JP2024023436A - 工学操作された核酸の送達および製剤 - Google Patents

工学操作された核酸の送達および製剤 Download PDF

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Abstract

【課題】修飾核酸などの生物学的部分を細胞内に送達してタンパク質発現を変調するための製剤および組成物を提供する。【解決手段】本願発明に係る組成物および方法は、生物学的部分の送達を含み、タンパク質の産生に有用である。【選択図】なし

Description

本発明は、送達方法に関する。本方法は、修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）などの修飾核酸の治療剤送達にとくに有用である。
治療剤用途およびバイオプロセス用途の両方で効果的なタンパク質発現を達成するための医薬組成物の従来の送達方法には、多くの問題が存在する。たとえば、導入されたＤＮＡは、ある頻度で宿主細胞ゲノムＤＮＡ内に組み込まれて、宿主細胞ゲノムＤＮＡに変化および／または損傷をもたらしうる。そのほか、細胞内に導入された異種デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、娘細胞（異種ＤＮＡが染色体中に組み込まれているか否かにかかわらず）または子孫に遺伝しうる。
それに加えて、送達後ただしコードタンパク質の産生前、タンパク質発現を達成可能にする多くの工程が行われなければならない。細胞内に入った後、ＤＮＡは、核中に輸送されてＲＮＡに転写されなければならない。次いで、ＤＮＡから転写されたＲＮＡは、細胞質に入ってタンパク質に翻訳されなければならない。投与されたＤＮＡからタンパク質までの多くのプロセス工程は、機能性タンパク質の産生前に遅延時間を形成するだけでなく、各工程は、誤差および細胞損傷の機会を与える。さらに、ＤＮＡは、細胞に進入するが発現されないかまたは適度な速度もしくは濃度で発現されないことが多いので、細胞内でＤＮＡ発現を達成するのは、困難であることが知られている。このことは、ＤＮＡが初代細胞または修飾細胞系に導入される場合、とくに問題となりうる。
以上のことが適正に管理されたとしても、効果的に送達して臨床転帰をもたらすのに十分な時間にわたりタンパク質の治療上適切なレベルを達成するには、依然としてかなりの困難を伴う。
したがって、ポリペプチドをコードする核酸の細胞内での翻訳およびプロセスの変調を取り巻く隠れた困難に対処する生物学的治療剤の送達、ひいては送達された治療剤からのタンパク質発現の最適化の必要性が、当技術分野に存在する。
本発明は、修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）などの修飾核酸を含有しうる医薬組成物を送達することによりこの必要性に対処し、さらには、当技術分野の問題を回避する製剤を包含しうる。
本明細書に記載されているのは、タンパク質発現を変調するために修飾核酸、工学操作されたメッセンジャーＲＮＡ、単離されたポリヌクレオチドなどの生物学的部分を細胞内に送達するための組成物および方法である。
単離されたポリヌクレオチドは、配列番号４、７、８、１２などの配列を含みうるが、これらに限定されるものではない。ポリヌクレオチドは、５’Ｃａｐ１構造と約１６０ヌクレオチド長のポリＡテールとをさらに含みうる。さらに、単離されたポリヌクレオチドは、医薬組成物中に製剤化されうる。
目的のポリペプチドは、ポリヌクレオチドを含む医薬組成物を対象に投与することにより、それを必要とする対象の細胞内、組織内、または体液内で産生されうる。ポリヌクレオチドは、配列番号４、７、８、および１２からなる群から選択される配列を含みうる。ポリヌクレオチドは、５’Ｃａｐ１構造と約１６０ヌクレオチド長のポリＡテールとをさらに含みうる。
医薬組成物は、製剤化されうる。この製剤は、生理食塩水製剤または脂質製剤から選択されうるが、これらに限定されるものではない。医薬組成物は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、局所投与などの任意の投与経路により投与されうるが、これらに限定されるものではない。脂質製剤は、リポソーム、リポプレックス、コポリマーたとえばＰＬＧＡ、脂質ナノ粒子などから選択されうるが、これらに限定されるものではない。
医薬組成物は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇの全用量で投与されうる。全用量は、複数回投与により投与されうる。投与および／または複数回投与は、１日３回、１日２回、１日１回、２日に１回、３日に１回、毎週１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、毎月１回などのスケジュールで行われうるが、これらに限定されるものではない。
修飾ポリペプチドは、ヌクレオシド修飾などのポリヌクレオチド修飾を含みうる。ヌクレオシド修飾は、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、５－アザ－シチジン、プソイドイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－プソイドイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－プソイドイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－プソイドイソシチジン、４－メトキシ－１－メチル－プソイドイソシチジン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニンおよび２－メトキシ－アデニン、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、およびＮ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシン、ならびにそれらの組合せを含みうるが、これらに限定されるものではない。
目的のポリペプチドのレベルの増加は、組織、たとえば、限定されるものではないが、肝臓、脾臓、腎臓、肺、心臓、腎周囲脂肪組織、胸腺、および筋肉で、ならびに／または体液、たとえば、限定されるものではないが、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液もしくは射精前液、汗、糞便、毛髪、涙、嚢胞液、胸水および腹水、心嚢液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、水様便、膵液、洞腔洗浄液、気管支肺吸引物、胞胚腔液、および臍帯血で観測可能である。レベルの増加は、投与後２時間以内、８時間以内、および／または２４時間以内に対象の組織および／または体液で観測可能である。さらに、レベルの増加は、エキソソーム中の修飾ポリペプチドのレベルから決定可能である。
本発明の種々の実施形態の詳細は、以下の説明に示される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
本発明に有用な先行技術の脂質構造を示す図。示されているのは、９８Ｎ１２－５（ＴＥＴＡ５－ＬＡＰ）、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ（２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］ジオキソラン）、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、およびＣ１２－２００の構造である。 本明細書に教示されるＩＶＴ反応に有用な代表的プラスミドを示す図。プラスミドは、本発明者らにより設計されたインサート６４８１８を含有する。 ｍＣｈｅｒｒｙ ｍｍＲＮＡを含有するＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡおよび９８Ｎ１２－１５（精製の前および後）のナノ粒子製剤についてｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング結果を示すヒストグラム。図３Ａは、ＨＥＫ２９３細胞でのスクリーニング結果を示している。 ｍＣｈｅｒｒｙ ｍｍＲＮＡを含有するＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡおよび９８Ｎ１２－１５（精製の前および後）のナノ粒子製剤についてｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング結果を示すヒストグラム。図３Ｂは、ＨｅｐＧ２細胞でのスクリーニング結果を示している。 ｍＣｈｅｒｒｙ ｍｍＲＮＡを含有するＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡおよび９８Ｎ１２－１５（精製の前および後）のナノ粒子製剤について平均蛍光強度のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング結果を示すヒストグラム。図４Ａは、ＨＥＫ２９３細胞でのスクリーニング結果を示している。 ｍＣｈｅｒｒｙ ｍｍＲＮＡを含有するＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡおよび９８Ｎ１２－１５（精製の前および後）のナノ粒子製剤について平均蛍光強度のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング結果を示すヒストグラム。図４Ｂは、ＨｅｐＧ２細胞でのスクリーニング結果を示している。 精製の前および後のＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡおよび９８Ｎ１２－１５のナノ粒子製剤についてｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング結果を示すヒストグラム。図５Ａは、ＨＥＫ２９３細胞での９８Ｎ１５－２のスクリーニング結果を示している。 精製の前および後のＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡおよび９８Ｎ１２－１５のナノ粒子製剤についてｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング結果を示すヒストグラム。図５Ｂは、ＨＥＫ２９３細胞でのＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡのスクリーニング結果を示している。 精製の前および後のＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡおよび９８Ｎ１２－１５のナノ粒子製剤についてｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング結果を示すヒストグラム。図５Ｃは、ＨＥＫ２９３細胞でのＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡのスクリーニング結果を示している。 ｍＣｈｅｒｒｙ ｍｍＲＮＡを含有するＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、およびＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡのナノ粒子製剤についてｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング結果を示すヒストグラム。図６Ａは、６０ｎｇ／ウェルの修飾ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡを含有するＨＥＫ２９３細胞でのｍＣｈｅｒｒｙの平均蛍光強度を示している。 ｍＣｈｅｒｒｙ ｍｍＲＮＡを含有するＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、およびＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡのナノ粒子製剤についてｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング結果を示すヒストグラム。図６Ｂは、６２．５ｎｇ／ウェルの濃度の修飾ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡを有するナノ粒子製剤を含有するＨＥＫ２９３細胞でのｍＣｈｅｒｒｙの平均蛍光強度を示している。 ｍＣｈｅｒｒｙ ｍｍＲＮＡを含有するＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、およびＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡのナノ粒子製剤についてｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング結果を示すヒストグラム。図６Ｃは、６２．５ｎｇ／ウェルの濃度の修飾ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡを有するナノ粒子製剤を含有するＨＥＫ２９３細胞でのｍＣｈｅｒｒｙの平均蛍光強度を示している。 ｍＣｈｅｒｒｙ ｍｍＲＮＡを含有するＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、およびＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡのナノ粒子製剤についてｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング結果を示すヒストグラム。図６Ｄは、６２．５ｎｇ／ウェルの濃度の修飾ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡを有するナノ粒子製剤を含有するＨｅｐＧ２細胞でのｍＣｈｅｒｒｙの平均蛍光強度を示している。 ｍＣｈｅｒｒｙ ｍｍＲＮＡを含有するＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、およびＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡのナノ粒子製剤についてｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング結果を示すヒストグラム。図６Ｅは、６２．５ｎｇ／ウェルの濃度の修飾ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡを有するナノ粒子製剤を含有するＨｅｐＧ２細胞でのｍＣｈｅｒｒｙの平均蛍光強度を示している。 マウスにおける修飾ヒトエリトロポイエチンｍｍＲＮＡまたはルシフェラーゼｍｍＲＮＡの投与後の血清中ヒトエリトロポイエチンのｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング結果を示すヒストグラム。図７Ａは、筋肉内投与後のヒトエリトロポイエチンのｐｇ／ｍｌ単位の濃度を示している。 マウスにおける修飾ヒトエリトロポイエチンｍｍＲＮＡまたはルシフェラーゼｍｍＲＮＡの投与後の血清中ヒトエリトロポイエチンのｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング結果を示すヒストグラム。図７Ｂは、皮下投与後のヒトエリトロポイエチンのｐｇ／ｍｌ単位の濃度を示している。 バイオフォトイメージングによるｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング結果のヒストグラム。図８Ａは、左後肢中への５μｇの筋肉内注射による生物発光（光子／秒）のヒストグラムである。 バイオフォトイメージングによるｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング結果のヒストグラム。図８Ｂは、右後肢中への５０μｇの筋肉内注射による生物発光のヒストグラムである。 バイオフォトイメージングによるｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング結果のヒストグラム。図８Ｃは、５０μｇの皮下注射後のバイオフォトイメージングによるｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング結果を示すヒストグラムである。 バイオフォトイメージングによるｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング結果のヒストグラム。図８Ｄは、５０μｇの静脈内投与後のバイオフォトイメージングによるｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング結果を示すヒストグラムである。 マウスにおいて筋肉内投与、皮下投与、または静脈内投与された修飾ヒトＧ－ＣＳＦ ｍｍＲＮＡについてｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング結果を示すヒストグラム。 筋肉内投与、皮下投与、または静脈内投与された修飾Ｇ－ＣＳＦについてｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング結果を示すヒストグラム。 マウスにおいて筋肉内投与または皮下投与された修飾ヒトＧ－ＣＳＦ ｍｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング結果を示すヒストグラム。図１３Ａは、修飾Ｇ－ＣＳＦの筋肉内投与後の血清中ヒトＧ－ＣＳＦのｐｇ／ｍｌ単位の濃度を示している。 マウスにおいて筋肉内投与または皮下投与された修飾ヒトＧ－ＣＳＦ ｍｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング結果を示すヒストグラム。図１３Ｂは、修飾Ｇ－ＣＳＦの皮下投与後の血清中ヒトＧ－ＣＳＦのｐｇ／ｍｌ単位の濃度を示している。 マウスにおいて筋肉内投与された修飾ヒトエリトロポイエチンｍｍＲＮＡまたはルシフェラーゼｍｍＲＮＡの投与後の血清中ヒトエリトロポイエチンのｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング結果を示すヒストグラム。
とくに定義されていないかぎり、本明細書で用いられる科学技術用語はすべて、本発明が関連する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同一の意味を有する。
本明細書に記載されているものは、タンパク質発現を変調するために修飾ｍＲＮＡ分子を送達するための組成物および方法である。
本明細書ならびに２０１１年８月５日に出願された同時係属共同出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４６８６１号および２０１１年１０月３日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５４６３６号（それらの内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、これら修飾核酸分子は、それらが導入された細胞集団の先天性免疫活性を低減させることにより、その細胞集団におけるタンパク質産生の効率を増大させることが可能である。
修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）
本発明は、少なくとも１種のポリペプチドをコードするかつ１種以上の修飾ヌクレオシド（「修飾核酸」または「修飾核酸分子」または「工学操作された核酸」と称される）を含有する核酸（ＲＮＡとくにｍＲＮＡを含む）を提供する。この核酸は、ｍＲＮＡが導入された細胞の先天性免疫反応の実質的誘導の欠如を含む有用な性質を有する。このｍｍＲＮＡは、タンパク質産生の効率、核酸の細胞内保持率、および接触細胞の生存能を増強するとともに、低減された免疫原性を有するので、これらの性質を有するこの核酸は、本明細書では「増強」核酸または修飾ＲＮＡと称される。
「核酸」という用語は、その最広義の意味では、ホスホジエステル（ｐｈｏｓｐｏｈｄｉｅｓｔｅｒ）結合を介して結合されたヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物および／または物質を含む。このポリマーは、多くの場合、オリゴヌクレオチドとして参照される。
例示的な核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはそれらのハイブリッドを含む。それらはまた、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、三重螺旋形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、ベクターなどを含みうる。
好ましい実施形態では、核酸は、１種以上の修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）である。本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態では、本発明に係るｍｍＲＮＡは、ｍＲＮＡが導入された細胞の先天性免疫反応を実質的に誘導しない。
本発明に係るｍｍＲＮＡは、１種以上のポリペプチドをコードしうる。一般的には、目的のポリペプチドは、哺乳動物ゲノム中に天然に存在するものである。
本発明によれば、本開示に係る修飾ｍＲＮＡ（本明細書では「ｍｍＲＮＡ」）の最も短い長さは、ジペプチドをコードするのに十分でありうるｍＲＮＡ配列の長さでありうる。他の実施形態では、ｍＲＮＡ配列の長さは、トリペプチドをコードするのに十分でありうる。他の実施形態では、ｍＲＮＡ配列の長さは、テトラペプチドをコードするのに十分でありうる。他の実施形態では、ｍＲＮＡ配列の長さは、ペンタペプチドをコードするのに十分でありうる。他の実施形態では、ｍＲＮＡ配列の長さは、ヘキサペプチドをコードするのに十分でありうる。他の実施形態では、ｍＲＮＡ配列の長さは、ヘプタペプチドをコードするのに十分でありうる。他の実施形態では、ｍＲＮＡ配列の長さは、オクタペプチドをコードするのに十分でありうる。他の実施形態では、ｍＲＮＡ配列の長さは、ノナペプチドをコードするのに十分でありうる。他の実施形態では、ｍＲＮＡ配列の長さは、デカペプチドをコードするのに十分でありうる。
一般的には、本発明に係る修飾ｍＲＮＡの長さは、約３０ヌクレオチド超の長さである（たとえば、約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、および３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００ヌクレオチド以上または１００，０００ヌクレオチド以下）。
いくつかの実施形態では、本発明に係る修飾ｍＲＮＡは、約３０～約１００，０００ヌクレオチドを含む（たとえば、３０～５０、３０～１００、３０～２５０、３０～５００、３０～１，０００、３０～１，５００、３０～３，０００、３０～５，０００、３０～７，０００、３０～１０，０００、３０～２５，０００、３０～５０，０００、３０～７０，０００、１００～２５０、１００～５００、１００～１，０００、１００～１，５００、１００～３，０００、１００～５，０００、１００～７，０００、１００～１０，０００、１００～２５，０００、１００～５０，０００、１００～７０，０００、１００～１００，０００、５００～１，０００、５００～１，５００、５００～２，０００、５００～３，０００、５００～５，０００、５００～７，０００、５００～１０，０００、５００～２５，０００、５００～５０，０００、５００～７０，０００、５００～１００，０００、１，０００～１，５００、１，０００～２，０００、１，０００～３，０００、１，０００～５，０００、１，０００～７，０００、１，０００～１０，０００、１，０００～２５，０００、１，０００～５０，０００、１，０００～７０，０００、１，０００～１００，０００、１，５００～３，０００、１，５００～５，０００、１，５００～７，０００、１，５００～１０，０００、１，５００～２５，０００、１，５００～５０，０００、１，５００～７０，０００、１，５００～１００，０００、２，０００～３，０００、２，０００～５，０００、２，０００～７，０００、２，０００～１０，０００、２，０００～２５，０００、２，０００～５０，０００、２，０００～７０，０００、および２，０００～１００，０００）。
ポリペプチド変異体
本発明に係るｍｍＲＮＡは、参照ポリペプチド配列（たとえば野生型ｍＲＮＡ）と特定の同一性を有する変異ポリペプチドをコードしうる。当技術分野で公知の「同一性」という用語は、配列比較により決定される２つ以上のペプチドの配列間の関係を意味する。当技術分野では、「同一性」はまた、２つ以上のアミノ酸残基の鎖間の一致数により決定されるペプチド間の配列関連度を意味する。「同一性」は、特定の数学的モデルまたはコンピュータープログラム（すなわち「アルゴリズム」）により扱われるギャップアライメント（もしあれば）を用いた２つ以上の配列のより小さい部分間の完全一致パーセントで見積られる。関連ペプチドの同一性は、公知の方法により容易に計算可能である。そのような方法としては、計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、レスク，Ａ．Ｍ．（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．）編、オックスフォード大学出版局（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９８８年、バイオコンピューティング：インフォマティクスおよびゲノムプロジェクト、スミス，Ｄ．Ｗ．（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９３年、配列データのコンピュータ解析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ）、第１部、グリフィン，Ａ．Ｍ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．）およびグリフィン，Ｈ．Ｇ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．）編、ヒューマナプレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージ（Ｎｅｗ
Ｊｅｒｓｅｙ）、１９９４年、分子生物学における配列解析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、フォンハインジ，Ｇ．（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．）著、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年、配列解析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ）、グリブスコフ，Ｍ．（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．）およびデベロー，Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）編、Ｍ．ストックトンプレス（Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９１年、ならびにカリロ（Ｃａｒｉｌｌｏ）ら著、ＳＩＡＭ応用数学誌（ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．）、第４８巻、１０７３頁（１９８８年）に記載のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド変異体は、参照ポリペプチドと同一または類似の活性を有する。他の選択肢として、変異体は、参照ポリペプチドに対して変化した活性（たとえば、増大または減少した）を有する。一般的には、本発明に係る特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、本明細書に記載のおよび当業者に公知の配列アライメントプログラムおよびパラメーターにより決定した場合、特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するであろう。
当業者であればわかるように、タンパク質断片、機能性タンパク質ドメイン、および相同タンパク質もまた、本発明の範囲内にあるとみなされる。たとえば、本明細書には、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００アミノ酸、または１００アミノ酸超の長さの参照タンパク質の任意のタンパク質断片（参照ポリペプチド配列よりも少なくとも１アミノ酸残基短いがそれ以外は同一であるポリペプチド配列を意味する）が提供される。他の例では、本明細書に記載の配列のいずれかに対して約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％の同一性である約２０、約３０、約４０、約５０、または約１００アミノ酸の伸長部を含む任意のタンパク質を、本発明に従って利用することが可能である。特定の実施形態では、本発明に従って利用されるタンパク質配列は、本明細書に提供されたまたはそこで参照された配列のいずれかに示されるように、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上の突然変異を含む。
標的化部分
本発明の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで、細胞が特定の組織間隙を標的とするようにまたは特定の部分と相互作用するように機能するタンパク質結合パートナまたはレセプターを細胞表面上に発現すべく、提供される。好適なタンパク質結合パートナは、抗体およびその機能性フラグメント、スキャフォールドタンパク質、またはペプチドを含む。
細胞透過性ペプチド
本明細書に開示されるｍｍＲＮＡは、細胞透過性ポリペプチドをコードしうる。本明細書で用いられる場合、「細胞透過性ポリペプチド」とは、分子の細胞内取込みを促進しうるポリペプチドを意味する。「ＣＰＰ」が細胞透過ポリペプチドおよび細胞透過性ペプチドを意味することは、当技術分野で公知である。本明細書で用いられる場合、略語ＣＰＰが細胞透過性ポリペプチドまたは細胞透過性ペプチドのいずれを意味するかは、明らかであろう。
本発明に係る細胞透過性ポリペプチドは、１種以上の検出可能な標識を含有していてもよい。ポリペプチドは、部分的に標識されていてもよいし、全体が完全に標識されていてもよい。ｍｍＲＮＡは、検出可能な標識を完全にまたは部分的にコードしていてもよいし、まったくコードしていなくてもよい。細胞透過性ペプチドはまた、シグナル配列を含んでいてもよい。本明細書で用いられる場合、「シグナル配列」とは、タンパク質翻訳時に新生タンパク質のアミノ末端に結合されるアミノ酸残基の配列を意味する。シグナル配列は、細胞透過性ポリペプチドの分泌シグナルを伝達するために使用されうる。
融合タンパク質
修飾核酸およびｍｍＲＮＡは、融合タンパク質をコードしうる。融合タンパク質は、荷電タンパク質を治療用タンパク質に機能可能に結合することにより形成されうる。本明細書で用いられる場合、「機能可能に結合」とは、細胞に導入された時に複合体の発現を可能にするような方法で治療用タンパク質および荷電タンパク質が結合されることを意味する。本明細書で用いられる場合、「荷電タンパク質」とは、正電荷、負電荷、全体として中性電荷を有するタンパク質を意味する。好ましくは、治療用タンパク質は、融合タンパク質の生成時に荷電タンパク質に共有結合されうる。全アミノ酸または表面アミノ酸に対する表面電荷の比は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、または０．９でありうる。
修飾ｍＲＮＡの合成
本発明に従って使用される核酸は、化学合成や酵素合成をはじめとする任意の利用可能な技術に従って調製可能であり、この技術は、一般的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、より長い前駆体の酵素切断または化学切断などと称されるが、これらに限定されるものではない。ＲＮＡの合成方法は、当技術分野で公知である（たとえば、ガイト，Ｍ．Ｊ．（Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．）編、オリゴヌクレオチド合成：実用的手法（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ）、オックスフォード［オックスフォードシャー］、ワシントンＤＣ：ＩＲＬプレス（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、１９８４年、およびヘルデウィン，Ｐ．（Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．）編、オリゴヌクレオチド合成：方法と応用（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、分子生物学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第２８８巻（クリフトン（Ｃｌｉｆｔｏｎ），Ｎ．Ｊ．）トトワ（Ｔｏｔｏｗａ），Ｎ．Ｊ．、フマナプレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、２００５年（両方とも参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
本明細書に開示される修飾ＲＮＡの合成に使用される修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、以下の一般的な方法および手順を用いて、容易に入手可能な出発材料から調製可能である。典型的なまたは好ましいプロセス条件（すなわち、反応温度、時間、反応剤のモル比、溶媒、圧力など）が与えられているが、とくに明記されていないかぎり他のプロセス条件もまた使用可能であるとみなされる。最適反応条件は、使用される特定の反応剤および溶媒によって異なりうるが、そのような条件は、当業者であれば、慣例的な最適化手順により決定可能である。
本明細書の製造プロセスは、当技術分野で公知の任意の好適な方法に従って監視可能である。たとえば、生成物形成は、核磁気共鳴分光法（たとえば、１Ｈもしくは１３Ｃ）、赤外分光法、分光測光法（たとえば、ＵＶ可視）、質量分析法などの分光学的手段により、または高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）や薄層クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーにより、監視可能である。
ｍＲＮＡの修飾
翻訳可能領域と、１、２、または２超の異なる修飾と、を含有するｍｍＲＮＡを提供する。
いくつかの実施形態では、化学修飾は、ヌクレオチドの核酸塩基上に位置しうる。
いくつかの実施形態では、化学修飾は、ヌクレオチドの糖部分上に位置しうる。
いくつかの実施形態では、化学修飾は、ヌクレオチドのリン酸骨格上に位置しうる。
本発明に係る修飾ＲＮＡの製造または合成に使用される修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドの調製は、種々の化学基の保護および脱保護を含みうる。保護および脱保護の必要性ならびに適切な保護基の選択は、当業者であれば、容易に決定可能である。
保護基の化学は、たとえば、グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）ら著、有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、第２版、ワイリー・アンド・サンズ（Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、１９９１年（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見いだしうる。
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、オガタ（Ｏｇａｔａ）ら著、有機化学誌（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第７４巻：２５８５～２５８８頁、２００９年、プルマル（Ｐｕｒｍａｌ）ら著、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第２２巻（第１号）：７２～７８頁、１９９４年、フクハラ（Ｆｕｋｕｈａｒａ）ら著、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第１巻（第４号）：５６３～５６８頁、１９６２年、およびシュイ（Ｘｕ）ら著、テトラヘドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）、第４８巻（第９号）：１７２９～１７４０頁、１９９２年（それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の合成方法に従って調製可能である。
修飾ｍＲＮＡは、分子の全長に沿って均一に修飾する必要はない。核酸中の種々の位置に異なるヌクレオチド修飾および／または骨格構造が存在してもよい。核酸の機能が実質的に低減されないように核酸の任意の位置にヌクレオチドアナログまたは他の修飾を配置しうることは、当業者であればわかるであろう。修飾はまた、５’または３’末端修飾でありうる。核酸は、最小で１つかつ最大で１００％の修飾ヌクレオチド、または任意の中間のパーセント、たとえば、少なくとも５０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも８０％の修飾ヌクレオチド、もしくは少なくとも９０％の修飾ヌクレオチドを含有しうる。
たとえば、ｍｍＲＮＡは、修飾ウラシルや修飾シトシンなどの修飾ピリミジンを含有しうる。いくつかの実施形態では、核酸中のウラシルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％は、修飾ウラシルで置換え可能である。修飾ウラシルは、単一の特異構造を有する化合物で置換え可能であるか、または異なる構造（たとえば、２、３、４、もしくはそれ以上の特異構造）を有する複数の化合物で置換え可能である。いくつかの実施形態では、核酸中のシトシンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％は、修飾シトシンで置換え可能である。修飾シトシンは、単一の特異構造を有する化合物で置換え可能であるか、または異なる構造（たとえば、２、３、４、もしくはそれ以上の特異構造）を有する複数の化合物で置換え可能である。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、および４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジンを含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、５－アザ－シチジン、プソイドイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－プソイドイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－プソイドイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－プソイドイソシチジン、および４－メトキシ－１－メチル－プソイドイソシチジンを含む。
他の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－トレオニルカルボバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン、および２－メトキシ－アデニンを含む。
他の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、およびＮ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシンを含む。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、主溝面上で修飾可能であり、かつウラシルのＣ－５上の水素をメチル基またはハロ基で置換え可能である。
特定の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－アデノシン、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－シチジン、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－グアノシン、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－ウリジン、または５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－プソイドウリジンである。
修飾ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチド組合せのさらなる例は、以下のテーブル１に提供される。

