PL215513B1 - Nowe boranofosforanowe analogi dinukleotydów, ich zastosowanie, czasteczka RNA, sposób otrzymywania RNA oraz sposób otrzymywania peptydów lub bialka - Google Patents
Nowe boranofosforanowe analogi dinukleotydów, ich zastosowanie, czasteczka RNA, sposób otrzymywania RNA oraz sposób otrzymywania peptydów lub bialkaInfo
- Publication number
- PL215513B1 PL215513B1 PL385388A PL38538808A PL215513B1 PL 215513 B1 PL215513 B1 PL 215513B1 PL 385388 A PL385388 A PL 385388A PL 38538808 A PL38538808 A PL 38538808A PL 215513 B1 PL215513 B1 PL 215513B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- formula
- group
- rna
- independently
- borate phosphate
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 32
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 18
- UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N trihydridoboron Substances B UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 30
- 229910000085 borane Inorganic materials 0.000 title description 29
- -1 borane phosphate analogs Chemical class 0.000 title description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 title 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims abstract description 47
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims abstract description 29
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 21
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 14
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- ZSJHIZJESFFXAU-UHFFFAOYSA-N boric acid;phosphoric acid Chemical class OB(O)O.OP(O)(O)=O ZSJHIZJESFFXAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 40
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 29
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 claims description 14
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 14
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims description 14
- 125000004923 naphthylmethyl group Chemical group C1(=CC=CC2=CC=CC=C12)C* 0.000 claims description 13
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 12
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 10
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 9
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 8
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 8
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 claims description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 150000003839 salts Chemical group 0.000 claims description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000003350 kerosene Substances 0.000 claims 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 abstract description 43
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 abstract description 17
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 abstract description 16
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 5
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 abstract description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 4
- 201000003639 autosomal recessive cerebellar ataxia Diseases 0.000 abstract 3
- JRPHGDYSKGJTKZ-UHFFFAOYSA-N selenophosphoric acid Chemical group OP(O)([SeH])=O JRPHGDYSKGJTKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 3
- 101100014154 Arabidopsis thaliana RACK1A gene Proteins 0.000 abstract 1
- 241001421757 Arcas Species 0.000 abstract 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 31
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 30
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 29
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 29
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- 239000000047 product Substances 0.000 description 24
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 22
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical class CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 16
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 108060002636 Eukaryotic Initiation Factor-4E Proteins 0.000 description 14
- 102000005233 Eukaryotic Initiation Factor-4E Human genes 0.000 description 14
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 12
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 12
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 11
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 11
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 11
- XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N Guanosine-5'-triphosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 10
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 10
- AFQIYTIJXGTIEY-UHFFFAOYSA-N hydrogen carbonate;triethylazanium Chemical compound OC(O)=O.CCN(CC)CC AFQIYTIJXGTIEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 10
- XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N rGTP Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 10
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 9
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 9
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 9
- 101150087322 DCPS gene Proteins 0.000 description 8
- 101100386724 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) nhm1 gene Proteins 0.000 description 8
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 8
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 8
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 7
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 7
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 7
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 7
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 7
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 7
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 6
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 6
- INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N iodomethane Chemical compound IC INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 6
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 6
- RQFCJASXJCIDSX-UHFFFAOYSA-N 14C-Guanosin-5'-monophosphat Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O RQFCJASXJCIDSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000180579 Arca Species 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 5
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 5
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 5
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical group [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-O 7-methylguanosine Chemical compound C1=2N=C(N)NC(=O)C=2[N+](C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-O 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000009609 Pyrophosphatases Human genes 0.000 description 4
- 108010009413 Pyrophosphatases Proteins 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 4
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 4
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 4
- 238000011894 semi-preparative HPLC Methods 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000388 Polyphosphate Polymers 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- TVYLOQJEHUAACN-UHFFFAOYSA-N bis(trimethylsilyl) hydrogen phosphite Chemical compound C[Si](C)(C)OP(O)O[Si](C)(C)C TVYLOQJEHUAACN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 3
- RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N guanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 125000001570 methylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])[*:2] 0.000 description 3
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 239000001205 polyphosphate Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- RPACBEVZENYWOL-XFULWGLBSA-M sodium;(2r)-2-[6-(4-chlorophenoxy)hexyl]oxirane-2-carboxylate Chemical compound [Na+].C=1C=C(Cl)C=CC=1OCCCCCC[C@]1(C(=O)[O-])CO1 RPACBEVZENYWOL-XFULWGLBSA-M 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- QRBHRPBSKUPJGF-UUOKFMHZSA-N C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COB(O)O)[C@@H](O)[C@H]1O Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COB(O)O)[C@@H](O)[C@H]1O QRBHRPBSKUPJGF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 101100223333 Caenorhabditis elegans dcap-2 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 101000871498 Homo sapiens m7GpppX diphosphatase Proteins 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000028391 RNA cap binding Human genes 0.000 description 2
- 108091000106 RNA cap binding Proteins 0.000 description 2
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- YKYOUMDCQGMQQO-UHFFFAOYSA-L cadmium dichloride Chemical compound Cl[Cd]Cl YKYOUMDCQGMQQO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 102000050769 human DcpS Human genes 0.000 description 2
- 229940079865 intestinal antiinfectives imidazole derivative Drugs 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 2
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- MBKDYNNUVRNNRF-UHFFFAOYSA-N medronic acid Chemical compound OP(O)(=O)CP(O)(O)=O MBKDYNNUVRNNRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 235000011176 polyphosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 2
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N triphenylphosphine Chemical compound C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Polymers OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VMZOBROUFBEGAR-UHFFFAOYSA-N tris(trimethylsilyl) phosphite Chemical compound C[Si](C)(C)OP(O[Si](C)(C)C)O[Si](C)(C)C VMZOBROUFBEGAR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVYNGSFVYRPRCG-UHFFFAOYSA-N 2'-O-Methylguanosine Natural products COC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC(N)=NC2=O)=C2N=C1 OVYNGSFVYRPRCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVYNGSFVYRPRCG-KQYNXXCUSA-N 2'-O-methylguanosine Chemical compound CO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=C(N)NC2=O)=C2N=C1 OVYNGSFVYRPRCG-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNIZHKITBISILC-RPKMEZRRSA-N 2-amino-9-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)-2-methyloxolan-2-yl]-3h-purin-6-one Chemical compound C1=NC(C(NC(N)=N2)=O)=C2N1[C@]1(C)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O QNIZHKITBISILC-RPKMEZRRSA-N 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 101001082110 Acanthamoeba polyphaga mimivirus Eukaryotic translation initiation factor 4E homolog Proteins 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 241000244186 Ascaris Species 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N Dimethyl sulfide Chemical compound CSC QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100494767 Drosophila melanogaster Dcp-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108050000946 Eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100022466 Eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710091919 Eukaryotic translation initiation factor 4G Proteins 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- 125000001753 GMP 3'-end group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 208000008636 Neoplastic Processes Diseases 0.000 description 1
- 108020003217 Nuclear RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000043141 Nuclear RNA Human genes 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002298 Purinergic P2Y Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010000818 Purinergic P2Y Receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 108020004688 Small Nuclear RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- FHHZHGZBHYYWTG-INFSMZHSSA-N [(2r,3s,4r,5r)-5-(2-amino-7-methyl-6-oxo-3h-purin-9-ium-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl [[[(2r,3s,4r,5r)-5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-hydroxyphosphoryl] phosphate Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1[N+]([C@H]1[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=C(C(N=C(N)N4)=O)N=C3)O)O1)O)=CN2C FHHZHGZBHYYWTG-INFSMZHSSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical group OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 230000006652 catabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229940125898 compound 5 Drugs 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 239000010439 graphite Substances 0.000 description 1
- 229910002804 graphite Inorganic materials 0.000 description 1
- JBFYUZGYRGXSFL-UHFFFAOYSA-N imidazolide Chemical compound C1=C[N-]C=N1 JBFYUZGYRGXSFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910001510 metal chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- UBLQIESZTDNNAO-UHFFFAOYSA-N n,n-diethylethanamine;phosphoric acid Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O.CC[NH+](CC)CC.CC[NH+](CC)CC.CC[NH+](CC)CC UBLQIESZTDNNAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- 230000033116 oxidation-reduction process Effects 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- FAIAAWCVCHQXDN-UHFFFAOYSA-N phosphorus trichloride Chemical compound ClP(Cl)Cl FAIAAWCVCHQXDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 239000002212 purine nucleoside Substances 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M sodium perchlorate Chemical compound [Na+].[O-]Cl(=O)(=O)=O BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910001488 sodium perchlorate Inorganic materials 0.000 description 1
- JXKPEJDQGNYQSM-UHFFFAOYSA-M sodium propionate Chemical compound [Na+].CCC([O-])=O JXKPEJDQGNYQSM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000010334 sodium propionate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004324 sodium propionate Substances 0.000 description 1
- 229960003212 sodium propionate Drugs 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000003797 solvolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- IMFACGCPASFAPR-UHFFFAOYSA-N tributylamine Chemical compound CCCCN(CCCC)CCCC IMFACGCPASFAPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IMFACGCPASFAPR-UHFFFAOYSA-O tributylazanium Chemical compound CCCC[NH+](CCCC)CCCC IMFACGCPASFAPR-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- WVLBCYQITXONBZ-UHFFFAOYSA-N trimethyl phosphate Chemical compound COP(=O)(OC)OC WVLBCYQITXONBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SIOVKLKJSOKLIF-HJWRWDBZSA-N trimethylsilyl (1z)-n-trimethylsilylethanimidate Chemical compound C[Si](C)(C)OC(/C)=N\[Si](C)(C)C SIOVKLKJSOKLIF-HJWRWDBZSA-N 0.000 description 1
- SYUQQUMHOZQROL-UHFFFAOYSA-N trimethylsilyl dihydrogen phosphite Chemical compound C[Si](C)(C)OP(O)O SYUQQUMHOZQROL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Przedmiotem wynalazku są nowe boranofosforanowe analogi dinukleotydów, ich zastosowanie, cząsteczka RNA, sposób otrzymywania RNA oraz sposób otrzymywania peptydów lub białka.
W organizmach eukariotycznych koniec 5' większości matrycowych RNA (mRNA) jest blokowany lub „kapowany”. Kapowane są także pewne inne formy RNA, na przykład krótkie jądrowe RNA (snRNA). Oznacza to, że cząsteczka RNA ma na 5' końcu strukturę kapu, czyli mostek 5'-5'-trifosforanowy pomiędzy dwoma nukleozydowymi ugrupowaniami i 7-metyloguanozynę. Kapowanie mRNA i snRNA wspomaga ich normalne funkcje w komórkach.
Możliwość syntezy kapowanych cząsteczek RNA in vitro jest więc użyteczna, ponieważ pozwala uzyskać cząsteczki RNA zachowujące się odpowiednio w różnych biologicznych zastosowaniach. Takie zastosowania obejmują zarówno prace badawcze, jak i komercyjną produkcję polipeptydów, np. produkcję w układzie translacji bezkomórkowej polipeptydów zawierających w specyficznym miejscu „nienaturalny” aminokwas lub produkcję w hodowlach komórkowych polipeptydów, które ze względu na aktywność i stabilność wymagają potranslacyjnej modyfikacji. W tych drugich układach synteza przebiega w znacznie dłuższym czasie i dlatego otrzymuje się więcej białka.
Najczęściej stosowanym sposobem otrzymywania kapowanego RNA in vitro jest synteza RNA na matrycy DNA za pomocą bakteryjnej lub bakteriofagowej polimerazy RNA w obecności wszystkich czterech trifosforanów rybonukleozydów oraz dinukleotydu kapu, takiego jak m7G(5')ppp(5')G (m7GpppG). Polimeraza inicjuje transkrypcję przez nukleofilowy atak 3'-OH ugrupowania Guo w m7GpppG na α-fosforan następnego transkrybowanego trifosforanu nukleozydu, dając jako początkowy produkt m7GpppGpN. Alternatywny produkt inicjowany przez GTP - pppGpN jest powstrzymywany przez ustalenie stosunku m7GpppG do GTP w transkrypcyjnej mieszaninie reakcyjnej od 5 do 10.
Ilość białka produkowanego przez syntetyczny mRNA wprowadzony do hodowli komórek ssaczych jest ograniczona przez degradację mRNA w naturalnym obiegu. Degradacja mRNA in vivo jest inicjowana głównie przez usunięcie kapu z nienaruszonego mRNA przez specyficzną pirofosfatazę, Dcp 1/2, która rozszczepia wiązanie pomiędzy α i β fosforanami. W publikacji E. Grudzien et al. „Differential inhibition of mRNA degradation pathways by novel cap analogs”, J. Biol. Chem., vol. 281, pp. 1857-1867 (2006) opisano właściwości analogu kapu, w którym grupa metylenowa zastępuje atom
7,3'-O
O pomiędzy grupami α and β fosforanowymi, m27,3'-OGppCH2pG. mRNA kapowane tym analogiem były odporne na hydrolizę in vitro rekombinowanym ludzkim Dcp2.
7,3'-O
Po wprowadzeniu do hodowli komórkowych mRNA kapowane za pomocą m27,3'-OGppCH2pG były 7,3'-O bardziej stabilne niż kapowane za pomocą m2 7,3'-OGpppG.
7,3'-O
Chociaż mRNA kapowane za pomocą m27,3'-OGppCH2pG były bardziej stabilne w hodowlach komórkowych, dawały mniejszą wydajność w procesie translacji, przypuszczalnie ze względu na znacznie
7,3'-O 7,3'-O mniejsze powinowactwo wiązania m2 7,3'-OGppCH2pG do eIF4E in vitro w porównaniu z m2 7,3'-OGpppG. Tak więc, chociaż były bardziej stabilne w hodowlach komórkowych, ta korzyść była dla wydajności syntetyzowanego białka wyrównana przez niższą wydajność translacji.
Poprawę tej sytuacji przedstawiono w publikacji J. Kowalska, et al. „Synthesis and characterization of mRNA cap analogs containing phosphorothioate substitutions that bind tightly to elF4E and are resistant to the decapping pyrophosphatase DcpS” RNA vol. 14, pp. 1119-31 (2008).
Opisano tu syntezę trzech analogów kapu typu ARCA, gdzie O zastąpiono przez S w resztach fosforanowych α, β, lub γ (nazwanych S-ARCA). Każdy z nich zsyntetyzowano w dwu formach izomerycznych, które mogły być rozdzielone chromatograficznie. Stwierdzono, że wszystkie z otrzymanych analogów silnie oddziałują z białkiem eIF4E (nie słabiej niż m7GpppG).
mRNA zakończone analogiem S-ARCA modyfikowanym w pozycji β były odporne na hydrolizę in vitro rekombinowanym ludzkim Dcp2, wydłużały czas półtrwania mRNA w komórkach ssaczych oraz znacznie zwiększały wydajność translacji elektoroporowanego do komórek mRNA. E. Grudzien et al. „Phosphorothioate Cap Analogs Stabilize mRNA and Increase Translational Efficiency in Mammalian Cells” RNA, vol. 13, str. 1745-1755 (2007).
Innym zastosowaniem analogów kapu jest ich użycie w badaniach nad inhibicją translacji zależnej od kapu w systemach bezkomórkowych. Stwierdzono, że analogi kapu efektywnie hamują translację poprzez konkurowanie z mRNA o miejsce wiązania białka eIF4E. [A. Cai et al, „Quantitative assessment of mRNA cap analogues as inhibitors of in vitro translation”. Biochemistry vol. 38, pp. 8538-8547 (1999), E. Grudzien, „Novel cap analogs for in vitro synthesis of mRNAs with high translational efficiency”. RNA vol. 10, pp. 1479-1487(2004).]
