Trotz
der bisher gezeigten Erfolge besteht daher ein erhöhter Bedarf
sowie erhebliches Interesse an einer verbesserten Immunstimulation,
insbesondere an Mitteln, die einerseits geeignet sind, eine effiziente
Immunantwort im zu therapierenden bzw. zu impfenden Patienten hervorrufen,
und andererseits effektiv die Aufnahme eines optional zusätzlich enthaltenen
Wirkstoffs in den Körper
bzw. Körperzellen
unterstützen.
Diese
Aufgabe wird gelöst
durch ein erfindungsgemäßes immunstimulierendes
Adjuvanz in Form einer Lipid-modifizierten Nukleinsäure. Diese
Lipid-modifizierte Nukleinsäure
besteht erfindungsgemäß aus einer
Nukleinsäure,
mindestens einem mit dieser Nukleinsäure kovalent verknüpften Linker
und mindestens einem mit dem jeweiligen Linker kovalent verknüpften Lipid.
Alternativ besteht die Lipid-modifizierte Nukleinsäure erfindungsgemäß aus (mindestens)
einer Nukleinsäure
und mindestens einem mit dieser Nukleinsäure (ohne Linker) kovalent
verknüpften
(bifunktionellen) Lipid. Gemäß einer
dritten Alternative besteht die Lipid-modifizierte Nukleinsäure erfindungsgemäß aus einer
Nukleinsäure,
mindestens einem mit dieser Nukleinsäure kovalent verknüpften Linker
und mindestens einem mit dem jeweiligen Linker kovalent verknüpften Lipid
sowie mindestens einem mit dieser Nukleinsäure (ohne Linker) kovalent
verknüpften
(bifunktionellen) Lipid.
Ein „immunstimulierendes" Adjuvanz gemäß der vorliegenden
Erfindung ist bevorzugt in der Lage eine Immunreaktion auszulösen. Eine
Immunreaktion kann allgemein auf verschiedene Art und Weise hervorgerufen
werden. Ein wesentlicher Faktor für eine passende Immunantwort
ist dabei die Stimulation unterschiedlicher T-Zell-Subpopulationen.
T-Lymphozyten differenzieren typischerweise in zwei Subpopulationen,
die T-Helfer 1 (Th1)- und T-Helfer 2 (Th2)-Zellen, mit denen das
Immunsystem in der Lage ist, intrazelluläre (Th1) und extrazelluläre (Th2)
Pathogene (z.B. Antigene) zu vernichten.
Die
beiden Th-Zellpopulationen unterscheiden sich im Muster der von
ihnen produzierten Effektorproteine (Zytokine). So unterstützen Th1-Zellen
die zelluläre
Immunantwort durch Aktivierung von Makrophagen und zytotoxischen
T-Zellen. Th2-Zellen fördern
dagegen die humorale Immunantwort durch Stimulierung der B-Zellen
zur Verwandlung in Plasmazellen und durch Bildung von Antikörpern (z.B.
gegen Antigene). Von hoher Wichtigkeit ist bei der Immunantwort
daher das Th1/Th2-Verhältnis.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird durch das erfindungsgemäße Adjuvanz
das Th1/Th2-Verhältnis
der Immunantwort bevorzugt in Richtung der zellulären Antwort
(Th1-Antwort) verschoben und damit eine zelluläre Immunantwort induziert.
Die
erfindungsgemäß für die Lipid-modifizierte
Nukleinsäure
(Adjuvanz) verwendete Nukleinsäure, kann
eine RNA oder DNA sein (bspw. eine cDNA), ein RNA- oder DNA-Oligonukleotid, ein
RNA- oder DNA-Homopolymer, eine CpG-Nukleinsäure, etc.. Sie kann einzelsträngig oder
doppelsträngig
sein, als Homo- oder -Heteroduplex und linear oder zirkulär vorliegen.
Besonders bevorzugt liegt die erfindungsgemäß für die Lipid-modifizierte Nukleinsäure (Adjuvanz)
eingesetzte Nukleinsäure
als einzelsträngige
RNA vor.
Typischerweise
handelt es sich bei der Lipid-modifizierten Nukleinsäure um relativ
kurze Nukleinsäure-Moleküle, die
bspw. aus etwa 2 bis etwa 1000 Nukleotiden, vorzugsweise aus etwa
5 bis 200, 6 bis etwa 200 Nukleotiden, und besonders bevorzugt aus
6 bis etwa 40 oder 6 bis etwa 31 Nukleotiden, bestehen. Nukleotide
sind in diesem Zusammenhang bevorzugt alle natürlich auftretenden Nukleotide
sowie deren Analoga, wie Ribonukleotide und/oder Desoxyribonukleotide
und umfassen, ohne darauf beschränkt
zu sein, bspw. Purine (Adenin (A), Guanin (G)) oder Pyrimidine (Thymin
(T), Cytosin (C), Uracil (U)), sowie Analoge oder Derivate von Purinen
und Pyrimidinen wie z.B. 1-Methyl-Adenin, 2-Methyl-Adenin, 2-Methylthio-N6-isopentenyl-Adenin,
N6-Methyl-Adenin, N6-Isopentenyl-Adenin, 2-Thio-Cytosin, 3-Methyl-Cytosin,
4-Acetyl-Cytosin, 5-Methyl-Cytosin, 2,6-Diaminopurin, 1-Methyl-Guanin,
2-Methyl-Guanin, 2,2-Dimethyl-Guanin, 7-Methyl-Guanin, Inosin, 1-Methyl-Inosin, Dihydro-Uracil,
2-Thio-Uracil, 4-Thio-Uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thio-Uracil,
5-(Carboxyhydroxylmethyl)-Uracil, 5-Fluoro-Uracil, 5-Bromo-Uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-Uracil,
5-Methyl-2-Thio-Uracil, 5-Methyl-Uracil,
N-Uracil-5-oxyessigsäuremethylester,
5-Methylaminomethyl-Uracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thio-Uracil,
5'-Methoxycarbonylmethyl-Uracil,
5-Methoxy-Uracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v),
Pseudouracil, 1-Methyl-Pseudouracil,
Queosin, β-D-Mannosyl-Queosin,
Wybutoxosin, sowie Phosphoramidate, Phosphorthioate, Peptidnukleotide,
Methylphosphonate, 7-Deazaguanosin, 5-Methylcytosin und Inosin.
Die Herstellung derartiger Analoga sind einem Fachmann bspw. aus
den US-Patenten
4,373,071,
US 4,401,796 ,
US 4,415,732 ,
US 4,458,066 ,
US 4,500,707 ,
US 4,668,777 ,
US 4,973,679 ,
US 5,047,524 ,
US 5,132,418 ,
US 5,153,319 ,
US 5,262,530 und
5,700,642 bekannt, deren Offenbarung
durch Verweis hier vollumfänglich
mit aufgenommen ist.
Die
Lipid-modifizierte Nukleinsäure
kann jede natürlich
vorkommende Nukleinsäuresequenz,
deren Komplement oder ein Fragment davon, umfassen. Ein Fragment
einer solchen Nukleinsäuresequenz
weist in diesem Zusammenhang bevorzugt eine Länge von vorzugsweise etwa 5
bis 200, 6 bis etwa 200 Nukleotiden, und besonders bevorzugt aus
6 bis etwa 40 oder 6 bis etwa 31 Nukleotiden, auf. Ebenfalls kann
die Lipidmodifizierte Nukleinsäure
teilweise oder vollständig
synthetischer Natur sein.
Gemäß einer
ersten bevorzugten Ausführungsform
wird in der Lipid-modifizierte Nukleinsäure CpG-Nukleinsäure verwendet,
insbesondere CpG-RNA oder CpG-DNA. Eine erfindungsgemäß verwendete CpG-RNA
oder CpG-DNA kann eine einzelsträngige
CpG-DNA (ss CpG-DNA),
eine doppelsträngige CpG-DNA
(dsDNA), eine einzelsträngige
CpG-RNA (ss CpG-RNA)
oder eine doppelsträngige
CpG-RNA (ds CpG-RNA) sein. Bevorzugt liegt die erfindungsgemäß verwendete
CpG-Nukleinsäure
als CpG-RNA vor, noch bevorzugter als einzelsträngige CpG-RNA (ss CpG-RNA).
Ebenfalls bevorzugt weisen solche CpG-Nukleinsäuren eine wie oben beschriebene
Länge auf.
Bevorzugt
enthält
die erfindungsgemäß verwendete
CpG-Nukleinsäure
mindestens eine oder meherere (mitogene) Cytosin/Guanin-Dinukleotid-Sequenzen)
(CpG-Motiv(e)), welche durch die generischen Formeln 5'-X1X2CGX3X4-3' („Hexamer", SEQ ID NO: 1) oder
5'-X1X2X3CGX4X5X6-3' („Oktamer", SEQ ID NO: 2) repräsentiert
werden. Gemäß einer
ersten bevorzugten Alternative ist dabei mindestens ein in diesen
Hexamer- oder Oktamer-Sequenzen
enthaltenes CpG-Motiv, d.h. das C (Cytosin) und das G (Guanin) dieses
CpG-Motivs, nicht-methyliert.
Alle weiteren, gegebenenfalls in den Hexamer- oder Oktamer-Sequenzen enthaltenen Cytosine
oder Guanine können
entweder methyliert oder nicht- methyliert
vorliegen. Gemäß einer
weiteren bevorzugten Alternative können jedoch auch das C (Cytosin)
und das G (Guanin) des CpG-Motivs methyliert vorliegen. Im Kontext
der oben genannten Hexamer- oder Oktamer-Sequenzen stellen X1, X2, X3,
X4, X5 und X6 bevorzugt Nukleotide dar, die unabhängig voneinander
oder gemeinsam aus allen natürlich
auftretenden Nukleotiden sowie deren Analoga ausgewählt werden
können,
wie zuvor allgemein für
hier verwendete Nukleinsäuren
beschrieben.
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
enthält
die erfindungsgemäß verwendete
CpG-Nukleinsäure als
CpG-Motiv mindestens eines oder mehrere Oktamere ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus: GACGTCCC (SEQ ID NO: 3); GACGCTCC (SEQ
ID NO: 4); GACGTCCC (SEQ ID NO: 5); GACGCCCC (SEQ ID NO: 6); AGCGTTCC
(SEQ ID NO: 7); AGCGCTCC (SEQ ID NO: 8); AGCGTCCC (SEQ ID NO: 9);
AGCGCCCC (SEQ ID NO: 10); AACGTTCC (SEQ ID NO: 11); AACGCTCC (SEQ
ID NO: 12); AACGTCCC (SEQ ID NO: 13); AACGCCCC (SEQ ID NO: 14);
GGCGTTCC (SEQ ID NO: 15); GGCGCTCC (SEQ ID NO: 16); GGCGTCCC (SEQ
ID NO: 17); GGCGCCCC (SEQ ID NO: 18); GACGTTCG (SEQ ID NO: 19);
GACGCTCG (SEQ ID NO: 20); GACGTCCG (SEQ ID NO: 21); GACGCCCG (SEQ
ID NO: 22); AGCGTTCG (SEQ ID NO: 23); AGCGCTCG (SEQ ID NO: 24);
AGCGTCCG (SEQ ID NO: 25); AGCGCCCG (SEQ ID NO: 26); AACGTTCG (SEQ
ID NO: 27); AACGCTCG (SEQ ID NO: 28); AACGTCCG (SEQ ID NO: 29);
AACGCCCG (SEQ ID NO: 30); GGCGTTCG (SEQ ID NO: 31); GGCGCTCG (SEQ
ID NO: 32); GGCGTCCG (SEQ ID NO: 33); GGCGCCCG (SEQ ID NO: 34).
Am stärksten
bevorzugt enthält
die erfindungsgemäß verwendete
CpG-Nukleinsäure
als CpG-Motiv mindestens ein oder mehrere Oktamere ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus: GACGTCCC (SEQ ID NO: 3), AACGTTCC (SEQ
ID NO: 11), GACGTTCG (SEQ ID NO: 19) und AACGTTCG (SEQ ID NO: 23).
Ebenfalls umfasst sind solche Sequenzen, die eine Identität zu einer
der vorhergehenden Sequenzen von mindestens 60%, bevorzugter 70
oder 80%, und am stärksten
bevorzugt von 90 oder 95% aufweisen. Um die prozentuale Identität zweier
Nukleinsäuresequenzen
zueinander zu bestimmen, können
die Sequenzen abgeglichen werden, um nachfolgend miteinander verglichen
zu werden. Hierfür
können
z.B. Lücken
in die Sequenz der ersten Nukleinsäuresequenz eingeführt werden
und die Nukleotide an der entsprechenden Position der zweiten Nukleinsäuresequenz
verglichen werden. Wenn eine Position in der ersten Nukleinsäuresequenz
mit dem gleichen Nukleotid besetzt ist, wie es an einer Position
in der zweiten Sequenz der Fall ist, dann sind beide Sequenzen an
dieser Position identisch. Die Bestimmung der prozentualen Identität zweier
Sequenzen kann anhand eines mathematischen Algorithmus durchgeführt werden.
Ein bevorzugtes, jedoch nicht beschränkendes, Beispiel eines mathematischen
Algorithmus, der für
den Vergleich zweier Sequenzen herangezogen werden kann, ist der
Algorithmus von Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873–5877. Ein
solcher Algorithmus ist in dem NBLAST-Programm integriert, mit dem
Sequenzen identifiziert werden können,
die eine gewünschte
Identität
zu den Sequenzen der vorliegenden Erfindung besitzen. Um einen Lücken-Abgleich
(auch "gapped alignment"), wie oben beschrieben,
zu erhalten, kann das "Gapped
BLAST"-Programm verwendet
werden, wie in Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res, 25:3389–3402 beschrieben.
Das
in der erfindungsgemäß eingesetzten
CpG-Nukleinsäure
enthaltene mitogene CpG-Motiv,
bevorzugter ein Hexamer oder Octamer gemäß einer der Sequenzen SEQ ID
NO: 1 bis 34, tritt bevorzugt mindestens einmal in der CpG-Nukleinsäure auf.
Besonders bevorzugt tritt dabei am 5'- und am 3'-Ende oder nahe zum 5'- und 3'-Ende der verwendeten
CpG-Nukleinsäure,
z.B. in einem Bereich von 1 bis 3 oder 1 bis 6 Nukleotiden, kein
GCG-Trinukleotid auf. Die Hexamer- oder Octamersequenzen gemäß einer
der Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis 34 können in der erfindungsgemäß verwendeten
CpG-Nukleinsäure
mindestens einmal auftreten, d.h. es ist mindestens eine Hexamer- und/oder Octamersequenz
gemäß einer
der Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis 34 enthalten. Alternativ können die
Hexamer- oder Octamersequenzen gemäß einer der Sequenzen SEQ ID
NO: 1 bis 34 in der erfindungsgemäß verwendeten CpG-Nukleinsäure als
Multimer auftreten z.B. als Abfolge von 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis
15, 15 bis 20, 20 bis 30, 30 bis 40 40 bis 50 oder 50 bis 100 der
Sequenzen gemäß SEQ ID
NO: 1 bis 34, wobei die Hexamer- und
Octamersequenzen beliebig miteinander kombiniert werden können. Dabei
können
die einzelnen Hexamer- oder Octamersequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 bis 34 durch
1–30,
bevorzugt 1–20,
stärker
bevorzugt 1 bis 10 der zuvor genannten Nukleotide voneinander getrennt sein
oder alternativ ohne dazwischenliegende Nukleotide unmittelbar aufeinander
folgen.
Die
erfindungsgemäß verwendete
CpG-Nukleinsäure
kann weiterhin als „stabilisiertes
Oligonukleotid" vorliegen,
d.h. als Oligoribo- oder Oligodesoxyribonukleotid, welches resistent
gegenüber
in vivo- Abbau (z.B. durch eine Exo- oder Endonuklease) ist. Ein
solche Stabilisierung kann z.B. durch ein modifiziertes Phosphat-Rückgrat (backbone)
der erfindungsgemäß verwendeten
CpG-Nukleinsäure
erfolgen. In diesem Zusammenhang bevorzugt verwendete Nukleotide
enthalten ein Phosphorthioat-modifiziertes Phosphat-Rückgrat (backbone), wobei bevorzugt
mindestens einer der im Phosphat-Rückgrat enthaltenen Phosphat-Sauerstoffe durch
ein Schwefelatom ersetzt wird. Andere stabilisierte Oligonukleotide
schließen
z.B. mit ein: nicht-ionische Analoga, wie z.B. Alkyl- und Aryl-Phophonate, bei welchen
der geladene Phosphonat-Sauerstoff durch eine Alkyl- oder Aryl-Gruppe ersetzt wird,
oder Phosphodiester und Alkylphosphotriester, bei welchen der geladene Sauerstoff-Rest
alkyliert vorliegt.
Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
liegt die für
die Lipid-modifizierte Nukleinsäure verwendete
Nukleinsäure
als RNA- oder DNA-Homopolymer vor, stärker bevorzugt, als RNA-Homopolymer. Ein
solches DNA- oder RNA-Homopolymer umfasst typischerweise einzelsträngige oder
doppelsträngige,
bevorzugt einzelsträngige,
Polynukleotide wie bspw. Polyinosinsäure (I), Polyadeninsäure (A),
Polyuridinsäure (U),
Polyxanthinsäure
(X) oder Polyguaninsäure
(G). Die erfindungsgemäß verwendeten
RNA- oder DNA-Homopolymere
können
dabei als einzelsträngige
RNA- oder DNA-Homopolymere
auftreten. Solche RNA- oder DNA-Homopolymere sind im Stand der Technik
gut bekannt und umfassen typischerwise kein einheitliches Molekulargewicht.
Molekulargewichte bei doppelsträngigen
Komplexen von Copolymeren wurden beispielsweise in einem Bereich
von etwa 1 × 105 bis 1,5 × 106 bestimmt.
Eine
erste bevorzugte Alternative der RNA- oder DNA-Homopolymere umfasst
einzelsträngige
RNA- oder DNA-Homopolymere. Solche einzelsträngigen RNA- oder DNA-Homopolymere enthalten
typischerweise ein wie zuvor definiertes Ribo- oder Desoxyribonukleotid
in n-facher Wiederholung, wobei n bevorzugt der Länge der
zuvor beschriebenen erfindungsgemäß verwendeten Nukleinsäuren gleich
ist und in einem Bereich von 2 bis etwa 1000, vorzugsweise 5 bis
200, stärker
bevorzugt 6 bis etwa 200, und am stärksten bevorzugt 6 bis etwa
40 oder 6 bis etwa 31 liegt. Besonders bevorzugte einzelsträngige RNA-
oder DNA-Homopolymere umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein,
folgende Sequenzen: 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3' (SEQ ID NO: 35),
5'-UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUU-3' (SEQ ID NO: 36), 5'- GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3' (SEQ ID NO: 37),
5'-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3' (SEQ ID NO: 38)
und 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3' (SEQ ID NO: 39). Ebenfalls umfasst
sind solche Sequenzen, die eine Identität zu einer der vorhergehenden
Sequenzen von mindestens 60%, stärker
bevorzugt mindestens 70 oder 80%, und am stärksten bevorzugt mindestens
90 oder 95% aufweisen.
Chemisch
veränderte
Polynukleotide stellen eine zweite bevorzugte Alternative der DNA- oder RNA-Homopolymere
dar. Chemisch veränderte
Polynukleotide im Sinne der vorliegenden Erfindung können wie
zuvor beschriebene DNA- oder RNA-Polymere sein, die in ihrer Sequenz
mindestens ein Nukleotid, z.B. ein Analoges oder Derivat von Purinen
(Adenin (A), Guanin (G)) oder Pyrimidinen (Thymin (T), Cytosin (C), Uracil
(U)) aufweist, wie zuvor beschrieben. Stärker bevorzugt weisen solche
chemisch veränderten
Polynukleotide einen Anteil an Analogen und Derivaten von 1 bis
100%, z.B. 1–20,
10–30,
20–40,
30–50,
40–60,
50–70, 60–80, 70–90 oder
80–100%
auf. Solche chemisch veränderten
Polynukleotide können
ebenfalls nach im Stand der Technik bekannten Verfahren (siehe Verfahren
zur Herstellung von Komplexen von Homopolymeren) hergestellt werden.
Beispielhafte chemisch veränderte
Polynukleotide umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Verbindungen wie
bspw. Poly-N1-Methyladenylat, Poly-„6-Methyladenylat", Poly-N7-Methylinosat,
Poly-N7-Methylguanylat, Poly-5-Methyluridylat, Poly-5-Fluorouridylat,
Poly-5-Bromuridylat, Poly-5-Bromcytidylat und Poly-5-Iodcytidylat,
etc..
Gemäß einer
sechsten Alternative können
als RNA- oder DNA-Homopolymere auch Kombinationen der zuvor beschriebenen
RNA- oder DNA-Homopolymere eingesetzt werden. Solche Kombinationen
umfassen bevorzugt Nukleinsäuresequenzen,
die mindestens zwei der oben genannten Alternativen der hier beschriebenen
RNA- oder DNA-Homopolymere
oder Multimere davon enthalten, z.B. eine Abfolge von 2 bis 5, 5 bis
10, 10 bis 15, 15 bis 20, 20 bis 30, 30 bis 40, 40 bis 50 oder 50
bis 100 einer oder mehrerer der zuvor beschriebenen RNA- oder DNA-Homopolymere,
besonders bevorzugt gemäß einer
der SEQ ID NO: 35 bis 39. Dabei können die einzelnen RNA- oder
DNA-Homopolymere durch 1–30,
bevorzugt 1–20,
stärker
bevorzugt 1 bis 10 der zuvor hier beschriebenen Nukleotide voneinander
getrennt sein oder alternativ ohne dazwischenliegende Nukleotide
unmittelbar aufeinander folgen.
Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
können
für die
Lipid-modifizierte Nukleinsäure solche
Nukleinsäuren
eingesetzt werden, die keiner der oben benannte Nukleinsäureklassen
zuzuordnen sind und im Stand der Technik bereits als immunogen bekannt
sind oder die noch nicht im Stand der Technik bekannt sind, aber
immunogene Eigenschaften aufweisen. Bevorzugt liegen Nukleinsäuren gemäß dieser
Alternative als RNA oder DNA, noch bevorzugter als RNA vor. Ebenfalls
bevorzugt weisen diese Nukleinsäuren eine
wie oben beschriebene Länge
auf und enthalten Nukleotide, z.B. Ribo- oder Desoxyribonukleotide, wie zuvor
hier offenbart. Solche Nukleinsäuren
können
beispielsweise Antigene kodieren. Alternativ können solche Nukleinsäuren Epitope
(von Proteinen) kodieren. Bevorzugt weisen solche Nukleinsäuren dann
ein ATG als Startsignal auf, welches den Start der Translation der
kodierten RNA markiert. Gemäß einer
besonderen Ausführungsform
weist z.B. die Nukleinsäuresequenz
der Lipid-modifizierten Nukleinsäure
mindestens eine Sequenz gemäß einer
der SEQ ID NOs: 40–67
auf, wie nachfolgend aufgeführt:
5'-GCCCGUCUGUUGUGUGACUC-3' (SEQ ID NO: 40,
auch als RNA 40 bezeichnet), 5'-GGUAAGUGUAAGGUGUAAGG-3' (SEQ ID NO: 41,
auch als RNA CV1 bezeichnet), 5'-AAUGGAUAUGGAAUAUGGAA-3' (SEQ ID NO: 42,
auch als RNA CV2 bezeichnet), 5'-UCCAUGACGUUCCUGACGUU-3' (SEQ ID NO: 43),
5'-UCCAGGACUUCUCUCAGGUU-3' (SEQ ID NO: 44),
5'-UCCAUGACGUUCCUGAUGCU-3' (SEQ ID NO: 45),
5'-GCCCGUCUGUUGUGUGACUC-3' (SEQ ID NO: 46),
5'-GGUAAGUGUAAGGUGUAAGG-3' (SEQ ID NO: 47),
5'-AAUGGAUAUGGAAUAUGGAA-3' (SEQ ID NO: 48),
5'-CUCUGGAGGAAAAGAAAGUTT-3' (SEQ ID NO: 49),
5'-CAAUGCAACUCGCUUCUCGTT-3' (SEQ ID NO: 50),
5'-AGCUUAACCUGUCCUUCAA-3' (SEQ ID NO: 51), 5'-AAAAAAAACUGUCCUUCAA-3' (SEQ ID NO: 52),
5'-AAAAAAAAAUGUCCUUCAA-3' (SEQ ID NO: 53), 5'-AAAAAAAAAAGUCCUUCAA-3' (SEQ ID NO: 54),
5'-AAAAAAAAAAAUCCUUCAA-3' (SEQ ID NO: 55), 5'-AAAAAAAAAAAACCUUCAA-3' (SEQ ID NO: 56),
5'-AGCUUAACCUGUCCUUAAA-3' (SEQ ID NO: 57), 5'-AGCUUAACCUGUCCUAAAA-3' (SEQ ID NO: 58),
5'-AGCUUAACCUGUCCAAAAA-3' (SEQ ID NO: 59), 5'-AGCUUAACCUGAAAAAAAA-3' (SEQ ID NO: 60),
5'-UGUCCUUCAAUGUCCUUCAA-3' (SEQ ID NO: 61) 5'- AGCUUAACCUGUCCUUCAU-3' (SEQ ID NO: 62),
5'-AGCUUAACCUGUCCUUCUU-3' (SEQ ID NO: 63), 5'-AGCUUAACCUGUCCUUCAACUACA-3' (SEQ ID NO: 64),
5'-CAAAUUGAAGGACAGGUUAAGCU-3' (SEQ ID NO: 65),
5'-UUAACCUGUCCUUCAA-3' (SEQ ID NO: 66),
5'-AACCUGUCCUUCA-3' (SEQ ID NO: 67).
Ebenfalls umfasst sind solche Sequenzen, die eine Identität zu einer
der vorhergehenden Sequenzen von mindestens 60%, bevorzugter 70
oder 80%, und am stärksten
bevorzugt von 90 oder 95 aufweisen.
Für die Lipid-modifizierte
Nukleinsäure
können
gemäß einer
weiteren Ausführungsform
auch solche Nukleinsäuren
eingesetzt werden, die ein Multimer aus einer oder mehreren der
zuvor beschriebenen Nukleinsäuren
darstellen, z.B. eine Abfolge von 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 15,
15 bis 20, 20 bis 30, 30 bis 40, 40 bis 50 oder 50 bis 100 der oben
beschriebenen Nukleinsäuren,
besonders bevorzugt gemäß SEQ ID
NO: 1 bis 67, aufweisen. Die Reihenfolge der Nukleinsäuren kann
dabei beliebig gewählt
werden. Dabei können
die einzelnen Nukleinsäuren/Nukleinsäureeinheiten
des Multimers durch 1–30,
bevorzugt 1–20,
stärker
bevorzugt 1 bis 10 der zuvor beschriebenen Nukleotide voneinander
getrennt sein oder alternativ ohne dazwischenliegende Nukleotide
unmittelbar aufeinander folgen.
Die
für die
erfindungsgemäße Lipid-modifizierte
Nukleinsäure
verwendete Nukleinsäure,
kann neben der Lipid-Modifizierung zusätzlich mindestens eine chemische
Modifikation aufweisen. Dabei werden erfindungsgemäß vor allem
solche chemischen Modifikationen bevorzugt, die die Immunogeniät des erfindungsgemäßen Adjuvanz
steigern oder nicht mit der Lipid-Modifikation der erfindungsgemäß verwendeten
Nukleinsäure
interferieren. Beispielsweise können,
falls die Lipid-Modifikation am 3' Ende der erfindungsgemäß verwendeten
Nukleinsäure
vorliegt, chemische Modifikationen typischerweise am 5'-Ende und/oder innerhalb
der Sequenz der erfindungsgemäß verwendeten
Nukleinsäure
eingeführt
werden. Falls die Lipid-Modifikation am 5' Ende der erfindungsgemäß verwendeten
Nukleinsäure
vorliegt, können
typischerweise chemische Modifikationen am 3'-Ende und/oder innerhalb der Sequenz
der erfindungsgemäß verwendeten
Nukleinsäure
eingeführt werden.
Falls dagegen die Lipid-Modifikation am 3'-Ende und am 5'-Ende der erfindungsgemäß verwendeten Nukleinsäure vorliegt,
wird die chemische Modifikationen bevorzugt innerhalb der Sequenz
der erfindungsgemäß verwendeten
Nukleinsäure
eingeführt.
Vorzugsweise
ist die chemische Modifikation der erfindungsgemäßen Lipid-modifizierten Nukleinsäure derart
ausgestaltet, dass die hierfür
verwendete Nukleinsäure,
bevorzugt RNA, mindestens ein Analoges natürlich vorkommender Nukleotide
enthält.
Solche Analoga schließen
die zuvor beschriebenen Nukleotide und deren Analoga mit ein. Zusätzlich können alle
zuvor genannten Nukleotide und deren Analoga, durch z.B. Acetylierung,
Methylierung, Hydroxylierung, etc. chemisch weiter modifiziert und
erfindungsgemäß eingesetzt
werden.
Die
für die
Lipid-modifizierte Nukleinsäure
erfindungsgemäß verwendete
Nukleinsäure
bzw. die Lipid-modifizierte Nukleinsäure selbst, kann weiterhin
stabilisiert werden. Wie zuvor ausgeführt, kann für die Lipid-modifizierte Nukleinsäure grundsätzlich jede
Nukleinsäure
verwendet werden. Unter dem Gesichtspunkt der Sicherheit ist der
Einsatz von RNA für
eine solche Nukleinsäure
jedoch bevorzugt. Insbesondere bringt RNA nicht die Gefahr mit sich,
stabil in das Genom der transfizierten Zelle integriert zu werden.
Darüber
hinaus wird RNA wesentlich einfacher in vivo abgebaut. Ebenso wurden,
wohl aufgrund der gegenüber
DNA relativ kurzen Halbwertszeit von RNA im Blutkreislauf, bisher
keine anti-RNA-Antikörper
nachgewiesen. Im Vergleich zu DNA ist RNA in Lösung allerdings wesentlich
instabiler, wofür
im wesentlichen RNA-abbauende Enzyme, sog. RNAasen (Ribonukleasen),
verantwortlich sind. Selbst kleinste Verunreinigungen von Ribonukleasen
reichen aus, um RNA in Lösung
vollständig
abzubauen. Derartige RNase-Verunreinigungen
können
allgemein nur durch besondere Behandlungen, insbesondere mit Diethylpyrocarbonat
(DEPC), beseitigt werden. Der natürliche Abbau von mRNA im Cytoplasma
von Zellen ist sehr fein reguliert. Diesbezüglich sind mehrere Mechanismen
im Stand der Technik bekannt. So ist für eine RNA in vivo typischerweise
die endständige
Struktur von entscheidender Bedeutung. Am 5'-Ende natürlich auftretender RNAs befindet
sich üblicherweise
eine sogenannte "Cap-Struktur" (ein modifiziertes
Guanosin-Nukleotid) und am 3'-Ende
eine Abfolge von bis zu 200 Adenosin-Nukleotiden (der sog. Poly-A-Schwanz).
Daher
kann die Nukleinsäure
der Lipid-modifizierten Nukleinsäure,
falls diese als RNA vorliegt, durch Anfügung einer sog. "5'-Cap"-Struktur
gegenüber
dem Abbau durch RNasen stabilisiert werden. Besonders bevorzugt
wird in diesem Zusammenhang einer m7G(5')ppp(5'(A,G(5')ppp(5')A oder G(5')ppp(5')G als 5'-Cap"-Struktur.
Eine solche Modifikation wird jedoch nur dann eingeführt, wenn
am 5'-Ende der erfindungsgemäß verwendeten
Nukleinsäure
nicht bereits eine Modifikation, z.B. eine Lipid-Modifikation, eingeführt wurde.
Alternativ
kann das 3'-Ende
der Nukleinsäure
der Lipid-modifizierten Nukleinsäure,
falls diese als RNA vorliegt, durch eine Abfolge von mindestens
50 Adenosin-Nukleotiden, vorzugsweise mindestens 70 Adenosin-Nukleotiden,
mehr bevorzugt mindestens 100 Adenosin-Nukleotiden, besonders bevorzugt
mindestens 200 Adenosin-Nukleotiden modifiziert werden. Analog kann
auch hier eine solche Modifikation nur dann eingeführt werden,
wenn am 3'-Ende
der erfindungsgemäß verwendeten
Nukleinsäure
nicht bereits eine Modifikation, z.B. eine Lipid-Modifikation, eingeführt wurde.