いくつかの実施形態では、シトシンの少なくとも２５％は、式Ｉ－ａで示される化合物で置き換えられる（たとえば、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）。
いくつかの実施形態では、ウラシルの少なくとも２５％は、式Ｉ－ａで示される化合物で置き換えられる（たとえば、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）。
いくつかの実施形態では、シトシンの少なくとも２５％かつウラシルの少なくとも２５％は、式Ｉ－ａで示される化合物で置き換えられる（たとえば、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）。
核酸の他の成分は、任意選択であり、いくつかの実施形態では有利である。たとえば、一方または両方が独立して１つ以上の異なるヌクレオシド修飾を含有しうる５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および／または３’ＵＴＲが提供される。そのような実施形態では、ヌクレオシド修飾はまた、翻訳可能領域中に存在しうる。また、コザック（Ｋｏｚａｋ）配列を含有する核酸も提供される。
リンカーおよびペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）
ｍｍＲＮＡ中に組み込まれうるヌクレオチドの核酸塩基は、検出可能剤や治療剤などのペイロードの任意の化学的に適切な位置に共有結合可能である。たとえば、核酸塩基としては、デアザ－アデノシンまたはデアザ－グアノシンが可能であり、リンカーは、デアザ－アデノシンまたはデアザ－グアノシンのＣ－７位またはＣ－８位に装着可能である。他の実施形態では、核酸塩基としては、シトシンまたはウラシルが可能であり、リンカーは、シトシンまたはウラシルのＮ－３位またはＣ－５位に装着可能である。
リンカー
本明細書で用いられる「リンカー」という用語は、原子団（たとえば１０～１，０００原子）を意味し、炭素、アミノ、アルキルアミノ、酸素、硫黄、スルホキシド、スルホニル、カルボニル、イミンなどの原子または基で構成可能であるが、これらに限定されるものではない。リンカーは、第１の末端を修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチドの核酸塩基上または糖部分上に、かつ第２の末端を検出可能剤や治療剤などのペイロードに、装着可能である。リンカーは、核酸配列中への組込みを妨害しない十分な長さでありうる。
リンカー中に組込み可能な化学基の例としては、アルキル基、アルケン基、アルキン基、アミド基、エーテル基、チオエーテル基、またはエステル基が挙げられるが、これらに限定されるものではない。リンカー鎖はまた、多環式環およびヘテロ芳香環を含めて飽和環、不飽和環、または芳香環の一部を構成可能であり、この場合、ヘテロ芳香環は、１～４個のヘテロ原子Ｎ、Ｏ、またはＳを含有するアリール基でありうる。リンカーの特定例としては、不飽和アルカン、ポリエチレングリコール、およびデキストランポリマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
たとえば、リンカーは、エチレングリコールまたはプロピレングリコールのモノマー単位を含みうるし、例としては、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、メチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、またはテトラエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、リンカーは、二価のアルキル部分、アルケニル部分、および／またはアルキニル部分を含みうるが、これらに限定されるものではない。リンカーは、エステル部分、アミド部分、またはエーテル部分を含みうる。
他の例は、たとえばジスルフィド結合（－Ｓ－Ｓ－）やアゾ結合（－Ｎ＝Ｎ－）などの切断可能な部分をリンカー中に含んで還元剤または光分解を用いて切断可能であるが、これらに限定されるものではない。リンカー中に組み込まれて修飾ヌクレオチドに装着された切断可能な結合が切断された場合、ヌクレオチド上に短い「傷痕」または化学修飾を生じうる。たとえば、切断後、ヌクレオチド塩基上に生じた傷痕は、修飾ヌクレオチドの一部を形成してポリヌクレオチド鎖中に組み込まれるが、非反応性であり、化学的に中和する必要はない。これにより、核酸ポリマー鋳型の配列決定時、一段と容易に後続ヌクレオチドを組み込むことが可能となる。たとえば、条件には、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、および／またはジスルフィド結合切断用の他の還元剤の使用が含まれる。アミド結合を含む選択的に切断可能な結合は、たとえば、ＴＣＥＰもしくは他の還元剤および／または光分解を用いることにより切断可能である。エステル結合を含む選択的に切断可能な結合は、たとえば、酸加水分解または塩基加水分解により切断可能である。
検出可能剤
本発明に係るｍｍＲＮＡはまた、１種以上の検出可能剤に結合またはコンジュゲートさせることが可能である。検出可能な物質の例としては、種々の有機小分子、無機化合物、ナノ粒子、酵素もしくは酵素基質、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、化学発光材料、放射性材料、および造影剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本開示によれば、本明細書に記載のもの以外の標識が考えられ、例として、他の光学的に検出可能な標識が挙げられるが、これに限定されるものではない。標識は、切断可能なリンカーが切断されると組み込まれた塩基から標識が除去可能になるように、標準的化学を用いて本開示に係る修飾ヌクレオチドの任意の位置に装着可能である。
末端構造修飾：５’キャッピング
内因性真核細胞メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子は、成熟ｍＲＮＡ分子の５’末端上に５’キャップ構造を含有する。５’キャップは、最も５’側のヌクレオチドとグアニンヌクレオチドとの間に５’－５’－三リン酸結合を含有する。コンジュゲート化グアニンヌクレオチドは、Ｎ７位がメチル化される。追加の修飾は、最後のおよび最後から２番目のほとんどの５’－ヌクレオチドの２’－ヒドロキシル基のメチル化を含む。５’キャップ構造は、ｍＲＮＡの細胞内安定性および翻訳能を担うｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）の結合に関与する。
複数の個別５’キャップ構造を用いて、合成ｍＲＮＡ分子の５’キャップを生成することが可能である。共転写的に合成ｍＲＮＡ分子をキャッピングするために、多くの化学キャップアナログが使用される。たとえば、抗逆方向キャップアナログ（ＡＲＣＡ）キャップは、５’－５’－三リン酸グアニン－グアニン結合を含有し、一方のグアニンは、Ｎ７メチル基さらには３’－Ｏ－メチル基を含有する。化学キャップアナログは、ＲＮＡ分子の同時キャッピングを可能にするが、転写物の２０％超は、キャッピングされない状態で残存し、合成キャップアナログは、基準細胞ｍＲＮＡの内因性５’キャップ構造と同一でない。このため、翻訳能の低下および細胞安定性の低下を招くおそれがある。
また、より基準に近い５’キャップ構造の生成に関与する酵素を用いて、転写後に合成ｍＲＮＡ分子をキャッピングすることも可能である。本明細書で用いられる場合、「より基準に近い」という表現は、構造的または機能的のいずれかで内因性または野生型の特徴をよく反映または模倣している特徴を意味する。本発明に係るより基準に近い５’キャップ構造は、とくに、キャップ結合タンパク質の結合の増強、半減期の増大、５’エンドヌクレアーゼに対する感受性の低下、および／または５’デキャッピングの低下をもたらすものである。たとえば、組換えワクシニアウイルスキャッピング酵素および組換え２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ酵素は、ｍＲＮＡの最も５’側のヌクレオチドとグアニンヌクレオチドとの間にカノニカル５’－５’－三リン酸結合を形成可能であり、この場合、グアニンはＮ７メチル化を含有しかつ最後の５’－ヌクレオチドは２’－Ｏ－メチルを含有して、Ｃａｐ１構造を生成する。この結果、より高い翻訳能および細胞安定性ならびに細胞炎症誘発性サイトカインの活性化の低減を有するキャップが得られる。合成ｍＲＮＡは転写後にキャッピングされるので、化学キャップアナログを含有する合成ｍＲＮＡの約８０％とは対照的に、ｍＲＮＡ分子のほぼ１００％がキャッピングされる。
末端構造修飾：ポリＡテール
ＲＮＡプロセシング時、通常、分子の安定性を増大させるために、アデニンヌクレオチドの長鎖（ポリＡテール）がメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に付加される。転写直後、転写物の３’末端は、切断されて３’ヒドロキシルを遊離する。次いで、ポリＡポリメラーゼは、アデニンヌクレオチド鎖をＲＮＡに付加する。ポリアデニル化と呼ばれるこのプロセスは、１００～２５０残基長のポリＡテールを付加する。
ユニークなポリＡテール長は、本発明に係る修飾ＲＮＡに特定の利点を提供することが判明した。
一般的には、本発明に係るポリＡテールの長さは、３０ヌクレオチド超の長さである。他の実施形態では、ポリＡテールは、３５ヌクレオチド超の長さである。他の実施形態では、長さは少なくとも４０ヌクレオチドである。他の実施形態では、長さは少なくとも４５ヌクレオチドである。他の実施形態では、長さは少なくとも５５ヌクレオチドである。他の実施形態では、長さは少なくとも６０ヌクレオチドである。他の実施形態では、長さは少なくとも６０ヌクレオチドである。他の実施形態では、長さは少なくとも８０ヌクレオチドである。他の実施形態では、長さは少なくとも９０ヌクレオチドである。他の実施形態では、長さは少なくとも１００ヌクレオチドである。他の実施形態では、長さは少なくとも１２０ヌクレオチドである。他の実施形態では、長さは少なくとも１４０ヌクレオチドである。他の実施形態では、長さは少なくとも１６０ヌクレオチドである。他の実施形態では、長さは少なくとも１８０ヌクレオチドである。他の実施形態では、長さは少なくとも２００ヌクレオチドである。他の実施形態では、長さは少なくとも２５０ヌクレオチドである。他の実施形態では、長さは少なくとも３００ヌクレオチドである。他の実施形態では、長さは少なくとも３５０ヌクレオチドである。他の実施形態では、長さは少なくとも４００ヌクレオチドである。他の実施形態では、長さは少なくとも４５０ヌクレオチドである。他の実施形態では、長さは少なくとも５００ヌクレオチドである。他の実施形態では、長さは少なくとも６００ヌクレオチドである。他の実施形態では、長さは少なくとも７００ヌクレオチドである。他の実施形態では、長さは少なくとも８００ヌクレオチドである。他の実施形態では、長さは少なくとも９００ヌクレオチドである。他の実施形態では、長さは少なくとも１０００ヌクレオチドである。
一実施形態では、ポリＡテールは、修飾ＲＮＡ分子全体の長さを基準にして設計される。この設計は、修飾ＲＮＡのコード領域の長さ、修飾ＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）の特定の特徴部もしくは領域の長さ、または修飾ＲＮＡから発現される最終産物の長さに基づきうる。これとの関連では、ポリＡテールは、修飾ＲＮＡまたはその特徴部よりも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％長くしうる。ポリＡテールはまた、それが属する修飾ＲＮＡの一部として設計しうる。これとの関連では、ポリＡテールは、構築物の全長または構築物の全長マイナスポリＡテールの１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、もしくは９０％、またはそれ以上でありうる。
修飾ｍＲＮＡの使用
本発明に係るｍｍＲＮＡは、研究、探索、治療、診断、ならびにキットおよび装置の多くの領域で使用されうる。
治療
本明細書に記載のｍｍＲＮＡ（修飾ＲＮＡ）およびｍｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質は、治療剤として使用可能である。たとえば、本明細書に記載のｍｍＲＮＡは、対象に投与可能であり、この場合、ｍｍＲＮＡは、対象においてｉｎ ｖｉｖｏで翻訳されて治療用ポリペプチドを産生する。提供されているのは、ヒトおよび他の哺乳動物において疾患または病態を治療または予防するための組成物、方法、キット、および試薬である。本発明に係る活性治療剤は、ｍｍＲＮＡ、ｍｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドを含有する細胞、ｍｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドを含む。
本明細書に提供されているのは、本明細書に記載のｍｍＲＮＡを用いて細胞集団において組換えポリペプチドの翻訳を誘導する方法である。そのような翻訳は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、培養下、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでありうる。細胞集団は、少なくとも１つのヌクレオシド修飾と組換えポリペプチドをコードする翻訳可能領域とを有するｍｍＲＮＡを含有する有効量の組成物に接触される。集団は、ｍｍＲＮＡが細胞集団の１つ以上の細胞内に局在化されて組換えポリペプチドが核酸から細胞内で翻訳されるような条件下で、接触される。
有効量の組成物は、少なくとも部分的には、標的組織、標的細胞型、投与手段、核酸の物理的特性（たとえば、修飾ヌクレオシドのサイズおよび広がり）、ならびに他の決定要因に基づいて提供される。一般的には、有効量の組成物は、細胞内で効率的なタンパク質産生、好ましくは、対応する非修飾核酸を含有する組成物よりも効率的なタンパク質産生を提供する。効率の増大は、細胞トランスフェクション（すなわち、核酸でトランスフェクトされた細胞のパーセント）の増大、核酸からのタンパク質翻訳の増大、核酸分解の低減（たとえば、ｍｍＲＮＡからのタンパク質翻訳の持続期間の増大により実証される）、または宿主細胞の先天性免疫反応の低減により実証されうる。
本発明の態様は、それを必要とする哺乳動物対象において組換えポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ翻訳を誘導する方法に関する。その場合、少なくとも１つのヌクレオシド修飾と組換えポリペプチドをコードする翻訳可能領域とを有するｍｍＲＮＡを含有する有効量の組成物は、本明細書に記載の送達方法および分割投与レジメンを用いて対象に投与される。ｍｍＲＮＡは、核酸が対象の細胞内に局在化されて組換えポリペプチドがｍｍＲＮＡから細胞内で翻訳されるような量および他の条件下で提供される。ｍｍＲＮＡが局在化された細胞またはその細胞が存在する組織は、１回またはそれ以上のｍｍＲＮＡ投与の標的となりうる。
治療剤が投与される対象は、疾患、障害、または有害病態に罹患しているか、またはそれらを発症するリスクがある。提供されているのは、これらを基礎にして対象を同定、診断、および分類する方法であり、この方法は、臨床診断、バイオマーカーレベル、ゲノムワイド関連研究（ＧＷＡＳ）、および当技術分野で公知の他の方法を含みうる。
特定の実施形態では、投与されたｍｍＲＮＡは、組換えポリペプチドが翻訳される細胞内に実質的に不在の機能活性を提供する１種以上の組換えポリペプチドの産生を誘導する。たとえば、欠失した機能活性は、本質的に、酵素性、構造性、または遺伝子調節性でありうる。関連実施形態では、投与されたｍｍＲＮＡは、存在するが組換えポリペプチドが翻訳される細胞内で実質的に欠損した機能活性を（たとえば相乗的に）増大させる１種以上の組換えポリペプチドの産生を誘導する。
他の実施形態では、投与されたｍｍＲＮＡは、組換えポリペプチドが翻訳される細胞内に実質的に不在のポリペプチド（または複数のポリペプチド）を代替する１種以上の組換えポリペプチドの産生を誘導する。そのような不在は、コード遺伝子の遺伝子突然変異またはその調節経路に起因しうる。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、細胞内の内因性タンパク質のレベルを望ましいレベルに増大させる。そのような増大は、内因性タンパク質のレベルを準正常レベルから正常レベルにまたは正常レベルから過正常レベルに上昇させうる。
他の選択肢として、組換えポリペプチドは、細胞内もしくは細胞表面上に存在するかまたは細胞から分泌される内因性タンパク質の活性をアンタゴナイズするように機能する。通常、その内因性タンパク質の活性は、たとえば、内因性タンパク質の突然変異により活性改変または局在化をもたらすので、対象に有害である。そのほかに、組換えポリペプチドは、細胞内もしくは細胞表面上に存在するかまたは細胞から分泌される生物学的部分の活性を、直接的または間接的にアンタゴナイズする。アンタゴナイズされる生物学的部分の例としては、脂質（たとえばコレステロール）、リポタンパク質（たとえば低密度リポタンパク質）、核酸、炭水化物、志賀毒素や破傷風毒素などのタンパク質毒素、またはボツリヌス毒素、コレラ毒素、ジフテリア毒素などの小分子毒素が挙げられる。そのほかに、アンタゴナイズされる生物学的分子は、細胞傷害活性や細胞静止活性などの望ましくない活性を呈する内因性タンパク質でありうる。
本明細書に記載のｍｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドは、細胞内（可能性としては核などの特定の区画内）に局在化すべく工学操作されるか、または細胞から分泌すべくもしくは細胞の形質膜に転位すべく工学操作される。
本発明の一実施形態には、二機能性ｍｍＲＮＡが含まれる。名称から示唆されるように、二機能性ｍｍＲＮＡとは、少なくとも２つの機能を有するまたは発揮しうるｍｍＲＮＡのことである。
二機能性ｍｍＲＮＡの複数の機能性は、ｍＲＮＡによりコードされうるか（機能は、コード産物が翻訳されるまで現れないであろう）、またはＲＮＡ自体の性質でありうる。それは、構造性または化学性でありうる。二機能性修飾ＲＮＡは、ＲＮＡと共有結合的に関連付けられるまたは静電的に関連付けられる機能を含みうる。
いくつかの実施形態では、本発明に係る修飾ｍＲＮＡおよびそのコードポリペプチドは、次のもの、すなわち、自己免疫障害（たとえば、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ）、炎症性障害（たとえば、関節炎、骨盤内炎症性疾患）、感染性疾患（たとえば、ウイルス感染症（たとえば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＲＳＶ）、細菌感染症、菌類感染症、敗血症）、神経障害（たとえば、アルツハイマー病、ハンチントン病、自閉症、デュシェンヌ筋ジストロフィー）、心臓血管障害（たとえば、アテローム硬化症、高コレステロール血症、血栓症、凝固障害、血管新生障害たとえば黄斑変性）、増殖性障害（たとえば、癌、良性新生物）、呼吸器障害（たとえば、慢性閉塞性肺疾患）、消化器障害（たとえば、炎症性腸疾患、潰瘍）、筋骨格障害（たとえば、線維筋痛症、関節炎）、内分泌、代謝、および栄養の障害（たとえば、糖尿病、骨粗鬆症）、泌尿器障害（たとえば、腎疾患）、精神障害（たとえば、抑鬱症、統合失調症）、皮膚障害（たとえば、創傷、湿疹）、血液およびリンパ系の障害（たとえば、貧血、血友病）などのうちの１つ以上を含むさまざまな疾患、障害、および／または病態のいずれかの治療に使用されうるが、これらに限定されるものではない。
先天性免疫反応の回避
「先天性免疫反応」という用語は、サイトカインとくにインターフェロンの発現および放出ならびに細胞死の誘導を含めて、一般的にはウイルス起源または細菌起源の外因性一本鎖核酸に対する細胞反応を含む。タンパク質合成もまた、先天性細胞免疫反応時に低減される。細胞内で先天性免疫反応を排除することが有利であるが、本発明は、そのような反応を完全には排除することなくインターフェロンシグナリングを含む免疫反応を実質的に低減する修飾ｍＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、免疫反応は、対応する非修飾核酸により誘導される免疫反応と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、または９９．９％超低減される。そのような低減は、１型インターフェロンの発現もしくは活性レベルまたはｔｏｌｌ様レセプター（たとえば、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８）などのインターフェロン調節遺伝子の発現により、測定可能である。先天性免疫反応の低減はまた、修飾ＲＮＡを細胞集団に１回以上投与した後の細胞死の低減により測定可能である。たとえば、細胞死は、対応する非修飾核酸で観測される細胞死頻度よりも１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％、または９５％超少ない。さらに、細胞死は、ｍｍＲＮＡに接触した細胞の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％未満、または０．０１％未満に影響を与えうる。
本発明は、たとえば、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで、標的細胞集団へのｍｍＲＮＡの繰返し導入（たとえば、トランスフェクション）の方法を提供する。細胞集団に接触させる工程は、１回以上繰返し可能である（たとえば、２、３、４、５回、または５回超）。いくつかの実施形態では、ｍｍＲＮＡを細胞集団に接触させる工程は、細胞集団でタンパク質翻訳の所定の効率が達成されるように十分な回数繰り返される。核酸修飾により提供される標的細胞集団の細胞傷害性の低減を考慮して、そのような繰返しトランスフェクションは、多様な一連の細胞型で達成可能である。
タンパク質産生
本明細書に提供される方法は、細胞培養プロセスでタンパク質産物の収率を向上させるのに有用である。複数の宿主細胞を含有する細胞培養では、本明細書に記載の修飾ｍＲＮＡの導入は、対応する非修飾核酸と比較してタンパク質産生の効率増大をもたらす。そのようなタンパク質産生の効率増大は、たとえば、細胞トランスフェクションの増大、核酸からのタンパク質翻訳の増大、核酸分解の低減、および／または宿主細胞の先天性免疫反応の低減を示すことにより、実証可能である。タンパク質産生は、ＥＬＩＳＡにより測定可能であり、タンパク質活性は、当技術分野で公知の種々の機能アッセイにより測定可能である。タンパク質産生は、連続式またはフェドバッチ式の哺乳動物プロセスにより実施可能である。
そのほかに、可能性のある対象の細胞系または一群の細胞系で、特定のポリペプチド、とくに工学操作されたタンパク質、たとえば既知の活性を有する参照タンパク質のタンパク質変異体の発現を最適化することが有用である。一実施形態では、複数の標的細胞型を提供して、工学操作されたポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡを複数の標的細胞型のそれぞれに独立して接触させることにより、標的細胞で工学操作されたタンパク質の発現を最適化する方法を提供する。そのほかに、培養条件を変化させてタンパク質産生効率を増大させることが可能である。続いて、複数の標的細胞型で工学操作されたポリペプチドの存在および／またはレベルを検出および／または定量して、効率的な標的細胞およびそれに関連する細胞培養条件の選択により、工学操作されたポリペプチドの発現の最適化を可能にする。そのような方法は、工学操作されたポリペプチドが１つ以上の翻訳後修飾を含むかまたは実質的な三次構造を有する場合、すなわち、効率的なタンパク質産生を複雑化することが多い状況で、とくに有用である。
遺伝子サイレンシング
本明細書に記載の修飾ｍＲＮＡは、細胞集団で１種以上の標的遺伝子の発現をサイレンシング（すなわち、防止または実質的に低減）するのに有用である。配列特異的ヒストンＨ３メチル化を誘導可能なポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡは、ポリペプチドが翻訳されてヒストンＨ３メチル化およびそれに続くヘテロクロマチン形成を介して標的遺伝子の遺伝子転写を低減するような条件下で、集団の細胞内に導入される。いくつかの実施形態では、サイレンシング機序は、哺乳動物対象に存在する細胞集団で行われる。例として、有用な標的遺伝子は、突然変異ヤヌスキナーゼ２ファミリーメンバーであり、この場合、哺乳動物対象は、この突然変異標的遺伝子を発現し、異常キナーゼ活性に起因する骨髄増殖性疾患に罹患している。ただし、これに限定されるものではない。
修飾ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの共投与もまた、本明細書に提供される。酵母で実証されるように、配列特異的トランスサイレンシングは、細胞機能を変化させるのに効果的な機序である。分裂酵母は、ｓｉＲＮＡ媒介ヘテロクロマチン集合に２つのＲＮＡｉ複合体、すなわち、ＲＮＡ誘導転写サイレンシング（ＲＩＴＳ）複合体およびＲＮＡ指向ＲＮＡポリメラーゼ複合体（ＲＤＲＣ）を必要とする（モタメディ（Ｍｏｔａｍｅｄｉ）ら著、細胞（Ｃｅｌｌ）、２００４年、第１１９巻、ｐ．７８９～８０２）。分裂酵母では、ＲＩＴＳ複合体は、ｓｉＲＮＡ結合アルゴノートファミリータンパク質Ａｇｏｌ、クロモドメインタンパク質Ｃｈｐ１、およびＴａｓ３を含有する。分裂酵母ＲＤＲＣ複合体は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＲｄｐ１、推定ＲＮＡヘリカーゼＨｒｒ１、およびポリＡポリメラーゼファミリータンパク質Ｃｉｄ１２で構成される。これらの２つの複合体は、活性にＤｉｃｅｒリボヌクレアーゼおよびＣｌｒ４ヒストンＨ３メチルトランスフェラーゼを必要とする。全体として、Ａｇｏｌは、Ｒｄｐ１共転写生成ｄｓＲＮＡ転写物のＤｉｃｅｒ媒介切断を介して生成されたｓｉＲＮＡ分子に結合して、メチル化およびヒストン修飾およびそれに続く転写サイレンシングヘテロクロマチンへの緻密化の対象となるＤＮＡの領域へのＣｈｐ１、Ｔａｓ３、Ｈｒｒ１、およびＣｌｒ４の配列特異的直接会合を可能にする。この機序は、ＤＮＡの動原体領域とシスで機能するが、ＤＮＡの特定領域に対する二本鎖ｓｉＲＮＡとの共トランスフェクションおよびｓｉＲＮＡリボヌクレアーゼＥｒｉ１の付随的ＲＮＡｉ指向サイレンシングを介して、配列特異的トランスサイレンシングが可能である（ビューラー（Ｂｕｈｌｅｒ）ら著、細胞（Ｃｅｌｌ）、２００６年、第１２５巻、ｐ．８７３～８８６）。
生物学的経路の変調
細胞内に導入された修飾ｍＲＮＡの迅速な翻訳は、標的生物学的経路を変調する望ましい機序を提供する。そのような変調は、所与の経路のアンタゴニズムまたはアゴニズムを含む。一実施形態では、核酸が細胞内に局在化されて組換えポリペプチドが細胞内で核酸から翻訳可能であり、その際、組換えポリペプチドが、生物学的経路で機能するポリペプチドの活性を阻害するような条件下で、組換えポリペプチドをコードする修飾核酸を含む有効量の組成物と細胞とを接触させることにより、細胞内で生物学的経路をアンタゴナイズする方法を提供する。例示的な生物学的経路は、自己免疫性または炎症性の障害、たとえば、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、紅斑性狼瘡、強直性脊椎炎、結腸炎、またはクローン病での欠陥経路であり、特定的には、ＩＬ－１２およびＩＬ－２３のシグナリング経路のアンタゴニズムは、とくに有用である。（キクリー Ｋ（Ｋｉｋｌｙ Ｋ）、リウ Ｌ（Ｌｉｕ Ｌ）、ナー Ｓ（Ｎａ Ｓ）、セジウィック ＪＤ（Ｓｅｄｇｗｉｃｋ
ＪＤ）（２００６年）免疫学の現状（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）第１８巻（第６号）：６７０－５頁を参照されたい）。
さらに、ケモカインレセプターに対するアンタゴニストをコードする修飾核酸が提供され、ケモカインレセプターＣＸＣＲ－４およびＣＣＲ－５は、たとえば、宿主細胞内へのＨＩＶ進入に必要とされる（ら著、（１９９６年）１０月３日、第３８３巻（第６５９９号）：４００頁）。
他の選択肢として、核酸が細胞内に局在化されて組換えポリペプチドが細胞内で核酸から翻訳可能であり、かつ組換えポリペプチドが、生物学的経路で機能するポリペプチドの活性を誘導するような条件下で、組換えポリペプチドをコードする有効量の修飾核酸と細胞とを接触させることにより、細胞内で生物学的経路をアゴナイズする方法を提供する。例示的なアゴナイズされる生物学的経路は、細胞運命決定を変調する経路を含む。そのようなアゴナイゼーションは、可逆的であるか、さもなければ不可逆的である。
細胞内核酸送達
本発明に係る方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、または培養下で、細胞集団への核酸送達を増強する。たとえば、複数の宿主細胞（たとえば、酵母細胞や哺乳動物細胞などの真核細胞）を含有する細胞培養物を、少なくとも１つのヌクレオシド修飾と任意選択的な翻訳可能領域とを有する増強核酸を含有する組成物に接触させる。組成物はまた、一般的には、宿主細胞内への増強核酸取込みの効率を増大させるトランスフェクション試薬または他の化合物を含有する。増強核酸は、対応する非修飾核酸と比較して、細胞集団内で保持率増強を呈する。増強核酸の保持率は、非修飾核酸の保持率よりも大きい。いくつかの実施形態では、それは、非修飾核酸の保持率よりも少なくとも約５０％、７５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、または２００％超大きい。そのような保持率の利点は、増強核酸を用いた１回のトランスフェクションにより達成可能であるか、またはトランスフェクションを何回か繰り返した後で取得可能である。
いくつかの実施形態では、増強核酸は、１つ以上の追加の核酸と共に標的細胞集団に送達される。そのような送達は、同時でありうるか、または増強核酸は、１つ以上の追加の核酸の送達前に送達される。追加の１つ以上の核酸は、修飾核酸または非修飾核酸でありうる。増強核酸の初期の存在は、細胞集団の先天性免疫応答を実質的に誘導せず、さらに、先天性免疫応答は、非修飾核酸の後続の存在により活性化されないものとする。これに関連して、標的細胞集団に存在することが望まれるタンパク質が非修飾核酸から翻訳される場合、増強核酸自体は、翻訳可能領域を含有していなくてもよい。
細胞表面上でのリガンドまたはレセプターの発現
本明細書に記載のいくつかの態様およびその態様の実施形態では、修飾ＲＮＡを用いて細胞の表面上（たとえばホーミング（ｈｏｍｉｎｇ）部分）にリガンドまたはリガンドレセプターを発現することが可能である。細胞表面に装着されたリガンド部分またはリガンドレセプター部分により、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞と組織または作用剤との所望の生物学的相互作用を行わせることが可能である。リガンドは、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、ペプチド、ビタミン、炭水化物、タンパク質もしくはポリペプチド、レセプターたとえば細胞表面レセプター、接着分子、糖タンパク質、糖残基、治療剤、薬剤、グリコサミノグリカン、またはそれらの任意の組合せでありうる。たとえば、リガンドは、癌細胞特異的抗原を認識することにより、細胞を腫瘍細胞と優先的に相互作用させて、修飾細胞の腫瘍特異的局在化を可能にする抗体でありうる。好ましいリガンドは、治療対象の組織の外面上の標的分子との相互作用を可能にしうるので、リガンドは、細胞組成物が治療対象の組織中に蓄積する能力を付与することが可能である。一般的には、他の組織に対して制限された交差反応性を有するリガンドが好ましい。
いくつかの場合には、リガンドは、細胞が特定の組織を標的とするようにするまたは特異的リガンドと相互作用するようにするホーミング部分として作用可能である。そのようなホーミング部分としては、限定されるものではないが、特異的結合対、抗体、モノクローナル抗体、またはそれらの誘導体もしくは類似体の任意のメンバー、たとえば、限定されるものではないが、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、単一ドメイン抗体、ラクダ化抗体および抗体フラグメント、ヒト化抗体および抗体フラグメント、ならびに以上の多価種、多価結合試薬、たとえば、限定されるものではないが、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖタンデム（（ＳＣＦＶ）２フラグメント）、ダイアボディー、トリボディー、テトラボディーなどの単一特異性または二重特異性の抗体（これらは、典型的には、共有結合されたまたは他の形で安定化された（すなわち、ロイシンジッパーまたはヘリックスで安定化された）ｓｃＦｖ断片である）が挙げられうる。また、他のホーミング部分としては、たとえば、アプタマー、レセプター、および融合タンパク質が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ホーミング部分は、細胞標的特異性の調整を可能にしうる表面結合抗体でありうる。このことは、所望の標的部位の対象エピトープに対してかなり特異的な抗体が産生されうるので、とくに有用である。一実施形態では、複数の抗体が細胞の表面上で発現され、かつ各抗体は、所望の標的に対して異なる特異性を有しうる。そのような手法は、ホーミング相互作用の結合活性および特異性を増大させうる。
当業者であれば、細胞の所望の局在化または機能に基づいて、任意のホーミング部分を選択可能であり、たとえば、タモキシフェンなどのエストロゲンレセプターリガンドにより、細胞は、細胞表面上のエストロゲンレセプター数が増大されたエストロゲン依存性乳癌細胞を標的とすることが可能である。リガンド／レセプター相互作用の他の例としては、ＣＣＲＩ（たとえば、関節リウマチおよび／または多発性硬化症で炎症を起こした関節組織または脳の治療のために）、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８（たとえば、リンパ節組織を標的として）、ＣＣＲ６、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０（たとえば、腸組織を標的とするために）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ１０（たとえば、皮膚を標的とするために）、ＣＸＣＲ４（たとえば、一般的な遊出増大に対して）、ＨＣＥＬＬ（たとえば、炎症および炎症性障害、骨髄の治療のために）、α４β７（たとえば、腸粘膜標的化のために）、ＶＬＡ－４／ＶＣＡＭ－１（たとえば、内皮を標的として）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一般的には、本明細書に記載の方法および組成物で使用するために、標的化（たとえば癌転移）に関与する任意のレセプターを利用することが可能である。
細胞死のメディエーター
一実施形態では、修飾核酸分子組成物は、デスレセプター、デスレセプターリガンド、またはそれらの組合せの発現を増大させることにより、細胞（たとえば癌細胞）内でアポトーシスを誘導するために使用可能である。この方法は、任意の所望の細胞で細胞死を誘導するために使用可能であり、細胞が天然アポトーシスシグナルを回避する癌の治療にはとくに有用である。
アポトーシスは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプター／リガンドスーパーファミリーに属するいくつかの「デスレセプター」とそれらのリガンドとの間の複数の相互作用で構成された最終エフェクター機序に収束する複数の独立したシグナリング経路により誘導可能である。最もよく特徴付けられたデスレセプターは、ＣＤ９５（「Ｆａｓ」）、ＴＮＦＲＩ（ｐ５５）、デスレセプター３（ＤＲ３またはＡｐｏ３／ＴＲＡＭＯ）、ＤＲ４およびＤＲ５（ａｐｏ２－ＴＲＡＩＬ－Ｒ２）である。アポトーシスの最終エフェクター機序は、カスパーゼと称される一連のプロテイナーゼの活性化でありうる。これらのカスパーゼの活性化の結果として、一連の生命にかかわる細胞タンパク質の切断および細胞死がもたらされる。デスレセプター／リガンド誘導アポトーシスの分子機序は、当技術分野で周知である。たとえば、Ｆａｓ／ＦａｓＬ媒介アポトーシスは、Ｃ末端デスドメイン（ＤＤ）を介してＦａｓレセプターの三量体化を誘導する３つのＦａｓＬ分子の結合、そして次に、アダプタータンパク質ＦＡＤＤ（デスドメインを有するＦａｓ会合タンパク質）およびカスパーゼ８の動員により、誘導される。この三分子複合体（Ｆａｓ／ＦＡＩＤＤ／カスパーゼ８）のオリゴマー化は、プロ酵素カスパーゼ８から活性カスパーゼ８へのタンパク質分解切断を引き起こし、そして次に、カスパーゼ３を含めて他の下流カスパーゼをタンパク質分解により活性化することによりアポトーシスプロセスを開始させる。デスリガンドは、一般的には、三量体以上の高次構造が形成された場合、アポトーシス性である。単量体としては、それらは、デスレセプターに結合するための三量体と競合することにより、抗アポトーシス剤として機能しうる。
一実施形態では、修飾核酸分子組成物は、デスレセプター（たとえば、Ｆａｓ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＭＯ、ＴＮＦＲ、ＴＬＲなど）をコードする。修飾ＲＮＡのトランスフェクションによりデスレセプターを発現するように作製された細胞は、そのレセプターを活性化するリガンドにより誘導される死を引き起こしやすくなる。同様に、たとえば表面上にデスリガンドを発現するように作製された細胞は、トランスフェクト細胞が標的細胞と接触した時、レセプターにより細胞死を誘導するであろう。他の実施形態では、修飾ＲＮＡ組成物は、デスレセプターリガンド（たとえば、ＦａｓＬ、ＴＮＦなど）をコードする。他の実施形態では、修飾ＲＮＡ組成物は、カスパーゼ（たとえば、カスパーゼ３、カスパーゼ８、カスパーゼ９など）をコードする。癌細胞が非増殖形態または抑制増殖形態に適正に分化できない状態を呈することが多い場合、他の実施形態では、合成修飾ＲＮＡ組成物は、デスレセプターおよびその適切な活性化リガンドの両方をコードする。他の実施形態では、合成修飾ＲＮＡ組成物は、癌幹細胞などの癌細胞内で発現された時、非病原性表現型もしくは非自己複製表現型（たとえば、低減された細胞増殖速度、低減された細胞分裂など）に分化するように細胞を誘導する、または休眠細胞期に入る（たとえば、Ｇ０静止期に移行する）ように細胞を誘導する、分化因子をコードする。
アポトーシス誘導技術を使用するには、修飾核酸分子が適切に腫瘍細胞などを標的として望ましくない広範にわたる細胞死を防止することが必要になりうることは、当業者であればわかるであろう。したがって、修飾核酸分子が癌細胞内のみで発現されるように、癌抗原を認識する送達機序（たとえば、リガンドまたは抗体、標的化リポソームなどに装着されたもの）を使用することが可能である。
修飾ｍＲＮＡの製剤
本明細書に提供されているのは、有効量のｍｍＲＮＡを含有する製剤である。特定の実施形態では、製剤は、１種以上の細胞透過剤（たとえばトランスフェクション剤）を含む。特定の一実施形態では、ｍｍＲＮＡは、トランスフェクション剤（またはその混合物）と混合または混和され、得られた混合物は、細胞にトランスフェクトするために利用される。好ましいトランスフェクション剤は、カチオン性脂質組成物、特定的には、一価または多価のカチオン性脂質組成物、より特定的には、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（登録商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、ＤＭＲＩＥ－Ｃ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＳＰＡ、およびＤＯＳＰＥＲ、ならびにデンドリマー組成物、特定的には、Ｇ５－Ｇ１０デンドリマー（緻密スターデンドリマー、ＰＡＭＡＭデンドリマー、グラフトデンドリマー、ならびにデンドリグラフトおよびＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（登録商標）として知られるデンドリマーを含む）である。
第２の特定のトランスフェクション法では、核酸結合基、たとえばポリアミン、より特定的にはスペルミンにリボ核酸をコンジュゲートし、次いで、細胞内に導入するか、またはトランスフェクション剤（もしくはそれらの混合物）と混和し、得られた混合物を細胞にトランスフェクトするために利用する。第３の特定の実施形態では、膜融合ペプチドもしくはタンパク質、輸送もしくは移行ペプチドもしくはタンパク質、レセプター－リガンドペプチドもしくはタンパク質、または核局在化ペプチドもしくはタンパク質、および／またはそれらの修飾類似体（たとえば、スペルミン修飾ペプチドもしくはタンパク質）、あるいはそれらの組合せを含めて、１種以上のトランスフェクション増強ペプチド、タンパク質、またはタンパク質断片の混合物を、リボ核酸と混合または複合化して細胞内に導入し、任意選択的に、トランスフェクション剤と混和して、得られた混合物を細胞にトランスフェクトするために利用する。さらに、トランスフェクション剤の成分（たとえば、脂質、カチオン性脂質、またはデンドリマー）を、所定のペプチド、タンパク質、またはタンパク質断片に、直接にまたはリンク基もしくはスペーサー基を介して共有結合でコンジュゲートする。この実施形態でとくに興味深いのは、膜融合性、膜透過性、輸送性、もしくは移行性であるまたは細胞標的化の機能を有するペプチドまたはタンパク質である。ペプチドまたはタンパク質トランスフェクション剤複合体は、リボ核酸と組み合わされて、トランスフェクションに利用される。
特定の実施形態では、製剤は、細胞を含有する標的組織内に有効量のｍｍＲＮＡが実質的に保持されるようにする薬学的に許容可能な担体を含む。
特定の実施形態では、製剤は、少なくともｍｍＲＮＡおよび送達剤を含みうる。いくつかの実施形態では、送達剤は、ｍｍＲＮＡの局所送達および全身送達を可能にするリピドイド系製剤を含みうる。
また、工学操作されたリボヌクレオチドを含有するｉｎ ｖｉｖｏデポ剤を生成するための組成物も提供される。たとえば、組成物は、生体内分解性生体適合性ポリマーと、ポリマーを可塑化してそれと共にゲルを形成するのに有効な量で存在する溶媒と、工学操作されたリボ核酸と、を含有する。特定の実施形態では、組成物はまた、本明細書に記載の細胞透過剤を含む。他の実施形態では、組成物は、チキソトロピー組成物を形成するのに有効であるようにポリマーと混合可能なチキソトロピー量のチキソトロピー剤をも含有する。さらなる組成物は、安定化剤、バルキング剤、キレート化剤、または緩衝剤を含む。
他の実施形態では、患者の環境（器官または組織の部位を意味する）へのｍｍＲＮＡの投与などのために、持続放出送達デポ剤が提供される。そのようなデポ剤は、一般的には、ｍｍＲＮＡおよび可撓性鎖状ポリマーを含有し、ｍｍＲＮＡおよび可撓性鎖状ポリマーは両方とも、架橋マトリックスタンパク質の多孔性マトリックス内に閉じ込められる。通常、細孔サイズは、１ｍｍ未満、たとえば、９００ｎｍ、８００ｎｍ、７００ｎｍ、６００ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍ、または１００ｎｍ未満である。通常、可撓性鎖状ポリマーは親水性である。通常、可撓性鎖状ポリマーは、少なくとも５０ｋＤａ、たとえば、７５ｋＤａ、１００ｋＤａ、１５０ｋＤａ、２００ｋＤａ、２５０ｋＤａ、３００ｋＤａ、４００ｋＤａ、５００ｋＤａ、または５００ｋＤａ超の分子量を有する。通常、可撓性鎖状ポリマーは、マトリックスタンパク質の持続長の１０％未満、たとえば、９、８、７、６、５、４、３、２、１％、または１％未満の持続長を有する。通常、可撓性鎖状ポリマーは、マトリックスタンパク質に類似した電荷を有する。いくつかの実施形態では、可撓性鎖状ポリマーは、マトリックスから、ｍｍＲＮＡが進入しうる細胞を含む周囲組織中への、ｍｍＲＮＡの拡散を持続可能にするサイズになるように、架橋マトリックスタンパク質のマトリックスの有効細孔サイズを変化させる。
リピドイド（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）を用いた製剤
本明細書に記載の医薬組成物は、ｍｍＲＮＡの局所送達および全身送達を可能にするリピドイド系製剤を含む。リピドイドの合成は、広範に記載されており、これらの化合物を含有する製剤は、ポリヌクレオチドの送達にとくに適している（マーン（Ｍａｈｏｎ）ら著、バイオコンジュゲート化学（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．）２０１０年 第２１巻：１４４８－１４５４頁、シュレーダー（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ）ら著、国際医学誌（Ｊ
Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．）２０１０年 第２６７巻：９－２１頁、アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、自然生物工学（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）２００８年 第２６巻：５６１－５６９頁、ラブ（Ｌｏｖｅ）ら著、米国国立科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．）２０１０年 第１０７巻：１８６４－１８６９頁、ジークバルト（Ｓｉｅｇｗａｒｔ）ら著、米国国立科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．）２０１１年 第１０８巻：１２９９６－３００１頁（それらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
本発明によれば、これらのリピドイドを含有する複合体、ミセル、リポソーム、または粒子を調製可能であるので、局所および全身投与経路によるｍｍＲＮＡ製剤化リピドイドの注射後、コードタンパク質の産生により判断した場合、ｍｍＲＮＡの効果的送達がもたらされる。修飾ｍＲＮＡ－リピドイド複合体は、本明細書に開示される種々の手段により投与可能である。
筋肉内経路または皮下経路に対して最適化されたリピドイド製剤の特徴は、標的細胞型および細胞外マトリックスを介する血流中への製剤の拡散能に有意に依存して異なりうる。効果的な肝細胞送達を行うには、内皮穿孔サイズに基づいて、１５０ｎｍ未満の粒子サイズが望まれるが（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、分子治療（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．）２００９年 第１７巻：８７２－８７９頁（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）、内皮細胞、骨髄細胞、および筋細胞（これらに限定されるものではない）をはじめとする他の細胞型に製剤を送達するためのリピドイドオリゴヌクレオチドの使用は、同様なサイズ制限を受けない可能性がある。
単球などの骨髄細胞への効果的送達の一態様では、リピドイド製剤は、類似の成分モル比を有しうる。リピドイドと、ジステロイルホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ－ＤＭＧ（これらに限定されるものではない）をはじめとする他の成分と、のさまざまな比を用いて、肝細胞、骨髄細胞、筋細胞など（これらに限定されるものではない）をはじめとするさまざまな細胞型への送達のために、ｍｍＲＮＡ分子の製剤を最適化しうる。たとえば、成分モル比としては、５０％脂質、１０％ジステロイルホスファチジルコリン、３８．５％コレステロール、および１．５％ＰＥＧが挙げられるが、これに限定されるものではない。脂質は、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００（異性体および誘導体を含む）、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ならびにそれらの類似体から選択されるが、これらに限定されるものではない。皮下送達または筋肉内送達のいずれかを介する細胞（たとえば、限定されるものではないが、脂肪細胞および筋細胞）への核酸の局所送達のためのリピドイド製剤の使用はまた、全身送達に必要とされうる製剤成分の必ずしもすべてを必要としないこともあり、したがって、リピドイドとｍｍＲＮＡとを含みうる。
さらなる実施形態では、さまざまなリピドイドの組合せを用いて、ｍｍＲＮＡ指向タンパク質の有効性を改善しうる。
本発明によれば、修飾ｍＲＮＡは、細胞への添加前に設定比でｍｍＲＮＡをリピドイドと混合することにより製剤化されうる。ｉｎ ｖｉｖｏ製剤は、生体全体にわたり循環を促進するために追加の成分の添加を必要とすることもある。ｉｎ ｖｉｖｏ作用に好適な粒子を形成するこれらのリピドイドの能力を試験するために、ｓｉＲＮＡ－リピドイド製剤に使用される標準的製剤化プロセスを出発点として使用しうる。最初のｍｍＲＮＡ－リピドイド製剤は、４２％リピドイド、４８％コレステロール、および１０％ＰＥＧを含む粒子で構成され、比のさらなる最適化が可能である。粒子形成後、ｍｍＲＮＡが添加されて、複合体に組み込まれる。カプセル化効率は、標準的色素排除アッセイを用いて決定される。
核酸のｉｎ ｖｉｖｏ送達は、製剤組成、粒子ＰＥＧ化性、充填度、オリゴヌクレオチド対脂質比、および粒子サイズなどの生物物理学的パラメーターをはじめとする多くのパラメーターにより影響されうる（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、分子治療（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．）２００９年 第１７巻：８７２－８７９頁（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。一例として、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質のアンカー鎖長がわずかに変化すると、ｉｎ ｖｉｖｏ有効性が有意な影響を受ける可能性がある。ペンタ［３－（１－ラウリルアミノプロピオニル）］－トリエチレンテトラミン塩酸塩（ＴＥＴＡ－５ＬＡＰ、別名９８Ｎ１２－５、ムルガイア（Ｍｕｒｕｇａｉａｈ）ら著、分析生化学（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第４０１巻：６１頁（２０１０年）を参照されたい）、Ｃ１２－２００（誘導体および異性体を含む）、ＭＤ１、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、およびＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（図１参照）（これらに限定されるものではない）をはじめとするさまざまなリピドイドを含む製剤を、ｉｎ ｖｉｖｏ活性に関して試験することが可能である。
「９８Ｎ１２－５」として本明細書で参照されるリピドイドは、アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、分子治療（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．）２００９年 第１７巻：８７２－８７９頁により開示されており、その全体が参照により組み込まれる。（図１参照）
「Ｃ１２－２００」として本明細書で参照されるリピドイドは、ラブ（Ｌｏｖｅ）ら著、米国国立科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．）２０１０年 第１０７巻：１８６４－１８６９頁（図１参照）ならびにリウ（Ｌｉｕ）およびホワーン（Ｈｕａｎｇ）著、分子治療（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）．２０１０年 ６６９－６７０頁（図１参照）により開示されており、両方ともその全体が参照により本明細書に組み込まれる。リピドイド製剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡに加えて、３もしくは４のいずれかまたはそれ以上の成分を含む粒子を含みうる。一例として、特定のリピドイドを含む製剤は、限定されるものではないが９８Ｎ１２－５を含み、４２％リピドイド、４８％コレステロール、および１０％ＰＥＧ（Ｃ１４アルキル鎖長）を含有しうる。他の例として、特定のリピドイドを含む製剤は、限定されるものではないがＣ１２－２００を含み、５０％リピドイド、１０％ジステロイルホスファチジルコリン、３８．５％コレステロール、および１．５％ＰＥＧ－ＤＭＧを含有しうる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションの試験に使用されるｍｍＲＮＡ対リピドイドの比は、経験に基づいてさまざまなリピドイド：ｍｍＲＮＡ比で試験される。ｓｉＲＮＡおよびリピドイドを用いた以前の研究では、２．５：１、５：１、１０：１、および１５：１のリピドイド：ｓｉＲＮＡ ｗｔ：ｗｔ比が利用された。ｓｉＲＮＡに対してｍｍＲＮＡの長さがより長いと仮定すれば、リピドイド対ｍｍＲＮＡのｗｔ：ｗｔ比をより小さくしても、おそらく効果を発揮するであろう。また、それに加えて、比較のために、ＲＮＡｉＭａｘ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））またはＴＲＡＮＳＩＴ－ｍＲＮＡ（ミラスバイオ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）、ウィスコンシン州マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ））のカチオン性脂質送達媒体を用いて、ｍｍＲＮＡを製剤化する。
所望のタンパク質産物を発現するリピドイド製剤化ｍｍＲＮＡの能力は、ルシフェラーゼ発現に関しては発光、発現に関してはフローサイトメトリー、および分泌に関してはＥＬＩＳＡにより確認可能である。
ｍｍＲＮＡコードタンパク質の発現は、筋肉内または皮下組織内でも、全身的に血液ならびに他の器官および流体、たとえば、肝臓および脾臓、尿、唾液などでも、評価可能である。
たとえば、単回用量研究では、所望の産物の発現の量、用量反応性、および寿命の評価が可能である。リピドイド製剤を用いたｍｍＲＮＡの製剤化後、以上に記載したように、動物は、生理食塩水製剤またはいくつかの異なるｍｍＲＮＡの１つを含有するリピドイド製剤のいずれかの投与を受ける群に分けられる。注射前、ｍｍＲＮＡ含有リピドイド製剤は、ＰＢＳ中に希釈され、動物は、５０ｍｇ／ｋｇから１ｎｇ／ｋｇ程度の低用量までの単回筋肉内用量の製剤化ｍｍＲＮＡが投与される。ただし、好ましい範囲は、１０ｍｇ／ｋｇ～１００ｎｇ／ｋｇである。試験動物がマウスである場合、後肢内に１回投与するのであれば、最大用量は、約１ｍｇのｍｍＲＮＡまたは０．０２ｎｇ程度の少量のｍｍＲＮＡでありうる。皮下投与でも同様に、ｍｍＲＮＡ含有リピドイド製剤は、ＰＢＳ中に希釈され、その後、動物は、約４００ｍｇ／ｋｇから１ｎｇ／ｋｇ程度の低用量までの単回皮下用量の製剤化ｍｍＲＮＡが投与される。好ましい投与量範囲は、８０ｍｇ／ｋｇ～１００ｎｇ／ｋｇを含む。試験動物がマウスである場合、用量が１回皮下投与されるのであれば、投与される最大用量は、約８ｍｇのｍｍＲＮＡまたは０．０２ｎｇ程度の少量のｍｍＲＮＡでありうる。
２０グラムのマウスでは、単回筋肉内注射液の量は、最大で０．０２５ｍｌ、単回皮下注射液の量は、最大で０．２ｍｌであることが好ましい。動物に投与されるｍｍＲＮＡの用量は、動物の体重に依存して計算される。ｍｍＲＮＡ－リピドイドの投与後の種々の時点で、血清、組織、および組織溶解物を取得して、ｍｍＲＮＡコード産物のレベルを決定することが可能である。所望のタンパク質産物を発現するリピドイド製剤化ｍｍＲＮＡの能力は、ルシフェラーゼ発現の発光、フローサイトメトリー、およびＥＬＩＳＡにより確認可能である。
また、複数回用量レジメンの追加の研究を行って、ｍｍＲＮＡを用いて最大発現を決定しり、ｍｍＲＮＡ駆動発現の飽和性を評価したり（並行的または逐次的に対照および活性ｍｍＲＮＡ製剤を投与することにより達成される）、繰返し薬剤投与の実現可能性を決定したり（何週間かまたは何ヶ月間かの間隔で何回かｍｍＲＮＡを投与してから、発現レベルが免疫原性などの因子により影響されるかを決定することにより）することも可能である。
投与
本発明は、本発明に係る修飾ｍＲＮＡまたは複合体を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。ｍｍＲＮＡもしくは複合体、またはそれらの医薬組成物、イメージング組成物、診断組成物、もしくは予防組成物は、疾患、障害、および／または病態（たとえば、作業記憶欠損に関連する疾患、障害、および／または病態）を予防、治療、診断、または画像化するのに有効でありうる任意の量および任意の投与経路を用いて、対象に投与されうる。厳密な必要量は、対象の種、年齢、および全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与形態、その活性形態など（これらに限定されるものではない）の因子に依存して、対象によって異なるであろう。
送達されるｍｍＲＮＡ、および／またはその医薬組成物、予防組成物、診断組成物、もしくはイメージング組成物は、哺乳動物（たとえば、ヒト、家畜、ネコ、イヌ、マウス、ラットなど）などの動物に投与されうる。いくつかの実施形態では、その医薬組成物、予防組成物、診断組成物、またはイメージング組成物はヒトに投与される。
ｍｍＲＮＡは、任意の経路により投与されうる。いくつかの実施形態では、ｍｍＲＮＡは、局所、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、皮下、脳室内、経真皮、皮膚層間、直腸、腟内、腹腔内、外用（たとえば、粉末剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、ローション剤、および／または滴剤による）、粘膜、鼻、頬腔内、腸内、硝子体、腫瘍内、舌下（これらに限定されるものではない）をはじめとするさまざまな経路の１つ以上により、気管内点滴注入、気管支点滴注入、および／または吸入により、経口スプレー、経鼻スプレー、および／またはエアロゾルとして、および／または門脈カテーテルを介して、投与される。
いくつかの実施形態では、ｍｍＲＮＡは、全身性静脈内注射により投与されうる。特定の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、静脈内投与および／または経口投与されうる。特定の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、血液脳関門、血管関門、または他の上皮性関門をｍｍＲＮＡが通過できるようにする方法で、投与されうる。
注射用製剤、たとえば、無菌の注射可能な水性または油性のサスペンジョン剤は、好適な分散剤、湿潤剤、および／または懸濁化剤を用いて、公知の技術に従って製剤化されうる。無菌注射用製剤は、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤および／または溶媒中の、たとえば、１，３－ブタンジオールの溶液としての、無菌の注射可能な溶液剤、サスペンジョン剤、および／またはエマルジョン剤でありうる。利用しうる許容可能な媒体および溶媒としては、水、リンゲル液（米国薬局方）、および生理食塩液がある。無菌固定油は、溶媒または懸濁媒体として従来方式で利用される。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む任意の無刺激性固定油を利用することが可能である。オレイン酸などの脂肪酸を注射剤の調製に使用することが可能である。
注射用製剤は、たとえば、細菌保持フィルターに通して濾過することにより、および／または使用前に無菌水または他の無菌注射用媒体に溶解可能または分散可能な無菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことにより、滅菌可能である。
組成物の局所投与、外用投与、および／または経真皮投与に供される製剤は、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、粉末剤、溶液剤、スプレー剤、吸入剤、および／または貼付剤を含みうる。そのほかに、本発明では、経真皮パッチの使用が考えられる。これは、多くの場合、生体への化合物の制御送達を提供するという追加の長所を有する。そのような製剤は、たとえば、適正な媒体中に化合物を溶解および／または分配することにより調製されうる。他の選択肢としてまたは追加として、速度制御膜を提供することにより、ならびに／またはポリマーマトリックス中および／もしくはゲル中に化合物を分散させることにより、速度を制御しうる。
外用投与に好適な製剤は、液体製剤および／または半液体製剤、たとえば、リニメント剤、ローション剤、水中油型および／もしくは油中水型エマルジョン剤、たとえば、クリーム剤、軟膏剤、および／もしくはペースト剤、ならびに／または溶液剤および／もしくはサスペンジョン剤を含むが、これらに限定されるものではない。外用投与可能な製剤は、たとえば、約１％～約１０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含みうるが、活性成分の濃度は、溶媒中への活性成分の溶解度限界程度に高くしうる。外用投与に供される製剤は、本明細書に記載の１つ以上の追加の成分をさらに含みうる。
医薬組成物は、経眼投与に好適な製剤の形態で、調製、包装、および／または販売を行いうる。そのような製剤は、たとえば、水性または油性の液体賦形剤中の活性成分の０．１／１．０％（ｗ／ｗ）溶液および／またはサスペンジョンを含む点眼剤の形態をとりうる。そのような滴剤は、緩衝剤、塩、および／または本明細書に記載の任意の追加成分の他の１つ以上をさらに含みうる。有用な他の経眼投与可能な製剤は、微結晶形態でおよび／またはリポソーム調製物中に活性成分を含むものを含む。点耳剤および／または点眼剤は、本発明の範囲内にあると考えられる。
一般的には、最も適切な投与経路は、送達されるｍｍＲＮＡの性質（たとえば、消化管、血流などの環境中でのその安定性）、患者の病態（たとえば、患者が特定の投与経路に耐えることができるか）などを含むさまざまな因子に依存するであろう。本発明は、薬剤送達の科学の進歩の可能性を考慮して、任意の適切な経路によるｍｍＲＮＡの送達を包含する。
特定の実施形態では、本発明に係る組成物は、所望の治療効果、診断効果、または予防効果を得るために、１日あたり対象体重基準で約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇを送達するのに十分な投与レベルで、１日１回以上投与されうる。所望の投与量は、１日３回、１日２回、１日１回、２日１回、３日に１回、毎週１回、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回送達されうる。特定の実施形態では、所望の投与量は、複数回投与（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４回、またはそれ以上の投与）を用いて送達されうる。複数回投与を利用する場合、本明細書に記載されるような分割投与レジメンを使用しうる。
本発明により、分割用量レジメンによるｍｍＲＮＡの投与は、哺乳動物対象においてより高レベルのタンパク質を産生することが判明した。本明細書で用いられる場合、「分割用量（ｓｐｌｉｔ ｄｏｓｅ）」とは、単回単位用量または全一日用量を２つ以上に分割した用量のことである。本明細書で用いられる場合、「単回単位用量」とは、１回で／一時点／一経路／一接触点で、すなわち単回投与イベントで、投与される任意の治療剤の用量のことである。本明細書で用いられる場合、「全一日用量」とは、２４時間以内で投与または処方される量のことである。それは、単回単位用量として投与されうる。一実施形態では、本発明に係るｍｍＲＮＡは、分割用量で対象に投与される。ｍｍＲＮＡは、緩衝液のみの形態でまたは本明細書に記載の製剤の形態で製剤化されうる。
修飾核酸分子または複合体は、１種以上の他の治療剤、予防剤、診断剤、またはイメージング剤と組み合わせて使用または投与されうる。「と組み合わせて」とは、作用剤を同時に投与しなければならないことおよび／または一緒に送達すべく製剤化しなければならないことを示すことを意図したものではないが、これらの送達方法は、本開示の範囲内にある。組成物は、１種以上の他の所望の治療剤または医学的手順と同時に、その前に、またはその後に、投与することが可能である。一般的には、各作用剤は、その作用剤に対して決められた用量および／または時間スケジュールで投与されるであろう。いくつかの実施形態では、本開示は、生物学的利用能の改善、代謝の低減および／もしくは改変、排泄の阻害、ならびに／または生体内の分布の改変を行いうる作用剤と組み合わせた、医薬組成物、予防組成物、診断組成物、またはイメージング組成物の送達を包含する。
さらに、組み合わせて利用される治療活性剤、予防活性剤、診断活性剤、またはイメージング活性剤は、単一組成物の形態で一緒に投与されうるか、または異なる組成物の形態で独立して投与されうることがわかるであろう。一般的には、組み合わせて利用される作用剤は、個別に利用されるレベルを超えないレベルで利用されることが予想されるであろう。いくつかの実施形態では、組み合わせて利用されるレベルは、個別に利用されるレベルよりも低いであろう。一実施形態では、組合せは、単独でまたは一緒に、本明細書に記載の分割投与レジメンに従って投与されうる。
組合せレジメンで利用される治療（治療剤または手順）の特定の組合せは、所望の治療剤および／または手順の適合性ならびに達成される所望の治療効果を考慮に入れるであろう。また、利用される治療が、同一の障害に対して所望の効果を達成しうるか（たとえば、本発明に従って癌を治療するのに有用な組成物は、化学療法剤と同時に投与されうる）、または異なる効果を達成しうることは（たとえば、副作用の抑制）、わかるであろう。
ｍｍＲＮＡを含有する組成物は、筋肉内に、経動脈的に、眼内に、経腟的に、経直腸的に、腹腔内に、静脈内に、鼻腔内に、皮下に、内視鏡下に、経真皮的に、筋肉内に、脳室内に、真皮内に、髄腔内に、外用として（たとえば、粉末剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、ローション剤、および／または滴剤により）、経粘膜的に、経鼻的に、経腸的に、腫瘍内に、気管内点滴注入、気管支点滴注入、および／もしくは吸入、経鼻スプレーおよび／もしくはエアロゾルにより、ならびに／または門脈カテーテルを介して、投与すべく製剤化される。
また、組成物は、直接浸漬または沐浴する方法、カテーテルを介した方法、ゲル剤、粉末剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、ローション剤、および／または滴剤による方法、組成物で被覆または含浸された布や生分解性材料などの基材を用いた方法など（これらに限定されるものではない）をはじめとする当技術分野のいくつかの方法のいずれかで、器官または組織に直接送達すべく製剤化されうる。いくつかの実施形態では、組成物は、長期放出に供すべく製剤化される。特定の実施形態では、ｍｍＲＮＡ分子もしくは複合体、ならびに／またはその医薬組成物、予防組成物、診断組成物、もしくはイメージング組成物は、ｍｍＲＮＡ分子または複合体が血液脳関門、血管関門、または他の上皮性関門を通過するように、投与されうる。
本発明のいくつかの態様では、核酸（特定的には、ポリペプチドをコードするリボ核酸）は、標的組織内にまたはそれに近接して空間的に保持される。提供されているのは、組成物とくに組成物の核酸成分が標的組織内に実質的に保持されるような条件下で、つまり、組成物の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９％、または９９．９９％超が標的組織内に保持されるような条件下で、標的組織（１つ以上の標的細胞を含有する）と組成物とを接触させることにより、哺乳動物対象の標的組織に組成物を提供する方法である。有利には、保持率は、１つ以上の標的細胞に進入する組成物中に存在する核酸の量を測定することにより決定される。たとえば、対象に投与された核酸の少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９％、または９９．９９％超は、投与後の一定の時点で細胞内に存在する。たとえば、哺乳動物対象への筋肉内注射は、リボ核酸およびトランスフェクション試薬を含有する水性組成物を用いて行われ、組成物の保持率は、筋細胞内に存在するリボ核酸の量を測定することにより決定される。
本発明の態様は、組成物が実質的に標的組織内に保持されるような条件下で、標的組織（１つ以上の標的細胞を含有する）と組成物とを接触させることにより、哺乳動物対象の標的組織に組成物を提供する方法に関する。組成物は、目的のポリペプチドが少なくとも１つの標的細胞内で産生されるような条件下で、リボ核酸が進入する細胞の先天性免疫反応を回避するように工学操作された有効量のリボ核酸（このリボ核酸は、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する）を含有する。組成物は、一般的には、細胞透過剤（ただし、「裸の」核酸（たとえば、細胞透過剤や他の作用剤を伴わない核酸）もまた、考えられる）と、薬学的に許容可能な担体と、を含有する。
いくつかの状況下では、組織内の細胞により産生されるタンパク質の量は、望ましくは増大される。好ましくは、タンパク質産生のこの増大は、標的組織内の細胞に空間的に制限される。したがって、哺乳動物対象の組織内の対象のタンパク質の産生を増大させる方法が提供される。リボ核酸が進入する細胞の先天性免疫反応を回避するように工学操作されかつ目的のポリペプチドをコードするリボ核酸を含有する組成物が提供される。この組成物は、標的組織の所定の体積内に含有される実質的パーセントの細胞内で目的のポリペプチドを産生するように組成物の単位量が決定されていることを特徴とする。いくつかの実施形態では、組成物は、複数の異なるリボ核酸を含み、リボ核酸の１つまたは２つ以上は、リボ核酸が進入する細胞の先天性免疫反応を回避するように工学操作され、かつリボ核酸の１つまたは２つ以上は、目的のポリペプチドをコードする。任意選択的に、組成物はまた、リボ核酸の細胞内送達を支援する細胞透過剤を含有する。標的組織の所定の体積内に含有される実質的パーセントの細胞内で目的のポリペプチドを産生するのに必要な組成物の用量の決定が行われる（一般的には、所定の体積に隣接するまたは標的組織に対して遠位にある組織内では、目的のポリペプチドの有意な産生を誘導しない）。この決定に続いて、決定された用量は、哺乳動物対象の組織内に直接導入される。
筋肉内および／または皮下に投与されうる製剤は、ポリマー、コポリマー、およびゲル剤を含みうるが、これらに限定されるものではない。ポリマー、コポリマー、および／またはゲル剤は、分子量、粒子サイズ、ペイロード、および／または単量体比などの因子を調節することにより放出速度を改変すべく、さらに調整されうるが、これらに限定されるものではない。たとえば、筋肉内および／または皮下に投与される製剤は、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）などのコポリマーを含みうるが、これに限定されるものではない。
本明細書に記載の組成物の局所送達は、外用送達、経眼送達、経真皮送達などの方法により施行されうるが、これらに限定されるものではない。組成物はまた、限定されるものではないが、対象の身体が治療時に環境に開放されている場合などでは、局所送達に通常は利用可能でない身体の一部に局所投与されうる。組成物はさらに、組成物を用いて身体部分を沐浴、浸漬、および／または包囲することにより送達されうる。
しかしながら、本発明は、薬剤送達の科学の進歩の可能性を考慮して、任意の適切な経路による、ｍｍＲＮＡ分子もしくは複合体、および／またはその医薬組成物、予防組成物、診断組成物、またはイメージング組成物の送達を包含する。
ｍｍＲＮＡのレベルまたは濃度は、エキソソームを用いて特徴付けられうる。エキソソーム中のｍｍＲＮＡのレベルまたは濃度は、ｍｍＲＮＡの発現レベル、存在、不在、切断（トランケーション）、または変化を表しうる。レベルまたは濃度は、構築物特異的プローブ、サイトメトリー、ｑＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、電気泳動、質量分析、またはそれらの組合せを用いたアッセイなどの方法により決定されうるが、これらに限定されるものではない。さらに、レベルまたは濃度は、臨床表現型に関連付けられうる。分析のために、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法などの免疫組織化学的方法、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、ナノ膜限外濾過、免疫吸着捕獲、アフィニティー精製、マイクロ流体分離、またはそれらの組合せなどの方法により、エキソソームを単離しうる。
医薬組成物
対象に投与した時、本明細書に記載の医薬組成物は、修飾ｍＲＮＡから産生されたタンパク質を提供しうる。医薬組成物は、任意選択的に、１つ以上の追加の治療活性物質を含んでいてもよい。いくつかの実施形態によれば、それを必要とする対象に送達される１つ以上のタンパク質を含む医薬組成物を投与する方法が提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、ヒト対象に投与される。さらなる実施形態では、組成物は、患者である対象に投与される。
医薬組成物は、任意選択的に、１つ以上の追加の治療活性物質を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、組成物はヒトに投与される。本開示の目的では、「活性成分」という表現は、一般的には、本明細書に記載されるように送達されるｍｍＲＮを意味する。
本明細書に提供される医薬組成物の説明は、主に、ヒトへの投与に好適な医薬組成物に関するものであるが、当業者であれば、そのような組成物がすべての種類の動物への投与に一般に好適であることは理解されよう。種々の動物への投与に好適な組成物にするための、ヒトへの投与に好適な医薬組成物の改変は、よく理解されており、通常の技能を有する獣医薬理学者であれば、かりに実験を行うとしても通常の実験を行うだけで、そのような改変を設計および／または実施することが可能である。医薬組成物の投与が考えられる対象は、ヒトおよび／もしくは他の霊長動物、哺乳動物（ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、および／もしくはラットなどの商業関連の哺乳動物を含む）、ならびに／またはトリ（ニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／もしくはシチメンチョウなどの商業関連のトリを含む）を含むが、これらに限定されるものではない。
本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、薬理学技術分野で公知であるまたは今後開発される任意の方法により調製されうる。一般的には、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤および／または１種以上の他の副成分と一体化させる工程と、次いで、必要であればおよび／または望ましければ、造形および／または包装を行って所望の単回または複数回用量ユニットにする工程と、を含む。
本発明に係る医薬組成物は、単回単位用量としておよび／または複数の単回単位用量として、大量に、調製、包装、および／または販売を行いうる。本明細書で用いられる場合、「単位用量」とは、所定量の活性成分を含む医薬組成物の個別量のことである。活性成分の量は、一般的には、対象に投与される活性成分の投与量および／またはそのような投与量の便利な部分量たとえばそのような投与量の１／２もしくは１／３に等しい。
本発明に係る医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容可能な賦形剤、および／または任意の追加の成分の相対量は、特性、サイズ、および／または治療される対象の病態に依存して、さらには組成物の投与経路に依存して、変化するであろう。例として、組成物は０．１％～１００％（ｗ／ｗ）の活性成分を含みうる。
医薬製剤は、薬学的に許容可能な賦形剤を追加的に含みうる。この賦形剤は、本明細書で用いられる場合、所望の特定の剤形に適したありとあらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体媒体、分散助剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張化剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、固形結合剤、滑沢剤などを含む。レミングトンの薬学の科学と実際（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）、第２１版、Ａ．Ｒ．ゲナロ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ）著（リッピンコット，ウィリアムズ＆ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）、メリーランド州ボルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）、２００６年、参照により本明細書に組み込まれる）には、医薬組成物の製剤化で使用される種々の賦形剤およびその公知の調製技術が開示されている。従来の賦形媒体はいずれも、望ましくない生物学的作用を生じたり、さもなければ、医薬組成物のいずれかの他の成分と有害な形で相互作用したりして、物質またはその誘導体と不適合である場合を除いて、その使用は、本発明の範囲内にあると考えられる。
いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の純度である。いくつかの実施形態では、賦形剤は、ヒトでの使用および獣医学的使用が認可されている。
いくつかの実施形態では、賦形剤は、米国食品医薬品局により認可されている。いくつかの実施形態では、賦形剤は、医薬グレードである。いくつかの実施形態では、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方、および／または国際薬局方の規格を満たす。
医薬組成物の製造で使用される薬学的に許容可能な賦形剤は、不活性希釈剤、分散剤および／もしくは顆粒化剤、界面活性剤および／もしくは乳化剤、崩壊剤、結合剤、保存剤、緩衝剤、滑沢剤、ならびに／または油を含むが、これらに限定されるものではない。そのような賦形剤は、任意選択的に、医薬製剤に含まれうる。ココア脂や坐剤ワックスなどの賦形剤、着色剤、コーティング剤、甘味剤、風味剤、および／または香気剤は、配合業者の判断に基づいて、組成物中に存在させることが可能である。
例示的な希釈剤は、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウムラクトース、スクロース、セルロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、トウモロコシデンプン、粉末糖など、および／またはそれらの組合せを含むが、これらに限定されるものではない。
例示的な顆粒化および／または分散剤は、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、タピオカデンプン、ナトリウムデンプングリコレート、クレー、アルギン酸、グアーガム、シトラスパルプ、寒天、ベントナイト、セルロースおよび木製品、天然スポンジ、陽イオン交換樹脂、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、炭酸ナトリウム、架橋ポリ（ビニルピロリドン）（クロスポビドン）、ナトリウムカルボキシメチルデンプン（ナトリウムデンプングリコレート）、カルボキシメチルセルロース、架橋ナトリウムカルボキシメチルセルロース（クロスカルメロース）、メチルセルロース、α化デンプン（デンプン１５００）、微結晶デンプン、水不溶性デンプン、カルシウムカルボキシメチルセルロース、ケイ酸マグネシウムアルミウニム（ビーガム（Ｖｅｅｇｕｍ））、ナトリウムラウリルスルフェート、第四級アンモニウム化合物など、および／またはそれらの組合せを含むが、これらに限定されるものではない。
例示的な界面活性剤および／または乳化剤は、天然乳化剤（たとえば、アカシア、寒天、アルギン酸、ナトリウムアルギネート、トラガカント、コンドラックス（ｃｈｏｎｄｒｕｘ）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、およびレシチン）、コロイドクレー（たとえば、ベントナイト［ケイ酸アルミニウム］およびビーガム（Ｖｅｅｇｕｍ）（登録商標）［ケイ酸マグネシウムアルミウニム］）、長鎖状アミノ酸誘導体、高分子量アルコール（たとえば、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、トリアセチンモノステアレート、エチレングリコールジステアレート、グリセリルモノステアレート、およびプロピレングリコールモノステアレート、ポリビニルアルコール）、カルボマー（たとえば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、およびカルボキシビニルポリマー）、カラゲナン、セルロース系誘導体（たとえば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル（たとえば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート［トゥイーン（ＴＷＥＥＮ）（登録商標）２０］、ポリオキシエチレンソルビタン［トゥイーン（ＴＷＥＥＮ）（登録商標）６０］、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート［トゥイーン（ＴＷＥＥＮ）（登録商標）８０］、ソルビタンモノパルミテート［スパン（ＳＰＡＮ）（登録商標）４０］、ソルビタンモノステアレート［スパン（ＳＰＡＮ）（登録商標）６０］、ソルビタントリステアレート［スパン（ＳＰＡＮ）（登録商標）６５］、グリセリルモノオレエート、ソルビタンモノオレエート［スパン（ＳＰＡＮ）（登録商標）８０］）、ポリオキシエチレンエステル（たとえば、ポリオキシエチレンモノステアレート［ミルジ（ＭＹＲＪ）（登録商標）４５］、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油、ポリエトキシル化ヒマシ油、ポリオキシメチレンステアレート、およびソルトール（ＳＯＬＵＴＯＬ）（登録商標））、スクロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（たとえば、クレモフォア（ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ）（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル（たとえば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ブリッジ（ＢＲＩＪ）（登録商標）３０］）、ポリ（ビニルピロリドン）、ジエチレングリコールモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、ナトリウムオレエート、カリウムオレエート、エチルオレエート、オレイン酸、エチルラウレート、ナトリウムラウリルスルフェート、プルロニック（登録商標）Ｆ６８、ポロキサマー（ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ）（登録商標）１８８、セトリモニウムブロミド、セチルピリジニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ドクセートナトリウムなど、および／またはそれらの組合せを含むが、これらに限定されるものではない。
例示的な結合剤は、デンプン（たとえば、トウモロコシデンプンおよびデンプン糊）、ゼラチン、糖（たとえば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）、天然および合成のガム（たとえば、アカシア、ナトリウムアルギネート、トチャカ抽出物、パンワール（ｐａｎｗａｒ）ガム、ガティガム、イサポール（ｉｓａｐｏｌ）皮粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶セルロース、セルロースアセテート、ポリ（ビニルピロリドン）、ケイ酸マグネシウムアルミウニム（ビーガム（Ｖｅｅｇｕｍ）（登録商標））、およびカラマツアラボガラクタン）、アルギネート、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、無機カルシウム塩、ケイ酸、ポリメタクリレート、ワックス、水、アルコールなど、ならびにそれらの組合せを含むが、これらに限定されるものではない。
例示的な保存剤は、抗酸化剤、キレート化剤、抗微生物保存剤、抗菌類保存剤、アルコール保存剤、酸性保存剤、および／または他の保存剤を含むが、これらに限定されるものではない。例示的な抗酸化剤は、αトコフェロール、アスコルビン酸、アコルビル（ａｃｏｒｂｙｌ）パルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、プロピルガレート、アスコルビン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および／または亜硫酸ナトリウムを含むが、これらに限定されるものではない。例示的なキレート化剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、ジナトリウムエデテート、ジカリウムエデテート、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、ナトリウムエデテート、酒石酸、および／またはトリナトリウムエデテートを含む。例示的な抗微生物保存剤は、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、セチルピリジニウムクロリド、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミドウレア、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、および／またはチメロサールを含むが、これらに限定されるものではない。例示的な抗菌類性保存剤は、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、カリウムベンゾエート、カリウムソルベート、ナトリウムベンゾエート、ナトリウムプロピオネート、および／またはソルビン酸を含むが、これらに限定されるものではない。例示的なアルコール保存剤は、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、フェノール化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシベンゾエート、および／またはフェニルエチルアルコールを含むが、これらに限定されるものではない。例示的な酸性保存剤は、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、β－カロテン、クエン酸、酢酸、デヒドロ酢酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、および／またはフィチン酸を含むが、これらに限定されるものではない。他の保存剤は、トコフェロール、トコフェロールアセテート、デテロキシム（ｄｅｔｅｒｏｘｉｍｅ）メシレート、セトリミド、ブチル化、ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）ブチル化する、ヒドロキシトルエン化（ＢＨＴ）エチレンジアミン、ナトリウムラウリルスルフェート（ＳＬＳ）、ナトリウムラウリルエーテルスルフェート（ＳＬＥＳ）、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、グライダント（ＧＬＹＤＡＮＴ）＋（登録商標）、フェノニップ（ＰＨＥＮＯＮＩＰ）（登録商標）、メチルパラベン、ジェルマール（ＧＥＲＭＡＬＬ）（登録商標）１１５、ゲルマベン（ＧＥＲＭＡＢＥＮ）（登録商標）ＩＩ、ネオロン（ＮＥＯＬＯＮＥ）（登録商標）、ケーソン（ＫＡＴＨＯＮ）（登録商標）、および／またはオイクシール（ＥＵＸＹＬ）（登録商標）を含むが、これらに限定されるものではない。
例示的な緩衝剤は、クエン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、リン酸緩衝溶液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプト酸カルシウム、カルシウムグルコネート、Ｄ－グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、第二リン酸カルシウム、リン酸、第三リン酸カルシウム、水酸化リン酸カルシウム、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、リン酸一水素カリウム、第一リン酸カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、第一リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、発熱原非含有水、等張生理食塩水、リンゲル液、エチルアルコールなど、および／またはそれらの組合せを含むが、これらに限定されるものではない。
例示的な滑沢剤は、マグネシウムステアレート、カルシウムステアレート、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、グリセリルベハネート（ｂｅｈａｎａｔｅ）、水素化植物性油、ポリエチレングリコール、ナトリウムベンゾエート、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、マグネシウムラウリルスルフェート、ナトリウムラウリルスルフェートなど、およびそれらの組合せを含むが、これらに限定されるものではない。
例示的な油は、アーモンド油、キョウニン油、アボカド油、ババス油、ベルガモット油、クロフサスグリ油、ボラージ油、カデ油、カモミール油、カノーラ油、キャラウェー油、カルナウバ油、カスター油、シナモン油、ココア脂油、ヤシ油、タラ肝油、コーヒー油、トウモロコシ油、綿実油、エミュー油、ユーカリ油、マツヨイグサ油、魚油、アマニ油、ゲラニオール油、ヒョウタン油、ブドウ種子油、ハシバミ油、ヒソップ油、イソプロピルミリステート、ホホバ油、ククイナッツ油、ラバンジン油、ラベンダー油、レモン油、アオモジ油、マカデミアナッツ（ｍａｃａｄｅｍｉａ ｎｕｔ）油、ゼニアオイ油、マンゴー種子油、メドウフォーム種子油、ミンク油、ナツメグ油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラフィー油、パーム油、パーム核油、トウニン油、ラッカセイ油、ケシの実油、カボチャ種子油、ナタネ油、コメヌカ油、ローズマリー油、サフラワー油、ビャクダン油、サスクアナ（ｓａｓｑｕａｎａ）油、セイボリー油、シーバックソーン油、ゴマ油、シアバター、シリコーン、ダイズ油、ヒマワリ油、ティーツリー油、アザミ油、ツバキ油、ベチベル油、クルミ油、およびコムギ胚芽油を含むが、これらに限定されるものではない。例示的な油は、ブチルステアレート、カプリル酸トリグリセリド、カプリン酸トリグリセリド、シクロメチコン、ジエチルセバケート、ジメチコン３６０、イソプロピルミリステート、鉱油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーン油、および／またはそれらの組合せを含むが、これらに限定されるものではない。
経口投与および非経口投与に供される液体投与製剤は、薬学的に許容可能なエマルジョン剤、マイクロエマルジョン剤、溶液剤、サスペンジョン剤、シロップ剤、および／またはエリキシル剤を含むが、これらに限定されるものではない。活性成分のほかに、液体投与製剤は、当技術分野で一般に使用される不活性希釈剤、たとえば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、たとえば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特定的には、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコ油シ、胚芽油、オリーブ油、カスター油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物などを含みうる。不活性希釈剤以外に、経口組成物は、補助剤、たとえば、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、風味剤、および／または香気剤を含みうる。非経口投与に供される特定の実施形態では、組成物は、可溶化剤、たとえば、クレモフォア（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）（登録商標）、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および／またはそれらの組合せと混合される。
医薬剤の製剤化および／または製造の一般的要件は、たとえば、レミングトン：薬学の科学と実際（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ
ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）、第２１版、リッピンコット ウィリアムズ＆ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）、２００５年（参照により本明細書に組み込まれる）に見いだしうる。
活性成分の効果を延長するために、多くの場合、皮下注射または筋肉内注射から活性成分の吸収を遅らせることは望ましい。これは、水への溶解度が悪い結晶性材料またはアモルファス材料の液体サスペンジョンを用いることにより、達成可能である。その場合、薬剤の吸収速度は、その溶解速度に依存し、これは、結果的に、結晶サイズおよび結晶形に依存する。他の選択肢として、非経口投与薬剤形態の吸収遅延は、油媒体中に薬剤を溶解または懸濁させることにより、達成される。注射用デポ剤形態は、ポリラクチド－ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に薬剤のマイクロカプセマトリックスを形成することにより、作製される。薬剤とポリマーとの比および利用される特定のポリマーの性質に依存して、薬剤放出の速度を制御することが可能である。他の生分解性ポリマーの例は、ポリ（オルトエステル）およびポリ（アンヒドリド）を含む。デポ注射用製剤は、体内組織と適合性があるリポソーム中またはマイクロエマルジョン中に薬剤を閉じ込めることにより、調製される。