PL 215 513 B1
Zdolność analogów kapu do inhibicji translacji ma także potencjalne znaczenie terapeutyczne, gdyż jak wykazano, białko eIF4E jest nadeksprymowane w wielu rodzajach komórek nowotworowych, a jego nadekspresja prowadzi selektywnie do nadekspresji czynników białkowych związanych z nowotworzeniem i metastazą [A. De Benedetti, J. R. Graff „eIF-4E expression and its role in malignancies and metastases” ONCOGENE vol. 23, pp. 3189-3199 (2004)].
Pokazano również, że wyciszenie ekspresji eIF4E za pomocą siRNA lub oligonukleotydów antysensownych [J. R. Graff et al. „Therapeutic suppression of translation initiation factor eIF4E expression reduces tumor growth without toxicity”, J. Clin. Investigation, vol. 117, pp. 2638-2648 (2007)], jak również zahamowanie jego aktywności poprzez ekspresję specyficznego represora, może zahamować proces nowotworzenia [Herbert et al. „Rapid induction of apoptosis by peptides that bind initiation factor eIF4E”. Curr. Biol. vol. 10, pp. 793-796 (2000)].
Syntetyczne analogi kapu stanowią grupę specyficznych inhibitorów eIF4E, mogą zatem znaleźć zastosowanie w leczeniu chorób nowotworowych. Działanie, analogów kapu jako inhibitorów translacji nie zostało jednak do tej pory zademonstrowane in vivo, głównie ze względu na ich nietrwałość w warunkach komórkowych. Rozwiązaniem tego problemu może być synteza analogów modyfikowanych w łańcuchu oligofosforanowym.
Oprócz modyfikacji metylenobisfosfonianowej (zamiana O na CH2) oraz tiofosforanowej (zamiana O na S) znane są również inne modyfikacje, które mogą chronić nukleotydy przed degradacją enzymatyczną. Jedną z nich jest modyfikacja boranofosforanowa, polegająca na zastąpieniu jednego z niemostkowych atomów O w grupie fosforanowej, grupą boranową (BH3-).
Modyfikacja boranofosforanowa jest najczęściej spotykana w chemicznie, bądź enzymatycznie syntetyzowanych oligonukleotydach, ale znane są również przykłady syntezy boranofosforanowych analogów mononukleotydów [Li P, et al. „Nucleoside and oligonucleoside boranophosphates: Chemistry and properties” Chemical Reviews vol. 107, pp. 4746-4796 (2007)], a nawet boranofosforanowych analogów polifosforanów dinukleozydów.
Boranofosforanowe analogi polifosforanów dinukleozydów przedstawiono w opisie zgłoszenia US 2006/0287271. Są nimi zwłaszcza opisane w przykładach diadenozyny i diurydyny użyteczne do leczenia i zapobiegania chorobom modulowanym przez receptory P2Y, jak cukrzyca typu 2 i nowotwór.
Boranofosforanowe analogi nukleotydów wykazują podobieństwo do tiofosforanów, ze względu na budowę przestrzenną, wartości pKa, oraz występowanie P-diastereoizomerii. Jednakże wykazano, że boranofosforany są nawet 10-krotnie bardziej odporne na hydrolizę enzymatyczną niż ich tiofosforanowe odpowiedniki. Są one również bardziej lipofilowe od tiofosforanów, co ułatwia ich przenikanie przez błony biologiczne. Kolejna zaletą analogów boranofosforanowych jest możliwość użycia ich w terapii BNCT (boron neutron capture therapy).
Przedmiotem wynalazku są nowe analogi kapu modyfikowane resztą boranofosforanową. Analogi te mają zastosowanie zwłaszcza jako 5' koniec mRNA, jako inhibitory zależnej od kapu translacji, np. do inhibicji translacji w komórkach nowotworowych, jak również jako reagenty do otrzymywania kapowanego mRNA o zwiększonym czasie życia w warunkach in vivo. W nowych pochodnych połączono BH3 - podstawienie przy różnych resztach fosforanowych z podstawieniem grupą 2' - i/lub 3'-O-alkilową, korzystnie metylową w celu zapewnienia prawidłowej orientacji podczas syntezy RNA in vitro, otrzymując nowe analogi nazywane BH3-analogi kapu lub BH3-ARCA dla analogów wbudowywanych do 5' końca RNA w prawidłowej orientacji. Modyfikacja analogów ARCA (anty-odwrotne analogi kapu, tj. dinukleotydowe analogi kapu modyfikowane na rybozie 7-metyloguanozyny, które są wbudowywane wyłącznie w poprawnej orientacji w procesie translacji in vitro, katalizowanej przez polimerazę RNA) zapewnia precyzyjne umiejscowienie boranofosforanowych grup α, β i γ w miejscach aktywnych białka wiążącego kap zarówno w procesie translacji, jak i usuwania kapu.
Nieoczekiwanie stwierdzono, że nowe 3-BH3-ARCA nie ulegają degradacji w reakcji katalizowanej przez enzym DcpS.
Nowe boranofosforanowe analogi dinukleozydów mają wzór ogólny 1,
PL 215 513 B1
w którym Y1, Y2, Y3, Y4 oznaczają niezależnie O lub BH3, przy czym co najmniej jeden Y oznacza BH3, n wynosi 0 lub 1,
N oznacza grupę o wzorze 6 lub grupę o wzorze 7,
w których
R1 i R2 oznaczają niezależnie H, OH, OCH3, i OCH2CH3,
X oznacza metyl, etyl, propyl, butyl, benzyl, podstawiony benzyl, naftylometyl lub podstawiony naftylometyl,
B oznacza grupę o wzorze 2a, 2b, 3, 4 lub 5,
R3 i R4 oznaczają niezależnie H, OH, OCH3 lub OCH2CH3 Związki o wzorze 1 mogą być w postaci wolnej lub w postaci soli.
Wynalazek obejmuje także diastereoizomery związków o ogólnym wzorze 1 i mieszaniny diastereoizomerów.
Do związków o ogólnym wzorze 1 należą związki o wzorach 8, 9, 10, 11, 12, i 13,
PL 215 513 B1
PL 215 513 B1
Do przykładowych korzystnych analogów należą związki o wzorze 1, w którym B oznacza grupę o wzorze 2a lub 2b; związki ogólnym wzorze 1, w którym B oznacza grupę o wzorze 2a, 2b, 3, 4, lub 5, zwłaszcza 2a, 2b, R3 i R4 oznaczają OH, N oznacza grupę o wzorze 6 lub 7, X oznacza metyl, etyl, propyl, butyl, benzyl, podstawiony benzyl, naftylometyl lub podstawiony naftylometyl, zwłaszcza metyl, a R1 i R2 oznaczają niezależnie H, OH, OCH3, i OCH2CH3, przy czym jeżeli B oznacza grupę o wzorze 2a, 3, 4, lub 5, wówczas jeden spośród R1 i R2 ma znaczenie inne niż OH.
Przykładami tych korzystnych związków są związki w których N oznacza grupę o wzorze 6, R2 oznacza OH, R1 oznacza H lub CH3, X oznacza metyl, n wynosi 0, a jeden spośród Y1, Y2, Y3 oznacza BH3 o wzorze ogólnym 14 podane w tabeli 1.
Tabela I
| OR OH | |||||
| Ύη | .ol z | 0 II -o—PI. Y | 0 II -o—pI. X | N P | |
| N<?· 0“ CH, Wzór 14 | y | β | a | OH OH | |
| Związek | X | Y | z | R | N |
| m7GpppBH3G (D1) | bh3 | 0 | 0 | H | Gua |
| m7GpppBH3G (D2) | bh3 | 0 | 0 | H | Gua |
| m7GppBH3pG (D1) | 0 | bh3 | 0 | H | Gua |
| m7GppBH3pG (D2) | 0 | bh3 | 0 | H | Gua |
| m7GppBH3pm7G | 0 | bh3 | 0 | H | m7Gua |
| m7GpBH3PpG (D1) | 0 | 0 | bh3 | H | Gua |
| m7GpBH3ppG (D2) | 0 | 0 | bh3 | H | Gua |
| m27’2’0GpppBH3G (D1) | bh3 | 0 | 0 | ch3 | Gua |
| m27.2'-°GpppBH3G (D2) | bh3 | 0 | 0 | ch3 | Gua |
| m27.2'-OGppBH3pG (D1) | 0 | bh3 | 0 | ch3 | Gua |
| rri27’2‘0GppBH3pG (D2) | 0 | bh3 | 0 | ch3 | Gua |
| m27’2'°GpBH3ppG (D1) | 0 | 0 | bh3 | ch3 | Gua |
| m27’2'-°GpBH3PpG (D2) | 0 | 0 | bh3 | ch3 | Gua |
Gua oznacza guanozynę o wzorze 2a, a m7Gua oznacza 7-metyloguanozynę o wzorze 2b, w którym X oznacza CH3.
Ze względu na zastosowanie, jako struktury kapu do korzystnych należą β-ΒΗ3- analogi kapu.
Nowe boranofosforanowe analogi dinukleozydów mogą być w postaci wolnej lub w postaci soli na przykład z kationem metali alkalicznych lub metali ziem alkalicznych, NH4+, N(R)3H+, gdzie R oznacza grupę alkilową o 1-6 atomach węgla, np. etylową, butylową i podobne.
Wynalazek dotyczy także zastosowania nowych boranofosforanowych analogów dinukleozydów o ogólnym wzorze 1, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie jako inhibitora zależnej od kapu translacji, np. jako inhibitora translacji w komórkach nowotworowych.
Ze względu na zastosowanie do inhibicji zależnej od kapu translacji korzystne są β i γ analogi.
PL 215 513 B1
Przedmiotem wynalazku jest ponadto cząsteczka RNA zawierająca na końcu 5' nowy boranofosforanowy analog o ogólnym wzorze 1, w którym B oznacza grupę o wzorze 2a, 2b, 3, 4, lub 5, N oznacza grupę o wzorze 6 lub 7, X oznacza metyl, etyl, propyl, butyl, benzyl, podstawiony benzyl, naftylometyl lub podstawiony naftylometyl, a R1 i R2 oznaczają niezależnie H, OH, OCH3, i OCH2CH3, R3 i R4 oznaczają niezależnie H, OH, OCH3, i OCH2CH3, z tym że, jeżeli B oznacza grupę o wzorze 2a, 3, 4, lub 5, wówczas jeden spośród R1 i R2 ma znaczenie inne niż OH, natomiast R3 i R4 oznaczają OH, a jeżeli B oznacza grupę o wzorze 2b, wówczas albo R1 i R2, albo R3 i R4 oznaczają OH, ich diastereoizomery lub mieszaniny diastereoizomerów.
Sposób otrzymywania RNA zawierającego na końcu 5' nowy boranofosforanowy analog o ogólnym wzorze 1, w którym podstawniki mają wyżej podane znaczenie, in vitro, polega według wynalazku na tym, że na polinukleotydowej matrycy w obecności polimerazy RNA poddaje się reakcji ATP, CTP, UTP, GTP oraz wyżej zdefiniowany analog o wzorze 1 w warunkach zapewniających transkrypcję polinukleotydowej matrycy przez polimerazę RNA.
W procesie tym do co najmniej części kopii RNA włącza się wyżej zdefiniowany analog o wzorze 1.
Nowy analog zazwyczaj stosuje się w nadmiarze w stosunku do GTP w zakresie od 2:1 do 50:1.
Sposób otrzymywania peptydu, białka lub peptydowego antygenu in vitro polega według wynalazku na tym, że translacji w układzie bezkomórkowym poddaje się cząsteczkę RNA zawierającą na końcu 5' nowy boranofosforanowy analog o wyżej zdefiniowanym wzorze 1, przy czym cząsteczka RNA ma otwartą ramkę odczytu, a proces prowadzi się w warunkach sprzyjających translacji otwartej ramki odczytu RNA do peptydu, białka lub peptydowego antygenu kodowanego przez otwartą ramkę odczytu
Sposób otrzymywania peptydu, białka lub peptydowego antygenu w hodowli komórkowej polega według wynalazku na tym, że do hodowli komórkowej wprowadza się cząsteczkę RNA zawierającą na końcu 5' nowy boranofosforanowy analog o wyżej zdefiniowanym wzorze 1, przy czym cząsteczka RNA ma otwartą ramkę odczytu, a proces prowadzi się w warunkach sprzyjających translacji otwartej ramki odczytu RNA do peptydu, białka lub peptydowego antygenu kodowanego przez otwartą ramkę odczytu.
Chemiczną syntezę boranofosforanowych analogów kapu przeprowadzono z wykorzystaniem metod podobnych do opracowanych dla syntezy analogów niemodyfikowanych w mostku 5',5'-polifosforanowym [M. Kadokura et al., „Efficient synthesis of γ-methyl-capped guanosine 5'-triphosphate as a 5'-terminal unique structure of U6 RNA via a new triphosphate bond formation involving activation of methyl phosphorimidazolidate using ZnCl2 as a catalyst in DMF under anhydrous conditions”, Tetrahedron Lett., vol. 38, pp. 8359-8362 (1997); J. Stępinski et al, Synthesis and properties of mRNAs containing the novel anti-reverse cap analogues 7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3'-deoxy)GpppG”, RNA, vol. 7, pp. 1486-1495 (2001), i J. Jemielity et al., „Novel anti-reverse cap analogues with superior translational properties”, RNA, vol. 9, pp. 1108-1122 (2003)], a także analogów kapu modyfikowanych resztą metylenobisfosfonianową [M. Kalek et al. „Enzymatically stable 5' mRNA cap analogs” (2006) Bioorg. Med. Chem. vol. 14, 3223-3230] oraz tiofosforanową [J. Kowalska et al. „Synthesis and characterization of mRNA cap analogs containing phosphorothioate substitutions that bind tightly to elF4E and are resistant to the decapping pyrophosphatase DcpS” (2008) RNA, vol. 14, 1119-1131]. Według tego podejścia dwa mononukleotydy, z których jeden uprzednio zaktywowano w postaci odpowiedniego imidazolidu, są sprzęgane w DMF. Reakcja jest w dużym stopniu ułatwiona przez zastosowanie 8-molowego nadmiaru ZnCl2, który jednocześnie znacząco zwiększa rozpuszczalność reagentów w medium organicznym, zapobiega hydrolizie imidazolowych pochodnych, oraz przyspiesza szybkość reakcji. Inne chlorki metali np. MnCl2, CdCl2, MgCl2 są również zdolne do promowania tworzenia wiązania pirofosforanowego jednak zazwyczaj z mniejszą wydajnością niż ZnCl2 [M. Kadokura et al., „Efficient synthesis of γ-methyl-capped guanosine 5'-triphosphate as a 5'-terminal unique structure of U6 RNA via a new triphosphate bond formation involving activation of methyl phosphorimidazolidate using ZnCl2 as a catalyst in DMF under anhydrous conditions”, Tetrahedron Lett., vol. 38, pp. 8359-8362 (1997)]. Podobną do opisanej metodologię, z kilkoma modyfikacjami, zastosowaliśmy do syntezy różnych analogów kapu zawierających mieszane bezwodnikowe wiązanie fosforano-boranofosforanowe. Najlepsze rezultaty w reakcjach sprzęgania otrzymaliśmy jednak z zastosowaniem MgCl2, a nie ZnCl2. W obecności chlorku cynku reakcje sprzęgania również zachodziły,
PL 215 513 B1 ale towarzyszyły im w znacznej mierze procesy uboczne związane z rozszczepieniem wiązania P-BH3 w środowisku kwaśnym (generowanym przez ZnCl2).
Drogi syntezy prowadzące do otrzymania różnych analogów kapu zawierających modyfikację boranofosforanową w pozycjach α, lub β mostka trifosforanowego przedstawiono odpowiednio na fig. 1, fig. 2, fig. 3 i fig. 4.
