JP5753779B2 - 生理学的pHの緩衝液中で向上した溶解性及び安定性を示すグルカゴン類縁体 - Google Patents
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Description
X1−X2−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Tyr−Ser−Lys−Tyr−Leu−Asp−Ser−Arg−Arg−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met−Z(配列番号39)
を含むグルカゴンペプチドを提供し、
ここで、X1及びX2は、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP−IV)による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する(又は耐性を増加する)、非天然アミノ酸であり、
Zは、−COOH(天然型のC−末端カルボキシレート)、−Asn−COOH、Asn−Thr−COOH、及びY−COOHからなる群より選択され、Yは1〜2個のアミノ酸であり、
分子内架橋(好ましくは共有結合)は、iの位置のアミノ酸の側鎖と、i+4の位置のアミノ酸の側鎖とを連結し、ここで、iは、12、16、20又は24である。
X1−X2−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Tyr−Ser−Lys−Tyr−Leu−Asp−Ser−Arg−Arg−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met−Z(配列番号39)
を含むグルカゴンペプチドを提供し、
ここで、X1及びX2は、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP−IV)による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する(又は耐性を増加する)、非天然アミノ酸であり、
グルカゴンペプチドの16、20、21、及び24位のうちの1、2、3、4つ又はそれ以上は、α,α−二置換アミノ酸で置換されており、
Zは、−COOH(天然型のC−末端カルボキシレート)、−Asn−COOH、Asn−Thr−COOH及びY−COOHからなる群より選択され、Yは1〜2個のアミノ酸である。
冷蔵温度で保存することができる。
本出願は、以下の優先権を請求する:米国仮出願第61/073,193号(2008年6月17日出願)、米国仮出願第61/078,165号(2008年7月3日出願)及び米国仮出願第61/090,415号(2008年8月20日出願)。それぞれの出願の開示は、その全体が参照として本明細書に明確に組み込まれる。
本発明を記載し、請求するに際し、以下の用語を下記に記載した定義に従って使用する。
I.小型で脂肪族の非極性又は僅かに極性の残基:
Ala、Ser、Thr、Pro、Gly;
II.極性の負荷電残基及びそれらのアミド:
Asp、Asn、Glu、Gln、システイン酸及びホモシステイン酸;
III.極性の正荷電残基:
His、Arg、Lys、オルニチン(Orn);
IV.大型で脂肪族の非極性残基:
Met、Leu、Ile、Val、Cys、ノルロイシン(Nle)、ホモシステイン;
V.大型の芳香族残基:
Phe、Tyr、Trp、アセチルフェニルアラニン。
<増強された溶解性>
出願者たちは、天然グルカゴンが、そのカルボキシ末端に電荷を導入することにより、ペプチドのアゴニスト特性を保持しつつ溶解性を増強するように修飾されうることを発見した。増強された溶解性は、ほぼ中性のpHでのグルカゴン溶液の調製及び保存を可能にする。比較的中性のpH(例えば、約6.0〜約8.0のpH)でのグルカゴン溶液の配合は、グルカゴンペプチドの長期安定性を改善する。
追加的な修飾をグルカゴンペプチドに行うことができ、これは溶解性及び/又は安定性及び/又はグルカゴン活性を更に増加することができる。あるいはまたグルカゴンペプチドは、溶解性又は安定性に実質的に影響を与えない及びグルカゴン活性を実質的に減少しないような、他の修飾を含むことができる。例示的な実施態様において、グルカゴンペプチドは、天然グルカゴン配列に対して合計1個、2個まで、3個まで、4個まで、5個まで、6個まで、7個まで、8個まで、9個まで、10個まで、11個まで、12個まで、13個まで、又は14個までのアミノ酸修飾を含むことができる。幾つかの実施態様において、そのようなグルカゴン類縁体は、天然グルカゴンの対応する位置に少なくとも22、23、24、25、26、27、又は28個の天然型のアミノ酸を保持する(例えば、天然型のグルカゴンに対して1〜7、1〜5、又は1〜3個の修飾を有する)。
(a)少なくとも部分的なグルカゴンアゴニスト活性を保持しながらの非保存的置換、保存的置換、付加、又は欠失、例えば、2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28又は29位の1つ以上での保存的置換、Val又はPheによる10位のTyrの置換、Argによる12位のLysの置換、Alaによるこれらの位置の1つ以上での置換;
(b)少なくとも部分的なグルカゴンアゴニスト活性を保持しながらの、29及び/又は28位のアミノ酸(場合により27位のアミノ酸も)の欠失;
(c)分解を低減しうる、15位のアスパラギン酸の修飾、例えばグルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸、若しくはホモシステイン酸での置換による修飾;又は、Asp15−Ser16結合の切断による分解を同様に低減しうる、16位のセリンの修飾、例えばトレオニン、AIB、グルタミン酸での置換、若しくは4原子の長さの側鎖を有する別の負荷電アミノ酸での置換、あるいはグルタミン、ホモグルタミン酸若しくはホモシステイン酸のいずれかでの置換による修飾;
(d)溶解性及び/又は半減期を増加しうる、例えば16、17、20、21、24、29、40位又はC末端アミノ酸への、本明細書に記載されている親水性部分、例えば水溶性ポリマーであるポリエチレングリコール、の付加;
(e)酸化分解を低減するための、例えばロイシン又はノルロイシンでの置換による、27位のメチオニンの修飾;
(f)Glnの脱アミド化を介して生じる分解を低減するための、例えばSer、Thr、Ala又はAIBでの置換による20又は24位のGlnの修飾;
(g)Aspの脱水により環状スクシンイミド中間体を形成し、続いて異性化によりイソアスパラギン酸塩を形成することにより生じる分解を低減するための、例えばGluでの置換による、21位のAspの修飾;
(h)DPP−IV切断への耐性を改善するための、本明細書に記載されている1又は2位での修飾、これは場合により、「i」と「i+4」(ここでiは、12〜25の整数、例えば12,16、20、24である)の位置の間のラクタム架橋のような、分子内架橋と組み合わせてもよい;