直腸投与または膣投与に供される組成物は、典型的には、周囲温度では固体であるが、体温では液体であり、したがって、直腸内または膣腔内では融解して活性成分を放出する、ココア脂、ポリエチレングリコール、坐剤ワックスなどの好適な非刺激性賦形剤と、組成物を、混合することにより調製可能な坐剤である。経口投与に供される固体製剤は、カプセル剤、錠剤、丸剤、粉末剤、および顆粒剤を含む。そのような固体製剤では、活性成分は、少なくとも１つの不活性な薬学的に許容可能な賦形剤、たとえば、ナトリウムシトレートまたはリン酸二カルシウムおよび／または充填剤または増量剤（たとえば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸）、結合剤（たとえば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、およびアカシア）、湿潤剤（たとえば、グリセロール）、崩壊剤（たとえば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプンまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム）、溶解遅延剤（たとえば、パラフィン）、吸収促進剤（たとえば、第四級アンモニウム化合物）、湿潤剤（たとえば、セチルアルコールおよびグリセロールモノステアレート）、吸収剤（たとえば、カオリンおよびベントナイトクレー）、および滑沢剤（たとえば、タルク、スカルシウムステアレート、マグネシウムステアレート、固体ポリエチレングリコール、ナトリウムラウリルスルフェート）、あるいはそれらの混合物と混合される。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合、製剤は、緩衝剤を含みうる。
ラクトースや乳糖さらには高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を用いて、軟質および硬質の充填ゼラチンカプセル中の充填剤として、類似のタイプの固体組成物を利用することが可能である。錠剤、糖衣剤、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤の固体剤形は、腸溶コーティングや医薬製剤化技術で周知の他のコーティングなどのコーティングおよびシェルを用いて作製可能である。それらは、任意選択的に、不透明化剤を含んでいてもよく、かつ任意選択的に、遅延方式で、活性成分のみを放出するかまたは腸管の特定部分で優先的に放出する組成物でありうる。使用可能な埋込み組成物の例は、高分子物質およびワックスを含む。ラクトースや乳糖さらには高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を用いて、軟質および硬質の充填ゼラチンカプセル中の充填剤として、類似のタイプの固体組成物を利用することが可能である。
組成物の外用投与および／または経真皮投与に供される製剤は、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、粉末剤、溶液剤、スプレー剤、吸入剤、および／または貼付剤を含みうる。一般的には、活性成分は、必要に応じて、薬学的に許容可能な賦形剤および／または任意の所要の保存剤および／または緩衝剤と無菌条件下で混合される。外用投与可能な製剤は、たとえば、約１％～約１０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含みうるが、活性成分の濃度は、溶媒中への活性成分の溶解度限界程度に高くしうる。外用投与に供される製剤は、本明細書に記載の１つ以上の追加の成分をさらに含みうる。
医薬組成物は、頬側口腔を介する肺内投与に好適な製剤の形態で、調製、包装、および／または販売を行いうる。そのような製剤は、活性成分を含むかつ約０．５ｎｍ～約７ｎｍまたは約１ｎｍ～約６ｎｍの範囲内の直径を有する乾燥粒子を含みうる。そのような組成物は、好適には、粉末を分散するように噴射剤ストリームを方向付けることが可能な乾燥粉末貯蔵部を含む用具を用いて、ならびに／または密封容器内で低沸点噴射剤中に溶解および／もしくは懸濁された活性成分を含む用具などの自己噴射型溶媒／粉末分配容器を用いて、投与に供される乾燥粉末の形態をとる。そのような粉末剤は、重量基準で粒子の少なくとも９８％が０．５ｎｍ超の直径を有する、かつ数基準で粒子の少なくとも９５％が７ｎｍ未満の直径を有する、粒子を含む。他の選択肢として、重量基準で粒子の少なくとも９５％は、１ｎｍ超の直径を有し、かつ数基準で粒子の少なくとも９０％は、６ｎｍ未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は、糖などの固体微粉末希釈剤を含んでいてもよく、ユニット製剤で適宜提供される。
低沸点噴射剤は、一般的には、大気圧で１８．３℃（６５°Ｆ）未満の沸点を有する液体噴射剤を含む。一般的には、噴射剤は、組成物の５０％～約９９．９％（ｗ／ｗ）を構成可能であり、活性成分は、組成物の０．１％～約２０％（ｗ／ｗ）を構成可能である。噴射剤はさらに、液体非イオン性界面活性剤および／または固体陰イオン性界面活性剤および／または固体希釈剤などの追加の成分（これは、活性成分を含む粒子と同程度の粒子サイズを有しうる）を含みうる。
肺内送達に供すべく製剤化される医薬組成物は、溶液および／またはサスペンジョンのドロップレットの形態で活性成分を提供可能である。そのような製剤は、活性成分を含む、水性および／または希釈アルコール性の溶液剤および／またはサスペンジョン剤（任意選択的に無菌のもの）として、調製、包装、および／または販売を行うことが可能であり、任意のネブライゼーション用具および／またはアトマイゼーション用具を用いて適宜投与可能である。そのような製剤はさらに、サッカリンナトリウムなどの風味剤、揮発性油、緩衝剤、界面活性剤、および／またはメチルヒドロキシベンゾエートなどの保存剤を含む１つ以上の追加の成分を含みうるが、これらに限定されるものではない。この投与経路により提供されるドロップレットは、約０．１ｎｍ～約２００ｎｍの範囲内の平均直径を有しうる。
肺内送達に有用である本明細書で説明した製剤は、医薬組成物の鼻腔内送達に有用である。鼻腔内投与に好適な他の製剤は、活性成分を含むかつ約０．２μｍ～５００μｍの平均粒子を有する粗粉末剤である。そのような製剤は、鼻呼吸する方法で、すなわち、鼻の近くに保持された粉末剤の容器から鼻道を介して迅速な吸入を行うことにより、投与される。
経鼻投与に好適な製剤は、たとえば、約０．１％（ｗ／ｗ）程度の少量および１００％（ｗ／ｗ）程度の大量の活性成分を含みうる。また、本明細書に記載の１つ以上の追加の成分を含みうる。医薬組成物は、頬腔内投与に好適な製剤の形態で、調製、包装、および／または販売を行いうる。そのような製剤は、たとえば、従来の方法を用いて作製される錠剤および／またはロゼンジ剤の形態をとることが可能であり、かつたとえば、０．１％～２０％（ｗ／ｗ）の活性成分で、残分は、経口的に可溶性および／または分解性の組成物、任意選択的に、本明細書に記載の１つ以上の追加の成分でありうる。他の選択肢として、頬腔内投与に好適な製剤は、活性成分を含む粉末剤ならびに／またはエアロゾル化および／もしくはアトマイズ化溶液剤および／もしくはサスペンジョン剤を含みうる。そのような粉末状、エアロゾル化、および／またはエアロゾル化製剤は、分散時、約０．１ｎｍ～約２００ｎｍの範囲内の平均粒子サイズおよび／または平均ドロップレットサイズを有しうる。またさらに、本明細書に記載の１つ以上の任意の追加の成分を含みうる。
医薬組成物の性質
本明細書に記載の医薬組成物は、以下の性質の１つ以上により特徴付け可能である。
生物学的利用能
ｍｍＲＮＡ分子は、本明細書に記載の送達剤を含む組成物の形態に製剤化された場合、本明細書に記載の送達剤が欠如している組成物と比較して、生物学的利用能の増大を呈することが可能である。本明細書で用いられる場合、「生物学的利用能」という用語は、哺乳動物に投与されたｍｍＲＮＡ分子の所与の量の全身的利用能を意味する。生物学的利用能は、哺乳動物への化合物の投与後、変化していない形態の化合物の曲線下面積（ＡＵＣ）または血清中もしくは血漿中の最大濃度（Ｃｍａｘ）を測定することにより、評価可能である。ＡＵＣは、横座標（Ｘ軸）に沿った時間に対して縦座標（Ｙ軸）に沿った化合物の血清中または血漿中濃度をプロットした曲線の下側の面積の決定値である。一般的には、特定の化合物のＡＵＣは、当業者に公知であるかつＧ．Ｓ．バンカー（Ｇ．Ｓ．Ｂａｎｋｅｒ）著、現代の医薬品、薬剤、および薬学（Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第７２巻、マーセル・デッカー社，ニューヨーク（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｉｎｃ．）、１９９６年（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法を用いて、計算可能である。
Ｃｍａｘ値は、哺乳動物への化合物の投与後、哺乳動物の血清中または血漿中で達成される化合物の最大濃度である。特定の化合物のＣｍａｘ値は、当業者に公知の方法を用いて測定可能である。「生物学的利用能の増大」または「薬動学的挙動の改善」という表現は、本明細書で用いられる場合、本明細書に記載の送達剤と共投与された場合、哺乳動物においてＡＵＣ、Ｃｍａｘ、またはＣｍｉｎとして測定される第１のｍｍＲＮＡ分子の全身的利用能が、そのような共投与が行われない場合よりも大きいことを意味する。いくつかの実施形態では、ｍｍＲＮＡ分子の生物学的利用能は、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％増大可能である。
治療ウィンドウ
ｍｍＲＮＡ分子は、本明細書に記載の組成物の形態に製剤化された場合、本明細書に記載の送達剤が欠如して投与されたｍｍＲＮＡ分子組成物の治療ウィンドウと比較して、投与されたｍｍＲＮＡ分子組成物の治療ウィンドウの増大を呈しうる。本明細書で用いられる場合、「治療ウィンドウ」とは、作用部位における治療活性物質の血漿中濃度の範囲またはレベルの範囲であって、治療効果を誘発する可能性の高い濃度範囲またはレベル範囲を意味する。いくつかの実施形態では、ｍｍＲＮＡ分子の治療ウィンドウは、本明細書に記載の送達剤と共投与された場合、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％増大可能である。
分布容積
ｍｍＲＮＡ分子は、本明細書に記載の組成物の形態に製剤化された場合、改善された分布容積（Ｖｄｉｓｔ）を呈しうる。分布容積（Ｖｄｉｓｔ）は、体内の薬剤の量を、血中または血漿中の薬剤の濃度に関連付ける。本明細書で用いられる場合、「分布容積」という用語は、体内の薬剤の全量を血液中または血漿中と同一の濃度で含有するのに必要とされるであろう流体体積を意味する。すなわち、Ｖｄｉｓｔは、体内の薬剤量／血液中または血漿中の薬剤濃度、に等しい。たとえば、用量１０ｍｇおよび血漿中濃度１０ｍｇ／Ｌでは、分布容積は１リットルである。分布容積は、薬剤が血管外組織内に存在する程度を反映する。大きい分布容積は、血漿タンパク質結合と比較して組織成分に結合する化合物の傾向を反映する。臨床現場では、Ｖｄｉｓｔは、定常状態の濃度を達成する負荷用量を決定するために使用可能である。いくつかの実施形態では、ｍｍＲＮＡ分子の分布容積は、本明細書に記載の送達剤と共投与した場合、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％低減可能である。
複数回投与のための装置および方法
複数回投与のための方法および装置は、本明細書に教示される分割投与レジメンに従って本発明に係るｍｍＲＮＡを送達するために利用されうる。そのような方法および装置は、以下に記載される。
細胞、器官、および組織への複数回投与のための当技術分野で公知の方法および装置は、本発明の実施形態として本明細書に開示される方法および組成物と組み合わせて使用可能であると考えられる。これらは、たとえば、複数の針を有する方法および装置、ルーメンやカテーテルなどを利用したハイブリッド装置、さらには熱、電流、または放射線により駆動される機構を利用した装置を含む。
本発明によれば、これらの複数回投与装置は、本明細書で想定されている分割用量を送達するために利用されうる。
本明細書に記載の真皮内医薬組成物送達で使用するための好適な用具は、短針用具、たとえば、米国特許第４，８８６，４９９号明細書、同第５，１９０，５２１号明細書、同第５，３２８，４８３号明細書、同第５，５２７，２８８号明細書、同第４，２７０，５３７号明細書、同第５，０１５，２３５号明細書、同第５，１４１，４９６号明細書、および同第５，４１７，６６２号明細書に記載されるものを含む。真皮内組成物は、皮膚中への針の有効進入長さを制限する用具により、たとえば、ＰＣＴ国際公開第９９／３４８５０号に記載されるものおよびその機能的等価物により、投与可能である。液体ジェット注射器を介して、および／または角質層に突刺して真皮に達するジェットを生成する針を介して、真皮に液体組成物を送達するジェット式注射用具は、好適である。ジェット式注射用具は、たとえば、米国特許第５，４８０，３８１号明細書、同第５，５９９，３０２号明細書、同第５，３３４，１４４号明細書、同第５，９９３，４１２号明細書、同第５，６４９，９１２号明細書、同第５，５６９，１８９号明細書、同第５，７０４，９１１号明細書、同第５，３８３，８５１号明細書、同第５，８９３，３９７号明細書、同第５，４６６，２２０号明細書、同第５，３３９，１６３号明細書、同第５，３１２，３３５号明細書、同第５，５０３，６２７号明細書、同第５，０６４，４１３号明細書、同第５，５２０，６３９号明細書、同第４，５９６，５５６号明細書、同第４，７９０，８２４号明細書、同第４，９４１，８８０号明細書、同第４，９４０，４６０号明細書、ならびにＰＣＴ国際公開第９７／３７７０５号およびＰＣＴ国際公開第９７／１３５３７号に記載されている。皮膚の外層を介して真皮に粉末形態のワクチンを加速すべく圧縮ガスを使用するバリスティック粉末／粒子送達用具は、好適である。他の選択肢としてまたは追加として、従来の注射器を真皮内投与の古典的マントー法で使用してもよい。
固形組織に治療剤を送達する方法は、バーラミ（Ｂａｈｒａｍｉ）らにより記載されており、たとえば、米国特許出願公開第２０１１０２３０８３９号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。バーラミ（Ｂａｈｒａｍｉ）によれば、一連の針が、各針の長さに沿って前記固形組織中の任意の位置に実質的に等しい量の流体を送達する装置中に組み込まれる。
生体組織を通って生物学的物質を送達するための装置は、コジュレ（Ｋｏｄｇｕｌｅ）らにより記載されており、たとえば、米国特許出願公開第２０１１０１７２６１０号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。コジュレ（Ｋｏｄｇｕｌｅ）によれば、１種以上の金属で作製されたかつ約２００マイクロメートル（ミクロン）～約３５０マイクロメートル（ミクロン）の外径および少なくとも１００マイクロメートル（ミクロン）の長さを有する複数の中空極微針が、ペプチド、タンパク質、炭水化物、核酸分子、脂質、および他の医薬活性成分、またはそれらの組合せを送達する装置中に組み込まれる。
組織に治療剤を送達するための送達プローブは、ガンデー（Ｇｕｎｄａｙ）らにより記載されており、たとえば、米国特許出願公開第２０１１０２７０１８４号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。ガンデー（Ｇｕｎｄａｙ）によれば、複数の針が、装着されたカプセル剤を活性化位置と不活性化位置との間で移動させて針を介してカプセル剤から作用剤を押し出す装置中に組み込まれる。
頻回注射用医療器具は、アッサフ（Ａｓｓａｆ）により記載されており、たとえば、米国特許出願公開第２０１１０２１８４９７号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。アッサフ（Ａｓｓａｆ）によれば、複数の針が、前記針の１つ以上に接続されたチャンバーと、各注射後、チャンバーに医用流体を連続的に再充填するための手段と、を有する装置中に組み込まれる。
患者の身体、特定的には、陰茎勃起刺激系に物質を注射するために少なくとも部分的には留置可能なシステムは、フォーセル（Ｆｏｒｓｅｌｌ）により記載されており、たとえば、米国特許出願公開第２０１１０１９６１９８号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。フォーセル（Ｆｏｒｓｅｌｌ）によれば、複数の針が、患者の左右陰核海綿体に隣接する１つ以上のハウジングと共に留置される装置中に組み込まれる。貯蔵部およびポンプもまた、針を介して薬剤を供給するために留置される。
治療有効量の鉄を経真皮送達するための方法は、ベレンソン（Ｂｅｒｅｎｓｏｎ）により記載されており、たとえば、米国特許出願公開第２０１００１３０９１０号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。ベレンソン（Ｂｅｒｅｎｓｏｎ）によれば、イオン泳動パッチ上のイオン鉄の経真皮送達を増強するために、角質層中に複数のマイクロチャネルを形成する複数の針が使用されうる。
生体組織を通って生物学的物質を送達するための方法は、コジュレ（Ｋｏｄｇｕｌｅ）らにより記載されており、たとえば、米国特許出願公開第２０１１０１９６３０８号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。コジュレ（Ｋｏｄｇｕｌｅ）によれば、治療活性成分を含有する複数の生分解性極微針が、タンパク質、炭水化物、核酸分子、脂質、および他の医薬活性成分、またはそれらの組合せを送達する装置中に組み込まれる。
ボツリヌス毒素組成物を含む経真皮パッチは、ドノバン（Ｄｏｎｏｖａｎ）により記載されており、たとえば、米国特許出願公開第２００８０２２００２０号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる））に教示されている。ドノバン（Ｄｏｎｏｖａｎ）によれば、複数の針が、血管を破壊せずに皮膚の角質層を通って突出する前記針を介してボツリヌス毒素を角質層下に送達するパッチ中に組み込まれる。
極低温処理の位置に活性剤を投与するためのクライオプローブは、トウビア（Ｔｏｕｂｉａ）により記載されており、たとえば、米国特許出願公開第２００８０１４００６１号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。トウビア（Ｔｏｕｂｉａ）によれば、複数の針が、チャンバー内に活性剤を収容して作用剤を組織に投与するプローブ中に組み込まれる。
炎症を治療もしくは予防するまたは正常関節を促進する方法は、ストック（Ｓｔｏｃｋ）らにより記載されており、たとえば、米国特許出願公開第２００９０１５５１８６号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。ストック（Ｓｔｏｃｋ）によれば、複数の針が、シグナル伝達モジュレーター化合物を含有する組成物を投与する装置中に組み込まれる。
多部位注射システムは、キンメル（Ｋｉｍｍｅｌｌ）らにより記載されており、たとえば、米国特許出願公開第２０１００２５６５９４号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。キンメル（Ｋｉｍｍｅｌｌ）によれば、複数の針が、針を介して医薬を角質層中に送達する装置中に組み込まれる。
インターフェロンを真皮内区画に送達する方法は、デッカー（Ｄｅｋｋｅｒ）らにより記載されており、たとえば、米国特許出願公開第２００５０１８１０３３号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。デッカー（Ｄｅｋｋｅｒ）によれば、０～１ｍｍの露出高さの出口部を有する複数の針が、物質を０．３ｍｍ～２ｍｍの深さに送達することにより薬動学的挙動および生物学的利用能を改善する装置中に組み込まれる。
遺伝子、酵素、および生物学的作用剤を組織細胞に送達する方法は、デサイ（Ｄｅｓａｉ）により記載されており、たとえば、米国特許出願公開第２００３００７３９０８号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。デサイ（Ｄｅｓａｉ）によれば、複数の針が、身体中に挿入されて前記針を介して医用流体を送達する装置中に組み込まれる。
線維芽細胞で心不整脈を治療するための方法は、リー（Ｌｅｅ）らにより記載されており、たとえば、米国特許出願公開第２００４０００５２９５号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。リー（Ｌｅｅ）によれば、複数の針が、線維芽細胞を組織の局所領域内に送達する装置中に組み込まれる。
脳腫瘍を処理するための磁気制御ポンプを用いた方法は、シャカル（Ｓｈａｃｈａｒ）らにより記載されており、たとえば、米国特許第７，７９９，０１２号明細書（方法）および同第７，７９９，０１６号明細書（装置）（それらの内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。シャカル（Ｓｈａｃｈａｒ）によれば、複数の針が、針を介して医薬剤を制御速度で押し出すポンプ中に組み込まれる。
哺乳動物雌において膀胱の機能障害を治療する方法は、ベルシ（Ｖｅｒｓｉ）らにより記載されており、たとえば、米国特許第８，０２９，４９６号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。ベルシ（Ｖｅｒｓｉ）によれば、一連の極微針が、針を介して治療剤を膀胱三角中に直接送達する装置中に組み込まれる。
極微針経真皮輸送装置は、エンジョル（Ａｎｇｅｌ）らにより記載されており、たとえば、米国特許第７，３６４，５６８号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。エンジョル（Ａｎｇｅｌ）によれば、複数の針が、異なる方向から表面中に挿入される針を介して身体表面中に物質を輸送する装置中に組み込まれる。
皮下注入するための装置は、ダルトン（Ｄａｌｔｏｎ）らにより記載されており、たとえば、米国特許第７，１５０，７２６号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。ダルトン（Ｄａｌｔｏｎ）によれば、複数の針が、針を介して流体を皮下組織中に送達する装置中に組み込まれる。
マイクロカニューレを介してワクチンおよび遺伝子治療剤を皮内送達するための装置および方法は、ミクスズタ（Ｍｉｋｓｚｔａ）らにより記載されており、たとえば、米国特許第７，４７３，２４７号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。ミツスズタ（Ｍｉｔｓｚｔａ）によれば、少なくとも１つの中空極微針が、対象の皮膚に０．０２５ｍｍ～２ｍｍの深さでワクチンを送達する装置中に組み込まれる。
インスリンを送達する方法は、ペティス（Ｐｅｔｔｉｓ）らにより記載されており、たとえば、米国特許第７，７２２，５９５号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。ペティス（Ｐｅｔｔｉｓ）によれば、２つの針が、本質的に同時に両方の針を皮膚中に挿入して第１の針では２．５ｍｍ未満の深さで真皮内区画にインスリンを送達しかつ第２の針では２．５ｍｍ超かつ５．０ｍｍ未満の深さで皮下区画にインスリンを送達する装置中に組み込まれる。
吸引下での皮膚注射送達は、コチャンバ（Ｋｏｃｈａｍｂａ）らにより記載されており、たとえば、米国特許第６，８９６，６６６号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。コチャンバ（Ｋｏｃｈａｍｂａ）によれば、互いに相対的に隣接した複数の針が、流体を皮膚層下に注射する装置中に組み込まれる。
皮膚に通して物質を吸引または送達する装置は、ダウン（Ｄｏｗｎ）らにより記載されており、たとえば、米国特許第６，６０７，５１３号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。ダウン（Ｄｏｗｎ）によれば、装置中に組み込まれる複数の皮膚透過部材は、約１００マイクロメートル（ミクロン）～約２０００マイクロメートル（ミクロン）の長さを有し、かつ約３０～５０ゲージである。
物質を皮膚に送達するための装置は、パルマー（Ｐａｌｍｅｒ）らにより記載されており、たとえば、米国特許第６，５３７，２４２号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。パルマー（Ｐａｌｍｅｒ）によれば、一連の極微針が、皮膚と針との接触を増強しかつ物質のより均一な送達を提供するために伸張アセンブリーを使用する装置中に組み込まれる。
局所薬剤送達用の灌流装置は、ザモイスキー（Ｚａｍｏｙｓｋｉ）により記載されており、たとえば、米国特許第６，４６８，２４７号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。ザモイスキー（Ｚａｍｏｙｓｋｉ）によれば、複数の皮下注射針が、皮下注射液が吸い込まれる組織中に皮下注射液の内容物を注射する装置中に組み込まれる。
極微針とヒト皮膚との間の相互作用を改善することによる組織を通る薬剤および生物学的分子の輸送を向上させる方法は、プラウスニッツ（Ｐｒａｕｓｎｉｔｚ）らにより記載されており、たとえば、米国特許第６，７４３，２１１号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。プラウスニッツ（Ｐｒａｕｓｎｉｔｚ）によれば、複数の極微針が、極微針が適用される、より高剛性かつより低変形性の表面を提示可能である装置中に組み込まれる。
医薬剤を器官内投与するための装置は、ティング（Ｔｉｎｇ）らにより記載されており、たとえば、米国特許第６，０７７，２５１号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。ティング（Ｔｉｎｇ）によれば、投与の向上のために側方開口を有する複数の針が、針チャンバーからのおよびその中への前記針の伸張および引込みにより医薬剤を貯蔵部から前記針中に押し出して前記医薬剤を標的器官中に注射する装置中に組み込まれる。
マルチ持針器および皮下マルチチャネル注入口は、ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）により記載されており、たとえば、米国特許第４，６９５，２７３号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）によれば、持針器上の複数の針が、注入口の隔壁に通して挿入され、前記注入口の隔離室と連通する。
デュアル皮下注射器は、ホーン（Ｈｏｒｎ）により記載されており、たとえば、米国特許第３，５５２，３９４号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。ホーン（Ｈｏｒｎ）によれば、装置中に組み込まれる２つの針は、６８ｍｍ未満離間しており、異なる形式および長さをとりうるので、異なる深さへの注入が可能である。
複数の針および複数の流体区画を備えたシリンジは、ハーシュベルグ（Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇ）により記載されており、たとえば、米国特許第３，５７２，３３６号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。ハーシュベルグ（Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇ）によれば、複数の針は、複数の流体区画を有するかつ１回の注射では混合不可能な不適合薬剤を同時に投与可能であるシリンジ中に組み込まれる。
流体の皮内注射用の外科用装置は、エリスク（Ｅｌｉｓｃｕ）らにより記載されており、たとえば、米国特許第２，５８８，６２３号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。エリスク（Ｅｌｉｓｃｕ）によれば、複数の針が、流体をより広く分散させて皮内に注射する装置中に組み込まれる。
物質を複数の乳管に同時送達するための装置は、ハング（Ｈｕｎｇ）により記載されており、たとえば、欧州特許第１８１８０１７号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。ハング（Ｈｕｎｇ）によれば、複数のルーメンが、腺管網の開口を介して挿入して流体を腺管網に送達する装置中に組み込まれる。
医薬剤を心臓または他の器官の組織に導入するためのカテーテルは、ツケブチャバ（Ｔｋｅｂｕｃｈａｖａ）により記載されており、たとえば、国際公開第２００６１３８１０９号（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。ツケブチャバ（Ｔｋｅｂｕｃｈａｖａ）によれば、平坦軌道で器官壁に進入する２つの湾曲針が組み込まれる。
医薬剤を送達するための装置は、マッケイ（Ｍｃｋａｙ）らにより記載されており、たとえば、国際公開第２００６１１８８０４号（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。マッケイ（Ｍｃｋａｙ）によれば、各針上に複数の開口を備えた複数の針が、脊椎円板の内側円板空間などの組織への局所送達を促進する装置中に組み込まれる。
哺乳動物皮膚中の真皮内空間内に免疫調節物質を直接送達する方法は、ペティス（Ｐｅｔｔｉｓ）により記載されており、たとえば、国際公開第２００４０２００１４号（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。ペティス（Ｐｅｔｔｉｓ）によれば、複数の針が、針を介して０．３ｍｍ～２ｍｍの深さに物質を送達する装置中に組み込まれる。
全身的吸収および薬動学的挙動の改善のために物質を皮膚中の少なくとも２つの区画中に投与するための方法およびデバイスは、ペティス（Ｐｅｔｔｉｓ）らにより記載されており、たとえば、国際公開第２００３０９４９９５号（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。ペティス（Ｐｅｔｔｉｓ）によれば、約３００ｍｍ～約５ｍｍの長さを有する複数の針が、真皮内区画および皮下組織区画に同時に送達する装置中に組み込まれる。
針および回転体を備えた薬剤送達デバイスは、ジマーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ）らにより記載されており、たとえば、国際公開第２０１２００６２５９号（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。ジマーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ）によれば、回転体中に定置された複数の中空針が、回転体が回転するとともに針を介して貯蔵部の内容物を送達する装置中に組み込まれる。
カテーテルおよび／またはルーメンを利用した方法および装置
カテーテルおよびルーメンを用いた方法および装置は、分割投与スケジュールで本発明に係るｍｍＲＮＡを投与するために利用されうる。そのような方法および装置は、以下に記載される。
損傷心臓の心筋への骨格筋芽細胞のカテーテル利用送達は、ヤコビー（Ｊａｃｏｂｙ）らにより記載されており、たとえば、米国特許出願公開第２００６０２６３３３８号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。ヤコビー（Ｊａｃｏｂｙ）によれば、複数の針が、血管内に少なくとも一部が挿入されて針を介して細胞組成物を対象の心臓の局所領域中に送達する装置中に組み込まれる。
神経毒を用いて喘息を治療するための装置は、ディーム（Ｄｅｅｍ）らにより記載されており、たとえば、米国特許出願公開第２００６０２２５７４２号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。ディーム（Ｄｅｅｍ）によれば、複数の針が、針を介して神経毒を気管支組織内に送達する装置中に組み込まれる。
多成分治療を施す方法は、ナヤック（Ｎａｙａｋ）により記載されており、たとえば、米国特許第７，６９９，８０３号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。ナヤック（Ｎａｙａｋ）によれば、頻回注射カニューレが、組織内に治療物質が送達される深さを制御するために深さスロットが含まれていてもよい装置中に組み込まれる。
チャネルを除去形成して組織の所望の領域中に少なくとも１種の治療剤を送達するための外科装置は、マッキンタイル（Ｍｃｌｎｔｙｒｅ）らにより記載されており、たとえば、米国特許第８，０１２，０９６号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。マッキンタイル（Ｍｃｌｎｔｙｒｅ）によれば、複数の針が、チャネルの周囲の組織領域中に治療剤を分配するかつ経心筋血行再建手術にとくに好適である装置中に組み込まれる。
哺乳動物雌において膀胱の機能障害を治療する方法は、ベルシ（Ｖｅｒｓｉ）らにより記載されており、たとえば、米国特許第８，０２９，４９６号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。ベルシ（Ｖｅｒｓｉ）によれば、一連の極微針が、針を介して治療剤を膀胱三角中に直接送達する装置中に組み込まれる。
可撓性生体内関門中に流体を送達する装置および方法は、イエシュラン（Ｙｅｓｈｕｒｕｎ）らにより記載されており、たとえば、米国特許第７，９９８，１１９号明細書（装置）および同第８，００７，４６６号明細書（方法）（それらの内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。イエシュラン（Ｙｅｓｈｕｒｕｎ）によれば、装置上の極微針が、可撓性生体内関門を貫通して延在し、流体が、中空極微針の孔を介して注射される。
心外膜表面を有するかつ胴体内に位置する心臓の組織領域に物質を心外膜注射する方法は、ボナー（Ｂｏｎｎｅｒ）らにより記載されており、たとえば、米国特許第７，６２８，７８０号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。ボナー（Ｂｏｎｎｅｒ）によれば、装置は、細長いシャフトと、針を組織中に押し込んで針を介して医薬剤を組織内に注射するための遠位注入頭と、を有する。
穿刺を塞ぐための装置は、ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）らにより記載されており、たとえば、米国特許第７，９７２，３５８号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）によれば、複数の針が、閉塞剤を穿刺管の周囲の組織中に送達する装置中に組み込まれる。
筋形成および血管新生のための方法は、チュー（Ｃｈｉｕ）らにより記載されており、たとえば、米国特許第６，５５１，３３８号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。チュー（Ｃｈｉｕ）によれば、少なくとも１．２５ｍｍの最大直径および６～２０ｍｍの穿刺深さを提供するのに有効な長さを有する５～１５個の針が、心筋の近位に挿入して前記針の少なくとも一部内に存在する導管を介して外因性の血管新生因子または筋原性因子を前記心筋に供給する装置中に組み込まれる。
前立腺組織の治療のための方法は、ボルムスジ（Ｂｏｌｍｓｊ）らにより記載されており、たとえば、米国特許第６，５２４，２７０号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。ボルムスジ（Ｂｏｌｍｓｊ）によれば、尿道に通して挿入されるカテーテルを含む装置は、周囲前立腺組織内に延在可能な少なくとも１つの中空先端を有する。収斂薬および鎮痛薬が、前記先端を介して前記前立腺組織内に投与される。
骨内部位に流体を注入する方法は、フィンドレー（Ｆｉｎｄｌａｙ）らにより記載されており、たとえば、米国特許第６，７６１，７２６号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。フィンドレー（Ｆｉｎｄｌａｙ）によれば、複数の針が、軟質材料層により覆われた硬質材料シェルを透過可能であるかつ前記硬質材料シェルの下方の所定の距離に流体を送達する装置中に組み込まれる。
血管壁に医薬剤を注射するための装置は、ビギル（Ｖｉｇｉｌ）らにより記載されており、たとえば、米国特許第５，７１３，８６３号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。ビギル（Ｖｉｇｉｌ）によれば、複数の注射器が、マルチルーメンカテーテルを介して医用流体をフレキシブルチューブ中に導入して注入のために前記注射器から血管壁中に導入する装置中の各フレキシブルチューブ上に取り付けられる。
生体通路の周囲の組織に治療剤および／または診断剤を送達するためのカテーテルは、ファクソン（Ｆａｘｏｎ）らにより記載されており、たとえば、米国特許第５，４６４，３９５号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。ファクソン（Ｆａｘｏｎ）によれば、少なくとも１つの針カニューレが、カテーテルの外側に突出する前記針を介して所望の作用剤を組織に送達するカテーテル中に組み込まれる。
治療剤を送達するためのバルーンカテーテルは、オア（Ｏｒｒ）により記載されており、たとえば、国際公開第２０１００２４８７１号（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。オア（Ｏｒｒ）によれば、複数の針が、治療剤を組織内の異なる深さに送達する装置中に組み込まれる。
電流を利用した方法および装置
電流を利用した方法および装置は、本明細書に教示される分割投与レジメンに従って本発明に係るｍｍＲＮＡを送達するために利用されうる。そのような方法および装置は、以下に記載される。
電気的コラーゲン導入治療装置は、マルケス（Ｍａｒｑｕｅｚ）により記載されており、たとえば、米国特許出願公開第２００９０１３７９４５号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。マルケス（Ｍａｒｑｕｅｚ）によれば、複数の針が、繰り返して皮膚に穿刺して最初に皮膚に適用される物質の一部を皮膚中で吸引する装置中に組み込まれる。
動電学的システムは、エサレッジ（Ｅｔｈｅｒｅｄｇｅ）らにより記載されており、たとえば、米国特許出願公開第２００７０１８５４３２号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。エサレッジ（Ｅｔｈｅｒｅｄｇｅ）によれば、極微針が、針を介して電流により医薬剤を標的治療部位に押し込む装置中に組み込まれる。
イオン泳動装置は、マツムラらにより記載されており、たとえば、米国特許第７，４３７，１８９号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。マツムラによれば、複数の針が、より高速でまたはより高効率でイオン化性薬剤を生体内に送達可能な装置中に組み込まれる。
無針注射および電気穿孔による生物学的活性剤の皮内送達は、ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎｎ）らにより記載されており、たとえば、米国特許第７，１７１，２６４号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎｎ）によれば、１つ以上の無針注射器が、電気穿孔装置中に組み込まれ、無針注入と電気穿孔とが組み合わされれば、作用剤を皮膚、筋肉、または粘膜の細胞内に導入するのに十分である。
電気可透過化媒介細胞内送達のための方法は、ルンドクビスト（Ｌｕｎｄｋｖｉｓｔ）らにより記載されており、たとえば、米国特許第６，６２５，４８６号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。ルンドクビスト（Ｌｕｎｄｋｖｉｓｔ）によれば、一対の針電極が、カテーテル中に組み込まれる。前記カテーテルは、生体ルーメン中に配置され、続いて、前記針電極を伸張させて前記ルーメンの周囲の組織内に透過させる。次いで、装置は、前記針電極の少なくとも１つに作用剤を導入して、前記一対の針電極により電場を印加することにより、前記作用剤が細胞膜を通過して治療部位の細胞内に進入できるようにする。
経真皮免疫化のための送達システムは、レビン（Ｌｅｖｉｎ）らにより記載されており、たとえば、国際公開第２００６００３６５９号（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。レビン（Ｌｅｖｉｎ）によれば、複合電極が、電極間に電気エネルギーを印加して皮膚中のマイクロチャネルを形成することにより経真皮送達を促進する装置中に組み込まれる。
皮膚中にＲＦエネルギーを送達する方法は、スコマッカー（Ｓｃｈｏｍａｃｋｅｒ）により記載されており、たとえば、国際公開第２０１１１６３２６４号（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。スコマッカー（Ｓｃｈｏｍａｃｋｅｒ）によれば、複数の針が、真空を適用して皮膚をプレートと接触させることにより針をプレート上の孔に通して皮膚中に挿入しＲＦエネルギーを送達する装置中に組み込まれる。
装置およびキット
装置はまた、本発明と組み合わせて使用されうる。一実施形態では、装置は、修飾ｍＲＮＡの形態で投与されたタンパク質のレベルを評価するために使用される。装置は、血液、尿、または他の生体流体の試験を含みうる。それは、自動化集中実験プラットフォームまたは小型分散卓上装置を含む程度に大きいものでありうる。それは、ポイントオブケア装置またはハンドヘルド装置でありうる。装置は、コンパニオン診断剤としての創薬への取組みに有用でありうる。
いくつかの実施形態では、装置は、内蔵型であり、任意選択的に、無線リモートアクセスにより、産生核酸の合成および／または分析のための説明書を取得することが可能である。装置は、少なくとも１種の核酸、好ましくは、無制限の異なる核酸配列の柔軟性のある合成が可能である。特定の実施形態では、装置は、１人または少人数で輸送が可能である。他の実施形態では、装置は、卓上または机上に収まる大きさである。他の実施形態では、装置は、スーツケース、バックパック、または類似のサイズの物体に収まる大きさである。さらなる実施形態では、装置は、車、トラック、救急車などの乗り物、または戦車、人員運搬車などの軍用車両の中に収まる大きさである。目的のタンパク質をコードする修飾ｍＲＮＡを産生するのに必要な情報は、装置中に存在するコンピュータ可読媒体内に存在する。
いくつかの実施形態では、装置は、核酸配列およびポリペプチド配列のデータベースとの通信（たとえば、無線通信）が可能である。装置は、１つ以上のサンプル容器を挿入するための少なくとも１つのサンプルブロックを含有する。そのようなサンプル容器は、鋳型ＤＮＡ、ヌクレオチド、酵素、緩衝液、他の試薬などの任意の数の材料を液体または他の形態で収容可能である。サンプル容器はまた、サンプルブロックとの接触により加熱または冷却が可能である。サンプルブロックは、一般的には、少なくとも１つのサンプルブロックに対する１つ以上の電子制御装置を備えた装置基部と通信状態にある。サンプルブロックは、好ましくは、加熱モジュールを含有し、そのような加熱分子は、サンプル容器およびその内容物を約－２０Ｃ～＋１００Ｃ超の温度に冷却および／または加熱することが可能である。装置基部は、電池や外部電圧電源などの電圧電源と通信状態にある。装置はまた、ＲＮＡ合成のための材料を貯蔵および分配するための手段をも含有する。
任意選択的に、サンプルブロックは、合成核酸を分離するためのモジュールを含有する。他の選択肢として、装置は、サンプルブロックに機能可能に結合された分離モジュールを含有する。好ましくは、装置は、合成核酸を分析するための手段を含有する。そのような分析は、配列同一性（ハイブリダイゼーションなどにより実証される）、望ましくない配列の不在、合成ｍＲＮＡの完全性の測定（分光測光と組み合わされたマイクロ流体粘度測定などにより）、ならびに修飾ＲＮＡの濃度および／または効力（分光測光などにより）を含む。
特定の実施形態では、装置は、対象から取得した生体材料中に存在する病原体を検出するための手段、たとえば、微生物同定用のＩＢＩＳ ＰＬＥＸ－ＩＤシステム（アボット（Ａｂｂｏｔｔ））と組み合わされる。
本発明は、目的のタンパク質をコードするｍｍＲＮＡが組み込まれた装置を提供する。この装置は、動物対象中に留置されうるか、またはカテーテルもしくはルーメンを介してｍｍＲＮＡ製剤を供給しうる。装置は、ポンプに接続されるか、またはそれを組み込みうる。そのような装置は、ＣＮＳなどの容易に到達できない生体領域にまたは血液脳関門に通して治療剤を送達可能なものを含む。この実施形態では、制御ポンプを用いて分割投与レジメンを実現することが可能である。
キット
本発明は、本発明に係る方法を便宜的および／または効果的に行うためのさまざまなキットを提供する。典型的には、キットは、使用者が対象の複数の治療を行えるようにおよび／または複数の実験を行えるように、十分な量および／または数の成分を含むであろう。
一態様では、本発明は、翻訳可能領域と核酸修飾とを含む第１の単離された核酸（ただし、この核酸は、第１の単離された核酸が導入されうる細胞の先天性免疫反応を回避可能である）と包装材料と説明書とを含む、タンパク質産生用のキットを提供する。キットは、製剤組成物を形成するために送達剤をさらに含みうる。送達組成物は、リピドイドを含みうる。このリポイドは、Ｃ１２－２００、９８Ｎ１２－５、ＭＤ１、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、およびその類似体から選択されるが、これらに限定されるものではない。
一態様では、本発明は、翻訳可能領域とヌクレオシド修飾とを含む第１の単離された核酸（ただし、この核酸は、細胞ヌクレアーゼによる分解の低減を呈する）と包装材料と説明書とを含む、タンパク質産生用のキットを提供する。
一態様では、本発明は、翻訳可能領域と少なくとも２つの異なるヌクレオシド修飾とを含む第１の単離された核酸（ただし、この核酸は、細胞ヌクレアーゼによる分解の低減を呈する）と包装材料と説明書とを含む、タンパク質産生用のキットを提供する。
いくつかの実施形態では、キットは、キットのｍｍＲＮＡの分割投与を施すための分割用量または説明書を提供するであろう。
定義
本明細書中の種々の箇所で、本開示に係る化合物の置換基は、群または範囲で開示される。本開示は、そのような群および範囲のメンバーのあらゆる個別の部分的組合せを含むことがとくに意図されている。たとえば、「Ｃ１～６アルキル」という用語は、メチル、エチル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキル、およびＣ６アルキルを個別に開示することがとくに意図されている。
動物： 本明細書で用いられる場合、「動物」という用語は、動物界の任意のメンバーを意味する。いくつかの実施形態では、「動物」は、任意の発生段階のヒトを意味する。いくつかの実施形態では、「動物」は、任意の発生段階の非ヒト動物を意味する。特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物（たとえば、齧歯動物、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長動物、またはブタ）である。いくつかの実施形態では、動物は、哺乳動物、トリ、爬虫動物、両生動物、魚、および虫を含むが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子工学操作動物、またはクローンである。
およそ： 本明細書で用いられる場合、「およそ」または「約」という用語は、目的の１つ以上の値に適用される場合、明記された参照値に類似した値を意味する。特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、とくに明記されていないかぎりまたはとくに文脈から自明でないかぎり、明記された参照値のいずれの方向にも（より大きいまたはより小さい）、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれよりも少ない範囲内に入る値の範囲を意味する（そのような数が、可能な値の１００％を超える場合を除く）。
会合： 本明細書で用いられる場合、「会合」、「コンジュゲート」、「結合」、「装着」、および「テザー連結」という用語は、２つ以上の部分に対して用いられる場合、直接にまたはリンク剤として機能する１つ以上の追加の部分を介して、互いに物理的に会合または接続されて、構造が用いられる条件下で、たとえば、生理学的条件下で、これらの部分が、物理的に会合された状態を維持するように、十分に安定な構造を形成することを意味する。「会合」は、厳密に直接の共有化学結合を介する必要はない。また、それは、イオン結合、水素結合、または「会合」要素が物理的会合を維持するように十分に安定なハイブリダイゼーションに基づく結合をも示唆しうる。
二機能性： 本明細書で用いられる場合、「二機能性」という用語は、少なくとも２つの機能が可能であるまたはそれを維持する任意の物質、分子、または部分を意味する。機能は、同一の転帰または異なる転帰をもたらしうる。機能を発揮する構造は、同一であっても異なっていてもよい。たとえば、本発明に係る二機能性修飾ＲＮＡは、細胞傷害性ペプチドをコードしうる（第１の機能）。一方、そのコードＲＮＡを含むヌクレオシドは、本質的にそれ自体で細胞傷害性である（第２の機能）。この例では、癌細胞への二機能性修飾ＲＮＡの送達により、癌を寛解または治療用しうるペプチド分子またはタンパク質分子が産生されるだけでなく、修飾ＲＮＡの翻訳の代わりに分解が起これば、ヌクレオシドの細胞傷害性ペイロードが細胞に送達されるであろう。
生物学的活性： 本明細書で用いられる場合、「生物学的活性」という表現は、生体系および／または生物で活性を有する任意の物質の特性を意味する。たとえば、生物に投与された時、その生物に対して生物学的作用を有する物質は、生物学的に活性であると考えられる。特定の実施形態では、核酸分子の一部であっても、生物学的に活性であれば、または生物学的関連性があるとみなされる活性を模倣するのであれば、本発明に係る核酸分子は、生物学的に活性であると考えられうる。
化学用語： 本明細書で用いられる場合、「アルキル」という用語は、直鎖状または分岐状の飽和炭化水素基を意味するものとする。例示的なアルキル基としては、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、プロピル（たとえば、ｎ－プロピルおよびイソプロピル）、ブチル（たとえば、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔ－ブチル）、ペンチル（たとえば、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル）などが挙げられる。アルキル基は、１～約２０、２～約２０、１～約１２、１～約８、１～約６、１～約４、または１～約３個の炭素原子を含有しうる。
本明細書で用いられる場合、「アルケニル」とは、１つ以上の炭素炭素二重結合を有するアルキル基を意味する。例示的なアルケニル基としては、エテニル、プロペニルなどが挙げられる。
本明細書で用いられる場合、「アルコキシ」とは、－Ｏ－アルキル基を意味する。例示的なアルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ（たとえば、ｎ－プロポキシおよびイソプロポキシ）、ｔ－ブトキシなどが挙げられる。
本明細書で用いられる場合、「アルケニル」とは、隣接炭素原子間に少なくとも１つの二重結合を含有する以上に定義したアルキルを意味する。アルケニルは、シスおよびトランスの両方の異性体を含む。代表的な直鎖状および分枝状アルケニルとしては、エチレニル、プロピレニル、１－ブテニル、２－ブテニル、イソブチレニル、１－ペンテニル、２－ペンテニル、３－メチル－１－ブテニル、２－メチル－２－ブテニル、２，３－ジメチル－２－ブテニルなどが挙げられる。
本明細書で用いられる場合、「アルキニル」とは、１つ以上の炭素炭素三重結合を有するアルキル基を意味する。例示的なアルキニル基としては、エチニル、プロピニルなどが挙げられる。
本明細書で用いられる場合、「アリール」とは、単環式または多環式（たとえば、２、３、または４個の縮合環を有する）の芳香族炭化水素、たとえば、フェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、インダニル、インデニルなどを意味する。いくつかの実施形態では、アリール基は、６～約２０個の炭素原子を有する。
本明細書で用いられる場合、「ハロ」または「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを含む。
化合物： 本明細書で用いられる場合、「化合物」という用語は、示された構造のすべての立体異性体、幾何異性体、互変異性体、および同位体を含むものとする。
本明細書に記載の化合物は、非対称でありうる（たとえば、１つ以上のステレオ中心を有する）。とくに指定がないかぎり、エナンチオマーやジアステレオマーなどの立体異性体はすべて、対象となる。非対称置換炭素原子を含有する本開示に係る化合物は、光学活性形またはラセミ形で単離可能である。光学活性出発材料から光学活性形をいかに調製するかに関する方法は、当技術分野で公知であり、たとえば、ラセミ混合物の分割によるものまたは立体選択的合成によるものがある。オレフィンの多くの幾何異性体、Ｃ＝Ｎ二重結合などもまた、本明細書に記載の化合物中に存在可能であり、そのような安定な異性体はすべて、本開示で利用可能と考えられる。本開示に係る化合物のシスおよびトランスの幾何異性体は、記載されており、異性体の混合物としてまたは分離された異性体形として単離されうる。
本開示に係る化合物はまた、互変異性型を含む。互変異性型は、隣接二重結合を有する単結合の交換およびプロトンの付随的移動から生じる。互変異性型は、同一の実験式および全電荷を有する異性プロトン化状態であるプロトトロピー互変異性体を含む。例としてのプロトトロピー互変異性体は、ケトン－エノール対、アミド－イミド酸対、ラクタム－ラクチム対、アミド－イミド酸対、エナミン－イミン対、およびプロトンがヘテロ環系の２つ以上の位置を占有可能である環状形、たとえば、１Ｈ－および３Ｈ－イミダゾール、１Ｈ－、２Ｈ－、および４Ｈ－１，２，４－トリアゾール、１Ｈ－および２Ｈ－イソインドール、ならびに１Ｈ－および２Ｈ－ピラゾールを含む。互変異性型は、平衡状態をとることが可能であるか、または適切な置換により一形態に立体的にロックすることが可能である。
本開示に係る化合物はまた、中間化合物中または最終化合物中に存在する原子の同位体のすべてを含む。「同位体」とは、同一の原子番号を有するが、原子核中の中性子数が異なることから生じる異なる質量数を有する原子を意味する。たとえば、水素の同位体としては、トリチウムおよびジュウテリウムが挙げられる。
本開示に係る化合物および塩は、慣用的方法により、溶媒分子または水分子と組み合わせて溶媒和物および水和物を形成するように調製可能である。
保存： 本明細書で用いられる場合、「保存」という用語は、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のヌクレオチド残基またはアミノ酸残基が、それぞれ、比較される２つ以上の配列の同一位置で不変で存在するものであることを意味する。比較的保存されるヌクレオチドまたはアミノ酸は、配列の他の箇所に現れるヌクレオチドまたはアミノ酸よりも関連性のある配列間で保存されるものである。
いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに１００％の同一性であれば、「完全に保存されている」と言われる。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、に少なくとも９５％の同一性であれば、「高度に保存されている」と言われる。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに約７０％の同一性、約８０％の同一性、約９０％の同一性、約９５％、約９８％、または約９９％の同一性であれば、「高度に保存されている」と言われる。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも３０％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性であれば、「保存されている」と言われる。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに約３０％の同一性、約４０％の同一性、約５０％の同一性、約６０％の同一性、約７０％の同一性、約８０％の同一性、約９０％の同一性、約９５％の同一性、約９８％の同一性、または約９９％の同一性であれば、「保存されている」と言われる。配列の保存は、オリゴヌクレオチドまたはポリペプチドの全長に適用しうるか、またはその一部分、一領域、または一特徴部に適用しうる。
送達： 本明細書で用いられる場合、「送達」とは、化合物、物質、要素、部分、カーゴ、またはペイロードを送達する行為または方式を意味する。
送達剤： 本明細書で用いられる場合、「送達剤」とは、少なくとも部分的に、標的細胞への核酸分子のｉｎ ｖｉｖｏ送達を促進する任意の物質を意味する。
検出可能な標識： 本明細書で用いられる場合、「検出可能な標識」とは、ラジオグラフィー、蛍光、化学発光、酵素活性、吸光度などをはじめとする当技術分野で公知の方法により容易に検出される他の要素に、装着、組込み、または会合が行われた、１つ以上のマーカー、シグナル、または部分を意味する。検出可能な標識としては、放射性同位体、発蛍光団、発色団、酵素、染料、金属イオン、リガンド（たとえば、ビオチン、アビジン、ストレパビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）、およびハプテン）、量子ドットなどが挙げられる。検出可能な標識は、本明細書に開示されるペプチド中またはタンパク質中の任意の位置に配置されうる。それらは、アミノ酸中、ペプチド中、もしくはタンパク質中でありうるか、またはＮ末端もしくはＣ末端で配置されうる。
遠位： 本明細書で用いられる場合、「遠位」とは、対象の対称中心塊もしくは対称中心線または基準点から離れていることを意味する。肢の場合、それは、胴体から離れている。
投与レジメン： 本明細書で用いられる場合、「投与レジメン」とは、投与のスケジュール、または医師が決定した治療、予防、もしくは緩和ケアのレジメンのことである。
用量分割因子（ＤＳＦ）－ 用量分割治療のＰＵＤを、全一日用量または単回単位用量のＰＵＤで割った比。この値は、投与レジメン群の比較から導出される。
発現： 本明細書で用いられる場合、核酸配列の「発現」とは、次のイベント、すなわち、（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の産生（たとえば、転写による）、（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（たとえば、スプライシング、エディティング、５’キャップ形成、および／または３’末端プロセシングによる）、（３）ポリペプチドまたはタンパク質へのＲＮＡの翻訳、ならびに（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾の１つ以上を意味する。
製剤： 本明細書で用いられる場合、「製剤」は、少なくとも修飾核酸分子および送達剤を含む。
機能性： 本明細書で用いられる場合、「機能性」生物学的分子とは、特徴付けられる性質および／または活性を呈する形態の生物学的分子のことである。
相同性： 本明細書で用いられる場合、「相同性」という用語は、高分子間、たとえば、核酸分子（たとえば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を意味する。いくつかの実施形態では、高分子は、それらの配列が少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性であれば、互いに「相同である」と考えられる。いくつかの実施形態では、高分子は、それらの配列が少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の類似性であれば、互いに「相同である」と考えられる。「相同」という用語は、必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列）間の比較を意味する。
本発明によれば、２つのポリヌクレオチド配列は、それらがコードするポリペプチドが、少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも１つの伸長に対して、少なくとも約５０％の同一性、少なくとも約６０％の同一性、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、または少なくとも約９０％の同一性であれば、相同であると考えられる。
いくつかの実施形態では、相同ポリヌクレオチド配列は、ユニークに特定された少なくとも４～５アミノ酸の伸長をコードする能力により特徴付けられる。６０ヌクレオチド長未満のポリヌクレオチド配列では、相同性は、ユニークに特定された少なくとも４～５アミノ酸の伸長をコードする能力により決定される。本発明によれば、２つのタンパク質配列は、タンパク質が、少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも１つの伸長に対して、少なくとも約５０％の同一性、少なくとも約６０％の同一性、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、または少なくとも約９０％の同一性であれば、相同であると考えられる。
同一性： 本明細書で用いられる場合、「同一性」という用語は、高分子間、たとえば、オリゴヌクレオチド分子（たとえば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を意味する。たとえば、２つのポリヌクレオチド配列の同一性パーセントの計算は、最適比較目的で２つの配列をアライメントすることにより、行うことが可能である（たとえば、最適アライメントになるように第１および第２の核酸配列の一方または両方にギャップを導入することが可能であり、比較目的では異なる配列を無視することが可能である）。特定の実施形態では、比較目的でアライメントされる配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。次いで、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドを比較する。第１の配列の位置が第２の配列の対応する位置と同一のヌクレオチドにより占有される場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列が最適アライメントになるように導入する必要のあるギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、配列により共有される同一位置の数の関数である。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成可能である。たとえば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、レスク，Ａ．Ｍ．（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．）編、オックスフォード大学出版局（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９８８年、バイオコンピューティング：インフォマティクスおよびゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）、スミス，Ｄ．Ｗ．（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９３年、分子生物学における配列解析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、フォンヘインジ，Ｇ．（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．）、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年、配列データのコンピュータ解析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ）、第Ｉ部、グリフィン，Ａ．Ｍ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．）およびグリフィン，Ｈ．Ｇ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．）編、ヒューマナプレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージ、１９９４年、ならびに配列解析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ）、グリブスコフ，Ｍ．（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．）およびデベロー，Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）編、Ｍストックトンプレス（Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９１年、（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるような方法を用いて決定可能である。たとえば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているマイヤー（Ｍｅｙｅｒｓ）およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）のアルゴリズム（生物科学におけるコンピュータ利用（ＣＡＢＩＯＳ）、１９８９年、第４巻、ｐ．１１～１７）により、決定可能である。２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、他の選択肢として、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムにより、決定可能である。配列間の同一性パーセントを決定するのに一般に利用される方法は、カリロ，Ｈ．（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．）およびリップマン，Ｄ．（Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．）著、ＳＩＡＭ応用数学誌（ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．）、第４８巻、ｐ．１０７３、１９８８年（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるものを含むが、これに限定されるものではない。同一性を決定するための技術は、公的に入手可能なコンピュータープログラムの形態で体系化されている。２つの配列間の相同性を決定する例示的なコンピュータソフトウェアは、ＧＣＧプログラムパッケージ（デベルー，Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）ら著、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第１２巻、第１号、ｐ．３８７、１９８４年）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（アッチュル，Ｓ．Ｆ．（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）ら著、分子生物学誌（Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．）、第２１５巻、ｐ．４０３、１９９０年）を含むが、これらに限定されるものではない。
遺伝子発現の阻害： 本明細書で用いられる場合、「遺伝子発現の阻害」という表現は、遺伝子の発現産物の量の低減を引き起こすことを意味する。発現産物は、遺伝子から転写されるＲＮＡ（たとえば、ｍＲＮＡ）または遺伝子から転写されるｍＲＮＡから翻訳されるポリペプチドでありうる。典型的には、ｍＲＮＡのレベルの低減は、それから翻訳されるポリペプチドのレベルの低減をもたらす。発現のレベルは、ｍＲＮＡまたはタンパク質を測定するための標準的技術を用いて決定可能である。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ： 本明細書で用いられる場合、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」という用語は、生物（たとえば、動物、植物、または微生物）内ではなく、人工環境下、たとえば、試験管または反応容器、細胞培養物、ペトリ皿などで起こるイベントを意味する。
ｉｎ ｖｉｖｏ： 本明細書で用いられる場合、「ｉｎ ｖｉｖｏ」という用語は、生物（たとえば、動物、植物、もしくは微生物、またはそれらの細胞）内に起こるイベントを意味する。
単離： 本明細書で用いられる場合、「単離された」という用語は、一体化された成分（自然環境または実験現場のいずれであるかにかかわらず）の少なくとも一部から分離された物質または要素を意味する。単離された物質は、一体化されていた物質に対してさまざまなレベルの純度を有しうる。単離された物質および／または要素は、それが最初に会合していた他の成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはより多くから分離されうる。いくつかの実施形態では、単離された作用剤は、約８０％超、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または、約９９％超の純度である。本明細書で用いられる場合、物質は、それが他の成分を実質的に含まないのであれば、「純粋」である。
実質的に単離された： 「実質的に単離された」とは、生成または検出された環境から化合物が実質的に分離されていることを意味する。部分的な分離は、たとえば、本開示に係る化合物が富化された組成物を含みうる。実質的な分離は、重量基準で、本開示に係る化合物またはその塩の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％を含有する組成物を含みうる。化合物およびその塩を単離する方法は、当技術分野で慣用されているものである。
修飾： 本明細書で用いられる場合、「修飾」とは、本発明に係る分子の変化した状態または構造を意味する。分子は、化学的、構造的、および機能的なものを含めて、多くの方法で修飾されうる。一実施形態では、本発明に係るｍＲＮＡ分子は、非天然のヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドの導入により修飾される。また、修飾ｍＲＮＡに関して、修飾とは、野生型とは異なる任意の変化を意味しうる。
天然に存在する： 本明細書で用いられる場合、「天然に存在する」とは、人為的な支援を受けることなく天然に存在することを意味する。
患者： 本明細書で用いられる場合、「患者」とは、治療を求めているもしくはそれが必要な状態にあると思われる、治療を必要とする、治療を受けている、または治療を受けるであろう対象、あるいは特定の疾患もしくは病態に対して訓練された専門家によるケアを受けている対象を意味する。
ペプチド： 本明細書で用いられる場合、「ペプチド」は、５０アミノ酸長以下、たとえば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長である。
プロドラッグ： 本開示はまた、本明細書に記載の化合物のプロドラッグを包含する。本明細書で用いられる場合、「プロドラッグ」とは、物質、分子、または要素が化学的または物理的な変化を受けたときに治療剤として作用するとみなされる形態をとる任意の物質、分子、または要素を意味する。プロドラッグは、共有結合されていても、なんらかの方法で捕獲されていてもよく、哺乳動物対象への投与前、投与時、または投与後、活性薬剤部分を放出するかまたはその形に変換される。プロドラッグは、慣例的な操作によりまたはｉｎ ｖｉｖｏで修飾が切断されて親化合物になるような方法で、化合物中に存在する官能基を修飾することにより、調製可能である。プロドラッグは、ヒドロキシル基、アミノ基、スルフヒドリル基、またはカルボキシル基が、哺乳動物対象に投与された時にそれぞれ遊離のヒドロキシル基、アミノ基、スルフヒドリル基、またはカルボキシル基を生成するように切断される任意の基に結合されている化合物を含む。プロドラッグの調製および使用は、Ｔ．ヒグチ（Ｔ．Ｈｉｇｕｃｈｉ）およびＶ．ステラ（Ｖ．Ｓｔｅｌｌａ）著、「新規な送達系としてのプロドラッグ（Ｐｒｏ－ｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、Ａ．Ｃ．Ｓ．シンポジウムシリーズ（Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ）の第１４巻、ならびに薬剤設計における生体可逆性担体（Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ）、エドワードＢ．ロッシュ（Ｅｄｗａｒｄ Ｂ．Ｒｏｃｈｅ）編、米国薬剤師協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）およびパーガモンプレス（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年（両方ともその全体が参照により本明細書に組み込まれる）で考察されている。
増殖： 本明細書で用いられる場合、「増殖」という用語は、成長、拡張、もしくは増大すること、または迅速に成長、拡張、もしくは増大を引き起こすことを意味する。「増殖」は、増殖する能力を有することを意味する。「抗増殖」とは、増殖性に対抗するまたは不適である性質を有することを意味する。
薬学的に許容可能： 「薬学的に許容可能」という表現は、本明細書では、妥当な便益／リスク比に見合って、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、もしくは他の問題、または合併症を伴うことなく、健全な医学的判断の範囲内で、ヒトおよび動物の組織に接触させて使用するのに好適な化合物、材料、組成物、および／または製剤を意味する。
薬学的に許容可能な塩： 本開示はまた、本明細書に記載の化合物の薬学的に許容可能な塩を包含する。本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容可能な塩」とは、既存の酸部分または塩基部分をその塩形に変換することにより親化合物が修飾されている開示化合物の誘導体を意味する。薬学的に許容可能な塩の例としては、アミンなどの塩基残基の鉱酸塩または有機酸塩、カルボン酸などの酸残基のアルカリ塩または有機塩などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本開示に係る薬学的に許容可能な塩は、親化合物の従来型の非毒性塩、たとえば、非毒性の無機酸または有機酸から生成されたものを含む。本開示に係る薬学的に許容可能な塩は、塩基部分または酸部分を含有する親化合物から従来の化学的方法により合成可能である。一般的には、そのような塩は、水中もしくは有機溶媒中または両者の混合物中で、これらの化合物の遊離の酸形または塩基形と化学量論量の適切な塩基または酸とを反応させることにより、調製可能である。一般的には、エーテル、エチルアセテート、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。好適な塩の一覧は、レミングトンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第１７巻、マック・パブリッシング・カンピニー（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ペンシルバニア州イーストン、１９８５年、ｐ．１４１８、および薬学誌（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第６６巻、２頁（１９７７年）（それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見いだされる。
ポリペプチド： 本明細書で用いられる場合、「ポリペプチド」とは、ペプチド結合により結合一体化されたアミノ酸残基のポリマーを意味する。この用語は、本明細書で用いられる場合、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを意味する。しかしながら、典型的には、ポリペプチドは、少なくとも５０アミノ酸長であろう。いくつかの場合には、コードされたポリペプチドは、約５０アミノ酸未満であり、このポリペプチドは、ペプチドと称される。ポリペプチドがペプチドであるならば、それは、少なくとも約５アミノ酸残基長であろう。したがって、ポリペプチドは、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、同族体、オルソログ、パラログ、断片、ならびに以上の他の等価体、変異体、および類似体を含む。ポリペプチドは、単一分子であってもよいし、二量体、三量体、四量体などの多分子複合体であってもよい。ポリペプチドという用語はまた、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用されうる。
単位薬剤あたりのポリペプチド（ＰＵＤ）： 本明細書で用いられる場合、ＰＵＤまたは単位薬剤あたりの産物とは、全一日用量の細分割部分として定義され、通常、体液中または組織中で測定される産物（たとえばポリペプチド）１ｍｇ、１ｐｇ、１ｋｇなど（通常、ｐｍｏｌ／ｍＬ、ｍｍｏｌ／ｍＬなどの濃度で定義される）を体液中の基準量で割り算したものである。
近位： 本明細書で用いられる場合、「近位」とは、対象の対称中心塊もしくは対称中心線または基準点により近いことを意味する。肢の場合、それは、胴体により近い。
サンプル： 本明細書で用いられる場合、「サンプル」という用語は、その組織、細胞、または構成部分の一部を意味する（たとえば、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液もしくは射精前液、汗、糞便、毛髪、涙、嚢胞液、胸水および腹水、心嚢液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、水様便、膵液、洞腔洗浄液、気管支肺吸引物、胞胚腔液、および臍帯血をはじめとする体液であるが、これらに限定されるものではない）。サンプルはさらに、全生物体、またはその組織、細胞、もしくは構成部分の一部、またはそれらの画分もしくは一部分、たとえば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚の外側部分、呼吸管、腸管、または泌尿生殖管、涙、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、器官から調製されるホモジネート、溶解物、または抽出物を含みうるが、これらに限定されるものではない。サンプルはさらに、タンパク質分子や核酸分子などの細胞成分を含有している可能性がある媒体、たとえば、栄養ブロスまたはゲルを意味する。
類似性： 本明細書で用いられる場合、「類似性」という用語は、高分子間、たとえば、ポリヌクレオチド分子（たとえば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を意味する。互いの高分子の類似性パーセントの計算は、当技術分野で理解されている保存的置換を考慮して類似性パーセントを計算すること以外は、同一性パーセントの計算と同一の方式で実施可能である。
安定： 本明細書で用いられる場合、「安定」とは、反応混合物から有用な純度への単離に耐えるのに十分なロバスト性のある、好ましくは、有効な治療剤への製剤化が可能である化合物を意味する。
対象： 本明細書で用いられる場合、「対象」または「患者」という用語は、たとえば、実験、診断、予防、および／または治療の目的で、本発明に係る組成物が投与されうる任意の生物を意味する。典型的な対象は、動物（たとえば、哺乳動物、たとえば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長動物、およびヒト）および／または植物を含む。
実質的： 本明細書で用いられる場合、「実質的」という用語は、目的の特徴または性質の全体またはほぼ全体の範囲または度合いを呈する定性的条件を意味する。生物学技術分野の当業者であれば、生物学的および化学的な現象が、最終状態に達することおよび／または完全に進行することまたは絶対的結果を達成もしくは回避することは、あってもまれであること理解されよう。したがって、「実質的」という用語は、多くの生物学的および化学的な現象に固有の完全性の欠如の可能性を取り込むべく、本明細書で用いられる。
実質的に等しい： 用量間の時間差に関して本明細書で用いられる場合、この用語は、±２％を意味する。
実質的に同時： 複数の用量に関して本明細書で用いられる場合、この用語は、２秒以内を意味する。
同時： 本明細書で用いられる場合、「同時」とは、科学的に再現可能な範囲内で同時であること意味する。
罹患： 疾患、障害、および／または病態に「罹患」している個体は、疾患、障害、および／または病態の１つ以上の症状で診断されてきたか、またはその症状を呈する。
易罹患性： 疾患、障害、および／または病態に「罹患しやすい」個体は、疾患、障害、および／または病態の症状で診断されていないか、かつ／またはその症状を呈していなくてもよいが、疾患またはその症状を発症する傾向を有する。いくつかの実施形態では、疾患、障害、および／または病態（たとえば癌）に罹患しやすい個体は、次のもの、すなわち、（１）疾患、障害、および／または病態の発生に関連付けられる遺伝子突然変異、（２）疾患、障害、および／または病態の発生に関連付けられる遺伝子多型、（３）疾患、障害、および／または病態に関連付けられるタンパク質および／または核酸の発現および／または活性の増大および／または低減、（４）疾患、障害、および／または病態の発生に関連付けられる習性および／または生活習慣、（５）疾患、障害、および／または病態の家族歴、ならびに（６）疾患、障害、および／または病態の発生に関連付けられる微生物への暴露および／またはその感染の１つ以上により特徴付け可能である。いくつかの実施形態では、疾患、障害、および／または病態に罹患しやすい個体は、疾患、障害、および／または病態を発生するであろう。疾患、障害、および／または病態に罹患しやすい個体は、疾患、障害、および／または病態を発生しないであろう。
合成： 「合成」という用語は、ヒトの手により産生、調製、および／または製造されることを意味する。本発明に係るポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは他の分子の合成は、化学的もしくは酵素的でありうる。
単回単位用量： 本明細書で用いられる場合、「単回単位用量」とは、１回で／一時点／一経路／一接触点で、すなわち単回投与イベントで、投与される任意の治療剤の用量のことである。
全一日用量： 本明細書で用いられる場合、「全一日用量」とは、２４時間以内で投与または処方される量のことである。それは、単回単位用量として投与されうる。
分割用量： 本明細書で用いられる場合、「分割用量」とは、単回単位用量または全一日用量を２つ以上に分割した用量のことである。
標的細胞： 本明細書で用いられる場合、「標的細胞」とは、任意の１つ以上の目的の細胞を意味する。細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ、または生物の組織もしくは器官で見いだされうる。生物は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト、最も好ましくは患者でありうる。
治療剤： 「治療剤」という用語は、対象に投与した時、治療効果、診断効果、および／もしくは予防効果を有する、ならびに／または所望の生物学的効果および／もしくは薬理学的効果を誘発する、任意の作用剤を意味する。
治療上有効量： 本明細書で用いられる場合、「治療上有効量」という用語は、疾患、障害、および／または病態に罹患しているまたは罹患しやすい対象に投与した時、疾患、障害、および／または病態を治療、その症状を改善、その発生を診断、予防、および／または遅延するのに十分な送達作用剤（たとえば、核酸、薬剤、治療剤、診断剤、予防剤など）の量を意味する。
転写因子： 本明細書で用いられる場合、「転写因子」という用語は、たとえば、転写の活性化または抑圧により、ＤＮＡからＲＮＡへの転写を調節するＤＮＡ結合タンパク質を意味する。いくつかの転写因子は、転写のみの調節を行うが、他のものは、他のタンパク質と協奏的に作用する。いくつかの転写因子は、特定の条件下で転写の活性化および抑制の両方を行うことが可能である。一般的には、転写因子は、標的遺伝子の調節領域の特定のコンセンサス配列にきわめて類似した１つもしくは複数の特異的標的配列に結合する。転写因子は、標的遺伝子の転写を単独でまたは他の分子との複合体で調節しうる。
治療： 本明細書で用いられる場合、「治療」という用語、特定の疾患、障害、および／または病態の発生を部分的にまたは完全に緩和、寛解、改善、軽減、遅延すること、その進行を阻害すること、その重症度を低減すること、および／またはその１つ以上の症状もしくは特徴を低減することを意味する。たとえば、癌を「治療」することは、腫瘍の生存、増殖、および／または拡がりを阻害することを意味しうる。治療は、疾患、障害、および／もしくは病態の徴候を呈しない対象に、ならびに／または疾患、障害、および／もしくは病態に関連付けられる病変を発生するリスクを低減する目的で、疾患、障害、および／もしくは病態の早期徴候を呈する対象に、施すことが可能である。
非修飾： 本明細書で用いられる場合、「非修飾」とは、なんらかの方法で変化させる前の任意の物質、化合物、または分子を意味する。非修飾とは、生体分子の野生型または未改変型を意味するが、常にそうであるとは限らない。分子は、一連の修飾を受けうるが、それにより、各修飾分子は、それに続く修飾のための「非修飾」出発分子として役立ちうる。
等価形態および範囲
当業者であれば、通常の実験の域を出ることなく、本明細書に記載の本発明に係る特定の実施形態に対する多くの等価形態がわかるであろう。またはそれらを確認することができるであろう。本発明の範囲は、以上の説明に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲に明記されるとおりである
特許請求の範囲では、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの冠詞は、相反する指示がないかぎりまたはとくに文脈から自明でないかぎり、１つ以上を意味しうる。グループの１つ以上のメンバー間に「ｏｒ（または）」を含む特許請求の範囲または説明は、相反する指示がないかぎりまたはとくに文脈から自明でないかぎりに、グループメンバーの１つ、２つ以上、またはすべてが、所与のプロダクトまたはプロセスに存在するか、そこで利用されるか、またはそれ以外の形でそれに適合する場合、満たされると考えられる。本発明は、厳密にグループの１つのメンバーが、所与のプロダクトまたはプロセスに存在するか、そこで利用されるか、またはそれ以外の形でそれに適合する、実施形態を含む。本発明は、グループメンバーの２つ以上またはすべてが、所与のプロダクトまたはプロセスに存在するか、そこで利用されるか、またはそれ以外の形でそれに適合する、実施形態を含む。
また、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（～を含む）」という用語は、オープンであるとみなされ、かつ追加の要素または工程の組込みを許容するとみなされることに留意されたい。
範囲が与えられた場合、端点が含まれる。さらに、とくに指定がないかぎりまたはとくに文脈および当業者の理解から自明でないかぎり、範囲として表現された値は、文脈上明らかに異なる場合を除いて、範囲の下限の１／１０単位まで、本発明のさまざまな実施形態で指定の範囲内の任意の特定の値または部分範囲を仮定しうるとみなされるものとする。
それに加えて、先行技術に包含される本発明の特定の実施形態はいずれも、請求項の任意の１項以上から明示的に除外されうるとみなされるものとする。そのような実施形態は、当業者に公知であるとみなされるので、たとえ本明細書で明示的に除外が明記されていないとしても、それらは除外しうる。本発明に係る組成物の特定の実施形態（たとえば、任意の核酸、それによりコードされたタンパク質、任意の製造方法、任意の使用方法など）はいずれも、先行技術の存在の有無にかかわらず、任意の理由で、いずれか１項以上の請求項から除外しうる。
とくに文脈上明確に示されてないかぎり、本明細書および特許請求の範囲で用いられる場合、単数形は、複数形表現を含み、その逆も同様である。操作例以外の場合またはとくに示されていない場合、本明細書で用いられる成分量または反応条件を表す数はすべて、いずれの場合も、「約」という用語で修飾されているとみなされるものとする。
特許、遺伝子識別番号により特定されるオリゴヌクレオチド配列、および本明細書で特定される他の出版物はすべて、本発明に関連して使用しうるそのような出版物に記載の方法などを記載および開示することを目的として、参照により明示的に組み込まれる。これらの出版物は、単に本出願の出願日前に開示されたものとして提供されているにすぎない。これに関連する記載内容は、先行発明に基づいてまたは任意の他の理由でそのような開示に先行する権利が本発明者らに与えられないことを容認するものとみなされるべきものではない。日付けに関する記述またはこれらの文献の内容に関する表現はすべて、本出願人らが利用可能な情報に基づいており、日付けの正確さまたはこれらの文献の内容に関してはなんら容認するものではない。
引用された出典、たとえば、本明細書に引用された参考文献、出版物、データベース、データベース項目、および技術はすべて、たとえ引用の中にはっきりと明記されていないとしても、参照により本出願に組み込まれる。引用された出典の記載内容と本出願の記載内容とが矛盾する場合、本出願の記載内容が優先するものとする。
（実施例）
実施例１．修飾ｍＲＮＡの産生
本発明に係る修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）は、標準的な実験室法および材料を用いてを作製されうる。目的の遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、強力なコザック翻訳開始シグナルを含有する５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、および／または、ポリＡテールの鋳型付加のためのオリゴ（ｄＴ）配列を含みうるα－グロビン３’ＵＴＲ、によりフランキングされうる。修飾ｍＲＮＡは、細胞先天性免疫反応を低減するように修飾されうる。細胞性応答を低減する修飾は、プソイドウリジン（ψ）および５－メチル－シチジン（５ｍｅＣまたはｍ５Ｃ）を含みうる。（カリコ，Ｋ（Ｋａｒｉｋｏ，Ｋ）ら著、免疫（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）、第２３巻、１６５～７５頁、２００５年、カリコ，Ｋ（Ｋａｒｉｋｏ，Ｋ）ら著、分子療法（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ）、第１６巻、１８３３～４０頁、２００８年、アンダーソン，ＢＲ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＢＲ）ら著、核酸研究（ＮＡＲ）（２０１０年）（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
ＯＲＦはまた、種々の上流側または下流の付加（たとえば、限定されるものではないが、β－グロビン、タグなど）を含んでいてもよく、限定されるものではないが、ＤＮＡ２．０（カリフォルニア州メンロパーク（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ））などの最適化サービスから注文してもよく、また、Ｘｂａｌ認識を有しうる複数のクローニング部位を含有してもよい。構築物を受け取った後、それを化学的コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に再構成してトランスフォームさせうる。
本発明では、ＮＥＢ ＤＨ５－αコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が使用される。トランスフォーメーションは、１００ｎｇのプラスミドを用いてＮＥＢ社説明書に従って行われる。プロトコルは次のとおりである。
１．ＮＥＢ５－αコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のチューブを氷上で１０分間解凍する。
２．１ｐｇ～１００ｎｇのプラスミドＤＮＡを含有する１～５μｌを細胞混合物に添加する。注意深くチューブを４～５回軽く叩いて細胞とＤＮＡとを混合する。ボルテックスしない。
３．混合物を氷上に３０分間配置する。混合しない。
４．４２℃で正確に３０秒間ヒートショックを与える。混合しない。
５．氷上に５分間配置する。混合しない。
６．９５０μｌの室温ＳＯＣを混合物中にピペット添加する。
７．３７℃で６０分間配置する。激しく（２５０ｒｐｍ）振盪するかまたは回転させる。
８．選択プレートを３７℃に加温する。
９．チューブを軽く叩いたり逆さにしたりすることにより細胞を十分に混合する。
１０．５０～１００μｌの各希釈液を選択プレート上に展延し、３７℃で一晩インキュベートする。他の選択肢として、３０℃で２４～３６時間または２５℃で４８時間インキュベートする。
次いで、単一のコロニーを用いて、適切な抗生物質を用いた５ｍｌのＬＢ増殖培地に接種し、次いで、５時間増殖させた（２５０ＲＰＭ、３７℃）。次いで、これを用いて、２００ｍｌ培養培地に接種し、同一条件下で一晩増殖させた。
プラスミド（８５０μｇまで）を単離するために、製造業者の説明書に従って、インビトロジェン・ピュアリンクＴＭ・ハイピュア・マキシプレップキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＰＵＲＥＬＩＮＫＴＭ ＨｉＰｕｒｅ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ）（カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を用いて、マキシプレップ（ｍａｘｉ ｐｒｅｐ）を行う。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）用のｃＤＮＡを産生するために、最初に、Ｘｂａｌなどの制限酵素を用いてプラスミド（その例は図２に示される）を線状化する。Ｘｂａｌによる典型的な制限消化は、次のものを含むであろう。すなわち、プラスミド１．０μｇ；１０×緩衝液１．０μｌ；Ｘｂａｌ １．５μｌ；ｄＨ２Ｏ 全量１０μｌ；３７℃で１時間インキュベート。実験室スケール（＜５μｇ）で行う場合、製造業者の使用説明書に従って、インビトロジェン・ピュアリンクＴＭ ＰＣＲマイクロキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ’ｓ ＰＵＲＥＬＩＮＫＴＭ ＰＣＲ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ）（カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を用いて、反応系を精製する。より大スケールの精製は、インビトロジェン・スタンダード・ピュアリンクＴＭ・ＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ’ｓ ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＵＲＥＬＩＮＫＴＭ ＰＣＲ Ｋｉｔ）（カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））などのより大きい負荷容量を有する製品を用いて行う必要があろう。精製後、ナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を用いて線形化ベクターを定量し、そしてアガロースゲル電気泳動を用いて分析して線状化を確認する。
たとえば、Ｇ－ＣＳＦは、目的のポリペプチドに対応しうるが、これに限定されるものではない。実施例１～５に概説される工程で使用される配列は、テーブル２に示される。開始コドン（ＡＴＧ）は、テーブル２の各配列中で下線が付されていることに留意されたい。