Synteza analogów modyfikowanych grupą boranofosforanową w pozycji α przedstawiona jest na fig. 1. W celu dokonania tej syntezy, opracowano najpierw metodę syntezy kluczowego związku pośredniego - 5'-O-boranofosforanu guanozyny. Materiałem wyjściowym do syntezy był 5'-H-fosfonian odpowiedniego nukleozydu, który poddano sililowaniu za pomocą BSA (N,O-bis(trimetylosililo)acetamidu), a otrzymany pośredni bis(trimetylosililo)fosforyn bez izolacji, poddano boranowaniu za pomocą kompleksu BH3 · SMe2. Następcza hydroliza i oczyszczanie za pomocą chromatografii jonowymiennej, prowadziły do pożądanego 5'-O-boranofosforan nukleozydu z wydajnością około 30%. W celu otrzymania analogu kapu m7 GpppBH3G oraz analogu kapu typu ARCA m27,2'-O GpppBH3G, 5'-O-boranofosforan guanozyny sprzęgano odpowiednio z imidazolową pochodną m7GDP lub m27,2'-OGDP w mieszaninie woda/DMF 9:1 w obecności nadmiaru chlorku magnezu. W obu przypadkach pożądany analog kapu powstaje jako mieszanina dwóch P-diastereoizomerów, które można rozdzielić techniką HPLC. Diastereoizomerom przypisano oznaczenia D1 i D2, zgodnie z kolejnością elucji z kolumny RP HPLC.
Synteza analogów modyfikowanych grupą boranofosforanową w pozycji β przedstawiona jest na fig. 2. Sól trietyloamoniową boranofosforanu zsyntetyzowano według zmodyfikowanej procedury opracowanej przez Nahum i wsp [V. Nahum i B. J. Inorg. Chem. vol. 20, 4124-4131 (2004)]. Według oryginalnej procedury, tris(trimetylosililo)fosforyn poddawany jest reakcji boranowania za pomocą kompleksu BH3 · SMe2, następcza solwoliza w metanolu w obecności odpowiedniej zasady (np. NH3. NBu3 etc.), pozwala na otrzymanie boranofosforanu w postaci soli (odpowiednio amonowej, tributyloamoniowej itd.), po uprzednim odparowaniu pozostałych, lotnych składników mieszaniny reakcyjnej. Jednakże, otrzymany przez nas w ten sposób boranofosforan był znacznie (nawet do 20%, jak stwier31 dzono za pomocą 31P NMR) zanieczyszczony fosforanem (III), który w trakcie dalszych eksperymentów okazał się niepożądanym produktem, przeszkadzającym w reakcji sprzęgania. Obecność fosforanu (III) wynikała prawdopodobnie z tego, że tris(trimetylosililofosforyn) częściowo hydrolizuje w warunkach reakcji do bis(trimetylosililo)fosforynu, którego równowaga tautomeryczna przesuniętą jest zdecydowanie w stronę formy H-fosfonianowej i dlatego nie ulega on reakcji boranowania. Rozwiązaniem tego problemu okazało się dodanie do mieszaniny reakcyjnej nadmiaru odczynnika sililującego (BSA), który zapobiegał tworzeniu się bis(trimetylosililo)fosforynu. Otrzymaną sól trietyloamoniową boranofosforanu sprzęgano z nadmiarem imidazolowej pochodnej 5'-monofosforanu guanozyny otrzymując symetryczny 5', 5”-O,O-(2-boranotrifosforan) diguanozyny (GppBH3pG, fig. 2). Związek został następnie poddany działaniu jodku metylu w DMSO, w celu wprowadzenia grupy metylowej w pozycję N7 guanozyny (fig. 2, krok ii). W reakcji tej powstaje mieszanina mono- i dimetylowanego analogu kapu (m7GppBH3pG i m7GppBH3pm7G). Wzajemny stosunek otrzymanych produktów mono- i dimetylowanych, może być kontrolowany poprzez staranne dobranie warunków reakcji. W obecności około 4-krotnego nadmiaru CH3I jako główny produkt powstaje m7GppBH3pG (ok. 70% wydajności HPLC), natomiast przy zastosowaniu większego nadmiaru CH3I (8-10eq.) m7GppBH3pm7G jest produktem przeważającym (ok. 50% w. HPLC). Jednakże, w przypadku tego związku bardziej efektywną, jednoetapową drogą syntezy jest sprzęganie boranofosforanu z imidazolową pochodną 5'-O-monofosforanu
7-metyloguanozyny, pozwalające na wyizolowanie go z 34% wydajnością (fig. 3).
W celu otrzymania modyfikowanego w pozycji β analogu typu ARCA przeprowadzono kilka prób otrzymania kluczowego dla tej syntezy związku pośredniego, 5'-O-(2-boranodifosforanu) 7,2'-O-di7,2'-Ο metyloguanozyny (m2 7 - GDPβΒΗ3). Mimo, iż analiza MS ESI (-) produktów sprzęgania imidazolowej
7,2'-Ο pochodnej m2 7 - GMP-Im z nadmiarem soli trietyloamoniowej boranofosforanu w DMF w obecności MgCI2 wskazywała na powstawanie pożądanego produktu, to jednak związku tego nie udało się wyizolować w zadowalających ilościach. Prawdopodobną przyczyną jest jego zaobserwowana nietrwa772'-Ο łość w roztworach wodnych (hydrolizuje do m2 7 - GMP), uniemożliwiająca oczyszczanie w procesie
772'-Ο chromatografii jonowymiennej. Syntezy dokonano zatem, otrzymując m2 7 - GDPBBH3 w reakcji
772'-Ο m2 7 - GMP-Im z nadmiarem soli trietyloamoniowej boranofosforanu i tak otrzymany związek, bez izolacji, poddano następczej reakcji z nadmiarem imidazolowej pochodnej GMP (fig. 4).
Inne analogi objęte wzorem ogólnym 1 otrzymuje się w reakcjach analogicznych do przedstawionych na fig. 17 27 3 i 4.
PL 215 513 B1
Na załączonych rysunkach fig. 1 do fig. 4 przedstawiają syntezę otrzymanych nowych analogów, fig. 5 pokazuje wydajność translacji, fig. 6 pokazuje inhibicję translacji przez boranofosforanowe analogi kapu, fig. 7 pokazuje inhibicję translacji po 60 minutach preinkubacji analogu kapu w lizacie z retikulocytów króliczych przed startem translacji.
Opisane niżej eksperymenty i przykłady bliżej ilustrują wynalazek.
Syntezy boranofosforanowych analogów kapu
Nukleotydowe związki pośrednie były oczyszczane przy użyciu kolumnowej chromatografii jo3nowymiennej na DEAD-Sephadex A-25 (HCO3- forma) przy użyciu liniowego gradientu wodorowęglanu trietyloamoniowego (TEAB) w dejonizowanej wodzie. W wyniku oczyszczania otrzymywano produkty w postaci soli trietyloamoniowych po uprzednim odparowaniu roztworu z dodatkiem etanolu pod zmniejszonym ciśnieniem. Finalne produkty (analogi kapu) były rozdzielane przez półpreparatywne HPLC, a następnie liofilizowane w wyniku czego otrzymywano produkty końcowe w postaci soli amonowych. Analityczne HPLC wykonywano na aparacie Agilent 1100 Series wyposażonym w kolumnę Supelcosil LC-18-T RP (4.6 x 250 mm, przepływ 1.3 ml/min) stosując 0-25% metanolu w 0.05 M octanie amonu pH 5.9 i detekcję UV przy 260 nm oraz detekcję fluorescencyjną stosując wzbudzanie przy 280 nm i detekcję fluorescencji przy 337nm. Półpreparatywne HPLC przeprowadzano na aparacie Waters 600E Multisolvent Delivery System wyposażonym w kolumnę RP Waters HR-C-18 (19 x 300 mm, przepływ 5.0 ml/min) stosując liniowy gradient metanolu w 0.05 M octanie amonu, pH 5.9, i detekcję 1 31
UV przy 260 nm. Widma H NMR i P NMR były zarejestrowane w temperaturze 25°C na aparacie
Varian UNITY-plus odpowiednio przy 399.94 MHz i 161.90 MHz. Przesunięcia chemiczne w 1H NMR podano w odniesieniu do 3-trimetylosilylo-[2,2,3,3-D4]-propionianu sodu (TSP) w D2O jako wzorca 31 wewnętrznego. Przesunięcia chemiczne w 31P NMR podano w odniesieniu do 20% kwasu fosforowego w D2O jako wzorca zewnętrznego. Widma masowe rejestrowano na aparacie Micromass QToF 1 MS stosując jonizację elektrosprej w trybie jonów ujemnych (ESI (-)).
Rozpuszczalniki oraz inne odczynniki zakupiono z Sigma-Aldrich i używano bez dalszej obróbki chyba, że w tekście zaznaczono inaczej. Acetonitryl i aceton przed użyciem destylowano znad P2O5 i przechowywano nad sitami molekularnymi 4A. GMP i GDP zakupiono z Sigma-Aldrich i przekształ7,2'-Ο cono w sól trietyloamoniową stosując żywicę jonowymienną Dowex 50 WX 8. m2 , - GMP
7,2'-Ο i m2 , - GDP otrzymano stosując metody opisane wcześniej [J. Jemielity et al. „Novel 'anti-reverse' cap analogues with superior translational properties”, RNA, vol. 9, pp. 1108-1122 (2003)]. 2'-O-metyloguanozyna została otrzymana według procedury opisanej wcześniej. [J. Kusmierek et al. „A new route to 2'(3')-O-alkyl purine nucleosides”, Nucleic Acids Res. vol. 1, pp. 73-77, Special Publication
No. 4 (1978).]. 2',3'-O,O-izopropylidenoguanozynę otrzymano według procedury opisanej wcześniej.
7,2'-Ο
Ogólna procedura otrzymywania imidazolowych pochodnych (GMP-Im, m2 , - GMP-Im,
7,2'-Ο
GDP-Im, and m2 , - GDP-Im) [T. Mukaiyama, et al. „Phosphorylation by oxidation-reduction condensation. Preparation of active phosphorylating reagents”, M. Bull. Chem. Soc. Jpn, vol. 44, 2284 (1971)].
Odpowiedni nukleotyd (1 mmol, TEA salt), imidazol (8 mmol), i 2,2'-dithiodipirydyna (3 mmol) zostały zmieszane w DMF (około 10 ml). Następnie dodano trietyloaminę (2 mmol) i trifenylfosfinę (3 mmol) i całość mieszano przez 6-8 h. Produkt wytrącono z mieszaniny reakcyjnej roztworem nadchloranu sodu w bezwodnym acetonie (1 mmol na ładunek ujemny) (50 ml). Po ochłodzeniu do 0°C osad przesączono, i kilkakrotnie przemyto bezwodnym acetonem, a następnie osad suszono nad P4O10. Wydajności 80-100%.
P r z y k ł a d I
5'-H-fosfonian guanozyny [M. Yoshikawa et al. „Studies of phosphorylation. IV. The phosphorylation of nucleosides with phosphorus trihalide”, Bull. Chem. Soc. Jpn, vol. 43, 456-461 (1970)].
2',3'-0,0-izopropylidenoguanozynę (1,3 g, 4,0 mmol) zawieszono w 19,5 ml fosforanu trimetylu i mieszaninę ochłodzono na łaźni lodowej. Następnie dodano PCI3 (1,06 ml, 12,1 mmol) i mieszano na łaźni lodowej do osiągnięcia klarownego roztworu (ok. 60 min). Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńczono wodą (80 ml) i doprowadzono za pomocą stałego NaHCO3 do pH ok. 1,5. Otrzymany roztwór ogrzewano przez 40-60 min w temp. 70°C, pozostawiono do ochłodzenia do temp. pokojowej, doprowadzono do pH ok. 5 za pomocą stałego NaHCO3, rozcieńczono dwukrotnie wodą, po czym naniesiono na kolumnę jonowymienną Sephadex i rozdzielano stosując 0-0,9 M gradient TEAB. Frakcje wymyte przy stężeniu buforu 0,6-0,65 M zawierające 39,5 tys. jednostek optycznych produktu
PL 215 513 B1 połączono, odparowano i wysuszono w eksykatorze próżniowym nad P2O5. Otrzymano 1,34 g (3,0 mmol) soli trietyloamoniowej 5'-H-fosfonianu guanozyny (wydajność 74%).
ESI MS (-) m/z: 346,08 (wartość obliczona dla C10H13N5O7P: 346,06);
1H NMR δ (ppm): 8,08 (1H, s, H8); 6,73 (1H, d, J = 640 Hz, H-P); 5,93 (1H, d, J = ~5,4 Hz, H1'); 4,77 (1H, t, J = ~5,4 Hz); 4,48 (1H, t, J = 3,2 Hz); 4,32 (1H, m, H4'); 4,11 (2H, m, H5' i H5) 31P NMR δ (ppm): 7,07 (1P, dt, J = 640 Hz, J = 6,0 Hz).
5'-O-boranofosforan guanozyny (GMPBH3, sól trietyloamoniowa)
5'-H-fosfonian guanozyny (1,03 g, 2,30 mmol) umieszczono w kolbie okrągłodennej zawieszono w 30 ml suchego acetonitrylu, kolbę zamknięto gumowym septum zaopatrzonym w dwie igły i przez mieszaninę przepuszczano argon przez ok. 30 min. Następnie do zawiesiny dodano za pomocą strzykawki BSA (11,3 ml, 46 mmol) i intensywnie mieszano do momentu otrzymania klarownego roztworu i dodatkowo przez 30 min. Po tym czasie kolbę umieszczono w łaźni lodowej, dodano za pomocą strzykawki 5,7 ml 2M roztworu BH3 · SMe2 w THF (11,5 mmol BH3), po 5 min łaźnię usunięto i kontynuowano mieszanie przez 30 min. Roztwór odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem do oleistej pozostałości, po czym ponownie umieszczono na łaźni lodowej i dodano 60 ml metanolu i 3 ml 2M roztworu NH3 w etanolu i mieszano przez 2h w temp pokojowej. Roztwór odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem do sucha, po czym rozpuszczono w 100 ml wody i przeekstrahowano jednokrotnie 20 ml eteru dietylowego. Resztki eteru z warstwy wodnej odpędzono pod zmniejszonym ciśnieniem i roztwór naniesiono na kolumnę jonowymienną Sephadex i rozdzielano stosując 0-0,9 M gradient TEAB. Z połączonych frakcji zawierających 13,2 tys. j. optycznych produktu po odparowaniu do sucha i liofilizacji otrzymano 410 mg soli trietyloamoniowej 5'-O-boranofosforanu guanozyny (Wydajność 32%).
ESI MS (-) m/z: 360,13 (wartość obliczona dla C10H16N5O7P11B: 360,09) 1H NMR δ (ppm): 8,17 (1H, s, H8); 5,82 (1H, d, J=6,0 Hz, H1'); 4,74 (1H, t, H2'); 4,47 (1H, t, H3'); 4,32 (1H, m, H4'), 4,03 (2H, m, H5' i H5) 31P NMR δ (ppm): 79,05 (1P, ~qq, J= 158 Hz, J= 22,5 Hz).
Synteza m7GpppBH3G
Do GMPBH3 (50 mg, 0,089 mmol, sól TEA) i m7GDP-Im (100 mg, 0,18 mmol, sól Na) w 2,5 ml mieszaniny DMF/H2O (9:1), dodano, niewielkimi porcjami, bezwodny MgCl2 (110 mg, 1,16 mmol), po czym mieszaninę intensywnie wytrząsano do momentu rozpuszczenia reagentów. Następnie roztwór mieszano przez 3 dni w temperaturze pokojowej. Reakcję zakończono dodając roztwór EDTA (430 mg, l, 16 mmol) w 25 ml wody i doprowadzono do pH ok. 6 za pomocą stałego NaHCO3. Produkty oczyszczono za pomocą chromatografii jonowymiennej stosując 0-1,2 M gradient TEAB. Otrzymano 685 jednostek optycznych (λ = 260 nm) diastereomerycznej mieszaniny m7GpppBH3G. Diastereoizomery rozdzielono następnie za pomocą półpreparatywnego HPLC, a zebrane frakcje trzykrotnie zliofilizo7,2'-Ο 7,2'-Ο wano. Wydajność po rozdziale HPLC: m2 , - GpppBH3G (D1) 13,4 mg i oraz m2 , - GpppBH3G (D2) 7,3 mg w postaci soli amonowych (odpowiednio 18% i 9,8%).
