DE102006051516A1 - (Basen-)modifizierte RNA zur Expressionssteigerung eines Proteins - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Anmeldung beschreibt eine (Basen-)modifizierte RNA, sowie deren Verwendung zur Expressionssteigerung eines Proteins, sowie zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, insbesondere einer Vakzine, zur Behandlung von Tumoren und Krebserkrankungen, Herz- und Kreislauferkrankungen, Infektionskrankheiten, Autoimmunkrankheiten oder monogenetischen Erkrankungen, z. B. in der Gentherapie. Die vorliegende Erfindung beschreibt weiterhin ein In-vitro-Transkriptionsverfahren, In-vitro-Verfahren zur Expressionssteigerung eines Proteins unter Verwendung der (Basen-)modifizierten RNA und ein In-vitro-Verfahren.

Description

  • Die vorliegende Anmeldung beschreibt eine (Basen-)modifizierte RNA, sowie deren Verwendung zur Expressionssteigerung eines Proteins, sowie zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, insbesondere einer Vakzine, zur Behandlung von Tumoren und Krebserkrankungen, Herz- und Kreislauferkrankungen, Infektionskrankheiten, Autoimmunkrankheiten oder monogenetischen Erkrankungen, z.B. in der Gentherapie. Die vorliegende Erfindung beschreibt weiterhin ein in vitro-Transkriptionsverfahren, in vitro-Verfahren zur Expressionssteigerung eines Proteins unter Verwendung der (Basen-)modifizierten RNA und ein in vivo-Verfahren.
  • Das Auftreten von Tumoren und Krebserkrankungen ist neben Herz- und Kreislauferkrankungen und Infektionskrankheiten eine der häufigsten Todesursachen moderner Gesellschaften und mit zumeist erheblichen Kosten bei der Therapie und anschließenden Rehabilitationsmaßnahmen verbunden. Die Behandlung von Tumoren und Krebserkrankungen hängt bspw. stark von der Art des auftretenden Tumors ab und erfolgt heute üblicherweise neben invasiven Eingriffen durch Anwendung einer Strahlen- oder Chemotherapie. Diese Therapien stellen jedoch für das Immunsystem eine außerordentliche Belastung dar und können in manchen Fällen nur eingeschränkt eingesetzt werden. Zudem erfordern diese Therapieformen zumeist lange Pausen zwischen den einzelnen Behandlungen zur Regeneration des Immunsystems. In den letzten Jahren haben sich daher neben diesen „klassischen Maßnahmen" insbesondere gentherapeutische Ansätze oder die genetische Vakzinierung zur Behandlung oder zur Unterstützung dieser Therapien als vielversprechend herausgestellt. Bei gentherapeutischen Ansätzen stehen dabei auch monogenetische Erkrankungen im Vordergrund, d.h. (Erb-)Erkrankungen, die durch einen Einzelgendefekt bedingt sind und nach den Mendel'schen Regeln vererbt werden. Zu den bekanntesten Vertretern monogenetischer Krankheiten zählen u.a. die Mukoviscidose (Zystische Fibrose) und die Sichelzellanämie.
  • Die Gentherapie und die genetische Vakzinierung sind molekularmedizinische Verfahren, deren Anwendung allgemein in der Therapie und Prävention von Erkrankungen erhebliche Auswirkungen auf die medizinische Praxis haben. Beide Verfahren beruhen auf der Einbringung von Nukleinsäuren in Zellen bzw. in Gewebe des Patienten sowie auf der anschließenden Verarbeitung der durch die eingebrachten Nukleinsäuren kodierten Information durch die Zellen bzw. das Gewebe, d.h. der Expression der erwünschten Polypeptide.
  • Die übliche Vorgehensweise bisheriger Verfahren der Gentherapie und der genetischen Vakzinierung ist die Verwendung von DNA, um die benötigte genetische Information in die Zelle einzuschleusen. In diesem Zusammenhang sind verschiedene Verfahren zur Einbringung von DNA in Zellen, wie bspw. Calciumphosphat-Transfektion, Polypren-Transfektion, Protoplasten-Fusion, Elektroporation, Mikroinjektion und Lipofektion, entwickelt worden, wobei sich insbesondere die Lipofektion als geeignetes Verfahren herausgestellt hat.
  • Ein weiteres Verfahren, das insbesondere bei genetischen Vakzinierungsverfahren vorgeschlagen wurde, ist die Verwendung von DNA-Viren als DNA-Vehikel. Derartige Viren haben den Vorteil, dass aufgrund ihrer infektiösen Eigenschaften eine sehr hohe Transfektionsrate zu erzielen ist. Die verwendeten Viren werden genetisch verändert, so dass in der transfizierten Zelle keine funktionsfähigen infektiösen Partikel gebildet werden. Trotz dieser Vorsichtsmaßnahme kann jedoch aufgrund möglicher Rekombinationsereignisse ein gewisses Risiko der unkontrollierten Ausbreitung der eingebrachten gentherapeutisch wirksamen sowie viralen Gene nicht ausgeschlossen werden.
  • Üblicherweise wird die in die Zelle eingebrachte DNA in gewissem Ausmaß in das Genom der transfizierten Zelle integriert. Einerseits kann dieses Phänomen einen erwünschten Effekt ausüben, da hierdurch eine langandauernde Wirkung der eingebrachten DNA erzielt werden kann. Andererseits bringt die Integration in das Genom ein wesentliches Risiko der Gentherapie mit sich. So kann es bspw. zu einer Insertion der eingebrachten DNA in ein intaktes Gen kommen, die wiederum eine Mutation darstellt, welche die Funktion des endogenen Gens behindert oder gar vollkommen ausschaltet. Durch solche Integrationsereignisse können einerseits für die Zelle lebenswichtige Enzymsysteme ausgeschaltet werden, andererseits besteht auch die Gefahr einer Transformation der so veränderten Zelle in einen entarteten Zustand, falls durch die Integration der Fremd-DNA ein für die Regulation des Zellwachstums entscheidendes Gen verändert wird. Daher kann bei der Verwendung von DNA-Viren als Gentherapeutika und Vakzine ein Risiko, bspw. der Krebsbildung, nicht ausgeschlossen werden. In diesem Zusammenhang ist auch zu beachten, dass zur wirksamen Expression der in die Zelle eingebrachten Gene die entsprechenden DNA-Vehikel einen starken Promotor, bspw. den viralen CMV-Promotor, enthalten. Die Integration derartiger Promotoren in das Genom der behandelten Zelle kann zu unerwünschten Veränderungen der Regulierung der Genexpression in der Zelle führen.
  • Ein weiterer Nachteil der Verwendung von DNA als Gentherapeutika und Vakzine ist die Induktion pathogener anti-DNA-Antikörper im Patienten unter Hervorrufung einer möglicherweise tödlichen Immunantwort.
  • Im Gegensatz zu DNA ist der Einsatz von RNA als Gentherapeutikum oder Vakzine als wesentlich sicherer einzustufen. Insbesondere bringt RNA nicht die Gefahr mit sich, stabil in das Genom der transfizierten Zelle integriert zu werden. Des weiteren sind keine viralen Sequenzen, wie Promotoren, zur wirksamen Transkription, erforderlich. Darüber hinaus wird RNA wesentlich einfacher in vivo abgebaut. Wohl aufgrund der gegenüber DNA relativ kurzen Halbwertszeit von RNA im Blutkreislauf sind bisher keine anti-RNA-Antikörper nachgewiesen worden. Daher kann RNA für molekularmedizinische Therapieverfahren als Molekül der Wahl angesehen werden.
  • Allerdings zeigen Expressionssysteme, die auf der Einbringung von Nukleinsäuren in Zellen bzw. in Gewebe des Patienten sowie der anschließenden Expression der dadurch kodierten erwünschten Polypeptide, basieren, unabhängig von der Verwendung von DNA oder RNA, in vielen Fällen nicht das gewünschte oder gar erforderliche Expressionsniveau, um eine effektive Therapie durchführen zu können.
  • Im Stand der Technik wurden bislang verschiedenste Anstrengungen unternommen, die Ausbeute der Proteinexpression von Expressionssystemen in vitro und/oder in vivo zu steigern. Allgemein im Stand der Technik beschriebene Verfahren zur Steigerung der Expression beruhen üblicherweise auf der Verwendung von Expressionskassetten mit bestimmten Promotoren und entsprechend verwendbaren Regulationselementen. Solche Expressionskassetten zeigen aufgrund ihrer Größe (unabhängig vom verwendeten Insert) zumeist deutliche Restriktionen bei der Transfektion. Weiterhin sind Expressionskassetten typischerweise auf bestimmte Zellsysteme beschränkt, so dass in Abhängigkeit der zu therapierenden Zellen neue Expressionssysteme kloniert und in die Zellen transfiziert werden müssen. Zu bevorzugen sind daher primär zunächst solche Nukleinsäuremoleküle, die unabhängig von auf Expressionskassetten eingebrachten Promotoren und Regulationselementen die kodierten Proteine in einer Zielzelle durch zelleigene Systeme exprimieren können.
  • So beschreibt bspw. DE 101 19 005 (Roche Diagnostics GmbH) Verfahren zur Proteinexpression auf Basis von DNA Molekülen, wobei durch verschiedene Maßnahmen eine Verbesserung der Stabilität der linearen kurzen DNA erzielt wird und damit in der Folge eine verbesserte Expression aufgrund verminderten Abbaus durch Exonukleasen stattfindet. So wird in DE 101 19 005 der Einbau von Exonuklease-resistenten Nukleotidanaloga oder anderen Molekülen am 3'-Ende der linearen kurzen DNA beschrieben. Daneben werden in DE 101 19 005 die Bindung von großen Molekülen an den Enden der linearen kurzen DNA beschrieben, wie z.B. Biotin, Avidin oder Streptavidin. Letztendlich können in DE 101 19 005 auch Exonukleasen durch die Zugabe von kompetitiven oder nicht-kompetitiven Inhibitoren inaktiviert bzw. inhibiert werden. Allerdings beschreibt DE 101 19 005 eine Steigerung der Expression des Proteins ausschließlich durch Verbesserung der Stabilität der eingesetzten linearen kurzen DNA. DE 101 19 005 zeigt jedoch keine Modifikationen für RNA.
  • Im Stand der Technik sind zudem einige Maßnahmen vorgeschlagen worden, um die Stabilität von RNA zu erhöhen und dadurch ihren Einsatz als Gentherapeutikum bzw. RNA-Vakzine zu ermöglichen.
  • In EP-A-1083232 wird bspw. zur Lösung des Problems der Instabilität von RNA ex vivo ein Verfahren zur Einbringung von RNA, insbesondere mRNA, in Zellen und Organismen vorgeschlagen, bei welchem die RNA in Form eines Komplexes mit einem kationischen Peptid oder Protein vorliegt.
  • Alternativ beschreibt WO 99/14346 Verfahren zur Stabilisierung von mRNA, insbesondere Modifizierungen der mRNA, welche die mRNA-Spezies gegenüber dem Abbau von RNasen stabilisieren. Derartige Modifikationen betreffen einerseits die Stabilisierung durch Sequenz-Modifikationen, insbesondere die Verminderung des C- und/oder U-Gehalts durch Baseneliminierung oder Basensubstitution. Andererseits werden chemische Modifikationen, wie bspw. die Verwendung von Nukleotidanaloga, sowie 5'- und 3'-Blockierungsgruppen, eine erhöhte Länge des Poly-A-Schwanzes sowie die Komplexierung der mRNA mit stabilisierenden Mitteln und Kombinationen der genannten Maßnahmen vorgeschlagen, ohne jedoch eine Steigerung der Expression von den durch die mRNAs kodierten Proteinen zu erreichen.
  • In den US-Patenten US 5,580,859 und US 6,214,804 werden unter anderem im Rahmen der "transienten Gentherapie" (TGT) mRNA-Vakzine und -Therapeutika offenbart. Es werden verschiedene Maßnahmen zur Erhöhung der Translationseffizienz und der mRNA-Stabilität beschrieben, die sich vor allem auf die nicht-translatierten Sequenzbereiche beziehen. Solche Modifikationen erfordern jedoch einen Expressionsvektor, der im Vergleich zur translatierten mRNA-Sequenz eine verhältnismäßig lange nicht-translatierte Sequenz aufweist. Dies vergrößert jedoch den Expressionsvektor erheblich und verschlechtert ggf. dadurch die Transfektion. Weiterhin zeigen die in US 5,580,859 und US 6,214,804 beschriebenen Sequenzen keinerlei gesteigerte Expression der dadurch kodierten Proteine.
  • Optimierte mRNAs werden auch in der Anmeldung WO 02/098443 (CureVac GmbH) beschrieben. So beschreibt WO 02/098443 in allgemeiner Form stabilisierte und für die Translation in ihren kodierenden Bereichen optimierte mRNAs und zeigt bspw. ein Verfahren zur Ermittlung von Sequenz-Modifikationen. WO 02/098443 beschreibt weiterhin für mRNA-Sequenzen Möglichkeiten der Substitution von Adenosin- und Uracil-Nukleotiden zur Erhöhung des G/C-Gehaltes dieser Sequenzen. Gemäß WO 02/098443 können solche Substitutionen und Anpassungen zur Erhöhung des G/C-Gehaltes bei gentherapeutischen Anwendungen wie auch im Fall der Verwendung als genetische Vakzine zur Behandlung von Krebs eingesetzt werden. Als Basissequenz für diese Modifikationen nennt WO 02/098443 allgemein Sequenzen, in denen die modifizierte mRNA für mindestens ein biologisch wirksames Peptid oder Polypeptid kodiert, welches in dem zu behandelnden Patienten bspw. nicht nur unzureichend oder fehlerhaft gebildet wird. Alternativ werden in WO 02/098443 als Basissequenz für solche Modifikationen für ein Krebsantigen kodierende mRNAs vorgeschlagen. WO 02/098443 beschreibt jedoch keine konkreten Sequenzen oder entsprechende, auf konkreten Sequenzen beruhende modifizierte Sequenzen, die z.B. bei gentherapeutischen Anwendungen wie auch im Fall der Verwendung als genetische Vakzine, zur Behandlung von Tumoren oder Krebserkrankungen oder zur Behandlung von Infektionskrankheiten geeignet sind. Darüber hinaus zeigen die in der WO 02/098443 beschriebenen Modifikationen von mRNAs keine Steigerung der Expression der entsprechend kodierten Proteine.
  • Weiterhin zeigt sich oftmals bei vielen Verfahren im Stand der Technik, dass Modifikationen erst durch aufwendige und zumeist teure Verfahren in Gensequenzen eingeführt werden müssen, z.B. mittels Austausch von Nukleotiden in Nukleinsäuresequenzen mittels Nukleinsäuresynthesen mit Hilfe von DNA/RNA-Synthesegeräten, etc.. Dies steigert im Allgemeinen die Kosten sowohl für die Untersuchung der Stabilität und der Expression von modifizierten Gensequenzen als auch für deren in vitro- oder in vivo-Verwendung zur Expression der dadurch kodierten Poteine.
  • Zusammenfassend zeigt der Stand der Technik damit außer der Verwendung von DNA-Expressionsvektoren kein zielgerichtetes Verfahren oder Verwendungen, die die Expression von Proteinen ausgehend von RNA-Template-Molekülen in vitro oder in vivo bei einem vernünftigen Kosten-/Nutzen-Verhältnis und gleichzeitiger größtmöglicher Variabilität der Reaktion bewußt steigern. Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren sowie Verwendungen zur Gentherapie und genetischen Vakzinierung bereitzustellen, die die Nachteile des Einsatzes von DNA als Gentherapeutikum oder Vakzine vermeiden und dennoch auf der Basis von mRNA eine gesteigerte Proteinexpression im Zielzellsystem erreichen.
  • Diese Aufgabe wird durch Verwendung einer Basen-modifizierten RNA-Sequenz zur Steigerung der Expression eines Proteins gelöst, wobei die Basen-modifizierte RNA-Sequenz mindestens eine Basen-Modifikation aufweist und ein Protein kodiert.
  • Eine erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA umfasst im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung jede RNA, die ein Protein kodiert. Die erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA kann einzelsträngig oder doppelsträngig, linear oder zirkulär sein oder als mRNA vorliegen. Besonders bevorzugt liegt die erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA als einzelsträngige RNA vor, noch stärker bevorzugt als mRNA. Das durch die erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA kodierte Protein kann im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung aus allen Proteinen ausgewählt werden, z.B. aus allen rekombinant erzeugten oder natürlich auftretenden Proteinen, die einem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt sind und für therapeutische Zwecke, für diagnostische oder für Forschungszwecke eingesetzt werden. Ohne darauf beschränkt zu sein, umfassen solche Proteine u.a. Wachstumshormone oder Wachstumsfaktoren, z.B. zur Förderung des Wachstums in einem (transgenen) Lebewesen, wie z.B. TGFα und den IGFs („Insuline like growth factors"), Proteine, die den Metabolismus und/oder die Hämatopoese beeinflussen, wie z.B. α-anti-Trypsin, LDL-Rezeptor, Erythropoietin (EPO), Insulin, GATA-1, etc., oder Proteine, wie z.B. die Faktoren VIII und XI des Blutgerinnungssystems, etc.. Solche Proteine umfassen weiterhin Enzyme, wie z.B. β-Galactosidase (lacZ), DNA Restriktionsenzyme (z.B. EcoRI, HindIII, etc.), Lysozyme, etc., oder Proteasen, wie z.B. Papain, Bromelain, Keratinasen, Trypsin, Chymotrypsin, Pepsin, Rennin (Chymosin), Suizym, Nortase, etc., und Protease-Inhibitoren (z.B. zur Behandlung von HIV-Infektionen), wie z.B. Protease-Inhibitoren, ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus Abacavirsulfat, AG1776, Amprenavir (141W94 oder VX-478), Atazanavir (BMS-232632), Cathepsin S Proteaseinhibitor, D1927, D9120, Efavirenz, Emtricitabin, Enfuvirtide (T-20), Fosamprenavir (GW-433908 oder VX-175), GS 9005, GW640385 (VX-385), HCV Proteaseinhibitor, Indinavir (MK-639), L-756, 423, Levoprin-ZG, Lopinavir (ABT-378), Lopinavir/Ritonavir (LPV ABT-378/r), MK-944A, Mozenavir (DMP450), Nelfinavir (AG-1343), Nevirapin, P-1946, PL-100, Prinomastat, Ritonavir (ABT-538), RO033-4649, TMC114, Saquinavir (Ro-31-8959), Tenofovirdisoproxilfumarate, Tipranavir (PNU-140690), TLK 19781, TMC-114, Vertex 385, VX-950. Durch die erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA kodierte Proteine können ebenfalls Proteine umfassen, die die Signalweiterleitung der Zelle stimulieren oder inhibieren, z.B. Cytokine, etc.. Solche Proteine, umfassen daher bspw. auch Cytokine der Klasse I der Cytokinfamilie, die 4 positionsmäßig konservierte Cysteinreste (CCCC) und eine konserviertes Sequenzmotiv Trp-Ser-X-Trp-Ser (WSXWS) aufweisen, wobei X eine nicht-konservierte Aminosäure darstellt. Cytokine der Klasse I der Cytokinfamilie umfassen die GM-CSF Unterfamilie, z.B. IL-3, IL-5, GM-CSF, die IL-6-Unterfamilie, z.B. IL-6, IL-11, IL-12, oder die IL-2-Unterfamilie, z.B. IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, etc., oder die Cytokine IL-1α, IL-1β, IL-10 etc.. Analog können solche Proteine auch Cytokine der Klasse II der Cytokinfamilie (Interferon-Rezeptor-Familie) umfassen, die ebenfalls 4 positionsmäßig konservierte Cysteinreste (CCCC), jedoch kein konserviertes Sequenzmotiv Trp-Ser-X-Trp-Ser (WSXWS), aufweisen. Cytokine der Klasse II der Cytokinfamilie umfassen z.B. IFN-α, IFN-β, IFN-γ, etc.. Hier durch die erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA kodierte Proteine können weiterhin auch Cytokine der Tumor-Nekrose-Familie umfassen, z.B. TNF-α, TNF-β, TNF-RI, TNF-RII, CD40, Fas, etc., oder Cytokine der Chemokin-Familie, die 7 Transmembran-Helices aufweisen und mit G-Protein interagieren, z.B. IL-8, MIP-1, RANTES, CCR5, CXR4, etc.. Solche Proteine können auch aus Apoptose-Faktoren oder Apoptose-verwandten oder -verknüpften Proteinen ausgewählt werden, einschließlich AIF, Apaf z.B. Apaf-1, Apaf-2, Apaf-3, oder APO-2 (L), APO-3 (L), Apopain, Bad, Bak, Bax, Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-xS, bik, CAD, Calpain, Caspasen z.B. Caspase-1, Caspase-2, Caspase-3, Caspase-4, Caspase-5, Caspase-6, Caspase-7, Caspase-8, Caspase-9, Caspase-10, Caspase-11, ced-3, ced-9, c-Jun, c-Myc, crm A, Cytochrom C, CdR1, DcR1, DD, DED, DISC, DNA-PKCS, DR3, DR4, DR5, FADD/MORT-1, FAK, Fas (Fas-Ligand CD95/fas (Rezeptor)), FLICE/MACH, FLIP, Fodrin, fos, G-Actin, Gas-2, Gelsolin, Granzyme A/B, ICAD, ICE, JNK, Lamin A/B, MAP, MCL-1, Mdm-2, MEKK-1, MORI-1, NEDD, NF-κB, NuMa, p53, PAK-2, PARP, Perforin, PITSLRE, PKCδ, pRb, Presenilin, prICE, RAIDD, Ras, RIP, Sphingomyelinase, Thymidinkinase aus Herpes simplex, TRADD, TRAF2, TRAIL, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, Transglutaminase, etc.. Hier durch die erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA kodierte Proteine können auch aus Antigenen ausgewählt werden, z.B. aus tumorspezifischen Oberflächenantigenen (TSSA), z.B. 5T4, α5β1-Integrin, 707-AP, AFP, ART-4, B7H4, BAGE, β-Catenin/m, Bcr-abl, MN/C IX-Antigen, CA125, CAMEL, CAP-1, CASP-8, β-Catenin/m, CD4, CD19, CD20, CD22, CD25, CDC27/m, CD 30, CD33, CD52, CD56, CD80, CDK4/m, CEA, CT, Cyp-B, DAM, EGFR, ErbB3, ELF2M, EMMPRIN, EpCam, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV- E7, HSP70-2M; HAST-2, hTERT (oder hTRT), iCE, IGF-1R, IL-2R, IL-5, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MACE, MART-1/Melan-A, MART-2/Ski, MC1R, Myosin/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, PAP, Proteinase-3, p190 minor bcr-abl, Pml/RARα, PRAME, PSA, PSM, PSMA, RAGE, RU1 oder RU2, SAGE, SART-1 oder SART-3, Survivin, TEL/AML1, TGFβ, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, VEGF und WT1, oder aus Sequenzen, wie z.B. NY-Eso-1 oder NY-Eso-B. Proteine, die durch die erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA kodiert werden können, umfassen weiterhin auch solche Proteine oder Proteinsequenzen, die zu einem der oben beschriebenen Proteine eine Sequenzidentität von mindestens 80% oder 85%, bevorzugt mindestens 90%, stärker bevorzugt mindestens 95% und am stärksten bevorzugt mindestens 99% aufweisen.