(i)、グルカゴン及びGLP−1受容体に対する活性を増加しうる、循環半減期を増加しうる、及び/又は作用の持続時間を延長しうる、及び/又は作用の開始を遅延しうるような、本明細書に記載されているグルカゴンペプチドのアシル化又はアルキル化(これは更に、親水性部分の付加と組み合わせてもよく、更に又はその代わりに、以下のいずれかと組み合わせてもよい:GLP−1ペプチドでの活性を選択的に低減する修飾、例えばヒドロキシル基を欠いているアミノ酸、例えばAbu若しくはIle、による7位のThrの置換のような、7位のThrの修飾;C末端から27位までのアミノ酸の欠失(例えば、長さがアミノ酸27若しくは28個のペプチドを生じるような、28位及び29位のアミノ酸の一方若しくは両方の欠失);、又はこれらの組み合わせ);
(j)本明細書に記載されているC末端延長部;
(k)本明細書に記載されているホモ二量体化又はヘテロ二量体化;並びに
上記の組み合わせ。
A群は、
荷電アミノ酸による28位のAsnの置換;
Lys、Arg、His、Asp、Glu、システイン酸及びホモシステイン酸からなる群より選択される荷電アミノ酸による28位のAsnの置換;
Asn、Asp又はGluによる28位での置換;
Aspによる28位での置換;
Gluによる28位での置換;
荷電アミノ酸による29位のThrの置換;
Lys、Arg、His、Asp、Glu、システイン酸及びホモシステイン酸からなる群より選択される荷電アミノ酸による29位のThrの置換;
Asp、Glu又はLysによる29位での置換;
Gluによる29位での置換;
29位の後への1〜3個の荷電アミノ酸の挿入;
29位の後へのGlu又はLysの挿入;
29位の後へのGlu−Lys又はLys−Lysの挿入;或いは
これらの組み合わせであり、
B群は、
Gluによる15位のAspの置換;
Thr又はAIBによる16位のSerの置換、であり、
C群は、
ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP−IV)による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する、非天然アミノ酸による1位のHisの置換;
ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP−IV)による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する、非天然アミノ酸による2位のSerの置換;
Argによる12位のLysの置換;
Ala又はAIBによる20位のGlnの置換;
Gluによる21位のAspの置換;
Ala又はAIBによる24位のGlnの置換;
Leu又はNleによる27位のMetの置換;
27〜29位のアミノ酸の欠失;
28〜29位のアミノ酸の欠失;
29位のアミノ酸の欠失;或いは
これらの組み合わせ、である。
グルカゴン受容体活性は、3位のアミノ酸修飾、例えば酸性、塩基性又は疎水性のアミノ酸による3位の天然型のグルタミンの置換、により低減することができる。例えば、グルタミン酸、オルチニン又はノルロイシンによる3位での置換は、グルカゴン受容体活性を実質的に低減又は破壊する。
幾つかの実施態様において、本明細書に開示されているグルカゴンペプチドは、ジペプチジルペプチダーゼIVによる切断に対する感受性を低減するために、1又は2位において更に修飾されている。より詳細には、幾つかの実施態様において、類縁体ペプチドの1位は、D−ヒスチジン、アルファ,アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸(DMIA)、N−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、及びホモ−ヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸で置換されている。
PEG基のような親水性部分を、タンパク質と活性化ポリマー分子との反応に使用される任意の適切な条件下でグルカゴンペプチドに結合することができる。アシル化、還元的アルキル化、マイケル付加、チオールアルキル化、又はその他の、PEG部分の反応性基(例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α−ハロアセチル、マレイミド又はヒドラジノ基)と標的化合物の反応性基(例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α−ハロアセチル、マレイミド又はヒドラジノ基)との化学選択的結合/連結方法を含む、当該技術において既知のあらゆる方法を使用することができる。水溶性ポリマーを1つ以上のタンパク質に結合するのに使用できる活性化基には、スルホン、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフレート、トレシレート、アジリジン、オキシラン、5−ピリジル、及びアルファ−ハロゲン化アシル基(例えば、アルファ−ヨード酢酸、アルファ−ブロモ酢酸、アルファ−クロロ酢酸)が含まれるが、これらに限定されない。還元的アルキル化によりペプチドに結合する場合、選択されるポリマーは、重合の程度が制御されるように、単一の反応性アルデヒドを有するべきである。例えば、Kinstler et al., Adv. Drug. Delivery Rev. 54: 477-485 (2002); Roberts et al., Adv. Drug Delivery Rev. 54: 459-476 (2002)及びZalipsky et al., Adv. Drug Delivery Rev. 16: 157-182 (1995)を参照すること。
一つの実施態様によると、グルカゴンペプチドは、アシル基、例えばアミノ酸において天然に生じてはいないアシル基(例えば、天然型のアミノ酸に対して非天然型であるアシル基)を含むように修飾される。アシル基の付加は、ペプチドが、循環半減期の延長、作用開始の遅延、作用の持続時間の延長、DPP−IVのようなプロテアーゼに対する耐性の改善、並びにGLP−1及びグルカゴン受容体に対する効力の増加の1つ以上を有する原因となる。本明細書に示されているように、グルカゴンペプチドのアシル化は、グルカゴン及びGLP−1受容体に対する効力の減少をもたらさない。むしろ、幾つかの場合では、アシル化は、実際にはGLP−1及びグルカゴン受容体に対する活性を増加する。したがって、アシル化されたグルカゴンコアゴニスト類縁体の効力は、非アシル化型の類縁体と比べて、より増強されないとしても、少なくともそれに匹敵する。
幾つかの実施態様によると、グルカゴンペプチドは修飾されて、アルキル基、例えばアミノ酸において天然に生じてはいないアルキル基(例えば、天然型のアミノ酸に対して非天然型であるアルキル基)を含む。任意の特定の理論にとらわれることなく、グルカゴンペプチドのアルキル化は、グルカゴンペプチドのアシル化と比べて、もしも同一でないとしても少なくとも同様の効果、例えば、循環半減期の延長、作用開始の遅延、作用の持続時間の延長、DPP−IVのようなプロテアーゼに対する耐性の改善、並びにGLP−1及びグルカゴン受容体に対する効力の増加、を達成すると考えられる。