Das
in der erfindungsgemäßen Lipid-modifizierten
Nukleinsäure
enthaltene Lipid ist typischerweise ein Lipid oder ein lipophiler
Rest, der bevorzugt an sich biologisch aktiv ist. Solche Lipide
umfassen bevorzugt Naturstoffe oder Verbindungen wie z.B. Vitamine,
z.B. α-Tocopherol
(Vitamin E), einschließlich
RRR-α-Tocopherol (früher D-α-Tocopherol),
L-α-Tocopherol, dem Racemat
D,L-α-Tocopherol,
Vitamin E-Succinat (VES), oder Vitamin A und dessen Derivate, z.B.
Retinsäure,
Retinol, Vitamin D und dessen Derivate, z.B. Vitamin D sowie dessen
Ergosterol-Vorstufen, Vitamin E und dessen Derivate, Vitamin K und
dessen Derivate, z.B. Vitamin K und verwandte Chinon bzw. Phytolverbindungen,
oder Steroide, wie Gallensäuren,
bspw. Cholinsäure,
Desoxycholinsäure,
Dehydrocholinsäure,
Cortison, Digoxygenin, Testosteron, Cholesterol oder Thiocholesterol. Weitere
Lipide oder lipophile Reste im Sinne der vorliegenden Erfindung
umfassen, ohne darauf beschränkt zu
sein, Polyalkylenglykole, (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res.,
1992, 20, 533), aliphatische Gruppen wie z.B. C1-C20-Alkane, C1-C20-Alkene, oder C1-C20-Alkanolverbindungen, etc. wie bspw. Dodecandiol,
Hexadecanol oder Undecyl-Reste (Saison-Behmoaras et al., EMBO J,
1991, 10, 111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327; Svinarchuk
et al., Biochimie, 1993, 75, 49), Phospholipide wie z.B. Phosphatidylglycerol,
Diacylphosphatidylglycerol, Phosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin,
Distearoylphosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin,
Di-hexadecyl-rac-glycerol, Sphingolipide, Cerebroside, Ganglioside,
oder Triethylammonium 1,2-Di-O-hexadecyl-rac-glycero-3-H-phosphonat (Manoharan
et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651; Shea et al., Nucl. Acids
Res., 1990, 18, 3777), Polyamine oder Polyalkylenglykole, wie z.B. Polyethylenglykol
(PEG) (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969), Hexaethylenglykol (HEG),
Palmitin oder Palmityl-Reste (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta,
1995, 1264, 229), Octadecylamine oder Hexylamino-carbonyl-oxycholesterol-Reste
(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923), sowie
Wachse, Terpene, alicyklische Kohlenwasserstoffe, gesättigte bzw.
einfach- oder mehrfach ungesättigte Fettsäurereste,
etc..
Die
Verknüpfung
zwischen dem Lipid und der erfindungsgemäß verwendeten Nukleinsäure kann grundsätzlich an
jedem Nukleotid, an der Base oder dem Zuckerrest jedes Nukleotids,
am 3'- und/oder
5'-Ende, und/oder
am Phosphatrückgrat
der erfindungsgemäß verwendeten
Nukleinsäure
stattfinden. Erfindungsgemäß wird eine
terminate Lipid-Modifizierung der erfindungsgemäß verwendeten Nukleinsäure an deren
3'- und/oder 5'-Ende besonders bevorzugt.
Eine terminate Modifizierung weist gegenüber sequenzinternen Modifikationen
mehrere Vorteile auf. Zum einen können sequenzinterne Modifikationen
das Hybridisierungsverhalten beeinflussen, was sich ggf. bei sterisch
anspruchsvollen Resten negativ auswirkt. Andererseits kann bei einer
synthetischen Herstellung einer erfindungsgemäßen Lipid-modifizierten Nukleinsäure, die
ausschließlich terminal
modifiziert ist, die Synthese der Nukleinsäuresequenz mit handelsüblichen,
in großer
Menge verfügbaren,
Monomeren durchgeführt
und im Stand der Technik bekannte Syntheseprotokolle verwendet werden.
Gemäß einer
ersten bevorzugten Ausführungsform
erfolgt die Verknüpfung
zwischen der erfindungsgemäß verwendeten
Nukleinsäure
und mindestens einem verwendeten Lipid über einen (kovalent mit der
Nukleinsäure
verknüpften) „Linker". Linker im Sinne
der vorliegenden Erfindung weisen typischerweise mindestens zwei
und optional 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10–20, 20–30 oder mehr reaktive Gruppen
auf, jeweils ausgewählt aus
z.B. einer Hydroxygruppe, einer Aminogruppe, einer Alkoxygruppe,
etc.. Bevorzugt dient eine reaktive Gruppe zur Bindung der oben
beschriebenen erfindungsgemäß verwendeten
Nukleinsäure,
z.B. eines RNA-Oligonukleotids. Diese reaktive Gruppe kann in einer geschützten Form
vorliegen, z.B. als DMT-Gruppe (Dimethoxytritylchlorid), als Fmoc-Gruppe, als MMT (Monomethoxytrityl-)-Gruppe,
als TFA (Trifluoressigsäure)-Gruppe,
etc. Weiterhin können
Schwefelgruppen durch Disulfide, z.B. Alkylthiole wie bspw. 3-Thiopropanol, oder
mit aktivierten Komponenten wie 2-Thiopyridin geschützt werden.
Eine oder mehrere weitere reaktive Gruppen dienen erfindungsgemäß zur kovalenten
Bindung eines oder mehrerer Lipide. Eine erfindungsgemäß verwendete
Nukleinsäure
kann daher gemäß der ersten
Ausführungsform über den
kovalent gebundenen Linker bevorzugt mindestens ein Lipid binden,
z.B. 1, 2, 3, 4, 5, 5–10,
10–20,
20–30
oder mehr Lipid(e), besonders bevorzugt mindestens 3–8 oder
mehr Lipide) pro Nukleinsäure.
Die gebundenen Lipide können
dabei getrennt voneinander an verschiedene Positionen der Nukleinsäure gebunden
werden, aber auch als Komplex an einer oder mehreren Positionen
der Nukleinsäure
vorliegen. Eine zusätzliche
reaktive Gruppe des Linkers kann zur direkten oder indirekten (spaltbaren)
Bindung an ein Trägermaterial,
z.B. eine Festphase, verwendet werden. Bevorzugte Linker gemäß der vorliegenden
Erfindung sind z.B. Glykol, Glycerin sowie Glycerinderivate, 2-Aminobutyl-1,3-propandiol
sowie 2-Aminobutyl-1,3-propandiol-Derivate/Gerüst, Pyrrolidin-Linker bzw.
Pyrrolidin enthaltende organische Moleküle (insbesondere für eine Modifikation
am 3'-Ende), etc..
Besonders bevorzugt werden erfindungsgemäß als Linker Glycerin oder
Glycerinderivate (C3-Anker) oder ein 2-Aminobutyl-1,3-propandiol-Derivat/Gerüst (C7-Anker) verwendet. Ein Glycerinderivat (C3-Anker)
als Linker wird insbesondere dann bevorzugt, wenn die Lipid-Modifikation über eine
Etherbindung eingeführt
werden kann. Soll die Lipid-Modifikation z.B. über eine Amid- oder eine Urethanbindung
eingeführt
werden, wird z.B. ein 2-Aminobutyl-1,3-propandiol-Gerüst (C7-Anker) bevorzugt. In diesem Zusammenhang
ist die zwischen dem Linker und der erfindungsgemäß verwendeten
Nukleinsäure
entstehende Bindung bevorzugt so beschaffen, dass sie mit den Bedingungen
und Chemikalien der Amiditchemie kompatibel ist, das heißt sie ist
bevorzugt weder säure- noch
basenlabil. Insbesondere werden solche Bindungen bevorzugt, die
synthetisch leicht zugänglich
sind, und nicht durch die ammoniakalische Abspaltprozedur eines
Nukleinsäuresyntheseverfahrens
hydrolysiert werden. Als Bindungen kommen grundsätzlich alle entsprechend geeigneten
Bindungen in Frage, bevorzugt Esterbindungen, Amidbindungen, Urethan-
sowie Etherbindungen. Neben der guten Zugänglichkeit der Edukte (wenige
Synthesestufen) ist dabei die Etherbindung aufgrund ihrer relativ
hohen biologischen Stabilität
gegenüber
enzymatischer Hydrolyse besonders bevorzugt.
Gemäß einer
zweiten bevorzugten Ausführungsform
erfolgt die Verknüpfung
(mindestens einer) der erfindungsgemäß verwendeten Nukleinsäure direkt
mit mindestens einem wie oben beschriebenen (bifunktionellen) Lipid,
d.h. ohne Verwendung eines wie oben beschriebenen Linkers. In diesem
Fall weist das erfindungsgemäß verwendete
(bifunktionelle) Lipid bevorzugt mindestens zwei reaktive Gruppen,
oder optional 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, oder mehr reaktive Gruppen,
auf, wobei eine erste reaktive Gruppe zur direkten oder indirekten
Bindung des Lipids an ein hier beschriebenes Trägermaterial und mindestens
eine weitere reaktive Gruppe zur Bindung einer erfindungsgemäß verwendeten
Nukleinsäure
dient. Gemäß der zweiten
Ausführungsform
kann eine erfindungsgemäß verwendete
Nukleinsäure
daher bevorzugt mindestens ein Lipid (direkt ohne Linker) binden,
z.B. 1, 2, 3, 4, 5, 5–10,
10–20,
20–30
oder mehr Lipid(e), besonders bevorzugt mindestens 3–8 oder
mehr Lipide) pro Nukleinsäure.
Die gebundenen Lipide können
dabei getrennt voneinander an verschiedene Positionen der Nukleinsäure gebunden
werden, aber auch als Komplex an einer oder mehreren Positionen
der Nukleinsäure
vorliegen. Alternativ kann gemäß der zweiten
Ausführungsform
an ein wie zuvor beschriebenes Lipid über dessen reaktive Gruppen
mindestens eine Nukleinsäure
gebunden werden, z.B. optional 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10–20, 20–30 oder
mehr Nukleinsäuren.
Besonders bevorzugt umfassen für
diese zweite Ausführungsform
verwendbare Lipide solche (bifunktionellen) Lipide, die (bevorzugt
an ihren Termini oder optional intramolekular) eine Kopplung ermöglichen,
wie z.B. Polyethylenglykol (PEG) sowie Derivate davon, Hexaethylenglykol
(HEG) sowie Derivate davon, Alkandiole, Aminoalkan, Thioalkanole,
etc.. Die Bindung zwischen einem (bifunktionellen) Lipid und einer
wie zuvor beschriebenen erfindungsgemäß verwendeten Nukleinsäure ist
bevorzugt so beschaffen, wie für
die erste bevorzugte Ausführungsform
beschrieben.
Gemäß einer
dritten Ausführungsform
kann die Verknüpfung
zwischen der erfindungsgemäß verwendeten
Nukleinsäure
und mindestens einem wie oben beschriebenen Lipid über beide
der zuvor genannten Ausführungsformen
gleichzeitig erfolgen. So kann z.B: die Nukleinsäure an einer Position der Nukleinsäure mit mindestens
einem Lipid über
einen Linker verknüpft
sein (analog 1. Ausführungsform)
und an einer anderen Position der Nukleinsäure direkt mit mindestens einem
Lipid ohne Verwendung eines Linkers (analog 2. Ausführungsform).
Beispielsweise kann am 3'-Ende
einer erfindungsgemäß verwendeten
Nukleinsäure
mindestens ein wie oben beschriebenes Lipid über einen Linker mit der Nukleinsäure kovalent
verknüpft
werden und am 5'-Ende
der Nukleinsäure
ein wie oben beschriebenen Lipid ohne einen Linker mit der Nukleinsäure kovalent
verknüpft
werden. Alternativ kann am 5'-Ende
einer erfindungsgemäß verwendeten
Nukleinsäure
mindestens ein wie oben beschriebenes Lipid über einen Linker mit der Nukleinsäure kovalent
verknüpft
werden und am 3'-Ende
der Nukleinsäure
ein wie oben beschriebenen Lipid ohne einen Linker mit der Nukleinsäure kovalent
verknüpft
werden. Ebenso können
kovalente Verknüpfungen
nicht nur an den Termini der Nukleinsäure sondern auch intramolekular
stattfinden, wie zuvor beschrieben, z.B. am 3'-Ende
und intramolekular, am 5'-Ende
und intramolekular, am 3'-
und 5'-Ende und
intramolekular, ausschließlich
intramolekular, etc..
Bevorzugt
kann können
die als erfindungsgemäßes Adjuvanz
verwendeten Lipidmodifizierte(n) Nukleinsäure(n) durch verschiedene Verfahren
erhalten werden. Die Lipid-Modifikation
kann dabei grundsätzlich – wie oben
definiert – an
jeder Position der verwendeten Nukleinsäuresequenz eingeführt werden,
z.B. an den 3'-
und/oder 5'-Enden
oder am Phosphatrückgrat
der verwendeten Nukleinsäuresequenz
und/oder an jeder Base bzw. am Zucker jedes Nukleotids der verwendeten
Nukleinsäuresequenz.
Erfindungsgemäß werden
terminale Lipid-Modifikationen an den 3'- und/oder 5'-Enden der verwendeten Nukleinsäuren bevorzugt.
Durch eine solche terminale chemische Modifizierung kann erfindungsgemäß eine große Zahl
verschieden derivatisierter Nukleinsäuren erhalten werden. Beispielhafte
und erfindungsgemäß mit umfasste
Varianten sind in 1 gezeigt. Das Verfahren zur
Herstellung solcher Lipid-modifizierten Nukleinsäuren wird bevorzugt in Abhängigkeit
der Position der Lipid-Modifizierung ausgewählt.
Findet
bspw. die Lipid-Modifikation am 3'-Ende der Nukleinsäure statt, so erfolgt die Lipid-Modifikation typischerweise
entweder vor oder nach Bereitstellung der erfindungsgemäß verwendeten
Nukleinsäure.
Die Bereitstellung der erfindungsgemäß verwendeten Nukleinsäure kann
dabei über
eine direkte Synthese der Nukleinsäure oder über Zugabe einer bereits fertig
synthetisierten (z.B. kommerziell erhältlichen) oder aus Proben isolierten
Nukleinsäure
durchgeführt
werden.
Gemäß einer
ersten Alternative wird die Nukleinsäure einer erfindungsgemäßen 3'-Lipidmodifizierten Nukleinsäure vor
der Einführung
des Lipids direkt synthetisiert, typischerweise über im Stand der Technik bekannte
Verfahren zur Synthese von Nukleinsäuren. Dazu wird bevorzugt ein
Startnukleosid, z.B. über
ein Kopplungsmolekül,
z.B. ein Succinylrest, an eine Festphase gebunden sowie die Nukleinsäure, z.B.
nach dem Verfahren der Amiditchemie, synthetisiert. Anschließend wird
ein wie zuvor beschriebener Linker bevorzugt über eine erste reaktive Gruppe
des Linkers kovalent an das 3'-Ende
der Nukleinsäure
gebunden. Über
eine zweite reaktive Gruppe des Linkers kann danach ein wie zuvor
beschriebenes Lipid kovalent mit dem Linker verknüpft werden.
Alternativ kann der Linker bereits vor der Bindung an das 3'-Ende der Nukleinsäure mit
dem Lipid kovalent verknüpft
sein. In diesem Fall ist nur die Bindung einer ersten reaktiven
Gruppe des Linkers mit dem 3'-Ende
der Nukleinsäure
erforderlich. Nach Synthese des Oligonukleotids bzw. nach Bindung
des Lipids kann die Nukleinsäure
von der Festphase abgespalten und entschützt werden. Falls die Synthese
in Lösung durchgeführt wurde,
kann nach der Synthese der Lipid-modifizierten Nukleinsäure ( und
ggf. vor der Abspaltung von dem Trägermaterial) ein Wasch- und
Aufreinigungsschritt zur Entfernung nicht umgesetzter Reaktanten
sowie von Lösungsmitteln
und unerwünschten
Nebenprodukten durchgeführt
werden.