  • Der Begriff "Identität" bedeutet vorliegend, dass die Sequenzen, wie folgt, miteinander verglichen werden. Um die prozentuale Identität zweier Nukleinsäuresequenzen zu bestimmen, können die Sequenzen zunächst zueinander angeordnet werden („alignment"), um nachfolgend einen Vergleich dieser Sequenzen zu ermöglichen. Hierfür können z.B. Lücken in die Sequenz der ersten Nukleinsäuresequenz eingeführt werden und die Nukleotide mit der entsprechenden Position der zweiten Nukleinsäuresequenz verglichen werden. Wenn eine Position in der ersten Nukleinsäuresequenz mit dem gleichen Nukleotid besetzt ist, wie es an einer Position in der zweiten Sequenz der Fall ist, dann sind beide Sequenzen an dieser Position identisch. Die prozentuale Identität zwischen zwei Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl identischer Positionen geteilt durch die Anzahl aller verglichenen Positionen der untersuchten Sequenzen. Wird z.B. für eine bestimmte Nukleinsäure (z.B. eine Nukleinsäure, die für ein Protein, wie zuvor beschrieben, kodiert) im Vergleich zu einer Referenznukleinsäure (z.B. eine Nukleinsäure aus dem Stand der Technik) einer definierten Länge eine spezifische Sequenzidentität angenommen, so wird diese prozentuale Identität relativ in Bezug auf diese Referenznukleinsäure angegeben. Geht man daher bspw. von einer Nukleinsäure aus, die eine Sequenzidentität von 50% zu einer 100-Nukleotide-langen Referenznukleinsäure aufweist, so kann diese Nukleinsäure eine 50-Nukleotide-lange Nukleinsäure darstellen, die vollkommen identisch zu einem 50-Nukleotide-langen Abschnitt der Referenznukleinsäure ist. Sie kann allerdings auch eine 100-Nukleotide-lange Nukleinsäure darstellen, die 50% Identität, d.h. in diesem Fall 50% identische Nukleinsäuren, mit der Referenznukleinsäure über deren gesamte Länge aufweist. Alternativ kann diese Nukleinsäure eine 200-Nukleotide-lange Nukleinsäure sein, die in einem 100-Nukleotide-langen Abschnitt der Nukleinsäure vollkommen identisch zu der 100-Nukleotide-langen Referenznukleinsäure ist. Andere Nukleinsäuren erfüllen selbstverständlich gleichermaßen diese Kriterien. Die für Nukleinsäuren beschriebenen Ausführungen zur Identität gelten gleichermaßen für Proteine oder Peptidsquenzen.
  • Die Bestimmung der prozentualen Identität zweier Sequenzen kann anhand eines mathematischen Algorithmus durchgeführt werden. Ein bevorzugtes, jedoch nicht beschränkendes, Beispiel eines mathematischen Algorithmus, der für den Vergleich zweier Sequenzen herangezogen werden kann, ist der Algorithmus von Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90: 5873-5877. Ein solcher Algorithmus ist in dem NBLAST-Programm integriert, mit dem Sequenzen identifiziert werden können, die eine gewünschte Identität zu den Sequenzen der vorliegenden Erfindung besitzen. Um einen Lücken-Abgleich (auch "gapped alignment"), wie oben beschrieben, zu erhalten, kann das "Gapped BLAST"-Programm verwendet werden, wie in Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res, 25: 3389-3402 beschrieben. Bei der Verwendung von BLAST-und Gapped BLAST-Programmen können die Vorgabe-Parameter des jeweiligen Programms (z.B. NBLAST) verwendet werden. Die Sequenzen können weiter unter Verwendung der Version 9 von GAP (global alignment program) der "Genetic Computing Group", unter Verwendung der Vorgabe-(BLOSUM62) Matrix (values –4 to +11) mit einem Strafwert für die Öffnung einer Lücke von –12 („gap open penalty” für die erste Null einer Lücke) und einem Strafwert für die Erweiterung einer Lücke von –4 (für jede zusätzliche aufeinanderfolgende Null in der Lücke) abgeglichen werden. Nach dem Abgleich (alignment) wird die prozentuale Identität dadurch berechnet, dass die Anzahl an Übereinstimmungen als Prozentanteil der Nukleinsäuren in der beanspruchten Sequenz ausgedrückt wird. Die beschriebenen Verfahren zur Bestimmung der prozentualen Identität zweier Nukleinsäuresequenzen kann entsprechend, falls erforderlich, auch auf Aminosäuresequenzen angewendet werden.
  • Die erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA-Sequenz weist typischerweise mindestens eine Basen-Modifikation auf, die bevorzugt geeignet ist, die Expression des durch die RNA kodierten Proteins signifikant gegenüber der nicht-veränderten, d.h. nativen, RNA-Sequenz zu steigern. Signifikant bedeutet in diesem Fall eine Steigerung der Expression des Proteins gegenüber der Expression der nativen RNA-Sequenz um mindestens 20%, bevorzugt mindestens 30%, 40%, 50% oder 60%, noch stärker bevorzugt um mindestens 70%, 80%, 90% oder gar 100% und am stärksten bevorzugt um mindestens 150%, 200% oder gar 300%. Ein Nukleotid mit einer Basen-Modifikation der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe der Basen-modifizierten Nukleotide, bestehend aus:
    • • 2-Amino-6-Chloropurinribosid-5'-triphosphat
    • • 2-Aminoadenosin-5'-triphosphat
    • • 2-Thiocytidin-5'-triphosphat
    • • 2-Thiouridin-5'-triphosphat
    • • 4-Thiouridin-5'-triphosphat
    • • 5-Aminoallylcytidin-5'-triphosphat
    • • 5-Aminoallyluridin-5'-triphosphat
    • • 5-Bromocytidin-5'-triphosphat
    • • 5-Bromouridin-5'-triphosphat
    • • 5-Iodocytidin-5'-triphosphat
    • • 5-Iodouridin-5'-triphosphat
    • • 5-Methylcytidin-5'-triphosphat
    • • 5-Methyluridin-5'-triphosphat
    • • 6-Azacytidin-5'-triphosphat
    • • 6-Azauridin-5'-triphosphat
    • • 6-Chloropurinribosid-5'-triphosphat
    • • 7-Deazaadenosin-5'-triphosphat
    • • 7-Deazaguanosin-5'-triphosphat
    • • 8-Azaadenosin-5'-triphosphat
    • • 8-Azidoadenosin-5'-triphosphat
    • • Benzimidazol-ribosid-5'-triphosphat
    • • N1-Methyladenosin-5'-triphosphat
    • • N1-Methylguanosin-5'-triphosphat
    • • N6-Methyladenosin-5'-triphosphat
    • • O6-Methylguanosin-5'-triphosphat
    • • Pseudouridin-5'-triphosphat
    • • Puromycin-5'-triphosphat
    • • Xanthosine-5'-triphosphat
  • Besonders bevorzugt werden dabei Nukleotide für Basen-Modifikationen ausgewählt aus der Gruppe von Basen-modifizierten Nukleotiden, bestehend aus 5-Methylcytidin-5'-triphosphat und Pseudouridin-5'-triphosphat.
  • Ohne darauf festgelegt zu sein, führen die Erfinder in diesem Zusammenhang eine Steigerung der Expression des durch die Basen-modifizierte RNA kodierten Proteins u.a. auf die Verbesserung der Stabilisierung von Sekundärstrukturen und ggf. auf die gebildete „starrere" Struktur der RNA und das verstärkte „base stacking" zurück. So ist bspw. für Pseudouridin-5'-triphosphat bekannt, dass dieses natürlich in strukturellen RNAs (tRNA, rRNA und snRNA) in Eukaryonten als auch in Prokaryonten auftritt. Es wird in diesem Zusammenhang angenommen, dass Pseudouridin in rRNA für die Stabilisierung von Sekundärstrukturen notwendig ist. Im Laufe der Evolution hat der Anteil an Pseudouridin in der RNA zugenommen und es konnte überraschenderweise gezeigt werden, dass die Translation von dem Vorhandensein von Pseudouridin in der tRNA und rRNA abhängt, wobei vermutlich dabei die Interaktion zwischen tRNA und mRNA verstärkt wird. Die Umwandlung von Uridin zu Pseudouridin erfolgt posttranskriptionell durch Pseudouridin-Synthase. Bei 5-Methylcytidin-5'-triphosphat erfolgt ebenfalls eine posttranskriptionelle Modifikation von RNA, die durch Methyltransferasen katalysiert wird. Eine weitere Steigerung des Anteils von Pseudouridin sowie die Basen-Modifikation von anderen Nukleotiden führt angenommenerweise zu ähnlichen Effekten, die allerdings im Unterschied zu den natürlich auftretenden gesteigerten Anteilen von Pseudouridin in der Sequenz gezielt und mit wesentlich größerer Variabilität durchgeführt werden können. Für 5-Methylcytidin-5'-triphosphat und die weiteren hier genannten Basen-Modifikationen wird daher ein ähnlicher Mechanismus angenommen wie für Pseudouridin-5'-triphosphat, d.h. eine verbesserte Stabilisierung von Sekundärstrukturen, und darauf basierend eine verbesserte Translationseffizienz. Neben dieser strukturell begründeten Expressionssteigerung wird jedoch auch ein positiver Effekt auf die Translation unabhängig von der Stabilisierung von Sekundärstrukturen und einer „starreren" Struktur der RNA vermutet. Weitere Ursachen der Expressionssteigerung liegen ggf. auch in der geringeren Abbaurate der mRNA-Sequenzen durch RNAsen in vitro oder in vivo begründet.
  • Die Basen-Modifikation(en) der erfindungsgemäß verwendeten RNA kann/können mit Hilfe von Verfahren in die RNA eingebracht werden, die einem Fachmann bekannt sind. In Frage kommen dazu bspw. Syntheseverfahren unter Verwendung von (automatischen oder halbautomatischen) Oligonukleotidsynthesegeräten, biochemische Verfahren, wie z.B. in vitro-Transkriptionsverfahren, etc.. Bevorzugt können in diesem Zusammenhang bei (kürzeren) Sequenzen, die im Allgemeinen eine Länge von 50-100 Nukleotiden nicht überschreiten, Syntheseverfahren unter Verwendung von (automatischen oder halbautomatischen) Oligonukleotidsynthesegeräten als auch in vitro-Transkriptionsverfahren eingesetzt werden. Bei (längeren) Sequenzen, z.B. Sequenzen, die eine Länge von mehr als 50 bis 100 Nukleotiden aufweisen, kommen bevorzugt biochemische Verfahren in Frage, wie bspw. in vitro-Transkriptionsverfahren, bevorzugt ein wie im folgenden beschriebenen erfindungsgemäßes in vitro-Transkriptionsverfahren.
  • Basen-Modifikationen erfindungsgemäß verwendeter Basen-modifizierter RNA-Sequenzen treten typischerweise an mindestens einem (Basen-modifizierbaren) Nukleotid der Basen-modifizierten RNA-Sequenz auf, bevorzugt an mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 (Basen-modifizierbaren) Nukleotiden, stärker bevorzugt an mindestens 10-20 (Basen-modifizierbaren) Nukleotiden, noch stärker bevorzugt an mindestens 10-100 (Basen-modifizierbaren) Nukleotiden und am stärksten bevorzugt an mindestens 10-200 oder mehr (Basen-modifizierbaren) Nukleotiden. Alternativ formuliert treten Basen-Modifikationen bei einer erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA-Sequenz typischerweise an mindestens einem (Basen-modifizierbaren) Nukleotid der Basen-modifizierten RNA-Sequenz auf, bevorzugt an mindestens 10% aller (Basen-modifizierbaren) Nukleotide, stärker bevorzugt an mindestens 25% aller (Basen-modifizierbaren) Nukleotide, noch stärker bevorzugt an mindestens 50% aller (Basen-modifizierbaren) Nukleotide, sogar noch stärker bevorzugt an mindestens 75% aller (Basen-modifizierbaren) Nukleotide und am stärksten bevorzugt an 100% der in der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA-Sequenz enthaltenen (Basen-modifizierbaren) Nukleotide. Ein „Basen-modifizierbares Nukleotid" ist in diesem Zusammenhang jedes (bevorzugt natürlich vorkommende (native) und damit nicht-modifiziertes) Nukleotid, das gegen ein, wie oben beschriebenes, Basen-modifiziertes Nukleotid ausgetauscht werden soll. Dabei können alle Nukleotide der RNA-Sequenz Basen-modifiziert werden oder nur bestimmte ausgewählte Nukleotide der RNA-Sequenz. Sollen alle Nukleotide der RNA-Sequenz Basen-modifiziert werden, so sind 100% der „Basen-modifizierbaren Nukleotide" der RNA-Sequenz alle Nukleotide der verwendeten RNA-Sequenz. Sollen dagegen nur bestimmte ausgewählte Nukleotide der RNA-Sequenz Basen-modifiziert werden, so sind die ausgewählten Nukleotide bspw. Adenosin, Cytidin, Guanosin oder Uridin. So kann bspw. ein Adenosin der nativen Sequenz gegen ein Basen-modifiziertes Adenosin ausgetauscht werden, ein Cytidin gegen ein Basen-modifiziertes Cytidin, ein Uridin gegen ein Basen-modifiziertes Uridin und ein Guanosin gegen ein Basen-modifiziertes Guanosin. In diesem Fall sind 100% der „Basen-modifizierbaren Nukleotide" der RNA-Sequenz 100% der in der verwendeten RNA-Sequenz enthaltenen Adenosine, Cytidine, Guanosine oder Uridine.
  • Erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA-Sequenzen können weiterhin auch Backbone-Modifikationen aufweisen. Eine Backbone-Modifikation im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist eine Modifikation, bei der Phosphate des Rückgrates („Backbone") der in der RNA enthaltenen Nukleotide chemisch modifiziert sind. Solche Backbone-Modifikationen umfassen dabei typischerweise, ohne darauf beschränkt zu sein, Modifikationen aus der Gruppe, bestehend aus Methylphosphonaten, Phosphoramidaten und Phosphorthioaten (z.B. Cytidin-5'-O-(1-thiophosphat)).
    Figure 00140001
    Schema 1: Positionen verschiedener Backbone-Modifikationen
  • Erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA-Sequenzen können ebenfalls auch Zucker-Modifikationen aufweisen. Eine Zucker-Modifikation im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist eine chemische Modifikation des Zuckers der enthaltenen Nukleotide und umfasst, ohne darauf beschränkt zu sein, typischerweise Zucker-Modifikationen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 2'-Deoxy-2'-fluoro-oligoribonucleotid (2'-Fluoro-2'-deoxycytidin-5'-triphosphat, 2'-Fluoro-2'-deoxyuridin-5'-triphosphat), 2'-Deoxy-2'-deamin-oligoribonucleotid (2'-Amino-2'-deoxycytidin-5'-triphosphat, 2'-Amino-2'-deoxyuridin-5'-triphosphat), 2'-O-Alkyloligoribonucleotid, 2'-Deoxy-2'-C-alkyloligoribonucleotid (2'-O-Methylcytidin-5'-triphosphat, 2'-Methyluridin-5'-triphosphat), 2'-C-alkyloligoribonucleotid, und Isomere davon (2'-Aracytidin-5'-triphosphat, 2'-Arauridin-5'-triphosphat), oder Azidotriphosphate (2'-Azido-2'-deoxycytidin-5'-triphosphat, 2'-Azido-2'-deoxyuridin-5'-triphosphat).
    Figure 00150001
    Schema 2: Position verschiedener Zucker-Modifikationen
  • Bevorzugt weist die erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA-Sequenz jedoch keine Zucker-Modifikationen oder Backbone-Modifikationen auf. Dieser bevorzugte Ausschluss liegt in der Problematik begründet, dass bestimmte Backbone-Modifikationen und Zucker-Modifikationen von RNA Sequenzen einerseits deren in vitro-Transkription verhindern oder zumindest stark vermindern können. So funktioniert eine beispielhaft durchgeführte in vitro Transkription von eGFP bspw. nur mit den Zucker-Modifikationen 2'-Amino-2'-deoxyuridin-5'-phosphat, 2'-Fluoro-2'-deoxyuridin-5'-phosphat und 2'-Azido-2'-deoxyuridin-5'-phosphat. Zusätzlich wird durch Backbone-Modifikationen, und, unabhängig davon, durch Zucker-Modifikationen von RNA-Sequenzen, die Translation des Proteins, d.h. die Proteinexpression in vitro bzw. in vivo typischerweise erheblich vermindert. Dies konnte bspw. für eGFP im Zusammenhang mit den oben ausgewählten Backbone-Modifikationen und Zucker-Modifikationen gezeigt werden.
  • Gemäß einer Ausführungsform weist die erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA einen GC-Gehalt auf, der gegenüber der nativen Sequenz verändert wurde. Gemäß einer ersten Alternative der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA ist der G/C-Gehalt für den kodierenden Bereich der Basen-modifizierten RNA größer als der G/C-Gehalt für den kodierenden Bereich der nativen RNA-Sequenz, wobei die kodierte Aminosäuresequenz gegenüber dem Wildtyp, d.h. der durch die native RNA-Sequenz kodierten Aminosäuresequenz, unverändert ist. Dabei spielt die Zusammensetzung und die Abfolge der verschiedenen Nukleotide eine große Rolle. Insbesondere sind Sequenzen mit erhöhtem G(Guanin)/C(Cytosin)-Gehalt stabiler als Sequenzen mit einem erhöhten A(Adenin)/U(Uracil)-Gehalt. Daher werden erfindungsgemäß unter Beibehaltung der translatierten Aminosäureabfolge die Codons gegenüber der Wildtyp-RNA derart variiert, dass sie vermehrt G/C-Nukleotide beinhalten. Da mehrere Codons für ein und dieselbe Aminosäure kodieren (Degeneration des genetischen Codes), können die für die Stabilität günstigsten Codons ermittelt werden (alternative Codonverwendung, engl. "codon usage").
  • In Abhängigkeit von der durch die erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA zu kodierenden Aminosäure sind unterschiedliche Möglichkeiten zur Modifikation der nativen Sequenz der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA möglich. Im Fall von Aminosäuren, die durch Codons kodiert werden, die ausschließlich G- oder C-Nukleotide enthalten, ist keine Modifikation des Codons erforderlich. So erfordern die Codons für Pro (CCC oder CCG), Arg (CGC oder CCG), Ala (GCC oder GCG) und Gly (GGC oder GGG) keine Veränderung, da kein A oder U vorhanden ist.
