KR101661636B1 - 세포로의 전달을 위한 이블록 공중합체 및 그의 폴리뉴클레오티드 복합체 - Google Patents

세포로의 전달을 위한 이블록 공중합체 및 그의 폴리뉴클레오티드 복합체 Download PDF

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알랜 에스. 호프만
앤서니 제이. 콘버틴
다니엘 베노이트
크레이그 엘. 더발
폴 존슨
안나 갈
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유니버시티 오브 워싱톤
페이즈알엑스, 인크.
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Abstract

공중합체, 및 이러한 공중합체의 제조 및 사용 방법이 본원에 기재되어 있다. 이러한 공중합체는 2개 이상의 블록을 갖는다: 생리적 pH에서 친수성인 하나 이상의 단위를 갖는 제1 블록, 및 소수성 기를 갖는 제2 블록. 이러한 제2 블록은 대략 생리적 pH에서 음이온성인 기를 갖는 하나 이상의 단위를 추가로 갖는다. 기재된 공중합체는 세포막, 예를 들어 세포외 막, 세포내 막, 소포, 소기관, 엔도솜, 리포솜 또는 적혈구를 붕괴시킨다. 바람직하게는, 특정 예에서, 공중합체는 막을 붕괴시키고 세포내 환경에 진입한다. 특정한 예에서, 공중합체는 엔도솜용해성이다.

Description

세포로의 전달을 위한 이블록 공중합체 및 그의 폴리뉴클레오티드 복합체 {DIBLOCK COPOLYMERS AND POLYNUCLEOTIDE COMPLEXES THEREOF FOR DELIVERY INTO CELLS}
<교차-참조>
본원은 2008년 5월 13일에 출원된 미국 가출원 제61/052,908호, 2008년 5월 13일에 출원된 미국 가출원 제61/052,914호, 2008년 8월 22일에 출원된 미국 가출원 제61/091,294호, 2008년 11월 6일에 출원된 미국 가출원 제61/112,054호, 2008년 11월 6일에 출원된 미국 가출원 제61/112,048호, 2008년 12월 12일에 출원된 미국 가출원 제61/120,769호, 2008년 12월 24일에 출원된 미국 가출원 제61/140,779호, 2008년 12월 24일에 출원된 미국 가출원 제61/140,774호 및 2009년 4월 21일에 출원된 미국 가출원 제61/171,377호의 이점을 청구하며, 상기 모든 가출원들의 내용은 각각 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.
<정부 지원 연구에 대한 진술>
본 발명은 미국 국립보건원에 의해 수여된 계약 번호 5 R01 EB 2991-03 하에 미국 정부 지원으로 이루어진 것이다. 미국 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
<기술분야>
본 발명은 유기 화학, 중합체 화학, 생화학, 분자 생물학 및 의학의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 살아있는 세포로의 폴리뉴클레오티드의 전달을 위해 비히클로서 사용되는 공중합체 (예를 들어, 이블록 공중합체) 및 폴리뉴클레오티드와의 그의 복합체에 관한 것이다.
특정 예에서, 살아있는 세포에게 치료제 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)를 제공하는 것이 유익하다. 몇몇 예에서, 살아있는 세포로의 이러한 폴리뉴클레오티드의 전달은 치료학적 이점을 제공한다.
<요약>
몇몇 실시양태에서, 친수성인 (예를 들어, 대략 생리적 pH에서) 하나 이상의 구성 단위를 포함하는 제1 블록 및 다수의 소수성 부분을 포함하는 제2 블록인, 2개 이상의 블록을 포함하는 공중합체가 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 제2 블록은 생리적 pH에서 음이온성인, 대전된 또는 비대전된 상태의 대전가능한 종을 추가로 포함한다. 그러나, pH가 대략 대전가능한 종의 pKa인 경우, 양자 모두의 형태의 대전가능한 종의 평형 분포가 존재할 것이다, 즉 약 50％는 음이온성일 것이고, 약 50％는 비대전될 것이다. pH가 대전가능한 종의 pKa로부터 더 멀어질수록, 이 평형의 상응하는 이동이 존재할 것이므로, 더 높은 pH 값에서 음이온성 형태가 우세할 것이고, 더 낮은 pH 값에서 비대전된 형태가 우세할 것이다. 본원에 기재된 실시양태는 임의의 pH 값에서의 공중합체의 형태를 포함한다. 엔도솜의 pH 값 (엔도솜 pH)에서, 대전가능한 종은 비대전된 형태로 우세하게 존재할 것이다.
