JPH07503372A

JPH07503372A - 生体外遺伝子導入

Info

Publication number: JPH07503372A
Application number: JP5513303A
Authority: JP
Inventors: ローズ，ゲイリー・エイチ; ドゥワーキ，バラバーニ・ジェイ; フェルグナー，フィリップ・エル; ファン−フェルグナー，ジン−ユ; マンソープ，マーストン
Original assignee: バイカル・インコーポレイテッド
Priority date: 1992-01-23
Filing date: 1993-01-21
Publication date: 1995-04-13
Also published as: WO1993014778A1; EP0625049A4; EP0625049A1; CA2128616A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】生体外遺伝子導入発明の分野本発明は、を椎動物細胞の内部へ生体外（ｅｘ　ｖｉｖｏ）でポリヌクレオチドを運搬するための方法に関する。本発明は特にを椎動物に戻す可能性がある細胞へ遺伝物質を導入するための迅速で便利な方法に関連する。このような遺伝物質を細胞内に導入して、機能性細胞欠陥を修正し、免疫反応を高め、あるいは外来タンパク質を発現させ得る。

発明の背景遺伝子導入という用語は、広く単一または複数の細胞内に遺伝子配列を導入するための方法を指す。現在、外因性遺伝物質を細胞に導入するために様々な方法か使用されている。その方法の中には、カルシウム沈降、ウィルス性ベクタ媒介によるデリバリ−（配達）、電気穿孔法およびリポソーム媒介によるデリバリ−（配達）などが含まれる。

所与の遺伝子と、その遺伝子から生じる遺伝物質か所定数の細胞に与える影響を研究するため、インビトロでの遺伝子導入が利用される。遺伝子導入の分野においては、初期の研究は遺伝子置換と遺伝子増幅の領域に関するものであった。遺伝子増幅には、変異した遺伝子の正しい複製物を欠陥のある細胞内に導入したり、外来配列の複製物を導入してその細胞内で遺伝子を発現させるための方法などが含まれる。遺伝子置換では、部位特異的組換えによって欠陥のある遺伝子配列を修正することによって目標とする相同組換えを行ない、知られた遺伝子の配列を得る。一般に、これらの方法はいずれも外因性ポリヌクレオチド配列の安定した発現が必要であると考えられている。

トランスフェクションに引続き、このトランスフェクションを行なった遺伝子からコードされたポリペプチドを安定して発現している細胞をさらなる分析のため選択する。

骨格筋と造血細胞に関する遺伝子治療について選択された安定なトランスフェクトントの例がサルミネン他（Ｓａｌｍｉｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ）およびディック他（Ｄｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ）による出版物（Ｈｕｍ、　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ、　２：１５−２６．１９９１年およびＢｌｏｏｄ　７８：６２４−６３４．１９９１年）に示されており、これらについてここで引用により援用する。安定した発現にはＤＮＡの宿主染色体への安定した組込みかまたは相同組換えが必要だと考えられるが、ただしエビソーム状構造で形成されたポリヌクレオチドでもポリペプチドの安定した発現を引き出すことができるかもしれないことを示す幾らかの証拠もある。

遺伝物質を宿主細胞内に導入する方法には当業者に知られた様々な方法がある。

ウィルス粒子内にウィルスベクターをカプセル化する方法は、極めて効果的な遺伝子運搬法の１っである。ウィルスベクターの多くは複製および遺伝子発現を行なうのに遺伝子組込みを必要とする。しかしなから、ウィルスベクターは確かに効率よく宿主ゲノム内に組込まれるのて、やがては発癌を促進する存置な組換えの発生の可能性を高めるかもしれない。ポリヌクレオチドを運搬する他の方法としては、リポソーム媒介によるトランスフェクションや裸のポリヌクレオチドを組織内に導入するなどの方法か含まれる。遺伝子運搬方法に関係なく、宿主ゲノムにポリヌクレオチドを組込むことは存寄になる可能性がある。したかって、宿主ゲノムへの組込みを含む安定なトランスフェクションは、存寄な組換えの発生の可能性を増大させるものである。

遺伝子治療の大きな課題は、標的組織へ遺伝子配列を効果的に配達することである。遺伝子治療をインビボで行なった場合のを幼性は、遺伝子の標的細胞へのアクセス能力により限られる。細胞表面結合タンパク質をウィルスパッケージ内に組込むことによって、ウィルスベクターを特定の細胞タイプに方向つけることかできる。同様に、両栄養性ウィルスベクターやリポソームを使用して遺伝子配列を様々な細胞タイプへ運搬することかできる。ベクターは経口または非経口の経路で体内に導入され得るか、血管内皮および粘膜かベクター播種の障壁となる。

組織部位へ直接治療用遺伝子を導入する方か経口や非経口の投与経路での播種に依存する方法よりも患者にとっては存益かもしれない。

ウィルスベクターは、遺伝子を発現させるためには細胞の複製を必要とするので、リポソーム媒介による運搬か幾つかの細胞タイプにはより適している。目的の組織内にベクターを注射することかできるか、経験から得られた結果では、発現されるタンパク質は、注射針の道筋に沿って直ちに細胞内に集中することかわかっている。針の道筋から離れているが依然としてこれに近い細胞か示した遺伝子の発現のレベルはかなり低いレベルまで減少した。注射針の道筋にすぐ隣接する細胞よりも広い半径で遺伝子の発現を発生させることができれば、遺伝子治療はより有効となるてあろう。

遺伝子増幅または遺伝子置換のためのインビボ遺伝子配達を行なうもう１つの方法には、患者から細胞を取出しこれら細胞を培地で随意に増殖させ、細胞をトランスフェクトして、安定したトランスフェクシントを同定するという方法かある。安定なトランスフェクシントの同定に引続き、これら細胞を随意に増殖させて宿主に返す。このやり方は造血細胞超厚の細胞をトランスフェクトする目的での使用か最も有効であった。

繊維芽細胞、筋芽細胞および肝細胞を含む他の細胞タイプを、培養において安定にトランスフェクトした。自己由来の宿主細胞の代わりに、ある応用ては安定な細胞系か経験的に使用された。これらの方法では、細胞か培地内に維持されることか必要である。トランスフェクションを行なうＭｉｆにインビトロで増殖させかつトランスフェクションに引続いて安定に１−ランスフエフｌ−した細胞を選択するという方法についての大きな欠点の１つは、細胞か培地内で過ごす時間の長さにある。患者から細胞を採取し、細胞に処理を行ない、安定なトランスフェクシントを選び、それらを宿主に返すまでに必要な時間は数週間から数カ月にまでわたる可能性かある。インビボ細胞性環境かなければ、タンパク質の発現は変化してしまう。培地でさらに時間を置くと、選択条件下で細胞のある小集団か生存し、池に比へてよく複製する。安定したトランスフェクシントを選ぶために条件を選へば、それはまた培地で細胞か生き残ることかできる条件を選ぶことになる。インビトロでの細胞生存はインビボでの改善された細胞生存に置換えられるわけてはない。このように培養を行なう細胞や培地て繁殖する細胞もインビボでは生存することかできないかもしれない。

細胞か培地内にいる時間を最少限にする方法かあれば、インビトロで細胞の変化か発生する可能性を減らすことになる。

今日の遺伝子治療のやり方は、労働集約的てかつ高いレベルの技術的専門性を必要とするものである。したがって、遺伝子治療は、高度に洗練された技術的支援を受けられる大規模な医療研究センターに限定されている。このようなセンターにアクセスを持たない個人は技術を集約した遺伝子治療の恩恵を受ける可能性は低い。最少のターン・アラウンド゛・タイムで関心のある遺伝子を宿主細胞に導入する方法で、医師のオフィスや、診療所や、地域の病院で迅速かつルーチンとして行なうことかできるような方法かあれば、遺伝子治療から恩恵を受ける人の数は増大するであろう。

本明細書で開示する方法によれば、ある特定の組織からの細胞を処理し、必要な遺伝子で処置を行なってから適時患者に戻してやることかできる。細胞の複製や選択が不要である。こうして、遺伝子治療にかかる専門技術、時間およびコストか低減される。

図面の簡単な説明図１は、マイクロタイタートランスフェクションで得られた結果を立体的な棒グラフで表わしたものである。

図２ａ−図２ｄは、細胞の密度とトランスフェクション効率を比較する三次元的な棒グラフである。

図３は、生体外（ｅｘ　ｖｉｖｏ）てＨＩＶｇｐ１２０で免疫処置した細胞に対するＩｇＧ抗体力価を示すグラフ本発明は、生体外（ｅｘ　ｖｉｖｏ）でを椎動物の細胞内部にポリペプチドを配達する方法を提供し、同方法は、を椎動物から生きた細胞を採取し、この生きた細胞を、ポリペプチドについて作動的にコードする有効量のポリヌクレオチドと、このポリヌクレオチドを細胞内に配達する効力かある脂質とを含む調製物に接触させるステップと、この接触させるステップの後４８時間以内にこの細胞をを椎動物に戻し、生きた細胞かインビボでポリヌクレオチドを発現するようにするステップとを含む。先行技術の生体外での方法とは違い、本発明では、トランスフェクション後の選択や増殖の工程は不要である。したがって、全工程を、数週間ではなく数時間のうちに終わらせることができる。