実施例２：ｃＤＮＡ産生のためのＰＣＲ
ｃＤＮＡ調製のためのＰＣＲ手順は、カパ・バイオシステムズ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（マサチューセッツ州ウォバーン（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ））製の２×カパＨＩＦＩＴＭホットスタート・レディーミックス（ＫＡＰＡ ＨＩＦＩＴＭ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ）を用いて行われる。このシステムは、２×カパ・レディーミックス（ＫＡＰＡ ＲｅａｄｙＭｉｘ）１２．５μｌ；フォワードプライマー（１０μＭ）０．７５μｌ；リバースプライマー（１０μＭ）０．７５μｌ；鋳型ｃＤＮＡ １００ｎｇ；およびｄＨ２Ｏ（２５．０μｌに希釈）、を含む。反応条件は、９５℃で５分間；および、９８℃で２０秒間、次いで５８℃で１５秒間、次いで７２℃で４５秒間、次いで７２℃で５分間の２５サイクル；次いで４℃で終了、である。
本発明に係るリバースプライマーは、ｍＲＮＡ中にポリ－Ａ１２０のためのポリ－Ｔ１２０が組み込まれている。より長いまたはより短いポリ（Ｔ）系を有する他のリバースプライマーを用いて、ｍＲＮＡ中のポリ（Ａ）テールの長さを調整することが可能である。
製造業者の使用説明書に従って、インビトロジェン・ピュアリンクＴＭ ＰＣＲマイクロキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ’ｓ ＰＵＲＥＬＩＮＫＴＭ ＰＣＲ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ）（カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を用いて、反応系を精製する（５μｇまで）。より大量の反応は、より大きい容量を有する製品を用いた精製を必要とするであろう。精製後、ナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を用いてｃＤＮＡを定量し、そしてアガロースゲル電気泳動により分析してｃＤＮＡが予想サイズであることを確認する。次いで、ｃＤＮＡを配列分析に付し、その後、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応に進む。
実施例３．ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応は、修飾ヌクレオチドまたは修飾ＲＮＡを含有するｍＲＮＡを産生する。供給ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）混合物は、天然および非天然ＮＴＰを用い作製される。
典型的なｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応は、次のものを含む。
１．鋳型ｃＤＮＡ １．０μｇ
２．１０×転写緩衝液（４００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１９０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭスペルミジン） ２．０μｌ
３．カスタムＮＴＰ（各２５ｍＭ） ７．２μｌ
４．ＲＮアーゼ阻害剤 ２０Ｕ
５．Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ ３０００Ｕ
６．ｄＨ２Ｏ ２０．０μｌまで および
７．３７℃で３時間～５時間のインキュベーション。
未精製のＩＶＴ混合物は、翌日の精製のために４℃で一晩貯蔵可能である。次いで、１ＵのＲＮアーゼフリーＤＮアーゼを用いて元の鋳型を消化する。３７℃で１５分間インキュベートした後、製造業者の説明書に従って、アンビオン・メガクリアーＴＭ・キット（Ａｍｂｉｏｎ’ｓ ＭＥＧＡＣＬＥＡＲＴＭ Ｋｉｔ）（テキサス州オースティン（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ））を用いて、ｍＲＮＡを精製する。このキットは、５００μｇまでのＲＮＡを精製可能である。精製後、ナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を用いてＲＮＡを定量し、そしてアガロースゲル電気泳動により分析してＲＮＡが適正なサイズであることおよびＲＮＡの分解が起こらなかったことを確認する。
実施例４．ｍＲＮＡの酵素キャッピング
ｍＲＮＡのキャッピングは、次のように行われる。この場合、混合物は、６０μｇ～１８０μｇのＩＶＴ ＲＮＡ、およびｄＨ２Ｏ（７２μｌまで）を含む。混合物を６５℃で５分間インキュベートしてＲＮＡを変性させ、次いで、直ちに氷に移す。
次いで、プロトコルは、１０×キャッピング緩衝液（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭ ＫＣｌ、１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）（１０．０μｌ）２０ｍＭ
ＧＴＰ（５．０μｌ）、２０ｍＭ Ｓ－アデノシルメチオニン（２．５μｌ）、ＲＮアーゼ阻害剤（１００Ｕ）、２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（４００Ｕ）、ワクシニアキャッピング酵素（グアニリルトランスフェラーゼ）（４０Ｕ）、ｄＨ２Ｏ（２８μｌまで）の混合、および６０μｇ ＲＮＡに対して３７℃で３０分間または１８０μｇ ＲＮＡに対して２時間までのインキュベーションを含む。
次いで、製造業者の説明書に従って、アンビオン・メガクリアーＴＭ・キット（Ａｍｂｉｏｎ’ｓ ＭＥＧＡＣＬＥＡＲＴＭ Ｋｉｔ）（テキサス州オースティン（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ））を用いて、ｍＲＮＡを精製する。精製後、ナノドロップＴＭ（ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ）（サーモ・フィッシャー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、マサチューセッツ州ウォルサム（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））を用いてＲＮＡを定量し、そしてアガロースゲル電気泳動により分析してＲＮＡが適正なサイズであることおよびＲＮＡの分解が起こらなかったことを確認する。ＲＮＡ産物はまた、逆転写ＰＣＲを行って配列決定のためのｃＤＮＡを産生することにより、配列決定することも可能である。
実施例５．ポリＡテーリング反応
ｃＤＮＡ中にポリＴがない場合、最終生成物の精製前にポリＡテーリング反応を行われなければならい。これは、キャップ化ＩＶＴ ＲＮＡ（１００μｌ）、ＲＮアーゼ阻害剤（２０Ｕ）、１０×テーリング緩衝液（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２）（１２．０μｌ）、２０ｍＭのＡＴＰ（６．０μｌ）、ポリＡポリメラーゼ（２０Ｕ）、ｄＨ２Ｏ（１２３．５μｌまで）の混合、および３７℃で３０分間のインキュベーションにより行われる。ポリＡテールがすでに転写物中に存在する場合、テーリング反応をスキップして、アンビオン・メガクリアーＴＭ・キット（Ａｍｂｉｏｎ’ｓ ＭＥＧＡＣＬＥＡＲＴＭ Ｋｉｔ）（テキサス州オースティン（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ））（５００までμｇ）を用いて直ちに精製に移ることが可能である。ポリＡポリメラーゼは、好ましくは、酵母中で発現される組換え酵素である。
実施された本明細書に記載の研究では、ポリＡテールは、１６０ヌクレオチド長を含むようにＩＶＴ鋳型中にコードされる。しかしながら、ポリＡテーリング反応のプロセシング性または完全性は、常に正確に１６０ヌクレオチドをもたらすとは限らないことを理解されたい。そのため、約１６０ヌクレオチドのポリＡテールの、たとえば、約１５０～１６５、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、または１６５は、本発明の範囲内である。
実施例６．リピドイドを使用した修飾ｍＲＮＡの製剤
製造業者のプロトコルに従って、次の化学ＲＮＡキャップアナログ、すなわち、３’－ＯＭｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ［（ＡＲＣＡ）キャップ］、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ニューイングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）（イプスウィッチ（Ｉｐｓｗｉｃｈ），ＭＡ））を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応と同時に、修飾ＲＮＡの５’キャッピングを行って、５’グアノシンキャップ構造を生成することが可能である。ワクシニアウイルスキャッピング酵素を用いて、修飾ＲＮＡの５’キャッピングを転写後に終了させ、「Ｃａｐ０」構造：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ニューイングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）（イプスウィッチ（Ｉｐｓｗｉｃｈ），ＭＡ））を生成することが可能である。ワクシニアウイルスキャッピング酵素および２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼの両方を用いて、Ｃａｐ１構造を生成することが可能である。ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ－２’－Ｏ－メチル。Ｃａｐ１に続いて、２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼを用いて、５’末端から三番目のヌクレオチドを２’－Ｏ－メチル化することにより、Ｃａｐ２構造を生成することが可能である。Ｃａｐ２に続いて、２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼを用いて、５’末端から四番目のヌクレオチドを２’－Ｏ－メチル化することにより、Ｃａｐ３構造を生成することが可能である。酵素は、好ましくは、組換え起源に由来する。
哺乳動物細胞中にトランスフェクトした場合、修飾ｍＲＮＡは、１２～１８時間または１８時間超、たとえば、２４、３６、４８、６０、７２時間、または７２時間超の安定性を有する。
実施例７．キャッピング
Ａ．タンパク質発現アッセイ
ＡＲＣＡ（３’－ＯＭｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ）キャップアナログまたはＣａｐ１構造を含有するヒトＧ－ＣＳＦ（配列番号１に示されるｃＤＮＡ）をコードする合成ｍＲＮＡは、等しい濃度でヒト初代角化細胞中にトランスフェクト可能である。トランスフェクションの６、１２、２４、および３６時間後、培養培地中に分泌されたＧ－ＣＳＦの量は、ＥＬＩＳＡによりアッセイすることが可能である。より高レベルのＧ－ＣＳＦを培地中に分泌する合成ｍＲＮＡは、より高い翻訳能を有するキャップ構造を用いた合成ｍＲＮＡに対応するであろう。
Ｂ．純度分析合成
ＡＲＣＡキャップアナログまたはＣａｐ１構造粗合成生成物を含有するヒトＧ－ＣＳＦ（配列番号１に示されるｃＤＮＡ）をコードするｍＲＮＡは、変性アガロース尿素ゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析を用いて純度の比較が可能である。電気泳動による単一統合バンドを有する合成ｍＲＮＡは、複数バンドまたは縞状バンドを有する合成ｍＲＮＡと比較してより高純度の生成物に対応する。単一ＨＰＬＣピークを有する合成ｍＲＮＡもまた、より高純度の生成物に対応するであろう。より高効率を有するキャッピング反応は、より高純度のｍＲＮＡ集団を提供するであろう。
Ｃ．サイトカイン分析
ＡＲＣＡキャップアナログまたはＣａｐ１構造を含有するヒトＧ－ＣＳＦ（配列番号１に示されるｃＤＮＡ）をコードする合成ｍＲＮＡは、複数の濃度でヒト初代角化細胞中にトランスフェクトすることが可能である。トランスフェクションの６、１２、２４、および３６時間後、培養培地中に分泌されたＴＮＦαやＩＦＮβなどの炎症誘発性サイトカインの量は、ＥＬＩＳＡによりアッセイすることが可能である。より高レベルの炎症誘発性サイトカインを培地中に分泌する合成ｍＲＮＡは、免疫活性化キャップ構造を含有する合成ｍＲＮＡに対応するであろう。
Ｄ．キャッピング反応効率
ＡＲＣＡキャップアナログまたはＣａｐ１構造を含有するヒトＧ－ＣＳＦ（配列番号１に示されるｃＤＮＡ）をコードする合成ｍＲＮＡは、キャップ化ｍＲＮＡヌクレアーゼ処理後、ＬＣ－ＭＳによりキャッピング反応効率に関して分析することが可能である。キャップ化ｍＲＮＡのヌクレアーゼ処理は、遊離ヌクレオチドとＬＣ－ＭＳにより検出可能なキャップ化５’－５－三リン酸キャップ構造との混合物を生成するであろう。ＬＣ－ＭＳスペクトルに基づくキャップ化生成物の量は、反応からの全ｍＲＮＡを基準にしたパーセントとして表すことが可能であり、キャッピング反応効率に対応するであろう。より高いキャッピング反応効率を有するキャップ構造は、ＬＣ－ＭＳによればより多量のキャップ化生成物を有するであろう。
実施例８．リピドイドを使用した修飾ｍＲＮＡの製剤
修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）は、細胞への添加前に、ｍｍＲＮＡとリピドイドとを設定比で混合することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験用として製剤化される。ｉｎ ｖｉｖｏ製剤は、生体全体にわたる循環を促進するために追加の成分の添加を必要とすることもある。ｉｎ ｖｉｖｏ作用に好適な粒子を形成するこれらのリピドイドの能力を試験するために、ｓｉＲＮＡ－リピドイド製剤に使用される標準的製剤化プロセスを出発点として使用した。最初のｍｍＲＮＡ－リピドイド製剤は、４２％リピドイド、４８％コレステロール、および１０％ＰＥＧを含む粒子で構成可能であり、比のさらなる最適化が可能である。粒子形成後、ｍｍＲＮＡが添加されて、複合体に組み込まれる。カプセル化効率は、標準的色素排除アッセイを用いて決定される。
実施例９～１３のための材料および方法
Ａ．脂質合成
修飾ＲＮＡを用いて製剤化されるために、当技術分野に概説される方法により、６種の脂質ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、およびＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡを合成した。ＤＬｉｎ－ＤＭＡおよび前駆体は、ヘイエス（Ｈｅｙｅｓ）ら著、制御放出誌（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ）、２００５年、第１０７巻、２７６－２８７頁に記載されるように合成した。ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡおよびＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡおよび前駆体は、センペル（Ｓｅｍｐｌｅ）ら著、自然生物工学（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２０１０年、第２８巻、１７２－１７６頁に記載されるように合成した。９８Ｎ１２－５および前駆体は、アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、自然生物工学（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２００８年、第２６巻、５６１－５６９頁に記載されるように合成した。
Ｃ１２－２００および前駆体は、ラブ（Ｌｏｖｅ）ら著、米国国立科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ）、２０１０年、第１０７巻、１８６４－１８６９頁に概説された方法に従って合成した。アミン２００（０．７２３ｇ、３．３６ｍｍｏｌ、１ｅｑ）および撹拌子を含有するバイアルに２－エポキシドデカン（５．１０ｇ、２７．７ｍｍｏｌ、８．２ｅｑ）を添加した。バイアルを密閉し８０℃に加温した。反応系を８０℃で４日間攪拌した。次いで、純粋ジクロロメタン（ＤＣＭ）からＤＣＭ：ＭｅＯＨ９８：２までのグラジエントを用いてシリカゲルクロマトグラフィーにより、混合物を精製した。目標化合物をＲＰ－ＨＰＬＣによりさらに精製して、所望の化合物を得た。
ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡおよび前駆体は、国際公開第２０１００５４４０１号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の手順に従って合成した。１０ｍＬのＤＭＦ中のジリノレイルメタノール（１．５ｇ、２．８ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ酪酸（１．５ｇ、２．８ｍｍｏｌ、ｌｅｑ）、ＤＩＰＥＡ（０．７３ｍＬ、４．２ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）、およびＴＢＴＵ（１．３５ｇ、４．２ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）の混合物を室温で１０時間攪拌した。次いで、反応混合物をエーテルで希釈し、水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。ＤＣＭからＤＣＭ：ＭｅＯＨ（９８：２）へのグラジエントを用いてシリカゲルクロマトグラフィーにより、粗生成物を精製した。続いて、目標化合物を追加のＲＰ－ＨＰＬＣ精製に付した。これをＹＭＣ－パックＣ４（ＹＭＣ－Ｐａｃｋ Ｃ４）カラムにより行って、目標化合物を得た。
Ｂ．修飾ＲＮＡナノ粒子の製剤
合成脂質１、２－ジステアロイル－３－ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）（アバンティ・ポーラ・リピッド（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、アラバマ州アラバスター（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ））、コレステロール（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、独国タウフキルヘン（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））、およびα－［３’－（１，２－ジミリストイル－３－プロパンオキシ）－カルボキサミドプロピル］－ω－メトキシポリオキシエチレン（ＰＥＧｃ－ ＤＯＭＧ）（ＮＯＦ、ベルギー国ボウェルベン（Ｂｏｕｗｅｌｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ））の溶液をエタノール中に５０ｍＭの濃度で調製して、－２０℃で貯蔵した。脂質を組み合わせて５０：１０：３８．５：１．５（脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧｃ－ＤＯＭＧ）のモル比を取得し、そしてエタノールで希釈して２５ｍＭの最終脂質濃度にした。水中１～２ｍｇ／ｍＬの濃度の修飾ｍＲＮＡの溶液をｐＨ３の５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液で希釈して、ストック修飾ｍＲＮＡ溶液を形成した。合成脂質溶液と修飾ｍＲＮＡ溶液とを１０：１、１５：１、２０：１、および３０：１の全脂質対修飾ｍＲＮＡ重量比で組み合わせることにより、脂質および修飾ｍＲＮＡの製剤を調製した。脂質エタノール性溶液を迅速に水性修飾ｍＲＮＡ溶液に注入して３３％エタノールを含有する懸濁液を得た。溶液を手動（ＭＩ）でまたはシリンジポンプ（ＳＰ）（Ｈａｒｖａｒｄ Ｐｕｍｐ ３３ Ｄｕａｌ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｐｕｍｐ Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ， ＭＡ）の助けを借りて注入した。
エタノールを除去して緩衝液交換を達成するために、１０ｋＤの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有するスライド－Ａ－ライザー（Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ）カセット（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック・インコーポレーテッド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．） 、イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））を用いて、一次生成物の２００倍の体積のｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で製剤を２回透析した。最初の透析を室温で３時間行い、次いで、製剤を４℃で一晩透析した。得られたナノ粒子懸濁液を０．２μｍ無菌フィルター（サルステッド（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）、独国ヌンブレヒト（Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ））に通してガラスバイアル中に濾過し、クリンプクロージャーで密閉した。
Ｃ．製剤の特性解析
ゼタサイザー・ナノＺＳ（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ）（モルバン・インストラメンツ・リミテッド（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ）、英国ウースターシャー州モルバン（Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ））を用いて、粒子サイズの決定では１×ＰＢＳ中で、およびζ電位の決定では１５ｍＭ ＰＢＳ中で、修飾ｍＲＮＡナノ粒子の粒子サイズ、多分散性指数（ＰＤＩ）、およびζ電位を決定した。
紫外可視分光法を用いて、修飾ｍＲＮＡナノ粒子製剤の濃度を決定した。１×ＰＢＳ中希釈製剤１００μＬを、メタノールとクロロホルムとの４：１（ｖ／ｖ）混合液９００μＬに添加した。混合後、ＤＵ８００分光光度計（ベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ベックマン・コールター・インコーポレーテッド（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州ブレア（Ｂｒｅａ，ＣＡ））を用いて、溶液の吸収スペクトルを２３０ｎｍ～３３０ｎｍで記録した。製剤で使用される修飾ＲＮＡの吸光係数、および、２６０ｎｍ波長の吸光度と３３０ｎｍ波長でのベースライン値との差に基づいて、ナノ粒子製剤中の修飾ＲＮＡ濃度を計算した。
クォント－ＩＴＴＭリボグリーン（登録商標）ＲＮＡアッセイ（ＱＵＡＮＴ－ＩＴＴＭ
ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ ａｓｓａｙ）（インビトロジェン・コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を用いて、ナノ粒子による修飾ＲＮＡのカプセル化を評価した。サンプルをＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中に約５μｇ／ｍＬの濃度で希釈した。５０μＬの希釈サンプルをポリスチレン９６ウェルプレートに移し、次いで、５０μｌのＴＥ緩衝液または５０μＬの２％トリトンＸ－１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）溶液のいずれかを添加した。プレートを３７℃の温度で１５分間インキュベートした。リボグーン（ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ）（登録商標）試薬をＴＥ緩衝液で１：１００に希釈し、１００μｌのこの溶液を各ウェルに添加した。約４８０ｎｍの励起波長および約５２０ｎｍの発光波長で蛍光プレート読取り機（ワラック・ビクター１４２０マルチラベル・カウンター（Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ
１４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｌｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ）、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、マサチューセッツ州ウォルサム（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））を用いて、蛍光強度を測定した。各サンプルの値から試薬ブランクの蛍光値を引き算し、そしてインタクトなサンプル（トリトンＸ－１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）の添加無し）の蛍光強度を、破壊されたサンプル（トリトンＸ－１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）の添加により引き起こされた）の蛍光値で割り算することにより、遊離の修飾ＲＮＡのパーセントを決定した。
Ｄ．ｉｎ ｖｉｔｒｏインキュベーション
ヒト胚性腎臓上皮（ＨＥＫ２９３）細胞および肝細胞癌上皮（ＨｅｐＧ２）細胞（ＬＧＣ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ＧｍｂＨ， Ｗｅｓｅｌ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅ ＧｍｂＨ， Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，
Ｇｅｒｍａｎｙ）上に接種した。また、ＨＥＫ２９３細胞のプレートは、１型コラーゲンでプレコーティングされたものであった。１００μｌ細胞培養培地中に、ＨＥＫ２９３を３０，０００細胞／ウェルの密度で接種し、そしてＨｅｐＧ２を３５，０００細胞／ウェルの密度で接種した。ＨＥＫ２９３では、細胞培養培地は、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＭナトリウムピルベート、および１×非必須アミノ酸（バイワクロム（ＡＧＢｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ）、独国ベルリン（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））、および１．２ｍｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、独国ミュンヘン（Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ））が添加されたＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳであり、ＨｅｐＧ２では、培養培地は、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＭナトリウムピルベート、および１×非必須アミノ酸（バイワクロム（ＡＧＢｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ）、独国ベルリン（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））が添加されたＭＥＭ（ギブコ・ライフ・テクノロジーズ（Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、独国ダルムシュタット（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ））、１０％ＦＣＳであった。細胞の接種直後、ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡ（配列番号５に示されるｍＲＮＡ配列；配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１）を含有する製剤を四重試験方式で添加して、インキュベートした。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）で使用した、Ｔ７プロモーター、５’非翻訳（ＵＴＲ）、および３’ＵＴＲを有するｍＣｈｅｒｒｙ ｃＤＮＡは、配列番号６に与えられている。
培養培地上清を９６ウェルのプロバインド（Ｐｒｏ－Ｂｉｎｄ）Ｕ底プレート（ベックトン・ディッキンソン・ゲーエムベーハー（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＧｍｂＨ）、独国ハイデルベルグ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ））に移すことにより、細胞を採取した。細胞を１／２体積のトリプシン／ＥＤＴＡ（バイオクロム・アーゲー（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ）、独国ベルリン（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））でトリプシン処理し、それぞれの上清を用いてプールし、１体積のＰＢＳ／２％ＦＣＳ（両方ともバイオクロム・アーゲー（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ）、独国ベルリン（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））／０．５％ホルムアルデヒド（メルク（Ｍｅｒｃｋ）、独国ダルムシュタット（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を添加することにより固定した。次いで、ＬＳＲＩＩ血球計（ベックトン・ディッキンソン・ゲーエムベーハー（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＧｍｂＨ）、独国ハイデルベルグ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ））により、ＰＥ－テキサスレッド（ＰＥ－Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）に対して５３２ｎｍ励起レーザーおよび６１０／２０フィルターを用いて、サンプルをフローサイトメーター測定に付した。分析サンプルに対して、すべてのイベントの平均蛍光強度（ＭＦＩ）および４つの独立したウェルの標準偏差を提示した。
実施例９．ナノ粒子製剤上の精製
修飾ＲＮＡに対する脂質の比および／または精製に、平均蛍光強度（ＭＦＩ）が依存するかを調べるために、ＨＥＫ２９３およびＨｅｐＧ２においてＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡおよび９８Ｎ１２－５のナノ粒子製剤を試験した。テーブル３に記載の仕様書に対してシリンジポンプを用いて、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡの３つの製剤および９８Ｎ１２－５の２つの製剤を作製した。精製サンプルは、セファデックス（登録商標） Ｇ－２５（ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標） Ｇ－２５） ＤＮＡグレード（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、スウェーデン国（Ｓｗｅｄｅ）ｎ）により精製された。２４ウェルプレートにおいて、２５０ｎｇ修飾ＲＮＡ／ウェルの濃度で、精製の前および後（ａＰ）の各製剤を試験した。各製剤およびバックグラウンドサンプルに対してフローサイトメーターにより分析したときのＦＬ４チャネルでマーカー陽性の細胞のパーセント（％ＦＬ４陽性）は、図３Ａおよび３Ｂに示されており、各製剤およびバックグラウンドサンプルに対するＦＬ４チャネルのマーカーのＭＦＩは、図４Ａおよび４Ｂに示されている。精製された製剤は、精製前に試験された製剤よりもわずかに高いＭＦＩを有していた。