特定の実施態様において、グルカゴンペプチド又はその類縁体は、GLP−1活性を選択的に低減するアミノ酸修飾を含む。例えば、アシル化若しくはアルキル化グルカゴンペプチド又はその類縁体は、C末端アルファカルボキシレート基;ヒドロキシル基を欠いているアミノ酸、例えばAbu若しくはIleによる7位のThrの置換;長さが27若しくは28個のアミノ酸のペプチドを生じるような、27若しくは28位のアミノ酸のアミノ酸C末端の欠失(例えば、28位のアミノ酸の欠失、28及び29位のアミノ酸の欠失)又はこれらの組み合わせ、を含む。
本開示は、本発明のグルカゴンペプチドが結合体部分に結合しているような他の結合体も包含し、この結合は、場合により共有結合を介してでもよく、場合によりリンカーを介してでもよい。結合は、共有化学結合、静電気、水素、イオン、ファンデルワールスのような物理的な力、又は疎水性若しくは親水性相互作用により達成することができる。ビオチン−アビジン、リガンド/受容体、酵素/基質、核酸/核酸結合タンパク質、脂質/脂質結合タンパク質、細胞付着分子パートナー、又は互いに親和性を有する任意の結合パートナー若しくはそのフラグメントを含む、多様な非共有結合系を使用することができる。
グルカゴンペプチドの1位及び/又は2位のアミノ酸の修飾によるグルカゴン活性の低減は、グルカゴンペプチドのC末端部分(アミノ酸12〜29あたり)のアルファ−へリックス構造の安定化により回復することができる。アルファ−へリックス構造は、例えば、共有若しくは非共有分子内架橋の形成によって安定化するか、アルファ−へリックス安定化アミノ酸(例えば、α,α−二置換アミノ酸)による12〜29位あたりのアミノ酸の置換及び/又は挿入によって安定化することができる。
一つの実施態様によると、配列番号1の天然グルカゴンペプチドは、負荷電アミノ酸(例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸)による28及び/又は29位の天然アミノ酸の置換によって修飾されており、更に、ペプチドのカルボキシ末端への負荷電アミノ酸(例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸)の付加によって修飾されてもよい。代替的な実施態様において、配列番号1の天然グルカゴンペプチドは、正電荷アミノ酸(例えば、リシン、アルギニン、又はヒスチジン)による29位の天然アミノ酸の置換により修飾されており、更に、ペプチドのカルボキシ末端への1〜2個の正荷電アミノ酸(例えば、リシン、アルギニン又はヒスチジン)の付加により修飾されてもよい。一つの実施態様によると、配列番号34のアミノ酸配列を含むが、但し、28又は29位の少なくとも1個のアミノ酸が酸性アミノ酸で置換されていること、及び/又は追加の酸性アミノ酸が配列番号34カルボキシ末端に付加されていることを条件とする、向上した溶解性及び安定性を有するグルカゴン類縁体が提供される。一つの実施態様において、酸性アミノ酸は、Asp、Glu、システイン酸及びホモシステイン酸からなる群より独立して選択される。
NH2−His−Ser−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Tyr−Ser−Lys−Tyr−Leu−Xaa−Ser−Arg−Arg−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Xaa−Xaa−Xaa−R(配列番号34)、
NH2−His−Ser−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Tyr−Ser−Lys−Tyr−Leu−Asp−Ser−Arg−Arg−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met−Asp−Thr−R(配列番号11)、及び
NH2−His−Ser−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Tyr−Ser−Xaa−Tyr−Leu−Glu−Ser−Arg−Arg−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met−Asp−Thr−R(配列番号13)
からなる群より選択される修飾グルカゴンペプチドを含むグルカゴンアゴニストが提供され、
ここで、15位のXaaは、Asp、Glu、システイン酸、ホモグルタミン酸、又はホモシステイン酸であり、28位のXaaは、Asn又は酸性アミノ酸であり、29位のXaaは、Thr又は酸性アミノ酸であり、そしてRは、酸性アミノ酸、COOH、又はCONH2であるが、但し、酸性酸残基は、28、29、又は30位のうちの1つに存在する。一つの実施態様において、RはCOOHであり、別の実施態様において、RはCONH2である。
実施例に詳細に記載されているように、本発明のグルカゴンアゴニストは、天然ペプチドと比べ、増強された生体活性を保持する又は示す一方で、生理学的pHの溶液において増強された生物物理学的安定性及び水溶性を有する。したがって、本発明のグルカゴンアゴニストは、天然グルカゴンペプチドについて既に記載されてきたあらゆる使用に適していると考えられる。したがって、本明細書に記載されている修飾グルカゴンペプチドを、低血糖症を治療すること、血中グルコースレベルを増加すること、放射線用途において腸管に一過性麻痺を誘導すること、体重を低減及び維持すること、インスリンの補助療法として、又は、グルカゴンの低血中レベルによりもたらされる他の代謝疾患を治療すること、に使用できる。
一般的合成プロトコール:
グルカゴン類縁体を、改良Applied Biosystem 430 Aペプチド合成機により、0.2mmolのBoc Thr(OBzl)Pam樹脂から出発し、HBTU活性化「Fast Boc」単一カップリングを使用して合成した。Bocアミノ酸及びHBTUは、Midwest Biotech(Fishers, IN)から得た。使用した側鎖保護基は、Arg(Tos)、Asn(Xan)、Asp(OcHex)、Cys(pMeBzl)、His(Bom)、Lys(2Cl−Z)、Ser(OBzl)、Thr(OBzl)、Tyr(2Br−Z)及びTrp(CHO)であった。N末端Hisの側鎖保護基はBocであった。
典型的には、グルカゴンCys類縁体をリン酸緩衝食塩水(5〜10mg/ml)に溶解し、0.01Mエチレンジアミン四酢酸を加える(総容量の10〜15%)。過剰(2倍)マレイミドメトキシPEG試薬(Nektar)を加え、反応を室温で撹拌し、その間、HPLCで反応進行をモニタリングする。8〜24時間後、反応混合物を酸性化し、精製のために、0.1%TFA/アセトニトリル勾配を使用する分取逆相カラムに装填する。適切な画分をまとめ、凍結乾燥して、所望のペグ化類縁体を得た。
グルカゴンCys17(1−29)及び同様のモノCys類縁体の合成
60mlの反応容器中の0.2mmolのBoc Thr(OBzl) Pam樹脂(SynChem Inc)及び以下の配列を改良Applied Biosystems 430A Peptide Synthesizerに入れ、FastBoc HBTU活性化単一カップリングを使用して合成を行った。
HSQGTFTSDYSKYLDSCRAQDFVQWLMNT(配列番号27)