바람직하게는, 본원에 기재된 중합체가 세포막과 접촉하는 특정 예에서, 본원에 기재된 중합체는 막을 붕괴시키거나 또는 다르게는 불안정화시키고, 세포내 환경에 진입한다. 구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 중합체는 엔도솜용해성 또는 다르게는 엔도솜 막 불안정화성이다.
특정 실시양태에서,
(a) 친수성 블록인 제1 블록; 및
(b) (i) 대략 생리적 pH에서 음이온성인 제1 대전가능한 종,
(ii) 대략 생리적 pH에서 양이온성인 제2 대전가능한 종
을 포함하는, 막 불안정화 소수성 블록인 제2 블록
을 포함하는, 세포막 불안정화 (예를 들어, 엔도솜용해성 또는 엔도솜-막 불안정화) 공중합체가 본원에 제공된다.
몇몇 실시양태에서,
(a) 대략 생리적 pH에서 양이온성인 제1 대전가능한 종을 포함하는 친수성 블록인 제1 블록;
(b) (i) 대략 중성의 pH에서 음이온성인 제2 대전가능한 종; 및
(ii) 대략 생리적 pH에서 양이온성인 제3 대전가능한 종
을 포함하는, 막 불안정화 소수성 블록인 제2 블록; 및
(c) 제1 블록과 회합된 올리고뉴클레오티드
를 포함하는, 세포막 불안정화 (예를 들어, 엔도솜용해성 또는 엔도솜-막 불안정화) 공중합체가 본원에 제공된다.
특정 실시양태에서,
(a) 친수성 블록인 제1 블록,
(b) 아크릴산 잔기 또는 알킬아크릴산 잔기를 포함하는 막 불안정화 소수성 블록인 제2 블록
을 포함하는, 세포막 불안정화 (예를 들어, 엔도솜용해성 또는 엔도솜-막 불안정화) 공중합체가 본원에 제공된다.
한 측면에서, 본 발명은
정상 생리적 pH에서 친수성인 제1 구성 단위를 포함하는 제1 블록;
정상 생리적 pH에서 양이온성이고 제1 구성 단위와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 구성 단위;
정상 생리적 pH에서 음이온성인 제3 구성 단위;
제2 구성 단위에 공유결합으로 결합되거나; 또는
제3 구성 단위에 공유결합으로 결합되거나; 또는
제2 블록의 제4 구성 단위에 포함되거나; 또는
이들의 임의의 조합인
소수성-향상 부분
을 포함하는, 전체 전하로 실질적으로 중성인 제2 블록
을 포함하는 공중합체 (예를 들어, 이블록 공중합체)에 관한 것이다.
다양한 실시양태에서, 제1 구성 단위는 정상 생리적 pH (즉, 대략 생리적 pH)에서 양이온성이거나, 정상 생리적 pH에서 음이온성이거나, 정상 생리적 pH에서 중성이거나, 또는 정상 생리적 pH에서 쯔비터이온성이다. 몇몇 실시양태에서, 공중합체의 제1 블록은 정상 생리적 pH에서 다가양이온성이거나, 정상 생리적 pH에서 다가음이온성이거나, 정상 생리적 pH에서 중성이거나, 또는 정상 생리적 pH에서 폴리쯔비터이온성이다. 추가 실시양태에서, 공중합체의 제1 블록은 엔도솜 pH에서 정상 생리적 pH에서와 실질적으로 동일한 이온 특성을 가지며, 예를 들어 엔도솜 pH에서 다가양이온성이거나, 엔도솜 pH에서 다가음이온성이거나, 엔도솜 pH에서 중성이거나, 또는 엔도솜 pH에서 폴리쯔비터이온성이다.
