飾グルカゴンペプチドの多量体も包含する。２つ以上の修飾グルカゴンペプチドを、標準的な結合剤及び当業者に既知の手順を使用して一緒に結合することができる。例えば、二量体は、２つの修飾グルカゴンペプチドから形成することができ、特にシステイン、リシン、オルチニン、ホモシステイン又はアセチルフェニルアラニン残基により置換されているグルカゴンペプチドでは、二官能チオール架橋剤及び二官能アミン架橋剤の使用を介して、形成することができる（例えば、配列番号４及び配列番号５）。二量体は、ホモ二量体であってもよいし、ヘテロ二量体であってもよい。一つの実施態様において、二量体は、グルカゴン融合ペプチドのホモ二量体を含み、ここでグルカゴンペプチド部分は、配列番号１１のアゴニスト類縁体と、グルカゴンペプチドのアミノ酸２９に結合している、配列番号２０（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号２１（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）、又は配列番号２２（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列とを含む。別の実施態様において、二量体は、配列番号１１のグルカゴンアゴニスト類縁体のホモ二量体を含み、ここでグルカゴンペプチドは、更に、グルカゴンペプチドの２１、２４、２９位、Ｃ末端延長部内、又はＣ末端のアミノ酸に共有結合している、ポリエチレングリコール鎖を含む。
一つの実施態様によると、リンカーを介して第２グルカゴンペプチドに結合している第１グルカゴンペプチドを含む二量体が提供され、ここで、第１グルカゴンペプチドは、配列番号１、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１からなる群より選択されるペプチドを含み、第２グルカゴンペプチドは配列番号３３を含む。更に、第２グルカゴンペプチドに関して、２８位のアミノ酸がアスパラギンであり、２９位のアミノ酸がトレオニンである場合、第２グルカゴンペプチドは、更に、第２グルカゴンペプチドのカルボンキシ末端に付加された１〜２個のアミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ又はＧｌｕからなる群より独立して選択される）を含み、前記グルカゴンポリペプチドの薬学的に許容される塩も提供される。
別の実施態様によると、リンカーを介して第２グルカゴンアンペプチドに結合している第１グルカゴンペプチドを含む二量体が提供され（ここで、前記第１グルカゴンペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１配列番号１２及び配列番号１３からなる群より選択され、第２グルカゴンペプチドは、配列番号１１及び配列番号１３からなる群より独立して選択される）、前記グルカゴンポリペプチドの薬学的に許容される塩も提供される。一つの実施態様において、第１グルカゴンペプチドは、配列番号７からなる群より選択され、第２グルカゴンペプチドは、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３からなる群より独立して選択される。一つの実施態様において、二量体は、それぞれのペプチドが配列番号１１のアミノ酸配列を含む、２つのペプチドによって形成される。
一つの実施態様によると、医薬組成物が提供され、組成物は本発明のグルカゴンアゴニスト類縁体又はその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含む。医薬組成物は、例えば以下の様な、任意の薬学的に許容される成分を含むことができる：酸化剤、添加剤、吸着剤、エアゾール噴射剤、排気剤、アルキル化剤、凝結防止剤、抗凝固剤、抗菌性保存剤、酸化防止剤、消毒剤、基剤、結合剤、緩衝剤、キレート剤、被覆剤、着色剤、乾燥剤、洗剤、希釈剤、殺菌剤、崩壊剤、分散剤、溶解促進剤、染料、緩和剤、乳化剤、乳化安定剤、充填剤、皮膜形成剤、風味強化剤、風味剤、流動性向上剤、ゲル化剤、造粒剤、保湿剤、潤滑剤、粘膜付着剤、軟膏基剤、軟膏、油性ビヒクル、有機基剤、芳香基剤、顔料、可塑剤、研磨剤、防腐剤、金属イオン封鎖剤、皮膚浸透剤、可溶化剤、溶媒、安定剤、坐薬基剤、表面活性剤、界面活性剤、懸濁剤、甘味剤、治療剤、増粘剤、等張化剤、毒性剤、粘度増加剤、吸水剤、水混和性共溶媒、硬水軟化剤、又は湿潤剤。
幾つかの実施態様において、医薬組成物は、以下の構成成分のうちの任意の１つ又は組み合わせを含む：アカシア、アセスルファムカリウム、アセチルトリブチルシトレート、アセチルトリエチルシトレート、寒天、アルブミン、アルコール、無水アルコール、変性アルコール、希アルコール、アロイリチン酸、アルギニン酸、脂肪族ポリエステル、アルミナ、水酸化アルミニウム、ステアリン酸アルミニウム、アミロペクチン、α−アミロース、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、アスパルテーム、注射用静菌性水、ベントナイト、ベントナイトマグマ、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、ブロノポール、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチルパラベン、ブチルパラベンナトリウム、アルギン酸カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、炭酸カルシウム、シクラミン酸カルシウム、無水第二リン酸カルシウム、脱水第二リン酸カルシウム、第三リン酸カルシウム、プロピオン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、ソルビン酸カルシウム、ステアリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸カルシウム半水和物、カノーラ油、カルボマー、二酸化炭素、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、β−カロテン、カラギーナン、ヒマシ油、硬化ヒマシ油、カチオン性乳化ロウ、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、エチルセルロース、微晶質セルロース、粉末セルロース、ケイ化微晶質セルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、セトステアリルアルコール、セトリミド、セチルアルコール、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、コレステロール、酢酸クロルヘキシジン、グルコン酸クロルヘキシジン、塩酸クロルヘキシジン、クロロジフルオロエタン（ＨＣＦＣ）、クロロジフルオロメタン、クロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）、クロロフェノキシエタノール、クロロキシレノール、コーンシロップ固形物、無水クエン酸、クエン酸一水和物、カカオ脂、着色剤、トウモロコシ油、綿実油、クレゾール、ｍ−クレゾール、ｏ−クレゾール、ｐ−クレゾール、クロスカメロースナトリウム、クロスポビドン、シクラミン酸、シクロデキストリン、デキストラン、デキストリン、デキストロース、デキストロース無水物、ジアゾリジニル尿素、フタル酸ジブチル、セバシン酸ジブチル、ジエタノールアミン、フタル酸ジエチル、ジフルオロエタン（ＨＦＣ）、ジメチル−β−シクロデキストリン、Captisol（登録商標）のようなシクロデキストリン型化合物、ジメチルエーテル、フタル酸ジメチル、エデト酸二カリウム、エデト酸二ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、ドキュセートカルシウム、ドキュセートカリウム、ドキュセートナトリウム、没食子酸ドデシル、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、エデト酸カルシウム二ナトリウム、エデト酸、エグルミン、エチルアルコール、エチルセルロース、没食子酸エチル、ラウリン酸エチル、エチルマルトール、オレイン酸エチル、エチルパラビン、エチルパラベンカリウム、エチルパラベンナトリウム、エチルバニリン、フルクトース、フルクトース液、粉砕フルクトース、発熱物質無含有フルクトース、粉末フルクトース、フマル酸、ゼラチン、グリコール、液状グルコース、飽和植物性脂肪酸のグリセリド混合物、グリセリン、ベヘン酸グリセリル、グリセリルモノオレエート、グリセリルモノステアレート、自己乳化グリセリルモノステアレート、グリセリルパルミトステアレート、グリシン、グリコール、グリコフロール、グアーガム、ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＣ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、高級フルクトースシロップ、ヒト血清アルブミン、炭化水素（ＨＣ）、希塩酸、ＩＩ型硬化植物油、ヒドロキシエチルセルロース、２−ヒドロキエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、イミド尿素、インジゴカルミン、イオン交換体、酸化鉄、イソプロピルアルコール、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、等張食塩水、カオリン、乳酸、ラクチトール、ラクトース、ラノリン、ラノリンアルコール、脱水ラノリン、レクチン、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、炭酸マグネシウム、規定炭酸マグネシウム、炭酸マグネシウム無水物、炭酸マグネシウム水酸化物、水酸化マグネシウム、ラウリル硫酸マグネシウム、酸化マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、三ケイ酸マグネシウム、三ケイ酸マグネシウム無水物、リンゴ酸、モルト、マルチトール、マルチトール溶液、マルトデキストリン、マルトール、マルトース、マンニトール、中鎖トリグリセリド、メグルミン、メントール、メチルセルロース、メタクリル酸メチル、オレイン酸メチル、メチルパラベン、メチルパラベンカリウム、メチルパラベンナトリウム、微晶質セルロース及びカルボキシメチルセルロースナトリウム、鉱油、軽鉱油、鉱油及びラノリンアルコール、油、オリーブ油、モノエタノールアミン、モンモリロナイト、没食子酸オクチル、オレイン酸、パルミチン酸、パラフィン、ヤシ油、ペトロラクタム、ペトロラクタム及びラノリンアルコール、製剤釉薬、フェール、液状フェノール、フェノキシエタノール、フェノキシプロパノール、フェニルエチルアルコール、酢酸フェニル水銀、ホウ酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、ポラクリリン、ポラクリリンカリウム、ポロキサマー、ポリデキストロース、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリアクリレート、ポリエチレン−ポリプロピレンブロックポリマー、ポリメタクリレート、ポリエチレンアルキルエーテル、ポリエチレンヒマシ油誘導体、ポリエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ポリエチレンステアレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、アルギン酸カリウム、安息香酸カリウム、重炭酸カリウム、重亜硫酸カリウム、塩化カリウム、クエン酸カリウム、クエン酸カリウム無水物、リン酸水素カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、リン酸二水素カリウム、プロピオン酸カリウム、ソルビン酸カリウム、ポビドン、プロパノール、プロピオン酸、プロピレンカーボネート、プロピレングリコール、アルギン酸プロピレングリコール、没食子酸プロピル、プロピルパラベン、プロピルパラベンカリウム、プロピルパラベンナトリウム、硫酸プロタミン、ナタネ油、リンゲル液、サッカリン、サッカリンアンモニウム、サッカリンカルシウム、サッカリンナトリウム、ベニバナ油、サポナイト、血清タンパク質、ゴマ油、コロイドシリカ、コロイド二酸化ケイ素、アルギン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、無水クエン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム脱水物、塩化ナトリウム、シクラミン酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、硫酸ドデシルナトリウム、硫酸ラウリルナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、第一リン酸ナトリウム、無水第三リン酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、フマル酸ステアリルナトリウム、亜硫酸ナトリウム、ソルビン酸、ソルビタンエステル（ソルビタン脂肪エステル）、ソルビトール、７０％ソルビトール溶液、ダイズ油、クジラロウ、デンプン、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルファ化デンプン、滅菌トウモロコシデンプン、ステアリン酸、精製ステアリン酸、ステアリルアルコール、スクロース、糖、圧縮性糖、粉糖、糖球体、転化糖、Sugartab、スーパーイエローＦＣＦ、合成パラフィン、タルク、酒石酸、タルトラジン、テトラフルオロエタン（ＨＦＣ）、カカオ脂、チメロサール、二酸化チタン、アルファトコフェロール、酢酸トコフェリル、アルファトコフェリル酸スクシネート、ベータ−トコフェロール、デルタ−トコフェロール、ガンマ−トコフェロール、トラガカント、トリアセチン、クエン酸トリブチル、トリエタノールアミン、クエン酸トリエチル、トリメチル−β−シクロデキストリン、トリメチルテトラデシルアンモニウムブロミド、トリス緩衝液、エデト酸三ナトリウム、バニリン、Ｉ型硬化植物油、水、軟水、硬水、二酸化炭素無含有水、発熱物質無含有水、注射用水、吸入用滅菌水、注射用滅菌水、潅注用滅菌水、ロウ、アニオン性乳化ロウ、カルナウバロウ、カチオン性乳化ロウ、セチルエステルロウ、微晶質ロウ、非イオン性乳化ロウ、坐剤用ロウ、白ロウ、黄ロウ、白色ペトロラクタム、羊毛脂、キサンタンガム、キシリトール、ゼイン、プロピオン酸亜鉛、亜鉛塩、ステアリン酸亜鉛、又はHandbook of Pharmaceutical Excipients, Third Edition, A. H. Kibbe (Pharmaceutical Press, London, UK, 2000）（その全体が参照として本明細書に組み込まれる）における任意の賦形剤。Remington's Pharmaceutical Sciences, Sixteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980）（その全体が参照として本明細書に組み込まれる）は、薬学的に許容される組成物の配合に使用される多様な構成成分及びそれらを調製する既知の技術を開示する。従来の作用物質のいずれについても、医薬組成物と不適合である場合を除いて、医薬組成物におけるその使用が考慮される。補助活性成分を組成物に組み込むこともできる。