Gemäß einer
weiteren Alternative wird die Nukleinsäure einer erfindungsgemäßen 3'-Lipidmodifizierten
Nukleinsäure
nach der Einführung
des Lipids an eine reaktive Gruppe des Linkers synthetisiert oder
als fertig synthetisierte oder aus Proben isolierte (kommerziell
erhältliche)
Nukleinsäure
an die reaktive Gruppe des Linkers gebunden (siehe z.B. 2).
Dazu kann z.B. eine erste reaktive Gruppe eines wie oben beschriebenen
Linkers mit einem wie zuvor beschriebenen Lipid umgesetzt werden.
Danach wird bevorzugt in einem zweiten Schritt eine zweite reaktive
Gruppe des Linkers mit einer säurestabilen
Schutzgruppe versehen, z.B. DMT, Fmoc, etc., um eine spätere Bindung
der Nukleinsäure
an diese reaktive Gruppe zu ermöglichen.
Danach kann über
eine dritte reaktive Gruppe des Linkers der Linker direkt oder indirekt
an eine Festphase gebunden werden. Eine indirekte Bindung ist z.B. über ein
(Kopplungs-)Molekül
möglich,
das sich sowohl kovalent an den Linker wie auch an die Festphase
binden lässt.
Ein solches (Kopplungs-)Molekül
ist z.B. ein Succinylrest, etc. wie hier im folgenden beschrieben.
Anschließend
erfolgt üblicherweise
die Entfernung der Schutzgruppe an der dritten reaktiven Gruppe
des Linkers sowie die Bindung oder Synthese einer Nukleinsäure an der
nun zugänglichen
reaktiven Gruppe. Abschließend
erfolgt typischerweise die Abspaltung der Lipid-modifizierten Nukleinsäure vom
Trägermaterial
(und ggf. die Entfernung der Schutzgruppen an der Nukleinsäure). Optional
kann jedoch auch an das 3'-Ende
der gekoppelten Nukleinsäure
ein weiteres Lipid gekoppelt werden, bevorzugt gemäß einem
der zuvor beschriebenen Schritte.
Entsprechend
einer Variante dieser vorgenannten Alternative kann ein wie oben
beschriebener Linker über
eine erste reaktive Gruppe direkt oder indirekt an eine Festphase
gebunden werden. An eine zweite reaktive Gruppe des Linkers wird
dann zunächst
eine säurestabile
Schutzgruppe gebunden. Nach Bindung der Schutzgruppe an die zweite
reaktive Gruppe kann an eine dritte reaktive Gruppe des Linkers
zunächst
ein wie oben beschriebenes Lipid gebunden werden. Anschließend erfolgt
ebenfalls bevorzugt die Entfernung der Schutzgruppe an der dritten
reaktiven Gruppe des Linkers, die Bindung oder Synthese einer Nukleinsäure an der
nun zugänglichen
reaktiven Gruppe sowie die Abspaltung der Lipid-modifizierten Nukleinsäure vom
Trägermaterial
(und ggf. die Entfernung der Schutzgruppen an der Nukleinsäure).
Gemäß einer
besonders bevorzugten Ausführungsform
der 3'-Lipid-Modifizierung
kann eine Lipid-modifizierte Nukleinsäure über einen Linker mit drei reaktiven
Gruppen (eine trifunktionelle Ankerverbindung) auf Basis eines Glycerin-Grundkörpers (C3-Anker) sowie mit einem monofunktionellen
Lipid, wie z.B. einem Palmitylrest, Cholesterol oder Tocopherol,
synthetisiert werden. Als Ausgangsstoff für die Synthese des Linkers kann
z.B. α,β-Isopropyliden-Glycerin
(ein Glycerin enthaltend eine Ketalschutzgruppe) eingesetzt werden,
das bevorzugt zunächst
mit Natriumhydrid in das Alkoholat überführt und mit Hexadecylbromid
und einem Lipid in einer Williamson-Synthese zum entsprechenden
Ether umgesetzt wird. Alternativ kann die Etherbindung in der ersten
Stufe mit einer anderen Methode geknüpft werden, z.B. durch Bildung
eines Tosylats des α,β-Isopropyliden-Glycerins, und der
Umsetzung des Tosylats mit der reaktiven Gruppe eines Lipids, z.B.
einem acidischen Proton, zum entsprechenden Ether. In einer zweiten
Stufe kann die Ketal-Schutzgruppe
mit einer Säure,
z.B. Essigsäure,
verdünnte
Salzsäure,
etc. entfernt und anschließend
die primäre
Hydroxygruppe des Diols selektiv durch Dimethoxytritylchlorid (DMT-Cl)
geschützt
werden. In der letzten Stufe erfolgt bevorzugt die Umsetzung des
aus dem vorangegangenen Schritt erhaltenen Produkts mit Bernsteinsäureanhydrid
zum Succinat mit DMAP als Katalysator. Ein solcher Linker ist z.B.
zur Bindung von Palmitylresten oder Tocopherol als Lipid besonders
geeignet (siehe z.B. 2).
Nach
einer anderen Alternative der 3'-Lipid-Modifizierung
kann eine Lipid-modifizierte Nukleinsäure über Verwendung eines (bifunktionellen)
Lipids, wie z.B. Polyethylenglykol (PEG) oder Hexaethylenglykol (HEG),
ohne einen wie oben beschriebenen Linker zu verwenden. Solche bifunktionelle
Lipide weisen typischerweise zwei wie oben beschriebene funktionelle
Gruppen auf, wobei bevorzugt ein Ende des bifunktionellen Lipids über ein
(Kopplungs-)Molekül,
z.B. einen basenlabilen Succinylanker, etc. wie hier beschrieben,
an das Trägermaterial
gebunden werden kann und auf das andere Ende des bifunktionellen
Lipids die Nukleinsäure
aufsynthetisiert werden kann (E. Bayer, M. Maier, K. Bleicher, H.-J.
Gaus Z. Naturforsch. 50b (1995) 671). Durch das Wegfallen der dritten
Funktionalisierung bzw. eines wie zuvor verwendeten Linkers vereinfacht sich
die Synthese einer solchen erfindungsgemäßen Lipid-modifizierten Nukleinsäure (siehe
z.B. 3). Zur Herstellung wird typischerweise das erfindungsgemäß verwendete
bifunktionelle Lipid, z.B. Polyethylenglykol, zunächst mit
einer Schutzgruppe, z.B. DMT, monosubstituiert. In einer zweiten
Stufe erfolgt üblicherweise
eine Veresterung des an einer reaktiven Gruppe geschützen Lipids
mit Bernsteinsäureanhydrid
unter Katalyse von DMAP zum Succinat. Danach kann in einer dritten
Stufe das bifunktionelle Lipid an ein Trägermaterial gekoppelt und entschützt werden,
worauf in einem vierten Schritt die Synthese der Nukleinsäure nach
einem wie zuvor beschriebenen Verfahren erfolgt. Optional erfolgt
danach die Entschützung
der Nukleinsäure
sowie die Abspaltung der Lipid-modifizierten Nukleinsäure vom
Trägermaterial.
Entsprechend
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
findet die Lipid-Modifikation am 5'-Ende der Nukleinsäure statt. Dabei erfolgt die
Lipid-Modifikation typischerweise entweder nach Bereitstellung oder nach
Synthese der erfindungsgemäß verwendeten
Nukleinsäure.
Die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kann
dabei – wie
oben definiert – über eine
direkte Synthese der Nukleinsäure
oder über
Zugabe einer bereits fertig synthetisierten oder aus Proben isolierten
bzw. kommerziell erhältlichen
Nukleinsäure durchgeführt werden.
Eine Synthese der Nukleinsäure
erfolgt dabei, bevorzugt analog zu dem zuvor Gesagten, nach im Stand
der Technik bekannten Verfahren zur Nukleinsäuresynthese, noch stärker bevorzugt
nach dem Phosphoramiditverfahren (siehe z.B. 4).
Gemäß einer
besonders bevorzugten Ausführungsform
erfolgt die Lipid-Modifikation am 5'-Ende
der erfindungsgemäß verwendeten
Nukleinsäure
durch besonders modifizierte Phosphoramidite im Anschluß an ein
Phosphoramiditverfahren zur Synthese der Nukleinsäure. Solche
relativ einfach synthetisch zugänglichen Amidite
werden üblicherweise
als letztes Monomer auf eine kommerziell erhältliche oder auf eine fertig
synthetisierte Nukleinsäure
aufgekuppelt. Diese Reaktionen zeichnen sich durch eine relativ
schnelle Reaktionskinetik und sehr hohe Kupplungsausbeuten aus.
Die Synthese der modifizierten Amidite erfolgt bevorzugt durch die
Umsetzung eines Phosphoramidits, z.B. β-Cyanoethyl-monochlorophosphoramidit
(Phosphorigsäure-mono-(2-cyanoethylester)-diisopropyl-amid-chlorid),
mit einem in einem geeigneten Lösungsmittel,
z.B. in absolutem Dichlormethan, gelösten Alkohol eines wie oben
definierten Lipids, z.B. einem Lipidalkohol von Tocopherol, Cholesterol,
Hexadecanol, DMT-PEG, etc.. Ebenfalls bevorzugt wird der Reaktionslösung als
Säurefänger DIPEA
zugesetzt.
Diese
für die
Synthese der erfindungsgemäßen 5'-Lipid-modifizierten
Nukleinsäuren
verwendeten Phosphoramidite sind gegenüber Hydrolyse relativ beständig und
können
(vor der Synthese) mit Kieselgel chromatographisch gereinigt werden.
Dafür wird
dem Eluenten typischerweise eine kleine Menge einer schwachen Base
wie z.B. Triethylamin zugesetzt, um eine Zersetzung des Amidits
zu vermeiden. Wichtig ist dabei, dass diese Base wieder vollständig aus
dem Produkt entfernt wird, um schlechte Kupplungsausbeuten zu vermeiden.
Die kann z.B. durch einfaches Trocknen im Vakuum erfolgen, bevorzugt
jedoch durch Reinigung der Phosphoramidite durch ihre Fällung aus
tert-Butylmetylether mit Pentan. Falls die verwendeten lipidmodifizierten
Amidite eine sehr hohe Viskosität
aufweisen, z.B. als zähes Öl vorliegen,
kann auch eine (zügige)
Säulenchromatographie
erfolgen, welche es ermöglicht
auf Triethylamin als Base zu verzichten. Eine solche Aufreinigung
wird typischerweise jedoch nicht bei PEG-modifizierten Amiditen
durchgeführt,
da diese die säurelabile DMT-Schutzgruppe
enthalten.
Für die Kupplungsreaktion
der Lipid-modifizierten Phosphoramidite auf das 5'-Ende der erfindungsgemäß verwendeten
Nukleinsäure
werden bevorzugt solche Lösungsmittel eingesetzt,
in denen die verwendeten Amidite in ausreichender Weise löslich sind.
So kann z.B. bedingt durch die hohe Lipophilie der erfindungsgemäß verwendeten
Amidite deren Löslichkeit
in Acetonitril begrenzt sein. Neben Acetonitril als typischerweise verwendetem
Lösungsmittel
wird daher für
die Kupplungsreaktionen bevorzugt eine Lösung von chlorierten Kohlenwasserstoffen
eingesetzt, z.B. eine 0,1 M Lösung
in (absolutem) Dichlormethan. Die Verwendung von Dichlormethan erfordert
jedoch einige Änderungen
im Standardprotokoll des Synthesezyklus. So werden z.B., um das
Ausfallen des Amidits in den Leitungen des Syntheseautomaten und
auf dem Trägermaterial
zu vermeiden, alle Ventile und Leitungen, die mit dem Amidit in
Kontakt geraten, vor und nach dem eigentlichem Kupplungsschritt
mit (absolutem) Dichlormethan gespült und trockengeblasen.
Bei
Verwendung von Lipid-modifizierten Amiditen ergeben sich typischerweise
hohe Kupplungsausbeuten, die mit der Kupplungsausbeute von üblicherweise
im Stand der Technik verwendeten Amiditen vergleichbar sind. Dabei
verläuft
die Kinetik der Reaktion von Lipid-modifizierten Amiditen allgemein
langsamer. Aus diesem Grund werden gegenüber Standardprotokollen die
Kupplungszeiten bei Verwendung von Lipidmodifizierten Amiditen bevorzugt
(deutlich) verlängert.
Solche Kupplungszeiten können
durch einen Fachmann einfach bestimmt werden. Da auf einen Capping-Schritt
nach der Kupplung verzichtet werden kann, ist es ebenfalls möglich, bei
Bedarf einen weiteren Synthesezyklus mit demselben Lipid-modifizierten
Amiditen durchzuführen,
um die Gesamtausbeute der Reaktion zu erhöhen. In diesem Fall wird üblicherweise,
z.B. bei DMT-modifizierten Lipiden wie DMT-PEG, der Detritylierungsschritt
nicht ausgeführt.
Bei
der Synthese von erfindungsgemäßen 5'-Lipid-modifizierten
Nukleinsäuren
kann der Phosphittriester, über
den das Lipid an die Nukleinsäure
gebunden wird, durch ein Sulfurierungsmittel oxidiert werden. Dazu
wird bevorzugt ein solches Sulfurierungsmittel verwendet, das die
Oxidation des Phosphotriesters möglichst
vollständig
erreicht. Andernfalls kann ggf. die Sulfurierungsreaktion, z.B.
aus sterischen Gründen, so
unvollständig
ablaufen, dass nach der ammoniakalischen Abspaltung und Entschützung der
MON nur wenig oder kein Produkt erhalten wird. Dieses Phänomen ist
abhängig
von der Art der Modifizierung, dem eingesetzten Sulfurierungsmittel
und den Sulfurierungsbedingungen. Bevorzugt wird daher die Oxidation
mit Iod durchgeführt.
Hierdurch wird zwar eine Phosphodiesterbindung eingeführt, durch
die Nachbarschaft des Lipidrestes ist jedoch nicht zu erwarten,
dass diese Bindung als Substrat von Nukleasen erkannt wird.
Die
in der erfindungsgemäß verwendeten
Lipid-modifizierten Nukleinsäure
enthaltenen Linker oder (bifunktionellen) Lipide oder ggf. die verwendeten
Nukleinsäuren
können,
wie zuvor beschrieben, direkt oder indirekt an ein Trägermaterial
gekoppelt werden. Eine direkte Kopplung erfolgt dabei bevorzugt
unmittelbar mit dem Trägermaterial,
während
eine indirekte Kopplung an das Trägermaterial typischerweise über ein
weiteres (Kopplungs-)Molekül
erfolgt. Die durch die Kopplung an ein Trägermaterial entstehende Bindung
weist bevorzugt eine (spaltbare) kovalente Bindung mit dem Linker
oder bifunktionellen Lipid und/oder eine (spaltbare) kovalente Bindung
mit der Festphase auf. Als (Kopplungs-)Molekül geeignete Verbindungen sind
z.B. Dicarbonsäuren,
bspw. Succinylreste (=Succinylanker), Oxalylreste (=Oxalylanker),
etc.. Linker, (bifunktionelle) Lipide oder ggf. verwendete Nukleinsäuren, die
wie z.B. Aminoalkylreste (bspw. Aminopropyl- oder Aminohexanylreste)
eine freie Aminofunktion tragen, können über einen Phtalimid-Linker
an das Trägermaterial
gebunden werden. Thiolhaltige Linker, (bifunktionelle) Lipide oder
ggf. verwendete Nukleinsäuren
können
als Disulfid an das Trägermaterial
gebunden werden. Als Trägermaterial
sind im Zusammenhang mit dieser Erfindung insbesondere Festphasen
wie CPG, Tentagel®, aminofunktionalisiertes
PS-PEG (Tentagel® S NH2)
etc., bevorzugt Tentagel® oder aminofunktionalisiertes
PS-PEG (Tentagel® S NH2),
geeignet. Gemäß einer
besonderen Ausführungsform
können
zur Kopplung an ein Trägermaterial
z.B. die Succinate der beschriebenen erfindungsgemäß verwendeten
Linker oder bifunktionellen Lipide bevorzugt mit TBTU/NMM (1H-Benzotriazol-1-yl-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluoroborat/N-Methylmorpholin)
als Kupplungsreagenz auf aminofunktionalisiertem PS-PEG (Tentagel® S
NH2) gekoppelt werden. Typischerweise werden
bei PS-PEG Trägermaterialien
im üblicherweise
verwendeten 1 μmol-Maßstab die
besten Resultate mit Beladungen zwischen 50 und 100 μmol/g erreicht
(E. Bayer, K. Bleicher, M. Maier Z. Naturforsch. 50b (1995) 1096).