한 측면에서, 본 발명은
정상 생리적 pH에서 양이온성인 제1 구성 단위를 포함하는 제1 블록;
정상 생리적 pH에서 양이온성이고 제1 구성 단위와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 구성 단위;
정상 생리적 pH에서 음이온성인 제3 구성 단위;
제2 구성 단위에 공유결합으로 결합되거나; 또는
제3 구성 단위에 공유결합으로 결합되거나; 또는
제2 블록의 제4 구성 단위에 포함되거나; 또는
이들의 임의의 조합인
소수성-향상 부분
을 포함하는, 전체 전하로 실질적으로 중성인 제2 블록
을 포함하는 공중합체 (예를 들어, 이블록 공중합체)에 관한 것이다.
본 발명의 한 측면에서, 제1 구성 단위는 양이온 질소 종 (즉, 정상 생리적 pH에서 양이온성인 질소 종)을 포함한다. 본 발명의 한 측면에서, 양이온 질소 종은 암모늄 종이다. 본 발명의 한 측면에서, 제2 구성 단위는 제1 구성 단위와 동일하다. 본 발명의 한 측면에서, 음이온 종은 카르복실산 음이온을 포함한다. 본 발명의 한 측면에서, 제1 블록은 제1 구성 단위 중에 무작위로 산재된 전하 중성 구성 단위를 추가로 포함한다. 본 발명의 한 측면에서, 제1 및/또는 제2 블록은 하나 이상의 반응성 또는 변형에 대해 순종적인 기를 포함한다. 본 발명의 한 측면에서, 존재한다면, 제4 구성 단위는 제2 블록의 약 10 중량％ 내지 약 60 중량％를 구성한다.
특정 실시양태에서, 제1 중합체 블록은 크기가 대략 10,000 달톤, 또는 약 2,000 달톤 내지 약 30,000 달톤, 또는 약 8,500 달톤 내지 약 13,000 달톤이다. 몇몇 실시양태에서, 제1 중합체 블록은 전달될 siRNA 분자 상의 순 음전하와 절대 값이 유사한 순 양전하를 갖는다.
몇몇 실시양태에서, 제2 중합체 블록은 분자량이 제1 중합체 블록과 대략 동등하거나, 또는 제1 중합체 블록의 크기의 약 0.2 내지 5배, 또는 약 1 내지 3배이고, 가장 바람직한 실시양태에서, 제2 중합체 블록은 제1 중합체 블록의 크기의 대략 2 내지 3배 (두배 내지 세배)이다.
몇몇 실시양태에서, 친수성 대전된 블록은 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 siRNA를 포함하는 하나 이상의 뉴클레오티드와 복합체를 형성한다 (본원에서 예를 들어, 하나 이상의 공유 결합, 하나 이상의 이온 상호작용, 이들의 조합 등에 의해 "~와 회합된" 또는 "~에 부착된"과 상호교환가능하게 사용됨).
본 발명의 한 측면에서, 폴리뉴클레오티드 블록은 임의로 절단가능한 공유 결합을 통해 중합체 블록 중 하나에 부착된다. 본 발명의 한 측면에서, 폴리뉴클레오티드 산은 DNA, RNA 및 그의 천연 및 합성 유사체로 구성된 군에서 선택된다. 본 발명의 한 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 안티센스이다. 본 발명의 한 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 RNA이다. 본 발명의 한 측면에서, RNA는 mRNA, piRNA, miRNA 및 siRNA로 구성된 군에서 선택된다. 본 발명의 한 측면에서, RNA는 siRNA이다.