本発明のもう１つの局面は、トランスフェクトされた細胞をを椎動物内でのポリペプチド発現用に調製するための方法であって、同方法は、を推動物から生きた細胞を採取するステップと、それら細胞を、ポリペプチドを作動的にコートする有効量のポリヌクレオチドとトランスフェクションを容易にする脂質とを含む調製物に接触させ（この調製物は細胞に接触することによって４８時間内に十分な量のポリヌクレオチドを細胞内に配達する能力がある）、これら生きた細胞の少なくとも幾つかをトランスフェクトするステップと、トランスフェクトされた細胞を分離または増殖する選択ステップを行なうことなく、を椎動物内に導入するためトランスフェクトされた細胞を薬理学的に許容可能な担体中に懸濁するステップとを含む。好ましくは、採取するステップには周囲の細胞外マトリックスから細胞を実質的に分離するステップもさらに含まれる。さらに、細胞を保管する必要かあれば（直ちに使用するのではなく）、この方法には、接触ステップの後４８時間以内に細胞を凍結するステップを含んでもよい。ある具体例では、ペプチドを使用して機能性遺伝子欠陥が引き起こしたを推動物の疾患を治療する。多くの場合、ポリヌクレオチドを使用して生きた細胞内でポリペプチドを発現させる。細胞によるポリヌクレオチドの発現は一時的であったり、かなりの期間持続するかもしれない。好ましい具体例では、ポリペプチドはを椎動物内の免疫原性ポリペプチドである。

この場合、を推動物（ヒトなどの哺乳類や、鳥または他のを推動物）は、トランスフェクトされた細胞が再導入された後、免疫原に対して免疫反応を発生させる。この方法を使用して動物に免疫処置をすることも可能である。好ましい実施例では、この方法でリンホカインを作動的にコードする。使用する細胞には（たとえば）白血球細胞、筋芽細胞および骨髄細胞などが含まれ得る。

本発明は、上に説明した方法のうちいずれかに従い調製された薬剤を含む。また本発明にはポリペプチドをインビボでを推動物に配達する方法も含まれ、この方法は、このような薬剤をを推動物に注射または移植するステップを含む。この方法で使用される細胞には好ましくは癌細胞、白血球細胞、幹細胞を含む骨髄細胞および筋芽細胞が含まれる。この方法を癌細胞に適用する場合には、ポリヌクレオチドが好ましくは作動的にリンホカインをコードする。

発明の詳細な説明本願に開示する方法は、患者から組織または細胞のサンプルを採取し、このサンプルの細胞を必要な遺伝子に生体外で接触させて、サンプルを患者から取り除いてから好ましくは４０時間を超えないうちに患者にこの細胞を戻すというものである。この方法によってポリペプチドを作動的にコードするポリヌクレオチドをを推動物の細胞の内部に配達する。［ポリペプチドＪおよび「タンパク質」という用語はこの特許出願において交換可能に使用される。［外因性ポリペプチドＪという用語は、細胞内で自然に生じるタンパク質を、本発明の方法を使用して細胞内に導入されるタンパク質と区別するために使用する用ａハである。「採取する」という用語はを推動物の患者から生きた細胞のサンプルを得るための当業者に公知のいずれかの方法を示すために使用される。生きた細胞のサンプルを採取する方法には、これに限られるわけでないか、静脈穿刺や、細胞かき取り、およびパンチ生検、針生検および外科的切除を含む生検技術などが考えられる。「接触させる」という用語にはポリヌクレオチドを細胞内に導入する方法が含まれる。

これらの方法には、電気穿孔法、リポソーム媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降およびＤＥＡＥデキストランなどを含むトランスフェクト方法かある。「戻す」という用語には、細胞を体内に戻すための当業者に公知の方法が含まれる。これらの方法には、これに限るわけてはないか、静脈導入、外科的移植および注射などが含まれる。

本発明のもう１つの具体例において開示される方法では、を推動物の患者から生きた細胞を採取し、この細胞を周囲の細胞外組織から実質的に取り除き、この生きた細胞を有効量のポリヌクレオチドを含む調製物に接触させ、かつその細胞を患者に戻す。

本発明の方法では、細胞は分離され、関心のある遺伝子に対し暴露されかつ直ちに宿主に戻され、インビトロでの細胞の変化の可能性を低減するため培地内にある時間は最少限にされる。細胞のうち幾つかは一時的に必要な遺伝子を発現させ、また安定的に発現させるものもあるが、ターン・アラウンド・タイムか最少なので、細胞が生体内で生存する確率はより高くなる。発現が安定的であれ一時的であれ、結果はを益である。必要であれば、治療を繰返して必要なレベルの外因性遺伝子発現を維持することもできる。

生体外での一時的な遺伝子の発現は、選択的な条件下で時間か経過すれば消失する一時的な遺伝子の発現として一般に規定される。インビボでの一時的発現をより広く定義し、１週間または１力月といった１年を超えない期間に発生する遺伝子の発現ということもできる。遺伝子治療の用途、ベクターの構成（染色体融合が起こったか否かにかかわらず）、細胞のタイプおよびトランスフェクションに続き細胞か移植される位置は、すへて特定の遺伝子が発現される時間の長さに影響を与える。本明細書の教示により当業者は様々な組織からの様々な細胞を生体外で処置して迅速に宿主に戻して遺伝子を発現させ、安定なトランスフェクシントを得るために選択を行なう必要がないような遺伝子配列の導入を行うことかできる。

本発明には多くの応用が可能であるが、以下にそのうちの幾つかを詳細に説明することにする。このＦ療法は、他の遺伝子治療のやり方では簡単にアクセスできないような様々な組織において外因性ポリヌクレオチドを発現させるために使用することができる。たとえば、肝細胞にＬＤＬ受容体を導入し、生体内の血清コレステロールを低減することかでき、かつ筋肉細胞を採取し、デュシエーヌ（Ｄｕｃｈｅｎｎｅｓ）筋ジストロフィーに関わる欠陥遺伝物質を有する細胞を処置することかできる。造血系からの前駆細胞を分化する前の段階で処置して、β− サラセミア等の遺伝的障害を修正することができる。この方法は機能的遺伝子欠陥による疾患の治療に特に有効である。これらの応用については、外因性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、その特定の遺伝疾患におけるポリペプチドの欠陥または機能不良部分をコートする。

遺伝物質の一時的な発現を有利に利用して免疫反応を促進することかできる。このようにしてウィルス性疾患を、インターフェロンの発現によって治療することかでき、またサイトカインを使用して免疫系を刺激し、外因性の抗原や癌などに対して反応させることかできる。同様に、外因性タンパク質を標的細胞から一時的に発現させて免疫反応を発生させることかできる。

生検と組織の処理生検または細胞のサンプルは好ましくは遺伝子治療を必要とする患者から入手する。ただし、処置される細胞は細胞系または細胞ドナー等の二次的な供給源由来のものでも、本発明の範囲内に含まれると考えられる。細胞のサンプルは好ましくは遺伝子の発現か最も有利であると考えられる細胞から入手する。細胞のサンプルは、皮膚、肝臓、膵臓、膵臓、筋肉、骨髄、神経細胞、血液細胞および癌細胞等の様々な組織由来のものでよい。

組織のタイプとその組織の位置によってどのサンプリング法か最も良いかがわかる。当業者であれば、特定の組織のタイプに対して利用可能な様々な生検およびサンプリング方法を容易に理解することであろう。形成された組織の生検は針、カテーテル、パンチ生検または外科的切除によって採取され得る。たとえば、皮膚の生検は、皮膚パンチによって得ることができるし、肝臓の生検の場合には針生検によって得ることができる。

生検の大きさおよび量については、組織の処理に伴う細胞の回収率のレベルによって決定される。トランスフェクションの方法は、５０−１００といった少数の細胞のトランスフェクションについて最適化され得ると予想される。

生検の大きさは細胞の回収率を考えて調節する必要がある。

０．５ｃｍ２の皮膚生検によって最少で２５００から５０００の細胞か生じるはずである。所与の生検からの細胞の回収率か低い場合には生検の大きさをより大きくするかまたは所与の細胞に対する細胞の解離方法を変える必要があるかもしれない。

血液中に存在する細胞のタイプについては、凝血防止を行なったＥＤＴＡまたはクエン酸塩チューブへ排出した血液自体を１００　Ｏｒ　ｐｍで１０分間遠心分離にかけて処理てきる。軟膜は、パスツールピペット内に引き込んで、その中に含まれる細胞を洗浄して血清、赤血球細胞および残渣を取り出す。これらの細胞を遺伝子治療に使用することかできる。

本発明の一実施例では、これらの細胞を周囲の支持組織や細胞外７１−リックスから分離する。細胞分離方法の一例として、皮膚の生検を酵素で消化してそれらの細胞外マトリックスから細胞を分離させる方法かある。以下に述へる方法は数多くある組織の分離方法のうちの１つにすぎない。