Sollen erfindungsgemäß jedoch
Nukleotide im größeren Maßstab (large
scale) synthetisiert werden, ist die Beladung der Trägermaterialien
bevorzugt möglichst
hoch (≥ 100 μmol). Erfindungsgemäß führt ein
solches Verfahren ebenfalls zu guten Kupplungsausbeuten (M. Gerster,
M. Maier, N. Clausen, J. Schewitz, E. Bayer Z. Naturforsch. 52b
(1997) 110). So können
z.B. Trägermaterialien
wie z.B. Harze mit bis zu 138 μmol/g
Beladung oder ggf. mehr mit guten Syntheseausbeuten verwendet werden.
Da die Kupplungsausbeuten mit den zuvor beschriebenen Linkern oder bifunktionellen
Lipiden annähernd
100% betragen, kann über
die Stöchiometrie
dieser Verbindungen relativ genau die Beladung des Trägermaterials
eingestellt werden. Die Kontrolle der Beladung erfolgt bevorzugt über die
spektroskopische Quantifizierung der abgespaltenen DMT-Schutzgruppe
(siehe experimenteller Teil). Die auf dem Trägermaterial noch vorhandenen
restlichen Aminofunktionen können
mit Acetanhydrid gecappt werden. Dieses Capping wird normalerweise
im Anschluss an die Belegung des Trägermaterials durchgeführt, kann
aber auch direkt bei der Nukleinsäure-Synthese, z.B. am DNA-Synthesizer, ausgeführt werden.
Für die Synthese
von Lipidmodifizierten Nukleinsäuren
auf den derivatisierten PS-PEG-Trägermaterialien werden bevorzugt
speziell für
Tentagel® entwickelte
Synthesezyklen verwendet, die die charakteristischen Eigenschaften des
Materials berücksichtigen
(E. Bayer, M. Maier, K. Bleicher, H.-J. Gaus Z. Naturforsch. 50b
(1995) 671, E. Bayer, K. Bleicher, M. Maier Z. Naturforsch. 50b
(1995) 1096.). Bevorzugte Änderungen
im Vergleich zum Standardprotokoll umfassen.
- • Verlängerte Reaktionszeiten
bei den Kupplungs-, Capping- und Oxidationsschritten;
- • Erhöhung der
Zahl der Detritylierungsschritte; • Verlängerte Waschschritte nach jedem
Schritt;
- • Verwendung
einer ascorbinsäurehaltigen
Waschlösung
(0,1 M in Dioxan/Wasser = 9:1) nach dem üblicherweise notwendigen Oxidationsschritt
(zur Oxidation des Phosphittriesters) während des Amiditverfahrens,
um Spuren von Iod zu entfernen.
Dabei
ist zu beachten, dass die Art der Modifizierung einen Einfluss auf
die einzelnen Schritte des Synthesezyklus haben kann. Z.B. wird
bei PEG1500-derivatisierten Trägermaterialien
eine stark verlangsamte Reaktionskinetik beobachtet, was eine nochmalige
Erweiterung der Detritylierungsschritte und eine zusätzliche Verlängerung
der Kupplungsdauer notwendig macht. Solche Änderungen und Anpassungen liegen
im Bereich des normalen Könnens
eines Fachmanns und können
im Rahmen der vorliegenden Offenbarung jederzeit vorgenommen werden.
Mit diesen derart veränderten
Reaktionszyklen können
sowohl Lipid-modifizierte Phosphordiester als auch Phosphorothioate
synthetisiert werden. Die Kupplungsausbeuten von Amiditen auf erfindungsgemäß verwendeten
Linkern oder bifunktionellen Lipiden werden nicht durch die Lipidreste
beeinträchtigt,
sondern entsprechen üblichen
Werten (97–99%).
Die Möglichkeit
der 5'-Derivatisierung
sowie die Einführung
weiterer Modifizierungen z.B. an Base, Zucker oder Phosphatrückgrat bleibt
bei Verwendung solcher 3'-Modifizierungen
bestehen.
Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
kann das erfindungsgemäße immunstimulierende
Adjuvanz mit weiteren, im Stand der Technik bekannten Adjuvanzien
kombiniert werden.
Die
vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen
enthaltend ein wie oben beschriebenes immunstimulierendes Adjuvanz,
mindestens einen Wirkstoff und optional einen pharmazeutisch geeigneten
Träger
und/oder weitere Hilfs- und Zusatzstoffe und/oder Adjuvanzien.
Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung
umfassen typischerweise eine sichere und effektive Menge des erfindungsgemäßen immunstimulierenden
Adjuvanz. Wie hier verwendet bedeutet "sichere und effektive Menge" eine solche Menge
einer Verbindung, die ausreichend ist, um signifikant eine positive
Modifikation eines zu behandelnden Zustands zu induzieren, z.B.
einer Tumor- oder Infektionserkrankung.
Gleichzeiztig ist eine "sichere
und effektive Menge" jedoch
gering genug, um schwerwiegende Nebeneffekte zu vermeiden, also
ein vernünftiges
Verhältnis
von Vorteil und Risiko zu ermöglichen. Die
Festlegung dieser Grenzen liegen typischerweise innerhalb des Bereichs
vernünftiger
medizinischer Urteilskraft. In Bezug auf das erfindungsgemäße immunstimulierende
Adjuvanz bedeutet der Begriff „sichere
und effektive Menge" bevorzugt
eine solche Menge, die geeignet ist, das Immunsystem in einer solchen
Weise zu stimulieren, dass keine überschießenden bzw. schädlichen
Immunreaktionen erzielt werden, jedoch bevorzugt auch keine solchen
Immunreaktionen unterhalb eines messbaren Niveaus. Eine „sichere
und effektive Menge" eines
erfindungsgemäßen Adjuvanz
bzw. eines erfindungsgemäßen Adjuvanz
wird im Zusammenhang mit dem besonderen zu behandelnden Zustand
variieren, sowie dem Alter und dem physischen Zustand des zu behandelnden
Patienten, der Schwere des Zustandes, der Dauer der Behandlung,
der Natur der begleitenden Therapie, des verwendeten besonderen
pharmazeutisch geeigneten Trägers
und ähnlichen
Faktoren innerhalb des Wissens und der Erfahrung des begleitenden
Arztes. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzungen können
erfindungsgemäß für humane
und wie auch für
veterinärmedizinische
Zwecke eingesetzt werden.
Zusätzlich zu
dem erfindungsgemäßen immunstimulierenden
Adjuvanz enthält
die erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzung bevorzugt mindestens einen Wirkstoff. Ein Wirkstoff
ist in diesem Zusammenhang eine Verbindung, die einen therapeutischen
Effekt gegen eine bestimmte Indikation aufweist, bevorzugt Krebserkrankungen
oder Infektionserkrankungen. Solche Verbindungen umfassen, ohne
darauf beschränkt
zu sein, Peptide, Proteine, Nukleinsäuren, (therapeutisch wirksame)
niedermolekulare organische oder anorganische Verbindungen (Molekulargewicht
kleiner als 5.000, bevorzugt kleiner als 1000), Zucker, Antigene,
oder Antikörper,
bereits im Stand der Technik bekannte Therapeutika, etc.. Gemäß einer
besonderen Ausführungsform
kann das zuvor beschriebene erfindungsgemäße immunstimulierende Adjuvanz
selbst ein Wirkstoff sein. Dies ist insbesondere dann der Fall,
wenn das Lipid der Lipid-modifizierten Nukleinsäure ein therapeutisch aktives
Molekül
darstellt, wie z.B. ein wie oben beschriebenes Vitamin, oder Steroid,
bspw. α-Tocopherol
(Vitamin E), D-α-Tocopherol,
L-α-Tocopherol,
D,L-α-Tocopherol,
Vitamin E-Succinat (VES), Vitamin A und dessen Derivate, Vitamin
D und dessen Derivate, Vitamin K und dessen Derivate, etc..
Gemäß einer
ersten Ausführungsform
liegt der in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzung enthaltene Wirkstoff als Antigen bzw. als Immunogen
vor. Unter einem „Antigen" wie auch einem „Immunogen" ist dabei jede Struktur
zu verstehen, welche die Bildung von Antikörpern und/oder die Aktivierung einer
zellulären
Immunantwort hervorrufen kann. Erfindungsgemäß werden daher die Begriffe „Antigen" und „Immunogen" synonym verwendet.
Beispiele von Antigenen sind Peptide, Polypeptide, also auch Proteine, Zellen,
Zellextrakte, Polysaccharide, Polysaccharidkonjugate, Lipide, Glykolipide
und Kohlenhydrate. Als Antigene kommen bspw. Tumorantigene, virale,
bakterielle, Pilz- und protozoologische Antigene in Betracht. Bevorzugt
sind dabei Oberflächenantigene
von Tumorzellen und Oberflächenantigene,
insbesondere sekretierte Formen, viraler, bakterieller, Pilz- oder
protozoologischer Pathogene. Selbstverständlich kann das Antigen z.B. in
einer erfindungsgemäßen Vakzine,
auch in Form eines an einen geeigneten Träger gekoppelten Haptens vorliegen.
Der
in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzung enthaltene Wirkstoff kann gemäß einer zweiten Ausführungsform
als Antikörper
vorliegen. In diesem Zusammenhang kann jeder therapeutisch geeignete
Antikörper
eingesetzt werden. Besonders bevorzugt ist erfindungsgemäß ein Antikörper, der gegen
Antigene, Proteine oder Nukleinsäuren
gerichtet ist, die eine wesentliche Rolle bei Krebserkrankungen oder
Infektionserkrankungen aufweisen, z.B. Zelloberflächenproteine,
Tumorsupressorgene oder deren Inhibitoren, Wachstums- und Elongationsfaktoren,
Apoptoserelevante Proteine, Tumorantigene, oder Antigene, wie zuvor
beschrieben, etc..
Gemäß einer
dritten Ausführungsform
liegt der in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzung enthaltene Wirkstoff als Nukleinsäure vor.
Eine solche Nukleinsäure
kann einzelsträngig
oder doppelsträngig
sein, und als Homo- oder- Heteroduplex
sowie linear oder zirkulär
vorliegen. Eine als Wirkstoff in der pharmazeutischen Zusammensetzung
enthaltene Nukleinsäure
ist dabei in ihrer Länge
nicht beschränkt und
kann jede natürlich
vorkommende Nukleinsäuresequenz
oder deren Komplement oder ein Fragment davon umfassen. Ebenfalls
kann die in diesem Zusammenhang eingesetzte Nukleinsäure teilweise
oder vollständig
synthetischer Natur sein. Beispielsweise kann die Nukleinsäure eine
solche Nukleinsäure
umfassen, die ein (therapeutisch relevantes) Protein kodiert, und/oder
die in der Lage ist, eine Immunreaktion hervorzurufen, z.B. ein
Antigen oder eine ein Antigen kodierende Nukleinsäure. Ein
Antigen ist dabei bevorzugt ein Antigen wie zuvor beschrieben.
Gemäß einer
ersten bevorzugten Alternative der vorgenannten Ausführungsform
liegt die als Wirkstoff in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung
enthaltene Nukleinsäure
als mRNA vor. Eine solche mRNA kann zur erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzung in ihrer nackten Form zugegeben werden oder in einer
stabilisierten Form, die den Abbau der Nukleinsäure in vivo, z.B. durch Exo- und/oder
Endonukleasen verringert oder gar verhindert.
Beispielsweise
kann die in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzung als Wirkstoff enthaltene mRNA mit einem wie oben
definierten 5'-Cap
und/oder einem Poly-A-Schwanz
am 3'-Ende von mindestens
50 Nukleotiden, vorzugsweise mindestens 70 Nukleotiden, mehr bevorzugt
mindestens 100 Nukleotiden, besonders bevorzugt mindestens 200 Nukleotiden
stabilisiert werden. Wie bereits erwähnt, ist die endständige Struktur
ist dabei in vivo von entscheidender Bedeutung. Über diese Strukturen wird die
RNA als mRNA erkannt und der Abbau reguliert. Darüber hinaus
gibt es jedoch weitere Prozesse, die RNA stabilisieren bzw. destabilisieren.
Viele diese Prozesse sind noch unbekannt, oftmals scheint jedoch
eine Wechselwirkung zwischen der RNA und Proteinen dafür maßgeblich
zu sein. Bspw. wurde kürzlich
ein „mRNA-Surveillance-System" beschrieben (Hellerin
und Parker, Ann. Rev. Genet. 1999, 33: 229 bis 260), bei dem durch
bestimmte Feedback-Protein-Wechselwirkungen im Cytosol unvollständige oder
Nonsense-mRNA erkannt
und dem Abbau zugänglich
gemacht wird, wobei ein Hauptteil dieser Prozesse durch Exonucleasen
vollzogen wird.
Ebenso
kann die Stabilisierung der in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung als
Wirkstoff enthaltenen mRNA dadurch erfolgen, dass die mRNA mit einer
kationischen Verbindung, insbesondere einer polykationischen Verbindung,
bspw. einem (poly)kationischen Peptid oder Protein, assoziiert bzw.
komplexiert oder daran gebunden ist. Insbesondere ist dabei die
Verwendung von Protamin, Nukleolin, Spermin oder Spermidin als polykationischem,
Nukleinsäure-bindenden
Protein besonders wirksam. Des weiteren ist die Verwendung anderer
kationischer Peptide oder Proteine, wie Poly-L-Lysin oder Histonen, ebenfalls möglich. Diese
Vorgehensweise zur Stabilisierung von mRNA ist in EP-A-1083232 beschrieben,
deren diesbezüglicher
Offenbarungsgehalt in die vorliegende Erfindung vollumfänglich eingeschlossen
ist. Weitere bevorzugte kationische Substanzen, die zur Stabilisierung
der als Wirkstoff enthaltnen mRNA verwendet werden können, schließen kationische
Polysaccharide, bspw. Chitosan, Polybren, Polyethylenimin (PEI)
oder Poly-L-Lysin (PLL), etc., ein. Die Assoziierung oder Komplexierung
der mRNA mit kationischen Verbindungen erhöht bevorzugt neben der bereits
vorteilhaften Wirkung der erfindungsgemäßen Lipid-modifizierten Nukleinsäure als
Adjuvanz bei der Verbesserung der Zellpermeabilität den Transfer
der als Wirkstoff enthaltenen mRNA in die zu behandelnden Zellen
bzw. den zu behandelnden Organismus.
Eine
weitere Möglichkeit
zur Stablisierung von mRNA, die als Wirkstoff in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzung vorliegen kann, ist die gezielte Veränderung
der Sequenz der mRNA durch Entfernen oder Veränderung sogenannter destabilisierender
Sequenzelemente (DSE). An diese destabilisierende Sequenzelemente
(DSE), die insbesondere bei eukaryotischer mRNA auftreten, können Signalproteine
binden und den enzymatischen Abbau der mRNA in vivo regulieren.
Daher werden zur weiteren Stabilisierung der als Wirkstoff enthaltenen
mRNA bevorzugt ein oder mehrere Veränderungen gegenüber dem entsprechenden
Bereich der Wildtyp-mRNA vorgenommen, so dass keine destabilisierenden
Sequenzelemente enthalten sind. Selbstverständlich ist es erfindungsgemäß ebenfalls
bevorzugt, gegebenenfalls in den nicht-translatierten Bereichen
(3'- und/oder 5'-UTR) vorhandene
DSE aus der mRNA zu eliminieren. Beispiele der vorstehenden DSE
sind AU-reiche Sequenzen ("AURES"), die in 3'-UTR-Abschnitten
zahlreicher instabiler mRNA vorkommen (Caput et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 1986, 83: 1670 bis 1674). Die als Wirkstoff eingesetzte
mRNA ist daher vorzugsweise derart gegenüber der Wildtyp-mRNA verändert, dass
sie keine derartigen destabilisierenden Sequenzen aufweist. Dies
gilt auch für
solche Sequenzmotive, die von möglichen
Endonukleasen erkannt werden, bspw. die Sequenz GAACAAG, die im
3' UTR-Segment des
für den
Transferin-Rezeptor kodierenden Gens enthalten ist (Binder et al.,
EMBO J. 1994, 13: 1969 bis 1980). Vorzugsweise werden auch diese
Sequenzmotive aus der erfindungsgemäßen Lipid-modifizierten Nukleinsäure eliminiert.