本明細書に開示されている医薬製剤は、下記に記載されているように、短期作用、迅速放出、長期作用、又は持続的放出であるように設計することができる。医薬製剤を即時放出、制御放出又は徐放性放出として配合することもできる。本組成物は、更に、保存性及び／又は送達効果の延長をもたらすために、例えばミセル若しくはリポソーム、又は他の封入形態を含んでもよいし、或いは延長放出形態で投与してもよい。開示されている医薬製剤を、任意のレジメンに従って、例えば毎日（１日あたり１回、１日あたり２回、１日あたり３回、１日あたり４回、１日あたり５回、１日あたり６回）、２日毎に１回、３日毎に１回、４日毎に１回、５日毎に１回、６日毎に１回、毎週、隔週、３週間毎に１回、毎月、又は隔月に、投与することができる。
幾つかの実施態様において、前述の構成成分は、任意の濃度、例えば少なくともＡの濃度で医薬組成物に存在することができ、ここでＡは、０．０００１％w/v、０．００１％w/v、０．０１％w/v、０．１％w/v、１％w/v、２％w/v、５％w/v、１０％w/v、２０％w/v、３０％w/v、４０％w/v、５０％w/v、６０％w/v、７０％w/v、８０％w/v、又は９０％w/vである。幾つかの実施態様において、前述の構成成分は、任意の濃度、例えば最大でＢの濃度で医薬組成物に存在することができ、ここでＢは、９０％w/v、８０％w/v、７０％w/v、６０％w/v、５０％w/v、４０％w/v、３０％w/v、２０％w/v、１０％w/v、５％w/v、２％w/v、１％w/v、０．１％w/v、０．０１％w/v、０．００１％w/v、又は０．０００１％である。他の実施態様において、前述の構成成分は、例えば約Ａから約Ｂのような、任意の濃度範囲で医薬組成物に存在することができる。幾つかの実施態様において、Ａは０．０００１％であり、Ｂは９０％である。
医薬組成物は、生理学的に適合するｐＨを達成するように配合することができる。幾つかの実施態様において、医薬組成物のｐＨは、製剤又は投与経路に応じて、少なくとも５、少なくとも５．５、少なくとも６、少なくとも６．５、少なくとも７、少なくとも７．５、少なくとも８、少なくとも８．５、少なくとも９、少なくとも９．５、少なくとも１０、又は少なくとも１０．５からｐＨ１１以下であることができる。特定の実施態様において、医薬組成物は、生理学的に適合するｐＨを達成するために１つ以上の緩衝剤を含むことができる。緩衝剤には、所望のｐＨで緩衝することができる任意の化合物、例えば、リン酸緩衝液（例えばＰＢＳ）、トリエタノール、トリス、ビシン、ＴＡＰＳ、トリシン、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、カコジル酸、ＭＥＳ、及びその他が含まれていてもよい８。特定の実施態様において、緩衝液の強度は、少なくとも０．５mM、少なくとも１mM、少なくとも５mM、少なくとも１０mM、少なくとも２０mM、少なくとも３０mM、少なくとも４０mM、少なくとも５０mM、少なくとも６０mM、少なくとも７０mM、少なくとも８０mM、少なくとも９０mM、少なくとも１００mM、少なくとも１２０mM、少なくとも１５０mM、又は少なくとも２００mMである。幾つかの実施態様において、緩衝液の強度は、３００mM以下（例えば、最大で２００mM、最大で１００mM、最大で９０mM、最大で８０mM、最大７０mM、最大で６０mM、最大で５０mM、最大で４０mM、最大で３０mM、最大で２０mM、最大で１０mM、最大で５mM、最大で１mM）である。
一つの実施態様において、医薬組成物は、１mg/mlの濃度のグルカゴンアゴニスト類縁体及び１０〜５０mMのトリエタノールアミンとをｐＨ７．０〜８．５又は６〜９又は７〜９で含む。一つの実施態様において、医薬組成物は、１mg/mlの濃度のグルカゴンアゴニスト類縁体及び２０mMのトリエタノールアミンをｐＨ８．５で含む。
一つの実施態様によれば、本発明の修飾グルカゴンペプチドを、キットの一部として提供することができる。一つの実施態様において、グルカゴンアゴニストを、それを必要とする患者に投与するキットが提供され、ここでキットは、水溶液中に本発明のグルカゴンペプチドのいずれかを含む。そのようなキットに含まれる例示的なグルカゴンペプチドには、以下からなる群より選択されるグルカゴンペプチドが含まれる：１）配列番号７、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１３又は配列番号３３の配列を含むグルカゴンペプチド；２）配列番号１１又は配列番号１３又は配列番号３３のグルカゴンアゴニスト類縁体と、グルカゴンペプチドのアミノ酸２９に結合している配列番号２０（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号２１（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）又は配列番号２２（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列とを含む、グルカゴン融合ペプチド；並びに、３）配列番号１１又は配列番号１３、又は配列番号３３のペグ化グルカゴンペプチドであって、配列番号２０（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号２１（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）、又は配列番号２２（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列がアミノ酸２９に結合しており、１６、１７、２１、２４若しくは２９位、Ｃ末端延長部内、又はＣ末端アミノ酸に共有結合しているＰＥＧ鎖が約５００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する、グルカゴンペプチド。一つの実施態様において、キットは、患者にグルカゴン組成物を投与するための装置、例えば、注射針、ペン型注入器、ジェット式注射器、又は他の無針注射器を備える。キットは、代替的に又は追加的に、１つ以上の多様な容器、例えば、バイアル、チューブ、ボトル、単室又は複室型の充填済シリンジ、カートリッジ、輸液ポンプ（体外型又は埋め込み型）、ジェット式注射器、充填済ペン型装置、などを含んでもよく、更にそれらの中に、グルカゴンペプチドを、凍結乾燥形態又は水性液剤形態で含有してもよい。好ましくは、キットは使用説明書も含む。一つの実施態様によると、キットの装置は、エアゾール・ディスペンサーであり、ここで組成物はエアゾール装置内に予め包装されている。別の実施態様において、キットは、シリンジ及び針を含み、一つの実施態様において、滅菌されたグルカゴン組成物は、シリンジの中に予め包装されている。
本発明の化合物を、標準的な合成方法、組み換えＤＮＡ技術又はペプチド及び融合タンパク質を調製する他の任意の方法により調製することができる。特定の非天然アミノ酸は標準的な組み換えＤＮＡ技術により発現することはできないが、それらを調製する技術は当該技術において知られている。非ペプチド部分を包含する本発明の化合物を、適用可能であれば、標準的なペプチド化学反応に加えて、標準的な有機化学反応により合成することもできる。
〔実施例〕
一般的合成プロトコール：
グルカゴン類縁体を、改良Applied Biosystem 430 Aペプチド合成機により、０．２mmolのBoc Thr(OBzl)Pam樹脂から出発し、ＨＢＴＵ活性化「Ｆａｓｔ Ｂｏｃ」単一カップリングを使用して合成した。Ｂｏｃアミノ酸及びＨＢＴＵは、Midwest Biotech（Fishers, IN）から得た。使用した側鎖保護基は、Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）、Ｃｙｓ（ｐＭｅＢｚｌ）、Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）、Ｌｙｓ（２Ｃｌ−Ｚ）、Ｓｅｒ（ＯＢｚｌ）、Ｔｈｒ（ＯＢｚｌ）、Ｔｙｒ（２Ｂｒ−Ｚ）及びＴｒｐ（ＣＨＯ）であった。Ｎ末端Ｈｉｓの側鎖保護基はＢｏｃであった。
合成の完了したそれぞれのペプチジル樹脂を、ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンの溶液で処理して、トリプトファンからホルミル基を除去した。液体フッ化水素切断を、ｐ−クレゾール及びジメチルスルフィドの存在下で実施した。切断は、ＨＦ装置（Penninsula Labs）を使用して氷浴で１時間実施した。ＨＦを蒸発させた後、残渣をジエチルエーテルに懸濁し、固体物質を濾過した。ペプチドをそれぞれ３０〜７０mlの酢酸水溶液に抽出し、希釈したアリコートをＨＰＬＣ〔Beckman System Gold、０．４６×５cmのZorbax C8、１ml／分、４５Ｃ、２１４nm、Ａ緩衝液＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％アセトニトリル、１０分間かけて１０％から８０％Ｂの勾配〕により分析した。
精製を２．２×２５cmのKromasil C18カラムのＦＰＬＣにより実施し、その間、２１４nmのＵＶでモニタリングし、５分毎の画分を収集した。均質画分をまとめ、凍結乾燥して、生成物純度＞９５％を得た。正確な分子量及び純度は、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析を使用して確認した。
一般的ペグ化プロトコール：（Ｃｙｓ−マレイミド）
典型的には、グルカゴンＣｙｓ類縁体をリン酸緩衝食塩水（５〜１０mg/ml）に溶解し、０．０１Mエチレンジアミン四酢酸を加える（総容量の１０〜１５％）。過剰（２倍）マレイミドメトキシＰＥＧ試薬（Nektar）を加え、反応を室温で撹拌し、その間、ＨＰＬＣで反応進行をモニタリングする。８〜２４時間後、反応混合物を酸性化し、精製のために、０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル勾配を使用する分取逆相カラムに装填する。適切な画分をまとめ、凍結乾燥して、所望のペグ化類縁体を得た。
＜実施例１＞
グルカゴンＣｙｓ17（１−２９）及び同様のモノＣｙｓ類縁体の合成
６０mlの反応容器中の０．２mmolのBoc Thr(OBzl) Pam樹脂（SynChem Inc）及び以下の配列を改良Applied Biosystems 430A Peptide Synthesizerに入れ、ＦａｓｔＢｏｃ ＨＢＴＵ活性化単一カップリングを使用して合成を行った。
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＣＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ（配列番号２７）
以下の側鎖保護基を使用した：Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ｃｙｓ（ｐＭｅＢｚｌ）、Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）、Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）、Ｌｙｓ（２Ｃｌ−Ｚ）、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｒｐ（ＣＨＯ）及びＴｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）。合成の完了したペプチジル樹脂を２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミドで処理して、Ｔｒｐホルミル保護を除去し、次にＨＦ反応容器に移し、真空下で乾燥した。１．０mlのｐ−クレゾール及び０．５mlのジメチルスルフィドを、磁気式撹拌バーと共に加えた。容器をＨＦ装置（Pennisula Labs）に取り付け、ドライアイス／メタノール浴で冷却し、排気し、およそ１０mlの液体フッ化水素を圧入した。反応を氷浴で１時間撹拌し、次にＨＦを減圧留去した。残渣をエチルエーテルに懸濁し、固体を濾過し、エーテルで洗浄し、ペプチドを５０mlの酢酸水溶液に抽出した。分析ＨＰＬＣ〔０．４６×５cmのZorbax C8、１ml／分、４５Ｃ、２１４nm、Ａ緩衝液は０．１％ＴＦＡ、Ｂ緩衝液は０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、１０分間かけて１０％Ｂから８０％Ｂの勾配〕を少量の切断抽出物試料により実施した。残りの抽出物を２．２×２５cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填し、Pharmacia FPLC系を使用してアセトニトリル勾配を実施した。５分毎の画分を収集し、その間、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリル。勾配＝４５０分間かけて３０％Ｂから１００％Ｂ。
最高純度の生成物を含有する画分（４８−５２）をまとめ、冷凍及び凍結乾燥して、３０．１mgを得た。生成物のＨＰＬＣ分析は、＞９０％の純度を示し、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、所望の質量の３４２９．７を示した。グルカゴンＣｙｓ21、グルカゴンＣｙｓ24及びグルカゴンＣｙｓ29を同様に調製した。
＜実施例２＞
グルカゴン−Ｃｅｘ及び他のＣ末端延長部類縁体の合成
２８５mg（０．２mmol）のメトキシベンズヒドリルアミン樹脂（Midwest Biotech）を６０mlの反応容器に入れ、以下の配列を改良Applied Biosystems 430Aペプチド合成機に入れ、ＦａｓｔＢｏｃ ＨＢＴＵ活性化単一カップリングを使用して合成を行った。