実施例１０．濃度反応曲線
用量範囲にわたり、ＦＬ４またはｍＣｈｅｒｒｙ（配列番号５に示されるｍＲＮＡ配列；配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１）のＭＦＩを決定するために、９８Ｎ１２－５（ＮＰＡ－００５）およびＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ（ＮＰＡ－００３）のナノ粒子製剤をさまざまな濃度で試験した。試験した製剤は、テーブル４にまとめられている。９８Ｎ１２－５のナノ粒子製剤の最適濃度を決定するために、さまざまな濃度の製剤化修飾ＲＮＡ（１００ｎｇ、１０ｎｇ、１．０ｎｇ、０．１ｎｇ、および０．０１ｎｇ／ウェル）をＨＥＫ２９３の２４ウェルプレートで試験し、各用量のＦＬ４ ＭＦＩの結果を図５Ａに示す。同様に、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡのナノ粒子製剤の最適濃度を決定するために、さまざまな濃度の製剤化修飾ＲＮＡ（２５０ｎｇ １００ｎｇ、１０ｎｇ、１．０ｎｇ、０．１ｎｇ、および０．０１ｎｇ／ウェル）をＨＥＫ２９３の２４ウェルプレートで試験し、各用量のＦＬ４ ＭＦＩの結果を図５Ｂに示す。また、ＨＥＫ２９３の２４ウェルプレート中で、製剤化修飾ＲＮＡ（２５０ｎｇ、１００ｎｇ、および３０ｎｇ／ウェル）のさまざまな濃度で、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡのナノ粒子製剤を試験した。各用量のＦＬ４ ＭＦＩの結果は、図５Ｃに示される。９８Ｎ１２－５では１ｎｇ／ウェルの用量およびＤＬｉｎＫ２－ＤＭＡでは１０ｎｇ／ウェルの用量が、バックグラウンドのＦＬ４ ＭＦＩに類似していることが判明した。
濃度がバックグラウンドにどの程度類似しているかを調べるために、我々は、ｍＣｈｅｒｒｙ発現の検出に対して最適化されたフィルターセットによるフローサイトメーターを利用し、バックグラウンドレベルと対比して増大された感度を有する結果を得ることが可能であった。９８Ｎ１２－５（ＮＰＡ－００５）およびＤＬｉｎ－Ｋ２－ＤＭＡ（ＮＰＡ－００３）に対して、２５ｎｇ／ウェル、０．２５ｎｇ／ウェル、０．０２５ｎｇ／ウェル、および０．００２５ｎｇ／ウェルの用量を分析して、ｍＣｈｅｒｒｙのＭＦＩを決定した。テーブル５に示されるように、０．０２５ｎｇ／ウェルの濃度およびそれ未満の濃度は、約３８６．１２５であるｍＣｈｅｒｒｙのバックグラウンドＭＦＩレベルに類似している。