본 발명의 한 측면에서, 각 구성 단위는 에틸렌계 단량체로부터 독립적으로 유도되고, 공중합체의 합성은 리빙 중합을 포함한다.
본 발명의 한 측면에서, 에틸렌계 단량체는 아크릴계 단량체이다.
특정 실시양태에서, 하기 화학식 I을 갖는 이블록 공중합체가 본원에 제공된다.
<화학식 I>
Figure 112010081450799-pct00001
몇몇 실시양태에서:
A0, A1, A2, A3 및 A4는 -C-C-, -C-, -C(O)(C)aC(O)O-, -O(C)aC(O)- 및 -O(C)bO-로 구성된 군에서 선택되고; 여기서,
a는 1 내지 4이고;
b는 2 내지 4이고;
Y4는 수소, (1C-10C)알킬, (3C-6C)시클로알킬, O-(1C-10C)알킬, -C(O)O(1C-10C)알킬, C(O)NR6(1C-10C) 및 아릴로 구성된 군에서 선택되며, 이들 중 임의의 것은 1개 이상의 불소 기로 임의로 치환되고;
Y0, Y1 및 Y2는 공유 결합, (1C-10C)알킬-, -C(O)O(2C-10C)알킬-, -OC(O)(1C-10C)알킬-, -O(2C-10C)알킬- 및 -S(2C-10C)알킬-, -C(O)NR6(2C-10C)알킬-로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고;
Y3은 공유 결합, (1C-10C)알킬 및 (6C-10C)아릴로 구성된 군에서 선택되고; 여기서,
R1 내지 R5 및 Y0 내지 Y4로 완전히 치환되지 않은 A1 내지 A4의 4가 탄소 원자는 적절한 개수의 수소 원자로 완성되고;
R1, R2, R3, R4, R5 및 R6은 각각 수소, -CN, 알킬, 알키닐, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고, 이들 중 임의의 것은 1개 이상의 불소 원자로 임의로 치환될 수 있고;
Q0은 생리적 pH에서 친수성이고 생리적 pH에서 적어도 부분적으로 양으로 대전되는 잔기 (예를 들어, 아미노, 알킬아미노, 암모늄, 알킬암모늄, 구아니딘, 이미다졸릴, 피리딜 등); 생리적 pH에서 적어도 부분적으로 음으로 대전되나 더 낮은 pH에서 양성자화를 거치는 잔기 (예를 들어, 카르복실, 술폰아미드, 보로네이트, 포스포네이트, 포스페이트 등); 생리적 pH에서 실질적으로 중성인 (또는 비대전되는) 잔기 (예를 들어, 히드록시, 폴리옥실화된 알킬, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 티올 등); 생리적 pH에서 적어도 부분적으로 쯔비터이온성인 잔기 (예를 들어, 생리적 pH에서 포스페이트 기 및 암모늄 기를 포함하는 단량체 잔기); 접합가능한 또는 관능화가능한 잔기 (예를 들어, 반응성 기를 포함하는 잔기, 예를 들어 아지드, 알킨, 숙신이미드 에스테르, 테트라플루오로페닐 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, p-니트로페닐 에스테르, 피리딜 디술피드 등); 또는 수소로 구성된 군에서 선택된 잔기이고;