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号２８）
以下の側鎖保護基を使用した：Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ｃｙｓ（ｐＭｅＢｚｌ）、Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）、Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）、Ｌｙｓ（２Ｃｌ−Ｚ）、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｒｐ（ＣＨＯ）及びＴｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）。合成の完了したペプチジル樹脂を２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミドで処理して、Ｔｒｐホルミル保護を除去し、次にＨＦ反応容器に移し、真空下で乾燥した。１．０mlのｐ−クレゾール及び０．５mlのジメチルスルフィドを、磁気式撹拌バーと共に加えた。容器をＨＦ装置（Pennisula Labs）に取り付け、ドライアイス／メタノール浴で冷却し、排気し、およそ１０mlの液体フッ化水素を圧入した。反応を氷浴で１時間撹拌し、次にＨＦを減圧留去した。残渣をエチルエーテルに懸濁し、固体を濾過し、エーテルで洗浄し、ペプチドを５０mlの酢酸水溶液に抽出した。分析ＨＰＬＣ〔０．４６×５cmのZorbax C8、１ml／分、４５Ｃ、２１４nm、Ａ緩衝液は０．１％ＴＦＡ、Ｂ緩衝液は０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、１０分間かけて１０％Ｂから８０％Ｂの勾配〕を切断抽出物のアリコートにより実施した。残りの抽出物を２．２×２５cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填し、Pharmacia FPLC系を溶出に使用してアセトニトリル勾配を実施した。５分毎の画分を収集し、その間、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリル。勾配＝４５０分間かけて３０％Ｂから１００％Ｂ。画分５８−６５を合わせ、冷凍及び凍結乾燥して、１９８．１mgを得た。
生成物のＨＰＬＣ分析は、９５％を超える純度を示した。ＭＡＤＩ質量スペクトル分析は、Ｃ末端アミドとして、所望の理論質量の４３１６．７を有する生成物の存在を示した。オキシントモジュリン及びオキシントモジュリン−ＫＲＮＲを、適切な装填ＰＡＭ樹脂から出発して、Ｃ末端カルボン酸として同様に調製した。
＜実施例３＞
グルカゴンＣｙｓ17Ｍａｌ−ＰＥＧ−５Ｋ
１５．１mgのグルカゴンＣｙｓ17（１−２９）及び２７．３mgの平均分子量５０００のメトキシポリ（エチレングリコール）マレイミド（ｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００、Nektar Therapeutics）を、３．５mlのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、０．５mlの０．０１Mエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を加えた。反応を室温で撹拌し、反応の進行をＨＰＬＣ分析〔０．４６×５cmのZorbax C8、１ml／分、４５Ｃ、２１４nm（０．５A）、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、勾配＝１０分間かけて１０％Ｂから８０％Ｂ〕によりモニターした。
５時間後、反応混合物を２．２×２５cmのKromasil C18分取逆送カラムに装填した。アセトニトリル勾配をPharmacia FPLCにより実施し、その間、２１４nmのＵＶ波長でモニタリングし、５分毎の画分を収集した。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリル、勾配＝４５０分間かけて３０％Ｂから１００％Ｂ。生成物に対応する画分をまとめ、冷凍及び凍結乾燥して、２５．９mgを得た。
この生成物をＨＰＬＣ〔０．４６×５cmのZorbax C8、１ml／分、４５Ｃ、２１４nm（０．５A）、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、勾配＝１０分間かけて１０％Ｂから８０％Ｂ〕により分析し、およそ９０％の純度を示した。ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）質量スペクトル分析は、８７００〜９５００の（ＰＥＧ誘導体に典型的な）広い質量範囲を示した。これは、出発グルカゴンペプチドの質量（３４２９）へのおよそ５，０００amuの追加を示す。
＜実施例４＞
グルカゴンＣｙｓ21Ｍａｌ−ＰＥＧ−５Ｋ
２１．６mgのグルカゴンＣｙｓ21（１−２９）及び２４mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００（Nektar Therapeutics）を、３．５mlのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、０．５mlの０．０１Mエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を加えた。反応を室温で撹拌した。２時間後、更なる１２．７mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００を加えた。８時間後、反応混合物を２．２×２５cmのVydac C18分取逆相カラムに装填し、アセトニトリル勾配を４ml／分のPharmacia FPLCにより実施し、その間、５分毎の画分を収集した。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ。勾配＝４５０分間かけて２０％から８０％Ｂ。
表れた生成物に対応する画分をまとめ、冷凍及び凍結乾燥して、３４mgを得た。分析ＨＰＬＣ〔０．４６×５cmのZorbax C8、１ml／分、４５Ｃ、２１４nm（０．５A）、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、勾配＝１０分間かけて１０％Ｂから８０％Ｂ〕によるこの生成物の分析は、出発グルカゴンペプチドと異なる均質な生成物を示した。ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）質量スペクトル分析は、８７００〜９７００の（ＰＥＧ類縁体に典型的な）広い質量範囲を示した。これは、出発グルカゴンペプチドの質量（３４７０）へのおよそ５，０００amuの追加を示す。
＜実施例５＞
グルカゴンＣｙｓ24Ｍａｌ−ＰＥＧ−５Ｋ
２０．１mgのグルカゴンＣ24（１−２９）及び３９．５mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００（Nektar Therapeutics）を、３．５mlのＰＢＳに撹拌しながら溶解し、０．５mlの０．０１M ＥＤＴＡを加えた。反応を室温で７時間撹拌し、次に更なる４０mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００を加えた。およそ１５時間後、反応混合物を、２．２×２５cmのVydac C18分取逆相カラムに装填し、アセトニトリル勾配を、Pharmacia FPLCを使用して実施した。５分毎の画分を収集し、その間、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。Ａ緩衝液＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ緩衝液＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ、勾配＝４５０分間かけて３０％Ｂから１００％Ｂ。生成物に対応する画分をまとめ、冷凍及び凍結乾燥して、４５．８mgを得た。ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、最大９１７５．２の典型的なＰＥＧ広域信号を示し、これはグルカゴンＣ24（３４５７．８）よりもおよそ５，０００amu多い。
＜実施例６＞
グルカゴンＣｙｓ24Ｍａｌ−ＰＥＧ−２０Ｋ
２５．７mgのグルカゴンＣ24（１−２９）及び４０．７mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−２０Ｋ（Nektar Therapeutics）を、３．５mlのＰＢＳに撹拌しながら室温で溶解し、０．５mlの０．０１M ＥＤＴＡを加えた。６時間後、出発物質と生成物の比率は、ＨＰＬＣにより決定すると、およそ６０：４０であった。更なる２５．１mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−２０Ｋを加え、反応を更に１６時間撹拌した。生成物比率が有意に改善されなかったので、反応混合物を、２．２×２５cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填し、４５０分かけて３０％Ｂから１００％Ｂへの勾配を使用するPharmacia FPLCにより精製した。Ａ緩衝液＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ緩衝液＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ、流量＝４ml／分、５分毎の画分を収集し、その間、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。均質な生成物を含有する画分をまとめ、冷凍及び凍結乾燥して、２５．７mgを得た。分析ＨＰＬＣにより決定された純度は約９０％であった。ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、２３，０００〜２７，０００の広域のピークを示し、これは出発グルカゴンＣ24（３４５７．８）よりもおよそ２０，０００amu多い。
＜実施例７＞
グルカゴンＣｙｓ29Ｍａｌ−ＰＥＧ−５Ｋ
２０．０mgのグルカゴンＣｙｓ29（１−２９）及び２４．７mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００（Nektar Therapeutics）を、３．５mlのＰＢＳに撹拌しながら室温で溶解し、０．５mlの０．０１M ＥＤＴＡを加えた。４時間後、更なる１５．６mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００を加えて、反応の完了を促進した。８時間後、反応混合物を、２．２×２５cmのVydac C18分取逆相カラムに装填し、アセトニトリル勾配を、Pharmacia FPLC系により実施した。５分毎の画分を収集し、その間、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ。画分７５−９７を合わせ、冷凍及び凍結乾燥して、ＨＰＬＣにより回収された出発物質（画分５８−６３）と異なる、４０．０mgの生成物を得た。分析ＨＰＬＣ〔０．４６×５cmのZorbax C8、１ml／分、４５Ｃ、２１４nm（０．５A）、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、勾配＝１０分間かけて１０％Ｂから８０％Ｂ〕によるこの生成物の分析は、９５％を超える純度を示した。ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、８，０００〜１０，０００（最大９０２５．３）の範囲の質量を有するＰＥＧ成分の存在を示し、これは出発物質（３４８４．８）よりも５，５４０amu多い。
＜実施例８＞
グルカゴンＣｙｓ24（２−ブチロラクトン）
２４．７mgのグルカゴンＣｙｓ24（１−２９）に、４mlの０．０５M重炭酸アンモニウム／５０％アセトニトリル及び５．５ulの２−ブロモ−４−ヒドロキシ酪酸−γ−ラクトンの溶液（アセトニトリル９００ul中１００ul）を加えた。室温で３時間撹拌した後、更なる１０５ulのラクトン溶液を反応混合物に加え、更に１５時間撹拌した。反応混合物を、１０％酢酸水溶液で１０mlに希釈し、２．２×２５cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填した。アセトニトリル勾配（４５０分かけて２０％Ｂから８０％Ｂ）をPharmacia FPLCにより実施し、その間、５分毎の画分を収集し、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。流量＝４ml／分、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ。画分７４−７７を合わせ、冷凍及び凍結乾燥して、７．５mgを得た。ＨＰＬＣ分析は、９５％の純度を示し、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、３５４０．７の質量又は出発物質よりも８４質量単位多い質量を示した。この結果は、単一ブチロラクトン部分の付加と一致している。
＜実施例９＞
グルカゴンＣｙｓ24（Ｓ−カルボキシメチル）
１８．１mgのグルカゴンＣｙｓ24（１−２９）を、９．４mlの０．１Mリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝９．２）に溶解し、０．６mlのブロモ酢酸溶液（アセトニトリル中１．３mg/ml）を加えた。反応を室温で撹拌し、反応の進行を分析ＨＰＬＣにより追跡した。１時間後、更なる０．１mlのブロモ酢酸溶液を加えた。反応を更に６０分間撹拌し、酢酸水溶液で酸性化し、精製のために２．２×２５cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填した。アセトニトリル勾配をPharmacia FPLC（流量＝４ml／分）により実施し、その間、５分毎の画分を収集し、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ。画分２６−２９を合わせ、冷凍及び凍結乾燥して、数mgの生成物を得た。分析ＨＰＬＣは、９０％の純度を示し、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、所望の生成物の質量３５１５を確認した。