実施例１１．手動注射製剤およびシリンジポンプ製剤
ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡおよび９８Ｎ１２－５の２つの製剤を手動注射（ＭＩ）およびシリンジポンプ注射（ＳＰ）により調製し、そしてバックグラウンドサンプルと共に分析して、さまざまな製剤のｍＣｈｅｒｒｙ（配列番号５に示されるｍＲＮＡ配列；配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１）のＭＦＩを比較した。テーブル５は、同一の脂質および脂質／ＲＮＡ比の手動注射製剤と比較して、シリンジポンプ製剤がより高いＭＦＩを有していたことを示している。

実施例１２．製剤のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光
ＨＥＫ２９３細胞のプレートでは６０ｎｇ／ウェルまたは６２．５ｎｇ／ウェルおよびＨｅｐＧ２細胞のプレートでは６２．５ｎｇ／ウェルの濃度で、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、およびＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡの製剤を２４時間インキュベートして、各製剤のｍＣｈｅｒｒｙ（配列番号５に示されるｍＲＮＡ配列；配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１）のＭＦＩを調べた。試験した製剤は、以下のテーブル６にまとめられている。６０ｎｇ／ウェルに対しては図６Ａならびに６２．５ｎｇ／ウェルに対しては図６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、および６Ｅに示されるように、ＮＰＡ－００３およびＮＰＡ－０１８の製剤は、最も高いｍＣｈｅｒｒｙ ＭＦＩを有し、ＮＰＡ－００８、ＮＰＡ－０１０、およびＮＰＡ－０１３の製剤は、バックグラウンドサンプルｍＣｈｅｒｒｙ ＭＦＩ値とほぼ同様である。