この特定の方法は皮膚、腎臓および肺の組織分離に有効である。

患者から取り除いた生検は、殺菌した生理食塩水に漬けて洗浄し血液と残渣を取り除く。組織は外科用メスまたはシングルエツジの剃刀の刃を用いて、少量のハンクス・バランスド・ソルト・ソリューション（Ｈａｎｋｓ　Ｂａ１ａｎｃｅｄ　５ａｌｔ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）　（Ｇ　Ｉ　ＢＣＯ、グランドアイランド、ニューヨーク州）中で細かく切り分ける。こうすることによって組織サンプルの相対的ｐＨを処理の間監視することかできる。生理学的ｐＨを維持することは細胞の生存にとって重要である。細かく切り分ける作業はおよそ１０分間かまたは細胞か厚いペーストのようになるまで行なう。このペーストを小さなエーレンマイヤフラスコまたはビー力（５ｍｌ）に移し、細胞ペーストの容量を概算する。０．２５％トリプシン／１ｍＭ　ＥＤＴＡ　（Ｇ　Ｉ　ＢＣＯ）とＩ％ｗｔ／Ｖｏ１．：）ラゲナーゼＢ　（Ｂｏｅｈｒｉｒｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、１ｎｄｉａｎａ）を３容量、細胞ペーストに添加する。

フラスコをホイルで覆い、３７℃のインキュベータ内の回転台」二に１５分から３０分置く。または、滅菌した小さな磁器攪拌バーをサンプルに加えて、フラスコを磁器攪拌プレート上に置く。ｐＨの維持と、組織の分離をモニタする両方の目的でサンプルを１０分ごとにモニタする。インキュベーション期間の終わりに、ウシ胎児血清またはアルブミンを添加し、サンプルを３層の滅菌チーズクロスを通過させて、結合組織の断片を取り除く。クロスを通る液体は目に見える細胞の塊がないかどうかチェックする。多数の塊かある場合には、これら塊をスピンダウン（１２００ｒｐｍ、５分）し、トリプシン／コラゲナーゼの方法を繰返す。酵素の溶液を細胞懸濁液から洗い流し、細胞を洗浄してＩ・ランスフェクションに適当な大きさの容器に移す。

他の組織の分離方法は異なる酵素調製物を利用してもよい。組織の分離に使用される他の酵素としては、ベルセン（Ｖｅｒｓｅｎｅ　）　、バンクレアチンおよび他のコラゲナーゼが含まれる。組織からの生検についている結合組織が最少限である場合、コラゲナーゼで処理する必要はない。これらのサンプルについては、トリプシンで消化を行なうだけで十分である。他の組織からのサンプルについては、トリプシン媒介による分離では粗すぎるかもしれない。ここでは、ＥＤＴＡや他のキレート化剤で、細胞の生存を維持しながら十分組織を分離することがてきるであろう。さらに他の組織サンプルについては、細かく切り分けるかまたは吸引すれば酵素で処理を行なわなくても細胞の懸濁物が生じるかもしれない。

幾つかの応用については、組織の分離は必要とされない場合もあり得る、すなわち生検サンプルがさらなる操作を伴わずにそのままトランスフェクトされる。

幾つかの遺伝子治療の応用については、均一な細胞群が好ましい。細胞はまず生検かまたは血液サンプルから分離され、それからさらに他の細胞タイプから分離される。細胞の混合懸濁物から特定の細胞タイプを取出す方法については様々な方法か当業者に知られている。

細胞のタイプは、他のタイプとその密度や大きさによって区別され得る。たとえば、メツシュスクリーン、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）またはスクロース勾配遠心分離を用いて１つの細胞の個体群を他の個体群から分離することができる。

細胞はまたそれらの粘着特性に基づき分離することもできる。たとえば、繊維芽細胞は上皮細胞よりも素早くプラスチックに粘着して固着する。細胞の個体群はまた表面タンパク質により相互に分離することかできる。レクチンまたは抗体を用いて細胞の１つの個体群を他の個体群からパニング（レクチンまたは抗体か結合した表面上に細胞を通すこと）、カラムクロマトグラフィーまたは蛍光活性細胞ソーティングを用いて他の個体群から選択的に分離することができる。好ましい方法によれば、血液サンプルからの細胞はある装置（セレクタ（Ｃｅｌｌｅｃｔｏｒ）、　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｉｍｍｕｎｅ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　）において分離される。

この装置は複数のポリスチレンプレートを備え、このプレートには特定の細胞に選択的に結合するモノクローナル抗体が永久的に付与されている。血液サンプルがこのセレク表面に付着したままとなり、一方他の細胞は装置を通過する。捉えられた細胞をそこで機械的または化学的手段によって解放することかできる。当業者は希望する特定の用途に応じて適切な細胞分離方法を選択することができるであろう。

洗浄され分離された細胞は培地において２４時間までまたはこれを上回る時間保管することかできる。しかしながら、細胞は好ましくは組織分離および細胞精製に引続いて直ちにトランスフェクトを行なうことか好ましい。細胞の分離とトランスフェクションとの間に遅れかある場合には、細胞をある栄養環境に戻してやることも一案である。細胞はその特定の細胞タイプに適合する組成を有する組織培養培地に保管され得る。典型的にはイーグルス（Ｅａｇｌｅｓ）　（ＥＭεＭ）またはダルベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の最少必須培地（ＤＭＥＭ）に１０％のウシ胎児血清（ＦＣ３）またはウシ胎児血清（ＦＢＳ）および抗生物質溶液（（Ｆｕｎｇｉ　Ｂｅｅｔ　５ｏｌｕｔｉｏｎ、　Ｉｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、　［ｒｖｉｎｅ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）　、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびフンギゾーンを含む）を加えたものを用いて細胞を生体外で維持する。

ポリヌクレオチドの調製本明細書中に開示する発明はＤＮＡまたはＲＮＡのいずれを用いることもてきる。安定なまたはより長い遺伝子発現を望む場合にはＤＮＡのデリバリ−が好ましいかもしれない。一方、一時的な遺伝子の発現の用途についてはＲＮＡまたはＤＮＡ遺伝子デリバリ−のいずれを用いてもよい。

なお、この方法では一時的な発現と安定した発現との間で選択は行なわない。しかし、選択を行なわなければ、細胞の多くは一時的にトランスフェクトされる可能性がある。

一時的な発現による遺伝子の発現は数時間から数カ月にわたることが可能である。幾つかの応用で繰返し治療を行なうことか必要とされる場合には、患者はそれでも遺伝子の発現の効果から恩恵を受けることになる。薬と同じように、ポリヌクレオチドの投与量や組織に対する配達部位の数をモニタし、これに応して調節を行なうことができる。

治療用遺伝子をコードするＤＮＡは環状または線状のいずれてもよく、標的細胞における発現を容易にする調節要素を含んでいる必要かある。分子生物学における今日の発展は組織特異的プロモータの同定および分離に向けられている。このような組織特異的プロモータか同定されると、これらは遺伝子発現ベクター内に組込まれて、特定の組織内の生体外遺伝子治療戦略に使用することかできるかもしれない。同様に、所与の応用に関してはプロモーション能力に応じてより雑多なプロモータを選択してもよい。こうして、アクチンプロモータである、ラウス肉腫ウィルス（Ｒ３Ｖ）プロモータまたはミオ（Ｍｙｏ）Ｄプロモータを萌芽細胞および筋肉トランスフェクションに使用し得る。サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）のごく初期の（ＩＥ）遺伝子／エンハンサ（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ他、Ｇｅｎｅ　４５：Ｉｏｌ　（１９８６年）引用により援用）、Ｒ８Ｖプロモータ／エンハンサ（Ｊ、　Ａ、　Ｗ。

ｉｆｆ他、５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：１４６５−１４６８　、引用により援用）、β−アクチン遺伝子／プロモータエンハンサ（Ｋａｗａｍｏｔｏ他Ｍｏｆ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　８：２６７　（１９８８年）引用により援用）、およびα−グロブリンプロモータ（Ｐ、　Ｍｅｌｌｏｎ他Ｃｅ１ｌ　２７：２７９− ２８８　（１９８１年）、これも引用により援用）を、より遍在的な細胞の発現に使用することかできる。また、第１イントロンを伴うＣＭＶ　ＩＥ遺伝子／エンハンサ−プロモータ（Ｂ、　Ｓ、　Ｃｈａｐｍａｎ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１９：３９７９−３９８６　、引用により援用）、およびＭＣＫプロモータ（Ｊａｙｎｅｓ他、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　８：６２　（１９８８年）、引用により援用）を用いて萌芽細胞にトランスフェクションを行ない、続いて筋肉注射を行なって成熟した筋肉線維での発現を行ない得る。トランスフェクトされたＤＮＡはさらに、リポソーム結合、ポリアデニル化シグナルを媒介する領域を含むへきでありかつインビボ遺伝子発現を容易にするエンハンサ領域を含むへきである。