Die
als Wirkstoff in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung
gegebenenfalls vorliegende mRNA kann weiterhin z.B. für eine gegebenenfalls
gewünschte
effiziente Translation, so verändert werden,
dass eine wirksame Bindung der Ribosomen an die Ribosomen-Bindungsstelle
(Kozak-Sequenz: GCCGCCACCAUGG, das AUG bildet das Startcodon) erfolgt.
Diesbezüglich
ist festgestellt worden, dass ein erhöhter A/U-Gehalt um diese Stelle
herum eine effizientere Ribosomen-Bindung an die mRNA ermöglicht.
Des
weiteren ist es möglich,
in die als Wirkstoff verwendete mRNA eine oder mehrere sog. IRES
(engl. "internal
ribosomal entry side")
einzufügen.
Eine IRES kann so als alleinige Ribosomen-Bindungsstelle fungieren,
sie kann jedoch auch zur Bereitstellung einer mRNA dienen, die mehrere
Peptide bzw. Polypeptide kodiert, die unabhängig voneinander durch die
Ribosomen translatiert werden sollen ("multicistronische mRNA"). Beispiele erfindungsgemäß verwendbarer
IRES-Sequenzen sind diejenigen aus Picornaviren (z.B. FMDV), Pestviren
(CFFV), Polioviren (PV), Enzephalo-Myocarditis-Viren (ECMV), Maul-und-Klauenseuche-Viren (FMDV),
Hepatitis-C-Viren (HCV), Klassisches-Schweinefieber-Viren (CSFV),
Murines-Leukoma-Virus (MLV), Simean-Immundefizienz-Viren (SIV) oder
Cricket-Paralysis-Viren
(CrPV).
Die
als Wirkstoff in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung
gegebenenfalls verwendete mRNA kann ebenfalls in ihren 5'- und/oder 3'-nicht translatierten
Bereichen Stabilisierungssequenzen aufweisen, die befähigt sind,
die Halbwertszeit der mRNA im Cytosol zu erhöhen. Diese Stabilisierungssequenzen
können
eine 100%ige Sequenzhomologie zu natürlich vorkommenden Sequenzen
aufweisen, die in Viren, Bakterien und Eukaryoten auftreten, sie
können
aber auch teilweise oder vollständig
synthetischer Natur sein. Als Beispiel für stabilisierende Sequenzen,
die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, können die
nicht-translatierten Sequenzen (UTR) des β-Globingens, bspw. von Homo sapiens oder
Xenopus laevis, genannt werden. Ein anderes Beispiel einer Stabilisierungssequenz
weist die allgemeine Formel (C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC auf, die im 3'UTR der sehr stabilen mRNA enthalten
ist, die für α-Globin, α-(I)-Collagen,
15-Lipoxygenase oder für
Tyrosin-Hydroxylase kodiert (vgl. Holcik et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 1997, 94: 2410 bis 2414). Selbstverständlich können derartige Stabilisierungssequenzen
einzeln oder in Kombination miteinander als auch in Kombination
mit anderen, einem Fachmann bekannten, Stabilisierungssequenzen
verwendet werden.
Zur
weiteren Erhöhung
einer gegebenenfalls gewünschten
Translation kann die als Wirkstoff verwendete mRNA gegenüber einer
entsprechenden Wildtyp-mRNA folgende Modifikationen aufweisen, die
entweder alternativ oder in Kombination vorliegen können. Zum
einen kann der G/C-Gehalt des für
ein Peptid oder Polypeptid kodierenden Bereichs der modifizierten
mRNA größer sein
als der G/C-Gehalt des kodierenden Bereichs der für das Peptid
oder Polypeptid kodierenden Wildtyp-mRNA, wobei die kodierte Aminosäuresequenz gegenüber dem
Wildtyp unverändert
ist. Diese Modifikation beruht auf der Tatsache, dass für eine effiziente Translation
einer mRNA die Sequenzabfolge des zu translatierenden Bereichs der
mRNA wesentlich ist. Dabei spielt die Zusammensetzung und die Abfolge
der verschiedenen Nukleotide eine große Rolle. Insbesondere sind
Sequenzen mit erhöhtem
G(Guanosin)/C(Cytosin)-Gehalt stabiler als Sequenzen mit einem erhöhten A(Adenosin)/U(Uracil)-Gehalt.
Daher werden erfindungsgemäß unter
Beibehaltung der translatierten Aminosäureabfolge die Codons gegenüber der
Wildtyp-mRNA derart variiert, dass sie vermehrt G/C-Nukleotide beinhalten.
Da mehrere Codons für
ein und dieselbe Aminosäure
kodieren (Degeneration des genetischen Codes), können die für die Stabilität günstigsten
Codons ermittelt werden (alternative Codonverwendung, engl. "codon usage"). In Abhängigkeit
von der durch die mRNA zu kodierenden Aminosäure sind unterschiedliche Möglichkeiten
zur Modifikation der mRNA-Sequenz gegenüber der Wildtyp-Sequenz möglich. Im
Fall von Aminosäuren,
die durch Codons kodiert werden, die ausschließlich G- oder C- Nukleotide
enthalten, ist keine Modifikation des Codons erforderlich. So erfordern
die Codons für
Pro (CCC oder CCG), Arg (CGC oder CGG), Ala (GCC oder GCG) und Gly
(GGC oder GGG) keine Veränderung,
da kein A oder U vorhanden ist. In folgenden Fällen werden die Codons, welche
A-und/oder U-Nukleotide enthalten, durch Substituieren anderer Codons,
welche die gleichen Aminosäuren
kodieren, jedoch kein A und/oder U enthalten, verändert. Beispiele sind:
Die Codons für
Pro können
von CCU oder CCA zu CCC oder CCG verändert werden; die Codons für Arg können von
CGU oder CGA oder AGA oder AGG zu CGC oder CGG verändert werden;
die Codons für
Ala können
von GCU oder GCA zu GCC oder GCG verändert werden; die Codons für Gly können von
GGU oder GGA zu GGC oder GGG verändert
werden. In anderen Fällen
können
A bzw. U-Nukleotide zwar nicht aus den Codons eliminiert werden,
es ist jedoch möglich,
den A- und U-Gehalt durch Verwendung von Codons zu vermindern, die
weniger A- und/oder U-Nukleotide enthalten. Zum Beispiel: Die Codons
für Phe
können
von UUU zu UUC verändert
werden; die Codons für
Leu können
von UUA, CUU oder CUA zu CUC oder CUG verändert werden; die Codons für Ser können von
UCU oder UCA oder AGU zu UCC, UCG oder AGC verändert werden; das Codon für Tyr kann
von UAU zu UAC verändert
werden; das Stop-Codon UAA kann zu UAG oder UGA verändert werden;
das Codon für
Cys kann von UGU zu UGC verändert
werden; das Codon His kann von CAU zu CAC verändert werden; das Codon für Gln kann
von CAA zu CAG verändert
werden; die Codons für
Ile können
von AUU oder AUA zu AUC verändert
werden; die Codons für
Thr können
von ACU oder ACA zu ACC oder ACG verändert werden; das Codon für Asn kann
von AAU zu AAC verändert
werden; das Codon für
Lys kann von AAA zu AAG verändert
werden; die Codons für
Val können
von GUU oder GUA zu GUC oder GUG verändert werden; das Codon für Asp kann
von GAU zu GAC verändert
werden; das Codon für
Glu kann von GAA zu GAG verändert
werden. Im Falle der Codons für
Met (AUG) und Trp (UGG) besteht hingegen keine Möglichkeit der Sequenzmodifikation.
Die vorstehend aufgeführten
Substitutionen können
selbstverständlich einzeln
aber auch in allen möglichen
Kombinationen zur Erhöhung
des G/C-Gehalts der modifizierten mRNA gegenüber der ursprünglichen
Sequenz verwendet werden. So können
beispielsweise alle in der ursprünglichen
(Wildtyp-) Sequenz auftretenden Codons für Thr zu ACC (oder ACG) verändert werden.
Vorzugsweise werden jedoch Kombinationen der vorstehenden Substitutionsmöglichkeiten
genutzt, z.B.: Substitution aller in der ursprünglichen Sequenz für Thr kodierenden
Codons zu ACC (oder ACG) und Substitution aller ursprünglich für Ser kodierenden
Codons zu UCC ( oder UCG oder AGC); Substitution aller in der ursprünglichen
Sequenz für
Ile kodierenden Codons zu AUC und Substitution aller ursprünglich für Lys kodierenden
Codons zu AAG und Substitution aller ursprünglich für Tyr kodierenden Codons zu
UAC; Substitution aller in der ursprünglichen Sequenz für Val kodierenden
Codons zu GUC (oder GUG) und Substitution aller ursprünglich für Glu kodierenden
Codons zu GAG und Substitution aller ursprünglich für Ala kodierenden Codons zu
GCC (oder GCG) und Substitution aller ursprünglich für Arg kodierenden Codons zu
CGC (oder CGG); Substitution aller in der ursprünglichen Sequenz für Val kodierenden
Codons zu GUC (oder GUG) und Substitution aller ursprünglich für Glu kodierenden
Codons zu GAG und Substitution aller ursprünglich für Ala kodierenden Codons zu
GCC (oder GCG) und Substitution aller ursprünglich für Gly kodierenden Codons zu
GGC (oder GGG) und Substitution aller ursprünglich für Asn kodierenden Codons zu
AAC; Substitution aller in der ursprünglichen Sequenz für Val kodierenden
Codons zu GUC (oder GUG) und Substitution aller usprünglich für Phe kodierenden
Codons zu UUC und Substitution aller ursprünglich für Cys kodierenden Codons zu
UGC und Substitution aller ursprünglich
für Leu
kodierenden Codons zu CUG (oder CUC) und Substitution aller ursprünglich für Gln kodierenden
Codons zu CAG und Substitution aller ursprünglich für Pro kodierenden Codons zu
CCC (oder CCG); usw.. Vorzugsweise wird der G/C-Gehalt des für das Peptid
bzw. Polypeptid kodierenden Bereichs (bzw. jedes anderen gegebenenfalls
vorhandenen weiteren Abschnitts) der mRNA um mindestens 7%-Punkte, mehr
bevorzugt um mindestens 15%-Punkte, besonders bevorzugt um mindestens
20%-Punkte gegenüber dem
G/C-Gehalt des kodierten Bereichs der für das entsprechende Peptid
bzw. Polypeptid kodierenden Wildtyp-mRNA erhöht. Besonders bevorzugt ist
es in diesem Zusammenhang, den G/C-Gehalt der derart modifizierten
mRNA im Vergleich zur Wildtyp-Sequenz
maximal zu erhöhen.
Eine
weitere bevorzugte Modifikation einer als Wirkstoff in der pharmazeutishen
Zusammensetzung verwendeten mRNA beruht auf der Erkenntnis, dass
die Translationseffizienz auch durch eine unterschiedliche Häufigkeit
im Vorkommen von tRNAs in Zellen bestimmt wird. Sind daher in einer
RNA-Sequenz vermehrt sogenannte "seltene" Codons vorhanden,
so wird die entsprechende mRNA deutlich schlechter translatiert
als in dem Fall, wenn für
relativ "häufige" tRNAs kodierende
Codons vorhanden sind. Somit wird erfindungsgemäß in der als Wirkstoff verwendeten
mRNA, der kodierende Bereich gegenüber dem entsprechenden Bereich
der Wildtyp-mRNA derart verändert,
dass mindestens ein Codon der Wildtyp-Sequenz, das für eine in
der Zelle relativ seltene tRNA kodiert, gegen ein Codon ausgetauscht
wird, das für
eine in der Zelle relativ häufige
tRNA kodiert, welche die gleiche Aminosäure trägt wie die relativ seltene
tRNA. Durch diese Modifikation werden die RNA-Sequenzen derart modifiziert,
dass Codons eingefügt
werden, für
die häufig
vorkommende tRNAs zur Verfügung
stehen. Welche tRNAs relativ häufig
in der Zelle vorkommen und welche demgegenüber relativ selten sind, ist
einem Fachmann bekannt; vgl. bspw. Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev.
2001, 11(6): 660–666.
Durch diese Modifikation können
erfindungsgemäß alle Codons
der Wildtyp-Sequenz, die für
eine in der Zelle relativ seltene tRNA kodieren, jeweils gegen ein
Codon ausgetauscht werden, das für
eine in der Zelle relativ häufige tRNA
kodiert, welche jeweils die gleiche Aminosäure trägt wie die relativ seltene
tRNA. Besonders bevorzugt ist es, den in der wie vorstehend beschriebenen
mRNA erhöhten,
insbesondere maximalen, sequenziellen G/C-Anteil mit den "häufigen" Codons zu verknüpfen, ohne die Aminosäuresequenz
eines durch den kodierenden Bereich des mRNA-kodierten antigenen
Peptids bzw. Polypeptids (ein oder mehrere) zu verändern.
Gemäß einer
zweiten bevorzugten Alternative der letztgenannten Ausführungsform
liegt die in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzung als Wirkstoff enthaltene Nukleinsäure als
dsRNA, bevorzugt als siRNA, vor. Eine dsRNA, v.a. eine siRNA, ist
insbesondere im Zusammenhang mit dem Phänomen der RNA-Interferenz von
Interesse. Auf das Phänomen
der RNA-Interferenz wurde man im Zuge der immunologischen Forschung
aufmerksam. In den letzten Jahren wurde ein RNA-basierter Abwehrmechanismus entdeckt,
der sowohl im Reich der Pilze, als auch im Pflanzen- und Tierreich
vorkommt und wie ein „Immunsystem
des Genoms" wirkt.
Das System wurde ursprünglich
unabhängig
voneinander in verschiedenen Spezies, zuerst in C. elegans, beschrieben,
ehe man die zugrundeliegenden Mechanismen der Vorgänge als
identisch identifizieren konnte: RNA-vermittelte Virus-Resistenz
in Pflanzen, PTGS („posttranscriptional
gene silencing")
bei Pflanzen, und RNA-Interferenz bei Eukaryoten basieren demnach
auf einer gemeinsamen Funktionsweise. Die in vitro Technik der RNA-Interferenz (RNAi)
beruht auf doppelsträngigen
RNA-Molekülen
(dsRNA), welche die sequenzspezifische Suppression der Genexpression
auslösen
(Zamore (2001) Nat. Struct. Biol. 9: 746–750; Sharp (2001) Genes Dev.
5:485–490:
Hannon (2002) Nature 41: 244–251).
Die Aktivierung von Proteinkinase R und RNaseL bewirkt bei der Transfektion
von Säugerzellen
mit langer dsRNA unspezifische Effekte, wie z.B. eine Interferon-Antwort
(Stark et. Al. (1998) Annu. Rev. Biochem. 67: 227–264; He
und Katze (2002) Viral Immunol. 15: 95–119). Diese unspezifischen
Effekte werden bei Verwendung von kürzerer, bspw. 21- bis 23-merer,
sog. siRNA (engl. „small
interfering RNA")
umgangen, da unspezifische Effekte durch siRNA, die kürzer als
30 bp ist, nicht ausgelöst
werden (Elbashir et. al.,. (2001) Nature 411: 494–498). Kürzlich wurden dsRNA-Moleküle auch
in vivo zur Anwendung gebracht (McCaffrey et. al.,. (2002), Nature
418: 38–39;
Xia et. al.,. (2002), Nature Biotech. 20: 1006–1010; Brummelkamp et. al.,.
(2002), Cancer Cell 2: 243–247).