以下の側鎖保護基を使用した:Arg(Tos)、Asp(OcHex)、Asn(Xan)、Cys(pMeBzl)、Glu(OcHex)、His(Boc)、Lys(2Cl−Z)、Ser(Bzl)、Thr(Bzl)、Trp(CHO)及びTyr(Br−Z)。合成の完了したペプチジル樹脂を20%ピペリジン/ジメチルホルムアミドで処理して、Trpホルミル保護を除去し、次にHF反応容器に移し、真空下で乾燥した。1.0mlのp−クレゾール及び0.5mlのジメチルスルフィドを、磁気式撹拌バーと共に加えた。容器をHF装置(Pennisula Labs)に取り付け、ドライアイス/メタノール浴で冷却し、排気し、およそ10mlの液体フッ化水素を圧入した。反応を氷浴で1時間撹拌し、次にHFを減圧留去した。残渣をエチルエーテルに懸濁し、固体を濾過し、エーテルで洗浄し、ペプチドを50mlの酢酸水溶液に抽出した。分析HPLC〔0.46×5cmのZorbax C8、1ml/分、45C、214nm、A緩衝液は0.1%TFA、B緩衝液は0.1%TFA/90%ACN、10分間かけて10%Bから80%Bの勾配〕を少量の切断抽出物試料により実施した。残りの抽出物を2.2×25cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填し、Pharmacia FPLC系を使用してアセトニトリル勾配を実施した。5分毎の画分を収集し、その間、214nm(2.0A)のUVでモニタリングした。A=0.1%TFA、B=0.1%TFA/50%アセトニトリル。勾配=450分間かけて30%Bから100%B。
グルカゴン−Cex及び他のC末端延長部類縁体の合成
285mg(0.2mmol)のメトキシベンズヒドリルアミン樹脂(Midwest Biotech)を60mlの反応容器に入れ、以下の配列を改良Applied Biosystems 430Aペプチド合成機に入れ、FastBoc HBTU活性化単一カップリングを使用して合成を行った。
HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTGPSSGAPPPS(配列番号28)
以下の側鎖保護基を使用した:Arg(Tos)、Asp(OcHex)、Asn(Xan)、Cys(pMeBzl)、Glu(OcHex)、His(Boc)、Lys(2Cl−Z)、Ser(Bzl)、Thr(Bzl)、Trp(CHO)及びTyr(Br−Z)。合成の完了したペプチジル樹脂を20%ピペリジン/ジメチルホルムアミドで処理して、Trpホルミル保護を除去し、次にHF反応容器に移し、真空下で乾燥した。1.0mlのp−クレゾール及び0.5mlのジメチルスルフィドを、磁気式撹拌バーと共に加えた。容器をHF装置(Pennisula Labs)に取り付け、ドライアイス/メタノール浴で冷却し、排気し、およそ10mlの液体フッ化水素を圧入した。反応を氷浴で1時間撹拌し、次にHFを減圧留去した。残渣をエチルエーテルに懸濁し、固体を濾過し、エーテルで洗浄し、ペプチドを50mlの酢酸水溶液に抽出した。分析HPLC〔0.46×5cmのZorbax C8、1ml/分、45C、214nm、A緩衝液は0.1%TFA、B緩衝液は0.1%TFA/90%ACN、10分間かけて10%Bから80%Bの勾配〕を切断抽出物のアリコートにより実施した。残りの抽出物を2.2×25cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填し、Pharmacia FPLC系を溶出に使用してアセトニトリル勾配を実施した。5分毎の画分を収集し、その間、214nm(2.0A)のUVでモニタリングした。A=0.1%TFA、B=0.1%TFA/50%アセトニトリル。勾配=450分間かけて30%Bから100%B。画分58−65を合わせ、冷凍及び凍結乾燥して、198.1mgを得た。
グルカゴンCys17Mal−PEG−5K
15.1mgのグルカゴンCys17(1−29)及び27.3mgの平均分子量5000のメトキシポリ(エチレングリコール)マレイミド(mPEG−Mal−5000、Nektar Therapeutics)を、3.5mlのリン酸緩衝食塩水(PBS)に溶解し、0.5mlの0.01Mエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を加えた。反応を室温で撹拌し、反応の進行をHPLC分析〔0.46×5cmのZorbax C8、1ml/分、45C、214nm(0.5A)、A=0.1%TFA、B=0.1%TFA/90%ACN、勾配=10分間かけて10%Bから80%B〕によりモニターした。
グルカゴンCys21Mal−PEG−5K
21.6mgのグルカゴンCys21(1−29)及び24mgのmPEG−Mal−5000(Nektar Therapeutics)を、3.5mlのリン酸緩衝食塩水(PBS)に溶解し、0.5mlの0.01Mエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を加えた。反応を室温で撹拌した。2時間後、更なる12.7mgのmPEG−Mal−5000を加えた。8時間後、反応混合物を2.2×25cmのVydac C18分取逆相カラムに装填し、アセトニトリル勾配を4ml/分のPharmacia FPLCにより実施し、その間、5分毎の画分を収集した。A=0.1%TFA、B=0.1%TFA/50%ACN。勾配=450分間かけて20%から80%B。
グルカゴンCys24Mal−PEG−5K
20.1mgのグルカゴンC24(1−29)及び39.5mgのmPEG−Mal−5000(Nektar Therapeutics)を、3.5mlのPBSに撹拌しながら溶解し、0.5mlの0.01M EDTAを加えた。反応を室温で7時間撹拌し、次に更なる40mgのmPEG−Mal−5000を加えた。およそ15時間後、反応混合物を、2.2×25cmのVydac C18分取逆相カラムに装填し、アセトニトリル勾配を、Pharmacia FPLCを使用して実施した。5分毎の画分を収集し、その間、214nm(2.0A)のUVでモニタリングした。A緩衝液=0.1%TFA、B緩衝液=0.1%TFA/50%ACN、勾配=450分間かけて30%Bから100%B。生成物に対応する画分をまとめ、冷凍及び凍結乾燥して、45.8mgを得た。MALDI質量スペクトル分析は、最大9175.2の典型的なPEG広域信号を示し、これはグルカゴンC24(3457.8)よりもおよそ5,000amu多い。
グルカゴンCys24Mal−PEG−20K
25.7mgのグルカゴンC24(1−29)及び40.7mgのmPEG−Mal−20K(Nektar Therapeutics)を、3.5mlのPBSに撹拌しながら室温で溶解し、0.5mlの0.01M EDTAを加えた。6時間後、出発物質と生成物の比率は、HPLCにより決定すると、およそ60:40であった。更なる25.1mgのmPEG−Mal−20Kを加え、反応を更に16時間撹拌した。生成物比率が有意に改善されなかったので、反応混合物を、2.2×25cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填し、450分かけて30%Bから100%Bへの勾配を使用するPharmacia FPLCにより精製した。A緩衝液=0.1%TFA、B緩衝液=0.1%TFA/50%ACN、流量=4ml/分、5分毎の画分を収集し、その間、214nm(2.0A)のUVでモニタリングした。均質な生成物を含有する画分をまとめ、冷凍及び凍結乾燥して、25.7mgを得た。分析HPLCにより決定された純度は約90%であった。MALDI質量スペクトル分析は、23,000〜27,000の広域のピークを示し、これは出発グルカゴンC24(3457.8)よりもおよそ20,000amu多い。