実施例１３．ｉｎ ｖｉｖｏ製剤研究
修飾ｍＲＮＡおよび脂質を含有する単回用量の製剤をマウス（ｎ＝５）に静脈内投与した。マウスに投与される修飾ｍＲＮＡは、Ｇ－ＣＳＦ（配列番号４に示されるｍＲＮＡ配列；配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１）、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）（配列番号７に示されるｍＲＮＡ配列；配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１）、第ＩＸ因子（配列番号８に示されるｍＲＮＡ配列；配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１）、またはｍＣｈｅｒｒｙ（配列番号５に示されるｍＲＮＡ配列；配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１）から選択される。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）で使用した、Ｔ７プロモーター、５’非翻訳（ＵＴＲ）、および３’ＵＴＲを有するエリトロポイエチンｃＤＮＡは、配列番号９に与えられている。
また、各製剤は、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、またはＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡの１つから選択される脂質を含有する。１００μｇ、１０μｇまたは１μｇの製剤化修飾ｍＲＮＡをマウスに注射して、製剤投与の８時間後、屠殺する。ヒトＧ－ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡを含有する製剤が投与されたマウスの血清を、特異的Ｇ－ＣＳＦ ＥＬＩＳＡにより測定し、ヒト第ＩＸ因子修飾ＲＮＡが投与されたマウスの血清を、特異的第ＩＸ因子ＥＬＩＳＡまたは色素原性アッセイにより分析する。ｍＣｈｅｒｒｙ修飾ｍＲＮＡが投与されたマウスの肝臓および脾臓を、免疫組織化学（ＩＨＣ）または蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）により分析する。対照として、１群のマウスにはいずれの製剤をも注射せずに、それらの血清および組織を採取してＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、および／またはＩＨＣにより分析する。
実施例１４．ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現およびｉｎ ｖｉｖｏ発現
Ａ．Ａ．リピドイド製剤を使用したヒト細胞でのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現
ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションの試験に使用されるｍｍＲＮＡ対リピドイドの比は、経験に基づいてさまざまなリピドイド：ｍｍＲＮＡ比で試験される。ｓｉＲＮＡおよびリピドイドを用いた以前の研究では、２．５：１、５：１、１０：１、および１５：１のリピドイド：ｓｉＲＮＡ ｗｔ：ｗｔ比が利用された。ｓｉＲＮＡよりもｍｍＲＮＡの長さが長いと仮定すれば、リピドイドに対するｍｍＲＮＡのｗｔ：ｗｔ比についてより小さい比で効果を発揮しうる。また、それに加えて、比較のために、ＲＮＡＩＭＡＸＴＭ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））またはＴＲＡＮＳＩＴ－ｍＲＮＡ（ミラスバイオ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）、ウィスコンシン州マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ））のカチオン性脂質送達媒体を用いて、ｍｍＲＮＡを製剤化した。リピドイド製剤化ルシフェラーゼ（配列番号１０に示されるＩＶＴ ｃＤＮＡ配列）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（配列番号１１に示されるＩＶＴ ｃＤＮＡ配列）、Ｇ－ＣＳＦ（配列番号４に示されるｍＲＮＡ配列；配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１）、および、所望のタンパク質産物を発現するＥＰＯ ｍｍＲＮＡ（配列番号７に示されるｍＲＮＡ配列；配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１）の能力を、ルシフェラーゼ発現に関しては発光、ＧＦＰ発現に関してはフローサイトメトリー、ならびに、Ｇ－ＣＳＦおよびエリトロポイエチン（ＥＰＯ）の分泌に関してはＥＬＩＳＡにより、確認することが可能である。
Ｂ．静脈内注射後のｉｎ ｖｉｖｏ発現
９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、およびＭＤ１をはじめとする多種多様なリピドイドを用いて、製剤の全身性静脈内投与を施すが、これらに限定されるものではない。
ｍｍＲＮＡを含有するリピドイド製剤は、動物に静脈内注射される。修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）コードタンパク質の発現は、血液サンプルならびに／または動物から採取された肝臓および脾臓（これらに限定されるものではない）をはじめとする他の器官サンプルで評価される。また、単回用量静脈内研究を行えば、所望の産物の発現の量、用量反応性、および寿命の評価が可能になるであろう。
一実施形態では、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、ＭＤ１、および他のリピドイドのリピドイド系製剤を用いて、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質、分泌型アルカリホスファターゼ（ｓＡＰ）、ヒトＧ－ＣＳＦ、ヒト第ＩＸ因子、またはヒトエリトロポイエチン（ＥＰＯ）ｍｍＲＮＡを動物中に送達する。以上に記載されたように脂質を用いてｍｍＲＮＡを製剤化した後、生理食塩水製剤またはさまざまなｍｍＲＮＡの１つを含有するリピドイド製剤のいずれかの投与を受けるように、動物をグループに分ける。ｍｍＲＮＡの１つは、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｓＡＰ、ヒトＧ－ＣＳＦ、ヒト第ＩＸ因子、およびヒトＥＰＯから選択される。動物に注射する前、ｍｍＲＮＡ含有リピドイド製剤をＰＢＳ中に希釈する。次いで、１０ｍｇ／ｋｇの用量から１ｎｇ／ｋｇ程度の低い用量までにわたり、単回用量（１回分）の製剤化ｍｍＲＮＡを動物に投与するが、好ましい範囲は、１０ｍｇ／ｋｇ～１００ｎｇ／ｋｇであり、ｍｍＲＮＡの用量は、動物の体重に依存し、たとえば、２０グラムのマウスは、最大で０．２ｍｌの製剤の投与を受ける（投与は、体重１ｋｇあたりのｍｍＲＮＡに基づく）。ｍｍＲＮＡ－リピドイド製剤の投与後、血清、組織、および／または組織溶解物を取得して、ｍｍＲＮＡコード製剤のレベルを単一および／または一連の時間間隔で決定する。リピドイド製剤化ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｓＡＰ、Ｇ－ＣＳＦ、第ＩＸ因子、および、所望のタンパク質産物を発現するＥＰＯ ｍｍＲＮＡの能力を、ルシフェラーゼの発現に関しては発光により、ＧＦＰ発現およびｍＣｈｅｒｒｙ発現に関してはフローサイトメトリーにより、または、ｓＡＰに関しては酵素活性により、Ｇ－ＣＳＦ、第ＩＸ因子、および／もしくはＥＰＯの分泌に関してはＥＬＩＳＡにより、確認する。
また、複数回用量（複数回投与）レジメンのさらなる研究を行って、ｍｍＲＮＡの最大発現を決定したり、ｍｍＲＮＡ駆動発現の飽和性を評価したり（並行的または逐次的に対照および活性ｍｍＲＮＡ製剤を投与することにより）、繰返し薬剤投与の実現可能性を決定したり（何週間かまたは何ヶ月間かの間隔で何回かｍｍＲＮＡを投与してから、発現レベルが免疫原性などの因子により影響されるかを決定することにより）することも可能である。また、Ｇ－ＣＳＦやＥＰＯなどのタンパク質の生理学的機能の評価は、それぞれ、試験動物のサンプルの分析ならびに顆粒球および赤血球のカウント数増大の検出を介して決定される。また、動物における第ＩＸ因子などの発現タンパク質産物の活性は、第ＩＸ因子酵素活性（たとえば、活性化部分トロンボプラスチン時間）および凝血時間の影響を分析することにより評価可能である。
Ｃ．筋肉内注射後および／または皮下注射後のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現
筋肉内経路または皮下注射経路を介してオリゴヌクレオチド（ｍＲＮＡを含む）を送達するためのリピドイド製剤の使用は、これまで報告されていないので、評価する必要がある。ｍｍＲＮＡの筋肉内注射および／または皮下注射を評価して、ｍｍＲＮＡ含有リピドイド製剤が所望のタンパク質（ｐｏｒｔｉｅｎｓ）の局所発現および全身発現の両方を引き起こしうるかを調べる。
ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質、分泌型アルカリホスファターゼ（ｓＡＰ）、ヒトＧ－ＣＳＦ、ヒト第ＩＸ因子、またはヒトエリトロポイエチン（ＥＰＯ）のｍｍＲＮＡから選択されるｍｍＲＮＡを含有する９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００およびＭＤ１のリピドイド製剤を動物中に筋肉内注射および／または皮下注射する。ｍｍＲＮＡコードタンパク質の発現は、筋肉内または皮下組織内でも、全身的に血液ならびに他の器官たとえば肝臓および脾臓でも、評価される。単回用量研究では、所望の産物の発現の量、用量反応性、および寿命の評価が可能である。
生理食塩水製剤または修飾ｍＲＮＡを含有する製剤のいずれかの投与を受けるグループに動物を分ける。注射前、ｍｍＲＮＡ含有リピドイド製剤をＰＢＳ中に希釈する。５０ｍｇ／ｋｇから１ｎｇｋｇ程度の低い用量までにわたり、製剤化ｍｍＲＮＡの単回筋肉内用量を動物に投与するが、好ましい範囲は、１０ｍｇ／ｋｇ～１００ｎｇｋｇである。筋肉内投与の最大用量は、マウスで、マウスの後肢中への筋肉内注射に供する場合、約１ｍｇ
ｍｍＲＮＡまたは０．０２ｎｇ ｍｍＲＮＡ程度に低い。皮下投与に供する場合、動物は、４００ｍｇ／ｋｇから１ｎｇ／ｋｇ程度の低用量までの単回筋肉内用量の製剤化ｍｍＲＮＡが投与される。ただし、好ましい範囲は、８０ｍｇ／ｋｇ～１００ｎｇ／ｋｇである。皮下投与の最大用量は、マウスでは、約８ｍｇ ｍｍＲＮＡ、または０．０２ｎｇ ｍｍＲＮＡ程度に低い。
２０グラムのマウスでは、単回筋肉内注射の量は、最大で０．０２５ｍｌであり、単回皮下注射では、最大で０．２ｍｌである。投与されるｍｍＲＮＡの最適用量は、動物の体重から計算される。ｍｍＲＮＡ－リピドイドの投与後の種々の時点で、血清、組織、および組織溶解物を取得して、ｍｍＲＮＡコード産物のレベルを決定する。リピドイド製剤化ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質、分泌型アルカリホスファターゼ（ｓＡＰ）、ヒトＧ－ＣＳＦ、ヒト第ＩＸ因子、または、所望のタンパク質産物を発現するヒトエリトロポイエチン（ＥＰＯ）のｍｍＲＮＡの能力は、ルシフェラーゼ発現に関しては発光により、ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙの発現に関してはフローサイトメトリー、ｓＡＰに関しては酵素活性により、およびＧ－ＣＳＦ、第ＩＸ因子、およびエリトロポイエチン（ＥＰＯ）の分泌に関してはＥＬＩＳＡにより、確認される。
また、複数回用量レジメンの追加の研究を行って、ｍｍＲＮＡを用いて最大発現を決定したり、ｍｍＲＮＡ駆動発現の飽和性を評価したり（並行的または逐次的に対照および活性ｍｍＲＮＡ製剤を投与することにより達成される）、繰返し薬剤投与の実現可能性を決定したり（何週間かまたは何ヶ月間かの間隔で何回かｍｍＲＮＡを投与してから、発現レベルが免疫原性などの因子により影響されるかを決定することにより）する。また、一時点で複数の皮下注射部位または筋肉内注射部位を利用する研究を利用して、ｍｍＲＮＡ薬剤への暴露をさらに増大させたり、タンパク質産生を改善したりする。ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｓＡＰ、ヒトＧ－ＣＳＦ、ヒト第ＩＸ因子、およびヒトＥＰＯなどのタンパク質の生理学的機能の評価は、試験動物のサンプルの分析ならびに顆粒球および／または赤血球のカウント数の変化の検出を介して決定される。また、動物における第ＩＸ因子などの発現タンパク質産物の活性は、第ＩＸ因子酵素活性（たとえば、活性化部分トロンボプラスチン時間）および凝血時間の影響を分析することにより評価可能である。
実施例１５．分割用量研究
一時点で複数の皮下注射部位または筋肉内注射部位を利用する研究を設計および実施して、ｍｍＲＮＡ薬剤への暴露を増大させたり、タンパク質産生を改善したりする方法を研究する。発現タンパク質産物の検出に加えて、タンパク質の生理学的機能の評価もまた、試験動物のサンプルの分析により決定した。
驚くべきことに、ｍｍＲＮＡの分割投与は、単回単位投与または複数回投与のスキームによりもたらされるよりも大きいタンパク質産生および表現型反応をもたらすことが確認された。
単回単位用量、複数回用量、および分割用量の実験の設計は、緩衝液のみに加えて投与されるヒトエリトロポイエチン（ＥＰＯ）ｍｍＲＮＡ（配列番号７に示されるｍＲＮＡ配列；配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１）を使用することを含んでいた。投与媒体（Ｆ．緩衝液）は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ Ｎａ＋－ホスフェート（１．４ｍＭ第一リン酸ナトリウム、０．６ｍＭ第二リン酸ナトリウム）、および０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５で構成された。水酸化ナトリウムを用いてｐＨを調整し、最終溶液を濾過滅菌した。ｍｍＲＮＡは、各シトシン部位では５ｍｅＣ置換および各ウリジン部位でプソイドウリジン置換により修飾した。
１００μｇの単回単位用量で動物（ｎ＝５）にＩＭ（筋肉内）注射した。複数回投与では、３回の１００μｇ投与および６回の１００μｇ投与の２つのスケジュールを使用した。分割投与スキームでは、３回の３３．３μｇ ｍｍＲＮＡ投与および６回の１６．５μｇ ｍｍＲＮＡ投与の２つのスケジュールを使用した。対照投与は、６回の緩衝液のみの使用を含んでいた。対照ｍｍＲＮＡは、１００μｇで６倍に投与された、ルシフェラーゼｍｍＲＮＡ（配列番号１０に示されるＩＶＴ ｃＤＮＡ配列）の使用を含んでいた。注射の１３時間後、血液および筋肉組織を評価した。
緩衝液中ＥＰＯ ｍｍＲＮＡのＩ．Ｍ．単回、複数回、または分割投与の１３時間後、ヒトＥＰＯタンパク質をマウス血清中で測定した。７つのマウスグループ（ｎ＝マウス５匹／グループ）を処置および評価した。結果はテーブル７に示される。

分割因子は、単位薬剤あたりの産物を単位薬剤あたりの単回用量産物で割り算したものとして定義される（ＰＵＤ）。たとえば、治療グループ２では、値 ．２８または単位薬剤（ｍｍＲＮＡ）あたりの産物（ＥＰＯ）を単位薬剤あたりの単回用量産物０．１４で割り算する。結果は２である。同様に、治療グループ４では、値１．１または単位薬剤（ｍｍＲＮＡ）あたりの産物（ＥＰＯ）を単位薬剤あたりの単回用量産物０．１４で割り算する。結果は７．９である。その結果、用量分割因子（ＤＳＦ）は、分割用量レジメンの有効性の指標として使用されうる。全一日用量の任意の単回投与では、ＤＳＦは１に等しいはずである。したがって、分割用量レジメンでこの値よりも大きいＤＳＦはいずれも、有効性の増大の指標である。
用量反応の傾向、注射部位の影響、および注射のタイミングの影響を調べるために、研究を行う。これらの研究では、１μｇ、５μｇ、１０μｇ、２５μｇ、５０μｇ、およびそれらの間の値を含むさまざまな用量を用いて、用量反応の転帰を調べる。１００μｇの全用量に対する分割投与は、１．６μｇ、４．２μｇ、８．３μｇ、１６．６μｇ、または所定の全用量の投与と等しい値および全用量の３または６回投与を含む。
注射部位は、肢または注射に好適な十分な領域を呈する任意の身体表面から選択される。これはまた、真皮（真皮内）、表皮（表皮）、皮下組織（ＳＣ）、または筋肉（ＩＭ）を標的とするために、注射深さの選択を含みうる。注射角度は、標的送達部位によって異なるであろう。真皮内部位を標的とする注射では皮膚の表面の平面から１０～１５度の角度であり、皮下注射では皮膚の表面の平面から２０～４５度であり、実質的に筋肉中への注射では６０～９０度の角度である。
実施例１６：用量反応および注射部位選択およびタイミング
用量反応の傾向、注射部位の影響、および注射のタイミングの影響を調べるために、実施例１５に概説されるプロトコルに従って研究を行う。これらの研究では、１μｇ、５μｇ、１０μｇ、２５μｇ、５０μｇ、およびそれらの間の値を含むさまざまな用量を用いて、用量反応の転帰を調べる。１００μｇの全用量に対する分割投与は、１．６μｇ、４．２μｇ、８．３μｇ、１６．６μｇ、または所定の全用量の投与と等しい値および全用量の３または６回投与を含む。
注射部位は、肢または注射に好適な十分な領域を呈する任意の身体表面から選択される。これはまた、真皮（真皮内）、表皮（表皮）、皮下組織（ＳＣ）、または筋肉（ＩＭ）を標的とするために、注射深さの選択を含みうる。注射角度は、標的送達部位によって異なるであろう。真皮内部位を標的とする注射では皮膚の表面の平面から１０～１５度の角度であり、皮下注射では皮膚の表面の平面から２０～４５度であり、実質的に筋肉中への注射では６０～９０度の角度である。ＲＮＡＩＭＡＸＴＭ
実施例１７．投与経路
さまざまな投与経路を用いた投与を研究するために、さらなる研究を行った。実施例１５に概説されるプロトコルに従って、テーブル８に概説される投与チャートにより、各グループあたり４匹のマウスの筋肉内（Ｉ．Ｍ．）、静脈内（ＩＶ）、または皮下（Ｓ．Ｃ．）に投与した。注射の１３時間後、すべてのマウスから血清を採取し、筋肉内および皮下のグループからは、注射部位の組織を採取し、静脈内グループからは、脾臓、肝臓、および腎臓を採取した。筋肉内グループの結果は、図７Ａに示されており、皮下グループの結果は、図７Ｂに示されている。

実施例１８：修飾ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ送達
修飾ＲＮＡをＣ５７／ＢＬ６マウスの筋肉内、皮下、または静脈内に送達して、ルシフェラーゼを用いた修飾ＲＮＡの生体内分布を評価した。すべての送達方法で使用した製剤緩衝液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化カルシウム、２ｍＭ Ｎａ＋リン酸塩（１．４ｍＭ第一リン酸ナトリウムおよび０．６ｍＭ第二リン酸ナトリウムを含んでいた）、および０．５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有していた。最終ｐＨ６．５に達するように、水酸化ナトリウムを用いて調整した後、濾過および滅菌を行った。送達緩衝液として１×濃度を使用した。マウスに送達するリポプレックス化溶液を形成するために、第１のバイアル内で、５０μｇのＲＮＡを送達緩衝液中、室温で１０分間平衡化させ、第２のバイアル内で、１０μｌのＲＮＡｉＭＡＸ ＴＭを送達緩衝液中、室温で１０分間平衡化させた。平衡後、バイアルを合わせて、１００μｌの最終体積に達するように送達緩衝液を添加し、次いで、室温で２０分間インキュベートした。各マウスに１５０ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射（ＩＰ）を行うことによりルシフェリンを投与し、その後、ルシフェリン暴露曲線のプラトー期（１５～３０分間）にイメージングを行った。ルシフェリンを形成するために、１ｇ Ｄ－ルシフェリンカリウム塩またはナトリウム塩を６６．６ｍｌの蒸留リン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ）（Ｍｇ２＋もＣａ２＋も含まれていない）中に溶解させて、１５ｍｇ／ｍｌ溶液を作製した。溶液を穏やかに混合して０．２μｍシリンジフィルターに通し、その後、窒素でパージし、分注し、そしてできるかぎり光から保護しながら－８０℃で凍結させた。ルシフェリンが溶解しなかった場合、水浴を用いて溶体を解凍し、穏やかに混合し、そして投与日に氷上に保持した。
投与の２、８、および２４時間後、各マウスの全身像を取得した。投与の２４時間後、各マウスから組織像および血清を取得した。静脈内投与を受けたマウスでは、それらの肝臓、脾臓、腎臓、肺、心臓、腎周囲脂肪組織、および胸腺のイメージングを行った。筋肉内投与または皮下投与を受けたマウスでは、それらの肝臓、脾臓、腎臓、肺、腎周囲脂肪組織、および筋肉が注射部位であった。各投与経路および投与レジメンで、全身像から生物発光をフォトン／秒単位で測定した。
Ａ．筋肉内投与
修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１０に示されるＩＶＴ ｃＤＮＡ配列）（裸のＬｕｃ）、リポプレックス化修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（リポプレックス－ｌｕｃ）、リポプレックス化修飾顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）ｍＲＮＡ（配列番号４に示されるｍＲＮＡ配列；配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１）（リポプレックス－サイトカイン）、または形成緩衝液のいずれかを、右後肢では各製剤につき５０μｌの注射量で５０μｇの修飾ＲＮＡの単回用量で、および左後肢では５０μｌの注射量で５μｇの修飾ＲＮＡの単回用量で、マウスに筋肉内（Ｉ．Ｍ．）投与した。投与の２、８、および２４時間後の各グループのルシフェラーゼ発現シグナルの生物発光平均を、左後肢では図８Ａにおよび右後肢では図８Ｂに示す。生物発光は、リポプレックスを含有するおよび含有しない５μｇおよび５０μｇの修飾ＲＮＡ製剤の注射部位で陽性シグナルを示した。
Ｂ．皮下投与
修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（裸のＬｕｃ）、リポプレックス化修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（リポプレックス－ｌｕｃ）、リポプレックス化修飾Ｇ－ＣＳＦ ｍＲＮＡ（リポプレックス－Ｇ－ＣＳＦ）、または形成緩衝液を、各製剤につき１００μｌの注射量で５０μｇの修飾ｍＲＮＡの単回用量で、マウスに皮下（Ｓ．Ｃ．）投与した。投与の２、８、および２４時間後の各グループのルシフェラーゼ発現シグナルの生物発光平均を、図８Ｃに示す。生物発光は、リポプレックスを含有するおよび含有しない５０μｇの修飾ｍＲＮＡ製剤の注射部位で陽性シグナルを示した。
Ｃ．静脈内投与
修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（裸のＬｕｃ）、リポプレックス化修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（リポプレックス－ｌｕｃ）、リポプレックス化修飾Ｇ－ＣＳＦ ｍＲＮＡ（リポプレックス－Ｇ－ＣＳＦ）、または形成緩衝液を、各製剤につき１００μｌの注射量で５０μｇの修飾ｍＲＮＡの単回用量で、マウスに静脈内（Ｉ．Ｖ．）投与した。投与の２時間後の各グループの脾臓のルシフェラーゼ発現シグナルの生物発光平均を図８Ｄに示す。生物発光は、リポプレックスを含有する５０μｇの修飾ｍＲＮＡ製剤の脾臓で陽性シグナルを示した。
実施例１９：リポプレックスを用いたｉｎ ｖｉｖｏ送達
Ａ．ヒトＥＰＯ修飾ＲＮＡリポプレックス
１００μｇの修飾ヒトエリトロポイエチンｍＲＮＡ（配列番号７に示されるｍＲＮＡ配列；配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１）（ＥＰＯ、完全修飾５－メチルシトシン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン）を含有する製剤を、３０体積％のＲＮＡＩＭＡＸ ＴＭでリポプレックス化し（リポプレックス－ｈ－Ｅｐｏ－４６、生成２またはＧｅｎ２）、４匹のＣ５７ＢＬ６マウスに５０～７０μＬで筋肉内送達した。他のグループは、３０体積％のＲＮＡＩＭＡＸＴＭでリポプレックス化された１００μｇの修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡを含有する対照として機能するリポプレックス化修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（リポプレックス－ｌｕｃ）（配列番号１０に示されるＩＶＴ ｃＤＮＡ配列）の注射を受けるマウス、または６５μｌの投与量で陰性対照として製剤緩衝液の注射を受けるマウスで構成される。筋肉内注射の１３時間後、各マウスから血清を採取して、ヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡによりマウス血清中のヒトＥＰＯタンパク質の量を測定した。結果を図９に示す。
Ｂ．ヒトＧ－ＣＳＦ修飾ＲＮＡリポプレックス
修飾ヒトＧ－ＣＳＦ ｍＲＮＡ（配列番号４に示されるｍＲＮＡ配列；配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１）（５－メチルシトシンおよびプソイドウリジンで完全に修飾されたＧ－ＣＳＦ（Ｇ－ＣＳＦ）または５－メチルシトシンおよびＮ１メチル－プソイドウリジンで完全に修飾されたＧ－ＣＳＦ（Ｇ－ＣＳＦ－Ｎ１））の２つのタイプの一方を１００μｇ含有する製剤を、３０体積％のＲＮＡＩＭＡＸＴＭでリポプレックス化し、筋肉内（Ｉ．Ｍ）では１５０μＬ、皮下（Ｓ．Ｃ）では１５０μＬ、および静脈内（ｌ．Ｖ）では２２５μＬを、Ｃ５７／ＢＬ６マウスに送達する。３つの対照グループでは、筋肉内で１００μｇの修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１０に示されるＩＶＴ ｃＤＮＡ配列）（Ｌｕｃ－ｕｎｓｐ Ｉ．Ｍ．）または静脈内に１５０μｇの修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（Ｌｕｃ－ｕｎｓｐ Ｉ．Ｖ．）または筋肉内に１５０μＬの製剤緩衝液（緩衝液Ｉ．Ｍ．）のいずれかを投与した。製剤の投与の６時間後、各マウスから血清を採取して、ヒトＧ－ＣＳＦ ＥＬＩＳＡによりマウス血清中のヒトＧ－ＣＳＦタンパク質の量を測定した。結果を図１０に示す。
Ｃ．ヒトＧ－ＣＳＦ修飾ＲＮＡリポプレックスの比較
３０体積％のＲＮＡＩＭＡＸＴＭでリポプレックス化された５－メチルシトシン（５ｍｃ）修飾およびプソイドウリジン（ψ）修飾を有する修飾ヒトＧ－ＣＳＦ ｍＲＮＡ（Ｇ－ＣＳＦ－Ｇｅｎ１－リポプレックス）、生理食塩水中の５ｍｃ修飾およびψ修飾を有する修飾ヒトＧ－ＣＳＦ ｍＲＮＡ（Ｇ－ＣＳＦ－Ｇｅｎ１－生理食塩水）、３０体積％のＲＮＡＩＭＡＸＴＭでリポプレックス化されたＮ１５－メチルシトシン（Ｎ１－５ｍｃ）修飾およびψ修飾を有する修飾ヒトＧ－ＣＳＦ ｍＲＮＡ（Ｇ－ＣＳＦ－Ｇｅｎ２－リポプレックス）、生理食塩水中のＮ１－５ｍｃ修飾およびψ修飾を有する修飾ヒトＧ－ＣＳＦ ｍＲＮＡ（Ｇ－ＣＳＦ－Ｇｅｎ２－生理食塩水）、３０体積％のＲＮＡＩＭＡＸＴＭでリポプレックス化された５ｍｃ修飾およびψ修飾を有する修飾ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ－リポプレックス）、または生理食塩水中の５ｍｃ修飾およびψ修飾を有する修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（Ｌｕｃ－生理食塩水）のいずれかを１００μｇ含有する製剤を筋肉内（Ｉ．Ｍ．）または皮下（Ｓ．Ｃ．）に送達し、そして各投与方法の対照グループでは、８０μＬの用量の製剤緩衝液（Ｆ．緩衝液）をＣ５７／ＢＬ６マウスに投与した。注射の１３時間後、各マウスの注射部位から血清および組織を採取してＧ－ＣＳＦ ＥＬＩＳＡにより分析し、ヒトＧ－ＣＳＦタンパク質レベルを比較した。筋肉内投与のマウス血清中のヒトＧ－ＣＳＦタンパク質の結果は、図１１Ａに示され、皮下投与の結果は、図１１Ｂに示される。
Ｄ．ｍＣｈｅｒｒｙ修飾ＲＮＡリポプレックスの比較
筋肉内投与および皮下投与
３０体積％のＲＮＡＩＭＡＸＴＭでリポプレックス化された１００μｇの修飾ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡ（配列番号５に示されるｍＲＮＡ配列；配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール、；５’キャップ、Ｃａｐ１）または生理食塩水中の修飾ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡのいずれかを含有する製剤を、マウスに筋肉内送達および皮下送達する。また、対照グループのマウスには、製剤緩衝液を筋肉内投与または皮下投与する。注射の１７時間後、マウスの注射部位を採取して、切片を切り出すことにより、タンパク質の産生に関与する細胞型を決定しうる。
硝子体内投与
ＲＮＡＩＭＡＸＴＭでリポプレックス化された修飾ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡ、製剤緩衝液中の修飾ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡ、ＲＮＡＭＡＸＴＭでリポプレックス化された修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ、製剤緩衝液中の修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡのいずれかを１０μｇ含有する製剤は、５μｌ／眼の投与量では硝子体内注射（ＩＶＴ）によりラットに投与可能である。また、ラットの対照グループには、５μｌ／眼の投与量で製剤緩衝液をＩＶＴにより投与する。注射の１８時間後、処置されたラットから眼を採取して、切片の切出しおよび溶解を行うことにより、ｉｎ ｖｉｖｏで効果的にｍｍＲＮＡを眼に送達してタンパク質産生をもたらしうるかを調べたり、ｉｎ ｖｉｖｏでタンパク質産生に関与する細胞型を調べたりすることが可能である。
鼻腔内投与
３０体積％のＲＮＡＩＭＡＸＴＭでリポプレックス化された修飾ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡ、生理食塩水中の修飾ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡ、３０体積％のＲＮＡＩＭＡＸＴＭでリポプレックス化された修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ、または生理食塩水中の修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡのいずれかを１００μｇ含有する製剤を鼻腔内送達する。また、対照グループには製剤緩衝液を鼻腔内投与する。点滴注入の約１３時間後、肺を採取して切片の切出し（ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡの投与を受けたもの）またはホモジナイゼーション（ルシフェラーゼｍＲＮＡの投与を受けたもの）に供しうる。これらのサンプルは、ｉｎ
ｖｉｖｏで効果的にｍｍＲＮＡを肺に送達してタンパク質産生をもたらしうるかを調べたり、ｉｎ ｖｉｖｏでタンパク質の産生に関与する細胞型を調べたりするために使用されるであろう。
実施例２０：さまざまな脂質比を用いたｉｎ ｖｉｖｏ送達
修飾ｍＲＮＡをＣ５７／ＢＬ６マウスに送達して、さまざまな脂質比および得られたタンパク質発現を評価した。１０％、３０％、もしくは５０％ＲＮＡＩＭＡＸＴＭでリポプレックス化された１００μｇ修飾ヒトＥＰＯ ｍＲＮＡ（配列番号７に示されるｍＲＮＡ配列；配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１）、１０％、３０％、もしくは５０％のＲＮＡＩＭＡＸＴＭでリポプレックス化された１００μｇ修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１０に示されるＩＶＴ ｃＤＮＡ配列）、または製剤緩衝液の製剤を、単回７０μｌ用量でマウスに筋肉内投与した。注射の１３時間後、血清を採取してヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡを行うことにより、各マウス中のヒトＥＰＯタンパク質レベルを決定した。図１２に示される、ヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡの結果は、筋肉中で発現される修飾ヒトＥＰＯが、さまざまなパーセントのＲＮＡＩＭＡＸＴＭのそれぞれで血清中に分泌されることを示している。
実施例２１：哺乳動物における筋肉内および皮下ｉｎ ｖｉｖｏ送達
生理食塩水中に製剤化された修飾ヒトＥＰＯ ｍＲＮＡ（配列番号７に示されるｍＲＮＡ配列；配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１）を、Ｃ５７／ＢＬ６マウスまたはスプラーグドーリーラットのいずれかに送達して、ヒトＥＰＯ産生への用量依存性を評価した。テーブル９の投与チャートに記載されるように、５０μｌの修飾ヒトＥＰＯ ｍＲＮＡ（ｈ－ＥＰＯ）、修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（Ｌｕｃ）（配列番号１０に示されるＩＶＴ ｃＤＮＡ配列）、または製剤緩衝液（Ｆ．緩衝液）を、ラットの筋肉内に注射した。
テーブル１０の投与チャートに記載されるように、５０μｌの修飾ヒトＥＰＯ ｍＲＮＡ（ｈ－ＥＰＯ）、修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（Ｌｕｃ）、または製剤緩衝液（Ｆ．Ｂｕｆｆｅｒ）を、マウスの筋肉内または皮下に注射した。注射の１３時間後、血液を採取して血清を分析することにより、各マウスまたはラットでヒトＥＰＯの量を決定した。ｐｇ／ｍｌ単位の平均および幾何平均もまた、ラット研究のために、テーブル９に示されている。

実施例２２：ラットにおける筋肉内ｉｎ ｖｉｖｏ送達後の活性持続期間
生理食塩水中で製剤化された修飾ヒトＥＰＯ ｍＲＮＡ（配列番号７に示されるｍＲＮＡ配列；配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１）をスプラーグドーリーラットに送達して、用量反応期間を調べた。テーブル１１の投与チャートに記載されるように、５０μｌの修飾ヒトＥＰＯ ｍＲＮＡ（ｈ－ＥＰＯ）、修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１０に示されるＩＶＴ ｃＤＮＡ配列）、または製剤緩衝液（Ｆ．緩衝液）を、ラットの筋肉内に注射した。筋肉内注射の２、６、１２、２４、４８、および７２時間後、ラットから採血して所定の時間で血清中のヒトＥＰＯの濃度を調べた。ｐｇ／ｍｌ単位の平均および幾何平均もまた、この研究のために、テーブル１１に示されている。

実施例２３．ＶＥＧＦ－Ａのｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション
リバーストランスフェクションによって、ヒト血管内皮増殖因子アイソフォームＡ（ＶＥＧＦ－Ａ）修飾ｍＲＮＡ（配列番号１２に示されるｍＲＮＡ配列；配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１）を、２４マルチウェルプレート中でヒト角化細胞内にトランスフェクトした。５０～７０％の集密度に達するまで、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））製のサプリメントＳ７を含むＥＰＩＬＩＦＥ（登録商標）培地中でヒト角化細胞を増殖させた。インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））製のＲＮＡＩＭＡＸＴＭで複合化されたＶＥＧＦ－Ａをコードする０、４６．８７５、９３．７５、１８７．５、３７５、７５０、および１５００ｎｇの修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を細胞にトランスフェクトした。最初に、５×体積希釈でサプリメントフリーＥＰＩＬＩＦＥ（登録商標）培地を用いて、ＲＮＡを室温で１０分間インキュベートすることにより、ＲＮＡ：ＲＮＡｉＭＡＸＴＭ複合体を生成した。第２のバイアル中で、１０×体積希釈でサプリメントフリーＥＰＩＬＩＦＥ（登録商標）培地を用いて、ＲＮＡＩＭＡＸＴＭ試薬を室温で１０分間インキュベートした。次いで、ＲＮＡバイアルをＲＮＡＩＭＡＸＴＭバイアルと混合して、室温で２０～３０分間インキュベートし、その後、細胞に滴下した。
ヒト角化細胞にトランスフェクトされたＶＥＧＦ－Ａをコードする完全最適化ｍＲＮＡは、天然ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）、各ウリジン部位にプソイドウリジンおよび各シトシン部位に５－メチルシトシン（プソイドＵ／５ｍＣ）、ならびに各ウリジン部位にＮ１－メチル－プソイドウリジンおよび各シトシン部位に５－メチルシトシン（Ｎ１－メチル－プソイドＵ／５ｍＣ）などの翻訳時の修飾を含んでいた。ＶＥＧＦ－ＡをコードするｍｍＲＮＡを細胞にトランスフェクトし、そしてトランスフェクションの６、１２、２４、および４８時間後、製造業者推奨説明書に従って、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））製のＥＬＩＳＡキットを用いて、各濃度について、培養培地中に分泌されたＶＥＧＦ－Ａ濃度（ｐｇ／ｍｌ）を測定した。テーブル１２に示されるこれらのデータは、ＶＥＧＦ－Ａをコードする修飾ｍＲＮＡがヒト角化細胞内で翻訳可能であり、かつＶＥＧＦ－Ａが細胞から輸送されて細胞外環境中に放出されることを示している。

実施例２４．第ＩＸ因子のｉｎ ｖｉｖｏ研究
生理食塩水中に製剤化されたヒト第ＩＸ因子ｍｍＲＮＡ（配列番号８に示されるｍＲＮＡ配列；配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１）（Ｇｅｎ１、完全修飾５－メチルシトシン（ｍｅｔｈｙｃｙｔｏｓｉｎｅ）およびプソイドウリジン）を筋肉内注射によりマウスに送達した。その結果から、投与の１３時間後に測定されるように、第ＩＸ因子タンパク質は、血清中で増加することが実証される。
本研究では、５０μｌの第ＩＸ因子ｍｍＲＮＡ（配列番号８に示されるｍＲＮＡ配列；配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１）、ルシフェラーゼ（配列番号１０に示されるＩＶＴのためのｃＤＮＡ配列）、または製剤緩衝液（Ｆ．緩衝液）を、マウス（第ＩＸ因子ではＮ＝５、ルシフェラーゼ対照または緩衝液対照ではＮ＝３）に、２×１００μｇ／マウスで筋肉内注射した。筋肉内注射の１３時間後、マウスから採血して血清中のヒトポリペプチドの濃度をｐｇ／ｍＬ単位で決定した。その結果から、第ＩＸ因子ｍｍＲＮＡの投与は、ルシフェラーゼまたは緩衝液の対照投与ではいずれも１００ｐｇ／ｍＬ未満の第ＩＸ因子であることとは対照的に、１３時間で１６００ｐｇ／ｍＬのレベルを生じることが判明した。
実施例２５．複数部位投与
Ｇｅｎ１またはＧｅｎ２（５－メチルシトシン（５ｍｃ）およびプソイドウリジン（ψ）修飾、Ｇ－ＣＳＦ－Ｇｅｎ１；またはＮ１－５－メチルシトシン（Ｎ１－５ｍｃ）およびψ修飾、Ｇ－ＣＳＦ－Ｇｅｎ２）のいずれかで修飾され、かつ生理食塩水中で製剤化された、ヒトＧ－ＣＳＦ ｍｍＲＮＡ（配列番号４に示されるｍＲＮＡ配列；配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１）を、筋肉内（ＩＭ）注射または皮下（ＳＣ）注射によりマウスに送達した。３日間（２４時間間隔）にわたり毎日、４回または２×５０μｇ（２つの部位）の注射を行った。４回目は、血液採取およびＣＢＣ分析の６時間前に投与した。対照は、ルシフェラーゼ（配列番号１０に示されるＩＶＴのためのｃＤＮＡ配列）または製剤緩衝液（Ｆ．緩衝液）を含んでいた。１回目のｍｍＲＮＡ注射の７２時間後（最後のｍｍＲＮＡの６時間後）、マウスから採血して、好中球数に及ぼすｍｍＲＮＡコードヒトＧ－ＣＳＦの影響を調べた。投与レジメンは、テーブル１３に示されており、得られた好中球数（１０００／μＬ）も示されている。アステリスクは、ｐ＜０．０５で統計的に有意であることを示す。
筋肉内投与の場合、３日目において、Ｇｅｎ１ Ｇ－ＣＳＦ ｍｍＲＮＡでは好中球数が対照の４倍に増大し、Ｇｅｎ２ Ｇ－ＣＳＦ ｍｍＲＮＡでは２倍に増大することが、データから明らかである。皮下投与の場合、３日目において、データは、Ｇｅｎ２ Ｇ－ＣＳＦ ｍｍＲＮＡでは好中球数が対照の２倍に増大することが、データから明らかである。

実施例２６．静脈内投与
５－メチルシトシン（５ｍｃ）およびプソイドウリジン（ψ）で修飾されたまたは修飾を有しない、かつ１０％のリポプレックス（ＲＮＡＩＭＡＸＴＭ）中で製剤化されたヒトＧ－ＣＳＦ ｍｍＲＮＡ（配列番号４に示されるｍＲＮＡ配列；配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１）を、０、２、および４日目に、５０μｇ ＲＮＡの用量および１００μｌの量で、静脈内（ＩＶ）注射を介してマウスに送達した。１、５、および８日目に、好中球数を測定した。対照は、非特異的哺乳動物ＲＮＡまたは製剤緩衝液単独（Ｆ．緩衝液）を含んでいた。１、５、および８日目に、マウスから採血して、好中球数を増加させるｍｍＲＮＡコードヒトＧ－ＣＳＦの効果を調べた。投与レジメンは、テーブル１４に示されており、得られた好中球数（１０００／μＬ、Ｋ／μＬ）も示されている。
静脈内投与の場合、５日目において、Ｇ－ＣＳＦ ｍｍＲＮＡでは、好中球数が対照の５倍に増大するが、非修飾Ｇ－ＣＳＦ ｍＲＮＡ対照または非特異的対照では、増大しないことが、データから明らかである。血球数は、最後の注射の４日後、ベースラインに戻った。白血球集団の他の変化は、観測されなかった。アステリスクは、緩衝液と比較してｐ＜０．００１で統計的に有意であることを示している。