  • In folgenden Fällen werden die Codons, welche A- und/oder U-Nukleotide enthalten durch Substituieren anderer Codons, welche für die gleichen Aminosäuren kodieren, jedoch kein A und/oder U enthalten, verändert. Beispiele sind:
    Die Codons für Pro können von CCU oder CCA zu CCC oder CCC verändert werden;
    die Codons für Arg können von CGU oder CGA oder AGA oder AGG zu CGC oder CGG verändert werden;
    die Codons für Ala können von GCU oder GCA zu GCC oder GCG verändert werden;
    die Codons für Gly können von GGU oder GGA zu GGC oder GGG verändert werden.
  • In anderen Fällen können A- bzw. U-Nukleotide zwar nicht aus den Codons eliminiert werden, es ist jedoch möglich, den A- und U-Gehalt durch Verwendung von Codons zu vermindern, die weniger A- und/oder U-Nukleotide enthalten. Zum Beispiel:
    Die Codons für Phe können von UUU zu UUC verändert werden;
    die Codons für Leu können von UUA, CUU oder CUA zu CUC oder CUG verändert werden;
    die Codons für Ser können von UCU oder UCA oder AGU zu UCC, UCG oder AGC verändert werden;
    das Codon für Tyr kann von UAU zu UAC verändert werden;
    das Stop-Codon UAA kann zu UAG oder UGA verändert werden;
    das Codon für Cys kann von UGU zu UGC verändert werden;
    das Codon His kann von CAU zu CAC verändert werden;
    das Codon für Gln kann von CAA zu CAG verändert werden;
    die Codons für Ile können von AUU oder AUA zu AUC verändert werden;
    die Codons für Thr können von ACU oder ACA zu ACC oder ACG verändert werden;
    das Codon für Asn kann von AAU zu AAC verändert werden;
    das Codon für Lys kann von AAA zu AAG verändert werden;
    die Codons für Val können von GUU oder GUA zu GUC oder GUG verändert werden;
    das Codon für Asp kann von GAU zu GAC verändert werden;
    das Codon für Glu kann von GAA zu GAG verändert werden.
  • Im Falle der Codons für Met (AUG) und Trp (UGG) besteht hingegen keine Möglichkeit der Sequenz-Modifikation.
  • Die vorstehend aufgeführten Substitutionen können selbstverständlich einzeln aber auch in allen möglichen Kombinationen zur Erhöhung des G/C-Gehalts der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA gegenüber der nativen RNA-Sequenz (bzw. Nukleinsäuresequenz) verwendet werden. So können beispielsweise alle in der nativen RNA-Sequenz auftretenden Codons für Thr zu ACC (oder ACG) verändert werden. Vorzugsweise werden jedoch Kombinationen der vorstehenden Substitutionsmöglichkeiten genutzt, z.B.:
    Substitution aller in der nativen RNA-Sequenz für Thr kodierenden Codons zu ACC (oder ACG) und Substitution aller ursprünglich für Ser kodierenden Codons zu UCC (oder UCG oder AGC);
    Substitution aller in der nativen RNA-Sequenz für Ile kodierenden Codons zu AUC- und Substitution aller ursprünglich für Lys kodierenden Codons zu AAG und Substitution aller ursprünglich für Tyr kodierenden Codons zu UAC;
    Substitution aller in der nativen RNA-Sequenz für Val kodierenden Codons zu GUC (oder GUG) und Substitution aller ursprünglich für Glu kodierenden Codons zu GAG und Substitution aller ursprünglich für Ala kodierenden Codons zu GCC (oder GCG) und Substitution aller ursprünglich für Arg kodierenden Codons zu CGC (oder CGG);
    Substitution aller in der nativen RNA-Sequenz für Val kodierenden Codons zu GUC (oder GUG) und Substitution aller ursprünglich für Glu kodierenden Codons zu GAG und Substitution aller ursprünglich für Ala kodierenden Codons zu GCC (oder GCG) und Substitution aller ursprünglich für Gly kodierenden Codons zu GGC (oder GGG) und Substituion aller ursprünglich für Asn kodierenden Codons zu AAC;
    Substitution aller in der nativen RNA-Sequenz für Val kodierenden Codons zu GUC (oder GUG) und Substitution aller usprünglich für Phe kodierenden Codons zu UUC und Substitution aller ursprünglich für Cys kodierenden Codons zu UGC und Substitution aller ursprünglich für Leu kodierenden Codons zu CUG (oder CUC) und Substitution aller ursprünglich für Gln kodierenden Codons zu CAG und Substitution aller ursprünglich für Pro kodierenden Codons zu CCC (oder CCG);
    usw..
  • Bevorzugt wird der G/C-Gehalt des kodierenden Bereichs der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA gegenüber dem G/C-Gehalt des kodierenden Bereichs der nativen RNA derart erhöht dass mindestens 5%, mindestens 10%, mindestens 15%, mindestens 20%, mindestens 25% oder stärker bevorzugt mindestens 30%, mindestens 35%, mindestens 40%, mindestens 45%, mindestens 50% oder mindestens 55%, noch stärker bevorzugt mindestens 60%, mindestens 65%, mindestens 70% oder mindestens 75% und am stärksten bevorzugt mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95% oder mindestens 100% der möglichen modifizierbaren Codons des kodierenden Bereichs der nativen RNA (bzw. Nukleinsäure) modifiziert sind.
  • Besonders bevorzugt ist es in diesem Zusammenhang, den G/C-Gehalt der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA, insbesondere im kodierenden Bereich, im Vergleich zur nativen RNA-Sequenz maximal zu erhöhen.
  • Eine zweite Alternative der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA beruht auf der Erkenntnis, dass die Translationseffizienz der RNA auch durch eine unterschiedliche Häufigkeit im Vorkommen von tRNAs in Zellen bestimmt wird. Sind daher in einer RNA-Sequenz vermehrt sogenannte "seltene" Codons vorhanden, so wird die entsprechende RNA deutlich schlechter translatiert als in dem Fall, wenn für relativ "häufige" tRNAs kodierende Codons vorhanden sind.
  • Gemäß dieser zweiten Alternative der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA ist daher der kodierende Bereich der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA gegenüber dem kodierenden Bereich der nativen RNA derart verändert, dass mindestens ein Codon der nativen RNA, das für eine in der Zelle relativ seltene tRNA kodiert, gegen ein Codon ausgetauscht ist, das für eine in der Zelle relativ häufige tRNA kodiert, welche die gleiche Aminosäure trägt wie die relativ seltene tRNA.
  • Durch diese Modifikation wird die erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA-Sequenz derart modifiziert, dass Codons eingefügt werden, für die häufig vorkommende tRNAs zur Verfügung stehen. Welche tRNAs relativ häufig in der Zelle vorkommen und welche demgegenüber relativ selten sind, ist einem Fachmann bekannt; vgl. bspw. Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev. 2001, 11(6): 660-666.
  • Durch diese Modifikation können erfindungsgemäß alle Codons der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA-Sequenz, die für eine in der Zelle relativ seltene tRNA kodieren, jeweils gegen ein Codon ausgetauscht werden, das für eine in der Zelle relativ häufige tRNA kodiert, welche jeweils die gleiche Aminosäure trägt wie die relativ seltene tRNA.
  • Besonders bevorzugt ist es, den in der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA erhöhten, insbesondere maximalen, sequenziellen G/C-Anteil mit den "häufigen" Codons zu verknüpfen, ohne die durch die erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA kodierte Aminosäuresequenz zu verändern. Diese bevorzugte Ausführungsform stellt eine besonders effizient translatierte und stabilisierte erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA (bspw. für eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung) bereit.
  • In den Sequenzen eukaryotischer RNAs gibt es typischerweise destabilisierende Sequenzelemente (DSE), an welche Signalproteine binden und den enzymatischen Abbau der RNA in vivo regulieren. Daher werden zur weiteren Stabilisierung der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA gegebenenfalls in dem für das Protein kodierenden Bereich eine oder mehr Veränderungen gegenüber dem entsprechenden Bereich der nativen RNA vorgenommen, so dass keine destabilisierenden Sequenzelemente enthalten sind. Selbstverständlich ist es erfindungsgemäß ebenfalls bevorzugt, gegebenenfalls in den nicht-translatierten Bereichen (3'- und/oder 5'-UTR) vorhandene DSE aus der RNA zu eliminieren.
  • Derartige destabilisierende Sequenzen sind bspw. AU-reiche Sequenzen ("AURES"), die in 3'-UTR-Abschnitten zahlreicher instabiler RNA vorkommen (Caput et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 83: 1670 bis 1674). Die erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA ist daher vorzugsweise derart gegenüber der nativen RNA verändert, dass diese keine derartigen destabilisierenden Sequenzen mehr aufweist. Dies gilt auch für solche Sequenzmotive, die von möglichen Endonukleasen erkannt werden, bspw. die Sequenz GAACAAG, die im 3' UTR-Segment des für den Transferrin-Rezeptor kodierenden Gens enthalten ist (Binder et al., EMBO J. 1994, 13: 1969 bis 1980). Auch diese Sequenzmotive werden bevorzugt in der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA eliminiert.
  • Einem Fachmann sind verschiedene Verfahren geläufig, die vorliegend zur Substitution von Codons in RNAs geeignet sind, d.h. zur Substitution von Codons in der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA. Im Falle kürzerer kodierender Bereiche (die für biologisch wirksame oder antigene Peptide kodieren) kann bspw. die gesamte erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA chemisch unter Verwendung von Standardtechniken synthetisiert werden, wie sie einem Fachmann geläufig sind.
  • Bevorzugt werden allerdings Basensubstitutionen unter Verwendung einer DNA-Matrize zur Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA mit Hilfe von Techniken der gängigen zielgerichteten Mutagenese eingeführt (siehe bspw. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory Press, 3. Aufl., Cold Spring Harbor, NY, 2001). Bei diesem Verfahren wird zur Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA daher ein entsprechendes DNA-Molekül in vitro transkribiert (s.u.). Diese DNA-Matrize besitzt ggf. einen geeigneten Promotor, bspw. einen T3, T7- oder SP6-Promotor, für die in vitro-Transkription, dem die gewünschte Nukleotidsequenz für die herzustellende Basen-modifizierte RNA und ein Termisationssignal für die in in vitro-Transkription folgen. Das DNA-Molekül, das die Matrize des herzustellenden Basen-modifizierten RNA-Konstrukts bildet, kann dann durch fermentative Vermehrung und anschließende Isolierung als Teil eines in Bakterien replizierbaren Plasmids hergestellt werden. Als dafür geeignete Plasmide können bspw. die Plasmide pT7Ts (GenBank-Zugriffsnummer U26404; Lai et al., Development 1995, 121: 2349 bis 2360), pGEM®-Reihe, bspw. pGEM®-1 (GenBank-Zugriffsnummer X65300; von Promega) und pSP64 (GenBank-Zugriffsnummer X65327) genannt werden; vgl. auch Mezei und Storts, Purification of PCR Products, in: Griffin und Griffin (Hrsg.), PCR Technology: Current Innovation, CRC Press, Boca Raton, FL, 2001.
  • Es kann so unter Verwendung kurzer synthetischer DNA-Oligonukleotide, die an den entstehenden Schnittstellen kurze einzelsträngige Übergänge aufweisen, oder durch chemische Synthese hergestellte Gene, die gewünschte Nukleotidsequenz nach einem Fachmann geläufigen molekularbiologischen Methoden in ein geeignetes Plasmid kloniert werden (vgl. Maniatis et al., (2001) supra). Das DNA-Molekül wird dann aus dem Plasmid, in welchem es in einfacher oder mehrfacher Kopie vorliegen kann, durch Verdauung mit Restriktionsendonukleasen ausgeschnitten.
  • Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA darüber hinaus eine 5'-Cap-Struktur (ein modifiziertes Guanosin-Nukleotid) aufweisen. Ms Beispiele von Cap-Strukturen können, ohne darauf festgelegt zu sein, m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A und G(5')ppp(5')G genannt werden.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA einen Poly-A-Schwanz von mindestens etwa 50 Nukleotiden, bevorzugt von mindestens etwa 70 Nukleotiden, stärker bevorzugt von mindestens etwa 100 Nukleotiden und noch stärker bevorzugt von mindestens etwa 200 Nukleotiden.
  • Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA einen Poly-C-Schwanz von mindestens etwa 20 Nukleotiden, bevorzugt von mindestens etwa 30 Nukleotiden, stärker bevorzugt von mindestens etwa 40 Nukleotiden und noch stärker bevorzugt von mindestens etwa 50 Nukleotiden.
  • Die erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA, wie zuvor beschrieben, kann gemäß einer weiteren Ausführungsform weiterhin einen Nukleinsäureabschnitt enthalten, der einen Tag zur Aufreinigung kodiert. Solche Tags umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, z.B. einen Hexahistidin-Tag (HIS-Tag, Polyhistidin-Tag), einen Streptavidin-Tag (Strep-Tag), einen SBP-Tag (Streptavidin-Bindungs-Tag), einen GST (Glutathion-S-Transferase)-Tag, etc.. Weiterhin kann die Basen-modifizierte RNA einen Tag für die Aufreinigung über ein Antikörper-Epitop kodieren (Antikörper-Bindungs-Tag), z.B. einen Myc-Tag, ein Swa11-Epitop, einen FLAG-Tag, einen HA-Tag, etc., d.h. über Erkennung des Epitops über den (immobilisierten) Antikörper.
  • Für eine effiziente Translation von RNA, insbesondere mRNA, ist weiterhin eine wirksame Bindung der Ribosomen an die Ribosomen-Bindungsstelle (Kozak-Sequenz: GCCGCCACCAUGG (SEQ ID NO: 1), das AUG bildet das Startcodon) erforderlich. Diesbezüglich ist festgestellt worden, dass ein erhöhter A/U-Gehalt um diese Stelle herum eine effizientere Ribosomen-Bindung an die mRNA ermöglicht. Daher kann, gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA einen um die Ribosomen-Bindungsstelle erhöhten A/U-Gehalt aufweisen, bevorzugt einen um 5 bis 50%, stärker bevorzugt einen um 25 bis 50% oder mehr erhöhten A/U-Gehalt, gegenüber der nativen RNA.
  • Des weiteren ist es gemäß einer Ausführungsform der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA möglich, in die RNA eine oder mehr sog. IRES (engl. "internal ribosomal entry side) einzufügen. Eine IRES kann so als alleinige Ribosomen-Bindungsstelle fungieren, sie kann jedoch auch zur Bereitstellung einer erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA dienen, die für mehrere Proteine kodiert, die unabhängig voneinander durch die Ribosomen translatiert werden sollen ("multicistronische RNA"). Beispiele erfindungsgemäß verwendbarer IRES-Sequenzen sind diejenigen aus Picornaviren (z.B. FMDV), Pestviren (CFFV), Polioviren (PV), Enzephalo-Myocarditis-Viren (ECMV), Maul-und-Klauenseuche-Viren (FMDV), Hepatitis-C-Viren (HCV), Klassisches-Schweinefieber-Viren (CSFV), Murines-Leukoma-Virus (MLV), Simean-Immundefizienz-Viren (SIV) oder Cricket-Paralysis-Viren (CrPV).
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA in den 5'- und/oder 3'- nicht translatierten Bereichen Stabilisierungssequenzen auf, die befähigt sind, die Halbwertszeit der RNA im Cytosol zu erhöhen. Diese Stabilisierungssequenzen können eine 100%ige Sequenzhomologie zu natürlich vorkommenden Sequenzen, die in Viren, Bakterien und Eukaryoten auftreten, aufweisen, können aber auch teilweise oder vollständig synthetischer Natur sein. Als Beispiel für stabilisierende Sequenzen, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, können die nicht-translatierten Sequenzen (UTR) des β-Globingens, bspw. von Homo sapiens oder Xenopus laevis, genannt werden. Ein anderes Beispiel einer Stabilisierungssequenz weist die allgemeine Formel (C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC (SEQ ID NO: 2) auf, die im 3'UTR der sehr stabilen RNA enthalten ist, die für α-Globin, α-(I)-Collagen, 15-Lipoxygenase oder für Tyrosin-Hydroxylase kodiert (vgl. Holcik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 2410 bis 2414). Selbstverständlich können derartige Stabilisierungssequenzen einzeln oder in Kombination miteinander als auch in Kombination mit anderen, einem Fachmann bekannten Stabilisierungssequenzen verwendet werden.
  • Des weiteren kann in einer bevorzugten Ausführungsform der wirksame Transfer der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA in die zu behandelnden Zellen bzw. den zu behandelnden Organismus dadurch verbessert werden, dass die erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA mit einem kationischen Peptid oder Protein assoziiert ist oder daran gebunden ist. Insbesondere ist dabei die Verwendung von Protamin, Histon, Spermin oder Nukleolin oder Derivaten dieser Sequenzen, die die basische Nukleinsäure-Bindungssequenz enthält, als polykationischem, Nukleinsäure-bindenden Protein besonders wirksam. Des weiteren ist die Verwendung anderer kationischer Peptide oder Proteine, wie Poly-L-Lysin oder Histonen, ebenfalls möglich. Diese Vorgehensweise zur Stabilisierung der modifizierten RNA ist bspw. in EP-A-1083232 beschrieben, deren diesbezüglicher Offenbarungsgehalt in die vorliegende Erfindung vollumfänglich eingeschlossen ist.
  • Darüber hinaus kann gemäß einer bevorzugten Ausführungsform die erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA neben dem für das Protein kodierenden Abschnitt auch mindestens einen weiteren funktionalen Abschnitt enthalten, der bspw. für ein die Immunantwort förderndes Cytokin (Monokin, Lymphokin, Interleukin oder Chemokin, wie IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, INF-α, IFN-β, INF-γ, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-β oder TNF-α, Wachstumsfaktoren, wie hGH, kodiert.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA zusätzlich zu dem wie oben beschriebenen Protein ein sekretorisches Signalpeptid kodieren. Solche Signalpeptide sind (Signal-)Sequenzen, die üblicherweise eine Länge von 15 bis 30 Aminosäuren umfassen und bevorzugt am N-Terminus des kodierten Peptids lokalisiert sind. Signalpeptide ermöglichen typischerweise den Transport eines damit fusionierten Proteins (hier z.B. eines therapeutisch wirksamen Proteins), in ein definiertes zelluläres Kompartiment, bevorzugt die Zelloberfläche, das endoplasmatische Reticulim oder das endosomal-lysosomale Kompartiment. Beispiele erfindungsgemäß verwendbarer Signalsequenzen sind z. B. Signalsequenzen von klassischen und nicht klassischen MHC-Molekülen, Cytokinen, Immunglobulinen, der invarianten Kette, Lamp1, Tapasin, Erp57, Calretikulin und Calnexin, sowie aller weiteren membranständigen, endosomal-lysosomal- oder endoplasmatisches Restikulum-assozierten Proteine. Bevorzugt wird das Signalpepid des humanen MHC-Klasse-I-Moleküls HLA-A*0201 verwendet.
  • Jede der oben genannten Ausführungsformen der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA kann miteinander in geeigneter Weise kombiniert werden. Die Ermittlung der optimalen erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA kann durch dem Fachmann bekannte Verfahren durchgeführt werden, z.B. manuell und/oder mittels eines automatisierten Verfahrens, wie gemäß WO 02/098443 offenbart. Dabei kann die Adaptierung der RNA-Sequenzen mit den oben beschriebenen zusätzlichen unterschiedlichen Optimierungszielen durchgeführt werden: Zum einen mit größtmöglichen G/C-Gehalt, zum anderen unter bestmöglicher Berücksichtigung der Häufigkeit der tRNAs gemäß Codon Usage. Im ersten Schritt des Verfahrens wird eine virtuelle Translation einer beliebigen RNA (oder DNA)-Sequenz durchgeführt, um die entsprechende Aminosäuresequenz zu generieren. Ausgehend von der Aminosäuresequenz wird eine virtuelle reverse Translation durchgeführt, die aufgrund des degenerierten genetischen Codes Wahlmöglichkeiten für die entsprechenden Codons liefert. Je nach geforderter Optimierung bzw. Modifizierung werden zur Auswahl der geeigneten Codons entsprechende Selektionslisten und Optimierungsalgorithmen verwendet. Die Ausführung der Algorithmen erfolgt typischerweise mit Hilfe einer geeigneten Software auf einem Computer. So wird die optimierte RNA-Sequenz erstellt und kann bspw. mit Hilfe einer entsprechenden Anzeigevorrichtung ausgegeben und mit der ursprünglichen (Wildtyp-)Sequenz verglichen werden. Das gleiche gilt auch für die Häufigkeit der einzelnen Nukleotide. Die Änderungen gegenüber der ursprünglichen Nukleotidsequenz werden dabei vorzugsweise hervorgehoben. Weiter werden gemäß einer bevorzugten Ausführungsform in der Natur bekannte stabile Sequenzen eingelesen, welche die Grundlage für eine gemäß natürlichen Sequenzmotiven stabilisierte RNA bieten können. Es kann ebenfalls eine Sekundärstrukturanalyse vorgesehen werden, die anhand von Strukturberechnungen stabilisierende und destabilisierende Eigenschaften bzw. Bereiche der RNA analysieren kann.