グルカゴンCys29Mal−PEG−5K
20.0mgのグルカゴンCys29(1−29)及び24.7mgのmPEG−Mal−5000(Nektar Therapeutics)を、3.5mlのPBSに撹拌しながら室温で溶解し、0.5mlの0.01M EDTAを加えた。4時間後、更なる15.6mgのmPEG−Mal−5000を加えて、反応の完了を促進した。8時間後、反応混合物を、2.2×25cmのVydac C18分取逆相カラムに装填し、アセトニトリル勾配を、Pharmacia FPLC系により実施した。5分毎の画分を収集し、その間、214nm(2.0A)のUVでモニタリングした。A=0.1%TFA、B=0.1%TFA/50%ACN。画分75−97を合わせ、冷凍及び凍結乾燥して、HPLCにより回収された出発物質(画分58−63)と異なる、40.0mgの生成物を得た。分析HPLC〔0.46×5cmのZorbax C8、1ml/分、45C、214nm(0.5A)、A=0.1%TFA、B=0.1%TFA/90%ACN、勾配=10分間かけて10%Bから80%B〕によるこの生成物の分析は、95%を超える純度を示した。MALDI質量スペクトル分析は、8,000〜10,000(最大9025.3)の範囲の質量を有するPEG成分の存在を示し、これは出発物質(3484.8)よりも5,540amu多い。
グルカゴンCys24(2−ブチロラクトン)
24.7mgのグルカゴンCys24(1−29)に、4mlの0.05M重炭酸アンモニウム/50%アセトニトリル及び5.5ulの2−ブロモ−4−ヒドロキシ酪酸−γ−ラクトンの溶液(アセトニトリル900ul中100ul)を加えた。室温で3時間撹拌した後、更なる105ulのラクトン溶液を反応混合物に加え、更に15時間撹拌した。反応混合物を、10%酢酸水溶液で10mlに希釈し、2.2×25cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填した。アセトニトリル勾配(450分かけて20%Bから80%B)をPharmacia FPLCにより実施し、その間、5分毎の画分を収集し、214nm(2.0A)のUVでモニタリングした。流量=4ml/分、A=0.1%TFA、B=0.1%TFA/50%ACN。画分74−77を合わせ、冷凍及び凍結乾燥して、7.5mgを得た。HPLC分析は、95%の純度を示し、MALDI質量スペクトル分析は、3540.7の質量又は出発物質よりも84質量単位多い質量を示した。この結果は、単一ブチロラクトン部分の付加と一致している。
グルカゴンCys24(S−カルボキシメチル)
18.1mgのグルカゴンCys24(1−29)を、9.4mlの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH=9.2)に溶解し、0.6mlのブロモ酢酸溶液(アセトニトリル中1.3mg/ml)を加えた。反応を室温で撹拌し、反応の進行を分析HPLCにより追跡した。1時間後、更なる0.1mlのブロモ酢酸溶液を加えた。反応を更に60分間撹拌し、酢酸水溶液で酸性化し、精製のために2.2×25cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填した。アセトニトリル勾配をPharmacia FPLC(流量=4ml/分)により実施し、その間、5分毎の画分を収集し、214nm(2.0A)のUVでモニタリングした。A=0.1%TFA、B=0.1%TFA/50%ACN。画分26−29を合わせ、冷凍及び凍結乾燥して、数mgの生成物を得た。分析HPLCは、90%の純度を示し、MALDI質量スペクトル分析は、所望の生成物の質量3515を確認した。
グルカゴンCys24マレイミド,PEG−3.4K−二量体
16mgのグルカゴンCys24及び1.02mgのMal−PEG−Mal−3400、平均分子量3400のポリ(エチレングリコール)−ビス−マレイミド(Nektar Therpeutics)を、3.5 のリン酸緩衝食塩水及び0.5mlの0.01M EDTAに溶解し、反応を室温で撹拌した。16時間後、更なる16mgのグルカゴンCys24を加え、撹拌を続けた。およそ40時間後、反応混合物をPharmcia PepRPC 16/10カラムに装填し、アセトニトリル勾配をPharmacia FPLCにより実施し、その間、2分毎の画分を収集し、214nm(2.0A)のUVでモニタリングした。流量=2ml/分、A=0.1%TFA、B=0.1%TFA/50%ACN。画分69−74を合わせ、冷凍及び凍結乾燥して、10.4mgを得た。分析HPLCは、90%の純度を示し、MALDI質量スペクトル分析は、9500〜11,000の範囲の成分を示し、これは所望の二量体と一致する。
グルカゴン溶解性アッセイ:
グルカゴン(又は類縁体)の溶液(1mg/ml又は3mg/ml)を0.01NのHClで調製する。100ulの原液を、0.01NのHClで1mlに希釈し、UV吸光度(276nm)を決定する。残りの原液のpHを、200〜250ulの0.1M Na2HOP4(pH9.2)を使用して、pH7に調整する。溶液を4℃で一晩放置し、次に遠心分離する。次に100ulの上澄みを、0.01NのHClで1mlに希釈し、UV吸光度を決定する(2回繰り返す)。
最終吸光度/初期吸光度×100=溶解率
結果を表1に示し、表中、グルカゴン−Cexは、野生型グルカゴン(配列番号1)+配列番号20のカルボキシ末端付加を表し、グルカゴン−Cex R12は、配列番号1を表し、ここで、12位のLysはArgで置換されており、配列番号20のペプチドはカルボキシ末端に付加されている。
グルカゴン受容体結合アッセイ
グルカゴン受容体へのペプチドの親和性を、シンチレーション近接アッセイ技術を利用する競争結合アッセイにより測定した。シンチレーション近接アッセイ緩衝液(0.05Mのトリス−HCl、pH7.5、0.15MのNaCl、0.1%w/vのウシ血清アルブミン)により作製したペプチドの一連の3倍希釈を、96ウエル白色/透明底プレート(Corning Inc., Acton, MA)において、0.05nMの(3−〔125I〕−ヨードチロシル)Tyr10グルカゴン(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)、1ウエルあたり1〜6マイクログラムの、ヒトグルカゴン受容体を過剰発現している細胞から調製した原形質膜画分及び1mg/ウエルのポリエチレンイミン処理ムギ胚芽凝集素A型シンチレーション近接アッセイビーズ(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)と混合した。ロータリー振とう器により800rpmで5分間振とうしてから、プレートを室温で12時間インキュベートし、次にMicroBeta1450液体シンチレーションカウンター(Perkin-Elmer, Wellesley, MA)で読み取った。非特異的結合(NSB)放射能をウエルで測定し、試験試料の最高濃度よりも4倍高い濃度の「非放射性」天然リガンドを有し、総結合放射能をウエルで検出し、競合物質がなかった。特異的結合の率を以下のように計算した:特異的結合率=((結合−NSB)/(総結合−NSB))×100。IC50値は、Origin software(OriginLab, Northampton, MA)を使用して決定した。