実施例２７．生理食塩水製剤：筋肉内投与
ヒトＧ－ＣＳＦ ｍｍＲＮＡ（配列番号４に示されるｍＲＮＡ配列；配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１）およびヒトＥＰＯ ｍｍＲＮＡ（配列番号７に示されるｍＲＮＡ配列；配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１）、Ｇ－ＣＳＦ ｍｍＲＮＡ（５－メチルシトシン（５ｍｃ）およびプソイドウリジン（ψ）で修飾）およびＥＰＯ ｍｍＲＮＡ（Ｎ１－５－メチルシトシン（Ｎ１－５ｍｃ）およびψ修飾で修飾）を生理食塩水中で製剤化し、１００μｇの用量で筋肉内（筋肉内）注射を介して、マウスに送達した。
対照は、ルシフェラーゼ（配列番号１０に示されるＩＶＴ ｃＤＮＡ配列）または製剤緩衝液（Ｆ．緩衝液）を含んでいた。注射の１３時間後、マウスから採血して、ｐｇ／ｍＬ単位で血清中ヒトポリペプチドの濃度を決定した（Ｇ－ＣＳＦグループでは、マウス血清中のヒトＧ－ＣＳＦを測定し、ＥＰＯグループでは、マウス血清中でヒトＥＰＯを測定した）。データをテーブル１５に示す。

実施例２８．ＥＰＯ複数回用量／複数回投与
一時点で複数の筋肉内注射部位を利用する研究を設計および実施した。
単回複数回用量（投与）実験の設計は、生理食塩水に加えて投与される、ヒトエリトロポイエチン（ＥＰＯ）ｍｍＲＮＡ（配列番号７に示されるｍＲＮＡ配列；配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１）またはＧ－ＣＳＦ（配列番号４に示されるｍＲＮＡ配列；配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１）を使用することを含むものであった。投与媒体（Ｆ．緩衝液）を対照として使用した。ＥＰＯおよびＧ－ＣＳＦ ｍｍＲＮＡを、各シトシン部位では５－メチルシトシン置換および各ウリジン部位ではプソイドウリジン置換で修飾した。
動物（ｎ＝５）（スプラーグドーリーラット）に１００μｇの単回単位用量（一方の大腿に送達）でＩＭ（筋肉内）注射を行った。複数回投与では、ＥＰＯおよびＧ－ＣＳＦ ｍｍＲＮＡの両方で、１００μｇの６回投与（両方の大腿に送達）を使用した。対照投与は、単回投与で、緩衝液の使用を含んでいた。注射の１３時間後、ヒトＥＰＯの血中レベルを評価した。
Ｉ．Ｍ．の１３時間後、ヒトＥＰＯタンパク質をラット血清中で測定した。５つのグループのラットを処置および評価した。結果はテーブル１６に示される。

実施例２９．シグナル配列交換研究
修飾ヌクレオチドのプソイドウリジンおよび５－メチルシトシン（プソイドＵ／５ｍＣ）を用いて、ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）（配列番号４に示されるｍＲＮＡ配列；配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１）をコードするｍｍＲＮＡのいくつかの変異体を合成した。これらの変異体は、野生型Ｎ末端分泌シグナルペプチド配列（ＭＡＧＰＡＴＱＳＰＭＫＬＭＡＬＱＬＬＬＷＨＳＡＬＷＴＶＱＥＡ；配列番号１３）をコードするＧ－ＣＳＦ構築物、分泌シグナルペプチド配列をコードしないＧ－ＣＳＦ構築物、または他のｍＲＮＡから取り出され分泌シグナルペプチド配列をコードするＧ－ＣＳＦ構築物を含んでいた。これらは、野生型ＧＣＳＦシグナルペプチド配列が、ヒトα－１－抗トリプシン（ＭＭＰＳＳＶＳＷＧＩＬＬＬＡＧＬＣＣＬＶＰＶＳＬＡ、配列番号１４）、ヒト第ＩＸ因子（ＭＱＲＶＮＭＩＭＡＥＳＰＳＬＩＴＩＣＬＬＧＹＬＬＳＡＥＣＴＶＦＬＤＨＥＮＡＮＫＩＬＮＲＰ Ｒ、配列番号１５）、ヒトプロラクチン（ＭＫＧＳＬＬＬＬＬＶＳＮＬＬＬＣＱＳＶＡＰ、配列番号１６）、またはヒトアルブミン（ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＧＶＦＲＲ、配列番号１７）のいずれかのシグナルペプチド配列と置き換えられた配列を含んでいた。
１μｌのリポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００）（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いて、２４ウェルプレート（各ウェルは３００，０００細胞を含有する）中で、各Ｇ－ＣＳＦ変異体をコードする２５０ｎｇの修飾ｍＲＮＡを、ＨＥＫ２９３Ａ（表中の２９３Ａ）、マウス筋芽細胞（表中のＭＭ）（Ｃ２Ｃ１２、ＣＲＬ－１７７２、ＡＴＣＣ）、およびラット筋芽細胞（表中のＲＭ）（Ｌ６系、ＣＲＬ－１４５８、ＡＴＣＣ）細胞系にトランスフェクトした。２４時間後、上清を採取し、そして、ヒトＧ－ＣＳＦ ＥＬＩＳＡキット（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いたＥＬＩＳＡにより、分泌されたＧ－ＣＳＦタンパク質を分析した。テーブル１７に示されるデータから、アルブミンシグナルペプチドをコードするＧ－ＣＳＦ ｍｍＲＮＡでトランスフェクトされた細胞は、その野生型対応物の少なくとも１２倍のＧ－ＣＳＦタンパク質を分泌することが明らかである。

実施例３０．サイトカイン研究：ＰＢＭＣ
ＰＢＭＣ単離物および培地： ２名のドナーに由来する５０ｍＬのヒト血液を、ヘパリンナトリウムチューブ中で、リサーチ・ブラッド・コンポーネンツ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）（ロットＫＰ３０９２８およびＰ３０９３１）から入手した。ドナーごとに、血液をプールし、ＤＰＢＳ（ＳＡＦＣバイオサイエンス（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）５９３３１Ｃ、ロット０７１Ｍ８４０８）で７０ｍＬに希釈し、２つの５０ｍＬコニカルチューブに等しく分割した。１０ｍＬのフィコールパック（Ｆｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ）（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）１７－５４４２－０３、ロット１００７４４００）を血液層の下に穏やかに供給した。低加速および低ブレーキで、２０００ｒｐｍで３０分間チューブを遠心分離した。チューブを取り出し、バフィーコートＰＭＢＣ層を穏やかに新しい５０ｍＬコニカルに移し、そしてＤＰＢＳで洗浄した。チューブを１４５０ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
上清を吸引し、ＰＢＭＣペレットを再懸濁させ、５０ｍＬのＤＰＢＳ中で洗浄した。チューブを１２５０ｒｐｍで１０分間遠心分離した。この洗浄工程を繰り返し、ＰＢＭＣペレットを１９ｍＬのオプティメンＩ（Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ）（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）１１０５８、ロット１０７２０８８）中に再懸濁させ、そしてカウントした。細胞懸濁液を３．０×１０６細胞／ｍＬ生細胞の濃度に調整した。
次いで、これらの細胞をドナーごとに、５つの９６ウェル組織培養処理丸底プレート（コスター３７９９（Ｃｏｓｔａｒ ３７９９））上に、５０μＬ／ウェルでプレーティングした。３０分以内に、トランスフェクション混合物を５０μＬ／ウェルの体積で各ウェルに添加した。トランスフェクションの４時間後、１０μＬのウシ胎仔血清（ギブコ１００８２（Ｇｉｂｃｏ １００８２）、ロット１０１２３６））を培地に追加した。
トランスフェクション調製物： ヒトＧ－ＣＳＦをコードするｍｍＲＮＡ（配列番号４に示されるｍＲＮＡ配列；配列には示されていない約１６０ヌクレオチドのポリＡテール；５’キャップ、Ｃａｐ１）（（１）天然ＮＴＰ、（２）５－メチルシチジンおよびプソイドウリジンで１００％置換、または（３）５－メチルシチジンおよびＮ１－メチルプソイドウリジンで１００％置換のいずれかを含有する）、ルシフェラーゼをコードするｍｍＲＮＡ（配列番号１０に示されるＩＶＴ ｃＤＮＡ配列）（（１）天然ＮＴＰまたは（２）５－メチルシチジンおよびプソイドウリジンで１００％置換のいずれかを含有する）、およびＴＬＲアゴニストＲ８４８（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ ｔｌｒｌ－ｒ８４８）を、最終体積２５００μＬのオプティメンＩ（Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ）中で３８．４ｎｇ／μＬに希釈した。
独立して、４３２μＬのリポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１１６６－０２７、ロット１０７０９６２）を１３．１ｍＬのオプティメンＩ（Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ）で希釈した。９６ウェルプレート中で、各ｍｍＲＮＡの１３５μＬの９アリコート、陽性対照（Ｒ－８４８）、または陰性対照（オプティメンＩ（Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ））を１３５μＬの希釈リポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００）に添加した。トランスフェクトされる材料を含有するプレートを２０分間インキュベートした。次いで、トランスフェクション混合物を５０μＬ／ウェルでヒトＰＢＭＣプレートのそれぞれに移した。次いで、プレートを３７Ｃでインキュベートした。２、４、８、２０、および４４時間で、各プレートをインキュベーターから取り出して、上清を凍結させた。
最後のプレートを取り出した後、ヒトＧ－ＣＳＦ ＥＬＩＳＡキット（インビトロジェンＨＣ２０３２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＨＣ２０３２））およびヒトＩＦＮαＥＬＩＳＡキット（サーモサイエンィフィック４１１０５－２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ４１１０５－２））を用いて、上清をアッセイした。各条件は、二重試験方式で行った。
結果： コードされたタンパク質を産生する非修飾および修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の能力を経時的に評価し（Ｇ－ＣＳＦ産生）、同様に、インターフェロンα産生により測定される先天性免疫認識を引き起こすｍＲＮＡの能力も評価した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＢＭＣ培養物の使用は、オリゴヌクレオチドの免疫刺激能を測定する一般に認められた方法である（ロビンス（Ｒｏｂｂｉｎｓ）ら著、オリゴヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）２００９年 第１９巻：８９－１０２頁）。
４パラメーターロジスティック曲線当てはめを用いて、各ＥＬＩＳＡプレートの標準曲線に対して結果を補間した。テーブル１８および１９に示されるのは、特異的ＥＬＩＳＡにより測定したときの経時的なＧ－ＣＳＦおよびＩＦＮ－αの産生の２つの個別のＰＢＭＣドナーからの平均である。
Ｇ－ＣＳＦ ＥＬＩＳＡでは、未処置条件のリポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００）からのバックグラウンドシグナルを各時点で引き算した。このデータから、ヒト末梢血単核によるヒトＧ－ＣＳＦタンパク質の特異的産生は、天然ＮＴＰ、５－メチルシチジンおよびプソイドウリジンによる１００％置換、または５－メチルシチジンおよびＮ１－メチルプソイドウリジンによる１００％置換を含有するＧ－ＣＳＦ ｍＲＮＡで見られることが実証された。Ｇ－ＣＳＦの産生は、修飾ｍＲＮＡの使用により、非修飾ｍＲＮＡと対比して有意に増大され、５－メチルシチジンおよびＮ１－メチルプソイドウリジンを含有するＧ－ＣＳＦ ｍｍＲＮＡは、最高レベルのＧ－ＣＳＦ産生を示した。先天性免疫認識に関して、非修飾ｍＲＮＡは、実質的なＩＦＮα産生をもたらすが、修飾ｍＲＮＡは、主にインターフェロン－α産生を防止した。

実施例３１．エキソソーム中の定量
本発明に係るｍｍＲＮＡの量および局在化は、単離されたエキソソーム中で量（初期、中間、または最終）を測定することにより決定可能である。本研究では、ｍｍＲＮＡは、典型的には、コドンが最適化されており、かつ内因性ｍＲＮＡと配列が異なるので、ｍｍＲＮＡのレベルは、ギビングス（Ｇｉｂｂｉｎｇｓ）の方法（国際出願ＰＣＴ／ＩＢ２００９／００５８７８号（それらの内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる））を用いて、天然または野生型ｍＲＮＡの内因性レベルと比較して定量される。
これらの研究では、この方法は、最初に、エキソソームまたはベシクル（好ましくは、本発明に係るポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡですでに治療された患者の体液に由来するもの）を単離することと、次いで、前記エキソソーム中のポリヌクレオチド、一次構築物、またはｍｍＲＮＡのレベルを、ｍＲＮＡマイクロアレイ、ｑＲＴ－ＰＣＲ、または、好適な抗体法もしくは免疫組織化学的方法によるものを含む当技術分野の他のＲＮＡ測定手段により、測定することによって行われる。
実施例３２：二機能性ｍｍＲＮＡ
本明細書に記載の教示および合成方法を用いて、修飾ＲＮＡは、二機能性になるように設計および合成され、それにより、１つ以上の細胞傷害性タンパク質分子をコードしたり、さらには細胞傷害性ヌクレオシドを用いて合成されたりするようになる。
二機能性修飾ｍＲＮＡの投与は、生理食塩水または脂質担体のいずれかを用いて行われる。投与されると、二機能性修飾ｍＲＮＡは、翻訳されて、コード細胞傷害性ペプチドを産生する。送達された修飾ｍＲＮＡが分解されると、細胞傷害性ヌクレオシドが放出されて、それもまた、対象に対して治療効果を発揮する。
実施例３３．修飾ｍＲＮＡの合成
修飾ｍＲＮＡは、市販のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ転写キット（メガスクリプト（登録商標）・ハイイールド・トランスフェクトョン・キット（ＭＥＧＡＳＣＲＩＰＴ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＫＩＴ）、アンビオン（ＡＭＢＩＯＮＲ）、テキサス州オースティン（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）；ムスクリプトＴＭ・ｍＲＮＡプロダンクション・キット（ＭＳＣＲＩＰＴＴＭ ｍＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）、エピセンター（登録商標）（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標））、バイオテクノロジーズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ウィスコンシン州マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｌ））を用いて、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含有するｃＤＮＡ鋳型から産生される。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応は、１～２μｇの線形化プラスミドの形態の鋳型ＤＮＡ、ＰＣＲ産物、または二本鎖ポリメラーゼプロモーター領域を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを含有する。鋳型ＤＮＡは、強いコンセンサスコザック配列またはＥＭＣＶ ＩＲＥＳを含む最適化高発現ＩＲＥＳなどの強い翻訳開始配列をコードする。反応空間は、２０～４０μｌであり、決められた修飾アデニン、グアニン、シチジン、およびウリジンリボヌクレオチドアナログの最適化リボヌクレオチド混合物に加えて３’－ＯＭｅ－ｍ７－Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ ＡＲＣＡキャップアナログ（ニューイングランド・バイオラボ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ）（登録商標））を含有する。ヌクレオチドの最終反応濃度は、キャップアナログが６ｍＭであり、他のヌクレオチドのそれぞれが１．５～７．５ ｍＭである。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応の温度および持続期間は、効率、忠実度、および収率に関して最適化される。反応は、３７℃で３～６時間から１６時間までインキュベートされうる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応後、キャップ化ｍＲＮＡは、市販のポリＡテーリングキット（エピセンター（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）（登録商標）バイオテクノロジーズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ウィスコンシン州マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を用いてポリアデニル化を受ける。得られたキャップ化およびポリアデニル化された合成ｍＲＮＡは、次いで、全長産物の産生を確認するために、変性アガロースゲル電気泳動により精製され、任意の分解産物を除去するために、続いて、スピンカラム濾過に付される（ＲＮｅａｓｙキット、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）、メガクリアＴＭアンビオン（登録商標）（ＭＥＧＡＣＬＥＡＲＴＭ ＡＭＢＩＯＮ（登録商標））、テキサス州オースティン（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ））。精製された合成ｍＲＮＡは、ＲＮアーゼ阻害剤（ＲＮＡＳＩＮ（登録商標）プラスＲＮアーゼ阻害剤、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を含有するＲＮアーゼフリー水中で再懸濁され、ナノドロップＴＭ（ＮＡＮＯＤＲＯＰ）ＴＭ（サーモサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ユタ州ローガン（Ｌｏｇａｎ，ＵＴ））により定量され、－２０℃で貯蔵される。
実施例３４：細胞培養物中への修飾ｍＲＮＡのバルクトランスフェクション
Ａ．カチオン性脂質送達媒体
ＲＮＡトランスフェクションは、ＲＮＡＩＭＡＸ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））またはＴＲＡＮＳＩＴ－ｍＲＮＡ（ミラスバイオ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）、ウィスコンシン州マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ））のカチオン性脂質送達媒体を用いて、行われる。ＲＮＡおよび試薬は、最初に、オプティメン（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ）基礎培地（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））中で希釈される。１００ｎｇ／μＬ ＲＮＡは、５×希釈され、１μｇのＲＮＡあたり５μＬのＲＮＡＩＭａｘは、１０×希釈される。希釈された成分は、プールされ、培養培地に分配される前に室温で１５分間インキュベートされる。ＴＲＡＮＳＩＴ－ｍＲＮＡトランスフェクションでは、１００ｎｇ／μＬ ＲＮＡは、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ中に１０×希釈され、ＢＯＯＳＴ試薬が添加され（１μｇのＲＮＡあたり２の濃度で）、ＴＲＡＮＳＩＴ－ｍＲＮＡが添加され（１μｇのＲＮＡあたり２μＬの濃度で）、次いで、室温で２分間インキュベートした後、ＲＮＡ脂質複合体が培養培地に送達される。ＲＮＡトランスフェクションは、ＲｉＰＳ誘導では、ニュートリステム（Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ）キセノフリーｈＥＳ媒体（ステムセンター（ＳＴＥＭＧＥＮＴＲ）、マサチューセッツ州ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ））中で行われ、角化細胞実験では、真皮細胞基礎培地プラス角化細胞増殖キット（ＡＴＣＣ）で行われ、そしてすべての他の実験では、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭプラス２％ＦＢＳで行われる。宿主細胞中での修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の奏効的導入は、種々の公知の方法を用いて、たとえば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光マーカーを用いて、モニター可能である。修飾ｍＲＮＡの奏効的トランスフェクションもまた、たとえば、ウェスタンブロッティングまたは免疫細胞化学により、標的ポリペプチドのタンパク質発現レベルを測定することにより、決定可能である。類似のＲＮＡ－脂質複合体比に従って、１リットル超（５～１０，０００Ｌ）の大量培養にスケールアップするために、類似の方法に従いうる。
Ｂ．外因性合成ｍＲＮＡ転写物の電気穿孔（エレクトロポレーション）送達
電気穿孔パラメーターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）転写物を用いてＭＲＣ－５線維芽細胞をトランスフェクトしてから、外因性転写物を特異的に検出するように設計されたプライマーを用いた定量的ＲＴ－ＰＣＲによりトランスフェクション効率を測定することにより、最適化される。標準的電気穿孔キュベット内で、１５０ｕＦ充電キャパシターを放電して、５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））中に懸濁された２．５×１０６細胞中に導入する。高い生存能（＞７０％）を維持しながら、標準曲線法を用いて決定したときに１細胞あたり１０，０００コピー超の修飾ｍＲＮＡ転写物が繰返し送達されるようにするのに、２ｍｍのギャップで十分である。さらなる実験によれば、ｍｍＲＮＡ転写物を細胞に効率的にトランスフェクトするのに必要な電圧は、電気穿孔時の細胞密度に依存しうることが明らかにされよう。細胞密度は、１×１０６細胞／５０μｌから２．５×１０６の密度までさまざまであろう。また、転写コピー数／細胞で測定される類似の効率で細胞をトランスフェクトするには１１０Ｖ～１４５Ｖが必要となろう。何リットルもの大量（５～１０，０００Ｌ）の電気穿孔は、以上に記載の制約のある記載の方法に類似した大量フローエレクトロポレーション戦略と同様に行われうる（リー（Ｌｉ）ら著、２００２年；ゲング（Ｇｅｎｇ）ら著、２０１０年）。
実施例３５．樹立ＣＨＯ細胞系におけるセラミド輸送タンパク質の過剰発現による治療用抗体タンパク質産生の増大
Ａ．バッチ培養
ヒト化治療用ＩｇＧ抗体を分泌する抗体産生ＣＨＯ細胞系（ＣＨＯ ＤＧ４４）は、脂質カチオン性送達剤単独（対照）、または野生型セラミド輸送タンパク質（ＣＥＲＴ）をコードする合成ｍＲＮＡ転写物、または非リン酸化コンピテントなＳｅｒ１３２Ａ ＣＥＲＴ突然変異体で、１回トランスフェクトされる。配列は、たとえば、米国特許出願第１３／２５２，０４９号明細書（それらの内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。ＣＥＲＴは、哺乳動物細胞内の必須サイトゾルタンパク質であり、スフィンゴ脂質セラミドを小胞体からゴルジ体に移動させ、そこで、スフィンゴ脂質セラミドはスフィンゴミエリンに変換される（ハナダ（Ｈａｎａｄａ）ら、２００３年）。ＣＥＲＴの過剰発現は、形質膜への分泌タンパク質の輸送を有意に増強し、真核細胞から分泌経路を介して輸送されるタンパク質の産生を改善し、それにより培養培地中へのタンパク質の分泌を増強する。合成ｍＲＮＡ転写物は、２～５：１の担体：ＲＮＡ比で脂質カチオン性送達剤と予備混合される。初期接種密度は、約２×１０５個の生存可能細胞／ｍＬである。合成ｍＲＮＡ転写物は、指数関数的培養増殖期の初期培養接種後に送達されて、１細胞あたり１０×１０２～１０×１０３個の最終合成ｍＲＮＡコピー数に達する。すべての相の細胞接種物の生成におよびバイオリアクター内での培養物の増殖に使用される基礎細胞培養培地は、グルタミン、重炭酸ナトリウム、インスリン、およびメトトレキセートを含有する改変ＣＤ－ＣＨＯ培地であった。培地のｐＨは、すべての成分を添加した後、１Ｎ ＨＣｌまたは１Ｎ ＮａＯＨを用いて、７．０に調整された。培養運転期間は、７、１４、２１、または２８日目＋で終了した。製造レベルの５０Ｌスケールリアクター（２つの海洋インペラーを備えたステンレス鋼リアクター）が使用された。また、１０，０００Ｌを超えるステンレス鋼リアクター（２００２年１２月２３日出願の同一譲受人の米国特許出願第６０／４３６，０５０号明細書、および米国特許出願第１０／７４０，６４５号明細書に記載されている）に拡張可能である。データ取得システム（インテルーション・フィックス３２（Ｉｎｔｅｌｌｕｔｉｏｎ Ｆｉｘ ３２））は、全運転期間を通じて、温度、ｐＨ、および溶存酸素（ＤＯ）を記録した。ガス流量は、ロータメーターにより制御された。ＣＯ２除去のため、浸漬フリット（５μｍ細孔サイズ）を介しかつリアクターヘッドスペースを通じて空気がスパージングされた。ＤＯ制御のために、同一のフリットを介して分子状酸素がスパージングされた。ＣＯ２は、ｐＨ調整に使用される場合、同一のフリットを介してスパージングされた。細胞のサンプルは、リアクターから毎日取り出された。細胞計数に使用されたサンプルは、トリパンブルー（ジクマ（Ｓｉｇｍａ）（セントルイス，Ｍｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）））で染色された。細胞数および細胞生存能の決定は、顕微鏡を用いた血球計算法により行われた。代謝物の分析では、細胞分離のために、追加サンプルを２０００ｒｐｍ（４℃）で２０分間遠心分離した。次のパラメーター、すなわち、力価、シアル酸、グルコース、乳酸、グルタミン、グルタミン酸、ｐＨ、ｐＯ２、ｐＣＯ２、アンモニア、および任意選択的に乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）に関して、上清を分析した。追加のバックアップサンプルを－２０℃で凍結した。分泌ヒト化ＩｇＧ抗体力価を測定するために、すべての安定な細胞プールのシードストック培養物から上清を取得し、ＥＬＩＳＡによりＩｇＧ力価を決定し、細胞の平均数で割り算して特異的生産性を計算する。最高値は、Ｓｅｒ１３２Ａ ＣＥＲＴ突然変異体を有する細胞プールであり、続いて、野生型ＣＥＲＴである。両方とも、ＩｇＧ発現は、担体単独または非トランスフェクト細胞と比較して著しく増強される。
連続培養またはバッチフェド培養
ヒト化ＩｇＧ抗体を分泌する抗体産生ＣＨＯ細胞系（ＣＨＯ ＤＧ４４）は、脂質カチオン性送達剤単独（対照）、または野生型セラミド輸送タンパク質をコードする合成ｍＲＮＡ転写物、または非リン酸化コンピテントＳｅｒ１３２Ａ ＣＥＲＴ突然変異体でトランスフェクトされる。合成ｍＲＮＡ転写物は、２～５：１の担体：ＲＮＡ比で脂質カチオン性送達剤と予備混合される。初期接種密度は、約２×１０５個の生存可能細胞／ｍＬであった。合成ｍＲＮＡ転写物は、指数関数的培養増殖期の初期培養接種後に送達されて、１細胞あたり１０×１０２～１０×１０３個の最終合成ｍＲＮＡコピー数に達する。すべての相の細胞接種物の生成におよびバイオリアクター内での培養物の増殖に使用される基礎細胞培養培地は、グルタミン、重炭酸ナトリウム、インスリン、およびメトトレキセートを含有する改変ＣＤ－ＣＨＯ培地であった。培地のｐＨは、すべての成分を添加した後、１Ｎ ＨＣｌまたは１Ｎ ＮａＯＨを用いて、７．０に調整された。最大ＣＥＲＴタンパク質産生および分泌ヒト化ＩｇＧ抗体曲線を得るために、５Ｌスケール（１つの海洋インペラーを備えたガラスリアクター）のバイオリアクターを使用した。連続培養またはフェドバッチ培養では、運転時に新しい培地で１日１回以上（または連続的に）培養培地を補うことにより、培養運転期間が延長される。連続供給レジメンおよびフェドバッチ供給レジメンでは、培養物は、培養物中で適切量の合成ｍＲＮＡ：担体を達成かつ維持するために、時限方式、規則方式、および／またはプログラム方式で、連続供給注入または培養物への他の自動添加として、供給培地を受け取る。好ましい方法は、培養運転の開始日から細胞の収集日まで、毎日の培養運転で、合成ｍＲＮＡ：担体を含有する供給媒体で１日１回のポーラス供給を行う供給レジメンである。１日供給量は、バッチシート上に記録された。製造レベルの５０Ｌスケールリアクター（２つの海洋インペラーを備えたステンレス鋼リアクター）を使用することが可能であり、１０，０００Ｌを超えるステンレス鋼リアクターに拡張可能である。データ取得システム（インテルーション・フィックス３２（Ｉｎｔｅｌｌｕｔｉｏｎ Ｆｉｘ ３２））は、全運転期間を通じて、温度、ｐＨ、および溶存酸素（ＤＯ）を記録した。ガス流量は、ロータメーターにより制御された。ＣＯ２除去のため、浸漬フリット（５μｍ細孔サイズ）を介しかつリアクターヘッドスペースを通じて空気がスパージングされた。ＤＯ制御のために、同一のフリットを介して分子状酸素がスパージングされた。ＣＯ２は、ｐＨ調整に使用される場合、同一のフリットを介してスパージングされた。細胞のサンプルは、リアクターから毎日取り出された。細胞計数に使用されたサンプルは、トリパンブルー（ジクマ（Ｓｉｇｍａ）（セントルイス，Ｍｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）））で染色された。細胞数および細胞生存能の決定は、顕微鏡を用いた血球計算法により行われた。代謝物の分析では、細胞分離のために、追加サンプルを２０００ｒｐｍ（４℃）で２０分間遠心分離した。次のパラメーター、すなわち、力価、シアル酸、グルコース、乳酸、グルタミン、グルタミン酸、ｐＨ、ｐＯ２、ｐＣＯ２、アンモニア、および任意選択的に乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）に関して、上清を分析した。追加のバックアップサンプルを－２０℃で凍結した。分泌ヒト化ＩｇＧ抗体力価を測定するために、すべての安定な細胞プールのシードストック培養物から上清を取得し、ＥＬＩＳＡによりＩｇＧ力価を決定し、細胞の平均数で割り算して特異的生産性を計算する。最高値は、Ｓｅｒ１３２Ａ ＣＥＲＴ突然変異体を有する細胞プールであり、続いて、野生型ＣＥＲＴである。両方とも、ＩｇＧ発現は、担体単独または非トランスフェクト細胞と比較して著しく増強される。
実施例３６．治療剤としてのヒトエリトロポイエチンを発現する哺乳動物細胞系のｄｅ
ｎｏｖｏ産生
Ａ．バッチ培養
この実施例は、培養初代ＣＨＯ細胞からのヒトエリトロポイエチンタンパク質（ＥＰＯ）の産生を記述する。エリトロポイエチンは、赤血球合成のために必要とされる糖タンパク質ホルモンである。ＥＰＯタンパク質は、治療剤として、癌、心不全、慢性腎疾患、および骨髄形成異常に起因する貧血に使用されうる。初代ＣＨＯ細胞は、記載のとおり単離および培養される（ツジオ（Ｔｊｉｏ）およびパック（Ｐｕｃｋ）著、１９５８年）。次いで、Ｔ－７５フラスコ（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ニューヨーク州コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎ．Ｙ．））ならびに２５０および５００ｍＬスピナー（Ｂｅｌｌｃｏ，Ｖｉｎｅｌａｎｄ， Ｎ．Ｊ．）を用いて、グルタミン、重炭酸ナトリウム、インスリンおよびメトトレキセート（実施例３５参照）を含有する修飾ＣＤ－ＣＨＯ培地中で、初代ＣＨＯ細胞を増殖させた。６％ＣＯ２中、３７℃でＴフラスコおよびスピナーをインキュベートした。十分な接種物を生成させた後、以上に記載の５Ｌまたは５０Ｌバイオリアクターのいずれかに、培養物を移した（実施例３５参照）。ヒトエリトロポイエチンタンパク質をコードする合成ｍＲＮＡ転写物を、最小限１％全培養量で２～５：１の担体：ＲＮＡ比で脂質カチオン性送達剤と予備混合する。初期接種密度は、約２×１０５個の生存可能細胞／ｍＬである。合成ｍＲＮＡ転写物は、指数関数的培養増殖期の初期培養接種後に送達されて、１細胞あたり１０×１０２～１０×１０３個の最終合成ｍＲＮＡコピー数に達する。培養増殖および分析は以上に記載したように行われた（実施例３４参照）。
Ｂ．連続培養またはバッチフェド培養
以上に記載したように誘導および増殖させた初代ＣＨＯ細胞系（実施例参照３６ａ）を、脂質カチオン性送達剤単独で（対照）、またはヒトエリトロポイエチンタンパク質をコードする合成ｍＲＮＡ転写物）で、トランスフェクトした。合成ｍＲＮＡ転写物は、２～５：１の担体：ＲＮＡ比で脂質カチオン性送達剤と予備混合される。初期接種密度は、約２×１０５個の生存可能細胞／ｍＬであった。合成ｍＲＮＡ転写物は、指数関数的培養増殖期の初期培養接種後に送達されて、１細胞あたり１０×１０２～１０×１０３個の最終合成ｍＲＮＡコピー数に達する。培養条件は、記載のとおりであった（実施例３５ａ）。連続培養またはフェドバッチ培養では、運転時に新しい培地で１日１回以上（または連続的に）培養培地を補うことにより、培養運転期間が延長される。連続供給レジメンおよびフェドバッチ供給レジメンでは、培養物は、培養物中で適切量の合成ｍＲＮＡ：担体を達成かつ維持するために、時限方式、規則方式、および／またはプログラム方式で、連続供給注入または培養物への他の自動添加として、供給培地を受け取る。好ましい方法は、培養運転の開始日から細胞の収集日まで、毎日の培養運転で、合成ｍＲＮＡ：担体を含有する供給媒体で１日１回のポーラス供給を行う供給レジメンである。１日供給量は、バッチシート上に記録された。製造レベルの５０Ｌスケールリアクター（２つの海洋インペラーを備えたステンレス鋼リアクター）を使用することが可能であり、１０，０００Ｌを超えるステンレス鋼リアクターに拡張可能である。培養増殖および分析は、本明細書に記載されるように行った（実施例３５参照）。
使用されてきた語は、限定ではなく説明を行う語であり、本発明の真の範囲および趣旨から逸脱することなく、そのより広い態様で、添付の特許請求の範囲内で、変更を加えうることを理解されたい。
いくつかの記載の実施形態に関してかなり詳細にかなり具体的に記載してきたが、いかなるそのような特定事項もしくは実施形態またはいかなる特定の実施形態にも限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲を参照しながら、先行技術を考慮して、そのような特許請求の範囲の可能なかぎり最広義の解釈を提供するように、したがって、本発明の意図された範囲を効果的に包含するように、解釈されるものとする。
本明細書に記載の刊行物、特許出願、特許、および他の引用文献はすべて、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾を生じた場合、定義を含む本明細書に従うものとする。それに加えて、見出し項目、材料、方法、および実施例は、例示的なものにすぎず、それらに限定しようとするものではない。

Claims (26)

  1. 目的のポリペプチドを、それを必要とする哺乳動物対象の細胞、組織、または体液において産生する方法であって、
    ポリヌクレオチドを含む医薬組成物を前記対象に投与することを含み、前記ポリヌクレオチドが、配列番号４、７、８、および１２からなる群から選択される配列を含む方法。
  2. 前記ポリヌクレオチドが、５’Ｃａｐ１構造および約１６０ヌクレオチド長のポリＡテールをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記医薬組成物が製剤化される、請求項２に記載の方法。
  4. 製剤が、生理食塩水製剤または脂質製剤から選択される、請求項３に記載の方法。
  5. 前記製剤が、生理食塩水製剤であり、かつ静脈内、筋肉内、皮下、および局所からなる群から選択される経路により投与される、請求項４に記載の方法。
  6. 前記製剤が、脂質製剤であり、かつ静脈内、筋肉内、皮下、および局所からなる群から選択される経路により投与される、請求項４に記載の方法。
  7. 前記製剤が、脂質製剤であり、かつリポソーム、リポプレックス、および脂質ナノ粒子からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
  8. 投与の前記経路が筋肉内または皮下であり、かつ前記脂質製剤がコポリマーを含む、請求項６に記載の方法。
  9. 前記コポリマーがＰＬＧＡである、請求項８に記載の方法。
  10. 前記投与が局所である、請求項２に記載の方法。
  11. 前記医薬組成物が、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇの全用量で投与される、請求項１に記載の方法。
  12. 前記投与が、１日３回、１日２回、１日１回、２日に１回、３日に１回、毎週１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、および毎月１回からなる群から選択されるスケジュールに従って行われる、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記全用量が複数回投与により投与される、請求項１１に記載の方法。
  14. 前記複数回投与が、１日３回、１日２回、１日１回、２日に１回、３日に１回、毎週１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、および毎月１回からなる群から選択されるスケジュールに従って行われる、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記目的のポリペプチドのレベルの増加が、組織または体液で８時間以内に観測される、請求項１に記載の方法。
  16. 前記目的のポリペプチドのレベルの増加が、組織または体液で２時間以内に観測される、請求項１に記載の方法。
  17. 前記目的のポリペプチドのレベルの増加が、肝臓、脾臓、腎臓、肺、心臓、腎周囲脂肪組織、胸腺、および筋肉からなる群から選択される組織で観測される、請求項１５に記載の方法。
  18. 前記体液が、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液もしくは射精前液、汗、糞便、毛髪、涙、嚢胞液、胸水および腹水、心嚢液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、水様便、膵液、洞腔洗浄液、気管支肺吸引物、胞胚腔液、ならびに臍帯血からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
  19. 前記ポリヌクレオチドが、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、５－アザ－シチジン、プソイドイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－プソイドイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－プソイドイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－プソイドイソシチジン、４－メトキシ－１－メチル－プソイドイソシチジン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン、および２－メトキシ－アデニン、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、およびＮ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシン、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の修飾を含む、請求項２に記載の方法。
  20. 体液中の修飾ポリヌクレオチドのレベルが、エキソソーム中の修飾ポリヌクレオチドのレベルから決定される、請求項１９に記載の方法。
  21. 単離されたポリヌクレオチドであって、
    前記ポリヌクレオチドが、配列番号４、７、８、および１２からなる群から選択される配列を含む、ポリヌクレオチド。
  22. ５’Ｃａｐ１構造および約１６０ヌクレオチド長のポリＡテールをさらに含む、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。
  23. 請求項２２に記載のポリヌクレオチドを含む医薬組成物。
  24. 製剤化され、かつ製剤が生理食塩水製剤または脂質製剤から選択される、請求項２３に記載の医薬組成物。
  25. 前記製剤が、脂質製剤であり、かつリポソーム、リポプレックス、および脂質ナノ粒子からなる群から選択される、請求項２４に記載の医薬組成物。
  26. 前記ポリヌクレオチドが、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、５－アザ－シチジン、プソイドイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－プソイドイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－プソイドイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－プソイドイソシチジン、４－メトキシ－１－メチル－プソイドイソシチジン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン、および２－メトキシ－アデニン、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、およびＮ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシン、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の修飾を含む、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
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