ESI MS (-) m/z: 799,22 (wartość obliczona dla C21H31N10O17P3B: 799,12)
D1 = 1H NMR δ (ppm): 8,93 (1H, s. H8 m7G); 7,99 (1H, s, H8 G); 5,79 (1H, d, J=3,2 Hz, Η1' m7G); 5,73 (1H, d, J=6,0 Hz, Η1' G); 4,59 (1H, ~t, H2' G); 4,48 (1H, dd, J=4,4 Hz, J= 3,2 Hz, H2' m7G); 4,40 (1H, m, H3; G); 4,37 (1H, m, H3' m7G); 4,27 (3H, nałożone m, H4', H5', H5); 4,13 (3H, nałożone m, H4', H5', H5); 3,95 (3H, s, CH3); 0,34 (3H, szeroki m, BH3) 31P NMR δ (ppm): 84,07 (1P, m, Pα (Pbhs)); -11,29 (1P, d, J=19,4 Hz, PY); -22,95 (1P, dd, J=19,4 Hz, J=30,0 Hz, Ρβ)
D2: 1H NMR δ (ppm): 8,87 (1H, s, H8 m7G); 7,95 (1H, s, H8 G); 5,79 (1H, d, J=~ 2 Hz, H1'm7G); 5,68 (1H, d, J = 5,4 Hz, Η1' G); 4,62 (1H, ~t, H2' G); 4,50 (1H, ~t, H2' m7G); 4,41 (1H, m, H3' G); 4,37 (1H, m, H3' m7G); 4,25 (3H, nałożone m, H4', H5', H5); 4,15 (3H, nałożone m, H4', H5', H5); 3,93 (3H, s, CH3); 0,34 (3H, szeroki m, BH3) 31PNMR δ (ppm): 84,0 (1Ρ, m, Ρα (Pbh3)); -11,38 (1Ρ, s, Ργ); -22,88 (1Ρ, s, Ρβ).
P r z y k ł a d II
7,2'-Ο
Synteza m2 ’ - GpppBH3G
Do zawiesiny GMPBH3 (30 mg, 0,053 mmol, sól TEA) i m2 7,2-°GDP-im (60 mg, 0,11 mmol, sól Na) w 1,5 ml mieszaniny DMF/H2O (9:1), dodano, niewielkimi porcjami, bezwodny MgCI2 (80 mg, 0,85 mmol) po czym mieszaninę intensywnie wytrząsano do momentu rozpuszczenia reagentów. Następnie roztwór mieszano przez 4 dni w temperaturze pokojowej. Reakcję zakończono poprzez dodanie roztworu EDTA (320 mg, 0,85 mmol) w 15 ml wody i doprowadzono do pH ok. 6 za pomocą stałego NaHCO3. Produkty oczyszczono za pomocą chromatografii jonowymiennej stosując 0-1,2 M graPL 215 513 B1 dient TEAB. Otrzymano 520 jednostek optycznych (λ=260 nm) diastereomerycznej mieszaniny
7,2'-Ο m2 , - GpppBH3G. Diastereoizomery rozdzielono następnie za pomocą półpreparatywnego HPLC,
7,2'-Ο zebrane frakcje trzykrotnie zliofilizowano. Wydajność po rozdziale HPLC: m2 , - GpppBH3G (D1) 6,1 mg
7,2'-Ο i oraz m2 , - GpppBH3G (D2) 3,7 mg w postaci soli amonowych (odpowiednio 13,4% i 8%).
ESI MS (-) m/z: 813,15 (wartość obliczona dla C22H33N10O17P311B: 813,13)
D1 = 1H NMR δ (ppm): 9,03 (1H, s, H8 m7G); 8,09 (1H, s, H8G); 5,95 (1H, d, J=2,7 Hz, H1' m7G); 5,84 (1H, d, J=6,0 Hz, H1' G); 4,70 (1H, dd, J=6,0 Hz, J=5,1 Hz, H2' G); 4,56 (1H, ~t, H3' m7G); 4,50 (1H, dd, J=3,5 Hz, 5,1 Hz, H3' G); 4,41 (1H, m, H5' G); 4,34 (2H, m, nałożone H4' m7G, H4'G); 4,27 (2H, m nałożone, H2' m7G, H5G); 4,24 (2H, m, H5', H5 m7G); 4,08 (3H, s, N-CH3); 3,60 (3H, s, O-CH3), 0,40 (3H, m, BH3).
31P NMR δ (ppm): 83,7 (1P, m, Pα (Pbh3)), -11,30 (1P, d, J=19,5 Hz, Ργ); -22,91 (1P, dd, J=19,5 Hz, J=30,0 Hz, Pp)
D2: 1H NMR δ (ppm): 8,98 (1H, s, H8 m7G); 8,06 (1H, s, H8G); 5,96 (1H, d, J=2,7 Hz, H1' m7G);
5,79 (1H, d, J=5,9 Hz, H1' G); 4,61 (1H, ~t, H2' G); 4,50 (1H, ~t, H3' m7G); 4,45 (1H, dd, J=3,5 Hz, 5,1 Hz, H3' G); 4,34 (2H, m (nałożone), H4' m7G, H5' G); 4,26 (3H, m (nałożone), H2' m7G, H4' G, H5G); 4,20 (2H, m, H5', H5 m7G); 4,06 (3H, s, N-CH3); 3,61 (3H, s, O-CH3), 0,40 (3H, m, BH3).
31P NMR δ (ppm): 83,7 (1Ρ, m, Ρα (Pbhs)), - 11,41 (1Ρ, d, J=19,0 Hz, Ργ); -22,87 (1Ρ, dd, J=19,0 Hz, J=32,0 Hz Ρβ).
P r z y k ł a d III
Sól trietyloamoniowa kwasu boranofosforanowego [zmodyfikowana procedura opisana wcześniej przez V. Nahum i B. Fischer w publikacji „Boranophosphate Salts as an Excellent Mimic of Phosphate Salts: Preparation, Characterization, and Properties” J. lnorg. Chem. vol. 20, 4124-4131 (2004)].
Tris(trimetyiosililo)fosforyn (600 pi, 1,8 mmol) umieszczono w kolbie okrągłodennej zawierającej 5 ml suchego acetonitrylu. Kolbę zamknięto gumowym septum zaopatrzonym w dwie igły i przez mieszaninę przepuszczano argon przez ok. 30 min. Następnie za pomocą strzykawki dodano do roztworu BSA (1,5 ml, 5,4 mmol). Po ok. 30 min kolbę umieszczono w łaźni lodowej, dodano za pomocą strzykawki 1,35 mi 2M roztworu BH3 · SMe2 w THF, po 5 min łaźnię usunięto i kontynuowano mieszanie przez 30 min. Roztwór odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem do oleistej pozostałości, po czym ponownie umieszczono na łaźni lodowej i dodano 20 ml metanolu oraz 500 pi (3,6 mmoi) trietyioaminy, po czym mieszano przez 2 h w temp. pokojowej. Roztwór odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem do sucha i pozostałość wysuszono w eksykatorze próżniowym nad P2O5. Otrzymano 530 mg (17,8 mmoi) [HN(CH2CH3)3]2HPO3BH3 (wydajność 97%) Tak otrzymaną sól trietyloamoniową boranofosforanu przechowywano w szczelnie zamkniętym naczyniu w temperaturze 4°C i w tej postaci używano do daiszych reakcji.
1H NMR δ (ppm): 0,33 (~dq, JB-H = 87,8 Hz, JP-H = 22,3 Hz) 31P NMR δ (ppm): 84,3 (~qq, JP-B = 147 Hz, JP-H = 22,3 Hz).
Synteza GppBH3pG
Imidazlolową pochodną GMP (GMP-Im) (200 mg, 0,46 mmol) oraz sól trietyloamoniową boranofosforanu (70 mg, 0,23 mmoi) w 4 mi DMF i dodano (380 mg, 4 mmoi) bezwodnego MgCi2. Po 1h reakcję zakończono poprzez dodanie roztworu EDTA (1,48 g, 4 mmol) w 40 ml H2O i doprowadzono do pH 6 za pomocą stałego NaHCO3. Produkt oczyszczono za pomocą chromatografii jonowymiennej stosując 0-1,2 M gradient TEAB. Po odparowaniu otrzymano 165 mg (4000 j.opt) GppBH3pG w postaci soli trietyloamoniowej. Wydajność ~65%
ESI MS (-) m/z: 785,12 (wartość obliczona dla C20H29N10O17P3B: 785,10) 1H NMR δ (ppm): 8,11 (1H, s, H8 GA*); 8,09 (1H, s, H8 GB); 5,84 (2H, d, J=5,2 Hz, Η1' GAB); 4,69 (2H, ~t, J=5,1 Hz, H2' GAB); 4,50 (1H, ~t, H3' GAiubB); 4,49 (1H, ~t, H3' GAiubB); 4,31 (2H, m, H4' GAB); 4,24 (4H, m, H5' GAB, H5 GAB). *Indeksy A i B oznaczają protony diastereotopowe.
31P NMR δ (ppm): 75,10 (1Ρ, m, Ρβ(ΡΒΗ3)), -11,20 (1Pa*, ~dt, J=30,2 Hz, J=~5Hz), -11,28 B (1PB*, ~dt, J=30,2 Hz, J=~5Hz). *Indeksy A i B oznaczają jądra diastereotopowe.
Synteza m7GppBH3pG
GppBH3pG (35 mg, 800 j. opt.) rozpuszczono w 1,5 ml DMSO i dodano 20 pi jodku metyiu. Po ~4h rekcje zakończono poprzez dodanie 15 ml H2O i doprowadzono do pH 7 za pomocą stałego NaHCO3. Produkt oczyszczono za pomocą chromatografii jonowymiennej stosując 0-1,2 M gradient TEAB. Zebrano 550 jednostek optycznych diastereomerycznej mieszaniny m7GppBH3pG. Po połączeniu i odparowaniu frakcji zawierających pożądany produkt rozpuszczono je w niewielkiej ilości wody i zamieniono w sól sodową na złożu Dowex. Następnie, diastereoizomery rozdzielono za pomocą
PL 215 513 B1 półpreparatywnego HPLC, zebrane frakcje trzykrotnie zliofilizowano. Wydajność po rozdziale HPLC: m7GppBH3pG (D1) 10,2 mg i oraz m27GppBH3pG (D2) 9,8 mg w postaci soli amonowych (odpowiednio 37,2% i 35,6%).
ESI MS (-) m/z: 799,3 (wartość obliczona dla C21H31N10O17P3B: 799,12).
D1: 1H NMR δ (ppm): 8,02 (1H, s, H8G); 5,89 (1H, d, J=3,0 Hz, H8 m7G); 5,80 (1H, d, J=6,2 Hz, H8G); 4, 68 (1H, ~t, H2' G); 4,51 (1H, ~t, H2' m7G); 4,50 (1H, ~t, H3' G);
4,42 (1H, ~t, H3' G); 4,35 (3H, m (nałożone), H4', H5', H5 G); 4,22 (3H, m (nałożone), H4', H5', H5 m7G), 4,06 (3H, s, CH3), 0,53 (3H, m, BH3);
31P NMR δ (ppm): 75,1 (1P, m, Pp(Pbh3)), - 11,3 (2P, ~d, JPc(-pp = 30,7 Hz, 2 x Pa).
D2: 1H NMR δ (ppm): 8,04 (1H, s, H8G); 5,92 (1H, d, J=3,0 Hz, H8 m7G); 5,82 (1H, d, J=6,2 Hz, H8G); 4, 68 (1H, ~t, H2' G); 4,51 (1H, ~t, H2' m7G); 4,50 (1H, ~t, H3' G);
4,42 (1H, ~t, H3' G); 4,35 (3H, m (nałożone), H4', H5', H5 G); 4,22 (3H, m (nałożone), H4', H5', H5 m7G), 4,06 (3H, s, CH3); 0,53 (3H, m, BH3);
31P NMR δ (ppm): 75,13 (1P, m, Pp(Pbh3)), -11,31 (2P, ~d, Jpa.pp = 30,7 Hz, 2 x Pa).
P r z y k ł a d IV
Synteza m7GppBH3pm7G
GppBH3pG (sól trietyloamoniowa, 50 mg, 570 j. optycznych) rozpuszczono w 1 ml DMSO i dodano 30 μΐ jodku metylu. Po ok. 2h dodano jeszcze 30 μΐ jodku metylu. Po kolejnych dwóch godzinach reakcję zakończono poprzez dodanie roztworu H2O i doprowadzono do pH 7 za pomocą stałego NaHCO3. Produkt oczyszczono za pomocą chromatografii jonowymiennej stosując 0-1,2 M gradient TEAB. Otrzymano 200 j. optycznych produktu, który zamieniono następnie w sól sodową na złożu Dowex. Po wytrąceniu etanolem i wysuszeniu nad P2O5 otrzymano 22 mg soli sodowej m7GppBH3pm7G (~54%).
ESI MS (-) m/z: 813,10 (wartość obliczona dla C22H33N10O17P311B: 813,13) 1H NMR δ (ppm): 9,02 (2H, s, H8 m7G); 6,04 (2H, d, J=3,7 Hz, H2' G); 4,67 (2H, ~t, H2' m7G); 4,53 (2H, ~t, H3' m7G); 4,40 (2H, m, H4' m7G); 4,36 (2H, m, H5' m7G); 4,23 (2H, m, H5 m7G); 4,13 (6H, s, CH3); 0,44 (3H, m, BH3) 31P NMR δ (ppm): 74,90 (1P, m, Pp(PBH3)), -11,33 (1PA*, ~d, JPc-Pp = 31,0 Hz), -11,36 (1PB*, ~d, JPc-Pp = 31,0 Hz). * Indeksy A i B oznaczają protony diastereotopowe.
P r z y k ł a d V
Synteza m7GppBH3pm7G (Wariant II)
Imidazlolową pochodną m7GMP (m7GMP-Im sól sodowa, 225 mg, 0,5 mmol) oraz sól trietyloamoniową boranofosforanu (75 mg, 0,25 mmol) zawieszono w 4 ml DMF i dodano (380 mg, 4 mmol) bezwodnego MgCl2. Po 1h reakcję zakończono poprzez dodanie roztworu EDTA (1,48 g, 4 mmol) w 40 ml H2O i doprowadzono do pH 6 za pomocą stałego NaHCO3. Produkt oczyszczono za pomocą chromatografii jonowymiennej stosując 0-1,1 M gradient TEAB. Po połączeniu i odparowaniu frakcji zawierających pożądany produkt rozpuszczono je w niewielkiej ilości wody i zamieniono w sól sodową na złożu Dowex. Po wytrąceniu etanolem i wysuszeniu w eksykatorze próżniowym nad P2O5 uzyskano 150 mg soli sodowej m7GppBH3pm7G (wydajność 34%). Dane spektralne - jak wyżej.