Figure 2015147791
＜実施例１０＞
グルカゴンＣｙｓ24マレイミド，ＰＥＧ−３．４Ｋ−二量体
１６mgのグルカゴンＣｙｓ24及び１．０２mgのＭａｌ−ＰＥＧ−Ｍａｌ−３４００、平均分子量３４００のポリ（エチレングリコール）−ビス−マレイミド（Nektar Therpeutics）を、３．５ のリン酸緩衝食塩水及び０．５mlの０．０１M ＥＤＴＡに溶解し、反応を室温で撹拌した。１６時間後、更なる１６mgのグルカゴンＣｙｓ24を加え、撹拌を続けた。およそ４０時間後、反応混合物をPharmcia PepRPC 16/10カラムに装填し、アセトニトリル勾配をPharmacia FPLCにより実施し、その間、２分毎の画分を収集し、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。流量＝２ml／分、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ。画分６９−７４を合わせ、冷凍及び凍結乾燥して、１０．４mgを得た。分析ＨＰＬＣは、９０％の純度を示し、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、９５００〜１１，０００の範囲の成分を示し、これは所望の二量体と一致する。
Figure 2015147791
＜実施例１１＞
グルカゴン溶解性アッセイ：
グルカゴン（又は類縁体）の溶液（１mg/ml又は３mg/ml）を０．０１NのＨＣｌで調製する。１００ulの原液を、０．０１NのＨＣｌで１mlに希釈し、ＵＶ吸光度（２７６nm）を決定する。残りの原液のｐＨを、２００〜２５０ulの０．１M Ｎａ2ＨＯＰ4（ｐＨ９．２）を使用して、ｐＨ７に調整する。溶液を４℃で一晩放置し、次に遠心分離する。次に１００ulの上澄みを、０．０１NのＨＣｌで１mlに希釈し、ＵＶ吸光度を決定する（２回繰り返す）。
初期吸光度の読み取りを容量の増加で補正し、以下の計算を使用して、溶解率を確立する。
最終吸光度／初期吸光度×１００＝溶解率
結果を表１に示し、表中、グルカゴン−Ｃｅｘは、野生型グルカゴン（配列番号１）＋配列番号２０のカルボキシ末端付加を表し、グルカゴン−Ｃｅｘ Ｒ12は、配列番号１を表し、ここで、１２位のＬｙｓはＡｒｇで置換されており、配列番号２０のペプチドはカルボキシ末端に付加されている。
表１ グルカゴン類縁体の溶解度データ
Figure 2015147791
グルカゴン類縁体のＤ２８、Ｅ２９、Ｅ３０、Ｅ１５Ｄ２８、Ｄ２８Ｅ３０、Ｄ２８Ｅ２９の溶解性を、表１に提示された化合物に使用したものと同じアッセイを使用して調査した。データ（図３及び４に示されている）は、ｐＨ値５．５及び７．０において天然グルカゴンと比べてＤ２８、Ｅ２９、Ｅ３０、Ｅ１５Ｄ２８、Ｄ２８Ｅ３０、Ｄ２８Ｅ２９類縁体の優れた溶解性を示す。図３に表されているデータは、２５℃で６０時間後に測定された溶解度を表し、一方、図４に表されているデータは、２５℃で２４時間後、次に４℃で２４時間後に測定した溶解度を表す。図５は、グルカゴン類縁体のＤ２８、Ｄ２８Ｅ３０及びＥ１５Ｄ２８の最大溶解度に関するデータを表す。
＜実施例１２＞
グルカゴン受容体結合アッセイ
グルカゴン受容体へのペプチドの親和性を、シンチレーション近接アッセイ技術を利用する競争結合アッセイにより測定した。シンチレーション近接アッセイ緩衝液（０．０５Mのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１５MのＮａＣｌ、０．１％w/vのウシ血清アルブミン）により作製したペプチドの一連の３倍希釈を、９６ウエル白色／透明底プレート（Corning Inc., Acton, MA）において、０．０５nMの（３−〔125Ｉ〕−ヨードチロシル）Ｔｙｒ１０グルカゴン（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）、１ウエルあたり１〜６マイクログラムの、ヒトグルカゴン受容体を過剰発現している細胞から調製した原形質膜画分及び１mg／ウエルのポリエチレンイミン処理ムギ胚芽凝集素Ａ型シンチレーション近接アッセイビーズ（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）と混合した。ロータリー振とう器により８００rpmで５分間振とうしてから、プレートを室温で１２時間インキュベートし、次にMicroBeta1450液体シンチレーションカウンター（Perkin-Elmer, Wellesley, MA）で読み取った。非特異的結合（ＮＳＢ）放射能をウエルで測定し、試験試料の最高濃度よりも４倍高い濃度の「非放射性」天然リガンドを有し、総結合放射能をウエルで検出し、競合物質がなかった。特異的結合の率を以下のように計算した：特異的結合率＝（（結合−ＮＳＢ）／（総結合−ＮＳＢ））×１００。ＩＣ50値は、Origin software（OriginLab, Northampton, MA）を使用して決定した。
＜実施例１３＞
機能アッセイ−ｃＡＭＰ合成
ｃＡＭＰを誘導するグルカゴン類縁体の能力を、ホタルルシフェラーゼに基づいたレポーターアッセイにより測定した。グルカゴン受容体又はＧＬＰ−１受容体のいずれかと、ｃＡＭＰ応答配列に結合したルシフェラーゼ遺伝子とを同時形質移入されたＨＥＫ２９３細胞から、０．２５％ウシ増殖血清（HyClone, Logan, UT）が補充されたＤＭＥＭ（Invitrogen, Carlsbad, CA）における１６時間の培養により血清を取り除き、次にグルカゴン、ＧＬＰ−１又は新規グルカゴン類縁体のいずれかによる一連の希釈と共に、９６ウエルポリ−Ｄ−リシン被覆「バイオコート」プレート（BD Biosciences, San Jose, CA）において３７℃、５％ＣＯ2で５時間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、１００マイクロリットルのLucLiteルミネセンス基質試薬（Perkin-Elmer, Wellesley, MA）を各ウエルに加えた。プレートを短時間振とうし、暗黒で１０分間インキュベートし、発光をMicroBeta-1450液体シンチレーションカウンター（Perkin-Elmer, Wellesley, MA）で測定した。ルミネセンス発光は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性化を示し、これは受容体の活性化の測度である。有効５０％濃度（「ＥＣ５０」）は、Origin software（OriginLab, Northampton, MA）を使用して計算した。結果を表２及び３に示す。ＥＣ５０は、示された受容体に対するペプチドの最大活性化反応の５０％を生じるペプチドの濃度である。比較的低いＥＣ５０は、ペプチドがその受容体に対して相対的により効力があることを示し、一方、高いＥＣ５０は、ペプチドの効力が弱いことを示す。
表２ Ｃ末端延長部を有するグルカゴン類縁体によるｃＡＭＰ誘導
Figure 2015147791
表３ ペグ化グルカゴン類縁体によるｃＡＭＰ誘導
Figure 2015147791
追加のグルカゴン類縁体のデータを、図６〜９及び表４に表す。
表４ グルカゴン受容体を過剰発現する細胞において観察されたＥＣ５０（nM）
Figure 2015147791
図１１は、次の修飾：Ｔ１６、Ａ２０、Ｅ２１、Ａ２４、Ｎｌｅ２７、Ｄ２８及びＥ２９（配列番号５６）を有するグルカゴン類縁体のグルカゴン及びＧＬＰ−１受容体に対するｃＡＭＰ誘導についてのデータを示す。データは、複数の修飾（７つの置換）を含有するグルカゴン類縁体が実質的にグルカゴン活性を保持することを示す。
＜実施例１４＞
グルカゴンＣｙｓ−マレイミドＰＥＧ類縁体の安定性アッセイ
各グルカゴン類縁体を水又はＰＢＳに溶解し、初期ＨＰＬＣ分析を実施した。ｐＨを調整した後（４、５、６、７）、試料を３７℃で特定の時間インキュベートし、ＨＰＬＣにより再び分析して、ペプチドの完全性を決定した。特定の目的のペプチドの濃度を決定し、無傷まま残っている率を初期分析と比較して計算した。グルカゴンＣｙｓ21−マレイミドＰＥＧ5Kの結果を図１及び２に示す。
＜実施例１５＞
グルカゴンラムタムの合成
２８５mg（０．２mmol）のメトキシベンズヒドリルアミン樹脂（Midwest Biotech）を６０mLの反応容器に入れ、以下の配列を、Ｂｏｃ ＤＥＰＢＴ活性化単一カップリングを使用する改良Applied Biosystems 430Aペプチド合成機により組み立てた。
以下の側鎖保護基を使用した：Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｘ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ｇｌｕ（ＯＦｍ）、Ｈｉｓ（ＢＯＭ）、Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｒｐ（ＣＨＯ）、Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）。例として、ラクタムが１６−２０、２０−２４又は２４−２８により構成される場合、Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）を使用して１２位の天然Ｌｙｓを保護した。合成の完了したペプチジル樹脂を２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミドにより回転しながら１時間処理して、Ｔｒｐホルミル基を、並びにＬｙｓ１２及びＧｌｕ１６からＦｍｏｃ及びＯＦｍ保護を除去した。陽性ニンヒドリン試験により除去を確認してから、樹脂をジメチルホルムアミド、続いてジクロロメタン、次に再びジメチルホルムアミドで洗浄した。樹脂を、ジメチルホルムアミド及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）中のベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）の５２０mg（１mmol）で処理した。反応は８〜１０時間進行し、環化は、陰性ニンヒドリン試験により確認した。樹脂を、ジメチルホルムアミド、続いてジクロロメタンで洗浄し、その後トリフルオロ酢酸で１０分間処理した。Ｂｏｃ基の除去は、陽性ニンヒドリン反応より確認した。樹脂を、ジメチルホルムアミド及びジクロロメタンで洗浄し、フッ化水素酸（ＨＦ）反応容器に移す前に乾燥した。５００μLのｐ−クレゾールを、磁気式撹拌バーと共に加えた。容器をＨＦ装置（Pennisula Labs）に取り付け、ドライアイス／メタノール浴で冷却し、排気し、およそ１０mLの液体フッ化水素を容器の中に圧入した。反応を氷浴で１時間撹拌し、次にＨＦを減圧留去した。残渣をエチルエーテルに懸濁し、固体を濾過し、エーテルで洗浄し、ペプチドを１５０mLの２０％アセトニトリル／１％酢酸に溶解した。
粗溶解ペプチドの分析ＨＰＬＣによる分析を次の条件〔０．４６×３０mmのXterra C8、１．５０mL／分、２２０nm、Ａ緩衝液は０．１％ＴＦＡ／１０％ＡＣＮ、Ｂ緩衝液は０．１％ＴＦＡ／１００％ＡＣＮ、１５分間かけて５〜９５％Ｂの勾配〕で実施した。抽出物を水で２倍に希釈し、２．２×２５cm Vydac C4分取逆相カラムに装填し、WatersＨＰＬＣ系（Ａ緩衝液は０．１％ＴＦＡ／１０％ＡＣＮ、Ｂ緩衝液は０．１％ＴＦＡ／１０％ＡＣＮ及び流量１５．００ml／分で１２０分間かけて０〜１００％Ｂの勾配）によりアセトニトリル勾配を使用して溶出した。精製ペプチドのＨＰＬＣ分析は、９５％を超える純度を示し、エレクトロスプレーイオン化質量スペクトル分析は、１２−１６ラクタムで３５０６Daの質量を確認した。１６−２０、２０−２４及び２４−２８のラクタムを同様に調製した。
＜実施例１６＞
例示的ペプチド
以下の配列を有するグルカゴンペプチドを本明細書に一般的に記載されているように構成した：
ＸＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＲＡＫＤＦＶＣ*ＷＬＭＮＴ（ラクタム＠１６−２０）（配列番号４０）
ここで、Ｘ＝ＤＭＩＡであり、Ｃ*はＰＥＧに結合しているＣｙｓである。
ＸＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＲＡＫＤＦＶＡＷＬＭＮＣ*（ラクタム＠１６−２０）（配列番号４１）
ここで、Ｘ＝ＤＭＩＡ、Ｑ２４Ａであり、Ｃ*はＰＥＧに結合しているＣｙｓである。
Ｘ１ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＲＡＫＤＦＶＣ*ＷＬＸ２ＮＴ（ラクタム＠１６−２０）（配列番号４２）
ここで、Ｘ１＝ＤＭＩＡであり、Ｘ２は、Ｎｌｅ又はＬｅｕであり、Ｃ*は、ＰＥＧに結合しているＣｙｓである。
Ｘ１ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＲＡＫＤＦＶＡＷＬＸ２ＮＣ*（ラクタム＠１６−２０）（配列番号４３）
ここで、Ｘ１＝ＤＭＩＡ、Ｑ２４Ａであり、Ｘ２は、Ｎｌｅ又はＬｅｕであり、Ｃ*は、ＰＥＧに結合しているＣｙｓである。
配列１に以下の修飾を有するグルカゴンペプチドを、本明細書に一般的に記載されているように構成した：
Ａ２０，Ａ２４，Ｎｌｅ２７，Ｄ２８（配列番号４４）
Ａ２０，Ａ２４，Ｎｌｅ２７，Ｄ２８，Ｅ２９（配列番号４５）
Ａ２０，Ａ２４，Ｎｌｅ２７，Ｄ２８，Ｅ３０（配列番号４６）
Ａ２０，Ａ２４，Ｎｌｅ２７，Ｅ２８，Ｅ２９（配列番号４７）
Ａ２０，Ａ２４，Ｎｌｅ２７，Ｅ２８，Ｅ３０（配列番号４８）
Ａ２０，Ａ２４，Ｎｌｅ２７，Ｅ２９，Ｅ３０（配列番号４９）
Ａ２０，Ｅ２１，Ａ２４，Ｎｌｅ２７，Ｄ２８（配列番号５０）
Ａ２０，Ｅ２１，Ａ２４，Ｎｌｅ２７，Ｄ２８，Ｅ２９（配列番号５１）
Ａ２０，Ｅ２１，Ａ２４，Ｎｌｅ２７，Ｄ２８，Ｅ３０（配列番号５２）
Ａ２０，Ｅ２１，Ａ２４，Ｎｌｅ２７，Ｅ２８，Ｅ２９（配列番号５３）
Ａ２０，Ｅ２１，Ａ２４，Ｎｌｅ２７，Ｅ２８，Ｅ３０（配列番号５４）
Ａ２０，Ｅ２１，Ａ２４，Ｎｌｅ２７，Ｅ２９，Ｅ３０（配列番号５５）
あるいは、これらのペプチドのいずれかは、Ａ２０及び／又はＡ２４置換の代わりにＡＩＢ２０及び／又はＡＩＢ２４を含むことができる。
これらのペプチドのいずれも、更にＴ１６又はＡＩＢ１６アミノ酸置換を含むことができる。例えば、Ｔ１６，Ａ２０，Ｅ２１，Ａ２４，Ｎｌｅ２７，Ｄ２８，Ｅ２９（配列番号５６）を構成した。
配列１に以下の修飾を有するグルカゴンペプチドを、本明細書に一般的に記載されているように構成した：ＤＭＩＡ１，Ｅ１６，Ｋ２０−グルカゴン−ＣＯＯＨ（Ｃ２４−ＰＥＧ、Ｅ１６〜Ｋ２０ラクタム）、その配列を下記に記載する：