  • Eine erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA weist bevorzugt eine Länge von 50 bis 15000 Nukleotiden auf, stärker bevorzugt eine Länge von 50 bis 10000 Nukleotiden auf, noch stärker bevorzugt eine Länge von eine Länge von 500 bis 10000 Nukleotiden auf und am stärksten bevorzugt eine Länge von 500 bis 5000 Nukleotiden auf.
  • Gemäß einer besonderen Ausführungsform kann die erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA eine Lipid-Modifizierung aufweisen. Eine solche, mit einem Lipid modifizierte RNA besteht typischerweise aus einer, wie oben definierten, erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA, mindestens einem mit dieser RNA kovalent verknüpften Linker und mindestens einem mit dem jeweiligen Linker kovalent verknüpften Lipid. Alternativ besteht die mit einem Lipid modifizierte erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA aus (mindestens) einer, wie oben definierten, erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA und mindestens einem mit dieser RNA kovalent verknüpften (bifunktionellen) Lipid. Gemäß einer dritten Alternative besteht die mit einem Lipid modifizierte erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA aus einer, wie oben definierten, erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA, mindestens einem mit dieser RNA verknüpften Linker und mindestens einem mit dem jeweiligen Linker kovalent verknüpften Lipid sowie mindestens einem mit dieser erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA (ohne Linker) kovalent verknüpften (bifunktionellen) Lipid.
  • Das zur Lipd-Modifikation der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA eingesetzte Lipid ist typischerweise ein Lipid oder ein lipophiler Rest, der bevorzugt an sich biologisch aktiv ist. Solche Lipide umfassen bevorzugt Naturstoffe oder Verbindungen, wie z.B. Vitamine, z.B. α-Tocopherol (Vitamin E), einschließlich RRR-α-Tocopherol (früher D-α-Tocopherol), L-α-Tocopherol, dem Racemat D,L-α-Tocopherol, Vitamin E-Succinat (VES), oder Vitamin A und dessen Derivate, z.B. Retinsäure, Retinol, Vitamin D und dessen Derivate, z.B. Vitamin D sowie dessen Ergosterol-Vorstufen, Vitamin E und dessen Derivate, Vitamin K und dessen Derivate, z.B. Vitamin K und verwandte Chinon- bzw. Phytolverbindungen, oder Steroide, wie Gallensäuren, bspw. Cholinsäure, Desoxycholinsäure, Dehydrocholinsäure, Cortison, Digoxygenin, Testosteron, Cholesterin oder Thiocholesterin. Weitere Lipide oder lipophile Reste im Sinne der vorliegenden Erfindung umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Polyalkylenglykole, (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533), aliphatische Gruppen, wie z.B. C1-C20-Alkane, C1-C20-Alkene, oder C1-C20-Alkanolverbindungen, etc., wie bspw. Dodecandiol, Hexadecanol oder Undecyl-Reste (Saison-Behmoaras et al., EMBO), 1991, 10, 111; Kabanov et al., FERS Lett., 1990, 259, 327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49), Phospholipide, wie z.B. Phosphatidylglycerin, Diacylphosphatidylglycerin, Phosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin, Distearoylphosphatidylchol in, Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin, Dihexadecyl-rac-glycerin, Sphingolipide, Cerebroside, Ganglioside, oder Triethylammonium 1,2-Di-O-hexadecyl-rac-glycero-3-H-phosphonat (Manoharan et a1, Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777), Polyamine oder Polyalkylenglykole, wie z.B. Polyethylenglykol (PEG) (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969), Hexaethylenglykol (HEG), Palmitin oder Palmityl-Reste (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229), Octadecylamine oder Hexylaminocarbonyloxycholesterin-Reste (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923), sowie Wachse, Terpene, alicyklische Kohlenwasserstoffe, gesättigte bzw. einfach- oder mehrfach ungesättigte Fettsäurereste, etc..
  • Die Verknüpfung zwischen dem Lipid und der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA kann grundsätzlich an jedem Nukleotid, an der Base oder dem Zuckerrest jedes Nukleotids, am 3'- und/oder 5'-Ende, und/oder am Phosphatrückgrat der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA stattfinden. Erfindungsgemäß wird eine terminale Lipid-Modifizierung der Basen-modifizierten RNA an deren 3'- und/oder 5'-Ende besonders bevorzugt. Eine terminale Modifizierung weist gegenüber sequenzinternen Modifikationen mehrere Vorteile auf. Zum einen können sequenzinterne Modifikationen das Hybridisierungsverhalten beeinflussen, was sich ggf. bei sterisch anspruchsvollen Resten negativ auswirkt. Sequenzinterne (sterisch anspruchsvolle) Modifikationen stören sehr oft auch bei der Translation, was häufig zu einem Abbruch der Proteinsynthese führen kann. Andererseits kann bei einer synthetischen Herstellung einer mit einem Lipid modifizierten erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA, die ausschließlich terminal modifiziert ist, die Synthese dieser Basen-modifizierten RNA mit handelsüblichen, in großer Menge verfügbaren, Monomeren durchgeführt und im Stand der Technik bekannte Syntheseprotokolle verwendet werden.
  • Gemäß einer ersten bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verknüpfung zwischen der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA und mindestens einem verwendeten Lipid über einen (kovalent mit der Basen-modifizierten RNA verknüpften) „Linker". Linker im Sinne der vorliegenden Erfindung weisen typischerweise mindestens zwei und optional 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 20-30 oder mehr reaktive Gruppen auf, jeweils ausgewählt aus z.B. einer Hydroxygruppe, einer Aminogruppe, einer Alkoxygruppe, etc.. Bevorzugt dient eine reaktive Gruppe zur Bindung der oben beschriebenen erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA. Diese reaktive Gruppe kann in einer geschützten Form vorliegen, z.B. als DMT (Dimethoxytritylchlorid)-Gruppe, als Fmoc-Gruppe, als MMT (Monomethoxytrityl-)-Gruppe, als TFA (Trifluoressigsäure)-Gruppe, etc. Weiterhin können Schwefelgruppen durch Disulfide, z.B. Alkylthiole, wie bspw. 3-Thiopropanol, oder mit aktivierten Komponenten, wie 2-Thiopyridin, geschützt werden. Eine oder mehr weitere reaktive Gruppen dienen erfindungsgemäß zur kovalenten Bindung eines oder mehr Lipide. Eine erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA kann daher gemäß der ersten Ausführungsform über den kovalent gebundenen Linker bevorzugt mindestens ein Lipid binden, z.B. 1, 2, 3, 4, 5, 5-10, 10-20, 20-30 oder mehr Lipid(e), besonders bevorzugt mindestens 3-8 oder mehr Lipide pro Basen-modifizierter RNA. Die gebundenen Lipide können dabei getrennt voneinander an verschiedene Positionen der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA gebunden werden, aber auch als Komplex an einer oder mehr Positionen der Basen-modifizierten RNA vorliegen. Eine zusätzliche reaktive Gruppe des Linkers kann zur direkten oder indirekten (spaltbaren) Bindung an ein Trägermaterial, z.B. eine Festphase, verwendet werden. Bevorzugte Linker gemäß der vorliegenden Erfindung sind z.B. Glykol, Glycerin sowie Glycerin-Derivate, 2-Aminobutyl-1,3-propandiol sowie 2-Aminobutyl-1,3-propandiol-Derivate/Gerüst, Pyrrolidin-Linker bzw. Pyrrolidin enthaltende organische Moleküle (insbesondere für eine Modifikation am 3'-Ende), etc.. Besonders bevorzugt werden erfindungsgemäß als Linker Glycerin oder Glycerinderivate (C3-Anker) oder ein 2-Aminobutyl-1,3-propandiol-Derivat/Gerüst (C7-Anker) verwendet. Ein Glycerinderivat (C3-Anker) als Linker wird insbesondere dann bevorzugt, wenn die Lipid-Modifikation über eine Etherbindung eingeführt werden kann. Soll die Lipid-Modifikation z.B. über eine Amid- oder eine Urethanbindung eingeführt werden, wird z.B. ein 2-Aminobutyl-1,3-propandiol-Gerüst (C7-Anker) bevorzugt. In diesem Zusammenhang ist die zwischen dem Linker und der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA entstehende Bindung bevorzugt so beschaffen, dass sie mit den Bedingungen und Chemikalien der Amiditchemie kompatibel ist, das heißt, sie ist bevorzugt weder säure- noch basenlabil. Insbesondere werden solche Bindungen bevorzugt, die synthetisch leicht zugänglich sind, und nicht durch die ammoniakalische Abspaltprozedur eines Nukleinsäuresyntheseverfahrens hydrolysiert werden. Als Bindungen kommen grundsätzlich alle entsprechend geeigneten Bindungen in Frage, bevorzugt Esterbindungen, Amidbindungen, Urethan- sowie Etherbindungen. Neben der guten Zugänglichkeit der Edukte (wenige Synthesestufen) ist dabei die Etherbindung aufgrund ihrer relativ hohen biologischen Stabilität gegenüber enzymatischer Hydrolyse besonders bevorzugt.
  • Gemäß einer zweiten bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verknüpfung (mindestens einer) der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA direkt mit mindestens einem, wie oben beschriebenen, (bifunktionellen) Lipid, d.h. ohne Verwendung eines, wie oben beschriebenen, Linkers. In diesem Fall weist das erfindungsgemäß verwendete (bifunktionelle) Lipid bevorzugt mindestens zwei reaktive Gruppen, oder optional 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, oder mehr reaktive Gruppen, auf, wobei eine erste reaktive Gruppe zur direkten oder indirekten Bindung des Lipids an ein hier beschriebenes Trägermaterial und mindestens eine weitere reaktive Gruppe zur Bindung der Basen-modifizierten RNA dient. Gemäß der zweiten Ausführungsform kann eine erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA daher bevorzugt mindestens ein Lipid (direkt ohne Linker) binden, z.B. 1, 2, 3, 4, 5, 5-10, 10-20, 20-30 oder mehr Lipid(e), besonders bevorzugt mindestens 3-8 oder mehr Lipide pro Basen-modifizierte RNA. Die gebundenen Lipide können dabei getrennt voneinander an verschiedene Positionen der Basen-modifizierten RNA gebunden werden, aber auch als Komplex an einer oder mehr Positionen der Basen-modifizierten RNA vorliegen. Alternativ kann gemäß der zweiten Ausführungsform an ein, wie zuvor beschriebenes, Lipid über dessen reaktive Gruppen mindestens eine erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA gebunden werden, z.B. optional 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 20-30 oder mehr Basen-modifizierte RNAs. Besonders bevorzugt umfassen für diese zweite Ausführungsform verwendbare Lipide solche (bifunktionellen) Lipide, die (bevorzugt an ihren Termini oder optional intramolekular) eine Kopplung ermöglichen, wie z.B. Polyethylenglykol (PEG) sowie Derivate davon, Hexaethylenglykol (HEG) sowie Derivate davon, Alkandiole, Aminoalkan, Thioalkanole, etc.. Die Bindung zwischen einem (bifunktionellen) Lipid und einer, wie zuvor beschriebenen, Basen-modifizierten RNA ist bevorzugt so beschaffen, wie für die erste bevorzugte Ausführungsform beschrieben.
  • Gemäß einer dritten Ausführungsform kann die Verknüpfung zwischen der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA und mindestens einem, wie oben beschriebenen, Lipid über beide der zuvor genannten Ausführungsformen gleichzeitig erfolgen. So kann z.B. die erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA an einer Position der RNA mit mindestens einem Lipid über einen Linker verknüpft sein (analog 1. Ausführungsform) und an einer anderen Position der Basen-modifizierten RNA direkt mit mindestens einem Lipid ohne Verwendung eines Linkers (analog 2. Ausführungsform). Beispielsweise kann am 3'-Ende der Basen-modifizierten RNA mindestens ein, wie oben beschriebenes, Lipid über einen Linker mit der RNA kovalent verknüpft werden und am 5'-Ende der Basen-modifizierten RNA ein, wie oben beschriebenes, Lipid ohne einen Linker mit der RNA kovalent verknüpft werden. Alternativ kann am 5'-Ende einer erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA mindestens ein, wie oben beschriebenes, Lipid über einen Linker mit der Basen-modifizierten RNA kovalent verknüpft werden und am 3'-Ende der Basen-modifizierten RNA ein, wie oben beschriebenes, Lipid ohne einen Linker mit der Basen-modifizierten RNA kovalent verknüpft werden. Ebenso können kovalente Verknüpfungen nicht nur an den Termini der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA sondern auch intramolekular stattfinden, wie zuvor beschrieben, z.B. am 3'-Ende und intramolekular, am 5'-Ende und intramolekular, am 3'- und 5'-Ende und intramolekular, ausschließlich intramolekular, etc..
  • Die oben beschriebene erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA kann nach im Stand der Technik bekannten Herstellungsverfahren hergestellt werden, z.B. automatisch oder manuell über bekannte synthetische Nukleinsäuresynthesen (siehe bspw. Maniatis et al. (2001) supra).
  • Die erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA kann gemäß einem weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Tumoren und Krebserkrankungen, Herz- und Kreislauferkrankungen, Infektionskrankheiten oder Autoimmunkrankheiten, wie auch zur der Behandlung von monogenetischen Erkrankungen, z.B. in der Gentherapie, verwendet werden.
  • Eine pharmazeutische Zusammensetzung im Sinne der vorliegenden Erfindung enthält eine, wie oben beschriebene, Basen-modifizierte RNA sowie optional einen pharmazeutisch geeigneten Träger und/oder weitere Hilfs- und Zusatzstoffe und/oder Adjuvanzien. Die gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzte pharmazeutische Zusammensetzung umfasst typischerweise eine sichere und effektive Menge einer, wie oben beschriebenen, Basen-modifizierten RNA. Wie hier verwendet, bedeutet "sichere und effektive Menge" eine solche Menge der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA, die ausreichend ist, um signifikant eine positive Änderung eines zu behandelnden Zustands zu induzieren, z.B. einer Tumor- oder Krebserkrankung, einer Herz- und Kreislauferkrankung oder einer Infektionskrankheit, wie im folgenden beschrieben. Gleichzeitig ist eine "sichere und effektive Menge" jedoch gering genug, um schwerwiegende Nebeneffekte bei der Therapie dieser Erkrankungen zu vermeiden, also ein vernünftiges Verhältnis von Vorteil und Risiko zu ermöglichen. Die Festlegung dieser Grenzen liegen typischerweise innerhalb des Bereichs vernünftiger medizinischer Urteilskraft. Die Konzentration der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA in derartigen pharmazeutischen Zusammensetzungen kann daher bspw., ohne darauf eingeschränkt zu werden, innerhalb eines weiten Bereichs von z.B. 0,1 μg bis 100 mg/ml variieren. Eine solche „sichere und effektive Menge" einer erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA kann im Zusammenhang mit dem besonderen zu behandelnden Zustand variieren, sowie dem Alter und dem physischen Zustand des zu behandelnden Patienten, der Schwere des Zustandes, der Dauer der Behandlung, der Natur der begleitenden Therapie, des verwendeten besonderen pharmazeutisch geeigneten Trägers und ähnlichen Faktoren innerhalb des Wissens und der Erfahrung des begleitenden Arztes. Die hier beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung kann für humane wie auch für veterinärmedizinische Zwecke eingesetzt werden.
  • Zur Erhöhung der Immunogenität der pharmazeutischen Zusammensetzung kann die Zusammensetzung zusätzlich einen oder mehr Hilfsstoffe enthalten. Hierbei wird vorzugsweise eine synergistische Wirkung der enthaltenen erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA und eines gegebenenfalls zusätzlich in der pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltenen Hilfsstoffes erzielt. In Abhängigkeit der verschiedenen Arten von Hilfsstoffen können diesbezüglich verschiedene Mechanismen in Betracht kommen. Bspw. bilden Verbindungen, welche die Reifung von dendritischen Zellen (DC) erlauben, bspw. Lipopolysaccharide, TNF-α oder CD40-Ligand, eine erste Klasse geeigneter Hilfsstoffe. Allgemein kann jedes das Immunsystem beeinflussende Agens von der Art eines "Gefahrsignals" (LPS, GP96 usw.) oder Cytokine, wie GM-CFS, als Hilfsstoff verwendet werden, welche es erlauben, eine durch Verabreichung der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA ggf. erzeugte Immunantwort zu verstärken, gerichtet zu beeinflussen und/oder begleitend eine Immunreaktion hervorzurufen. Besonders bevorzugte Hilfsstoffe sind Cytokine, wie Monokine, Lymphokine, Interleukine oder Chemokine, z.B. IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, INF-α, IFN-β, INF-γ, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-β oder TNF-α, oder Interferone, bspw. IFN-γ, oder Wachstumsfaktoren, bspw. hGH.
  • Die oben beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung kann weiterhin zusätzlich ein im Stand der Technik bekanntes Adjuvanz enthalten. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung schließen im Stand der Technik bekannte Adjuvanzien, ohne darauf beschränkt zu sein, wie zuvor beschriebene, stabilisierende kationische Peptide bzw. Polypeptide ein, wie Protamin, Nukleolin, Spermin oder Spermidin und kationische Polysaccharide, insbesondere Chitosan, TDM, MDP, Muramyldipeptid, Pluronics, Alaun-Lösung, Aluminiumhydroxid, ADJUMERTM (Polyphosphazen); Aluminumphosphat-Gel; Glucane aus Algen; Algammulin; Aluminumhydroxid-Gel (Alaun); stark Protein-adsorbierendes Aluminumhydroxid-Gel; niedrig-viskoses Aluminumhydroxid-Gel; AF oder SPT (Emulsion von Squalane (5%), Tween 80 (0.2%), Pluronic L121 (1.25%), Phosphat-gepufferte Salzlösung, pH 7.4); AVRIDINETM (Propandiamin); BAY R1005TM ((N-(2-Deoxy-2-L-leucylamino-b-D-glucopyranosyl)-N-octadecyldodecanoyl-amidhydroacetat); CALCITRIOLTM (1,25-Dihydroxyvitamin D3); Calciumphosphat-Gel; CAPTM (Calciumphosphat-Nanopartikel); Cholera-Holotoxin, Cholera-Toxin-A1-Protein-A-D-Fragment-Fusionsprotein, die Untereinheit B des Choleratoxins; CRL 1005 (Block Copolymer P1205); Cytokin-enthaltende Liposome; DDA (Dimethyldioctadecylammoniumbromid); DHEA (Dehydroepiandrosteron); DMPC (Dimyristoylphosphatidylcholin); DMPG (Dimyristoylphosphatidylglycerin); DOC/Alaun- Komplex (Deoxycholinsäurenatriumsalz); Freund'sches vollständiges Adjuvanz; Freund'sches unvollständiges Adjuvanz; Gamma Inulin; Gerbu-Adjuvanz (Mischung aus: i) N-Acetylglucosaminyl-(P1-4)-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamin (GMDP), ii) Dimethyldioctadecylammoniumchlorid (DDA), iii) Zink-L-Prolin-Salz-Komplex (ZnPro-8); GM-CSF); GMDP (N-acetylglucosaminyl-(b1-4)-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin); Imiquimod (1-(2-Methypropyl)-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-4-amin); ImmTherTM (N-Acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-glycerindipalmitat); DRVs (Immunoliposome hergestellt aus Dehydrations-Rehyrdrations-Vesikeln); Interferon-γ; Interleukin-1β; Interleukin-2; Interleukin-7; Interleukin-12; ISCOMSTM („Immune Stimulating Complexes"); ISCOPREP 7.0.3.TM; Liposome; LOXORIBINETM (7-Allyl-8-oxoguanosin); LT Orales Adjuvanz (E. coli-labiles Enterotoxin-Protoxin); Microspheren and Micropartikel jeder Zusammensetzung; MF59TM; (Squalene-Wasser-Emulsion); MONTANIDE ISA 51TM (aufgereinigtes unvollständiges Freund'sches Adjuvanz); MONTANIDE ISA 720TM (metabolisierbares Öl-Adjuvanz); MPLTM(3-Q-Desacyl-4'-monophosphoryl-lipid A); MTP-PE- und MTP-PE-Liposome ((N-Acetyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-(hydroxyphospho-ryloxy))ethylamid, Mononatriumsalz); MURAMETIDETM (Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3); MURAPALMITINETM und D-MURAPALMITINETM (Nac-Mur-L-Thr-D-isoGln-sn-Glycerindipalmitoyl); NAGO (Neuraminidase-Galactoseoxidase); Nanospheren oder Nanopartikel jeder Zusammensetzung; NISVs (Nicht-ionische Tensid-Vesikel, „Non-Ionic Surfactant Vesicles"); PLEURANTM (β-Glucan); PLGA, PGA and PLA (Homo- und Co-Polymere von Milchsäure und Glykolsäure; Micro-/Nanospheren); PLURONIC L121TM; PMMA (Polymethylmethacrylat); PODDSTM (Oroteinoid-Microspheren); Polyethylen-Carbamat-Derivate; Poly-rA: Poly-rU (Polyadenylsäure-Polyuridylsäure-Komplex); Polysorbate 80 (Tween 80); Protein-Cochleate (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL); STIMULONTM (QS-21); Quil-A (Quil-A-Saponin); S-28463 (4-Amino-otec-dimethyl-2-ethoxymethyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-ethanol); SAF-1TM („Syntex Adjuvant Formulation"); Sendai Proteoliposome und Sendai-enthaltende Lipid-Matrices; Span-85 (Sorbitantrioleat); Specol (Emulsion von Marcol 52, Span 85 und Tween 85); Squalen oder Robane® (2,6,10,15,19,23-Hexamethyltetracosan und 2,6,10,15,19,23-Hexamethyl-2,6,10,14,18,22-Tetracosahexan); Stearyltyrosin (Octadecyltyrosinhydrochlorid); Theramid® (N-Acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-dipalmitoxypropylamid); Theronyl-MDP (TermurtideTM oder [Thr 1]-MDP; N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin); Ty-Partikel (Ty-VIPs oder Virus-artige Partikel); Walter-Reed-Liposome (Liposome-enthaltend, an Aluminiumhydroxid adsorbiertes Lipid A), und ähnliches, etc.. Des weiteren sind Lipopeptide, wie Pam3Cys, ebenfalls besonders geeignet, um mit der hier beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzung kombiniert zu werden (vgl. Deres et al., Nature 1989, 342: 561-564). Ebenfalls kann in der oben beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzung als (zusätzliches) Adjuvanz ein Nukleinsäure-basiertes Adjuvanz enthalten sein, bspw. CpG- und RNA-Oligonukleotide, etc., oder Toll-like-Rezeptor-Liganden, z.B. Liganden von TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 oder TLR13 oder Homologen davon.