Die
als Wirkstoff verwendete doppelsträngige RNA (dsRNA) enthält daher
bevorzugt eine Sequenz mit der allgemeinen Struktur 5'-(N17-29)-3', wobei N irgendeine
Base ist und für
Nukleotide steht. Die allgemeine Struktur setzt sich aus einer doppelsträngigen RNA
mit einem aus Ribonukleotiden aufgebauten Makromolekül zusammen,
wobei das Ribonukleotid aus einer Pentose (Ribose), einer organischen
Base und einem Phosphat besteht. Hierbei bestehen die organischen
Basen in der RNA aus den Purinbasen Adenin (A) und Guanin (G) sowie
den Pyrimidinbasen Cytosin (C) und Uracil (U). Die erfindungsgemäß als Wirkstoff
verwendete dsRNA enthält
derartige Nukleotide oder Nukleotidanaloga mit einer gerichteten
Struktur. Vorzugsweise weisen erfindungsgemäß als Wirkstoff verwendete
dsRNAs die allgemeine Struktur 5'-(N19-25)-3',
stärker
bevorzugt 5'-(N19-24)-3',
noch stärker
bevorzugt 5'-(N21-23)-3' auf,
wobei N irgendeine Base ist. Hierbei werden bevorzugt zumindest
90%, vorzugsweise 95% und insbesondere 100% der Nukleotide einer
als Wirkstoff verwendeten dsRNA komplementär zu einem Abschnitt der (m)RNA-Sequenz
eines zuvor (als Wirkstoff) beschriebenen (therapeutisch relevanten)
Proteins oder Antigens sein. 90% komplementär bedeutet hierbei, dass bei
einer Länge
einer erfindungsgemäß verwendeten
dsRNA von bspw. 20 Nukleotiden diese höchstens 2 Nukleotide ohne entsprechende
Komplementarität
mit dem entsprechenden Abschnitt auf der (m)RNA aufweist. Die Sequenz
der erfindungsgemäß verwendeten
doppelsträngigen
RNA ist mit ihrer allgemeinen Struktur vorzugsweise aber vollständig komplementär zu einem
Abschnitt der (m)RNA eines zuvor als Wirkstoff beschriebenen Proteins
oder Antigens.
Grundsätzlich können alle
im kodierenden Bereich der (m)RNA auftretenden 17 bis 29, vorzugsweise 19
bis 25 Basenpaare langen Abschnitte als Zielsequenz für eine erfindungsgemäß als Wirkstoff
verwendete dsRNA dienen. Gleichwohl können als Wirkstoff verwendete
dsRNAs auch gegen Nukleotidsequenzen eines zuvor (als Wirkstoff)
beschriebenen (therapeutisch relevanten) Proteins oder Antigens,
die nicht im kodierenden Bereich liegen, gerichtet sein, insbesondere
im nicht-kodierenden 5'-Bereich
der (m)RNA, bspw. also gegen nicht-kodierende Bereiche der (m)RNA
mit Regulationsfunktion. Die Zielsequenz der als Wirkstoff eingesetzten
dsRNA eines zuvor beschriebenen Proteins oder Antigens kann also
im translatierten und nicht-translatierten Bereich der (m)RNA und/oder
im Bereich der Steuerungselemente liegen. Auch kann die Zielsequenz einer
als Wirkstoff verwendeten dsRNA im Überlappungsbereich von nicht-translatierter
und translatierter Sequenz liegen, insbesondere kann die Zielsequenz
mindestens ein Nukleotid stromaufwärts vom Starttriplett des kodierenden
Bereichs der (m)RNA umfassen.
Bei
einer in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzung als Wirkstoff enthaltenen dsRNA kann vorzugsweise
ein modifiziertes Nukleotid auftreten. Der Begriff „modifiziertes
Nukleotid" bedeutet erfindungsgemäß, dass
das jeweilige Nukleotid chemisch modifiziert ist. Der Fachmann versteht
unter dem Begriff „chemische
Modifikation", dass
das modifizierte Nukleotid durch Ersetzen, Anfügen oder Entfernen einzelner
oder mehrerer Atome oder Atomgruppen im Vergleich zu natürlich vorkommenden
Nukleotiden verändert
ist. Mindestens ein modifiziertes Nukleotid in erfindungsgemäß verwendeter
dsRNA dient einerseits der Stabilität und andererseits der Verhinderung
der Dissoziation. Vorzugsweise sind zwischen 2 und 10, bevorzugt
zwischen 2 und 5 Nukleotide in einer erfindungsgemäß verwendeten
dsRNA modifiziert.
Vorteilhafterweise
ist mindestens eine 2'-Hydroxygruppe
der Nukleotide der dsRNA in der doppelsträngigen Struktur durch eine
chemische Gruppe, vorzugsweise eine 2'-Amino- oder eine 2'-Methylgruppe, ersetzt. Mindestens ein
Nukleotid in mindestens einem Strang der doppelsträngigen Struktur
kann auch ein sogenanntes „locked
nucleotide" mit
einem, vorzugsweise durch eine 2'-O,
4'-C-Methylenbrücke, chemisch
modifizierten Zuckerring sein. Vorteilhafterweise sind mehrere Nukleotide
der erfindungsgemäß verwendeten
dsRNA „locked
nucleotides". Darüber hinaus
kann durch Modifizierung des Rückgrates
einer erfindungsgemäß verwendeten
dsRNA ein vorzeitiger Abbau derselben verhindert werden. Insbesondere
bevorzugt ist in diesem Zusammenhang eine dsRNA, die in Form von
Phosphorthioat, 2'-O-Methyl-RNA,
LNA, LNA/DNA-Gapmeren, etc. modifiziert ist und daher eine längere Halbwertszeit
in-vivo aufweist.
Vorzugsweise
können
die Enden der als Wirkstoff in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung
eingesetzten doppelsträngigen
RNA (dsRNA) modifiziert werden, um einem Abbau in der Zelle oder
einer Dissoziation in die Einzelstränge entgegenzuwirken, insbesondere
um einen vorzeitigen Abbau durch Nukleasen zu umgehen. Eine regelmäßig nicht
gewünschte
Dissoziation der Einzelstränge
von dsRNA tritt insbesondere bei Verwendung niedriger Konzentrationen
derselben oder kurzer Kettenlängen
auf. Zur besonders wirksamen Hemmung der Dissoziation kann der durch
die Nukleotidpaare bewirkte Zusammenhalt der doppelsträngigen Struktur
von erfindungsgemäß verwendeter
dsRNA durch mindestens eine, vorzugsweise mehr chemische Verknüpfungen
erhöht
werden. Eine als Wirkstoff erfindungsgemäß verwendete dsRNA, deren Dissoziation
vermindert ist, weist eine höhere
Stabilität
gegen enzymatischen und chemischen Abbau in der Zelle bzw. im Organismus
(in vivo) oder ex vivo auf und besitzt daher eine höhere Halbwertszeit.
Eine weitere Möglichkeit
zur Verhinderung frühzeitiger
Dissoziation erfindungsgemäß verwendeter
dsRNA in der Zelle besteht darin, dass an den Enden der Stränge jeweils
Haarnadelschleife(n) ausgebildet sein können. In einer besonderen Ausführungsform
weist eine erfindungsgemäß verwendete
dsRNA daher eine Haarnadelstruktur auf, um die Dissoziationskinetik
zu verlangsamen. Bei einer derartigen Struktur ist vorzugsweise
am 5'- und/oder
3'-Ende eine Loop-Struktur
ausgebildet. Eine derartige Loop-Struktur weist keine Wasserstoffbrücken, typischerweise
also keine Komplementarität,
zwischen Nukleotidbasen auf. Typischerweise weist ein derartiger „Loop" eine Länge von
mindestens 5, vorzugsweise mindestens 7 Nukleotiden auf und verbindet
auf diese Weise die beiden komplementären Einzelstränge einer
erfindungsgemäß verwendeten
dsRNA. Bevorzugt können
ebenfalls die Nukleotide der beiden Stränge der erfindungsgemäß verwendeten
dsRNA, um eine Dissoziation der Stränge zu verhindern, so modifiziert
sein, dass eine Verstärkung
der Wasserstoffbrückenbindung
erreicht wird, bspw. durch Erhöhung
der Wasserstoffbrückenbindungskapazität zwischen
den Basen durch ggf. modifizierte Nukleotide. Dadurch wird die Stabilität der Wechselwirkung
zwischen den Strängen
erhöht
und die dsRNA gegen einen Angriff von RNAsen geschützt.
Gemäß einer
besonders bevorzugten Ausführungsform
ist die als Wirkstoff in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung
verwendete dsRNA gegen die (m)RNA eines wie zuvor beschriebenen Proteins
oder Antigens gerichtet. Vorzugsweise unterdrückt dabei die verwendete dsRNA
die Translation eines zuvor beschriebenen Proteins oder Antigens
in einer Zelle mindestens zu 50%, stärker bevorzugt 60%, noch stärker bevorzugt
70%, und am stärksten
bevorzugt zu mindestens 90%, d.h. die Zelle enthält vorzugsweise höchstens
die Hälfte
der nativ (ohne Behandlung mit erfindungsgemäß verwendeter dsRNA) auftretenden,
zellulären
Konzentration eines zuvor beschriebenen Proteins oder Antigens.
Die Suppression der Translation dieser Proteine oder Antigene in
Zellen nach Zugabe erfindungsgemäß verwendeter
dsRNA-Moleküle
beruht auf dem durch solche Moleküle hervorgerufenen Phänomen der
RNA-Interferenz. Bei der erfindungsgemäß verwendeten dsRNA handelt
sich dann um sogenannte siRNA, die das Phänomen der RNA-Interferenz auslösen und
die (m)RNA eines zuvor beschriebenen Proteins oder Antigens binden
kann. Die Messung bzw. der Nachweis der durch die erfindungsgemäß verwendete
dsRNA ausgelösten
Translationssuppression in Zellen kann über Northern-Blot, quantitative
Real-Time PCR oder auf Proteinebene mit spezifischen Antikörpern gegen eine
zuvor beschriebenes Proteins oder Antigen erfolgen. Die in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung
ggf. als Wirkstoff eingesetzte dsRNA sowie eine entsprechende siRNA
kann nach dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden.
Zur
weiteren Erhöhung
der Immunogenität
kann die erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzung zusätzlich
einen oder mehrere Hilfsstoffe enthalten. Hierbei wird vorzugsweise
eine synergistische Wirkung des erfindungsgemäßen immunstimulatorischen Adjuvanz
und eines gegebenenfalls zusätzlich
in der pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltenen Hilfsstoffes
und/oder ggf. eines wie oben beschriebenen Wirkstoffes erzielt.
In Abhängigkeit
der verschiedenen Arten von Hilfsstoffen können diesbezüglich verschiedene
Mechanismen in Betracht kommen. Bspw. bilden Verbindungen, welche
die Reifung von dendritischen Zellen (DC) erlauben, bspw. Lipopolysaccharide,
TNF-α oder
CD40-Ligand, eine erste Klasse geeigneter Hilfsstoffe. Allgemein
kann jedes das Immunsystem beeinflussende Agenz von der Art eines "Gefahrsignals" (LPS, GP96 usw.)
oder Cytokine, wie GM-CFS, als Hilfsstoff verwendet werden, welche
es erlauben, eine durch das erfindungsgemäße immunstimulatorische Adjuvanz
erzeugte Immunantwort zu verstärken
und/oder gerichtet zu beeinflussen. Besonders bevorzugte Hilfsstoffe
sind Cytokine, wie Monokine, Lymphokine, Interleukine oder Chemokine,
z.B. IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10,
IL-12, INF-γ,
INF-β, GM-CFS, M-CSF,
G-CSF, LT-β,
TNF-α, oder
Interferone, bspw. IFN-γ,
oder Wachstumsfaktoren, bspw. hGH.
Die
erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzung kann weiterhin zusätzlich ein im Stand der Technik
bekanntes Adjuvanz enthalten. Im Zusammenhang mit der vorliegenden
Erfindung schließen
im Stand der Technik bekannte Adjuvanzien, ohne darauf beschränkt zu sein,
Aluminiumhydroxid, das (komplette oder inkomplette) Freund'sche Adjuvanz sowie
zuvor beschriebene stabilisierende kationische Peptide bzw. Polypeptide,
wie Protamin, Nukleolin, Spermin oder Spermidin und kationische
Polysaccharide, insbesondere Chitosan, TDM, MDP, Muramyldipeptid,
Alaun-Lösung,
Pluronics, etc. ein. Des weiteren sind Lipopeptide, wie Pam3Cys,
ebenfalls besonders geeignet, um mit dem erfindungsgemäßen immunstimulierenden
Adjuvanz kombiniert zu werden (vgl. Deres et al., Nature 1989, 342:
561–564).
Optional
kann die erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzung einen pharmazeutisch geeigneten Träger enthalten.
Der hier verwendete Begriff "pharmazeutisch
geeigneter Träger" umfasst bevorzugt einen
oder mehrere kompatible feste oder flüssige Füllstoffe, bzw. Verdünnungsmittel
oder einkapselnde Verbindungen, welche für die Verabreichung an eine
Person geeignet sind. Der Begriff "kompatibel", wie hier verwendet, bedeutet, dass
die Bestandteile der Zusammensetzung in der Lage sind, mit dem Wirkstoff,
dem Adjuvanz als solchem und miteinander in einer solchen Art zusammengemischt
zu werden, dass keine Interaktion auftritt, welche wesentlich die
pharmazeutische Effektivität
der Zusammensetzung unter gewöhnlichen
Verwendungsbedingungen reduzieren würde. Pharmazeutisch geeignete
Träger
müssen
selbstverständlich
eine ausreichend hohe Reinheit und eine ausreichend geringe Toxizität aufweisen,
um sie für
die Verabreichung an eine zu behandelnde Person geeignet zu machen.
Einige Beispiele von Verbindungen, welche als pharmazeutisch geeignete
Träger
oder Bestandteile davon dienen können,
sind Zucker, wie beispielsweise Lactose, Glucose und Sukrose; Stärken wie
beispielsweise Kornstärke
oder Kartoffelstärke;
Cellulose und seine Derivate, wie beispielsweise Natriumcarboxymethylcellulose,
Ethylcellulose, Celluloseacetat; pulverisiertes Tragacanth; Malz;
Gelatine; Talg; feste Gleitmittel, wie beispielsweise Stearinsäure, Magnesiumstearat;
Kalziumsulfat; vegetabile Öle,
wie beispielsweise Erdnussöl,
Baumwollsamenöl,
Sesamöl,
Olivenöl,
Kornöl
und Öl
aus Theobroma; Polyole, wie beispielsweise Polypropylenglycol, Glycerin,
Sorbitol, Mannitol und Polyethylenglycol; Algininsäure; Emulgatoren,
wie beispielsweise Tween®; Benetzungsmittel, wie
beispielsweise Natriumlaurylsulfat; färbende Agenzien; geschmacksvermittelnde
Agenzien, Arzneistoffträger;
tablettenbildende Agenzien; Stabilisatoren; Antioxidantien; Konservierungsmittel;
pyrogen-freies Wasser; isotonische Salzlösung und phosphatgepufferte
Lösungen.
Die
Wahl eines pharmazeutisch geeigneten Trägers wird grundsätzlich durch
die Art bestimmt, durch die die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen
verabreicht werden. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen
können
bspw. systemisch verabreicht werden. Routen zur Verabreichung schließen z.B.
transdermale, orale, parenterale, einschließlich subkutane oder intravenöse Injektionen,
topische und/oder intranasale Routen ein. Die geeignete Menge der
zu verwendenen pharmazeutischen Zusammensetzung kann durch Routineexperimente
mit Tiermodellen bestimmt werden. Solche Modelle schließen, ohne
jedoch darauf begrenzt zu sein, Modelle von Kaninchen, Schaf, Maus,
Ratte, Hund und nicht-humane Primatenmodelle mit ein. Bevorzugte
Einheitsdosisformen zur Injektion schließen sterile Lösungen von
Wasser, physiologischer Salzlösung
oder Mischungen davon mit ein. Der pH solcher Lösungen sollte auf etwa 7,4
eingestellt werden. Geeignete Träger
zur Injektion schließen
Hydrogele, Vorrichtungen zur kontrollierten oder verzögerten Freigabe,
polylaktische Säure
und Collagenmatrizen mit ein. Geeignete pharmazeutisch-geeignete
Träger
zur topischen Anwendung schließen
solche mit ein, die zur Verwendung in Lotionen, Cremes, Gels u.ä. geeignet
sind. Falls die Verbindung peroral verabreicht werden soll, sind
Tabletten, Kapseln u.ä.
die bevorzugte Einheitsdosisform. Die pharmazeutisch geeigneten
Träger
zur Herstellung von Einheitsdosisformen, die für die orale Verabreichung verwendbar
sind, sind im Stand der Technik gut bekannt. Ihre Auswahl wird von
sekundären Überlegungen
wie Geschmack, Kosten und Lagerfähigkeit
abhängen,
welche für
die Zwecke der vorliegenden Erfindung nicht kritisch sind, und ohne
Schwierigkeiten durch einen Fachmann durchgeführt werden können.