ＤＭＩＡ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ*−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＣＯＯＨ（ここで、２４位のＣｙｓ*は、分子量が約４０，０００ダルトンのＰＥＧに結合しており、１６位のＧｌｕ及び２０位のＬｙｓは、ラクタム架橋を介して結合している）（配列番号４０）。このペプチドを実施例１３に一般的に従って、グルカゴン及びＧＬＰ−１受容体に対する活性について試験した。ペプチドは、天然グルカゴンの２７．７％の効力及び天然ＧＬＰ−１の１．１％の効力を示した。
＜実施例１７＞
アシル化及び／又はペグ化ペプチドの調製
アシル化及び／又はペグ化ペプチドを以下のように調製する。ペプチドは、CS Bio 4886 Peptide Synthesizer又はApplied Biosystems 430A Peptide Synthesizerのいずれかを使用して、固体支持樹脂上に合成する。Schnolzer et al., Int. J. Peptide Protein Res. 40: 180-193（1992）に記載されている現場中和化学を使用する。アシル化ペプチドでは、アシル化される標的アミノ酸残基（例えば、１０位）をＮε−ＦＭＯＣリシン残基で置換する。ＤＭＦ中の２０％ピペリジンによる完全Ｎ末端ＢＯＣ保護ペプチドの３０分間の処理によって、ＦＭＯＣ／ホルミル基を除去する。遊離ε−アミノＬｙｓ残基へのカップリングは、ＦＭＯＣ保護スペーサーアミノ基（例えば、ＦＭＯＣ−（Ｎ−ＢＯＣ）−トリプトファン−ＯＨ）又はアシル鎖（例えば、Ｃ１７−ＣＯＯＨ）のいずれかの１０倍モル過剰と、ＤＭＦ／ＤＩＥＡ中のＰｙＢＯＰ又はＤＥＰＢＴ試薬とのカップリングにより達成される。その後のスペーサーアミノ酸のＦＭＯＣ基の除去に続いて、アシル鎖とのカップリングが繰り返される。１００％ＴＦＡによる最終処理は、あらゆる側鎖保護基及びＮ末端ＢＯＣ基の除去をもたらす。ペプチド樹脂を、５％ＤＩＥＡ／ＤＭＦで中和し、乾燥し、次にＨＦ／ｐ−クレゾール９５：５を０℃で１時間使用して支持体から切断する。エーテル抽出の後、５％ＨＯＡｃ溶液を使用して粗ペプチドを溶媒和する。次に溶液の試料を、正確な分子量のペプチドを含有しているかについてＥＳＩ−ＭＳにより確認する。正確なペプチドを、１００％ＣＨ３ＣＮ中の１０％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡから０．１％ＴＦＡの直線勾配を使用してＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。Vydac C18の２２mm×２５０mmタンパク質カラムを精製に使用する。アシル化ペプチド類縁体は、一般に、緩衝液比率の２０：８０で完全に溶離する。一部を一緒にプールし、分析ＲＰ−ＨＰＬＣにより純度を調べる。純粋な画分を凍結乾燥して、白色の固体ペプチドを得る。
ペプチドがアシル化されるラクタム架橋及び標的残基を含む場合、アシル化は、ペプチド主鎖へのアミノ酸の付加に加えて、上記に記載されたとおりに実施される。
ペプチドのペグ化では、４０kDaのメトキシポリ（エチレングリコール）マレイミド−プロピオンアミド（Chirotech Technology Ltd.）を、ペプチドとＰＥＧの両方を溶解して透明な溶液にするのに必要な最小量の溶媒（一般に、２〜３mgのペプチドを使用する反応において２mL未満）を使用して、７Mの尿素、５０mMのトリス−ＨＣｌ緩衝液中のモル当量のペプチドと反応させる。室温での激しい撹拌を開始して４〜６時間行い、反応を分析ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析する。ペグ化生成物は、保持時間が減少しているので出発物質と異なっていると思われる。精製は、初期ペプチド精製に使用した条件と同じ条件のVydac C4カラムにより実施する。溶出は、典型的には、緩衝液比率がおよそ５０：５０で生じる。純粋なペグ化ペプチドの画分を収集し、凍結乾燥する。
ペプチドを、上記の実施例１３に記載されているように、生体活性についてアッセイする。
＜実施例１８＞
グルカゴン類縁体の投与後のビーグル犬における血清グルコース濃度の変化
月齢が８〜１６か月の健康な８〜１２kgのイヌ／ビーグル犬を使用して、グルカゴン作用の薬物動態及び薬力学を決定した。全ての動物を一晩絶食させ、各投与後の以下の時点で出血させた：０時（投与前）、投与後５、１０、２０、３０、４５、６０、９０、１２０、２４０分。６匹の動物を各投与量群に使用し、およそ１〜２mlの全血を各時点で取り出した。約１．０mlの全血を、十分な量のトラジロール（アプロチニン）を含有するＫ2 ＥＤＴＡ管に加えて、少なくとも５００KIU/mLの全血を得た。冷蔵遠心分離機により１，５００〜３，０００×ｇで試料を１０〜１５分間遠心分離した後、およそ５００uLの血漿を収集した。試料をプラスチックバイアルに移し、−７０℃以下で凍結保存した。残りの１．０mLの全血は、血液試料を空の管に入れ、周囲温度で１５〜２０分間放置し、次に冷蔵遠心分離機により１，５００〜３，０００×ｇで１０〜１５分間遠心分離することによって、血清に変換した。試料をプラスチックバイアルに移し、−７０℃以下で凍結保存した。グルカゴン及び類縁体を０．０１NのＨＣｌに０．１６６７mg/mlの濃度で溶解し、動物に０．０３ml/kgで投与した。
動物には、グルカゴン、グルカゴンのカルボキシ末端に結合した配列番号３１の配列を有するグルカゴンを含むグルカゴン類縁体（グルカゴン−ＣＥＸ）又は配列番号１１のアミノ酸２８にアスパラギン酸置換を含むグルカゴン類縁体（グルカゴン−Ａｓｐ２８）のいずれかの０．００５mg/kg用量を筋肉内投与した。得られたデータを図１０に表す。
＜実施例１９＞
以下のペプチドを実質的に上記に記載されたように作製した：
（Ａ）ＡＩＢによる１６位のアミノ酸置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド（「ＡＩＢ１６グルカゴン」）；
（Ｂ）ＡＩＢによる１９位でのアミノ酸置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド（「ＡＩＢ１９グルカゴン」）；
（Ｃ）ＡＩＢによる２０位でのアミノ酸置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド（「ＡＩＢ２０グルカゴン」）；
（Ｄ）ＡＩＢによる２１位でのアミノ酸置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド（「ＡＩＢ２１グルカゴン」）；
（Ｅ）ＡＩＢによる２４位でのアミノ酸置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド（「ＡＩＢ２４グルカゴン」）；
（Ｆ）ＡＩＢによる１６及び２０位でのアミノ酸置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド（「ＡＩＢ１６，２０グルカゴン」）；
（Ｇ）ＡＩＢによる１６及び２４位でのアミノ酸置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド（「ＡＩＢ１６，２４グルカゴン」）；
（Ｈ）ＡＩＢによる２０及び２４位でのアミノ酸置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド（「ＡＩＢ２０，２４グルカゴン」）；並びに
（Ｉ）ＡＩＢによる１６、２０及び２４位でのアミノ酸置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド（「ＡＩＢ１６，２０，２４グルカゴン」）。
ペプチドを、実施例１３に実質的に記載されているようにアッセイし、結果を表５に示す。
Figure 2015147791
＜実施例２０＞
以下のグルカゴン類縁体ペプチドを実質的に上記に記載されたように作製した：
２８位にＡｓｐ及び２９位にＧｌｕを含むように修飾された配列番号１のアミノ酸配列を含む「Ｄ２８／Ｅ２９グルカゴン」：
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＤＥ（配列番号７５）；及び
１６位にＡｉｂを含むように更に修飾された配列番号７５のアミノ酸配列を含む「ＡＩＢ１６／Ｄ２８／Ｅ２９グルカゴン」）：
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＡｉｂＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＤＥ（配列番号７６）。
グルカゴン受容体に対するそれぞれのペプチドのインビトロ活性を、実施例１３に記載されたように試験した。Ｄ２８／Ｅ２９グルカゴンペプチドのＥＣ５０は、０．０６nMであったが、ＡＩＢ１６／Ｄ２８／Ｅ２９グルカゴンペプチドのＥＣ５０は、０．０８nMであった。
＜実施例２１＞
表６に提示されている修飾を有する配列番号１のアミノ酸をそれぞれ含む、Ａセットのペプチドを、本明細書に実質的に記載されているように作製する。
Figure 2015147791
Figure 2015147791
Figure 2015147791
第２セット（Ｂセット）のペプチドを、Ｂセットの各ペプチドが２４位にＣｙｓを含み、このＣｙｓ残基が４０kDaのＰＥＧと共有結合していることを除いて、Ａセットのペプチドと同じ構造で作製する。
Ａ及びＢセットのペプチドを、実施例１３に実質的に記載されているように、グルカゴン受容体に対するインビトロ活性について試験する。
＜実施例２２＞
以下の、３位に追加の修飾を有する、ペプチドＪ：
ＨＳ−Ｘ−ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＴＲＲＡＡＥＦＶＡＷＬ（Ｎｌｅ）ＤＥ
（配列番号５９）の主鎖、又は
ペプチドＫ：
ＨＳ−Ｘ−ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＡＤＦＶＡＷＬＭＤＥ
（配列番号６０）
の主鎖を含むグルカゴン類縁体ペプチドを、本明細書に実質的に記載されているように、固相ペプチド合成により作製した。ペプチドを、実施例１３に実質的に記載されているように、グルカゴン受容体に対するインビトロ活性について試験した。それぞれのペプチドのＥＣ５０(nM）を表７に示す。
Figure 2015147791
表７に示されているように、複数のアミノ酸を、グルカゴン受容体に対する活性を実質的に失うことなく３位に配置することができ、幾つかの場合では、修飾は、実際には活性を増加し、例えばペプチドＫ主鎖におけるＤａｂ（Ａｃ）及びＱ（Ｍｅ）である。
＜実施例２３＞
多様なグルカゴン類縁体主鎖の３位にＤａｂ（Ａｃ）を含むグルカゴン類縁体ペプチドを、本明細書に実質的に記載されているように作製し、グルカゴン受容体に対するインビトロ活性を試験した。それぞれのペプチドの構造及び活性を表８に示す。
Figure 2015147791
＜実施例２４＞
表９に示されている修飾を有する配列番号１のアミノ酸を含む、第１セット（Ａセット）のペプチドを、本明細書に実質的に記載されているように作製する。
Figure 2015147791
アシル基がＣ１６又はＣ１８脂肪アシル基である以外はＡセットと同じ構造を含むペプチドを、本明細書に実質的に記載されているように作製する。Ｃ１６脂肪アシル基を含むペプチドは、Ｂセットのペプチドを含み、一方、Ｃ１８脂肪アシル基を含むペプチドは、Ｃセットのペプチドを含んだ。
脂肪アシル基が以下のスペーサーの１つを介して示された位置でＬｙｓ残基の側鎖に共有結合している以外はＡ、Ｂ及びＣセットのペプチドと同じ構造を含むＤセットのペプチドを、本明細書に記載されているように作製する：γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕ、β−Ａｌａ−β−Ａｌａ、Ａｌａ−Ａｌａ、６−アミノヘキサン酸、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ及びＰｒｏ−Ｐｒｏ。
Ａ〜Ｄセットのペプチドを、実施例１３に記載されているように、グルカゴン受容体に対するインビトロ活性について試験し、それぞれのＥＣ５０を、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの活性と比較する。
＜実施例２５＞
共有分子内架橋を欠き、２位にＡＩＢを含む、１６位にＡＩＢを含む及び１０位のＬｙｓ残基にスペーサーを介して結合している脂肪アシル基を含む幾つかのグルカゴン類縁体を、本明細書に実質的に記載されているように作製した。アシル化グルカゴン類縁体は、スペーサーの種類、ペグ化の存在若しくは不在、及び／又はアシル基の大きさによって異なった。アシル化グルカゴン類縁体を、実施例１３に実質的に記載されているように、グルカゴン受容体及びＧＬＰ−１受容体に対するインビトロ活性について試験した。それぞれのペプチドの構造、並びにグルカゴン及びＧＬＰ−１受容体に対するインビトロ活性の概要を、表１０及び１１に示す。
Figure 2015147791
Figure 2015147791
表１０及び１１に示されているように、スペーサーを介して結合している脂肪アシル基を含むペプチドは、ペプチド主鎖に直接結合している脂肪アシル基を含むペプチドと比較して、効力を有意に増加した。
＜実施例２６＞
配列番号７１、７６及び７８のグルカゴン類縁体ペプチドを安定性についてアッセイした。全てのペプチドは、２８位にＡｓｐを含み、配列番号７１及び７６のペプチドは、追加的に２９位にＧｌｕを含んだ。配列番号７８のペプチドは追加の修飾を何も含まなかったが、配列番号７１及び７６のペプチドは、両方とも１６位にＡＩＢを含んだ。配列番号７１のペプチドは、更に、３位にＤａｂ（Ａｃ）、２０及び２４位にＡｌａ、並びに２７位にＬｅｕを含んだ。
ペプチドを、１mg/mLのペプチド濃度になるように溶液中で配合した。シリンジにペプチド溶液の１つを充填し、空気との接触を最小限にするように調整した。シリンジを４、２５、３０又は４０℃で維持した。分析ＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相高速液体クロマトグラフィー）を使用し、２８０nmのＵＶ検出器により０、１、２、４、及び６か月目に潜在的な化学分解をモニターした。ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）を使用し、２８０nmのＵＶ検出器により０、１、２、４及び６か月目に凝集体の形成があるかについて評価した。