  • Optional kann die hier beschriebene erfindungsgemäß verwendete pharmazeutische Zusammensetzung einen pharmazeutisch geeigneten Träger enthalten. Der hier verwendete Begriff "pharmazeutisch geeigneter Träger" umfasst bevorzugt einen oder mehr kompatible feste oder flüssige Füllstoffe, bzw. Verdünnungsmittel oder einkapselnde Verbindungen, welche für die Verabreichung an eine Person geeignet sind. Der Begriff "kompatibel", wie hier verwendet, bedeutet, dass die Bestandteile der Zusammensetzung in der Lage sind, mit der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA, dem optional zusätzlich enthaltenen Adjuvanz als solchem und miteinander in einer solchen Art zusammengemischt zu werden, dass keine Interaktion auftritt, welche wesentlich die pharmazeutische Effektivität der Zusammensetzung unter gewöhnlichen Verwendungsbedingungen reduzieren würde, wie z.B. die pharmazeutische Aktivität des kodierten pharmazeutisch wirksamen Proteins vermindern oder gar die Expression des pharmazeutisch wirksamen Proteins unterbinden oder verschlechtern würde. Pharmazeutisch geeignete Träger müssen selbstverständlich eine ausreichend hohe Reinheit und eine ausreichend geringe Toxizität aufweisen, um sie für die Verabreichung an eine zu behandelnde Person geeignet zu machen. Einige Beispiele von Verbindungen, welche als pharmazeutisch geeignete Träger oder Bestandteile davon dienen können, sind Zucker, wie beispielsweise Lactose, Glucose und Sukrose; Stärken, wie beispielsweise Kornstärke oder Kartoffelstärke; Cellulose und ihre Derivate, wie beispielsweise Natriumcarboxymethylcellulose, Ethylcellulose, Celluloseacetat; pulverisiertes Tragacanth; Malz; Gelatine; Talg; feste Gleitmittel, wie beispielsweise Stearinsäure, Magnesiumstearat; Calciumsulfat; Pflanzenöle, wie beispielsweise Erdnussöl, Baumwollsamenöl, Sesamöl, Olivenöl, Kornöl und Öl aus Theobroma; Polyole, wie beispielsweise Polypropylenglycol, Glycerin, Sorbitol, Mannitol und Polyethylenglycol; Algininsäure; Emulgatoren, wie beispielsweise Tween®; Benetzungsmittel, wie beispielsweise Natriumlaurylsulfat; färbende Agenzien; geschmacksvermittelnde Agenzien, Arzneistoffträger; tablettenbildende Agenzien; Stabilisatoren; Antioxidantien; Konservierungsmittel; Pyrogen-freies Wasser; isotonische Salzlösung und phosphatgepufferte Lösungen.
  • Die Wahl eines pharmazeutisch geeigneten Trägers wird grundsätzlich durch die Art bestimmt, durch die die erfindungsgemäß verwendete pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht wird. Die erfindungsgemäß verwendete pharmazeutische Zusammensetzung kann bspw. systemisch verabreicht werden. Routen zur Verabreichung schließen z.B. transdermale, orale, parenterale, einschließlich subkutane oder intravenöse Injektionen, topische und/oder intranasale Routen ein. Die geeignete Menge der zu verwendenden pharmazeutischen Zusammensetzung kann durch Routineexperimente mit Tiermodellen bestimmt werden. Solche Modelle schließen, ohne jedoch darauf begrenzt zu sein, Modelle von Kaninchen, Schaf, Maus, Ratte, Hund und nicht-humane Primatenmodelle mit ein. Bevorzugte Einheitsdosisformen zur Injektion schließen sterile Lösungen von Wasser, physiologischer Salzlösung oder Mischungen davon mit ein. Der pH solcher Lösungen sollte auf etwa 7,4 eingestellt werden. Geeignete Träger zur Injektion schließen Hydrogele, Vorrichtungen zur kontrollierten oder verzögerten Freigabe, polylaktische Säure und Collagenmatrizen ein. Hier verwendbare pharmazeutisch-geeignete Träger zur topischen Anwendung schließen solche ein, die zur Verwendung in Lotionen, Cremes, Gels u.ä. geeignet sind. Falls die Verbindung peroral verabreicht werden soll, sind Tabletten, Kapseln u.ä. die bevorzugte Einheitsdosisform. Die pharmazeutisch geeigneten Träger zur Herstellung von Einheitsdosisformen, die für die orale Verabreichung verwendbar sind, sind im Stand der Technik gut bekannt. Ihre Auswahl wird von sekundären Überlegungen wie Geschmack, Kosten und Lagerfähigkeit abhängen, welche für die Zwecke der vorliegenden Erfindung nicht kritisch sind und ohne Schwierigkeiten durch einen Fachmann durchgeführt werden können.
  • Gemäß einer besonderen Ausführungsform kann die hier verwendete pharmazeutische Zusammensetzung auch als Vakzine vorliegen. Die Vakzinierung beruht, ohne an eine Theorie gebunden zu sein, auf der Einbringung eines Antigens, im vorliegenden Fall der erfindungsgemäß verwendeten, für (ein therapeutisch wirksame(s)) Protein(e) kodierenden, Basen-modifizierten RNA, in den Organismus, insbesondere in die Zelle. Die in der hier verwendeten pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltene Basen-modifizierte RNA wird in das kodierte Protein translatiert, d.h. das von der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA kodierte Protein wird exprimiert, wodurch eine gegen dieses Protein gerichtete Immunantwort stimuliert wird. Im vorliegenden Fall der Verwendung als genetische Vakzine zur Behandlung von Krebs- oder Tumorerkrankungen wird die Immunantwort bspw. durch Einbringung der genetischen Information für ein Tumorantigen erreicht. Dadurch wird das oder die Krebsantigen(e) im Organismus exprimiert, wodurch eine Immunantwort hervorgerufen wird, die wirksam gegen die Krebs- bzw. Tumorzellen gerichtet ist. Vakzine im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung umfassen typischerweise eine Zusammensetzung, wie zuvor für eine pharmazeutische Zusammensetzung beschrieben, wobei die Zusammensetzung solcher verwendeten Vakzine insbesondere durch die Art bestimmt wird, durch die sie verabreicht werden. Bevorzugt werden, wie hier beschrieben, Vakzine systemisch verabreicht. Routen zur Verabreichung von solchen Vakzinen schließen typischerweise transdermale, orale, parenterale, einschließlich subkutane oder intravenöse Injektionen, topische und/oder intranasale Routen mit ein. Wie hier beschriebene Vakzine werden daher bevorzugt in flüssiger oder fester Form formuliert. Auch können ggf. in einer, wie hier beschriebenen, Vakzine weitere Hilfsstoffe eingearbeitet sein, die die Immunogenität des Vakzins weiter steigern können. Vorteilhafterweise wird/werden ein oder mehr weitere solcher, wie zuvor definierter, Hilfsstoffe in Abhängigkeit der Immunogenität und anderen Eigenschaften der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA in der hier beschrieben Vakzine zu wählen sein.
  • Gemäß einem weiteren bevorzugten Gegenstand der vorliegenden Erfindung wird die hier beschriebene Basen-modifizierte RNA oder eine, wie hier beschriebene, pharmazeutische Zusammensetzung, besonders bevorzugt die hier beschriebene Vakzine, zur Behandlung von im folgenden genannten beispielhaften Indikationen verwendet. Ohne darauf beschränkt zu werden, können mit der beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzung, besonders bevorzugt mit der beschriebenen Vakzine, beispielsweise Erkrankungen oder Zustände behandelt werden, wie z.B. Krebs bzw. Tumorerkrankungen, ausgewählt aus Melanomen, malignen Melanomen, Kolon-Karzinomen, Lymphomen, Sarkomen, Blastomen, Nierenkarzinomen, Gastrointestinalen Tumoren, Gliomen, Prostatatumoren, Blasenkrebs, Rektaltumoren, Magenkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Leberkrebs, Mammakarzinomen (= Brustkrebs), Gebärmutterkrebs, Gebärmuttehalskrebs, Akuter myeloider Leukämie (AML), Akuter Lymphoider Leukämie (ALL), chronischer myeloider Leukämie (CML), chronischer lymphozytischre Leukämie (CLL), Hepatomen, diversen Virus-induzierten Tumoren, wie z. B. Papillomvirus-induzierten Karzinomen (z.B. Cervixkarzinom = Gebärmutterhalskrebs), Adenokarzinomen, Herpesviren-induzierten Tumoren (z. B. Burkitt's Lymphom, EBV-induziertem B Zelllymphom), Hepatitis B-induzierten Tumoren (Hepatozellkarzinomen), HTLV-1- und HTLV-2-induzierten Lymphomen, Akustikusneurinom, Lungenkarzinomen (= Lungenkrebs = Bronchialkarzinom), kleinzelligen Lungenkarzinomen, Rachenkrebs, Analkarzinom, Glioblastom, Rektumkarzinom, Astrozytom, Hirntumoren, Retinoblastom, Basaliom, Hirnmetastasen, Medulloblastomen, Scheidenkrebs, Hodenkrebs, Schilddrüsenkarzinom, Hodgkin-Syndrom, Meningeomen, Schneeberger Krankheit, Hypophysentumor, Mycosis fungoides, Karzinoien, Neurinom, Spinaliom, Burkitt-Lymphom, Kehlkopfkrebs, Nierenkrebs, Thymom, Corpuskarzinom, Knochenkrebs, Non-Hodgkin-Lymphomen, Urethrakrebs, CUP-Syndrom, Kopf-Hals-Tumoren, Oligodendrogliom, Vulvakrebs, Darmkrebs, Kolonkarzinom, Ösphaguskarzinom (= Speiseröhrenkrebs), Warzenbeteiligung, Dünndarmtumoren, Kraniopharyngeomen, Ovarial-Karzinom, Weichteiltumoren, Eierstockkrebs (= Ovarialkarzinom), Pankreaskarzinom (= Bauchspeicheldrüsenkrebs), Endometriumkarzinom, Lebermetastasen, Peniskrebs, Zungenkrebs, Gallenblasenkrebs, Leukämie, Plasmozytom, Lidtumor, Prostatakrebs (= Prostatatumoren), etc., oder Infektionskrankheiten, ausgewählt aus Influenza, Malaria, SARS, Gelbfieber, AIDS, Lyme-Borreliose, Leischmaniasis, Anthrax, Meningitis, viralen Infektionskrankheiten, wie AIDS, Condyloma acuminata, Dellwarze, Dengue-Fieber, Dreitagefieber, Ebolavirus, Erkältung, Frühsommermeningoenzephalitis (FSME), Grippe, Gürtelrose, Hepatitis, Herpes-Simplex Typ I, Herpes-Simplex Typ II, Herpes zoster, Influenza, Japanischer Enzephalitis, Lassafieber, Marburg-Virus, Masern, Maul- und Klausenseuche, Mononukleose, Mumps, Norwalk-Virus-Infektion, Pfeifersches Drüsenfieber, Pocken, Polio (Kinderlähmung), Pseudokrupp, Ringelröteln, Tollwut, Warzen, West-Nil-Fieber, Windpocken, Zytomegalie-Virus (CMV), bakteriellen Infektionskrankheiten, wie Abort (Prostataentzündung), Anthrax, Appendizitis (Blinddarmentzündung), Borreliose, Botulismus, Camphylobacter, Chiamydia trachomatis (Harnröhren-, Bindehautentzündung), Cholera, Diphterie, Donavanosis, Epiglottitis, Fleckfieber, Flecktyphys, Gasbrand, Gonorhoe, Hasenpest, Heliobakter pylori, Keuchhusten, klimatischem Bubo, Knochenmarksentzündung, Legionärskrankheit, Lepra, Listeriose, Lungenentzündung, Meningitis, Bakterieller Gehirnhautentzündung, Milzbrand, Mittelohrentzündung, Mycoplasma hominis, Neugeborenensepsis (Chorioamnionitis), Noma, Paratyphus, Pest, Reitersyndrom, Rocky Mountain spotted fever, Salmonellen-Paratyphus, Salmonellen-Typhus, Scharlach, Syphilis, Tetanus, Tripper, Tsutsugamushi, Tuberkulose, Typhus, Vaginitis (Kolpitis), Weichem Schanker und durch Parasiten, Protozoen oder Pilze hervorgerufener Infektionskrankheiten, wie Amöbenruhr, Bilharziose, Chagas-Krankheit, Echinococcus, Fischbandwurm, Fischvergiftung (Ciguatera), Fuchsbandwurm, Fußpilz, Hundebandwurm, Kandiose, Kleienpilzflechte, Krätze (Skabies), Kutaner Leishmaniose, Lamblienruhr (Giadiasis), Läuse, Malaria, Mikroskopie, Onchozerkose (Flussblindheit), Pilzerkrankungen, Rinderbandwurm, Schistosomiasis, Schlafkrankheit, Schweinebandwurm, Toxoplasmose, Trichomoniasis, Trypanosomiasis (Schlafkrankheit), Viszeraler Leishmaniose, Windeldermatitis oder Zwergbandwurm, oder Herz- und Kreislauferkrankungen, ausgewählt aus Koronare Herzkrankheit, Arteriosklerose, Apoplexie, Hypertonie, und neuronale Erkrankungen ausgewählt aus Alzheimerscher Krankheit, Amyotrophe Lateralsklerose, Dystonie, Epilepsie, Multiple Sklerose und Parkinsonscher Krankheit, sowie Autoimmunkrankheiten, ausgewählt aus Autoimmun-Typ-I-Erkrankungen oder Autoimmun-Typ-II-Erkrankungen oder Autoimmun-Typ-III-Erkrankungen oder Autoimmun-Typ-IV-Erkrankungen, wie bspw. Multipler Sklerose (MS), Rheumatoider Arthritis, Diabetes, Diabetes-Typ-I (Diabetes mellitus), Systemischem Lupus Erythematosus (SLE), Chronischer Polyarthritis, Basedowscher Krankheit, Autoimmunen Formen der chronischen Hepatitis, Colitis Ulcerosa, Allergie-Typ-I-Erkrankungen, Allergie-Typ-II-Erkrankungen, Allergie-Typ-III-Erkrankungen, Allergie-Typ-IV-Erkrankungen, Fibromyalgie, Haarausfall, Morbus Bechterew, Morbus Crohn, Myasthenia gravis, Neurodermitis, Polymyalgia rheumatica, Progressiver Systemischer Sklerose (PSS), Psiorasis, Reiter-Syndrom, Rheumatischer Arthritis, Schuppenflechte, Vaskulitis, etc., oder Diabetes-Typ-II. Erkrankungen im Sinne der vorliegenden Erfindung umfassen auch monogenetische Erkrankungen, d.h. (Erb-)Erkrankungen, die durch einen Einzelgendefekt bedingt sind und nach den Mendel'schen Regeln vererbt werden. Monegenetische Erkrankungen im Sinne der vorliegenden Erfindung werden bevorzugt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus autosomal-rezessiven Erbkrankheiten, wie bspw. Adenosin-Deaminase-Mangel, Familiäre Hypercholesterinanämie, Canavan-Syndrom, Morbus Gaucher, Fanconi-Anämie, neuronale Ceroid-Lipofuszinosen, Mukoviscidose (Zystische Fibrose), Sichelzellanämie, Phenylketonurie, Alkaptonurie, Albinismus, Hypothyreose, Galactosämie, Alpha-1-Anti-Trypsin-Mangel, Xeroderma pigmentosum, Ribbing-Syndrom, Mukopolysaccharidosen, Lippen-, Kiefer-, Gaumenspalte, Laurence-Moon-Biedl-Bardet-Syndrom, Kurzripp-Polydaktylie-Syndrom, Kretinismus, Joubert-Syndrom, Progerie Typ II, Brachydaktylie, Adrenogenitalem Syndrom, und X-chromosomalen Erbkrankheiten, wie bspw. Farbenblindheit, z.B. Rot-Grün-Blindheit, Fragilem X-Syndrom, Muskeldystrophie (Duchenne- und Becker-Kiener-Typ), Hämophilie A und B, G6PD-Mangel, Morbus Fabry, Mukopolysaccharidose, Norrie-Syndrom, Retinitis pigmentosa, Septischer Granulomatose, X-SCID, Ornitihin-Transcarbamylase-Mangel, Lesch-Nyhan-Syndrom, oder aus autosomal-dominanten Erbkrankheiten, wie bspw. heriditäres Angioödem, Marfan-Syndrom, Neurofibromatose, Progerie Typ I, Osteogenesis imperfecta, Klippel-Trenaurnay-Syndrom, Sturge-Weber-Syndrom, Hippel-Lindau-Syndrom und Tuberöse Sklerose.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft daher auch die Verwendung einer, wie hier beschriebenen, Basen-modifizierten RNA oder eine, wie hier beschriebene, pharmazeutische Zusammensetzung, besonders bevorzugt die hier beschriebene Vakzine, zur Behandlung von zuvor beschriebenen Indikationen bzw. Erkrankungen. Damit umfasst ist insbesondere auch die Verwendung der hier beschriebenen Basen-modifizierten RNA zur Impfung bzw. die Verwendung der beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzung als Impfstoff.
  • Gemäß einem weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung wird auch ein Verfahren zur Behandlung der vorstehend genannten Krankheiten bzw. ein Impfverfahren zur Prävention der vorstehend genannten Erkrankungen bereitgestellt, welches das Verabreichen der beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzung an einen Patienten, insbesondere einen Menschen, umfasst.
  • Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung richtet sich auf ein in vitro-Transkriptionsverfahren zur Herstellung Basen-modifizierter RNA, umfassend folgende Schritte:
    • a) Bereitstellung einer Nukleinsäure, kodierend ein wie zuvor beschriebenes Protein;
    • b) Zugabe der Nukleinsäure zu einem in vitro-Transkriptionsmedium, umfassend eine RNA-Polymerase, einen geeigneten Puffer, einen Nukleinsäure-Mix, umfassend ein oder mehrere wie zuvor beschriebene Basen-modifizierte Nukleotide, im Austausch gegen ein oder mehrere der natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U, und gegebenenfalls ein oder mehrere natürlich vorkommende Nukleotide A, G, C oder U, falls nicht alle natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U ausgetauscht werden sollen, und gegebenenfalls einen RNase-Inhibitor;
    • c) Inkubation der Nukleinsäure im in vitro-Transkriptionsmedium und in vitro-Transkription der Nukleinsäure;
    • d) gegebenenfalls Aufreinigung und Entfernung der nicht-eingebauten Nukleotide aus dem in vitro-Transkriptionsmedium.