P r z y k ł a d VI
7,2'-Ο
Synteza m2 ’ - GppBH3pG
Do zawiesiny m2 , - GMP-Im (15 mg, 0,03 mmol, sól Na) i PBH3 (30 mg, 1 mmol, sól TEA) w 0,5 ml DMF, dodano, niewielkimi porcjami, bezwodny MgCl2 (40 mg, 0,4 mmol) po czym mieszaninę intensywnie wytrząsano do momentu rozpuszczenia reagentów (1-2 min). Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodano GMP-Im (40 mg, 0,09 mmol) oraz 40 mg MgCl2. Reakcję zakończono po ok. 5h poprzez dodanie roztworu EDTA (300 mg, 0,8 mmol) w 10 ml wody i doprowadzono do pH 6 za pomocą stałego NaHCO3. Produkty oczyszczono za pomocą półpreparatywnego HPLC, a zebrane frakcje
7,2'-Ο 7,2'-Ο trzykrotnie zliofilizowano. Otrzymano: m2 , - GppBH3pG (D1) 5,1 mg oraz m2 , - GppBH3pG (D2) 4,8 mg w postaci soli amonowych (wydajność odpowiednio 18 i 17%).
ESI MS (-) m/z: 813,14 (wartość obliczona dla C22H33N10O17P311B: 813,13)
D1: 1H NMR δ (ppm): 9,04 (1H, s, H8 m7G); 8,10 (1H, s, H8G); 5,97 (1H, d, J=2,9 Hz, H1'm7G);
5,80 (1H, d, J=5,9 Hz, H1' G); 4,70 (1H, ~t, H2' G); 4,56 (1H, ~t, H3' m7G); 4,50 (1H, ~t Hz, H3' G);
4,41 (1H, m, H5' G); 4,34 (2H, m, nałożone H4' m7G, H4'G); 4,27 (2H, m nałożone, H2' m7G, H5G);
4,24 (2H, m, H5', H5 m7G); 4,08 (3H, s, N-CH3); 3,59 (3H, s, O-CH3), 0,45 (3H, m, BH3).
31P NMR δ (ppm): 75,12 (1P, m, Pp(PBH3)), -11,09 (2P, ~d, JPc-Pp = 30,7 Hz, 2 x Pc)
PL 215 513 B1
D2: 1H NMR δ (ppm): 9,00 (1H, s, H8 m7G); 8,08 (1H, s, H8G); 5,96 (1H, d, J=2,9 Hz, H1 m7G);
5,81 (1H, d, J=5,9 Hz, H1' G); 4,70 (1H, ~t, H2' G); 4,55 (1H, ~t, H3' m7G); 4,48 (1H, ~t, H3' G); 4,40 (2H, m (nałożone), H4' m7G, H5' G); 4,30 (3H, m (nałożone), H2' m7G, H4' G, H5 G); 4,25 (2H, m, H5', H5 m7G); 4,07 (3H, s, N-CH3); 3,62 (3H, s, O-CH3), 0,45 (3H, m, BH3).
31P NMR δ (ppm): 75,12 (1P, m, Pp(Pbh3)), -11,11 (2P, ~d, JPa-Pp = 30,7 Hz, 2 x Pa)
P r z y k ł a d VII
Wyznaczanie stałych asocjacji z białkiem eIF4E
Pomiary miareczkowania fluorescencyjnego zostały przeprowadzone przy użyciu spektrofluorymetru LS-50B (Perkin Elmer Co.) w buforze 50 mM HEPES/KOH (pH 7,2), 100 mM KCl, 0,5 mM
EDTA, 1 mM DTT w temperaturze 20,0 ± 0,2°C. Jednomikrolitrowe roztwory analogu kapu o zwiększającym się stężeniu były dodawane do 1,4 ml roztworu białka o stężeniu 0,1 μΜ. Intensywności fluorescencji (wzbudzenie przy 280 nm, szerokość spektralna szczeliny 2,2 nm, detekcja przy 337 nm, szerokość szczeliny 4 nm i 290 nm fitr cut-off) zostały skorygowane tak, by uwzględniały rozcieńczenie próbki i efekt filtra wewnętrznego. Równowagowe stałe asocjacji (KAS) zostały wyznaczone poprzez dopasowanie teoretycznej zależności intensywności fluorescencji od całkowitego stężenia analogu kapu, do eksperymentalnych punktów danych, zgodnie z wcześniej opisanym równaniem (A. Niedźwiecka et al. „Biophysical Studies of eIF4E Cap-binding Protein: Recognition of mRNA 5' Cap Structure and Synthetic Fragments of eIF4G and 4E-BP1 Proteins” J. Mol. Biol. (2002) vol. 312, 615-635). Stężenie białka zostało dopasowane jako wolny parametr równania równowagi pokazując ilość „aktywnego” białka. Ostatecznie podane wartości KAS zostały podane jako średnie ważone z 3-10 niezależnych miareczkowań, przy czym wagą były odwrotności kwadratów odchyleń standardowych. Numerycznie, nieliniowe dopasowania metodą najmniejszych kwadratów zostały przeprowadzone przy użyciu programu ORGIN 6.0 (Microcal Software Inc., USA).
Swobodne energie Gibbsa wiązania kapu do eIF4E zostały obliczone z wartości KAS zgodnie z równaniem standardowym AG° = - RT1 nKAS.
Badanie podatności na hydrolizę enzymem DcpS
Ekspresję ludzkiego enzymu DcpS przeprowadzono w Escherichia coli według opisanych
2,2,7 wcześniej procedur (L. Cohen et al. „Nematode m7GpppG and m32,2,7GpppG decapping: Activities in Ascaris embryos and characterization of C. elegans scavenger DcpS (2004), vol. 10, 1609-1624). Białko przechowywano w temp. -80°C w 20 mM buforze Tris, pH 7,5, zawierającym 50 mM KCl, 0,2 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5 mM PMSF oraz 20% glicerol.
Reakcje enzymatyczne prowadzono w temperaturze 30°C, w 50 mM buforze Tris, pH=7,9, zawierającym 20 mM of MgCl2 i 60 mM of (NH4)2SO4. Do 40 μΜ roztworu odpowiedniego analogu kapu w buforze dodawano 5 μΐ enzymu DcpS i inkubowano przez 120 min. Po 10, 30, 60 oraz 120 min od rozpoczęcia reakcji, z mieszaniny reakcyjnej pobierano próbki o objętości 100 μ|, dezaktywowano enzym przez 2 min w 90°C, po czym skład mieszaniny poreakcyjnej analizowano przy użyciu analitycznego HPLC stosując do elucji liniowy gradient metanolu w 0,1 M buforze KH2PO4 (0-50% w ciągu 15 min).
P r z y k ł a d VIII
Wydajność translacji mRNA kapowanych boranofosforanowymi analogami kapu
a. transkrypcja in vitro
Matrycą DNA do transkrypcji in vitro był produkt PCR zawierający sekwencję kodującą lucyferazę świetlika ('firefly luciferase') poprzedzoną bezpośrednio sekwencją 5'UTR mRNA b-globiny króliczej i promotorem dla DNA-zależnej polimerazy RNA SP6 (SP6p-5'UTR^globin-LUCiferase).
Reakcja transkrypcji in vitro prowadzona była standardowo w 50 μΙ mieszaniny reakcyjnej. Skład mieszaniny reakcyjnej (końcowe stężenia): bufor do transkrypcji przez polimerazę SP6-Fermentas, matryca DNA 2 μg (0,04 μg/μl), inhibitor RNaz - RiboLock - Fermentas (2υ/μΙ), ATP/CTP/UTP (2 mM), GTP (0,1 mM), dinukletydowy analog kapu (1 mM) [10-krotny nadmiar kapu w stosunku do GTP pozwala na przyłączenie struktury kapu do 5'-końca mRNA przez polimerazę RNA; poziom GTP jest następnie uzupełniany, aby uzyskać pełnej długości transkrypty]. Mieszanina była inkubowana przez 5 minut w 37°C przed dodaniem polimerazy SP6 - Fermentas (st. końcowe 2U^l). Reakcje prowadzono przez 30 minut w 37°C, a następnie dodano GTP do stężenia 1 mM i kontynuowano reakcję przez kolejne 90 minut.
Po reakcji transkrypcji wytrawiano matrycę DNA dodając do próbki DNazę (RQ1 DNase, RNase-free, Promega) w ilości 1U na 1 μg DNA. Reakcję prowadzono w buforze transkrypcyjnym przez 20 minut w 37°C.
PL 215 513 B1
Transkrypty RNA oczyszczono na złożu Sephadex G-50 ('spin kolumn chromatography'). Stężenie oznaczono spektrofotometrycznie. Wodne roztwory transkryptów przechowywano w -80°C.
b. wydajność translacji kapowanego mRNA w lizacie z retikulocytów króliczych (RRL) Reakcję translacji standardowo prowadzono w objętości 10 ul przez 60 minut w 30°C, dla warunków ustalonych dla kap-zależnej translacji. W skład mieszaniny translacyjnej wchodziły: lizat z retikulocytów króliczych - Promega7 Flexi RRL- (40% w końcowej objętości), mieszanina aminokwasów (0,01 mM), octan magnezu (1.2 mM), octan potasu (170 mM) i mRNA. Reakcja translacji prowadzona była dla 5 stężeń mRNA: 0.25/0.5/1/2 i 4 ng/μΗ Aktywność powstałej lucyferazy mierzono w luminometrze, wyniki naniesiono na wykres i do punktów dopasowano prostą (regresja liniowa). Wydajność translacji charakteryzowano poprzez współczynnik nachylenia dopasowanej prostej7 a wyniki porównywano do mRNA kapowanego in vitro m7GpppG (wydajność translacji = 1).
T a b e l a 2
Wydajność translacji in vitro mRNA lucyferazy kapowanego modyfikowanymi dinukleotydowymi analogami kapu w odniesieniu do m7GpppG-LUC-RNA.
| Rodzaj kapu na 5' końcu LUC-RNA | Wydajność translacji w odniesieniu do m7GpppG-kapowanego RNA | ||||
| Numer eksperymentu | 1 | 2 | 3 | 4 | Średnia (+/- SD) |
| ApppG— | 0734 | 0755 | 0753 | 0748 | 0748 ( 0709) |
| m7GpppG— | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| m7,3'O-GpppG— | 2753 | 2792 | 2796 | 2750 | 2773 ( 0725) |
| m7GppBH3pG--- | 1766 | 1742 | 1714 | - | 1741 (0726) |
| m7GppBH3pm7G--- | - | 2763 | 2791 | 2789 | 2781 (0716) |
P r z y k ł a d IX
Inhibicja zależnej od kapu translacji w lizacie z retikulocytów króliczych przez boranofosforanów dinukleotydowe analogi kapu
Reakcję translacji in vitro standardowo prowadzono w objętości 12.5 μl przez 60 minut w 30°C, dla warunków ustalonych dla kap-zależnej translacji. Mieszanina reakcyjna była inkubowana przez 60 minut przed dodaniem inhibitora (kapu) i mRNA lucyferazy. W celu analizy stabilności badanych kapów w lizacie retikulocytów króliczych (rabbit reticulocyte lysate, RRL) dany analog był inkubowany w mieszaninie reakcyjnej przez 60 minut w 30°C, i następnie dodawano mRNA lucyferazy.
W skład mieszaniny translacyjnej wchodziły: lizat z retikulocytów króliczych - Promega7 Flexi RRL - (58% w końcowej objętości), mieszanina aminokwasów (0.01 mM), octan magnezu (1.2 mM), octan potasu (170 mM)> RiboLock inhibitor RNaz (0.32υ/μΟ, analog kapu (1/10 objętości reakcji) i mRNA lucyferazy. mRNA lucyferazy wykapowane m773'O-GpppG zostało otrzymane podczas transkrypcji in vitro. Otrzymane transkrypty m773'O-GpppG_rb-bglobin-UTR_LUC nie były poliadenylowane na końcu 3' RNA. Reakcje przeprowadzono dla zakresu stężeń inhibitora od 0.12 μΜ do 100 μΜ.
Aktywność lucyferazy w poszczególnych próbkach mierzono w luminometrze. Otrzymane wyniki analizowano na wykresie, i wyznaczano wartość IC50 przez dopasowanie do otrzymanych punktów krzywej o wzorze: y = Z/(1+x/IC50)+N (gdzie: y - cała translacja, Z - komponent kap-zależnej translacji, N - komponent kap-niezależnej translacji, x - stężenie inhibitora).
Badania biofizyczne i biochemiczne
Powinowactwo analogów kapu do białkowego czynnika inicjującego translację 4E (eIF4E; ang. eukaryotic initiation factor 4E), zostało wyznaczone metodą miareczkowania fluorescencyjnego. Stwierdzono, że wszystkie z badanych boranofosforanowych analogów kapu charakteryzują się stałymi asocjacji (KAS) nie mniejszymi lub większymi niż ich niemodyfikowane odpowiedniki (tabela 2).
Zbadano także podatność nowych analogów kapu na hydrolizę ludzkim enzymem DcpS. Postęp reakcji enzymatycznych monitorowano, za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Stwierdzono, że wszystkie analogi zmodyfikowane w pozycji β łańcucha trifosforanowego, są odporne na hydrolizę enzymem DcpS (tabela 2).
Wydajność translacji mRNA kapowanych boranofosforanowymi analogami kapu testowano in vitro w lizatach z reticulocytów króliczych (rabbit reticulocyte lysate, RRL). mRNA zakończone boranofosforanowymi analogami kapu wykazują zwiększoną wydajność translacyjną w stosunku
PL 215 513 B1 do niemodyfikowanych mRNA, szczególnie w przypadku analogów mających zdolność do wbudowywania się do mRNA wyłącznie w prawidłowej orientacji (jak np. m7GppBH3pm7G oraz analogi metylowane w pozycji 2'- lub 3'- rybozy w obrębie 7-metyloguanozyny). Ze względu na ich zwiększoną odporność enzymatyczną, efekt ten będzie jeszcze bardziej widoczny in vivo.
Właściwości boranofosforanowych analogów kapu jako inhibitorów zależnej od kapu translacji, również testowano w lizatach z reticulocytów króliczych. Przeprowadzono dwa rodzaje eksperymentów, w których analog kapu dodawany był do RRL bądź razem z mRNA (warunki A), bądź też był preinkubowany w RRL przez 60 min przed dodaniem mRNA. W obu eksperymentach boranofosforanowe analogi kapu były dobrymi inhibitorami translacji (bądź lepszymi bądź porównywalnymi z m7GpppG). Co więcej, w przeciwieństwie do m7GpppG, preinkubacja tychże analogów w RRL nie osłabiała ich właściwości inhibitorowych (tabela 2, fig. 5 i fig. 6), co prawdopodobnie jest związane z ich zwiększoną odpornością na degradację przez enzymy o aktywności pirofosfataz.
T a b e l a 3
Biofizyczne właściwości boranofosforanowych analogów kapu
| Analog kapu | K.\s kap- eIF4E“ (μΜ1) | Podatność na DcpS | Względna wydajność translacji w odniesieniu do m7GpppG- kapowanego RNA | Wartość IC50 w lizatach z retikulocytów króliczych (warunki A, bez preinkubacji) | Wartość IC50 w lizatach z retikulocytów króliczych (warunki B, preinkubacja kapu przez 60 min) |
| m7GpppG | 9.4 ± 0.4 | hydrolizowany | 1 | 9,75 ± 2,75 | 35,1 ± 10,8 |
| m7Gpppm7G | 5.0 ± 0.2 | hydrolizowany | N.B. | N.B. | N.B. |
| rr/GpppBmG (Dl) | 14.5 ± 0.2 | hydrolizowany | N.B. | N.B. | N.B. |
| m'GpppBH3G (D2) | 14.4 ± 0.6 | hydrolizowany | N.B. | N.B. | N.B. |
| m'GppBH3pG (Dl) | 44 ±2 | odporny | 1.41 ±0.26 (dla mieszaniny Dl i D2) | 1,70 ±0,60 | 1,49 ±0,68 |
| m'GppBH3pG (D2) | 13.0 ± 0.2 | odporny | 13 ± 8 | 3,9 ± 2,78 | |
| m7GppBH3pm7G | 11.1 ± 0.2 | odporny | 2.81 ±0.16 | 9±3 | 2,66 ± 1,35 |
| °GpppBH3G | 10,8 ± 0,3 | hydrolizowany | N.B. | N.B. | N.B. |
| m27 3 ’ °GpPPBH3G | 10,2 ± 0,3 | hydrolizowany | 2.73 ±0.25* | N.B. | N.B. |
PL 215 513 B1
Claims (13)
1. Nowe boranofosforanowe analogi dinukleotydów o wzorze ogólnym 1, w którym Y1, Y2, Y3, Y4 oznaczają niezależnie O lub BH3, przy czym co najmniej jeden Y oznacza BH3, n wynosi 0 iub 1,
N oznacza grupę o wzorze 6 lub grupę o wzorze 7, w których:
R1 i R2 oznaczają niezależnie H, OH, OCH3 iub OCH2CH3,
X oznacza metyi, etyi, propyi, butyi, benzyi, podstawiony benzyi, naftyiometyi iub podstawiony naftyiometyi,
B oznacza grupę o wzorze 2a, 2b, 3, 4 lub 5,
R3 i R4 oznaczają niezależnie H, OH, OCH3 iub OCH2CH3 w postaci wolnej lub w postaci soli, ich diastereoizomery i mieszaniny diastereoizomerów.