Gemäß einer
besonderen Ausführungsform
kann die pharmazeutische Zusammensetzung auch als Vakzine vorliegen.
Erfindungsgemäße Vakzine
umfassen dabei typischerweise eine Zusammensetzung wie zuvor für pharmazeutische
Zusammensetzung beschrieben, wobei die Zusammensetzung solcher erfindungsgemäßen Vakzine
insbesondere durch die Art bestimmt wird, mit denen sie verabreicht
werden. Bevorzugt werden erfindungsgemäße Vakzine systemisch verabreicht.
Routen zur Verabreichung von solchen Vakzinen schließen typischerweise
transdermale, orale, parenterale, einschließlich subkutane oder intravenöse Injektionen,
topische und/oder intranasale Routen mit ein. Vakzine werden daher
bevorzugt in flüssiger
oder fester Form formuliert. Auch können ggf. in eine erfindungsgemäße Vakzine
weitere Hilfsstoffe eingearbeitet sein, die die Immunogenität des Vakzins
weiter steigern können.
Vorteilhafterweise wird/werden ein oder mehr weitere solcher, wie
zuvor definierte, Hilfsstoffe in Abhängigkeit der Immunogenität und anderen
Eigenschaften des Wirkstoffes in der erfindungsgemäßen Vakzine
zu wählen
sein.
Gemäß einem
weiteren bevorzugten Gegenstand der vorliegenden Erfindung werden
die erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzungen, besonders bevorzugt die erfindungsgemäßen Vakzine, zur
Behandlung von im folgenden genannten beispielhaften Indikationen
verwendet. Mit erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzungen, besonders bevorzugt erfindungsgemäßen Vakzinen,
können
beispielsweise solche Erkrankungen oder Zustände behandelt werden, die mit
diversen pathologisch unterbleibenden Immunantworten verknüpft sind
oder die eine Immunantwort, bevorzugt eine gesteigerte Immunantwort,
im Rahmen einer Therapie erfordern. Bevorzugt werden dabei erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzungen oder Vakzine eingesetzt, um tumorspezifische oder
pathogenspezifische Immunantworten auszulösen. Besonders bevorzugt können solche
erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzungen oder Vakzine, zur Steigerung von Immunantworten
antigenpräsentierender
Zellen (APC) verwendet werden. Ebenfalls besonders bevorzugt können die
erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzungen oder Vakzine zur Behandlung von Krebs bzw. Tumorerkrankungen
eingesetzt werden, bevorzugt ausgewählt aus Kolonkarzinomen, Melanomen,
Nierenkarzinomen, Lymphomen, akuter myeloider Leukämie (AML),
akute lymphoider Leukämie
(ALL), chronischer myeloider Leukämie (CML), chronischer lymphozytischer
Leukämie (CLL),
Gastrointestinalen Tumoren, Lungenkarzinomen, Gliomen, Schilddrüsentumoren,
Mammakarzinomen, Prostatatumoren, Hepatomen, diversen virus-induzierten
Tumoren wie z.B. Papillomvirus-induzierten Karzinomen (z.B. Cervixkarzinome),
Adenokarzinomen, Herpesviren-induzierten Tumoren (z.B. Burkitt's Lymphom, EBV-induziertes
B Zelllymphome), Hepatitis B-induzierten Tumoren (Hepatozellkarzinome),
HTLV-1 und HTLV-2 induzierten Lymphomen, Akustikusneurinomen, Gebärmuttehalskrebs,
Lungenkrebs, Rachenkrebs, Analkarzinomen, Glioblastomen, Lymphomen,
Rektumkarzinomen, Astrozytomen, Hirntumoren, Magenkrebs, Retinoblastomen,
Basaliomen, Hirnmetastasen, Medulloblastomen, Scheidenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs,
Hodenkrebs, Melanomen, Schilddrüsenkarzinomen,
Blasenkrebs, Hodgkin-Syndrom, Meningeomen, Schneeberger Krankheit,
Bronchialkarzinomen, Hypophysentumor, Mycosis fungoides, Speiseröhrenkrebs, Brustkrebs,
Karzinoide, Neurinomen, Spinaliomen, Burkitt-Lymphomen, Kehlkopfkrebs,
Nierenkrebs, Thymomen, Corpuskarzinomen, Knochenkrebs, Non-Hodgkin-Lymphomen,
Urethrakrebs, CUP-Sysndrom, Kopf-Hals-Tumoren, Oligodendrogliomen,
Vulvakrebs, Darmkrebs, Kolonkarzinomen, Ösphaguskarzinomen, Warzenbeteiligung,
Dünndarmtumoren,
Kraniopharyngeomen, Ovarial-Karzinomen, Weichteiltumoren, Eierstockkrebs,
Leberkrebs, Pankreaskarzinomen, Zervixkarzinomen, Endometriumkarzinomen,
Lebermetastasen, Peniskrebs, Zungenkrebs, Gallenblasenkrebs, Leukämie, Plasmozytomen,
Gebärmutterkrebs,
Lidtumor, Prostatakrebs, etc.. In diesem Zusammenhang ist es besonders
bevorzugt, wenn als Lipid in der Lipid-modifizierten-Nukleinsäure oder
als Wirkstoff α-Tocopherol
(Vitamin E), D-α-Tocopherol,
L-α-Tocopherol, D,L-α-Tocopherol
oder Vitamin E-Succinat (VES) eingesetzt werden. α-Tocopherol (Vitamin
E) ist wenig toxisch und zeigt eine potente Antitumor-Wirkung (A.
Bendich, L.J. Machlin Am. J. Clin. Nutr. 48 (1988) 612), was dessen in
der Krebstherapie vielversprechend erscheinen lässt. Als Erklärung für die Inhibierung
der Proliferation von Tumorzellen bzw. der zytotoxischen Wirkung
auf sie sind v.a. zwei Mechanismen bekannt: Zum einen ist Vitamin
E ein potentes Antioxidanz und ein guter Radikalfänger (C.
Borek Ann. NY Acad. Sci. 570 (1990) 417), zum anderen kann es über eine
Stimulierung der Immunantwort das Tumorwachstum verhindern (G. Shklar, J.
Schwartz, D.P. Trickler, S. Reid J. Oral Pathol. Med. 19 (1990)
60). In neueren Arbeiten wurde weiterhin ein Zusammenhang zwischen
der Expression des Tumorsuppressorgens p53 in Tumorzellen (oral
squamous cancer) und einer Behandlung mit Vitamin E-Succinat (VES)
gefunden (J. Schwartz, G. Shklar, D. Trickler Oral Oncol. Europ.
J. Cancer 29B (1993) 313). Dabei konnte sowohl eine Stimulierung
der Produktion des wild type p53, welches als Tumorsuppressor gilt,
beobachtet werden, als auch eine Reduktion von mutiertem p53, das onkogene
Wirkung entfaltet. Interessanterweise ist die biologische Wirkung
von VES auf diese Tumorzellen in zweifacher Hinsicht dosisabhängig: In
physiologischen Dosen (0,001–50 μmol/l) ist
ein ansteigendes Zellwachstum zu beobachten, in pharmakologischen
Dosen (100–154 μmol/l) wird
das Zellwachstum inhibiert. Dies wurde in Zellkultur gezeigt (T.M.A.
Elattar, A.S. Virji Anticancer Res. 19 (1999) 365). Auch konnte
in verschiedenen Brustkrebszelllinien durch Behandlung mit VES Apoptose
induziert werden (W. Yu, K. Israel, Q.Y. Liao, C. M. Aldaz, B.G.
Sanders, K. Kline Cancer Res. 59 (1999) 953). Die induzierte Apoptose
wird dabei über eine
Interaktion von Fas-Ligand und Fas-Rezeptor eingeleitet. Dies ist
deshalb besonders hervorzuheben, weil bei den entsprechenden Zelllinien
ein derartiger Mechanismus bisher nicht beobachtet werden konnte.
Von Vitamin E existieren verschiedene Isomere, die sich in der Anzahl
und Position der Methylgruppen am aromatischen Ring unterscheiden.
In den beschriebenen Arbeiten wurde die biologisch wirksamste Form
des natürlich vorkommenden
Vitamin E, das α-Tocopherol,
eingesetzt. Dieses kommt wiederum in verschiedenen Stereoisomeren
vor, da das Molekül
drei optisch aktive Zentren enthält.
Die natürliche
Form des Vitamin E ist das RRR-α-Tocopherol (früher D-α-Tocopherol),
allerdings wird heutzutage überwiegend
das Racemat (D,L-α-Tocopherol)
eingesetzt. Alle hier zuvor genannten Formen von Vitamin E sind
ebenfalls als Lipid im Sinne der vorliegenden Erfindung mit umfasst.
Ebenfalls
besonders bevorzugt werden die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen
zur von Infektionserkrankungen eingesetzt. Ohne darauf beschränkt zu sein
werden solche Infektionskrankheiten bevorzugt ausgewählt aus
Influenza, Malaria, SARS, Gelbfieber, AIDS, Lyme-Borreliose, Leischmaniasis,
Anthrax, Meningitis, viralen Infektionskrankheiten wie AIDS, Condyloma
acuminata, Dellwarze, Dengue-Fieber, Dreitagefieber, Ebolavirus,
Erkältung,
Frühsommermeningoenzephalitis
(FSME), Grippe, Gürtelrose,
Hepatitis, Herpes-Simplex Typ I, Herpes-Simplex Typ II, Herpes zoster,
Influenza, Japanische Enzephalitis, Lassafieber, Marburg-Virus,
Masern, Maul- und Klausenseuche, Mononukleose, Mumps, Norwalk-Virus-infektion,
Pfeifersches-Drüsenfieber,
Pocken, Polio (Kinderlähmung),
Pseudokrupp, Ringelröteln,
Tollwut, Warzen, West-Nil-Fieber, Windpocken, Zytomegalie-Virus
(CMV), aus bakteriellen Infektionskrankheiten wie Abort (Prostataentzündung),
Anthrax, Appendizitis (Blinddarmentzündung), Borreliose, Botulismus,
Camphylobacter, Chlamydia trachomatis (Harnröhren-, Bindehautentzündung),
Cholera, Diphterie, Diphterie, Donavanosis, Epiglottitis, Fleckfieber,
Flecktyphys, Gasbrand, Gonorhoe, Hasenpest, Heliobakter pylori,
Keuchhusten, klimatischer Bubo, Knochenmarksentzündung, Legionärskrankheit,
Lepra, Listeriose, Iungenentzündung, Meningitis,
Bakterielle Gehirnhautentzündung,
Milzbrand, Mittelohrentzündung,
Mycoplasma hominis, Neugeborenensepsis (Chorioamnionitis), Noma,
Paratyphus, Pest, Reitersyndrom, Rocky Mountain spotted fever, Salmonellen-Paratyphus, Salmonellen-Typhus,
Scharlach, Syphilis, Tetanus, Tripper, Tsutsugamushi, Tuberkulose,
Typhus, Vaginitis (Kolpitis), Weicher Schanker und aus durch Parasiten,
Protozoen oder Pilze hervorgerufenen Inkektionskrankheiten wie Amöbenruhr,
Bilharziose, Chagas-Krankheit, Fußpilz, Kleienpilzflechte, Krätze (Skabies),
Malaria, Onchozerkose (Flussblindheit), oder Pilzerkrankungen, Toxoplasmose,
Trichomoniasis, Trypanosomiasis (Schlafkrankheit), Viszerale Leishmaniose,
Windeldermatitis, Schistosomiasis, Fischvergiftung (Ciguatera),
Kandiose, Kutane Leishmaniose, Lamblienruhr (Giadiasis), oder Schlafkrankheit,
oder aus Infektionskrankheiten hervorgerufen durch Echinococcus,
Fischbandwurm, Fuchsbandwurm, Hundebandwurm, Läuse, Rinderbandwurm, Schweinebandwurm,
Zwergbandwurm.
Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung eines
erfindungsgemäßen immunstimulierenden
Adjuvanz zur Herstellung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung
oder eines erfindungsgemäßen Vakzins
zur Behandlung von zuvor beschriebene Indikationen, z.B. zur Behandlung von
den genannten Tumor- bzw. Infektionserkrankungen. Alternativ umfasst
die Erfindung die (therapeutische) Verwendung eines erfindungsgemäßen immunstimulierenden
Adjuvanz zur Behandlung von Tumor- oder Infektionserkrankungen,
wie zuvor beschrieben.
Ebenfalls
umfasst werden von der vorliegenden Erfindung Kits, enthaltend ein
erfindungsgemäßes immunstimulierendes
Adjuvanz und/oder eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung
und/oder eine erfindungsgemäße Vakzine
sowie optional eine technische Gebrauchsanweisung mit Angaben zur
Verabreichung und Dosierung des erfindungsgemäßen immunstimulierenden Adjuvanz
und/oder der erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzung und/oder der erfindungsgemäßen Vakzine.
Die
vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Figuren und Beispielen
weiter illustriert, ohne dass diese dazu gedacht sind, die Gegenstände der
vorliegenden Erfindung hierauf zu beschränken.
Figurenbeschreibung:
1:
zeigt verschiedene erfindungsgemäße Möglichkeiten
der Endmodifizierung von Nukleinsäuren mit Lipiden. Dargestellt
sind insbesondere die Lipidmodifizierten Linker bzw. bifunktionellen
Peptide, die zur Kopplung bzw. Synthese mit Nukleinsäuresequenzen
(kurz: ODN-Sequenz) verwendet werden können.
2:
beschreibt beispielhaft einen Syntheseweg für (trifunktionale) Lipid-modifizierte
Linker, mit der z.B. eine Tocopherolmodifizierung an das 3'-Ende einer Nukleinsäure eingebracht
werden kann. Solche beispielhaft dargestellten Verbindungen stellen
ein Zwischenprodukt bei der Herstellung der erfindungsgemäßen 5'- oder 3'-Lipid-modifizierten
Nukleinsäuren
sowie der erfindungsgemäßen Adjuvanzien
dar.
3:
zeigt beispielhaft ein bifunktionelles Lipid mit einem Succinylanker,
das eine 3'-Modifizierung einer
Nukleinsäure
mit einem bifunktionellen Lipid, z.B. mit PEG, ermöglicht.
4:
stellt schematisch die Kopplung von Lipid-modifizierten Amiditen
an das 5'-Ende von Nukleinsäuren dar.
5A,B: beschreiben die Stimulation humaner
PBMCs mit erfindungsgemäßen immunstimulierenden
Adjuvanzien sowie mit verschiedenen RNA-Oligonukleotiden. A) Es ist insbesondere
bei der Ausschüttung von
Zytokinen (IL-6) zu beobachten, dass die erfindungsgemäßen immunstimulierenden
Adjuvanzien ohne Zugabe von Protamin eine mehr als 5-fache Erhöhung der
Zytokin-Ausschüttung
(IL-6) gegenüber
dem Medium aufweisen sowie bei Zugabe von Protamin gegenüber β-Galaktosidase
und RNA Oligo 40 alleine (SEQ ID NO: 40) eine leicht verbesserte
Freisetzung von IL-6. B) Bei der Bestimmung der TNFα-Ausschüttung lässt sich eine
deutliche Stimulierung des Immunsystems feststellen, die der von β-Galactosidase
oder RNA mindestens gleichzusetzen ist.
6:
zeigt die Freisetzung von TNF-α durch
humane PBMC-Zellen nach Stimulation mit erfindungsgemäß verwendeten
RNA-Oligonukleotiden sowie erfindungsgemäßen immunstimulierenden Adjuvanzien. 6 zeigt
insbesondere, dass immunstimulierende erfindungsgemäße Adjuvanzien
in Form einer Lipid-modifizierten Nukleinsäure, enthaltend z,B; eine der
Sequenzen SEQ ID NO: 40, 41 oder 42, im Vergleich zu z.B. einem
nicht modifizierten RNA-Oligonukleotid der Sequenz gemäß SEQ ID
NO: 40 (RNA Oligo 40) eine deutlich verbesserte Freisetzung von
TNF-α und
damit eine deutlich verbesserte Immunstimulation aufweisen. Die besten
Ergebnisse mit einer Steigerung der Immunstimulation um mehr als
das 10-fache gegenüber
dem nicht-modifizierten RNA-Oligonukleotid konnten mit einer Tocopherol-modifizierten Sequenz
gemäß SEQ ID NO:
42 (RNA Oligo Toc CV2) erreicht werden.