  • Eine wie in Schritt a) des erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptionsverfahrens beschriebene Nukleinsäure kann jede wie oben beschriebene Nukleinsäure sein, die ein hier genanntes Protein kodiert, bevorzugt ein diagnostisch relevantes, ein therapeutisch wirksames oder ein sonstiges, zu Labor- oder Forschungszwecken verwendetes bzw. verwendbares Protein. Typischerweise werden dazu DNA-Sequenzen, z.B. genomische DNA oder Fragmente davon, oder Plasmide, kodierend ein wie oben beschriebenes Protein, oder (dazu korrespondierende) RNA Sequenzen, z.B. mRNA-Sequenzen eingesetzt, bevorzugt in linearisierter Form. Die in vitro-Transkription kann üblicherweise durch Verwendung eines Vektors erfolgen, der eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle aufweist. Dazu können jegliche im Stand der Technik bekannte Vektoren verwendet werden, z.B. kommerziell erhältliche Vektoren (s.o.). Bevorzugt sind bspw. solche Vektoren, die stromaufwärts und/oder stromabwärts der Klonierungsstelle eine SP6 bzw. eine T7- oder T3-Bindungsstelle aufweisen. So können die verwendeten Nukleinsäuresequenzen später nach Belieben in Abhängigkeit der gewählten RNA-Polymerase transkribiert werden. Eine zur in vitro-Transkription verwendete und ein wie oben definiertes Protein kodierende, Nukleinsäuresequenz wird typischerweise in den Vektor einkloniert, z.B. über eine „multiple cloning site" des verwendeten Vektors. Vor der Transkription wird typischerweise der Klon mit Restriktionsenzymen an der Stelle, an der sich das zukünftige 3'-Ende der RNA befinden soll, mit einem geeigneten Restriktionsenzym gespalten und das Fragment aufgereinigt. Dadurch wird ausgeschlossen, dass die RNA Vektorsequenzen enthält, und es wird eine RNA definierter Länge erhalten. Bevorzugt werden dabei keine Restriktionsenzyme verwendet, die überhängende 3'-Enden erzeugen (wie z.B. AatII, ApaI, BanII, BglI, Bsp 1286, BstXI, CfoI, HaeII, HgiAI, HhaI, KpnI, PstI, PvuI, SacI, SacII, SfiI, SphI, etc.). Sollten dennoch solche Restriktionsenzyme verwendet, wird bevorzugt das überhängende 3'-Ende aufgefüllt, z.B. mit Klenow- oder T4-DNA-Polymerase.
  • Alternativ dazu kann als Transkriptionstemplate die Nukleinsäure auch per Polymerasekettenreaktion (PCR) hergestellt werden. Dazu enthält typischerweise einer der verwendeten Primer die Sequenz einer RNA-Polymerase-Bindungsstelle. Weiterhin bevorzugt enthält das 5'-Ende des verwendeten Primers eine Verlängerung von etwa 10-50 weiteren Nukleotiden, stärker bevorzugt von 15 bis 30 weiteren Nukleotiden und am stärksten bevorzugt von etwa 20 Nukleotiden.
  • Vor der in vitro-Transkription wird die Nukleinsäure, bspw. die Nukleinsäure, z.B. das DNA- oder RNA-Template, typischerweise aufgereinigt und von RNase befreit, um eine hohe Ausbeute zu gewährleisten. Eine Aufreinigung kann dabei mit Hilfe jedes im Stand der Technik bekannten Verfahrens durchgeführt werden, bspw. mit einem Cäsiumchloridgradienten oder Ionenaustauschverfahren.
  • Gemäß Verfahrenschritt b) wird die Nukleinsäure zu einem in vitro-Transkriptionsmedium gegeben. Ein geeignetes in vitro-Transkriptionsmedium enthält zunächst eine wie unter Schritt a) bereitgestellte Nukleinsäure, bspw. etwa 0,1-10 μg, bevorzugt etwa 1-5 μg, stärker bevorzugt 2,5 μg und am stärksten bevorzugt etwa 1 μg einer solchen Nukleinsäure. Ein geeignetes in vitro-Transkriptionsmedium enthält weiterhin gegebenenfalls ein Reduktionsmittel, z.B. DTT, stärker bevorzugt etwa 1-20 μl 50 mM DTT, noch stärker bevorzugt etwa 5 μl 50 mM DTT. Das in vitro-Transkriptionsmedium enthält weiterhin Nukleotide, z.B. einen Nukleotid-Mix, im Falle der vorliegenden Erfindung bestehend aus wie oben definierten Basen-modifizierten Nukleotide (typischerweise etwa 0,1-10 mM je Nukleotid, bevorzugt 0,1 bis 1 mM je Nukleotid (bevorzugt etwa 4 mM gesamt) und gegebenenfalls nicht-modifizierten Nukleotiden. Wie oben definierte Basen-modifizierte Nukleotide (etwa 1 mM je Nukleotid, bevorzugt etwa 4 mM gesamt), z.B. Pseudouridin-5'-triphosphat, 5-Methylcytidin-5'-triphosphat, etc., werden typischerweise in einer Menge zugegeben, dass das basenmodifizierte Nukleotid komplett durch das natürliche Nukleotid ersetzt wird. Es können jedoch auch Mischungen eines oder mehrerer basenmodifizierter Nukleotide und eines oder mehrerer natürlich auftretender Nukleotide anstelle eines bestimmten Nukleotids eingesetzt werden, d.h. es können also ein oder mehrere wie zuvor beschriebene Basen-modifizierte Nukleotide im Austausch gegen ein oder mehrere der natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U auftreten und gegebenenfalls zusätzlich ein oder mehrere natürlich vorkommende Nukleotide A, G, C oder U, falls nicht alle natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U ausgetauscht werden sollen. Durch selektive Zugabe der gewünschten Base zu dem in vitro-Transkriptionsmedium kann daher der Gehalt, d.h. das Auftreten und die Menge, der gewünschten Basen-Modifikation in der transkribierten Basen-modifizierten RNA-Sequenz gesteuert werden. Ein geeignetes in vitro-Transkriptionsmedium enthält ebenfalls eine RNA Polymerase, z.B. z.B. T7-RNA-Polymerase (bspw. T7-Opti mRNA Kit, CureVac, Tübingen, Deutschland), T3-RNA-Polymerase oder SP6, typischerweise etwa 10 bis 500 U, bevorzugt etwa 25 bis 250 U, stärker bevorzugt etwa 50 bis 150 U, und am stärksten bevorzugt etwa 100 U RNA-Polymerase. Das in vitro-Transkriptionsmedium wird weiterhin bevorzugt frei von RNase gehalten, um einen Abbau der transkribierten RNA zu vermeiden. Ein geeignetes in vitro-Transkriptionsmedium enthält daher gegebenenfalls zusätzlich einen RNase-Inhibitor.
  • Die Nukleinsäure wird in einem Schritt c) im in vitro-Transkriptionsmedium inkubiert und transkribiert, typischerweise für etwa 30 bis 120 Minuten, bevorzugt etwa 40 bis 90 Minuten und am stärksten bevorzugt etwa 60 Minuten bei etwa 30-45°C, bevorzugt bei 37-42°C. Die Inkubationstemperatur richtet sich nach der verwendeten RNA-Polymerase, z.B. bei T7-RNA-Polymerase etwa 37°C. Die durch die Transkription erhaltenen Nukleinsäure ist bevorzugt eine RNA, noch bevorzugter eine mRNA.
  • Nach der Inkubation kann gegebenenfalls in Schritt d) des erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptionsverfahrens eine Aufreinigung der Reaktion stattfinden. Dazu kann jedes im Stand der Technik bekanntes geeignetes Verfahren verwendet werden, z.B. chromatographische Aufreinigungsverfahren, z.B. Affinitätschromatographie, Gelfitration, etc. Durch die Aufreinigung können nicht-eingebaute, d.h. überschüssige Nukleotide aus dem in vitro-Transkriptionsmedium entfernt werden.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung richtet sich auf ein in vitro- Transkriptions- und Translationsverfahren zur Steigerung der Expression eines Proteins, umfassend folgende Schritte:
    • a) Bereitstellung einer Nukleinsäure, kodierend ein wie zuvor beschriebenes Protein;
    • b) Zugabe der Nukleinsäure zu einem in vitro-Transkriptionsmedium, umfassend eine RNA-Polymerase, einen geeigneten Puffer, einen Nukleinsäure-Mix, umfassend ein oder mehrere wie zuvor beschriebene Basen-modifizierte Nukleotide, im Austausch gegen ein oder mehrere der natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U, und gegebenenfalls ein oder mehrere natürlich vorkommende Nukleotide A, G, C oder U, falls nicht alle natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U ausgetauscht werden sollen, und gegebenenfalls einen RNase-Inhibitor;
    • c) Inkubation der Nukleinsäure im in vitro-Transkriptionsmedium und in vitro-Transkription der Nukleinsäure;
    • d) gegebenenfalls Aufreinigung und Entfernung der nicht-eingebauten Nukleotide aus dem in vitro-Transkriptionsmedium;
    • e) Zugabe der in Schritt c) (und ggf. in Schritt d) erhaltenen Basen-modifizierten Nukleinsäure zu einem in vitro-Translationsmedium;
    • f) Inkubation der Basen-modifizierten Nukleinsäure im in vitro-Translationsmedium und in vitro Translation des durch die Basen-modifizierte Nukleinsäure kodierten Proteins;
    • g) ggf. Aufreinigung des in Schritt f) translatierten Proteins.
  • Die Schritte a), b) c) und d) des erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptions- und Translationsverfahren zur Steigerung der Expression eines Proteins sind identisch zu den Schritten a), b) c) und d) des oben beschriebenen erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptionsverfahrens.
  • In Schritt e) des erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptions- und Translationsverfahrens zur Steigerung der Expression eines Proteins wird die in Schritt c) (und ggf. in Schritt d) Basen-modifizierte Nukleinsäure zu einem geeigneten in vitro-Translationsmedium zugegeben. Ein geeignetes in vitro-Translationsmedium umfasst bspw. Reticulozyten-Lysat, Weizenkeim-Extrakt, etc.. Ein solches Medium umfasst üblicherweise weiterhin einen Aminosäure-Mix. Der Aminosäure-Mix umfasst typischerweise (alle) natürlich vorkommenden Aminosäuren und gegebenenfalls modifizierte Aminosäuren, z.B. 35S-Methionin (bspw. zur Kontrolle der Translationseffizienz über Autoradiographie). Ein geeignetes in vitro-Translationsmedium umfasst weiterhin einen Reaktionspuffer. In vitro-Translationsmedien sind bspw. durch Krieg und Melton (1987) (P. A. Krieg and D. A. Melton (1987) In vitro RNA synthesis with SP6 RNA polymerase Methods Enzymol 155: 397-415), deren diesbezüglicher Offenbarungsgehalt in die vorliegende Erfindung vollumfänglich eingeschlossen ist, beschrieben.
  • In einem Schritt f) des erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptions- und Translationsverfahrens zur Steigerung der Expression eines Proteins wird die Basen-modifizierte Nukleinsäure in dem in vitro-Translationsmedium inkubiert und das durch die Basen-modifizierte Nukleinsäure kodierte Protein in vitro translatiert. Die Inkubation dauert typischerweise etwa 30 bis 120 Minuten, bevorzugt etwa 40 bis 90 Minuten und am stärksten bevorzugt etwa 60 Minuten. Die Inkubationstemperatur liegt typischerweise in einem Bereich von etwa 20-40°C, bevorzugt bei etwa 25 bis etwa 35°C und am stärksten bevorzugt bei etwa 30°C.
  • Die Schritte b) bis f) des erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptions- und Translationsverfahrens zur Steigerung der Expression eines Proteins oder einzelne Schritte der Schritte b) bis f) können miteinander kombiniert werden, d.h. gemeinsam durchgeführt werden. Dabei werden bevorzugt alle notwendigen Komponenten zu Beginn gemeinsam oder während der Reaktion nacheinander entsprechend der Abfolge der beschriebenen Schritte b) bis f) dem Reaktionsmedium zugegeben.
  • In einem optionalen Schritt g) kann das in Schritt f) erhaltene translatierte Protein aufgereinigt werden. Eine Aufreinigung kann mit Verfahren erfolgen, die einem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt sind, z.B. Chromatographie, wie bspw. Affinitätschromatographie (HPLC, FPLC, etc.), Ionenaustauschchromatographie, Gelchromatographie, Größenausschlusschromatographie, Gaschromatographie, oder Antikörper-Detektion, oder biophysikalische Verfahren, wie z.B. NMR-Analysen, etc. (siehe z.B. Maniatis et al. (2001) supra). Chromatographische Verfahren, einschließlich affinitätschromatographische Verfahren, können in geeigneter Weise Tags zur Aufreinigung einsetzen, wie zuvor beschrieben, z.B. ein Hexahistidin-Tag (HIS-Tag, Polyhistidin-Tag), ein Streptavidin-Tag (Strep-Tag), ein SBP-Tag (Streptavidin-Bindungs-Tag), ein GST(Glutathion-S-Transferase)-Tag, etc.). Weiterhin kann die Aufreinigung über ein Antikörper-Epitop erfolgen (Antikörper-Bindungs-Tag), z.B. ein Myc-Tag, ein Swa11-Epitop, ein FLAG-Tag, ein HA-Tag, etc., d.h. über Erkennung des Epitops über den (immobilisierten) Antikörper.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung richtet sich auf ein in vitro-Transkriptions- und Translationsverfahrens zur Steigerung der Expression eines Proteins in einer Wirtszelle, umfassend folgende Schritte:
    • a) Bereitstellung einer Nukleinsäure, kodierend ein wie zuvor beschriebenes Protein;
    • b) Zugabe der Nukleinsäure zu einem in vitro-Transkriptionsmedium, umfassend eine RNA-Polymerase, einen geeigneten Puffer, ein oder mehrere wie zuvor beschriebene Basen-modifizierte Nukleotide im Austausch gegen ein oder mehrere der natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U und gegebenenfalls ein oder mehrere natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U, falls nicht alle natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U ausgetauscht werden sollen;
    • c) Inkubation der Nukleinsäure im in vitro-Transkriptionsmedium und in vitro-Transkription der Nukleinsäure; d) gegebenenfalls Aufreinigung und Entfernung der nicht-eingebauten Nukleotide aus dem in vitro-Transkriptionsmedium;
    • e') Transfektion der in Schritt c) (und ggf. d)) erhaltenen Basen-modifizierten Nukleinsäure in eine Wirtsszelle;
    • f') Inkubation der Basen-modifizierten Nukleinsäure in der Wirtszelle und Translation des durch die Basen-modifizierte Nukleinsäure kodierten Proteins in der Wirtszelle;
    • g') Optional Isolation und/oder Aufreinigung des in Schritt f') translatierten Proteins.
  • Die Schritte a), b) c) und d) des erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptions- und Translationsverfahrens zur Steigerung der Expression eines Proteins in einer Wirtszelle sind identisch zu den Schritten a), b) c) und d) des oben beschriebenen erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptionsverfahrens und des oben beschriebenen erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptions- und Translationsverfahrens zur Steigerung der Expression eines Proteins Gemäß Schritt e') des erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptions- und Translationsverfahrens erfolgt die Transfektion der in Schritt c) (und ggf. d)) erhaltenen Basen-modifizierten Nukleinsäure in eine Wirtszelle. Die Transfektion erfolgt im Allgemeinen über im Stand der Technik bekannte Transfektionsverfahren (siehe bspw. Maniatis et al. (2001) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Habor, NY). Geeignete Transfektionsverfahren schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, z.B. Elektroporations-Verfahren einschließlich modifizierter Elektroporations-Verfahren (z.B. Nukleofektion), Calciumphosphate-Verfahren, z.B. das Calcium-Copräzipitations-Verfahren, das DEAE-Dextran-Verfahren, das Lipofektions-Verfahren, z.B. das Transferrin-vermittelte Lipofektions-Verfahren, Polypren-Transfektion, Partikelbeschuss, Nanoplexe, z.B. PLGA, Polyplexe, z.B. PEI, Protoplasten-Fusion und das Mikroinjektions-Verfahren, wobei sich insbesondere das Lipofektion-Verfahren als geeignetes Verfahren herausgestellt hat.
  • Im Zusammenhang mit Schritt e') des erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptions- und Translationsverfahrens zur Steigerung der Expression eines Proteins in einer Wirtszelle umfasst eine (geeignete) Wirtszelle jede Zelle, die eine Expression der erfindungsgemäß verwendeten Basen-modifizierten RNA erlaubt, bevorzugt jede kultivierte eukaryotische Zelle (z.B. Hefezellen, Pflanzenzellen, tierische Zellen und humane Zellen) oder prokaryotische Zelle (bakterielle Zellen). Bevorzugt werden zur Expression des durch die erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA kodierten Proteins Zellen von multizellulären Organismen ausgewählt, falls posttranslationale Modifikationen, z.B. Glykosylierung des kodierten Proteins, erforderlich sind (N und/oder O-gekoppelt). Im Unterschied zu prokaryotischen Zellen, ermöglichen solche (höheren) eukaryotischen Zellen die posttranslationale Modifikation des synthetisierten Proteins. Der Fachmann kennt eine Vielzahl von solchen höheren eukaryotischen Zellen oder Zelllinien, z.B. 293T (embryonische Nierenzelllinie), HeLa (humane Cervixcarcinomzellen), CHO (Zellen aus den Ovarien chinesischer Hamster) und weitere Zelllinien, einschließlich solcher für Laborzwecke entwickelten Zellen und Zellinien, wie bspw. hTERT-MSC-, HEK293-, Sf9- oder COS-Zellen. Geeignete eukaryotische Zellen umfassen weiterhin Zellen oder Zellinien, die durch Erkrankungen oder Infektionen beeinträchtigt sind, z.B. Krebszellen, insbesondere Krebszellen jeder der hier in der Beschreibung genannten Krebsarten, durch HIV beeinträchtigte Zellen, und/oder Zellen des Immunsystems oder des Zentralen Nervensystems (CNS). Besonders bevorzugt sind als eukaryotische Zellen humane Zellen oder tierische Zellen. Geeignete Wirtszellen können ebenfalls aus eukaryotischen Mikroorganismen wie Hefe, z.B. Saccharomyces cerevisiae (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39, (1997)), Schizosaccharomyces pombe, Candida, Pichia, und filamentöse Pilze der Gattungen Aspergillus, Penicillium, etc. abgeleitet sein. Geeignete Wirtszellen umfassen ebenfalls prokaryotische Zellen, wie z.B. Bakterienzellen z.B. aus Escherichia coli oder aus Bakterien der Gattungen Bacillus, Lactococcus, Lactobacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Streptococcus, Staphylococcus, vorzugsweise E. coli, etc..
  • In Schritt f') des erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptions- und Translationsverfahrens zur Steigerung der Expression eines Proteins in einer Wirtszelle erfolgt die Inkubation der Basen-modifizierten Nukleinsäure in der Wirtszelle und die Translation des durch die Basen-modifizierte Nukleinsäure kodierten Proteins in der Wirtszelle. Dazu werden bevorzugt wirtszelleigene Expressionsmechanismen genutzt, z.B. durch Translation der (m)RNA in der Wirtzelle über Ribosomen und tRNAs. Die dabei verwendeten Inkubationstemperaturen richten sich nach den jeweils verwendeten Wirtszellsystemen.
  • In einem optionalen Schritt g') kann das in Schritt f') erhaltene translatierte Protein isoliert und/oder aufgereinigt werden. Eine Isolation des translatierten (exprimierten) Proteins umfasst dabei typischerweise eine Abtrennung des Proteins von Reaktionsbestandteilen und kann mit Verfahren erfolgen, die einem Fachmann bekannt sind, bspw. durch Zelllyse, Ultraschallaufschluss, oder ähnliche Verfahren. Eine Aufreinigung kann mit Verfahren durchgeführt werden, wie für Schritt e) des erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptions- und Translationsverfahrens zur Steigerung der Expression eines Proteins beschrieben.
  • Unabhängig von den Schritten (a) bis (d) kann die erfindungsgemäße verwendete Nukleinsäure auch durch ein in vitro Translationsverfahren der Schritte (e') bis (g') exprimiert werden, welches auch als solches Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung richtet sich auf ein in vitro-Transkriptions- und in vivo-Translationsverfahrens zur Steigerung der Expression eines (therapeutisch wirksamen) Proteins in einem Organismus, umfassend folgende Schritte:
    • a) Bereitstellung einer Nukleinsäure, kodierend ein wie zuvor beschriebenes Protein;
    • b) Zugabe der Nukleinsäure zu einem in vitro-Transkriptionsmedium, umfassend eine RNA-Polymerase, einen geeigneten Puffer, einen Nukleinsäure-Mix, umfassend ein oder mehrere wie zuvor beschriebene Basen-modifizierte Nukleotide, im Austausch gegen ein oder mehrere der natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U, und gegebenenfalls ein oder mehrere natürlich vorkommende Nukleotide A, G, C oder U, falls nicht alle natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U ausgetauscht werden sollen, und gegebenenfalls einen RNase-Inhibitor;
    • c) Inkubation der Nukleinsäure im in vitro-Transkriptionsmedium und in vitro-Transkription der Nukleinsäure;
    • d) gegebenenfalls Aufreinigung und Entfernung der nicht-eingebauten Nukleotide aus dem in vitro-Transkriptionsmedium;
    • e'') Transfektion der in Schritt c) (und ggf. d)) erhaltenen Basen-modifizierten Nukleinsäure in eine Wirtsszelle und Transplantation der transfizierten Wirtszelle in einen Organismus;
    • f) Translation des durch die Basen-modifizierte Nukleinsäure kodierten Proteins im Organismus.