機能アッセイ−cAMP合成
cAMPを誘導するグルカゴン類縁体の能力を、ホタルルシフェラーゼに基づいたレポーターアッセイにより測定した。グルカゴン受容体又はGLP−1受容体のいずれかと、cAMP応答配列に結合したルシフェラーゼ遺伝子とを同時形質移入されたHEK293細胞から、0.25%ウシ増殖血清(HyClone, Logan, UT)が補充されたDMEM(Invitrogen, Carlsbad, CA)における16時間の培養により血清を取り除き、次にグルカゴン、GLP−1又は新規グルカゴン類縁体のいずれかによる一連の希釈と共に、96ウエルポリ−D−リシン被覆「バイオコート」プレート(BD Biosciences, San Jose, CA)において37℃、5%CO2で5時間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、100マイクロリットルのLucLiteルミネセンス基質試薬(Perkin-Elmer, Wellesley, MA)を各ウエルに加えた。プレートを短時間振とうし、暗黒で10分間インキュベートし、発光をMicroBeta-1450液体シンチレーションカウンター(Perkin-Elmer, Wellesley, MA)で測定した。ルミネセンス発光は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性化を示し、これは受容体の活性化の測度である。有効50%濃度(「EC50」)は、Origin software(OriginLab, Northampton, MA)を使用して計算した。結果を表2及び3に示す。EC50は、示された受容体に対するペプチドの最大活性化反応の50%を生じるペプチドの濃度である。比較的低いEC50は、ペプチドがその受容体に対して相対的により効力があることを示し、一方、高いEC50は、ペプチドの効力が弱いことを示す。
グルカゴンCys−マレイミドPEG類縁体の安定性アッセイ
各グルカゴン類縁体を水又はPBSに溶解し、初期HPLC分析を実施した。pHを調整した後(4、5、6、7)、試料を37℃で特定の時間インキュベートし、HPLCにより再び分析して、ペプチドの完全性を決定した。特定の目的のペプチドの濃度を決定し、無傷まま残っている率を初期分析と比較して計算した。グルカゴンCys21−マレイミドPEG5Kの結果を図1及び2に示す。
グルカゴンラムタムの合成
285mg(0.2mmol)のメトキシベンズヒドリルアミン樹脂(Midwest Biotech)を60mLの反応容器に入れ、以下の配列を、Boc DEPBT活性化単一カップリングを使用する改良Applied Biosystems 430Aペプチド合成機により組み立てた。
例示的ペプチド
以下の配列を有するグルカゴンペプチドを本明細書に一般的に記載されているように構成した:
XSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFVC*WLMNT(ラクタム@16−20)(配列番号40)
ここで、X=DMIAであり、C*はPEGに結合しているCysである。
XSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFVAWLMNC*(ラクタム@16−20)(配列番号41)
ここで、X=DMIA、Q24Aであり、C*はPEGに結合しているCysである。
X1SQGTFTSDYSKYLDERRAKDFVC*WLX2NT(ラクタム@16−20)(配列番号42)
ここで、X1=DMIAであり、X2は、Nle又はLeuであり、C*は、PEGに結合しているCysである。
X1SQGTFTSDYSKYLDERRAKDFVAWLX2NC*(ラクタム@16−20)(配列番号43)
ここで、X1=DMIA、Q24Aであり、X2は、Nle又はLeuであり、C*は、PEGに結合しているCysである。
A20,A24,Nle27,D28(配列番号44)
A20,A24,Nle27,D28,E29(配列番号45)
A20,A24,Nle27,D28,E30(配列番号46)
A20,A24,Nle27,E28,E29(配列番号47)
A20,A24,Nle27,E28,E30(配列番号48)
A20,A24,Nle27,E29,E30(配列番号49)
A20,E21,A24,Nle27,D28(配列番号50)
A20,E21,A24,Nle27,D28,E29(配列番号51)
A20,E21,A24,Nle27,D28,E30(配列番号52)
A20,E21,A24,Nle27,E28,E29(配列番号53)
A20,E21,A24,Nle27,E28,E30(配列番号54)
A20,E21,A24,Nle27,E29,E30(配列番号55)
あるいは、これらのペプチドのいずれかは、A20及び/又はA24置換の代わりにAIB20及び/又はAIB24を含むことができる。
これらのペプチドのいずれも、更にT16又はAIB16アミノ酸置換を含むことができる。例えば、T16,A20,E21,A24,Nle27,D28,E29(配列番号56)を構成した。
DMIA−Ser−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Tyr−Ser−Lys−Tyr−Leu−Asp−Ser−Arg−Arg−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−Cys*−Trp−Leu−Met−Asn−Thr−COOH(ここで、24位のCys*は、分子量が約40,000ダルトンのPEGに結合しており、16位のGlu及び20位のLysは、ラクタム架橋を介して結合している)(配列番号40)。このペプチドを実施例13に一般的に従って、グルカゴン及びGLP−1受容体に対する活性について試験した。ペプチドは、天然グルカゴンの27.7%の効力及び天然GLP−1の1.1%の効力を示した。
アシル化及び/又はペグ化ペプチドの調製
アシル化及び/又はペグ化ペプチドを以下のように調製する。ペプチドは、CS Bio 4886 Peptide Synthesizer又はApplied Biosystems 430A Peptide Synthesizerのいずれかを使用して、固体支持樹脂上に合成する。Schnolzer et al., Int. J. Peptide Protein Res. 40: 180-193(1992)に記載されている現場中和化学を使用する。アシル化ペプチドでは、アシル化される標的アミノ酸残基(例えば、10位)をNε−FMOCリシン残基で置換する。DMF中の20%ピペリジンによる完全N末端BOC保護ペプチドの30分間の処理によって、FMOC/ホルミル基を除去する。遊離ε−アミノLys残基へのカップリングは、FMOC保護スペーサーアミノ基(例えば、FMOC−(N−BOC)−トリプトファン−OH)又はアシル鎖(例えば、C17−COOH)のいずれかの10倍モル過剰と、DMF/DIEA中のPyBOP又はDEPBT試薬とのカップリングにより達成される。その後のスペーサーアミノ酸のFMOC基の除去に続いて、アシル鎖とのカップリングが繰り返される。100%TFAによる最終処理は、あらゆる側鎖保護基及びN末端BOC基の除去をもたらす。ペプチド樹脂を、5%DIEA/DMFで中和し、乾燥し、次にHF/p−クレゾール95:5を0℃で1時間使用して支持体から切断する。エーテル抽出の後、5%HOAc溶液を使用して粗ペプチドを溶媒和する。次に溶液の試料を、正確な分子量のペプチドを含有しているかについてESI−MSにより確認する。正確なペプチドを、100%CH3CN中の10%CH3CN/0.1%TFAから0.1%TFAの直線勾配を使用してRP−HPLCにより精製する。Vydac C18の22mm×250mmタンパク質カラムを精製に使用する。アシル化ペプチド類縁体は、一般に、緩衝液比率の20:80で完全に溶離する。一部を一緒にプールし、分析RP−HPLCにより純度を調べる。純粋な画分を凍結乾燥して、白色の固体ペプチドを得る。