関心のあるポリペプチドをコードするＲＮＡは同様に適当なプロモータ要素とリポソーム結合部位とを含むへきである。好ましくは、翻訳を促進しかつエキソヌクレアーゼ活性を最少限にするため、ＲＮＡはキャップされるかまたは安定化される。カチオン媒介による遺伝子の運搬におけるＲＮＡの使用についてはＭａｌｏｎｅ他による刊行物に記載されている（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６：６０７７−６０８１（１９８９）、引用により援用）。またｍＲＮＡはキャップされていないｍＲＮＡの発現を可能にする特定の５ ′配列を含むことかできる。脳心筋炎ウィルス（ＥＭＣＶ）を含むピコルナウィルス群の中には、元からキャップされていないｍＲＮＡを持つものもあるか、それでもこれらは翻訳され安定である。５′未翻訳領域における６５０ｂｐ（塩基対）配列によって、キャップ構造を伴わないリポソームの結合を可能にするリポソーム結合部位か提供される（Ｅｌｒ。

ｙ−３ｔｅｉｎ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６：６１２６−６１３０（１９８９年）、引用により援用）。これらの配列をキャップ構造の代わりとして用いることもできる。

リン酸カルシウム沈降または電気穿孔法を用いて細胞をトランスフェクトする場合、トランスフエクション工程の間に試薬のＲＮアーセ汚染を最少限にするためさらに注意を払う必要かあるかもしれない。

ポリヌクレオチド配列のリポソーム媒介による運搬本発明の「接触」ステップには、ポリヌクレオチド配列を標的細胞内に導入するための方法が含まれる。この方法には、リン酸カルシウム沈降、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔法およびリポソーム媒介による遺伝子運搬が含まれる。これらの方法は当業者に周知である。

好ましい具体例では、リポソーム媒介による遺伝子運搬を用いてポリヌクレオチドを標的細胞内に導入する。リポソームは、中空の脂質小胞を形成する両親媒性の脂質を備える。これらは遺伝子配列を組織培養細胞内に導入するための機構としてインビトロで使用されてきた（Ｒ，Ｊ、　Ｍａｎｎｉｎｏ　、Ｆｏｕｌｄ− Ｆｏｇｅｒｉｔｅ、　Ｓ、、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６：６８２−６９０．１９８８年）。リポソームを構成する脂質を十に荷電（陽イオン）してもよいし、−に荷電（陰イオン）してもよいし、または中性でもよい。リポソーム開発における大きな進歩は、十に荷電された合成カチオン脂質である、Ｎ−［１−９２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］　−Ｎ、　Ｎ、　Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）が、自発的にＤＮＡと作用して細胞膜に結合する −に荷電された脂質と融合する能力かある脂質ＤＮＡ複合体を形成することかできるという発見てあった（Ｐ、　Ｌ、　Ｆｅ１ｇｎｅｒ他、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　８４ニア４１３−７４１７　（１９８７年））およびり、　Ｅｐｐｓｔｅｉｎ他の米国特許第４．８９７．３５５号）。リポソームか媒介する遺伝子のデリバリ−は、レトロウィルス媒介による遺伝子のデリバリ−とは異なり、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれても運搬することかできる。したかって、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ポリヌクレオチドまたはこれらを組合せたものを直接細胞質内に導入することかできる（Ｍａｌｏｎｅ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　８６：６０７７−６０８１．１９８９年））。

リボフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、メリーランド州ゲテイスバーグ）をインビトロで使用して核酸トランスフェクションか行なわれる。リポフエクチン（商標）は、滅菌水中０．５ｍｇ／ｍ１のＤＯＴＭＡと０．５ｍｇ／ｍｌジオしオイルホスファチジルエタノールアミンからなる。ＤＯＴＭＡは、リボフェクチン（商標）の陽イオン脂質成分て、ジエーテル脂質である。他の適当なカチオン脂質の種には、１．２−ヒス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）またはＮ−（ｗ、ｗ −１−ジアルコキシ）−アルキル−イル−Ｎ、　Ｎ、　Ｎ−トリ置換アンモニウム界面活性剤または同様の構造および特性を有する複合カチオン脂質またはこれらの混合物等の公知のカチオン脂質か含まれる。

インビボてより容易に分解可能と考えられるこれらカチオン脂質を含む特に好ましいカチオン脂質については、ＦｅＩｇｎｅｒ他により１９９１年４月１９日に出願された継続出願米国出願番号第６８６７４６号に記載されるものかあり、これを引用により援用する。これらの脂質にはＤＯＲＩ（ＤＬ−１，２−ジオしオイル−３−ジメチルアミノプロピル−β−ヒドロキシエチルアンモニウム）およびＤＯＲＩＥ　（ＤＬ−１，２−０−ジオレイル−３−ジメチルアミノプロピル −β−ヒドロキシエチルアンモニウム）の類似体ならびにＤＯＲＩエステル／エーテル化合物（ＤＬ−１−〇−オレイルー２−オレイルー３−ジメチルアミノプロピル−β−ヒドロキシエチルアンモニウムまたはＤＬ−１−才レイル−２−０ −オレイル−３−ジメチル−アミノプロピル−β−ヒドロキシエチルアンモニウム）または以下の一般式を有する誘導体が含まれる。

ここてＹｌおよびＹ２は同じかまたは異なっており、かつ−ＯＣＨ２−１−０− Ｃ（０）−または−〇−てあり、Ｒ１およびＲ２は同しかまたは異なっており、かつＨまたはＣ８〜Ｃ２２アルキルもしくはアルケニルであり、Ｒ７およびＲ４は同じかまたは異なっており、０１〜Ｃ２４アルキルまたはＨてあり、Ｒ５は、ＣＩ−Ｃ２４アルキル直鎖または技分かれ鎖であり、Ｒ１は、−Ｃ（０）−（ＣＨ２）、−ＮＨ−、アルキル、アリールもしくはアラルキルであるジアミノカルボン酸、または前記ジアミノカルボン酸に連結したーＣ（０）　−（ＣＨ２）　、−ＮＨ−であるか、または存在していないかであり、Ｒ７は、Ｈ１スペルミン、スペルミジン、ヒストン、またはＤＮＡ結合特異性を有するタンパク質、またはそこにおいてＲ７部分のアミンかＲ’　、Ｒ’　もしくはＲ′基で四級化されているものであり、またはＲ７は、側鎖上に十に荷電した基を有するし−またはＤ−αアミノ酸で、前記アミノ酸がアルギニン、ヒスチジン、リジン、オルニチンまたはこれらの誘導体を含むものであるか、または同じアミノ酸においてＲ７部分のアミンがＲ３、Ｒ４もしくはＲ５基で四級化されているものであり、またはＲ７は、Ｌ−またはＤ−αアミノ酸からなるグループから選択されるポリペプチドて、そこにおいてアミノ酸残基の少なくとも１つがアルギニン、ヒスチジン、リジン、オルニチン、またはこれらの誘導体を含むものであり、ｎは１ないし８であり、ｍは１ないし１８であり、かつＸは非毒性アニオンである。

本明細書中に記載する非毒性アニオンは、無機酸および有機酸を含む薬理学的に非毒性の酸とすることかできる。

これら酸には、塩酸、臭酸、硫酸、リン酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、グルタミン酸、乳酸等が含まれる。薬理学的に許容可能な塩の調製については、Ｓ、　Ｍ、　Ｂｅｒｇｅ他の、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ１６６：１−１９　（１９７７年）を参照。さらに、ＤＯＴＭＡ　（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］　−Ｎ、　Ｎ、　Ｎｌ−リメチルアンモニウム）を、改良されたカチオン脂質と組合せて、またはコレステロール、リソ脂質または中性脂質と組合せて使用することもできる。

これらのカチオン脂質に加えて、他の脂質を選択したカチオン脂質に添加してもよい。これらは限定されるわけではないが、リソ脂質が含まれ、その例としてリソホスファチジルコリン（ｌ−オレオイルリソホスファチジルコリン）かあり、コレステロール、またはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）もしくはジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）を含む中性リン脂質か含まれる。脂質の比は、コレステロールまたはリソもしくは中性脂質の混合物と組合せて主成分としてのカチオン脂質を含むため様々な比か可能である。好ましい脂質の処方については以下の例の項で詳細に述べることにする。

トランスフェクション方法の好ましい例として、カチオン脂質媒介のＤＮＡ　ｌ −ランスフエクションについて説明する。本発明の特定の応用に関連するカチオン脂質媒介のトランスフェクションの例について例１と例２で説明する。

リポフェクチン（商標）は商業的に入手可能なカチオン脂質である。商業に入手か可能てないまたはリポソームに処方されていないものについては、脂質分子および／または他の脂質成分をクロロホルムに溶かした後、真空ポンプを用いて１晩乾燥して、少量のクロロホルムをも取り除くようにする。この脂質膜を次に滅菌精製蒸留脱イオン水で水和し、このサンプルをｌＯｏＣて透明になるまで音波処理する。脂質の混合物をポリヌクレオチドと混合してトランスフェクションに用いる。これらの技術は当業者には知られた技術である。