  • Die Schritte a), b), c) und d) des erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptions- und in vivo-Translationsverfahrens zur Steigerung der Expression eines Proteins in einem Organismus sind identisch zu den Schritten a), b), c) und d) des oben beschriebenen erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptionsverfahrens, des oben beschriebenen erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptions- und Translationsverfahrens zur Steigerung der Expression eines Proteins und des oben beschriebenen erfindungsgemäßen in vitro-Transkriptions- und Translationsverfahrens zur Steigerung der Expression eines Proteins in einer Wirtszelle.
  • Wirtszellen in Schritt e'') können hier auch autologe Zellen umfassen, d.h. Zellen, die einem Patienten entnommen und wieder zurückgeführt werden (körpereigene Zellen).
  • Solche autologen Zellen verringern die Gefahr der Abstoßung durch das Immunsystem bei in vivo-Anwendungen. Bevorzugt werden bei autologen Zellen (gesunde oder erkrankte) Zellen aus den betroffenen Körperbereichen/Organen des Patienten eingesetzt. Transfektionsverfahren sind bevorzugt solche wie zuvor für Schritt e) beschrieben. In Schritt e'') erfolgt zusätzlich zu Schritt e) die Transplantation der Wirtszelle in einen Organismus. Ein Organismus bzw. ein Lebewesen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sind typischerweise Tiere, einschließlich Rind, Schwein, Maus, Hund, Katze, Nagetiere, Hamster, Kaninchen, etc., sowie Menschen. Alternativ zu Schritt e'') und f'') kann die Isolation und/oder Aufreinigung gemäß den Schritten f)/f') und/oder g)/g') und eine anschließende Verabreichung des translatierten (therapeutisch wirksamen) Proteins an das Lebewesen erfolgen. Die Verabreichung kann, wie für pharmazeutische Zusammensetzungen beschrieben, durchgeführt werden.
  • In Schritt f'') erfolgt die Translation des durch die Basen-modifizierte Nukleinsäure kodierten Proteins im Organismus. Die Translation erfolgt dabei durch wirtszellspezifische Systeme in Abhängigkeit der verwendeten Wirtszelle.
  • Unabhängig von den Schritten (a) bis (d) kann die erfindungsgemäße verwendete Nukleinsäure auch durch ein in vitro Translationsverfahren der Schritte (e'') bis (g'') exprimiert werden, welches auch als solches Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist.
  • Die folgenden Beispiele und Figuren sollen die vorhergehende Beschreibung, ohne darauf eingeschränkt zu werden, näher erläutern und illustrieren.
  • 1 illustriert die Ergebnisse der Basen-Modifikationen von Luciferase-RNA mit Pseudouridin-5'-triphosphat und anschließender Transfektion in Hela-Zellen (vgl. Beispiel 2A). Wie in 2 zu beobachten, wurde die Überexpression der Luciferase wesentlich verbessert (960 amol (attomol) reale Stoffmenge der unmodifizierten mRNA-Sequenz gegenüber 94015 amol reale Stoffmenge der Basen-modifizierten mRNA-Sequenz).
  • 2 zeigt die Ergebnisse der Basen-Modifikationen von Luciferase-RNA mit 5-Methylcytidin-5'-triphosphat und anschließender Transfektion in Hela-Zellen (vgl. Beispiel 2B). Wie in 2 zu beobachten, wurde ebenfalls die Überexpression der Luciferase wesentlich verbessert (960 amol reale Stoffmenge der unmodifizierten mRNA-Sequenz gegenüber 3087 amol reale Stoffmenge der Basen-modifizierten mRNA-Sequenz).
  • 3 veranschaulicht die Ergebnisse der Basen-Modifikationen von Luciferase-RNA mit Pseudouridin-5'-triphosphat und parallel mit 5-Methylcytidin-5'-triphosphat und anschließender Transfektion in hPBMC-Zellen (vgl. Beispiel 3B). Wie in 3 zu beobachten, wurde auch hier die Überexpression der Luciferase wesentlich verbessert (260 amol reale Stoffmenge der unmodifizierten mRNA-Sequenz gegenüber 3351 amol reale Stoffmenge der mit Pseudouridin-5'-triphosphat modifizierten mRNA-Sequenz und 1274 amol reale Stoffmenge der mit 5-Methylcytidin-5'-triphosphat modifizierten mRNA-Sequenz).
  • 4A zeigt die mRNA-Sequenz von Luciferase (SEQ ID NO: 3) mit folgenden weiteren Modifikationen (vgl. Beispiel 1A):
    • • Stabilisierende Sequenzen aus alpha-Globin-Gen
    • • Poly-A-Schwanz aus 70 Adenosinen am 3'-Ende
    • • Poly-A-Schwanz aus 30 Cytosinen am 3'-Ende.
  • 4B zeigt die native kodierende mRNA-Sequenz von Luciferase (SEQ ID NO: 4) (vgl. Beispiel 1A)
  • 4C zeigt die mit Pseudouridin modifizierte mRNA-Sequenz von Luciferase (SEQ ID NO: 5) mit folgenden weiteren Modifikationen (vgl. Beispiel 1B):
    • • Stabilisierende Sequenzen aus alpha-Globin-Gen
    • • Poly-A-Schwanz aus 70 Adenosinen am 3'-Ende
    • • Poly-A-Schwanz aus 30 Cytosinen am 3'-Ende
  • 4D zeigt die mit Methylcytidin modifizierte mRNA-Sequenz von Luciferase (SEQ ID NO: 6,) mit folgenden weiteren Modifikationen (vgl. Beispiel 1B):
    • • Stabilisierende Sequenzen aus alpha-Globin-Gen
    • • Poly-A-Schwanz aus 70 Adenosinen am 3'-Ende
    • • Poly-A-Schwanz aus 30 Cytosinen am 3'-Ende
  • Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung näher, ohne sie einzuschränken.
  • Beispiel 1 Basen-Modifikationen von RNA:
  • A) mRNA-Konstrukte
  • Zunächst wurde als Template für die Basen-Modifikation ein Luciferase-Konstrukt (CAP-Ppluc(wt)-muag-A70-C30) erzeugt (siehe 4A, SEQ ID NO: 3), das zusätzlich zur nativen kodierenden Sequenz (SEQ ID NO: 4, siehe 4B) folgende Modifikationen aufwies.
    • • Stabilisierende Sequenzen aus alpha-Globin-Gen
    • • Poly-A-Schwanz aus etwa 70 Adenosinen am 3'-Ende
    • • Poly-A-Schwanz aus 30 Cytosinen am 3'-Ende
  • B) in vitro-Transkription
  • Zur Einbringung von erfindungsgemäß verwendeten Basen-Modifikationen wurde das Luciferase-Konstrukt (CAP-Ppluc(wt)-muag-A70-C30, siehe 4A, SEQ ID NO: 3) mittels der T7-Polymerase (T7-Opti mRNA Kit, CureVac, Tübingen, Deutschland) transkribiert. Modifizierte Nukleotide wurden dazu von TriLink (San Diego, USA) bezogen. Alle mRNA-Transkripte enthielten einen etwa 70-Basen-langen PolyA-Schwanz und eine 5'-Cap-Struktur. Die Cap-Struktur wurde durch Zugabe eines Überschusses an N7-Methylguanosin-5'-triphosphat-5'-guanosin erhalten. Pseudouridin-5'-triphosphat-modifizierte mRNA wurde durch Zugabe von Pseudouridin-5'-triphosphat anstatt von Uridintriphosphat zur in vitro-Transkriptionsreaktion erhalten (SEQ ID NO: 5, 4C) (s.u.). 5-Methylcytidin-5'-triphosphat-modifizierte RNA wurden durch Zugabe von 5-Methylcytidin-5'-triphosphat anstatt von Cytidintriphosphat zur in vitro Transkriptionsreaktion erhalten (SEQ ID NO: 6, 4D) (s.u.).
  • Beispiel 2. Einfluss von Basen-Modifikationen auf die Expression von Luciferase in Hela-Zellen
  • A) Modifikation mit Pseudouridin-5'-triphosphat
  • Um den Einfluss von verschiedenen Basen-Modifikationen auf die Expression des von der mRNA kodierten Proteins zu untersuchen, wurde ein für Luciferase kodierendes Plasmid unter Verwendung eines Mediums mit Pseudouridin-5'-triphosphat anstatt Uridin-5'-triphosphat einer in vitro-Transkription unterworfen. Die transkribierte mRNA wurde anschließend in Hela-Zellen transfiziert (s.o.). Die Expression der Luciferase wurde nach Lyse der Zellen mit Hilfe eines Luminometers gemessen. Die Überexpression der Luciferase wurde wesentlich verbessert (960 amol reale Stoffmenge der unmodifizierten mRNA-Sequenz gegenüber 94015 amol reale Stoffmenge der Basen-modifizierten mRNA-Sequenz) (siehe 1).
  • B) Modifikation mit 5-Methylcytidin-5'-triphosphat
  • Alternativ wurde eine für Luciferase kodierende Plasmid unter Verwendung eines Mediums mit 5-Methylcytidin-5'-triphosphat anstatt Cytidin-5'-triphosphat einer in vitro-Transkription unterworfen. Die transkribierte mRNA wurde anschließend in Hela-Zellen transfiziert (s.o.). Die Expression der Luciferase wurde nach Lyse der Zellen mit Hilfe eines Luminometers gemessen. Die Überexpression der Luciferase wurde wesentlich verbessert (960 amol reale Stoffmenge der unmodifizierten mRNA-Sequenz gegenüber 3087 amol reale Stoffmenge der Basen-modifizierten mRNA-Sequenz) (siehe 2).
  • Beispiel 3 Vergleichsversuche zum Einfluss von Basen-Modifikationen auf die Expression von Luciferase
    • A) Messung der Luciferase-Expression in Hela-Zellen und hPBMCs nach Elektroporation mit nicht-modifzierter und Basen-modifizierter mRNA, kodierend für Luciferase Gemäß Beispiel 1 wurden Hela-Zellen und hPBMCs mittels des EasyjecT Plus (Peqlab, Erlangen, Deutschland) mit 10 μg nicht modifizierter oder Basen-modifizierter RNA transfiziert. 16 h nach der Transfektion wurden die Zellen mit Lyse-Puffer (25 mM Tris-PO4, 2 mM EDTA, 10% Glycerin, 1% Triton-X 100, 2 mM DTT) lysiert. Die Überstände wurden mit Luciferin-Puffer (25 mM Glycylglycin, 15 mM MgSO4, 5 mM ATP, 62,5 μM Luciferin) vermischt und die Lumineszenz wurde mit Hilfe eines Luminometers (Lumat LB 9507 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Deutschland)) bestimmt.
    • B) In einem Vergleichsversuch wurden eine für Luciferase kodierende mRNA und 1) Pseudouridin-5'-triphosphat anstatt Uridin-5'-triphosphat und 2) 5-Methylcytidin-5'-triphosphat anstatt Cytidin-5'-triphosphat einer in vitro-Transkription unterworfen und in hPBMC-Zellen transfiziert. Die Expression der Luciferase wurde nach Lyse der Zellen mit Hilfe eines Luminometers gemessen. Auch hier wurde die Überexpression der Luciferase wesentlich verbessert (260 amol reale Stoffmenge der unmodifizierten mRNA-Sequenz gegenüber 3351 amol reale Stoffmenge der mit Pseudouridin-5'-triphosphat modifizierten mRNA-Sequenz und 1274 amol reale Stoffmenge der mit 5-Methylcytidin-5'-triphosphat modifizierten mRNA-Sequenz) (siehe 3).
  • Zusammenfassend wird Luciferase mit Methylcytidin als Basenmodifkation der mRNA im Vergleich zur unmodifizierten mRNA etwa 3mal mehr in Hela-Zellen und 5mal mehr in hPBMCs exprimiert. Die Modifikation der mRNA mit Pseudouridin wirkt sich noch wesentlich stärker auf die Expression der kodierten Luciferase aus. In Hela-Zellen wird bspw. Luciferase etwa 100mal mehr exprimiert und in hPBMCs etwa 13mal mehr als im Vergleich mit der unmodifizierten mRNA. Der Effekt der gesteigerten Überexpression des durch eine erfindungsgemäß verwendete Basen-modifizierte RNA kodierten Proteins ist damit auch unabhängig von der gewählten Wirtszelle.
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims (25)

  1. Verwendung einer Basen-modifizierten RNA-Sequenz zur Steigerung der Expression eines Proteins, wobei die Basen-modifizierte RNA-Sequenz mindestens eine Basen-Modifikation aufweist und für ein Protein kodiert.
  2. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Basen-modifizierte RNA einzelsträngig oder doppelsträngig, linear oder zirkulär, als rRNA, tRNA oder mRNA vorliegt.
  3. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Basen-modifizierte RNA als mRNA vorliegt.
  4. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Basen-modifizierte RNA für ein Protein kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, rekombinant erzeugten oder natürlich auftretenden Proteinen, bestehend aus Wachstumshormonen oder Wachstumsfaktoren, einschließlich TGFα, IGFs („Insuline like growth factors"), Proteine, die den Metabolismus und/oder die Hämatopoiese beeinflussen, einschließlich α-anti-Trypsin, LDL-Rezeptor, Erythropoietin (EPO), Insulin, GATA-1, oder Proteine des Blutgerinnungssystems, einschließlich der Faktoren VIII und XI, etc., [beta]-Galactosidase (lacZ), DNA-Restriktionsenzyme, einschließlich EcoRI, HindIII, Lysozyme, oder Proteasen, einschließlich Papain, Bromelain, Keratinasen, Trypsin, Chymotrypsin, Pepsin, Rennin (Chymosin), Suizym, Nortase, und Protease-Inhibitoren, ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus Abacavirsulfat, AG1776, Amprenavir (141W94 oder VX-478), Atazanavir (BMS-232632), Cathepsin S Proteaseinhibitor, D1927, D9120, Efavirenz, Emtricitabin, Enfuvirtide (T-20), Fosamprenavir (GW-433908 oder VX-175), GS 9005, GW640385 (VX-385), HCV Proteaseinhibitor, Indinavir (MK-639), L-756, 423, Levoprin-ZG, Lopinavir (ABT-378), Lopinavir/Ritonavir (LPV ABT-378/r), MK-944A, Mozenavir (DMP450), Nelfinavir (AG-1343), Nevirapin, P-1946, PL-100, Prinomastat, Ritonavir (ABT-538), RO033-4649, TMC114, Saquinavir (Ro-31-8959), Tenofovirdisoproxilfumarate, Tipranavir (PNU-140690), TLK 19781, TMC-114, Vertex 385, VX-950, oder Proteine, die die Signalweiterleitung der Zelle stimulieren, einschließlich Cytokinen, Cytokine der Klasse I der Cytokinfamilie, die 4 positionsmäßig konservierte Cysteinreste (CCCC) und eine konserviertes Sequenzmotiv Trp-Ser-X-Trp-Ser (WSXWS) aufweisen, umfassend IL-3, IL-5, GM-CSF, die IL-6-Unterfamilie, umfassend IL-6, IL-11, IL-12, oder die IL-2-Unterfamilie, umfassend IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, oder die Cytokine IL-1α, IL-1β, IL-10, Cytokine der Klasse II der Cytokinfamilie (Interferon-Rezeptor-Familie), die ebenfalls 4 positionsmäßig konservierte Cysteinreste (CCCC), jedoch kein konserviertes Sequenzmotiv Trp-Ser-X-Trp-Ser (WSXWS), aufweisen, umfassend IFN-α, IFN-β, IFN-γ, Cytokine der Tumor-Nekrose-Familie umfassen, umfassend TNF-α, TNF-β, TNF-RI, TNF-RII, CD40, Fas, oder Cytokine der Chemokin-Familie, die 7 Transmembran-Helices aufweisen und mit G-Protein interagieren, umfassend IL-8, MIP-1, RANTES, CCR5, CXR4, oder Apoptose-Faktoren oder Apoptose-verwandte oder -verknüpfte Proteinen, einschließlich AIF, Apaf z.B. Apaf-1, Apaf-2, Apaf-3, oder APO-2 (L), APO-3 (L), Apopain, Bad, Bak, Bax, Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-xS, bik, CAD, Calpain, Caspasen z.B. Caspase-1, Caspase-2, Caspase-3, Caspase-4, Caspase-5, Caspase-6, Caspase-7, Caspase-8, Caspase-9, Caspase-10, Caspase-11, ced-3, ced-9, c-Jun, c-Myc, crm A, Cytochrom C, CdR1, DcR1, DD, DED, DISC, DNA-PKCS, DR3, DR4, DR5, FADD/MORI-1, FAK, Fas (Fas-Ligand CD95/fas (Rezeptor)), FLICE/MACH, FLIP, Fodrin, fos, G-Actin, Gas-2, Gelsolin, Granzyme A/B, ICAD, ICE, JNK, Lamin A/B, MAP, MCL-1, Mdm-2, MEKK-1, MORI-1, NEDD, NF-κB, NuMa, p53, PAK-2, PARP, Perforin, PITSLRE, PKCδ, pRb, Presenilin, prICE, RAIDD, Ras, RIP, Sphingomyelinase, Thymidinkinase aus Herpes simplex, TRADD, TRAF2, TRAIL, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, Transglutaminase, oder Antigene, umfassend tumorspezifische Oberflächenantigene (TSSA), einschließlich 5T4, α5β1-Integrin, 707-AP, AFP, ART-4, B7H4, BAGE, β-Catenin/m, Bcr-abl, MN/C IX-Antigen, CA125, CAMEL, CAP-1, CASP-8, β-Catenin/m, CD4, CD19, CD20, CD22, CD25, CDC27/m, CD 30, CD33, CD52, CD56, CD80, CDK4/m, CEA, CT, Cyp-B, DAM, EGFR, ErbB3, ELF2M, EMMPRIN, EpCam, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HAST-2, hTERT (oder hTRT), iCE, IGF-1R, IL-2R, IL-5, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/Melan-A, MART-2/Ski, MC1R, Myosin/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, PAP, Proteinase-3, p190 minor bcr-abl, Pml/RARα, PRAME, PSA, PSM, PSMA, RAGE, RU1 oder RU2, SAGE, SART-1 oder SART-3, Survivin, TEL/AML1, TGFβ, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, VEGF und WT1, oder Sequenzen, umfassend NY- Eso-1 oder NY-Eso-B, oder Proteine oder Proteinsequenzen, die zu einem der oben beschriebenen Proteine eine Sequenzidentität von mindestens 80% aufweisen.
  5. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Basen-modifizierte RNA mindestens eine Basen-Modifikation aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 2-Amino-6-Chloropurineribosid-5'-triphosphat, 2-Aminoadenosin-5'-triphosphat, 2-Thiocytidin-5'-triphosphat, 2-Thiouridin-5'-triphosphat, 4-Thiouridin-5'-triphosphat, 5-Aminoallylcytidin-5'-triphosphat, 5-Aminoallyluridin-5'-triphosphat, 5-Bromocytidin-5'-triphosphat, 5-Bromouridin-5'-triphosphat, 5-Iodocytidin-5-triphosphat, 5-Iodouridin-5'-triphosphat, 5-Methylcytidin-5'-triphosphat, 5-Methyluridin-5'-triphosphat, 6-Azacytidin-5'-triphosphat, 6-Azauridin-5'-triphosphat, 6-Chloropurinribosid-5'-triphosphat, 7-Deazaadenosin-5'-triphosphat, 7-Deazaguanosin-5'-triphosphat, 8-Azaadenosin-5'-triphosphat, 8-Azidoadenosin-5'-triphosphat, Benzimidazolribosid-5'-triphosphat, N1-Methyladenosin-5'-triphosphat, N1-Methylguanosin-5'-triphosphat, N6-Methyladenosin-5'-triphosphat, O6-Methylguanosin-5'-triphosphat, Pseudouridin-5'-triphosphat, Puromycin-5'-triphosphat, oder Xanthosine-5'-triphosphat.
  6. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Basen-Modifikation ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus 5-Methylcytidin-5'-triphosphat und Pseudouridin-5'-triphosphat.