時間の関数として、配列番号７１、７６、及び７８のペプチドのＵＶ吸光度に基づいたピーク積分領域をそれぞれ図１２〜１４に示す。これらの図に示されているように、ペプチドの安定性は、配列番号７１のペプチドにおいて最大であり、配列番号７８のペプチドでは最小であったが、それでも２か月後の時点で３０℃でのペプチドの９０％が検出された。ピーク領域における有意な損失は配列番号７１において観察されず、ペプチドの良好な化学的及び生物物理学的安定性を示した。
＜実施例２７＞
それぞれ平均体重４８．７ｇのＤＩＯマウス（１群あたり８匹）に、ビヒクルのみ、３０nmol/kg若しくは１００nmol/kgのアシル化グルカゴン類縁体ペプチド、又は長期作用ＧＬＰ−１類縁体であるリラグルチド (Novo Nordisk, Denmark）を７日間毎日皮下注射した。アシル化グルカゴン類縁体は以下であった：
野生型グルカゴン（配列番号１）のアミノ酸配列のうち、１０位のＴｙｒが修飾されてアシル化Ｌｙｓ残基となり、アシル化Ｌｙｓが、Ｃ１６脂肪アシルを含み、Ｃ末端カルボキシレートがアミド基に置換されたアミノ酸配列を含む「（Ｃ１６）グルカゴンアミド」；
Ｃ１６脂肪アシル基がガンマ−Ｇｌｕ−ガンマ−Ｇｌｕジペプチドスペーサーを介して１０位のＬｙｓに結合している以外はＣ１６グルカゴンアミドと同じ構造を含む「γＥ−γＥ−Ｃ１６グルカゴンアミド」（アシル化Ｌｙｓの構造については下記を参照すること）；
Figure 2015147791
 Ｃ１６脂肪アシル基がＡｌａ−Ａｌａジペプチドスペーサーを介して１０位のＬｙｓに結合している以外はＣ１６グルカゴンアミドと同じ構造を含む「ＡＡ−Ｃ１６グルカゴンアミド」；及び
Ｃ１６脂肪アシル基がβ−Ａｌａ−β−Ａｌａジペプチドスペーサーを介して１０位のＬｙｓに結合している以外はＣ１６グルカゴンアミドと同じ構造を含む「βＡβＡ−Ｃ１６グルカゴンアミド」。
マウスの体重を毎日モニターし、体重の総変化（％）を図１５に示す。図１５に示されているように、大部分のアシル化グルカゴンペプチドは、それぞれの用量で体重の減少を引き起こした。リラグルチドは体重においておよそ１２％の減少を示したが、グルカゴン類縁体ペプチドのγＥ−γＥ−Ｃ１６グルカゴンアミドは、対応する用量でマウスにおいて減量を引き起こす最大の能力を示した。低い用量のγＥ−γＥ−Ｃ１６グルカゴンアミドでさえ、体重に実質的な減少を引き起こした。
マウスの脂肪量を分析の７日目に測定した。図１６に示されているように、１００nmol/kgのγＥ−γＥ−Ｃ１６グルカゴンアミドを投与されたマウスは、最低の脂肪量を示した。
マウスの血中グルコースレベルも、アッセイの期間中にモニターした。図１７に示されているように、高用量のグルカゴン類縁体ペプチドのγＥ−γＥ−Ｃ１６グルカゴンアミドは、リラグルチドと同様に、マウスの血中グルコースレベルを減少するように作用した。
＜実施例２８＞
グルカゴン類縁体ペプチドを、本明細書に記載されているように固相ペプチド合成により作製し、ペプチドの１０又は３０位のいずれかをアシル化した。ペプチド及びそれらの構造は以下である：
２位のＸがｄ−Ｓｅｒであり、３０位のＬｙｓがＣ１４脂肪アシル基でアシル化され、Ｃ末端カルボキシレートがアミドに代わっている、アミノ酸配列ＨＸＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＲＡＫＤＦＶＱＷＬＭＮＴＫ−アミド（配列番号７９）を含む「ペプチドｄＳ２Ｅ１６Ｋ２０Ｋ３０−Ｃ１４グルカゴンアミド」；
２位のＸがｄ−Ｓｅｒであり、１０位のＬｙｓがＣ１４脂肪アシル基でアシル化され、Ｃ末端カルボキシレートがアミドに代わっている、アミノ酸配列ＨＸＱＧＴＦＴＳＤＫＳＫＹＬＤＥＲＲＡＫＤＦＶＱＷＬＭＮＴ−アミド（配列番号８０）を含む「ペプチドｄＳ２Ｋ１０（Ｃ１４）Ｅ１６Ｋ２０−グルカゴンアミド」；
２位のＸがｄ−Ｓｅｒであり、３０位のＬｙｓがＣ１６脂肪アシル基でアシル化され、Ｃ末端カルボキシレートがアミドに代わっている、アミノ酸配列ＨＸＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＲＡＫＤＦＶＱＷＬＭＮＴＫ−アミド（配列番号８１）を含む「ペプチドｄＳ２Ｅ１６Ｋ２０Ｋ３０−Ｃ１６グルカゴンアミド」；
２位のＸがｄ−Ｓｅｒであり、１０位のＬｙｓがＣ１６脂肪アシル基でアシル化され、Ｃ末端カルボキシレートがアミドに代わっている、アミノ酸配列ＨＸＱＧＴＦＴＳＤＫＳＫＹＬＤＥＲＲＡＫＤＦＶＱＷＬＭＮＴ−アミド（配列番号８２）を含む「ペプチドｄＳ２Ｋ１０（Ｃ１６）Ｅ１６Ｋ２０−グルカゴンアミド」；
２位のＸがＡＩＢであり、１０位のＫがＣ１８脂肪アシル基でアシル化され、２４位のＣｙｓが４０kDaのＰＥＧ分子を含み、Ｃ末端カルボキシレートがアミドに代わっている、アミノ酸配列ＨＸＱＧＴＦＴＳＤＫＳＫＹＬＤＥＱＡＡＫＥＦＩＣＷＬＭＮＴ−アミド（配列番号８３）を含む「ペプチドキメラ２−ＡＩＢ２−Ｋ１０−アシル化」；及び
２位のＸがＡＩＢであり、３０位のＫがＣ１８脂肪アシル基でアシル化され、２４位のＣｙｓが４０kDaのＰＥＧ分子を含み、Ｃ末端カルボキシレートがアミドに代わっている、アミノ酸配列ＨＸＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＱＡＡＫＥＦＩＣＷＬＭＮＴＫ−アミド（配列番号８４）を含む「ペプチドキメラ２−ＡＩＢ２−Ｋ３０−アシル化」。
それぞれのペプチドのＧＬＰ−１受容体及びグルカゴン受容体に対するインビトロ活性を、実施例１３に実質的に記載されたように試験した。結果を表１２に示す。
Figure 2015147791
本明細書に引用されている、出版物、特許出願、及び特許を含む、全ての参考文献は、まるでそれぞれの参考文献が個別にかつ明確に参照として組み込まれているように示され、その全体が本明細書に記載されているのと同じ程度で、参照として本明細書に組み込まれる。
本発明を記載する文脈における（特に、後に続く請求項の文脈における）用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」、並びに類似の参照の使用は、本明細書において特に指定がない限り又は文脈において明らかに相反しない限り、単数及び複数の両方を網羅することが考慮されるべきである。用語「含む」、「有する」、「含まれる」、及び「含有する」は、特に示されない限り、非限定的用語である（すなわち、「含まれるが、これらに限定されない」を意味する）と考慮されるべきである。
本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において特に指定のない限り、単に、範囲内にあるそれぞれ別個の値及びそれぞれの終点を個別に参照するための省略的な方法として機能することが意図され、それぞれの別個の値及び終点は、まるで本明細書において個別に引用されているかのように本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載されている全ての方法は、本明細書において特に指定のない限り又は文脈において明らかに相反しない限り、任意の適切な順番で実施することができる。本明細書において提供されている任意の又は全ての例又は例示的な言葉（例えば「のような」）は、単に本明細書をより良好に説明することだけが意図され、特に請求項に記載されていない限り、本発明の範囲に制限を課すものではない。本明細書におけるどの言葉も、請求項に記載されていない何らかの要素が本発明の実施に必須であることを示している、と考慮されるべきではない。
本発明を実施するために、発明者たちが知っている最良の形態を含む、本発明の好ましい実施態様が本明細書に記載されている。これらの好ましい実施態様の変更は、前述の記載を読むことにより当業者に明らかとなりうる。発明者たちは、当業者がそのような変更を適切な場合に用いることを予想し、発明者たちは、発明が本明細書に特定的に記載されている以外の方法で実施されることを意図している。したがって、本発明は、適用法令が許す限り、添付の請求項に引用されている主題の全ての修正及び等価物を含む。更に、全ての可能な変更における上記記載の要素の任意の組み合わせは、本明細書において特に指定のない限り又は文脈において明らかに相反しない限り、本明細書に包含される。

Claims (96)

  1. グルカゴンアゴニスト活性を有するグルカゴンペプチドであって、（ｉ）α，α−二置換アミノ酸により１６、２０、２１、及び２４位のうちの１、２、３個又は全てのアミノ酸が置換されている配列番号１のアミノ酸配列、を含む、グルカゴンペプチド。
  2. 以下のいずれかを含む、請求項１記載のグルカゴンペプチド：
    （ａ）１６位にアミノ酪酸（ＡＩＢ）、
    （ｂ）２０位にＡＩＢ、
    （ｃ）２１位にＡＩＢ、
    （ｄ）２４位にＡＩＢ、
    （ｅ）１６及び２０位にＡＩＢ、
    （ｆ）１６及び２４位にＡＩＢ、
    （ｇ）２０及び２４位にＡＩＢ、又は
    （ｈ）１６、２０、及び２４位にＡＩＢ。
  3. １６位にＡＩＢを含む、請求項２記載のグルカゴンペプチド。
  4. アミノ酸修飾を更に含む、請求項１〜３のいずれか１項記載のグルカゴンペプチドの類縁体であって、該グルカゴンペプチドが、（ｉ）Ｃ末端から２７位までのアミノ酸のうちに、少なくとも１つの荷電アミノ酸；（ｉｉ）３位のアミノ酸のグルタミン類縁体による置換；又は（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方、のいずれかを含む、類縁体。
  5. 以下からなる群より選択される少なくとも１個のアミノ酸置換を含む、請求項４記載のグルカゴンペプチドの類縁体：
    荷電アミノ酸による２８位のＡｓｎの置換；
    Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、及びホモシステイン酸からなる群より選択される荷電アミノ酸による、２８位のＡｓｎの置換；
    Ａｓｎ、Ａｓｐ、又はＧｌｕによる２８位での置換；
    Ａｓｐによる２８位での置換；
    Ｇｌｕによる２８位での置換；
    荷電アミノ酸による２９位のＴｈｒの置換；
    Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、及びホモシステイン酸からなる群より選択される荷電アミノ酸による、２９位のＴｈｒの置換；
    Ａｓｐ、Ｇｌｕ、又はＬｙｓによる２９位での置換；
    Ｇｌｕによる２９位での置換；
    ２９位の後への１〜３個の荷電アミノ酸の挿入；
    ２９位の後へのＧｌｕ又はＬｙｓの挿入；
    ２９位の後へのＧｌｕ−Ｌｙｓ又はＬｙｓ−Ｌｙｓの挿入；
    下記の構造Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩで示される側鎖を含むアミノ酸による３位のＧｌｎの置換：
    Figure 2015147791
     〔式中、Ｒ1は、Ｃ0-3アルキル又はＣ0-3ヘテロアルキルであり；Ｒ2は、ＮＨＲ4又はＣ1-3アルキルであり；Ｒ3は、Ｃ1-3アルキルであり；Ｒ4は、Ｈ又はＣ1-3アルキルであり；Ｘは、ＮＨ、Ｏ、又はＳであり；そしてＹは、ＮＨＲ4、ＳＲ3、又はＯＲ3である〕、及び
    これらの組み合わせ。
  6. 以下からなる群より選択される少なくとも１個のアミノ酸修飾を更に含む、請求項４又は５記載の類縁体：
    Ａｌａ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒによる２０位のＧｌｎの置換；
    Ａｌａ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒによる２４位のＧｌｎの置換；
    Ｃ末端への配列番号２０のアミノ酸の付加（ここで２９位のアミノ酸はＴｈｒ又はＧｌｙである）；及び、
    これらの組み合わせ。
  7. 配列番号７１〜７４のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項６記載の類縁体。
  8. 親水性部分を更に含む、請求項４〜７のいずれか１項記載の類縁体。
  9. 親水性部分が、類縁体の、アミノ酸位置１６、１７、２０、２１、２４、若しくは２９のいずれか、又はＣ末端アミノ酸に共有結合している、請求項８記載の類縁体。
  10. 親水性部分が、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン、又はアセチル−フェニルアラニンに共有結合している、請求項８又は９記載の類縁体。
  11. 親水性部分がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項８〜１０のいずれか１項記載の類縁体。
  12. ＰＥＧが約１，０００ダルトン〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１１記載の類縁体。
  13. ＰＥＧが約２０，０００ダルトン〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１２記載の類縁体。
  14. （ｉ）ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する非天然アミノ酸による、１位のＨｉｓの置換、（ｉｉ）ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する非天然アミノ酸による、２位のＳｅｒの置換；又は、（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方、のいずれかを更に含む、請求項４〜１３のいずれか１項記載の類縁体。
  15. １位のＨｉｓが、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｎ−メチル−Ｈｉｓ、アルファ−メチル−Ｈｉ、イミダゾール酢酸、デス−アミノ−Ｈｉｓ、ヒドロキシル−Ｈｉｓ、アセチル−Ｈｉｓ、ホモ−Ｈｉｓ、又はアルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、のいずれかにより置換されている、請求項１４記載の類縁体。
  16. １位のＨｉｓがＤＭＩＡで置換されている、請求項１５記載の類縁体。
  17. ２位のＳｅｒが、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、Ｖａｌ、又はアルファ，アミノ−イソ酪酸（ＡＩＢ）のいずれかにより置換されている、請求項１４〜１６のいずれか１項記載の類縁体。