上に述へたとおり、異なる細胞精製のスキームとともに様々な組織分離方法か実行可能である。生検および細胞は組織分離の前後に凍結させてもよい。分離と精製工程は、細胞の生存能力を最大限にするため、生検の後できるだけ迅速かつ都合よく行なう必要かある。一度分離されると、細胞はトランスフェクトされる。

トランスフェクトされた細胞は好ましくは培地での増殖または選択を行なわずに直ちに患者に戻される。幾つかの応用については、生検された組織を分離し、必要なポリヌクレオチドで処理しかつ培地での増殖または選択を行なわずに凍結させることかてきる。サンプルは、必要に応して後の処理に備えて解凍することかできる。同様に凍結した細胞の一部を解凍し、トランスフェクションの効率や遺伝子の発現のためアツセイすることもてきる。細胞を凍結させる方法については当業者には様々な方法か知られている。標準的な細胞凍結方法には、２−７％ＤＭＳＯまたはグリセロールを用いる５−２０９６Ｆ　ＣＳ中の細胞懸濁物を凍結するという方法か含まれる。細胞を一７０°Ｃに１晩置きかつ一１２０°Ｃ付近で保管する。この標準的な技術を修正したものは当業者にとり周知の方法である。

本発明の好ましい具体例においては、生体外（ｅｘ　ｖｉｖｏ）ての方法を使用して免疫系を活性化させることができると考えられる。存効量のポリヌクレオチドを適当な細胞に配達しかつこのポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの発現か免疫系の活性をもたらす。

この特定の方法には様々な用途かある。最も直接的な用途は体液性および細胞性免疫系を刺激するというものである。関心のあるポリペプチドを作動的にコードする遺伝子を血液サンプルまたは組織サンプルから得た細胞の個体群に導入する。これらの細胞を患者に戻す。宿主内での外来遺伝子の発現によって免疫系に対する細胞の提示か刺激され、Ｂ　ＩＪンバ球からの体液性反応およびＴ細胞個体における細胞性反応か生しる。加えて、免疫系細胞の所与の個体群における外来遺伝子の発現によって直接的に免疫反応を刺激することかできる。

例５および例６のデータは、免疫系の活性へのアプローチを示し、これによってこれまでの免疫処置のプロトコールに比へてインビボでウィルス感染細胞や癌細胞に対する細胞性免疫反応に対しより良い制御を行なうことかできる。

免疫系の細胞性攻撃に対し抗原を最適に提示するためには、細胞内抗原合成か必要であることを示すデータか増えている。これは、主要組織適合抗原複合体（ＭＭＣ）クラス■タンパク質に関連する抗原の提示は、抗原かゴルジ体内でＭＨＣクラスＩタンパク質とともに処理された場合に最もよく達成されるためである。

免疫反応の効力に対して細胞内抗原合成か有効であるということは、サブユニットワクチンの従来の全身性細胞外注射による組換え型抗原に対する機能的細胞性免疫反応の発生に関する問題点を説明する鍵となる。この考え方と一致して、レトロウィルス変換１次細胞または同系の細胞系は、細胞内抗原を発現して、インビボで抗原を提示することかできかっＭＨＣ−１制限態様で細胞性免疫反応を刺激することかできる。我々の実験結果ては、レトロウィルス媒介による方法ではとれとしてこのような制限を同様にバイパスできるものはなく、そこで、調節という観点から、これはウィルスヘクターを必要とする方法よりも好ましいてあろうと考える。この生体外遺伝子治療は免疫反応を発生させるためには有効な技術となる。本発明の範囲内で考えられる治療用ポリペプチドの一時的な発現は、遺伝子生産物を治療用薬剤として体内に一時的に導入するのに使用される。

本発明のもう１つの具体例には、免疫系を刺激して癌細胞の所与の個体群を外来であると認識させることを含む。

この応用では、腫瘍の細胞を患者から採取し、遺伝子をトラ’ｙ　ス’）エクトシて、細胞をトランスフェクション後４８時間以内に患者に戻す。好ましい具体例では、細胞は直ちに患者に戻される。免疫系はそこで外因性ポリペプチドを発現するこれら特定の癌細胞を外来として認識する。癌にかかった組織の一般的な場所における免疫反応を刺激することで処置されていない腫瘍細胞も新たに外来として認識され、全身に広かる腫瘍の緩解を生じる可能性が増す。免疫原性タンパク質を幾つか使用して免疫系を癌に罹った細胞に対して刺激することも可能である。内因性遺伝子たとえは主要組織適合性複合体のものと、外来抗原の両方が有効かもしれない。

免疫系活性化のためのさらにもう１つの候補は、癌細胞または身体の他の選択された細胞内にリンホカインを導入して発現させることである。一般にリンホカインおよび特定的にはＩＬ−２は、有効な免疫系刺激物質である。リンホカインの発現を利用して、内因性リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細胞）を活性化することができる。ＩＬ−２は、ヌル細胞の分化を刺激してＬＡＫ細胞にする。

これらの細胞は様々な癌を攻撃するものとして知られており、これらの細胞の殺傷活性の刺激は外因性ＩＬ−２により促進される。第２の細胞タイプである、腫瘍浸透性リンパ球（ＴＩＬ）もＩＬ−２によって刺激されかつ腫瘍の緩解を促進するうえではＬ　Ａ　Ｋ細胞よりも効果的であることがゎかっている。また、そのまま腫瘍細胞に対して細胞毒性を有する他のサイトカインも見つかっている。

腫瘍の部位内および周りへのこれらのタンパク質の発現によって癌の緩解か起こる。細胞毒性Ｔ細胞の制御を改善すれは潜在的なウィルス感染の排除を高めかつ発癌の中心となる部分を破壊することか容易となるかもしれない。この方法によるヘルパーおよびサプレッサーＴ細胞個体群の改善された制御により、最終的に慢性関節リューマチを含む自己免疫疾患を制御するための改善された方法か得られるかもしれない。

本発明のもう１つの好ましい具体例では、筋肉の生検を使用して筋肉の部分細胞を分離する。患者の部分細胞はＢＩａｕ他の技術により分離することかできる（Ｐｒａｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７８：５６２３−５６２７１９８１年、引用により援用）。

部分細胞は患者に対し実質的に迷惑をかけずに筋肉から簡単に採取することかできる。Ｂｌａｕ他の技術に従い処理した少量の組織はｌ・ランスフエクション用に十分な量の部分細胞を生成する。この筋肉の部分細胞を本明細書に開示する方法に従い生体外（ｅｘ　ｖｉｖｏ）でトランスフェクト肉または他の組織に戻す。部分細胞はまた細胞の生存率を大きくロスすることなくまたは細胞の表現型を大きく変えることなくある一定時間保管するかまたは凍結させることかできる。

部分細胞は再び筋肉に戻されると利用可能な成熟した筋原線維と融合することができる。こうして部分細胞のデリバリ−は筋肉細胞へ遺伝子を配達するための特に効率的な方法である。部分細胞は簡単に分離され患者の筋肉組織から都合よく採取できるので、組織拒絶の危険性はない。一時的な遺伝子発現は自家移植した細胞において繰返し治療を行なうと時間の経過により、より持続する可能性が高まる。部分細胞トランスフェクションに関するもう１つの重要な利点は、筋肉組織には注射か可能でありかつ筋肉組織か身体のはとんとの表面下にあること、したがってトランスフェクトされた細胞を必要なだけ何度も何箇所にもわたって注射することかできるという点である。ＭＣＫ　（Ｊａｙｎｅｓｆｔｈ上記）等の筋肉特異的プロモータを使用して、遺伝子物質の発現を成熟した筋肉線維に制限することかできる。

筋肉細胞はこうして所望のポリヌクレオチド配列を発現する。最近のｌｉＪＦ究によれば、筋肉組織に注射された安定な部分細胞のＩ・ランスフエクタントはそれらの遺伝子生産物を血液の流れの中に発現することか示されている（Ｍ．　Ｈｏｆｆｍａｎ，　Ｓｃ１ｅｎｃｅ　２５４：１４５５−１４５６　、１９９２年）。

幾つかの治療用試薬を使用して生体外で患者からの細胞のサンプルを処置することかできる点も本発明の範囲内にあると考えられる。ちょうとポリヌクレオチドが、分離された細胞から一時的に発現され得るように、幾つかの試薬を細胞に加えて一時的な治療効果をもたらすことかできる。

こうしてポリヌクレオチド、ヌクレオシド類似体、リボ酵素、アンチセンスポリヌクレオチドまたは他の薬剤を細胞に配達することができる。

処置された細胞の再導入一度トランスフエクションが完了すると、細胞を洗浄し、濃縮して患者に戻す。

細胞は元の組織に直接戻してもよいしまたは幾つかの応用については細胞を元の組織の範囲内の第２の位置または元の組織から離れた場所に戻してもよい。好ましくは大きな孔径の針（１８ゲ一ジ以上）を用いて細胞を身体に戻す。細胞を破壊せずまた細胞の組織内への通過を制限しないものであればどのような孔径を用いてもよい。所与の組織内の複数の場所に処置した細胞を導入することか仔効かもしれない。たとえばデュシエーヌ筋ジストロフィーの場合など、処置した細胞を多数注射することで組織全体に遺伝子生成物を存利に分散させることになる。