  7. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Basen-modifizierte mRNA keine Backbone- und Zucker-Modifikationen aufweist.
  8. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Basen-modifizierte mRNA zusätzlich einen G/C-Gehalt im kodierenden Bereich der Basen-modifizierten RNA aufweist, der größer ist als der G/C-Gehalt des kodierenden Bereichs der nativen RNA-Sequenz, wobei die kodierte Aminosäuresequenz gegenüber dem Wildtyp unverändert ist.
  9. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der kodierende Bereich der Basen-modifizierten RNA gegenüber dem kodierenden Bereich der nativen RNA derart verändert ist, dass mindestens ein Codon der nativen RNA, das für eine in der Zelle relativ seltene tRNA kodiert, gegen ein Codon ausgetauscht ist, das für eine in der Zelle relativ häufige tRNA kodiert, welche die gleiche Aminosäure trägt wie die relativ seltene tRNA.
  10. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Basen-modifizierte RNA zusätzlich eine 5'-Cap-Struktur aufweist, ausgewählt aus der Gruppe betsehend aus m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A und G(5')ppp(5')G.
  11. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Basen-modifizierte RNA zusätzlich einen Poly-A-Schwanz von mindestens 50 Nukleotiden aufweist.
  12. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Basen-modifizierte RNA einen Poly-C-Schwanz von mindestens 20 Nukleotiden aufweist.
  13. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Basen-modifizierte RNA zusätzlich für einen Tag zur Aufreinigung kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Hexahistidin-Tag (HIS-Tag, Polyhistidin-Tag), einem Streptavidin-Tag (Strep-Tag), einem SBP-Tag (Streptavidin-Bindungs-Tag) oder einem GST (Glutathion-S-Transferase)-Tag, oder für einen Tag für die Aufreinigung über ein Antikörper-Epitop kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Antikörper-Bindungs-Tags, einem Myc-Tag, einem Swa11-Epitop, einem FLAG-Tag oder einem HA-Tag.
  14. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Basen-modifizierte RNA zusätzlich eine Lipid-Modifizierung aufweist.
  15. Verwendung einer Basen-modifizierten RNA-Sequenz, wie in den Ansprüchen 1 bis 14 definiert, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Tumoren und Krebserkrankungen, Herz- und Kreislauferkrankungen, Infektionskrankheiten, Autoimmunkrankheiten oder monogenetischen Erkrankungen.
  16. Verwendung gemäß Anspruch 15, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zusätzlich ein Adjuvanz enthält, ausgewählt aus der Gruppe umfassend kationische Peptide bzw. Polypeptide, einschließlich Protamin, Nukleolin, Spermin oder Spermidin, und kationische Polysaccharide, einschließlich Chitosan, TDM, MOP, Muramyldipeptid, Pluronics, Alaun-Lösung, Aluminiumhydroxid, ADJUMERTM (Polyphosphazen); Aluminumphosphat-Gel; Glucane aus Algen; Algammulin; Aluminumhydroxid-Gel (Alaun); stark Protein-adsorbierendes Aluminumhydroxid-Gel; niedrig-viskoses Aluminumhydroxid-Gel; AF oder SPT (Emulsion von Squalane (5%), Tween 80 (0.2%), Pluronic L121 (1.25%), Phosphat-gepufferte Salzlösung, pH 7.4); AVRIDINETM (Propandiamin); BAY R1005TM ((N-(2-Deoxy-2-L-leucylamino-b-D-glucopyranosyl)-N-octadecyldodecanoyl-amidhydroacetat); CAICITRIOLTM (1,25-Dihydroxyvitamin D3); Calciumphosphat-Gel; CAPTM (Calciumphosphat-Nanopartikel); Cholera-Holotoxin, Cholera-Toxin-A1-Protein-A-D-Fragment-Fusionsprotein, die Untereinheit B des Choleratoxins; CRL 1005 (Block Copolymer P1205); Cytokin-enthaltende Liposome; DDA (Dimethyldioctadecylammoniumbromid); DHEA (Dehydroepiandrosteron); DMPC (Dimyristoylphosphatidylcholin); DMPG (Dimyristoylphosphatidylglycerin); DOC/Alaun-Komplex (Deoxycholinsäurenatriumsalz); Freund'sches vollständiges Adjuvanz; Freund'sches unvollständiges Adjuvanz; Gamma Inulin; Gerbu-Adjuvanz (Mischung aus: i) N-Acetylglucosaminyl-(P1-4)-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamin (GMDP), ii) Dimethyldioctadecylammoniumchlorid (DDA), iii) Zink-L-Prolin-Salz-Komplex (ZnPro-8); GM-CSF); GMDP (N-acetylglucosaminyl-(b1-4)-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin); Imiquimod (1-(2-Methypropyl)-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-4-amin); ImmTherTM (N-Acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-glycerindipalmitat); DRVs (Immunoliposome hergestellt aus Dehydrations-Rehyrdrations-Vesikeln); Interferon-γ; Interleukin-1β; Interleukin-2; Interleukin-7; Interleukin-12; ISCOMSTM („Immune Stimulating Complexes"); ISCOPREP 7.0.3.TM; Liposome; LOXORIBINETM (7-Allyl-8-oxoguanosin); LT Orales Adjuvanz (E. coli labiles Enterotoxin-Protoxin); Microspheren and Micropartikel jeder Zusammensetzung; MF59TM; (Squalene-Wasser-Emulsion); MONTANIDE ISA 51TM (aufgereinigtes unvollständiges Freund'sches Adjuvanz); MONTANIDE ISA 720TM (metabolisierbares Öl-Adjuvanz); MPLTM(3-Q-Desacyl-4'-monophosphoryl-lipid A); MTP-PE- und MTP-PE-Liposome ((N-Acetyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-(hydroxyphospho-ryloxy))ethylamid, Mononatriumsalz); MURAMETIDETM (Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3); MURAPALMITINETM und D-MURAPALMITINETM (Nac-Mur-L-Thr-D-isoGln-sn-Glycerindipalmitoyl); NAGO (Neuraminidase-galactoseoxidase); Nanospheren oder Nanopartikel jeder Zusammensetzung; NISVs (Nicht-ionische Tensid-Vesikel, „Non-Ionic Surfactant Vesicles"); PLEURANTM (β-Glucan); PLGA, PGA and PLA (Homo- und Co-Polymere von Milchsäure und Glykolsäure; Micro-/Nanospheren); PLURONIC L121TM; PMMA (Polymethylmethacrylat); PODDSTM (Oroteinoid-Microspheren); Polyethylen-Carbamat-Derivate; Poly-rA: Poly-rU (Polyadenylsäure-Polyuridylsäure-Komplex); Polysorbate 80 (Tween 80); Protein-Cochleate (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL); STIMULONTM (QS-21); Quil-A (Quil-A-Saponin); S-28463 (4-Amino-otec-dimethyl-2-ethoxymethyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-ethanol); SAF-1TM („Syntex Adjuvant Formulation"); Sendai Proteoliposome und Sendai-enthaltende Lipid-Matrices; Span-85 (Sorbitantrioleat); Specol (Emulsion von Marcol 52, Span 85 und Tween 85); Squalen oder Robane® (2,6,10,15,19,23-Hexamethyltetracosan und 2,6,10,15,19,23-Hexamethyl-2,6,10,14,18,22-Tetracosahexan); Stearyltyrosin (Octadecyltyrosinhydrochlorid); Theramid® (N-Acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-dipalmitoxypropylamid); Theronyl-MDP (TermurtideTM oder [Thr 1]-MDP; N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin); Ty-Partikel (Ty-VIPs oder Virus-artige Partikel); Walter-Reed-Liposome (Liposome enthaltend an Aluminiumhydroxid adsorbiertes Lipid A), und Lipopeptide, einschließlich Pam3Cys, oder ein Nukleinsäure-basiertes Adjuvanz, ausgewählt aus CpG- und/oder RNA-Oligonukleotiden, oder Toll-like-Rezeptor-Liganden, ausgewählt aus Liganden von TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 oder TLR13 oder Homologen davon.
  17. Verwendung gemäß Anspruch 15 oder 16, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung als Vakzine vorliegt.
  18. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei die Krebs- bzw. Tumorerkrankungen ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Melanomen, malignen Melanomen, Kolon-Karzinomen, Lymphomen, Sarkomen, Blastomen, Nierenkarzinomen, Gastrointestinalen Tumoren, Gliomen, Prostatatumoren, Blasenkrebs, Rektaltumoren, Magenkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Leberkrebs, Mammakarzinomen (= Brustkrebs), Gebärmutterkrebs, Gebärmuttehalskrebs, Akuter myeloider Leukämie (AMI), Akuter Lymphoider Leukämie (ALL), chronischer myeloider Leukämie (CML), chronischer lymphozytischre Leukämie (CLL), Hepatomen, diversen Virus-induzierten Tumoren, wie z.B. Papillomvirus-induzierten Karzinomen (z.B. Cervixkarzinom = Gebärmutterhalskrebs), Adenokarzinomen, Herpesviren-induzierten Tumoren (z.B. Burkitt's Lymphom, EBV-induziertem B Zelllymphom), Hepatitis B-induzierten Tumoren (Hepatozellkarzinomen), HTLV-1- und HTLV-2-induzierten Lymphomen, Akustikusneurinom, Lungenkarzinomen (= Lungenkrebs = Bronchialkarzinom), kleinzelligen Lungenkarzinomen, Rachenkrebs, Analkarzinom, Glioblastom, Rektumkarzinom, Astrozytom, Hirntumoren, Retinoblastom, Basaliom, Hirnmetastasen, Medulloblastomen, Scheidenkrebs, Hodenkrebs, Schilddrüsenkarzinom, Hodgkin-Syndrom, Meningeomen, Schneeberger Krankheit, Hypophysentumor, Mycosis fungoides, Karzinoien, Neurinom, Spinaliom, Burkitt-Lymphom, Kehlkopfkrebs, Nierenkrebs, Thymom, Corpuskarzinom, Knochenkrebs, Non-Hodgkin-Lymphomen, Urethrakrebs, CUP-Syndrom, Kopf-Hals-Tumoren, Oligodendrogliom, Vulvakrebs, Darmkrebs, Kolonkarzinom, Osphaguskarzinom (= Speiseröhrenkrebs), Warzenbeteiligung, Dünndarmtumoren, Kraniopharyngeomen, Ovarial-Karzinom, Weichteiltumoren, Eierstockkrebs (= Ovarialkarzinom), Pankreaskarzinom (= Bauchspeicheldrüsenkrebs), Endometriumkarzinom, Lebermetastasen, Peniskrebs, Zungenkrebs, Gallenblasenkrebs, Leukämie, Plasmozytom, Lidtumor und Prostatakrebs (= Prostatatumoren).
  19. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei die Infektionskrankheiten ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Influenza, Malaria, SARS, Gelbfieber, AIDS, Lyme-Borreliose, Leischmaniasis, Anthrax, Meningitis, viralen Infektionskrankheiten, wie AIDS, Condyloma acuminata, Dellwarze, Dengue-Fieber, Dreitagefieber, Ebolavirus, Erkältung, Frühsommermeningoenzephalitis (FSME), Grippe, Gürtelrose, Hepatitis, Herpes-Simplex Typ I, Herpes-Simplex Typ II, Herpes zoster, Influenza, Japanischer Enzephalitis, Lassafieber, Marburg-Virus, Masern, Maul- und Klausenseuche, Mononukleose, Mumps, Norwalk-Virus-Infektion, Pfeiferschem Drüsenfieber, Pocken, Polio (Kinderlähmung), Pseudokrupp, Ringelröteln, Tollwut, Warzen, West-Nil-Fieber, Windpocken, Zytomegalie-Virus (CMV), bakteriellen Infektionskrankheiten, wie Abort (Prostataentzündung), Anthrax, Appendizitis (Blinddarmentzündung), Borreliose, Botulismus, Camphylobacter, Chlamydia trachomatis (Harnröhren-, Bindehautentzündung), Cholera, Diphterie, Donavanosis, Epiglottitis, Fleckfieber, Flecktyphys, Gasbrand, Gonorhoe, Hasenpest, Heliobakter pylori, Keuchhusten, klimatischem Bubo, Knochenmarksentzündung, Legionärskrankheit, Lepra, Listeriose, Lungenentzündung, Meningitis, Bakterieller Gehirnhautentzündung, Milzbrand, Mittelohrentzündung, Mycoplasma hominis, Neugeborenensepsis (Chorioamnionitis), Noma, Paratyphus, Pest, Reitersyndrom, Rocky Mountain spotted fever, Salmonellen-Paratyphus, Salmonellen-Typhus, Scharlach, Syphilis, Tetanus, Tripper, Tsutsugamushi, Tuberkulose, Typhus, Vaginitis (Kolpitis), Weichem Schanker und durch Parasiten, Protozoen oder Pilze hervorgerufenen Inkektionskrankheiten, wie Amöbenruhr, Bilharziose, Chagas-Krankheit, Echinococcus, Fischbandwurm, Fischvergiftung (Ciguatera), Fuchsbandwurm, Fußpilz, Hundebandwurm, Kandiose, Kleienpilzflechte, Krätze (Skabies), Kutane Leishmaniose, Lamblienruhr (Giadiasis), Läuse, Malaria, Mikroskopie, Onchozerkose (Flussblindheit), Pilzerkrankungen, Rinderbandwurm, Schistosomiasis, Schlafkrankheit, Schweinebandwurm, Toxoplasmose, Trichomoniasis, Trypanosomiasis (Schlafkrankheit), Viszerale Leishmaniose, Windeldermatitis, oder Infektionen, verursacht durch den Zwergbandwurm.
  20. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei die Herz- und Kreislauferkrankungen ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus aus Koronare Herzkrankheit, Arteriosklerose, Apoplexie, Hypertonie, und neuronale Erkrankungen ausgewählt aus Alzheimerscher Krankheit, Amyotrophe Lateralsklerose, Dystonie, Epilepsie, Multiple Sklerose und Parkinsonscher Krankheit.
  21. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei die Autoimmunkrankheiten ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Autoimmun-Typ-I-Erkrankungen oder Autoimmun-Typ-II-Erkrankungen oder Autoimmun-Typ-III-Erkrankungen oder Autoimmun-Typ-IV-Erkrankungen, wie bspw. Multipler Sklerose (MS), Rheumatoider Arthritis, Diabetes, Diabetes-Typ-I (Diabetes mellitus), Systemischem Lupus Erythematosus (SLE), Chronischer Polyarthritis, Basedowscher Krankheit, Autoimmunen Formen der chronischen Hepatitis, Colitis Ulcerosa, Allergie-Typ-I-Erkrankungen, Allergie-Typ-II-Erkrankungen, Allergie-Typ-III-Erkrankungen, Allergie-Typ-IV-Erkrankungen, Fibromyalgie, Haarausfall, Morbus Bechterew, Morbus Crohn, Myasthenia gravis, Neurodermitis, Polymyalgia rheumatica, Progressiver Systemischer Sklerose (PSS), Psiorasis, Reiter-Syndrom, Rheumatischer Arthritis, Schuppenflechte oder Vaskulitis.
  22. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei die monegenetischen Erkrankungen ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus autosomal-rezessiven. Erbkrankheiten, einschließlich Adenosin-Deaminase-Mangel, Familiäre Hypercholesterinanämie, Canavan-Syndrom, Morbus Gaucher, Fanconi-Anämie, neuronale Ceroid-Lipofuszinosen, Mukoviscidose (Zystische Fibrose), Sichelzellanämie, Phenylketonurie, Alkaptonurie, Albinismus, Hypothyreose, Galactosämie, Alpha-1-Anti-Trypsin-Mangel, Xeroderma pigmentosum, Ribbing-Syndrom, Mukopolysaccharidosen, Lippen-, Kiefer-, Gaumenspalte, Laurence-Moon-Biedl-Bardet-Syndrom, Kurzripp-Polydaktylie-Syndrom, Kretinismus, Joubert-Syndrom, Progerie Typ II, Brachydaktylie, Adrenogenitalem Syndrom, und X-chromosomalen Erbkrankheiten, einschließlich Farbenblindheit, umfassend Rot-Grün-Blindheit, Fragilem X-Syndrom, Muskeldystrophie (Duchenne- und Becker-Kiener-Typ), Hämophilie A und B, G6PD-Mangel, Morbus Fabry, Mukopolysaccharidose, Norrie-Syndrom, Retinitis pigmentosa, Septischer Granulomatose, X-SCID, Ornitihin-Transcarbamylase-Mangel, Lesch-Nyhan-Syndrom, oder aus autosomal-dominanten Erbkrankheiten, einschließlich heriditäres Angioödem, Marfan-Syndrom, Neurofibromatose, Progerie Typ I, Osteogenesis imperfecta, Klippel-Trenaurnay-Syndrom, Sturge-Weber-Syndrom, Hippel-Lindau-Syndrom und Tubenöse Sklerose.
  23. In vitro-Transkriptionsverfahren zur Herstellung Basen-modifizierter RNA, umfassend folgende Schritte: a) Bereitstellung einer Nukleinsäure, kodierend ein Protein wie in Anspruch 4 definiert; b) Zugabe der Nukleinsäure zu einem in vitro-Transkriptionsmedium, umfassend eine RNA-Polymerase, einen Puffer, einen Nukleinsäure-Mix, umfassend ein oder mehrere Basen-modifizierte Nukleotide wie in Anspruch 5 definiert, im Austausch gegen ein oder mehrere der natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U, und gegebenenfalls ein oder mehrere natürlich vorkommende Nukleotide A, G, C oder U, falls nicht alle natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U ausgetauscht werden sollen, und gegebenenfalls einen RNase-Inhibitor; c) Inkubation der Nukleinsäure im in vitro-Transkriptionsmedium und in vitro-Transkription der Nukleinsäure; d) Gegebenenfalls Aufreinigung und Entfernung der nicht-eingebauten Nukleotide aus dem in vitro-Transkriptionsmedium.
  24. In vitro-Transkriptions- und Translationsverfahren zur Steigerung der Expression eines Proteins, umfassend folgende Schritte: a) Bereitstellung einer Nukleinsäure, kodierend ein Protein wie in Anspruch 4 definiert; b) Zugabe der Nukleinsäure zu einem in vitro-Transkriptionsmedium, umfassend eine RNA-Polymerase, einen Puffer, einen Nukleinsäure-Mix, umfassend ein oder mehrere Basen-modifizierte Nukleotide wie in Anspruch 5 definiert, im Austausch gegen ein oder mehrere der natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U, und gegebenenfalls ein oder mehrere natürlich vorkommende Nukleotide A, G, C oder U, falls nicht alle natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U ausgetauscht werden sollen, und gegebenenfalls einen RNase-Inhibitor; c) Inkubation der Nukleinsäure im in vitro-Transkriptionsmedium und in vitro-Transkription der Nukleinsäure; d) Gegebenenfalls Aufreinigung und Entfernung der nicht-eingebauten Nukleotide aus dem in vitro-Transkriptionsmedium; e) Zugabe der in Schritt c) (und ggf. in Schritt d) erhaltenen Basen-modifizierten Nukleinsäure zu einem in vitro-Translationsmedium; f) Inkubation der Basen-modifizierten Nukleinsäure im in vitro-Translationsmedium und in vitro Translation des durch die Basen-modifizierte Nukleinsäure kodierten Proteins; g) Optional Aufreinigung des in Schritt f) translatierten Proteins.
  25. In vitro-Transkriptions- und Translationsverfahrens zur Steigerung der Expression eines Proteins in einer Wirtszelle, umfassend folgende Schritte: a) Bereitstellung einer Nukleinsäure, kodierend ein Protein wie in Anspruch 4 definiert; b) Zugabe der Nukleinsäure zu einem in vitro-Transkriptionsmedium, umfassend eine RNA-Polymerase, einen Puffer, einen Nukleinsäure-Mix, umfassend ein oder mehrere Basen-modifizierte Nukleotide wie in Anspruch 5 definiert, im Austausch gegen ein oder mehrere der natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U, und gegebenenfalls ein oder mehrere natürlich vorkommende Nukleotide A, G, C oder U, falls nicht alle natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C oder U ausgetauscht werden sollen, und gegebenenfalls einen RNase-Inhibitor; c) Inkubation der Nukleinsäure im in vitro-Transkriptionsmedium und in vitro-Transkription der Nukleinsäure; d) Gegebenenfalls Aufreinigung und Entfernung der nicht-eingebauten Nukleotide aus dem in vitro-Transkriptionsmedium; e') Transfektion der in Schritt c) (und ggf. d)) erhaltenen Basen-modifizierten Nukleinsäure in eine Wirtsszelle; f') Inkubation der Basen-modifizierten Nukleinsäure in der Wirtszelle und Translation des durch die Basen-modifizierte Nukleinsäure kodierten Proteins in der Wirtszelle; g') Optional Isolation und/oder Aufreinigung des in Schritt f') translatierten Proteins.
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