グルカゴン類縁体の投与後のビーグル犬における血清グルコース濃度の変化
月齢が8〜16か月の健康な8〜12kgのイヌ/ビーグル犬を使用して、グルカゴン作用の薬物動態及び薬力学を決定した。全ての動物を一晩絶食させ、各投与後の以下の時点で出血させた:0時(投与前)、投与後5、10、20、30、45、60、90、120、240分。6匹の動物を各投与量群に使用し、およそ1〜2mlの全血を各時点で取り出した。約1.0mlの全血を、十分な量のトラジロール(アプロチニン)を含有するK2 EDTA管に加えて、少なくとも500KIU/mLの全血を得た。冷蔵遠心分離機により1,500〜3,000×gで試料を10〜15分間遠心分離した後、およそ500uLの血漿を収集した。試料をプラスチックバイアルに移し、−70℃以下で凍結保存した。残りの1.0mLの全血は、血液試料を空の管に入れ、周囲温度で15〜20分間放置し、次に冷蔵遠心分離機により1,500〜3,000×gで10〜15分間遠心分離することによって、血清に変換した。試料をプラスチックバイアルに移し、−70℃以下で凍結保存した。グルカゴン及び類縁体を0.01NのHClに0.1667mg/mlの濃度で溶解し、動物に0.03ml/kgで投与した。
以下のペプチドを実質的に上記に記載されたように作製した:
(A)AIBによる16位のアミノ酸置換を有する配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチド(「AIB16グルカゴン」);
(B)AIBによる19位でのアミノ酸置換を有する配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチド(「AIB19グルカゴン」);
(C)AIBによる20位でのアミノ酸置換を有する配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチド(「AIB20グルカゴン」);
(D)AIBによる21位でのアミノ酸置換を有する配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチド(「AIB21グルカゴン」);
(E)AIBによる24位でのアミノ酸置換を有する配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチド(「AIB24グルカゴン」);
(F)AIBによる16及び20位でのアミノ酸置換を有する配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチド(「AIB16,20グルカゴン」);
(G)AIBによる16及び24位でのアミノ酸置換を有する配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチド(「AIB16,24グルカゴン」);
(H)AIBによる20及び24位でのアミノ酸置換を有する配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチド(「AIB20,24グルカゴン」);並びに
(I)AIBによる16、20及び24位でのアミノ酸置換を有する配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチド(「AIB16,20,24グルカゴン」)。
以下のグルカゴン類縁体ペプチドを実質的に上記に記載されたように作製した:
28位にAsp及び29位にGluを含むように修飾された配列番号1のアミノ酸配列を含む「D28/E29グルカゴン」:
HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMDE(配列番号75);及び
16位にAibを含むように更に修飾された配列番号75のアミノ酸配列を含む「AIB16/D28/E29グルカゴン」):
HSQGTFTSDYSKYLDAibRRAQDFVQWLMDE(配列番号76)。
表6に提示されている修飾を有する配列番号1のアミノ酸をそれぞれ含む、Aセットのペプチドを、本明細書に実質的に記載されているように作製する。
以下の、3位に追加の修飾を有する、ペプチドJ:
HS−X−GTFTSDYSKYLDTRRAAEFVAWL(Nle)DE
(配列番号59)の主鎖、又は
ペプチドK:
HS−X−GTFTSDYSKYLD(Aib)RRAADFVAWLMDE
(配列番号60)
の主鎖を含むグルカゴン類縁体ペプチドを、本明細書に実質的に記載されているように、固相ペプチド合成により作製した。ペプチドを、実施例13に実質的に記載されているように、グルカゴン受容体に対するインビトロ活性について試験した。それぞれのペプチドのEC50(nM)を表7に示す。
多様なグルカゴン類縁体主鎖の3位にDab(Ac)を含むグルカゴン類縁体ペプチドを、本明細書に実質的に記載されているように作製し、グルカゴン受容体に対するインビトロ活性を試験した。それぞれのペプチドの構造及び活性を表8に示す。
表9に示されている修飾を有する配列番号1のアミノ酸を含む、第1セット(Aセット)のペプチドを、本明細書に実質的に記載されているように作製する。
共有分子内架橋を欠き、2位にAIBを含む、16位にAIBを含む及び10位のLys残基にスペーサーを介して結合している脂肪アシル基を含む幾つかのグルカゴン類縁体を、本明細書に実質的に記載されているように作製した。アシル化グルカゴン類縁体は、スペーサーの種類、ペグ化の存在若しくは不在、及び/又はアシル基の大きさによって異なった。アシル化グルカゴン類縁体を、実施例13に実質的に記載されているように、グルカゴン受容体及びGLP−1受容体に対するインビトロ活性について試験した。それぞれのペプチドの構造、並びにグルカゴン及びGLP−1受容体に対するインビトロ活性の概要を、表10及び11に示す。
配列番号71、76及び78のグルカゴン類縁体ペプチドを安定性についてアッセイした。全てのペプチドは、28位にAspを含み、配列番号71及び76のペプチドは、追加的に29位にGluを含んだ。配列番号78のペプチドは追加の修飾を何も含まなかったが、配列番号71及び76のペプチドは、両方とも16位にAIBを含んだ。配列番号71のペプチドは、更に、3位にDab(Ac)、20及び24位にAla、並びに27位にLeuを含んだ。