組織分離を行なわないでカチオン性リポソームおよびポリヌクレオチドで組織か処置される場合には、そのままの生検を外科的な移植と取り替えてもよい。肝細胞等の他の細胞は、その器官につながっている血管に注射することで元の器官に戻され得る。

処置を行なった癌細胞を患者に戻す方法については癌のタイプに依存する。自己由来のトランスフェクトされた癌細胞を腫瘍の塊または骨髄のいずれかに注射することが可能である。ＭＨＣタンパク質、外来タンパク質または免疫刺激タンパク質の発現によって治療された腫瘍細胞と治療されていない腫瘍細胞の双方に向けられる免疫反応が刺激され、腫瘍の塊か減少したりなくなったりする。造血細胞超厚の他のトランスフェクトされた癌細胞は直接血液の流れの中に導入してもよい。硬い組織の腫瘍からの細胞は腫瘍の緩解を導出するため腫瘍の塊に直接戻してもよい。これは、カテーテル等を用いて外部または内部からの注入により行なうことができる。本発明の好ましい具体例では、遺伝子治療を行なうのに必要な試薬はキットの形で得られる。したかって、例１および例２て特定の細胞タイプへの遺伝子のトランスフェクションの最適化例として示した方法は、特定の組織から得られた細胞内へ特定の遺伝子をトランスフェクトすることについての最適な組合せを決定するために使用される。トランスフェクト用遺伝子は、カチオン脂質または脂質トランスフェクト試薬に複合されたまたはこれらから別のＲＮＡもしくはＤＮＡとして供給される。所与の治療に必要な器具も供給してよく、これらの器具には生検用の道具、緩衝塩、媒質、洗浄用緩衝液、および組織分離用の道具などが含まれる。こうして、最適化された方法は、研究室での必要な作業を最少限にしたルーチンで行なう研究用の方法として実現される。技術者は医者から生検、血液のサンプルまたは皮膚のパンチを受け取る。

このサンプルをキットの指示に従い処理する。特定のレジュメ（最適化された）に関する適当な数の細胞をトランスフエクソヨンウェルにおいて関心のある遺伝子でトランスフェクトする。インキュベ−１・と洗浄の期間に引続き、細胞を好ましくは注射または外科的な移植によって患者に再び挿入する。

細胞トランスフェクションの標準的な方法ではトランスフェクションごとに３００００を超える細胞が必要である。

この標準的な技術を用いれば、生検または細胞のサンプルはまず培地で培養して、トランスフェクションに十分な目標の個体数を得る必要がある。本明細書に開示される方法を使用すれば、標準的な生検や血液抽出から簡単に分離できる細胞数で効率的なトランスフェクションや遺伝子の発現か可能である。また、以前の方法では技術者がトランスフェクション後関心の遺伝子を安定に発現する細胞を選択し、これらの細胞がさらに増殖されていた。本明細書に開示する発明では、ｌ・ランスフエクションに先立つ細胞の増殖やトランスフェクションに引続く細胞の選択などは必要ではない。細胞は直ちに凍結されるかまたはそのまま患者に戻される。これによって技術者が要する時間および専門技術か低減されて、遺伝子治療か広く利用できる医療行為となり得る。

安定に変換された遺伝子か長期間かけて比較的一定したレヘルの遺伝子生産物を製造する従来技術の遺伝子治療とは異なり、本発明の実施においては一時的な発現が望まれる場合か多い。このような先行技術との大きな概念上の違いによって、医師は関心のある遺伝子を薬剤として使用することか可能となる。このように遺伝子を周期的に投与することかでき、投与量を調節し、かつ効果は最終的に一時的である。これらの利点の１つとして従来技術の遺伝子治療では得られないものである。

本発明の特定の実施例について詳細に説明しかつ本発明の範囲内で可能な変更例についても言及することにする。

当業者においてはここに意図する発明を上首尾に行なうのに利用可能な他の技術や方法か様々存在する。

例１マイクロタイタープレートトランスフェクションブロトコールトランスフエクションブロトコールを最適化する方法について以下に述べる。最大トランスフェクション効率を容易に得るためには、各遺伝子治療のレジュメを最適化する必要かある。一度最適条件か特定の細胞タイプ、カチオン脂質試薬およびポリヌクレオチドについて得られれば、次に、５０−１００の細胞を含む個々のウェルをトランスフェクトすることかできる。以下に述へる最適化のスキームはウェル当たり５０００から４００００の細胞を用いているが、より少ない数の細胞を使用する技術の最適化を行なう場合には数を減らしてもよい。

カチオン脂質希釈スキーム２００００−４００００細胞／ウエルが９６−ウエルマィクロタイタープレートに対し播種されがっ湿度の高い５から１０％ＣＯ２環境内で３７℃において１晩インキユベートされた。ＤＮＡとカチオン脂質連続希釈物を以下のスキームに従い２つの別個の９６−ウェルプレートに準備した。

カチオン脂質希釈スキーム列方向Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中２×連続希釈カチオン脂質（ナノモル）１６．８　８．４　４．２　２．１　１．０５　０．５３　０．２６　０．１３カチオン脂質小胞を水で０．７４７ｍＭまで希釈。

第１列（ＡＩ・・・Ｈｌ）およびＡＩＯにおけるウェルごとにＯｐ　ｔ　ｉ　− ＭＥＭ６６ｕ　Ｉを分散。

各ウェルにＯｐ　ｔ　ｉ　−ＭＥＭ６０　ｕ　］を分散（Ａ２・Ｈ８およびＢＩＯｌＨＩＯ）。

第１列（ＡＩ・・・Ｈｌ）の各ウェルおよびｒＸＪて示したウェルＡＩＯに０．７４７ｍＭカチオン脂質５４ｕｌをロード。

混合の後、次の列に６０ｕｌを移す。

ＤＮＡ希釈スキーム行方向Ｏｐｔｊ−ＭＥＭ中２×連続希釈ＤＮＡ　ＤＮＡ（ｎｍｏｌｅ）　ｃｔｒｌＯｐｔｉ−ＭＥＭを用いてＤＮＡ調製物を８０ｕｇ／ｍ１に希釈（平均ヌクレオチドＭＷ＝３３０）各ウェルにおいてＯｐ　ｔ　ｉ　−ＭＥＭ７０　ｕ　ｌを分散１行目の最初の９つのウェルにウェル当り８０ｕｇ／ｍＩ　ＤＮＡを７０ｕ１充填する。

混合の後次の行に７０ｕｌを移して連続希釈物の調製を行なう。

等しい容量のＤＮＡを脂質プレートの対応するウェルに移し混合した。これによって以下のようにトランスフェクション前のカチオン脂質とＤＮＡの最終濃度か得られた。

モル比は以下のとおりである。

カラム９とカラム１０（図示せず）は、それぞれＤＮＡの対照および脂質対照である。カラム１１と１２（表に示さず）は脂質を含まない対照であった。培地が細胞がら吸引されかつ１００ｕｌのカチオン脂質／ＤＮＡ？３！合体を直ちに細胞に添加した。プレートは３７°Ｃて湿気のある５％から１０％ＣＯ２環境てインキュベートされた。ＯＰＴＭ−ＭＥＭｒｔｊ３０％ＢＣ３Ｃ仔つシ血清）５０ｕｌがトランスフェクション後４〜６時間で添加された。組織の分離後すぐに細胞かトランスフェクトされかつそのトランスフェクション法かカチオン脂質を使用するものであれば、Ｏｐｔ　ｉ　−ＭＥＭ　Ｉ　（Ｇｉｂｃｏ）培地または類似する製品を使用することか望ましい。トランスフェクション工程の間、０ｐｔｉ　−ＭＥＭ　Ｉは、リポフェクチン（商標）に必要な血清を低減した条件下でも良い細胞生存率をもたらす。

インキユベーシヨンを継続し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中１０％ＦＣ３を再びｌ０ｆ）ｕｌｌ−ランスフエクソヨン後２４時間で添加した。この最適方法からのデータ分析の例を例２ＲＮＡ　）−ランスフェクションに必要なやり方はＤＮＡの方法と同して、ただし相違する点はＲＮＡの単位質量に対し必要なりボッエフチン（商標）の最適量か典型的にはＤＮＡｌ−ランスフエクションの場合に比べ幾らか少なく、遺伝子発現の収穫期かメツセージを加えてから８時間後である点である。ＤＮＡをＲＮＡに変えて、上記の方法を使用してこれらの細部についても行なうことかできる。インビトロ網状赤血球溶解物系で翻訳可能なメツセージも無傷細胞に対しては活性状態ではないかもしれない点を認識することか重要である。

細胞内活性は、翻訳されない要素に囲まれたメツセージが必要である。Ｂ、　Ｍａｌｏｎｅ他（上記）には、アフリカッメガエルのベータグロビンｍＲＮＡに存在する５′および３′非翻訳領域と３′ポリＡテイルおよび５’Ｍｅ−Ｇキャップを含む典型的なルシフェラーゼメツセージを記載している。無傷細胞ではこれら翻訳されない要素のすへてか顧著な発現を得るためには必要であることが示された。