2. Nowe boranofosforanowe analogi według zastrz. 1, w których B oznacza grupę o wzorze 2a iub 2b.
3. Nowe boranofosforanowe analogi według zastrz. 1, w których R3 i R4 oznaczają OH, N oznacza grupę o wzorze 6 lub 7, X oznacza metyl, etyl, propyl, butyl, benzyl, podstawiony benzyl, naftylometyi iub podstawiony naftyiometyl, B oznacza grupę o wzorze 2a, 2b, 3, 4, lub 5, a R1 i R2 oznaczają niezależnie H, OH, OCH3, i OCH2CH3, przy czym jeżeli B oznacza grupę o wzorze 2a, 3, 4 lub 5 wówczas jeden spośród R1 i R2 ma znaczenie inne niż OH.
4. Nowe boranofosforanowe analogi według zastrz. 3, w których N oznacza grupę o wzorze 6, R2 oznacza OH, R1 oznacza H iub CH3, X oznacza metyi, n wynosi 0, a jeden spośród Y1, Y2, Y3 oznacza BH3.
5. Nowe boranofosforanowe analogi według zastrz. 1, w których grupa BH3 jest w pozycji β lub γ.
6. Nowe boranofosforanowe analogi dinukleozydów o wzorze ogólnym 1, w którym Y1, Y2, Y3, Y4 oznaczają niezależnie O lub BH3, przy czym co najmniej jeden Y oznacza BH3, n wynosi 0 iub 1,
PL 215 513 B1
N oznacza grupę o wzorze 6 lub grupę o wzorze 7, R1 i R2 oznaczają niezależnie H, OH, OCH3 lub OCH2CH3, X oznacza metyl, etyl, propyl, butyl, benzyl, podstawiony benzyl, naftylometyl lub podstawiony naftylometyl, B oznacza grupę o wzorze 2a, 2b, 3, 4 lub 5, R3 i R4 oznaczają niezależnie H, OH, OCH3 lub OCH2CH3 do zastosowania jako inhibitory zależnej od kapu translacji.
7. Nowe boranofosforanowe analogi według zastrz. 5 do zastosowania jako inhibitor translacji w komórkach nowotworowych.
8. Cząsteczka RNA zawierająca na końcu 5' nowy boranofosforanowy analog o ogólnym wzorze 1, w którym B oznacza grupę o wzorze 2a, 2b, 3, 4, lub 5, N oznacza grupę o wzorze 6 lub 7, X oznacza metyl, etyl, propyl, butyl, benzyl, podstawiony benzyl, naftylometyl lub podstawiony naftylometyl, a R1 i R2 oznaczają niezależnie H, OH, OCH3, i OCH2CH3, R3 i R4 oznaczają niezależnie H, OH, OCH3, i OCH2CH3, z tym że, jeżeli B oznacza grupę o wzorze 2a, 3, 4, lub 5, wówczas jeden spośród R1 i R2 ma znaczenie inne niż OH, natomiast R3 i R4 oznaczają OH, a jeżeli B oznacza grupę o wzorze 2 b, wówczas albo R1 i R2, albo R3 i R4 oznaczają OH, jego diastereoizomer lub mieszaninę diastereoizomerów.
9. Cząsteczka RNA według zastrz. 8, zawierająca na końcu 5' nowy boranofosforanowy analog, w którym grupa BH3 jest w pozycji β.
10. Cząsteczka RNA według zastrz. 8, zawierająca na końcu 5' nowy boranofosforanowy analog, w którym w których B oznacza grupę o wzorze 2a lub 2b.
11. Sposób otrzymywania in vitro RNA zawierającego na końcu 5' nowy boranofosforanowy analog o ogólnym wzorze 1, w którym B oznacza grupę o wzorze 2a, 2b, 3, 4, lub 5, N oznacza grupę o wzorze 6 lub 7, X oznacza metyl, etyl, propyl, butyl, benzyl, podstawiony benzyl, naftylometyl lub podstawiony naftylometyl, a R1 i R2 oznaczają niezależnie H, OH, OCH3, i OCH2CH3, R3 i R4 oznaczają niezależnie H, OH, OCH3, i OCH2CH3, z tym że, jeżeli B oznacza grupę o wzorze 2a, 3, 4, lub 5, wówczas jeden spośród R1 i R2 ma znaczenie inne niż OH, natomiast R3 i R4 oznaczają OH, a jeżeli B oznacza grupę o wzorze 2 b, wówczas albo R1 i R2, albo R3 i R4 oznaczają OH, jego diastereoizomer lub mieszaninę diastereoizomerów, znamienny tym, że na polinukleotydowej matrycy w obecności polimerazy RNA poddaje się reakcji ATP, CTP, UTP, GTP oraz związek o wzorze 1 w warunkach zapewniających transkrypcję polinukleotydowej matrycy przez polimerazę RNA.
12. Sposób otrzymywania peptydu, białka lub peptydowego antygenu in vitro, znamienny tym, że translacji w układzie bezkomórkowym poddaje się cząsteczkę RNA zawierającą na końcu 5' nowy boranofosforanowy analog o wzorze 1 według zastrz. 8, przy czym cząsteczka RNA ma otwartą ramkę odczytu, a proces prowadzi się w warunkach sprzyjających translacji otwartej ramki odczytu RNA do peptydu, białka lub peptydowego antygenu kodowanego przez otwartą ramkę odczytu
13. Sposób otrzymywania peptydu, białka lub peptydowego antygenu w hodowli komórkowej, znamienny tym, że do hodowli komórkowej wprowadza się cząsteczkę RNA zawierającą na końcu 5' nowy boranofosforanowy analog o wzorze 1 według zastrz. 8, przy czym cząsteczka RNA ma otwartą ramkę odczytu, a proces prowadzi się w warunkach sprzyjających translacji otwartej ramki odczytu RNA do peptydu, białka lub peptydowego antygenu kodowanego przez otwartą ramkę odczytu.
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL385388A PL215513B1 (pl) | 2008-06-06 | 2008-06-06 | Nowe boranofosforanowe analogi dinukleotydów, ich zastosowanie, czasteczka RNA, sposób otrzymywania RNA oraz sposób otrzymywania peptydów lub bialka |
| JP2011512643A JP5715560B2 (ja) | 2008-06-06 | 2009-06-04 | ｍＲＮＡ ＣＡＰ類似体 |
| AU2009256131A AU2009256131B2 (en) | 2008-06-06 | 2009-06-04 | mRNA cap analogs |
| PCT/US2009/046249 WO2009149253A2 (en) | 2008-06-06 | 2009-06-04 | Mrna cap analogs |
| US12/996,243 US8519110B2 (en) | 2008-06-06 | 2009-06-04 | mRNA cap analogs |
| PL09759412T PL2297175T3 (pl) | 2008-06-06 | 2009-06-04 | Analogi czapeczki mRNA |
| EP09759412.1A EP2297175B1 (en) | 2008-06-06 | 2009-06-04 | Mrna cap analogs |
| CA2727091A CA2727091C (en) | 2008-06-06 | 2009-06-04 | Mrna cap analogs |
| ES09759412T ES2425781T3 (es) | 2008-06-06 | 2009-06-04 | Análogos de CAP de ARNm |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL385388A PL215513B1 (pl) | 2008-06-06 | 2008-06-06 | Nowe boranofosforanowe analogi dinukleotydów, ich zastosowanie, czasteczka RNA, sposób otrzymywania RNA oraz sposób otrzymywania peptydów lub bialka |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL385388A1 PL385388A1 (pl) | 2009-12-07 |
| PL215513B1 true PL215513B1 (pl) | 2013-12-31 |
Family
ID=41398862
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL385388A PL215513B1 (pl) | 2008-06-06 | 2008-06-06 | Nowe boranofosforanowe analogi dinukleotydów, ich zastosowanie, czasteczka RNA, sposób otrzymywania RNA oraz sposób otrzymywania peptydów lub bialka |
| PL09759412T PL2297175T3 (pl) | 2008-06-06 | 2009-06-04 | Analogi czapeczki mRNA |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL09759412T PL2297175T3 (pl) | 2008-06-06 | 2009-06-04 | Analogi czapeczki mRNA |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8519110B2 (pl) |
| EP (1) | EP2297175B1 (pl) |
| JP (1) | JP5715560B2 (pl) |
| AU (1) | AU2009256131B2 (pl) |
| CA (1) | CA2727091C (pl) |
| ES (1) | ES2425781T3 (pl) |
| PL (2) | PL215513B1 (pl) |
| WO (1) | WO2009149253A2 (pl) |
Families Citing this family (212)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012019168A2 (en) | 2010-08-06 | 2012-02-09 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
| DE19177059T1 (de) | 2010-10-01 | 2021-10-07 | Modernatx, Inc. | N1-methyl-pseudouracile enthältendes ribonucleinsäuren sowie ihre verwendungen |
| DE12722942T1 (de) | 2011-03-31 | 2021-09-30 | Modernatx, Inc. | Freisetzung und formulierung von manipulierten nukleinsäuren |
| US9464124B2 (en) | 2011-09-12 | 2016-10-11 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
| JP6113737B2 (ja) | 2011-10-03 | 2017-04-12 | モデルナティエックス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａＴＸ，Ｉｎｃ． | 修飾型のヌクレオシド、ヌクレオチドおよび核酸、ならびにそれらの使用方法 |
| MX2014007233A (es) | 2011-12-16 | 2015-02-04 | Moderna Therapeutics Inc | Composiciones de nucleosidos, nucleotidos y acidos nucleicos modificados. |
| WO2013143555A1 (en) * | 2012-03-26 | 2013-10-03 | Biontech Ag | Rna formulation for immunotherapy |
| EP2834259A4 (en) | 2012-04-02 | 2016-08-24 | Moderna Therapeutics Inc | MODIFIED POLYNUCLEOTIDES |
| US9283287B2 (en) | 2012-04-02 | 2016-03-15 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins |
| US9572897B2 (en) | 2012-04-02 | 2017-02-21 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins |
| US10501512B2 (en) | 2012-04-02 | 2019-12-10 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides |
| CA2892529C (en) | 2012-11-26 | 2023-04-25 | Moderna Therapeutics, Inc. | Terminally modified rna |
| EP2931319B1 (en) | 2012-12-13 | 2019-08-21 | ModernaTX, Inc. | Modified nucleic acid molecules and uses thereof |
| CN103254260B (zh) * | 2013-02-07 | 2015-11-11 | 江西科技师范大学 | 由核苷氢亚磷酸单酯合成对称双核苷二磷酸二钠盐的方法 |
| US10258698B2 (en) | 2013-03-14 | 2019-04-16 | Modernatx, Inc. | Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions |
| EP2983804A4 (en) | 2013-03-15 | 2017-03-01 | Moderna Therapeutics, Inc. | Ion exchange purification of mrna |
| WO2014152031A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Moderna Therapeutics, Inc. | Ribonucleic acid purification |
| US10077439B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-09-18 | Modernatx, Inc. | Removal of DNA fragments in mRNA production process |
| US8980864B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-03-17 | Moderna Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of altering cholesterol levels |
| EP3578663A1 (en) * | 2013-03-15 | 2019-12-11 | ModernaTX, Inc. | Manufacturing methods for production of rna transcripts |
| JP7019233B2 (ja) | 2013-07-11 | 2022-02-15 | モデルナティエックス インコーポレイテッド | ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドおよび合成ｓｇＲＮＡを含む組成物ならびに使用方法 |
| EP3041934A1 (en) | 2013-09-03 | 2016-07-13 | Moderna Therapeutics, Inc. | Chimeric polynucleotides |
| EP3041938A1 (en) | 2013-09-03 | 2016-07-13 | Moderna Therapeutics, Inc. | Circular polynucleotides |
| WO2015048744A2 (en) | 2013-09-30 | 2015-04-02 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides |
| EP3052511A4 (en) | 2013-10-02 | 2017-05-31 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotide molecules and uses thereof |
| CA2926218A1 (en) | 2013-10-03 | 2015-04-09 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor |
| SG10201805660WA (en) | 2013-12-30 | 2018-08-30 | Curevac Ag | Methods for rna analysis |
| EP3540060A1 (en) | 2013-12-30 | 2019-09-18 | CureVac AG | Methods for rna analysis |
| CN106661621B (zh) | 2014-06-10 | 2020-11-03 | 库尔维科公司 | 用于增强rna产生的方法和工具 |
| US10286086B2 (en) | 2014-06-19 | 2019-05-14 | Modernatx, Inc. | Alternative nucleic acid molecules and uses thereof |
| US10407683B2 (en) | 2014-07-16 | 2019-09-10 | Modernatx, Inc. | Circular polynucleotides |
| US20170204152A1 (en) | 2014-07-16 | 2017-07-20 | Moderna Therapeutics, Inc. | Chimeric polynucleotides |
| WO2016014846A1 (en) | 2014-07-23 | 2016-01-28 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of intrabodies |
| EP3041948B1 (en) | 2014-11-10 | 2019-01-09 | Modernatx, Inc. | Alternative nucleic acid molecules containing reduced uracil content and uses thereof |
| WO2016098028A1 (en) | 2014-12-16 | 2016-06-23 | Novartis Ag | End capped nucleic acid molecules |
| EP4019635A1 (en) | 2015-03-25 | 2022-06-29 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-related methods, compositions and components |
| RU2749113C2 (ru) | 2015-04-22 | 2021-06-04 | Куревак Аг | Содержащая рнк композиция для лечения опухолевых заболеваний |
| WO2016183236A1 (en) | 2015-05-11 | 2016-11-17 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for treating hiv infection and aids |
| JP7030522B2 (ja) | 2015-05-11 | 2022-03-07 | エディタス・メディシン、インコーポレイテッド | 幹細胞における遺伝子編集のための最適化ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９システムおよび方法 |
| CN107873055B (zh) | 2015-05-29 | 2021-09-17 | 库瑞瓦格房地产有限公司 | 包括至少一个切向流过滤步骤的产生和纯化rna的方法 |
| CN116334142A (zh) | 2015-06-09 | 2023-06-27 | 爱迪塔斯医药公司 | 用于改善移植的crispr/cas相关方法和组合物 |
| EP4239080A3 (en) | 2015-07-01 | 2023-11-01 | CureVac Manufacturing GmbH | Method for analysis of an rna molecule |
| EP3350333B1 (en) | 2015-09-17 | 2021-10-27 | ModernaTX, Inc. | Polynucleotides containing a stabilizing tail region |
| RS63030B1 (sr) | 2015-09-17 | 2022-04-29 | Modernatx Inc | Jedinjenja i kompozicije za intracelularno isporučivanje terapeutskih sredstava |
| US11434486B2 (en) | 2015-09-17 | 2022-09-06 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides containing a morpholino linker |
| AU2016336344A1 (en) | 2015-10-05 | 2018-04-19 | Modernatx, Inc. | Methods for therapeutic administration of messenger ribonucleic acid drugs |
| WO2017066789A1 (en) * | 2015-10-16 | 2017-04-20 | Modernatx, Inc. | Mrna cap analogs with modified sugar |
| WO2017066781A1 (en) * | 2015-10-16 | 2017-04-20 | Modernatx, Inc. | Mrna cap analogs with modified phosphate linkage |
| US11866754B2 (en) | 2015-10-16 | 2024-01-09 | Modernatx, Inc. | Trinucleotide mRNA cap analogs |
| AU2016341919A1 (en) | 2015-10-21 | 2018-04-19 | Editas Medicine, Inc. | CRISPR/CAS-related methods and compositions for treating hepatitis b virus |
| CN109312338B (zh) | 2015-10-30 | 2022-09-27 | 爱迪塔斯医药公司 | 治疗单纯疱疹病毒的crispr/cas相关方法及组合物 |
| JP7114465B2 (ja) | 2015-12-22 | 2022-08-08 | モデルナティエックス インコーポレイテッド | 薬剤の細胞内送達のための化合物および組成物 |
| EP3394280A1 (en) | 2015-12-23 | 2018-10-31 | CureVac AG | Method of rna in vitro transcription using a buffer containing a dicarboxylic acid or tricarboxylic acid or a salt thereof |