  18. アシル基又はアルキル基に共有結合している側鎖を含むアミノ酸を含み、該アシル基又はアルキル基は天然型のアミノ酸に対して非天然型である、請求項４〜１７のいずれか１項記載の類縁体。
  19. アシル基又はアルキル基が結合しているアミノ酸は、１０位のアミノ酸又はＣ末端アミノ酸である、請求項１８記載の類縁体。
  20. アシル基又はアルキル基は、スペーサーを介してアミノ酸の側鎖に結合している、請求項１８又は１９記載の類縁体。
  21. アシル基がＣ4〜Ｃ30脂肪アシル基である、又は、アルキル基がＣ4〜Ｃ30アルキルである、請求項１８〜２０のいずれか１項記載の類縁体。
  22. 以下からなる群より選択される１個のアミノ酸修飾を更に含む、請求項４〜２１のいずれか１項記載の類縁体：
    ヒドロキシル基を欠いているアミノ酸による７位のＴｈｒの置換；
    Ｃ末端から２７位までのアミノ酸のうちの１又は２個のアミノ酸の欠失；
    Ｃ末端アルファカルボキシレート；及び
    これらの組み合わせ。
  23. ヒドロキシル基を欠いているアミノ酸が、Ｉｌｅ又はアミノ酪酸（Ａｂｕ）である、請求項２２記載の類縁体。
  24. 以下からなる群より選択される１個のアミノ酸修飾を更に含む、請求項４〜２３のいずれか１項記載の類縁体：
    Ｐｈｅ又はＶａｌによる１０位のＴｙｒの置換；
    Ａｒｇによる１２位のＬｙｓの置換；
    Ｇｌｕによる１５位のＡｓｐの置換；
    Ｔｈｒによる１６位のＳｅｒの置換；
    Ａｌａ又はＡＩＢによる２０位のＧｌｎの置換；
    Ｇｌｕによる２１位のＡｓｐの置換；
    Ａｌａ又はＡＩＢによる２４位のＧｌｎの置換；
    Ｌｅｕ又はＮｌｅによる２７位のＭｅｔの置換；
    ２７〜２９位のアミノ酸の欠失；
    ２８〜２９位のアミノ酸の欠失；
    ２９位のアミノ酸の欠失；
    Ｃ末端への配列番号２０のアミノ酸の付加（ここで２９位のアミノ酸はＴｈｒ又はＧｌｙである）；及び、
    これらの組み合わせ。
  25. グルカゴンアゴニスト活性を有するグルカゴンペプチドであって、配列番号７７のアミノ酸配列を含み、３位のＸａａが、下記の構造Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩで示される側鎖を含むアミノ酸である、グルカゴンペプチド：
    Figure 2015147791
     〔式中、Ｒ1は、Ｃ0-3アルキル又はＣ0-3ヘテロアルキルであり；Ｒ2は、ＮＨＲ4又はＣ1-3アルキルであり；Ｒ3は、Ｃ1-3アルキルであり；Ｒ4は、Ｈ又はＣ1-3アルキルであり；Ｘは、ＮＨ、Ｏ、又はＳであり；そしてＹは、ＮＨＲ4、ＳＲ3、又はＯＲ3である〕。
  26. ＸがＮＨであるか、又はＹがＮＨＲ4である、請求項２５記載のグルカゴンペプチド。
  27. Ｒ1が、Ｃ0-2アルキル又はＣ1ヘテロアルキルである、請求項２５又は２６記載のグルカゴンペプチド。
  28. Ｒ2が、ＮＨＲ4又はＣ1アルキルである、請求項２５〜２７のいずれか１項記載のグルカゴンペプチド。
  29. Ｒ4が、Ｈ又はＣ1アルキルである、請求項２５〜２８のいずれか１項記載のグルカゴンペプチド。
  30. ３位のＸａａが、以下の構造のいずれかを有する側鎖を含むアミノ酸である、請求項２５記載のグルカゴンペプチド：
    （ｉ）構造Ｉであって、式中、Ｒ1がＣＨ2−Ｓであり、ＸがＮＨであり、そしてＲ2がＣＨ3である（Ｃ（Ａｃｍ））；
    （ｉｉ）構造Ｉであって、式中、Ｒ1がＣＨ2であり、ＸがＮＨであり、そしてＲ2がＣＨ3である（Ｄａｂ（Ａｃ））；
    （ｉｉｉ）構造Ｉであって、式中、Ｒ1がＣ0アルキルであり、ＸがＮＨであり、Ｒ2がＮＨＲ4であり、そしてＲ4がＨである（Ｄａｐ（尿素））：
    （ｉｖ）構造ＩＩであって、式中、Ｒ1がＣＨ2であり、ＹがＮＨＲ4であり、そしてＲ4がＣＨ3である（Ｑ（Ｍｅ））；
    （ｖ）構造ＩＩＩであって、式中、Ｒ1がＣＨ2であり、そして構造ＩＩＩのＲ4がＨである（Ｍ（Ｏ））；又は
    （ｖｉ）構造Ｉであって、式中、Ｒ1がＣＨ2−ＣＨ2であり、ＸがＮＨであり、そしてＲ2がＣＨ3である（Ｏｍ（Ａｃ））。
  31. （ｉ）ｉの位置のアミノ酸の側鎖と、ｉ＋４の位置のアミノ酸の側鎖とを連結する分子内架橋（ここでｉは１２、１６、２０、又は２４である）、（ｉｉ）１６、２０、２１、及び２４位のうちの１、２、３つ、若しくは全てにおけるα，α−二置換アミノ酸；又は（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方、のいずれかを含む、請求項２５〜３０のいずれか１項記載のグルカゴンペプチドの類縁体。
  32. α，α−二置換アミノ酸がＡＩＢである、請求項３１記載の類縁体。
  33. ＡＩＢがグルカゴンペプチドの１６位にある、請求項３２記載の類縁体。
  34. 以下からなる群より選択される１個のアミノ酸修飾を含む、請求項３１〜３３のいずれか１項記載のグルカゴンペプチドの類縁体：
    ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する非天然アミノ酸による、１位のＨｉｓの置換；
    ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する非天然アミノ酸による、２位のＳｅｒの置換；
    Ａｂｕ又はＩｌｅによる7位のＴｈｒの置換；
    Ｐｈｅ又はＶａｌによる１０位のＴｙｒの置換；
    Ａｒｇによる１２位のＬｙｓの置換；
    Ｇｌｕによる１５位のＡｓｐの置換；
    Ｔｈｒ又はＡＩＢによる１６位のＳｅｒの置換；
    Ａｌａ又はＡＩＢによる２０位のＧｌｎの置換；
    Ｇｌｕによる２１位のＡｓｐの置換；
    Ａｌａ又はＡＩＢによる２４位のＧｌｎの置換；
    Ｌｅｕ又はＮｌｅによる２７位のＭｅｔの置換；
    ２７〜２９位のアミノ酸の欠失；
    ２８〜２９位のアミノ酸の欠失；
    ２９位のアミノ酸の欠失；
    Ｃ末端への配列番号２０のアミノ酸配列の付加（ここで２９位のアミノ酸はＴｈｒ又はＧｌｙである）；
    天然型のアミノ酸に対して非天然型であるアシル又はアルキル基に共有結合している側鎖を含むアミノ酸の置換又は付加；及び
    これらの組み合わせ。
  35. グルカゴンペプチドが、配列番号６２〜６７及び６９〜７４のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項３４記載の類縁体。
  36. １６、１７、２０、２１、２４、及び２９位のいずれかのアミノ酸又はＣ末端アミノ酸に共有結合している、１個の親水性部分を含む、請求項３１〜３５のいずれか１項記載の類縁体。
  37. 親水性部分がＰＥＧである、請求項３６記載の類縁体。
  38. アシル基又はアルキル基が、１０位のアミノ酸又はＣ末端アミノ酸の側鎖に共有結合している、請求項３４〜３７のいずれか１項記載の類縁体。
  39. アシル基がＣ4〜Ｃ30脂肪アシル基である、又は、アルキル基がＣ4〜Ｃ30アルキルである、請求項３４〜３８のいずれか１項記載の類縁体。
  40. アシル又はアルキル基は、スペーサーを介してアミノ酸の側鎖に結合している、請求項３４〜３９のいずれか１項記載の類縁体。
  41. グルカゴンペプチドが、ヒドロキシル基を欠いているアミノ酸を７位に含む、請求項４０記載の類縁体。
  42. ヒドロキシル基を欠いているアミノ酸が、Ａｂｕ又はＩｌｅである、請求項４１記載の類縁体。
  43. グルカゴンアゴニスト活性を有するグルカゴンペプチドであって、１〜３個のアミノ酸修飾を含む以下のアミノ酸配列を含む、グルカゴンペプチド：
    Ｘ１−Ｘ２−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｚ（配列番号３９）
    〔ここで、Ｘ１及びＸ２は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する非天然アミノ酸であり、
    Ｚは、−ＣＯＯＨ、−Ａｓｎ−ＣＯＯＨ、Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＣＯＯＨ、及びＹ−ＣＯＯＨからなる群より選択され、Ｙは１〜２個のアミノ酸であり、
    ラクタム架橋が、ｉの位置のアミノ酸の側鎖と、ｉ＋４の位置のアミノ酸の側鎖とを連結し、ここでｉは、１２、１６、２０、又は２４である〕。
  44. 配列番号３９のｉの位置及びｉ＋４の位置のアミノ酸が、Ｌｙｓ及びＧｌｕである、請求項４３記載のグルカゴンペプチド。
  45. １６位のアミノ酸がＧｌｕであり、そして２０位のアミノ酸がＬｙｓである、請求項４４記載のグルカゴンペプチド。
  46. Ｘ１が、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｎ−メチル−Ｈｉｓ、アルファ−メチル−Ｈｉ、イミダゾール酢酸、デス−アミノ−Ｈｉｓ、ヒドロキシル−Ｈｉｓ、アセチル−Ｈｉｓ、ホモ−Ｈｉｓ、及びアルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）からなる群より選択される、請求項４３〜４５のいずれか１項記載のグルカゴンペプチド。
  47. Ｘ１がＤＭＩＡである、請求項４６記載のグルカゴンペプチド。
  48. Ｘ２が、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、Ｖａｌ、及びアルファ，アミノ−イソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群より選択される、請求項４３〜４７のいずれか１項記載のグルカゴンペプチド。
  49. ＺがＡｓｎ−Ｔｈｒ−ＣＯＯＨである、請求項４３〜４８のいずれか１項記載のグルカゴンペプチド。
  50. ＺがＡｓｎ−ＣＯＯＨである、請求項４３〜４８のいずれか１項記載のグルカゴンペプチド。
  51. Ｚが−ＣＯＯＨである、請求項４３〜４８のいずれか１項記載のグルカゴンペプチド。
  52. １６、１７、２０、２１、２４、若しくは２９位のいずれかのアミノ酸又はＣ末端アミノ酸において親水性部分と共有結合している、請求項４３〜５１のいずれか１項記載のグルカゴンペプチド。
  53. 親水性部分が、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン、又はアセチル−フェニルアラニンに共有結合している、請求項５２記載のグルカゴンペプチド。
  54. 親水性部分がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項５２又は５３記載のグルカゴンペプチド。
  55. ＰＥＧが約１，０００ダルトン〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項５４記載のグルカゴンペプチド。
  56. ＰＥＧが約２０，０００ダルトン〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項５４記載のグルカゴンペプチド。
  57. グルカゴン受容体を過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞におけるｃＡＭＰ誘導を測定するインビトロでのアッセイにおいて、ヒトグルカゴン受容体に対して約１０nM以下のＥＣ５０を有すると決定されることを特徴とする、請求項４３〜５６のいずれか１項記載のグルカゴンペプチド。
  58. グルカゴンアゴニスト活性を有するグルカゴンペプチドであって、以下のアミノ酸配列を含み、更に、１６、１７、２０、２１、２４、若しくは２９位のいずれかのアミノ酸、又はＣ末端アミノ酸において親水性部分と共有結合していてもよい、グルカゴンペプチド：
    Ｘ１−Ｘ２−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｚ（配列番号３９）
    〔ここで、Ｘ１及びＸ２は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する（又は耐性を増加する）非天然アミノ酸であり、
    １６、２０、２１及び２４位のうちの１、２、３つ、又は全てのアミノ酸が、α，α−二置換アミノ酸で置換されており、
    Ｚは、−ＣＯＯＨ（天然型のＣ−末端カルボキシレート）、−Ａｓｎ−ＣＯＯＨ、Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＣＯＯＨ、及びＹ−ＣＯＯＨからなる群より選択され、Ｙは１〜２個のアミノ酸である〕。
  59. 以下のいずれかを含む、請求項５８記載のグルカゴンペプチド：
    （ａ）１６位にＡＩＢ、
    （ｂ）２０位にＡＩＢ、
    （ｃ）２１位にＡＩＢ、
    （ｄ）２４位にＡＩＢ、
    （ｅ）１６及び２０位にＡＩＢ、
    （ｆ）１６及び２４位にＡＩＢ、
    （ｇ）２０及び２４位にＡＩＢ、又は
    （ｈ）１６、２０、及び２４位にＡＩＢ。
  60. Ｘ１が、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｎ−メチル−Ｈｉｓ、アルファ−メチル−Ｈｉ、イミダゾール酢酸、デス−アミノ−Ｈｉｓ、ヒドロキシル−Ｈｉｓ、アセチル−Ｈｉｓ、ホモ−Ｈｉｓ、及びアルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）からなる群より選択される、請求項５８又は５９項記載のグルカゴンペプチド。
  61. Ｘ１がＤＭＩＡである、請求項６０記載のグルカゴンペプチド。
  62. Ｘ２が、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、Ｖａｌ、及びアルファ，アミノ−イソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群より選択される、請求項５８〜６１のいずれか１項記載のグルカゴンペプチド。
  63. ＺがＡｓｎ−Ｔｈｒ−ＣＯＯＨである、請求項５８〜６２のいずれか１項記載のグルカゴンペプチド。
  64. ＺがＡｓｎ−ＣＯＯＨである、請求項５８〜６２のいずれか１項記載のグルカゴンペプチド。
  65. Ｚが−ＣＯＯＨである、請求項５８〜６２のいずれか１項記載のグルカゴンペプチド。
  66. 親水性部分が、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン、又はアセチル−フェニルアラニンに共有結合している、請求項５８〜６５のいずれか１項記載のグルカゴンペプチド。