例２９６ウエルプレートにおけるトランスフェクション後４８時間で、細胞はウェルごと５０ｕｌの溶解緩衝液（０゜１％トリトンで溶解された。プレートはアッセイの前に一７０°Ｃで凍結された。０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ５０μｌを列１２を除く各ウェルに添加した。β−ガラクトシダーゼスタンダードの連続希釈物を０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳにおいて調製し、最後の列に添加した（たとえば５００００、２５０００、１２５００、６２５０、３１２５、Ｉ２Ｏ３、７８１、３９０ｐｇ／ｍｌスタンダー′ドを５０ｕｌ）。１５０ｕｌの基質をウェルに添加した。基質はβ−ｇａｌ緩衝液中１ｍｇ／ｍ］　ＣＰＲＧ　（クロロホルムレッドガラクトピラノシド）または２ｍｇ／ｍｌのＯＮＰＧ　（オルト−ニトロフェノールガラクトピラノシド）のいずれかからなる。β−ｇａｌ緩衝液は、６０ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８、１ｍＭ硫酸マグネシウム、１０ｍＭ塩化カリウムおよび５０ｍＭベータメルカプトエタノールを含む。基質は各ウェルに加えられ、結果を、発色させた後、マイクロタイターリーダー上で５８０ｎｍで読取ってＣＰＲＧアッセイを行なうかまたは４０５ｎｍでＯＮＰＧアッセイを行なうかした。ＣＰＲＧアッセイはＯＮＰＧよりも感度か高くかつ細胞残渣から反射される光による影響も少なかった。検定はまたアルカリホスフエートレボータ遺伝子を利用し、リン酸ｐ−ニトロフェノールを基質として行なうこともできる。また、細胞溶解物の一部を抗体で被覆したプレートに移すことによってＥＬＩＳＡフォーマットにも適合できる。

例３ＤＯＲ　ＩおよびＤＯＰＥのＩ：１混合物を使用するＣｏｓ７細胞に関する基本的なアッセイの特徴図１のデータはこの方法を用いる典型的なトランスフェクションアッセイの結果を示す。三次元プロットのバーはマイクロタイタープレートの個々のウェルにおけるβ−ガラクトシダーゼ発現のレベルを表わす。各ウェルの細胞はウェルに存在するＤＮＡおよびカチオン脂質のレベルに関して別個に処置された。２次元マトリックスの一方の軸に沿って示されるのかカチオン脂質の一連の希釈物であり、かつ他方の軸はＤＮＡの一連の希釈物である。最適活性はプレートの中央付近で生じる。カチオン脂質濃度が高い部分て活性に低下か見られるのは脂質の毒性のせいであり、これは顕微鏡による細胞の直接的な観察によっても裏付けられ、このような観察によると、細胞は高濃度の脂質によって強く影響を受け得ることかわかる。ＤＮＡとカチオン脂質の濃度は最適トランスフェクション活性を得るために同時に変更する必要がある。効率的なデリバリ−のためにカチオン脂質とポリヌクレオチドのバランスが必要とされる、というのもカチオン脂質は高濃度では細胞にとって毒性を持ち得るからである。

図２のデータは、マイクロタイターウェル内での細胞濃度の変化の影響を示す。

ウェル当りの細胞の数が増えると、ウェル当りの発現の最大レベルも増大し、最大発現領域はより高いカチオン脂質濃度にシフトした。細胞を目で観察したところでは、カチオン脂質は細胞密度が低いほど細胞にとってより毒性が強いことがわかった。したかって、このカチオン脂質の毒性は細胞当りの脂質量の関数である。

非常に細胞密度か高い点で、最適レベルの発現における安定水準に達するようである。このデータはまた、細胞の数が少なければ９６ウエルマイクロタイタープレートの大きさよりも小さい容器で効率よくトランスフェクトを行なうことかできることを示しており、というのも細胞当りの脂質の量はこれに従って変化させることができるからである。

したかって少ない数の細胞、好ましくは５０−１００細胞／ウエルが、好ましくは１から３ｍｍの直径を有するウェルに効率よくトランスフェクトされ得る。

異なる細胞タイプの間でｌ・ランスフエクション活性を比較すると、タンパク質発現の最大レベルにかなり違いがあることがわかる。マウスＬ細胞はＢＨＫ細胞に比べ４００倍少ζ−遺伝子産物を生成した。トランスフェクション効率の違いは、カチオン脂質か媒介する細胞―合の効率によるものかもしれない。異なる細胞タイプの間では、固有の細胞内転写および／または翻訳効率に違いがあるかもしれない。細胞内ポリヌクレオチド分解能力は違いがあるかもしれず、また、細胞質からの核への取込みも違うかもしれない。３つの異なる細胞系はＣＯＳ７細胞と同じレベルでうまくトランスフェクトされ、かつ１次うット脳星状細胞もこれらの濃度でトランスフェクトされた。これらの結果は例１および例２に示すように、異なる細胞タイプおよびベクターそれぞれに関するトランスフェクションプロセスの最適化の重要性を強調するものである。こうして存効量の脂質は、本明細書にある最適化プロトコールを用いて各応用につき１つ決定されることになる。

例４以下の方法は、２００００細胞のサンプルサイズについて、Ｌ、ａｃＺのための遺伝子とともに遺伝子発現を促進するのに必要なＳＶ４０調節要素を含むＤＮＡプラスミドベクターｐ　Ｓ　Ｖ　Ｚ　（ＮＪｌＰｉｓｃａｔａｗａｙのＰｈａｒｍａｃｉａから入手した修飾ｐＳＶプラスミド）を用いて行なわれる。

ＤＯＲＩ／ＤＯＰＥの１．ｌ混合物のカチオン脂質小胞を滅菌水中０．７４７ｍＭまで希釈した。２００００ＣＯ３７細胞／ウエルを９６ウエルマイクロタイタープレートに播種した。第２のプレートにおいて、６０ｕｌＯｐｔｉ−ＭＥＭと５４ｕ１の０．７４７カチオン脂質か混合された。一連の２倍の希釈物を０ｐｔｉ　−ＭＥＭ中で調製して、８４日Ｍの最終カチオン脂質濃度を得た。ＤＮＡはＯｐｔｉ−ＭＥＭ中で連続して希釈され最終濃度６０ｕＭになった。等しい容量のカチオン脂質とＤＮＡを混合して、４２日Ｍ脂質と３０日ＭＤＮＡの最終濃度を得、脂質：　ＤＮＡ比は１．３９になった。媒質またはバランス生理食塩水を細胞から取り除き、カチオン脂質／ＤＮＡ複合体１００ｕ１を細胞に添加した。

細胞は３７°Ｃて１０％ＣＯ２中て４−６時間インキュベートされた。トランスフェクションに引続き、細胞を洗浄した。これらの細胞はアフリカミドリザルに皮下注射される。４８時間後組織を採取し、βガラクトシダーセ活性について試験する。

例５この生体外（ｅｘ　ｖｉｖｏ）でのインビボ抗体力価の導出方法（図３）においては、＋００万のＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞を含む、単一の６０ｍｍ組織培養プレートでカチオン脂質（ＤＯＲＩ　Ｅ／ＤｏＰＥ）を使用してＨＴＶ遺伝子ｇｐ１２０をコードするプラスミドＤＮＡ　Ｉ　Ｏμｇをトランスフェクトして、ＤＮＡを細胞内に導入した。ｐＢＲ３２２系プラスミド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）は、ＲＳＶプロモータを含むよう修飾され、かつＨＩＶｇｐ１２０遺伝子が含まれた。トランスフェクション後４０時間で細胞を洗浄し、培地から取り出しかつ同系のスイスＮＩＨマウスに注射した。

当業者に知られる標準的なＥｌｉｓａを用いかつＨＩＶ感染Ｈ９細胞溶解物を使用して、ＩｇＧ抗ｇｐ１２０抗体か注射後１２日目で検出され、かつレベルは注射後２８日でピークに達した。抗体力価は、平均血清力価の１／２００００で比較的高かった。細胞は抗原についての遺伝子で一時的にトランスフェクト要せず体液性の反応か観察された。動物は免疫反応を増大させるためにプラスミドの第２の注射を必要とするかもしれない（例６を参照）が、マウスにおけるｇｐ１２０に対する高い力価の応答のためにはこのような増大は必要ではなかった。

例６住血吸虫症に対する生体外免疫処置この例では、２つのプラスミドを、ルシフェラーゼ（対照）または住血吸虫症タンパク質Ｓｊ２３の免疫支配的フラグメントにリンクしたＲＳＶ調節要素を有するｐＢＲ３２２系プラスミドを用いて調製する（Ｗｒｉｇｈｔ他、Ｊ．　［ｍｍｕｎｏｉ．　１４７：４３３８−４３４２　、１９９１年およびＤａｖｅｒｎ池、ＭＯＬ．　Ｂｉ。