| EP3394093B1 (en) | 2015-12-23 | 2022-01-26 | Modernatx, Inc. | Methods of using ox40 ligand encoding polynucleotides |
| MA43587A (fr) | 2016-01-10 | 2018-11-14 | Modernatx Inc | Arnm thérapeutiques codant pour des anticorps anti-ctla-4 |
| PL415967A1 (pl) * | 2016-01-29 | 2017-07-31 | Univ Warszawski | 5'-tiofosforanowe analogi końca 5' mRNA (kapu), sposób ich otrzymywania i zastosowanie |
| EP3417069A1 (en) | 2016-02-15 | 2018-12-26 | CureVac AG | Method for analyzing by-products of rna in vitro transcription |
| US11920174B2 (en) | 2016-03-03 | 2024-03-05 | CureVac SE | RNA analysis by total hydrolysis and quantification of released nucleosides |
| WO2017162266A1 (en) | 2016-03-21 | 2017-09-28 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Rna replicon for versatile and efficient gene expression |
| WO2017162265A1 (en) | 2016-03-21 | 2017-09-28 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Trans-replicating rna |
| WO2017180917A2 (en) | 2016-04-13 | 2017-10-19 | Modernatx, Inc. | Lipid compositions and their uses for intratumoral polynucleotide delivery |
| WO2017191258A1 (en) | 2016-05-04 | 2017-11-09 | Curevac Ag | Influenza mrna vaccines |
| MX2018013445A (es) | 2016-05-06 | 2019-09-09 | Juno Therapeutics Inc | Celulas diseñadas geneticamente y metodos para obtener las mismas. |
| CA3024917A1 (en) | 2016-05-18 | 2017-11-23 | Modernatx, Inc. | Combinations of mrnas encoding immune modulating polypeptides and uses thereof |
| WO2017201332A1 (en) | 2016-05-18 | 2017-11-23 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding acyl-coa dehydrogenase, very long-chain for the treatment of very long-chain acyl-coa dehydrogenase deficiency |
| WO2017201346A1 (en) | 2016-05-18 | 2017-11-23 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding porphobilinogen deaminase for the treatment of acute intermittent porphyria |
| US11001861B2 (en) | 2016-05-18 | 2021-05-11 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding galactose-1-phosphate uridylyltransferase for the treatment of galactosemia type 1 |
| EP3458107B1 (en) | 2016-05-18 | 2024-03-13 | ModernaTX, Inc. | Polynucleotides encoding jagged1 for the treatment of alagille syndrome |
| CA3024507A1 (en) | 2016-05-18 | 2017-11-23 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding .alpha.-galactosidase a for the treatment of fabry disease |
| JP7246930B2 (ja) | 2016-05-18 | 2023-03-28 | モデルナティエックス インコーポレイテッド | インターロイキン－１２（ｉｌ１２）をコードするポリヌクレオチドおよびその使用 |
| AU2017268396B2 (en) | 2016-05-18 | 2023-05-18 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding citrin for the treatment of citrullinemia type 2 |
| EP3468537A1 (en) | 2016-06-14 | 2019-04-17 | Modernatx, Inc. | Stabilized formulations of lipid nanoparticles |
| SG11201811432WA (en) | 2016-08-19 | 2019-03-28 | Curevac Ag | Rna for cancer therapy |
| JP7289265B2 (ja) | 2016-10-26 | 2023-06-09 | キュアバック エスイー | 脂質ナノ粒子ｍＲＮＡワクチン |
| US11583504B2 (en) | 2016-11-08 | 2023-02-21 | Modernatx, Inc. | Stabilized formulations of lipid nanoparticles |
| US11524066B2 (en) | 2016-12-23 | 2022-12-13 | CureVac SE | Henipavirus vaccine |
| US11141476B2 (en) | 2016-12-23 | 2021-10-12 | Curevac Ag | MERS coronavirus vaccine |
| JP2020508056A (ja) | 2017-02-22 | 2020-03-19 | クリスパー・セラピューティクス・アクチェンゲゼルシャフトＣＲＩＳＰＲ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ＡＧ | 遺伝子編集のための組成物および方法 |
| SG11201907916TA (en) | 2017-03-15 | 2019-09-27 | Modernatx Inc | Compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents |
| JP7332478B2 (ja) | 2017-03-15 | 2023-08-23 | モデルナティエックス インコーポレイテッド | 脂質ナノ粒子製剤 |
| AU2018270111B2 (en) | 2017-05-18 | 2022-07-14 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding tethered interleukin-12 (IL12) polypeptides and uses thereof |
| US11485972B2 (en) | 2017-05-18 | 2022-11-01 | Modernatx, Inc. | Modified messenger RNA comprising functional RNA elements |
| WO2018232006A1 (en) | 2017-06-14 | 2018-12-20 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding coagulation factor viii |
| WO2018231990A2 (en) | 2017-06-14 | 2018-12-20 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase |
| EP3638678A1 (en) | 2017-06-14 | 2020-04-22 | Modernatx, Inc. | Compounds and compositions for intracellular delivery of agents |
| US10034951B1 (en) | 2017-06-21 | 2018-07-31 | New England Biolabs, Inc. | Use of thermostable RNA polymerases to produce RNAs having reduced immunogenicity |
| BR112019028280A2 (pt) | 2017-07-04 | 2020-07-14 | Curevac Ag | moléculas de ácido nucleico |
| US20200362382A1 (en) | 2017-08-18 | 2020-11-19 | Modernatx, Inc. | Methods of preparing modified rna |
| WO2019038332A1 (en) | 2017-08-22 | 2019-02-28 | Curevac Ag | VACCINE AGAINST BUNYAVIRUS |
| EP3675817A1 (en) | 2017-08-31 | 2020-07-08 | Modernatx, Inc. | Methods of making lipid nanoparticles |
| WO2019053056A1 (en) | 2017-09-13 | 2019-03-21 | Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh | RNA REPLICON FOR EXPRESSING A T CELL RECEPTOR OR ARTIFICIAL LYMPHOCYTIC T CELL RECEPTOR |
| JP7424968B2 (ja) | 2017-09-13 | 2024-01-30 | バイオエヌテック エスエー | 細胞におけるｒｎａ発現を増強する方法 |
| EP3681993A1 (en) | 2017-09-13 | 2020-07-22 | BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH | Rna replicon for reprogramming somatic cells |
| CN111511924A (zh) | 2017-11-08 | 2020-08-07 | 库瑞瓦格股份公司 | Rna序列调整 |
| JP7424976B2 (ja) | 2017-11-22 | 2024-01-30 | モダーナティエックス・インコーポレイテッド | プロピオン酸血症の治療用のプロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼアルファ及びベータサブユニットをコードするポリヌクレオチド |
| WO2019104160A2 (en) | 2017-11-22 | 2019-05-31 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding phenylalanine hydroxylase for the treatment of phenylketonuria |
| MA50803A (fr) | 2017-11-22 | 2020-09-30 | Modernatx Inc | Polynucléotides codant pour l'ornithine transcarbamylase pour le traitement de troubles du cycle de l'urée |
| US11931406B2 (en) | 2017-12-13 | 2024-03-19 | CureVac SE | Flavivirus vaccine |
| SG11202005760PA (en) | 2017-12-21 | 2020-07-29 | Curevac Ag | Linear double stranded dna coupled to a single support or a tag and methods for producing said linear double stranded dna |
| US11802146B2 (en) | 2018-01-05 | 2023-10-31 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding anti-chikungunya virus antibodies |
| US20210361761A1 (en) | 2018-04-05 | 2021-11-25 | Curevac Ag | Novel yellow fever nucleic acid molecules for vaccination |
| EP3773745A1 (en) | 2018-04-11 | 2021-02-17 | ModernaTX, Inc. | Messenger rna comprising functional rna elements |
| EP4227319A1 (en) | 2018-04-17 | 2023-08-16 | CureVac SE | Novel rsv rna molecules and compositions for vaccination |
| FR3081169B1 (fr) * | 2018-05-15 | 2020-06-19 | Messenger Biopharma | Substitution de la coiffe des arn messagers par deux sequences d'arn introduites a leur extremite 5' |
| EP3813874A1 (en) | 2018-06-27 | 2021-05-05 | CureVac AG | Novel lassa virus rna molecules and compositions for vaccination |
| WO2020023390A1 (en) | 2018-07-25 | 2020-01-30 | Modernatx, Inc. | Mrna based enzyme replacement therapy combined with a pharmacological chaperone for the treatment of lysosomal storage disorders |
| US20220110966A1 (en) | 2018-09-02 | 2022-04-14 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding very long-chain acyl-coa dehydrogenase for the treatment of very long-chain acyl-coa dehydrogenase deficiency |
| MA53608A (fr) | 2018-09-13 | 2021-07-21 | Modernatx Inc | Polynucléotides codant pour les sous-unités e1-alpha, e1-beta et e2 du complexe alpha-cétoacide déshydrogénase à chaîne ramifiée pour le traitement de la leucinose |
| WO2020056147A2 (en) | 2018-09-13 | 2020-03-19 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding glucose-6-phosphatase for the treatment of glycogen storage disease |
| MA53615A (fr) | 2018-09-14 | 2021-07-21 | Modernatx Inc | Polynucléotides codant pour le polypeptide a1, de la famille de l'uridine diphosphate glycosyltransférase 1, pour le traitement du syndrome de crigler-najjar |
| WO2020061367A1 (en) | 2018-09-19 | 2020-03-26 | Modernatx, Inc. | Compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents |
| JP2022501367A (ja) | 2018-09-20 | 2022-01-06 | モデルナティエックス インコーポレイテッドModernaTX, Inc. | 脂質ナノ粒子の調製及びその投与方法 |
| WO2020069169A1 (en) | 2018-09-27 | 2020-04-02 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding arginase 1 for the treatment of arginase deficiency |
| EP3861108A1 (en) | 2018-10-04 | 2021-08-11 | New England Biolabs, Inc. | Methods and compositions for increasing capping efficiency of transcribed rna |
| US11072808B2 (en) * | 2018-10-04 | 2021-07-27 | New England Biolabs, Inc. | Methods and compositions for increasing capping efficiency of transcribed RNA |
| EP3897702A2 (en) | 2018-12-21 | 2021-10-27 | CureVac AG | Rna for malaria vaccines |
| US20220073962A1 (en) | 2018-12-21 | 2022-03-10 | Curevac Ag | Methods for rna analysis |
| KR20210133218A (ko) | 2019-01-31 | 2021-11-05 | 모더나티엑스, 인크. | 볼텍스 믹서 및 연계된 방법, 시스템 및 이의 장치 |
| AU2020214843A1 (en) | 2019-01-31 | 2021-08-19 | Modernatx, Inc. | Methods of preparing lipid nanoparticles |
| EP3920950A1 (en) | 2019-02-08 | 2021-12-15 | CureVac AG | Coding rna administered into the suprachoroidal space in the treatment of ophtalmic diseases |
| US20220370354A1 (en) | 2019-05-08 | 2022-11-24 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase for the treatment of methylmalonic acidemia |
| EP3965797A1 (en) | 2019-05-08 | 2022-03-16 | AstraZeneca AB | Compositions for skin and wounds and methods of use thereof |
| US20220313813A1 (en) | 2019-06-18 | 2022-10-06 | Curevac Ag | Rotavirus mrna vaccine |
| EP3986480A1 (en) | 2019-06-24 | 2022-04-27 | ModernaTX, Inc. | Messenger rna comprising functional rna elements and uses thereof |
| US20220251577A1 (en) | 2019-06-24 | 2022-08-11 | Modernatx, Inc. | Endonuclease-resistant messenger rna and uses thereof |
| CA3150061A1 (en) | 2019-08-07 | 2021-02-11 | Modernatx, Inc. | Compositions and methods for enhanced delivery of agents |
| CN114502204A (zh) | 2019-08-14 | 2022-05-13 | 库尔维科公司 | 具有降低的免疫刺激性质的rna组合和组合物 |
| WO2021076811A1 (en) | 2019-10-15 | 2021-04-22 | Moderna TX, Inc. | Mrnas encoding granulocyte-macrophage colony stimulating factor for treating parkinson's disease |
| WO2021123332A1 (en) | 2019-12-20 | 2021-06-24 | Curevac Ag | Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids |
| EP4147717A1 (en) | 2020-02-04 | 2023-03-15 | CureVac SE | Coronavirus vaccine |
| US11576966B2 (en) | 2020-02-04 | 2023-02-14 | CureVac SE | Coronavirus vaccine |
| CN114206827B (zh) | 2020-04-09 | 2023-05-23 | 苏州艾博生物科技有限公司 | 脂质纳米颗粒组合物 |
| CN113874507A (zh) | 2020-04-09 | 2021-12-31 | 苏州艾博生物科技有限公司 | 冠状病毒的核酸疫苗 |
| MX2022013254A (es) | 2020-04-22 | 2023-01-24 | BioNTech SE | Vacuna contra el coronavirus. |
| CA3182920A1 (en) | 2020-05-14 | 2021-11-18 | Modernatx, Inc. | Lnp compositions comprising an mrna therapeutic and an effector molecule |
| WO2021239880A1 (en) | 2020-05-29 | 2021-12-02 | Curevac Ag | Nucleic acid based combination vaccines |
| EP4157217A1 (en) | 2020-06-01 | 2023-04-05 | Modernatx, Inc. | Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding glucose-6-phosphatase and uses thereof |
| EP4158005A1 (en) | 2020-06-01 | 2023-04-05 | ModernaTX, Inc. | Phenylalanine hydroxylase variants and uses thereof |
| AU2021286169A1 (en) | 2020-06-04 | 2023-01-19 | BioNTech SE | RNA replicon for versatile and efficient gene expression |
| AU2021297248A1 (en) | 2020-06-23 | 2023-02-02 | Modernatx, Inc. | LNP compositions comprising mRNA therapeutics with extended half-life |
| CN114206463A (zh) | 2020-06-30 | 2022-03-18 | 苏州艾博生物科技有限公司 | 脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物 |
| CN116710079A (zh) | 2020-07-24 | 2023-09-05 | 斯特兰德生物科技公司 | 包含经修饰的核苷酸的脂质纳米颗粒 |
| US20230272052A1 (en) | 2020-07-31 | 2023-08-31 | CureVac SE | Nucleic acid encoded antibody mixtures |
| CN114391008B (zh) | 2020-08-20 | 2024-05-03 | 苏州艾博生物科技有限公司 | 脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物 |
| US20240066114A1 (en) | 2020-08-31 | 2024-02-29 | CureVac SE | Multivalent nucleic acid based coronavirus vaccines |
| WO2022104131A1 (en) | 2020-11-13 | 2022-05-19 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding cystic fibrosis transmembrane conductance regulator for the treatment of cystic fibrosis |
| US20230414516A1 (en) | 2020-11-16 | 2023-12-28 | BioNTech SE | Enhanced formulation stabilization and improved lyophilization processes |
| CA3201552A1 (en) | 2020-12-09 | 2022-06-16 | Thomas ZIEGENHALS | Rna manufacturing |
| MX2023007574A (es) | 2020-12-22 | 2023-09-29 | CureVac SE | "vacuna de arn contra variantes de sars-cov-2. |
| WO2022137133A1 (en) | 2020-12-22 | 2022-06-30 | Curevac Ag | Rna vaccine against sars-cov-2 variants |
| WO2022135993A2 (en) | 2020-12-22 | 2022-06-30 | Curevac Ag | Pharmaceutical composition comprising lipid-based carriers encapsulating rna for multidose administration |
| US20240166707A1 (en) | 2021-01-08 | 2024-05-23 | Strand Therapeutics Inc. | Expression constructs and uses thereof |