  67. 親水性部分がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項５８〜６６のいずれか１項記載のグルカゴンペプチド。
  68. ＰＥＧが約１，０００ダルトン〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項６７記載のグルカゴンペプチド。
  69. ＰＥＧが約２０，０００ダルトン〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項６７記載のグルカゴンペプチド。
  70. グルカゴン受容体を過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞におけるｃＡＭＰ誘導を測定するインビトロでのアッセイにおいて、ヒトグルカゴン受容体に対して約１０nM以下のＥＣ５０を有すると決定されることを特徴とする、請求項５８〜６９のいずれか１項記載のグルカゴンペプチド。
  71. グルカゴンアゴニスト活性を有し、以下からなる群より選択される１個の更なるアミノ酸修飾を含む、請求項４３又は請求項５８記載のグルカゴンペプチドの類縁体：
    Ｐｈｅ又はＶａｌによる１０位のＴｙｒの置換；
    Ａｒｇによる１２位のＬｙｓの置換；
    Ｇｌｕによる１５位のＡｓｐの置換；
    Ｔｈｒ又はＡＩＢによる１６位のＳｅｒの置換；
    Ａｌａ又はＡＩＢによる２０位のＧｌｎの置換；
    Ｇｌｕによる２１位のＡｓｐの置換；
    Ａｌａ又はＡＩＢによる２４位のＧｌｎの置換；
    Ｌｅｕ又はＮｌｅによる２７位のＭｅｔの置換；
    荷電アミノ酸による２８位のＡｓｎの置換；
    Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、及びホモシステイン酸からなる群より選択される荷電アミノ酸による、２８位のＡｓｎの置換；
    Ａｓｎ、Ａｓｐ又はＧｌｕによる２８位での置換；
    Ａｓｐによる２８位での置換；
    Ｇｌｕによる２８位での置換；
    荷電アミノ酸による２９位のＴｈｒの置換；
    Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、及びホモシステイン酸からなる群より選択される荷電アミノ酸による、２９位のＴｈｒの置換；
    Ａｓｐ、Ｇｌｕ、又はＬｙｓによる２９位での置換；
    Ｇｌｕによる２９位での置換；
    ２９位の後への１〜３個の荷電アミノ酸の挿入；
    ３０位へのＧｌｕ又はＬｙｓの挿入；
    ３１位へのＬｙｓの挿入；或いは
    これらの組み合わせ。
  72. 以下のアミノ酸修飾のうちの１つ又は組み合わせを更に含む、請求項７１記載の類縁体：
    下記の構造Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩで示される側鎖を含むアミノ酸による、３位のＧｌｎの置換：
    Figure 2015147791
     〔式中、Ｒ1は、Ｃ0-3アルキル又はＣ0-3ヘテロアルキルであり；Ｒ2は、ＮＨＲ4又はＣ1-3アルキルであり；Ｒ3は、Ｃ1-3アルキルであり；Ｒ4は、Ｈ又はＣ1-3アルキルであり；Ｘは、ＮＨ、Ｏ、又はＳであり；そしてＹは、ＮＨＲ4、ＳＲ3、又はＯＲ3である〕；
    アシル又はアルキル基（該アシル又はアルキル基は天然型のアミノ酸に対して非天然型である）に共有結合（該結合は場合によりスペーサーを介してでもよい）している側鎖を含むアミノ酸による置換又は付加であって、更に、Ａｂｕ又はＩｌｅによる７位のＴｈｒの置換と組み合わされてもよい、置換又は付加；
    Ａｌａ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒによる２０位のＧｌｎの置換；
    Ａｌａ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒによる２４位のＧｌｎの置換；
    Ｃ末端への配列番号２０のアミノ酸配列の付加（ここで２９位のアミノ酸はＴｈｒ又はＧｌｙである）；
    親水性部分に共有結合しているアミノ酸の置換又は付加；或いは
    これらの組み合わせ。
  73. グルカゴンアゴニスト活性を有し、以下のアミノ酸修飾のうちの１つ又は組み合わせを含む、請求項４３又は５８記載のグルカゴンペプチドの類縁体：
    下記の構造Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩで示される側鎖を含むアミノ酸による３位のＧｌｎの置換：
    Figure 2015147791
     〔式中、Ｒ1は、Ｃ0-3アルキル又はＣ0-3ヘテロアルキルであり；Ｒ2は、ＮＨＲ4又はＣ1-3アルキルであり；Ｒ3は、Ｃ1-3アルキルであり；Ｒ4は、Ｈ又はＣ1-3アルキルであり；Ｘは、ＮＨ、Ｏ、又はＳであり；そしてＹは、ＮＨＲ4、ＳＲ3、又はＯＲ3である〕；
    アシル又はアルキル基（該アシル又はアルキル基は天然型のアミノ酸に対して非天然型である）に共有結合（該結合は場合によりスペーサーを介してでもよい）している側鎖を含むアミノ酸による置換又は付加であって、更に、Ａｂｕ又はＩｌｅによる７位のＴｈｒの置換と組み合わされてもよい、置換又は付加；
    Ａｌａ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒによる２０位のＧｌｎの置換；
    Ａｌａ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒによる２４位のＧｌｎの置換；
    Ｃ末端への配列番号２０のアミノ酸の付加（ここで２９位のアミノ酸はＴｈｒ又はＧｌｙである）；
    親水性部分に共有結合しているアミノ酸の置換又は付加；或いは
    これらの組み合わせ。
  74. グルカゴンアゴニスト活性を有する、配列番号１のグルカゴンペプチドの類縁体であって、
    （ａ）下記：
    荷電アミノ酸による２８位のＡｓｎの置換；
    Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、及びホモシステイン酸からなる群より選択される荷電アミノ酸による、２８位のＡｓｎの置換；
    Ａｓｎ、Ａｓｐ又はＧｌｕによる２８位での置換；
    Ａｓｐによる２８位での置換；
    Ｇｌｕによる２８位での置換；
    荷電アミノ酸による２９位のＴｈｒの置換；
    Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、及びホモシステイン酸からなる群より選択される荷電アミノ酸による、２９位のＴｈｒの置換；
    Ａｓｐ、Ｇｌｕ又はＬｙｓによる２９位での置換；
    Ｇｌｕによる２９位での置換；
    ２９位の後への１〜３個の荷電アミノ酸の挿入；
    ２９位の後へのＧｌｕ又はＬｙｓの挿入；
    ２９位の後へのＧｌｕ−Ｌｙｓ又はＬｙｓ−Ｌｙｓの挿入；或いは
    これらの組み合わせ
    からなる群より選択される少なくとも１個のアミノ酸修飾と、
    Ａ群若しくはＢ群又はこれらの組み合わせから選択される少なくとも１個のアミノ酸修飾と
    を含む、類縁体。
    〔ここで、
    Ａ群は、Ｇｌｕによる１５位のＡｓｐの置換、及びＴｈｒ又はＡＩＢによる１６位のＳｅｒの置換、からなる群より選択されるアミノ酸修飾であり、
    Ｂ群は、以下からなる群より選択されるアミノ酸修飾である：
    ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する非天然アミノ酸による、１位のＨｉｓの置換；
    ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する非天然アミノ酸による、２位のＳｅｒの置換；
    Ｐｈｅ又はＶａｌによる１０位のＴｙｒの置換；
    Ａｒｇによる１２位のＬｙｓの置換；
    Ａｌａ又はＡＩＢによる２０位のＧｌｎの置換；
    Ｇｌｕによる２１位のＡｓｐの置換；
    Ａｌａ又はＡＩＢによる２４位のＧｌｎの置換；
    Ｌｅｕ又はＮｌｅによる２７位のＭｅｔの置換；
    ２７〜２９位のアミノ酸の欠失；
    ２８〜２９位のアミノ酸の欠失；
    ２９位のアミノ酸の欠失；或いは
    これらの組み合わせ。〕
  75. 以下のアミノ酸修飾のうちの１つ又は組み合わせを更に含む、請求項７４記載の類縁体：
    下記の構造Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩで示される側鎖を含むアミノ酸による、３位のＧｌｎの置換：
    Figure 2015147791
     〔式中、Ｒ1は、Ｃ0-3アルキル又はＣ0-3ヘテロアルキルであり；Ｒ2は、ＮＨＲ4又はＣ1-3アルキルであり；Ｒ3は、Ｃ1-3アルキルであり；Ｒ4は、Ｈ又はＣ1-3アルキルであり；Ｘは、ＮＨ、Ｏ、又はＳであり；そしてＹは、ＮＨＲ4、ＳＲ3、又はＯＲ3である〕；
    アシル又はアルキル基（該アシル又はアルキル基は天然型のアミノ酸に対して非天然型である）と共有結合（該結合は場合によりスペーサーを介してでもよい）している側鎖を含むアミノ酸による置換又は付加であって、更に、Ａｂｕ又はＩｌｅによる７位のＴｈｒの置換と組み合わされてもよい、置換又は付加；
    Ａｌａ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒによる２０位のＧｌｎの置換；
    Ａｌａ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒによる２４位のＧｌｎの置換；
    Ｃ末端への配列番号２０のアミノ酸配列の付加（ここで２９位のアミノ酸はＴｈｒ又はＧｌｙである）；
    親水性部分に共有結合しているアミノ酸の置換又は付加；或いは
    これらの組み合わせ。
  76. ラクタム架橋が、ｉの位置のアミノ酸の側鎖と、ｉ＋４の位置のアミノ酸の側鎖とを連結し、ここでｉは、１２、１６、２０、又は２４である、請求項７４又は７５記載の類縁体。
  77. 類縁体の１６、２０、２１、及び２４位のうちの１、２、３個又は全てのアミノ酸が、α，α−二置換アミノ酸で置換されている、請求項７４〜７６のいずれか１項記載の類縁体。
  78. α，α−二置換アミノ酸がＡＩＢである、請求項７７記載の類縁体。
  79. 配列番号７６のアミノ酸配列を含む、請求項７８記載の類縁体。
  80. 配列番号４０〜５６のいずれかのアミノ酸配列を含む、グルカゴンペプチド。
  81. 配列番号４０のアミノ酸配列を含む、グルカゴンペプチド。
  82. 請求項１〜８１のいずれか１項記載のグルカゴンペプチド又はその類縁体であって、親水性部分を欠いている場合、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの活性の少なくとも約２０％の活性を示す、グルカゴンペプチド又は類縁体。
  83. 請求項１〜８２のいずれか１項記載のグルカゴンペプチド又はその類縁体であって、親水性部分を欠いている場合、ＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１の活性の約０．５％以下の活性を示す、グルカゴンペプチド又は類縁体。
  84. リンカーを介して互いに結合している２つのペプチドを含む二量体であって、該２つのペプチドの少なくとも一方が、請求項１〜３、２５〜３０、４３〜７０、及び８０〜８３のいずれか１項記載のグルカゴンペプチド、又は、請求項４〜２４、３１〜４２、及び７１〜７９記載の類縁体のいずれかである、二量体。
  85. 二量体がホモ二量体である、請求項８４記載の二量体。
  86. リンカーが、二官能チオール架橋剤及び二官能アミン架橋剤からなる群より選択される、請求項８４又は８５記載の二量体。
  87. 結合体部分と、請求項１〜３、２５〜３０、４３〜７０、及び８０〜８３のいずれか１項記載のグルカゴンペプチド、請求項４〜２４、３１〜４２、及び７１〜７９記載の類縁体、請求項８４〜８６のいずれか１項記載の二量体、又はこれらの組み合わせと、を含む、結合体。
  88. 請求項１〜３、２５〜３０、４３〜７０、及び８０〜８３のいずれか１項記載のグルカゴンペプチド、請求項４〜２４、４１〜４２、及び７１〜７９記載のうちの１つの類縁体、又は、請求項８４〜８６のいずれか１項記載の二量体、のいずれかを含む融合ペプチドであって、該グルカゴンペプチド、類縁体、又は二量体が、配列番号２０のアミノ酸配列を含むペプチドと融合している、融合ペプチド。
  89. 請求項１〜３、２５〜３０、４３〜７０、及び８０〜８３のいずれか１項記載のグルカゴンペプチド、請求項４〜２４、３１〜４２、及び７１〜７９記載の類縁体、請求項８４〜８６のいずれか１項記載の二量体、請求項８７記載の二量体、請求項８８記載の融合ペプチド、又はこれらの組み合わせと、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物。
  90. グルカゴンアゴニストを必要とする患者に、グルカゴンアゴニストを投与するためのキットであって、請求項８９記載の医薬組成物と、該医薬組成物を該患者に投与する装置とを含む、キット。
  91. 装置がシリンジ及び針を含み、医薬組成物がシリンジ内に予め包装されている、請求項９０記載のキット。
  92. 腸管の一過性麻痺を必要とする患者において、腸管の一過性麻痺を起こす方法であって、該患者において腸管の一過性麻痺を起こすのに有効な量の請求項８９記載の医薬組成物を、該患者に投与することを含む方法。
  93. 体重増加の低減又は減量の誘導を必要とする患者において、体重増加の低減又は減量の誘導を行う方法であって、該患者において体重増加を低減する又は減量を誘導するのに有効な量の請求項８９記載の医薬組成物を、該患者に投与することを含む方法。
  94. 低血糖症の治療又は予防を必要とする患者において、低血糖症の治療又は予防を行う方法であって、該患者において低血糖症を治療又は予防するのに有効な量の請求項８９記載の医薬組成物を、該患者に投与することを含む方法。
  95. 血中グルコースレベルの安定化を必要とする患者において、血中グルコースレベルの安定化を行う方法であって、該患者の血中グルコースレベルを安定化するのに有効な量の請求項８９記載の医薬組成物を、該患者に投与することを含み、該患者がインスリンの投与を含む治療レジメンを受けていることを特徴とする、方法。
  96. 医薬組成物がインスリンを更に含む、請求項９５記載の方法。
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