ｃｈｅｍ．　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．　４８：６７、１９９１年、引用により援用）。Ｓ４２３をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドＤＮＡは、ＤＯＲ　Ｉ／ＤＯＰＥの１．１混合物中で調製される。カチオンリポソームを伴う等価な濃度の１５０μｇプラスミドＤＮＡをそれぞれＢａｌｂ／Ｃマウスの各々関部に左右対称に注射する。マウスのうち半分はｐＲＳＶ−ルシフェラーセ対照を受けておりかつ残りの半分はｐＲＳＶ−Ｓｊ２３を受けている。一方の関部への第２回目の免疫処置を最初の注射後２２日目に繰返す。第２の注射後１２日目てシス１−ツマ・マンソニ（Ｓｃｈｉ　ｓ　ｔｏｓｏｍａｍａｎｓｏｎｉ）を使用して動物の免疫性をテストする。免疫性をテストンた後動物から毎週１力月間採血を行なう。力価をこの２つの動物間で比較して、住血吸虫症のタンノくり質の免疫支配的な領域から発生した抗体かウィルスの攻撃に抵抗するかどうかを決定する。

例７生体外での部分細胞へのポリヌクレオチドのデリバリ例７は、筋肉細胞中で外因性ポリヌクレオチド配列を発現させる方法を示す。この例では、部分細胞を関心のある遺伝子で処置して、全筋肉内に戻す。

この研究において使用されるマウスの部分細胞系はＣ２、Ｃ７およびＣ８である。Ｃ２は正常なおとなのＣ３Ｈマウスの足の筋肉から確立されたマウス部分細胞系である（Ｎａｔｕｒｅ　２７０ニア２５−７２７　；　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０ニア５８−７６６　、引用により援用）。Ｃ７どＣ８とはスイスウェブスターマウスの胎児の後肢の筋肉から分離したマウス部分細胞系である。Ｃ７は発癌性で、Ｃ８は発癌性ではない（Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９６：９９５−９９８、１９７７年、引用により援用）。これらの筋肉細胞系を使用できる可能性を決定するため、一時的なトランスフェクションか例１から最適化されたＤＯＲ　Ｉ　Ｅ／ＤＯＰＥ濃度てｐＳＶ２−ＬａｃＺレボータ構成物を用いて行なわれた。これらの細胞をＢａｌｂ　Ｃマウスの後肢に移植した。注射された筋肉からの組織の断片をＬａｃＺに対する抗体を用いて染色した。同様に、血液サンプルをＬａｃＺタンパク質についてＥＬＩＳＡによりアッセイする。トランスフェクト〜された細胞はすへてＬａｃＺに対し組織陽性であり、かつ部分細胞系Ｇ７およびＣ８も血清陽性である。結果によれば、部分細胞は他の商業的に入手可能な細胞系に適用可能な方法を用いてインビトロで１〜ランスフエクトされ得ることか示された。

例８インビＩ・ロトランスフエクションおよび自己由来肝細胞の置換による動物へのピトα１ー抗トリブシンのデリバリー肝細胞を部分肝切除により得た肝臓のサンプルから分離し、培養培地に置き、本質的にＭ、にａｙ　ｆｔ！Ｉ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８９：８９−９３　（１９９２年）に記載するようなトランスフェクションを行なった後動物に戻す。

対象動物から取り出した肝臓のサンプルからコラゲナーゼ処理によって分離した量にして５０００から２００００の肝細胞を９６ウエルマイクロタイタープレートの各ウェルに播種し、例１、例２および例４に記載する方法に従いトランスフェクトした。トランスフェクション用のカチオン脂質はＤＯＲＩ　：　ＤＯＰＥの５０：５０混合物で、細胞は、サイトメガロウィルスプロモータの転写制御の下、ヒトα１抗−トリブシンｃＤＮＡを含む、ＤＮＡプラスミドベクターｐＳＶＺ構成物によりトランスフェクトされる。

トランスフェクション脂質とＤＮＡの濃度および比率は例２のスキームに従い決定する。３７°Ｃで１０％ＣＯＩにおいて４−６時間インキュベートした後、トランスフェクトされた細胞を２−１０％の動物血清を含む基礎培地中で濯ぎ、１０’−１０７細胞／ｍｌの濃度で同じ溶液中に再懸濁する。トランスフェクトした細胞を含む溶液を同じ動物の肝臓の門脈循環系に、好ましくは約０．　５から２．０ｍｌ／ｍｉｎの速度で注入ポンプを用いて注入する。ヒトα１抗トリプシンのインビボ分泌に引続き、ヒトα１抗トリプシンの血清レベルのアッセイを行なう。

例９インビトロトランスフェクションおよび自己由来星状細胞の置換による動物の脳組織へのヒト神経成長因子のデリバリ− 脳細胞を、動物の脳の領域から取り出した生検試料から分離し、培養培地に置き、上の例８に記載されたものと本質的に同じ方法で神経成長因子についてｃＤＮＡを用いるトランスフェクションを行なった後動物に戻す。

細胞は初期ＳＶ４０またはごく初期ＣＭＶプロモータの転写制御下でヒト神経成長因子ｃＤＮＡを含むＤＮＡプラスミドベクターｐＲ３Ｖ、ｐｓＶ２またはｐＣＭＶ構成物によりトランスフェクトされる。３７°Ｃ１１０％ＣＯ７中４−６時間のインキュベーションに引続き、トランスフェクトされた細胞を基礎培地で濯ぎ、同じ溶液中に濃度１０’−１０７細胞／ｍｌで再懸濁する。トランスフェクトされた細胞を含む溶液を適当な脳の部位に注射して戻し、治療を行なう。対象の動物においては、繰返し生検を用いて発現を確かめる。繰返し生検が適切でない場合には、細胞のサンプルを培養のため維持して発現を確かめる。神経成長因子の発現は神経成長因子に対するモノクローナル抗体を結合剤としてＥｌｉｓａ法により示される。

本発明の特定の実施例について詳細に説明したが、当業者においては、これら実施例か限定的ではなく例示的であり、かつ本発明の真の範囲か以下の特許請求の範囲に規定ヘ１４〕へ θ へへフロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　５／１０Ｃ１２Ｐ　２１１００　Ｃ９２８２−４Ｂ／／（Ｃｌ３Ｆ　２１１００Ｃ１２Ｒ１：９１）（７２）発明者　フェルグナー、フィリップ・エルアメリカ合衆国、９２０６７　カリフォルニア州、ランチョ・サンタ・フエ、ビイ・オウ・ボックス・３３９２、ラス・パロマス、Ｉ（７２）発明者　ファンーフェルグナー、ジンーユアメリカ合衆国、９２０６７　カリフォルニア州、ランチョ・サンタ・フエ、ビイ・オウ・ボックス・３３９２、ラス・パロマス、（７２）発明者　マンソープ、マーストンアメリカ合衆国、９２１２９　カリフォルニア州、サン・ディエゴ、ケストレル・ストリート、１２４１８

Claims

【特許請求の範囲】

１．トランスフェクトされた細胞を脊椎動物におけるポリペプチド発現用に調製するための方法であって、前記脊椎動物から生きた細胞を採取するステップと、前記生きた細胞のうち少なくとも幾つかを、前記ポリペプチドを作動的にコードする有効量のポリヌクレオチドおよびトランスフェクションを容易にする脂質を含む調製物に接触させることによりトランスフェクトするステップと、前記調製物は接触によって前記細胞内に４８時間以内に前記ポリヌクレオチドの十分な量を配達する効力があり、前記トランスフェクトされた細胞を分離しまたは増殖する選択ステップなしに、前記脊椎動物への導入のために前記トランスフェクトされた細胞を薬理学的に許容可能な担体中に懸濁するステップとを含む、方法。
２．前記採取ステップがさらに前記細胞を周りの細胞外マトリックスから実質的に分離するステップを含む、請求項１に記載の方法。
３．前記細胞が前記接触ステップの後４８時間以内に凍結される、請求項１に記載の方法。
４．前記ペプチドが機能性遺伝子欠陥により引き起こされる前記脊椎動物の疾患を治療するために使用される、請求項１に記載の方法。
５．前記ポリヌクレオチドが前記生きた細胞内で前記ポリペプチドを発現するために使用される、請求項１に記載の方法。
６．前記細胞による前記ポリヌクレオチドの発現が一時的なものである、請求項５に記載の方法。
７．前記ポリペプチドが前記脊椎動物における免疫原性ポリペプチドである、請求項５に記載の方法。
８．前記ポリヌクレオチドが作動的にリンホカインをコードする、請求項５に記載の方法。
９．前記細胞が白血球細胞である、請求項５に記載の方法。
１０．前記細胞が骨髄細胞である、請求項５に記載の方法。
１１．前記細胞が筋芽細胞である、請求項７に記載の方法。
１２．クレーム１−１１のいずれかに従い調製される薬剤。
１３．インビボで脊椎動物にポリペプチドを配達するための方法であって、請求項１２の薬剤を前記脊椎動物に注射または移植するステップを含む、方法。