| WO2022152109A2 (en) | 2021-01-14 | 2022-07-21 | Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. | Lipid compounds and lipid nanoparticle compositions |
| CN116615472A (zh) | 2021-01-14 | 2023-08-18 | 苏州艾博生物科技有限公司 | 聚合物缀合的脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物 |
| EP4087938A2 (en) | 2021-01-27 | 2022-11-16 | CureVac AG | Method of reducing the immunostimulatory properties of in vitro transcribed rna |
| CA3210878A1 (en) | 2021-02-12 | 2022-08-18 | Modernatx, Inc. | Lnp compositions comprising payloads for in vivo therapy |
| JP2024512026A (ja) | 2021-03-24 | 2024-03-18 | モデルナティエックス インコーポレイテッド | オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症の治療を目的とした脂質ナノ粒子及びオルニチントランスカルバミラーゼをコードするポリヌクレオチド |
| WO2022204380A1 (en) | 2021-03-24 | 2022-09-29 | Modernatx, Inc. | Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding propionyl-coa carboxylase alpha and beta subunits and uses thereof |
| WO2022204369A1 (en) | 2021-03-24 | 2022-09-29 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase for the treatment of methylmalonic acidemia |
| WO2022204371A1 (en) | 2021-03-24 | 2022-09-29 | Modernatx, Inc. | Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding glucose-6-phosphatase and uses thereof |
| WO2022204390A1 (en) | 2021-03-24 | 2022-09-29 | Modernatx, Inc. | Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding phenylalanine hydroxylase and uses thereof |
| JP2024511206A (ja) | 2021-03-26 | 2024-03-12 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | 免疫原性組成物 |
| CA3171429A1 (en) | 2021-03-31 | 2022-09-30 | Alexander SCHWENGER | Syringes containing pharmaceutical compositions comprising rna |
| WO2022212710A1 (en) | 2021-03-31 | 2022-10-06 | Modernatx, Inc. | PURIFICATION AND RECYCLING OF mRNA NUCLEOTIDE CAPS |
| AU2022249357A1 (en) | 2021-04-01 | 2023-10-12 | Modernatx, Inc. | Methods for identification and ratio determination of rna species in multivalent rna compositions |
| EP4334446A1 (en) | 2021-05-03 | 2024-03-13 | CureVac SE | Improved nucleic acid sequence for cell type specific expression |
| WO2022234416A1 (en) | 2021-05-03 | 2022-11-10 | Pfizer Inc. | Vaccination against pneumoccocal and covid-19 infections |
| EP4333880A1 (en) | 2021-05-03 | 2024-03-13 | Pfizer Inc. | Immunogenic composition against influenza |
| CA3218544A1 (en) | 2021-05-03 | 2022-11-10 | Pfizer Inc. | Vaccination against bacterial and betacoronavirus infections |
| WO2022246020A1 (en) | 2021-05-19 | 2022-11-24 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase for the treatment of methylmalonic acidemia |
| AU2022281746A1 (en) | 2021-05-24 | 2023-09-14 | Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. | Lipid compounds and lipid nanoparticle compositions |
| WO2022266083A2 (en) | 2021-06-15 | 2022-12-22 | Modernatx, Inc. | Engineered polynucleotides for cell-type or microenvironment-specific expression |
| WO2022271776A1 (en) | 2021-06-22 | 2022-12-29 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding uridine diphosphate glycosyltransferase 1 family, polypeptide a1 for the treatment of crigler-najjar syndrome |
| WO2023287751A1 (en) | 2021-07-12 | 2023-01-19 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding propionyl-coa carboxylase alpha and beta subunits for the treatment of propionic acidemia |
| WO2023009499A1 (en) | 2021-07-27 | 2023-02-02 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding glucose-6-phosphatase for the treatment of glycogen storage disease type 1a (gsd1a) |
| WO2023007019A1 (en) | 2021-07-30 | 2023-02-02 | CureVac SE | Cap analogs having an acyclic linker to the guanine derivative nucleobase |
| CA3171750A1 (en) | 2021-07-30 | 2023-02-02 | Tim SONNTAG | Mrnas for treatment or prophylaxis of liver diseases |
| WO2023031392A2 (en) | 2021-09-03 | 2023-03-09 | CureVac SE | Novel lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids comprising phosphatidylserine |
| WO2023031394A1 (en) | 2021-09-03 | 2023-03-09 | CureVac SE | Novel lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids |
| WO2023056044A1 (en) | 2021-10-01 | 2023-04-06 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding relaxin for the treatment of fibrosis and/or cardiovascular disease |
| CN116064598B (zh) | 2021-10-08 | 2024-03-12 | 苏州艾博生物科技有限公司 | 冠状病毒的核酸疫苗 |
| AU2022361755A1 (en) | 2021-10-08 | 2024-04-04 | Pfizer Inc. | Immunogenic lnp compositions and methods thereof |
| AR127312A1 (es) | 2021-10-08 | 2024-01-10 | Suzhou Abogen Biosciences Co Ltd | Compuestos lipídicos ycomposiciones de nanopartículas lipídicas |
| AU2022358824A1 (en) | 2021-10-08 | 2024-04-11 | Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. | Lipid compounds and lipid nanoparticle compositions |
| AU2022372325A1 (en) | 2021-10-18 | 2024-05-02 | BioNTech SE | Methods for determining mutations for increasing modified replicable rna function and related compositions and their use |
| AU2022369342A1 (en) | 2021-10-18 | 2024-03-14 | BioNTech SE | Modified replicable rna and related compositions and their use |
| WO2023077170A1 (en) | 2021-11-01 | 2023-05-04 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding integrin beta-6 and methods of use thereof |
| WO2023092060A1 (en) | 2021-11-18 | 2023-05-25 | Cornell University | Microrna-dependent mrna switches for tissue-specific mrna-based therapies |
| WO2023111907A1 (en) | 2021-12-17 | 2023-06-22 | Pfizer Inc. | Polynucleotide compositions and uses thereof |
| WO2023138786A1 (en) | 2022-01-21 | 2023-07-27 | BioNTech SE | Analysis of rna molecules using catalytic nucleic acids |
| WO2023144330A1 (en) | 2022-01-28 | 2023-08-03 | CureVac SE | Nucleic acid encoded transcription factor inhibitors |
| TW202345864A (zh) | 2022-02-18 | 2023-12-01 | 美商現代公司 | 編碼檢查點癌症疫苗之ｍＲＮＡ及其用途 |
| US20230279376A1 (en) | 2022-03-01 | 2023-09-07 | Crispr Therapeutics Ag | Methods and compositions for treating angiopoietin-like 3 (angptl3) related conditions |
| WO2023180904A1 (en) | 2022-03-21 | 2023-09-28 | Crispr Therapeutics Ag | Methods and compositions for treating lipoprotein-related diseases |
| WO2023183909A2 (en) | 2022-03-25 | 2023-09-28 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding fanconi anemia, complementation group proteins for the treatment of fanconi anemia |
| WO2023196399A1 (en) | 2022-04-06 | 2023-10-12 | Modernatx, Inc. | Lipid nanoparticles and polynucleotides encoding argininosuccinate lyase for the treatment of argininosuccinic aciduria |
| WO2023201294A1 (en) | 2022-04-14 | 2023-10-19 | Modernatx, Inc. | Rna polymerase variants |
| WO2023212618A1 (en) | 2022-04-26 | 2023-11-02 | Strand Therapeutics Inc. | Lipid nanoparticles comprising venezuelan equine encephalitis (vee) replicon and uses thereof |
| WO2023213378A1 (en) | 2022-05-02 | 2023-11-09 | BioNTech SE | Replicon compositions and methods of using same for the treatment of diseases |
| WO2023215498A2 (en) | 2022-05-05 | 2023-11-09 | Modernatx, Inc. | Compositions and methods for cd28 antagonism |
| WO2023227608A1 (en) | 2022-05-25 | 2023-11-30 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Nucleic acid based vaccine encoding an escherichia coli fimh antigenic polypeptide |
| US11878055B1 (en) | 2022-06-26 | 2024-01-23 | BioNTech SE | Coronavirus vaccine |
| WO2024017479A1 (en) | 2022-07-21 | 2024-01-25 | BioNTech SE | Multifunctional cells transiently expressing an immune receptor and one or more cytokines, their use and methods for their production |
| WO2024026254A1 (en) | 2022-07-26 | 2024-02-01 | Modernatx, Inc. | Engineered polynucleotides for temporal control of expression |
| WO2024026490A1 (en) | 2022-07-28 | 2024-02-01 | Sqz Biotechnologies Company | Polynucleotides encoding linked antigens and uses thereof |
| WO2024037578A1 (en) | 2022-08-18 | 2024-02-22 | Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. | Composition of lipid nanoparticles |
| WO2024056856A1 (en) | 2022-09-15 | 2024-03-21 | BioNTech SE | Systems and compositions comprising trans-amplifying rna vectors with mirna |
| WO2024057209A1 (en) | 2022-09-15 | 2024-03-21 | Pfizer Inc. | Coaxial flow device for nanoparticle preparation and manufacturing equipment including such device |
| WO2024068545A1 (en) | 2022-09-26 | 2024-04-04 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Influenza virus vaccines |
| WO2024084397A1 (en) | 2022-10-19 | 2024-04-25 | Pfizer Inc. | Vaccination against pneumoccocal and covid-19 infections |
| WO2024089638A1 (en) | 2022-10-28 | 2024-05-02 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Nucleic acid based vaccine |
| WO2024097639A1 (en) | 2022-10-31 | 2024-05-10 | Modernatx, Inc. | Hsa-binding antibodies and binding proteins and uses thereof |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6060456A (en) * | 1993-11-16 | 2000-05-09 | Genta Incorporated | Chimeric oligonucleoside compounds |
| AU687492B2 (en) * | 1993-11-16 | 1998-02-26 | Genta Incorporated | Synthetic oligomers having phosphonate internucleosidyl linkages of undefined chirality mixed with non-phosphonate internucleosidyl linkages |
| US7074596B2 (en) * | 2002-03-25 | 2006-07-11 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Synthesis and use of anti-reverse mRNA cap analogues |
| US7368439B2 (en) * | 2005-06-15 | 2008-05-06 | Bar - Ilan University | Dinucleoside poly(borano)phosphate derivatives and uses thereof |
-
2008
- 2008-06-06 PL PL385388A patent/PL215513B1/pl unknown
-
2009
- 2009-06-04 PL PL09759412T patent/PL2297175T3/pl unknown
- 2009-06-04 EP EP09759412.1A patent/EP2297175B1/en active Active
- 2009-06-04 US US12/996,243 patent/US8519110B2/en active Active
- 2009-06-04 ES ES09759412T patent/ES2425781T3/es active Active
- 2009-06-04 WO PCT/US2009/046249 patent/WO2009149253A2/en active Application Filing
- 2009-06-04 JP JP2011512643A patent/JP5715560B2/ja active Active
- 2009-06-04 AU AU2009256131A patent/AU2009256131B2/en active Active
- 2009-06-04 CA CA2727091A patent/CA2727091C/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20110092574A1 (en) | 2011-04-21 |
| WO2009149253A3 (en) | 2010-03-25 |
| PL2297175T3 (pl) | 2014-01-31 |
| AU2009256131B2 (en) | 2013-05-30 |
| US8519110B2 (en) | 2013-08-27 |
| EP2297175A4 (en) | 2011-06-15 |
| JP2011522542A (ja) | 2011-08-04 |
| AU2009256131A1 (en) | 2009-12-10 |
| WO2009149253A2 (en) | 2009-12-10 |
| JP5715560B2 (ja) | 2015-05-07 |
| PL385388A1 (pl) | 2009-12-07 |
| EP2297175B1 (en) | 2013-08-07 |
| CA2727091A1 (en) | 2009-12-10 |
| CA2727091C (en) | 2017-05-09 |
| ES2425781T3 (es) | 2013-10-17 |
| EP2297175A2 (en) | 2011-03-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL215513B1 (pl) | Nowe boranofosforanowe analogi dinukleotydów, ich zastosowanie, czasteczka RNA, sposób otrzymywania RNA oraz sposób otrzymywania peptydów lub bialka | |
| AU2008265683B2 (en) | Synthesis and use of anti-reverse phosphorothioate analogs of the messenger RNA cap | |
| CN109311925A (zh) | 立体限定的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体与核苷或寡核苷酸的增强的偶联 | |
| Johannsen et al. | Amino acids attached to 2′-amino-LNA: synthesis and excellent duplex stability | |
| JP7144050B2 (ja) | ５’－ホスホロチオラート ｍＲＮＡ ５’－末端（キャップ）類似体、それを含むｍＲＮＡ、それらを得る方法およびそれらの使用方法 | |
| Rydzik et al. | Synthetic dinucleotide mRNA cap analogs with tetraphosphate 5′, 5′ bridge containing methylenebis (phosphonate) modification | |
| CA3167563A1 (en) | Novel mrna 5'-end cap analogs modified within phosphate residues, rna molecule incorporating the same, uses thereof and method of synthesizing rna molecule or peptide | |
| Ziemniak et al. | Phosphate-modified analogues of m7GTP and m7Gppppm7G—Synthesis and biochemical properties | |
| Wojtczak et al. | Clickable trimethylguanosine cap analogs modified within the triphosphate bridge: synthesis, conjugation to RNA and susceptibility to degradation | |
| Kowalska et al. | Synthesis and properties of mRNA cap analogs containing phosphorothioate moiety in 5′, 5′-triphosphate chain | |
| EP3484907A1 (en) | Novel phosphotriazole mrna 5'-end cap analogs, composition comprising the same, rna molecule incorporating the same, uses thereof and method of synthesizing rna molecule, protein or peptide | |
| WO2023282245A1 (ja) | ヌクレオチド類の精製方法及びヌクレオチド類の精製装置並びに疎水性試薬及び疎水性基質 | |
| WO2023199261A1 (en) | Rna molecule containing modified cap analogs at the 5 ' end, use of rna molecule in in vitro protein or peptide synthesis, rna molecule for use in medicine, and use of modified cap analogs for rna capping | |
| Shipitsyn et al. | Synthesis of [bis (Inosine-5′)]-tetraphosphate and [bis (Inosine-5′)]-pentaphosphate Analogues Bearing the Residues of Methylenediphosphonic Acid | |
| Linjalahti et al. | Intra‐and Intermolecular Interactions Influence the Reactivity of RNA Oligonucleotides | |
| PL214850B1 (pl) | Cząsteczka RNA, sposób otrzymywania RNA oraz sposób otrzymywania peptydów lub białka |