それぞれ平均体重48.7gのDIOマウス(1群あたり8匹)に、ビヒクルのみ、30nmol/kg若しくは100nmol/kgのアシル化グルカゴン類縁体ペプチド、又は長期作用GLP−1類縁体であるリラグルチド (Novo Nordisk, Denmark)を7日間毎日皮下注射した。アシル化グルカゴン類縁体は以下であった:
野生型グルカゴン(配列番号1)のアミノ酸配列のうち、10位のTyrが修飾されてアシル化Lys残基となり、アシル化Lysが、C16脂肪アシルを含み、C末端カルボキシレートがアミド基に置換されたアミノ酸配列を含む「(C16)グルカゴンアミド」;
C16脂肪アシル基がガンマ−Glu−ガンマ−Gluジペプチドスペーサーを介して10位のLysに結合している以外はC16グルカゴンアミドと同じ構造を含む「γE−γE−C16グルカゴンアミド」(アシル化Lysの構造については下記を参照すること);
C16脂肪アシル基がβ−Ala−β−Alaジペプチドスペーサーを介して10位のLysに結合している以外はC16グルカゴンアミドと同じ構造を含む「βAβA−C16グルカゴンアミド」。
グルカゴン類縁体ペプチドを、本明細書に記載されているように固相ペプチド合成により作製し、ペプチドの10又は30位のいずれかをアシル化した。ペプチド及びそれらの構造は以下である:
2位のXがd−Serであり、30位のLysがC14脂肪アシル基でアシル化され、C末端カルボキシレートがアミドに代わっている、アミノ酸配列HXQGTFTSDYSKYLDERRAKDFVQWLMNTK−アミド(配列番号79)を含む「ペプチドdS2E16K20K30−C14グルカゴンアミド」;
2位のXがd−Serであり、10位のLysがC14脂肪アシル基でアシル化され、C末端カルボキシレートがアミドに代わっている、アミノ酸配列HXQGTFTSDKSKYLDERRAKDFVQWLMNT−アミド(配列番号80)を含む「ペプチドdS2K10(C14)E16K20−グルカゴンアミド」;
2位のXがd−Serであり、30位のLysがC16脂肪アシル基でアシル化され、C末端カルボキシレートがアミドに代わっている、アミノ酸配列HXQGTFTSDYSKYLDERRAKDFVQWLMNTK−アミド(配列番号81)を含む「ペプチドdS2E16K20K30−C16グルカゴンアミド」;
2位のXがd−Serであり、10位のLysがC16脂肪アシル基でアシル化され、C末端カルボキシレートがアミドに代わっている、アミノ酸配列HXQGTFTSDKSKYLDERRAKDFVQWLMNT−アミド(配列番号82)を含む「ペプチドdS2K10(C16)E16K20−グルカゴンアミド」;
2位のXがAIBであり、10位のKがC18脂肪アシル基でアシル化され、24位のCysが40kDaのPEG分子を含み、C末端カルボキシレートがアミドに代わっている、アミノ酸配列HXQGTFTSDKSKYLDEQAAKEFICWLMNT−アミド(配列番号83)を含む「ペプチドキメラ2−AIB2−K10−アシル化」;及び
2位のXがAIBであり、30位のKがC18脂肪アシル基でアシル化され、24位のCysが40kDaのPEG分子を含み、C末端カルボキシレートがアミドに代わっている、アミノ酸配列HXQGTFTSDYSKYLDEQAAKEFICWLMNTK−アミド(配列番号84)を含む「ペプチドキメラ2−AIB2−K30−アシル化」。
Claims (11)
- グルカゴンアゴニスト活性を有するグルカゴンペプチドであって、
配列番号77のアミノ酸配列を含み、
前記配列番号77のアミノ酸配列は、下記から選ばれる置換をされており、
Thr又はAIBによる16位のSerの置換;
Ala、Ser、Thr又はAIBによる20位のGlnの置換;
Gluによる21位のAspの置換;
Ala、Ser、Thr又はAIBによる24位のGlnの置換;
Leu又はNleによる27位のMetの置換;
荷電アミノ酸による、28位のAsnの置換;
荷電アミノ酸による、29位のThrの置換; 及び
これらの組み合わせ;
前記配列番号77のアミノ酸配列の3位のXaaが、アセトアミドメチル−システイン(C(Acm))、アセチルジアミノブタン酸(Dab(Ac))、カルバモイルジアミノプロパン酸(Dap(尿素))、アセチルオルニチン(Om(Ac))、メチルグルタミン(Q(Me))及びメチオニン−スルホキシド(M(O))からなる群から選択され、
16、20、21、及び24位のうちの1、2、3つ、若しくは全てにおける、α,α−二置換アミノ酸を含み、
ヒトグルカゴン受容体に対し1nM以下のEC50を示す、グルカゴンペプチド。 - 16位にα,α−二置換アミノ酸がある、請求項1に記載のグルカゴンペプチド。
- α,α−二置換アミノ酸がアミノイソ酪酸(AIB)である、請求項1又は2に記載のグルカゴンペプチド。
- 以下からなる群より選択される1個のアミノ酸修飾を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のグルカゴンペプチド:
Ala又はAIBによる20位のGlnの置換;
Ala又はAIBによる24位のGlnの置換;
Leuによる27位のMetの置換;
C末端への配列番号20のアミノ酸配列の付加(ここで29位のアミノ酸はThr又はGlyである);
荷電アミノ酸による、28位のAsnの置換;
荷電アミノ酸による、29位のThrの置換;及び
これらの修飾の組み合わせ。 - 配列番号69〜74のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のグルカゴンペプチド。
- 配列番号71のアミノ酸配列を含む、グルカゴンペプチド。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のグルカゴンペプチドを含む、結合体、融合ペプチド、又は二量体であって、前記結合体は前記グルカゴンペプチドに結合している異種ペプチド、異種ポリペプチド、血漿タンパク質、標的作用物質、免疫グロブリン若しくはその一部、可変部領域、CDR、Fc領域、診断用標識、放射性同位体、蛍光体、酵素標識、ポリマー、水溶性ポリマー、治療剤、又は診断剤であり、前記融合ペプチドは、前記グルカゴンペプチドの末端に融合している第2のペプチド又はポリペプチドを含む、結合体、融合ペプチド又は二量体。
- 請求項1〜6に記載のグルカゴンペプチド、請求項7に記載の二量体、結合体、若しくは融合ペプチド、又はこれらの組み合わせと、
薬学的に許容される担体と、
を含む医薬組成物。 - グルカゴンアゴニストを必要とする患者に、グルカゴンアゴニストを投与するためのキットであって、請求項8に記載の医薬組成物と、該医薬組成物を該患者に投与するための装置とを含む、キット。
- 低血糖症の治療又は予防を必要とする患者の低血糖症の治療若しくは予防、又は血中グルコースレベルの安定化を必要とする患者の血中グルコースレベルの安定化に使用するための、請求項1〜6のいずれか1項に記載のグルカゴンペプチド。
- 低血糖症の治療又は予防を必要とする患者の低血糖症を治療若しくは予防するための医薬品の製造、又は血中グルコースレベルの安定化を必要とする患者の血中グルコースレベルを安定化するための医薬品の製造における、請求項1〜6のいずれか1項に記載のグルカゴンペプチドの使用方法。
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