Q1은 생리적 pH에서 친수성이고 생리적 pH에서 적어도 부분적으로 양으로 대전되는 잔기 (예를 들어, 아미노, 알킬아미노, 암모늄, 알킬암모늄, 구아니딘, 이미다졸릴, 피리딜 등); 생리적 pH에서 적어도 부분적으로 음으로 대전되나 더 낮은 pH에서 양성자화를 거치는 잔기 (예를 들어, 카르복실, 술폰아미드, 보로네이트, 포스포네이트, 포스페이트 등); 생리적 pH에서 실질적으로 중성인 잔기 (예를 들어, 히드록시, 폴리옥실화된 알킬, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 티올 등); 또는 생리적 pH에서 적어도 부분적으로 쯔비터이온성인 잔기 (예를 들어, 생리적 pH에서 포스페이트 기 및 암모늄 기를 포함하는 단량체 잔기)이고;
Q2는 아미노, 알킬아미노, 암모늄, 알킬암모늄, 구아니딘, 이미다졸릴 및 피리딜을 포함하나 이에 제한되지 않는, 생리적 pH에서 양으로 대전되는 잔기이고;
Q3은 카르복실, 술폰아미드, 보로네이트, 포스포네이트 및 포스페이트를 포함하나 이에 제한되지 않는, 생리적 pH에서 음으로 대전되나 더 낮은 pH에서 양성자화를 거치는 잔기이고;
m은 0 내지 1.0 미만 (예를 들어, 0 내지 약 0.49)이고;
n은 0 초과 내지 1.0 (예를 들어, 약 0.51 내지 약 1.0)이고; 여기서
m + n = 1이고,
p는 약 0.1 내지 약 0.9 (예를 들어, 약 0.2 내지 약 0.5)이고;
q는 약 0.1 내지 약 0.9 (예를 들어, 약 0.2 내지 약 0.5)이고; 여기서
r은 0 내지 약 0.8 (예를 들어, 0 내지 약 0.6)이고; 여기서
p + q + r = 1이고,
v는 약 1 내지 약 25 kDa이고;
w는 약 1 내지 약 50 kDa이다.
구체적 실시양태에서, v는 약 5 내지 약 25 kDa이다. 추가 또는 별법의 구체적 실시양태에서, w는 약 1 내지 약 50 kDa이다.
몇몇 실시양태에서, p 및 q에 의해 표시되는 단량체 잔기의 개수 또는 비율은 서로의 약 30％, 서로의 약 20％, 서로의 약 10％ 등 이내에 있다. 구체적 실시양태에서, p는 q와 실질적으로 동일하다. 특정 실시양태에서, 적어도 부분적으로 대전된은 일반적으로 미량보다 많은 양의 대전된 종을 포함하며, 예를 들어 잔기의 20％ 이상이 대전된, 잔기의 30％ 이상이 대전된, 잔기의 40％ 이상이 대전된, 잔기의 50％ 이상이 대전된, 잔기의 60％ 이상이 대전된, 잔기의 70％ 이상이 대전된 등을 포함한다.
특정 실시양태에서, m은 0이고, Q1은 생리적 pH에서 친수성이고 실질적으로 중성인 (또는 비대전되는) 잔기이다. 즉, 생리적 pH에서, Q1 상의 임의의 대전가능한 종은 우세하게 중성 형태이다. 몇몇 실시양태에서, 실질적으로 비대전된은 예를 들어, 5％ 미만 대전된, 3％ 미만 대전된, 1％ 미만 대전된 등을 포함한다. 특정 실시양태에서, m은 0이고, Q1은 생리적 pH에서 친수성이고 적어도 부분적으로 양이온성인 잔기이다. 특정 실시양태에서, m은 0이고, Q1은 생리적 pH에서 친수성이고 적어도 부분적으로 음이온성인 잔기이다. 특정 실시양태에서, m은 >0이고, n은 >0이고, Q0 또는 Q1 중 하나는 생리적 pH에서 친수성이고 적어도 부분적으로 양이온성인 잔기이고, Q0 또는 Q1 중 다른 하나는 생리적 pH에서 친수성이고 실질적으로 중성인 잔기이다. 특정 실시양태에서, m은 >0이고, n은 >0이고, Q0 또는 Q1 중 하나는 생리적 pH에서 친수성이고 적어도 부분적으로 음이온성인 잔기이고, Q0 또는 Q1 중 다른 하나는 생리적 pH에서 친수성이고 실질적으로 중성인 잔기이다. 특정 실시양태에서, m은 >0이고, n은 >0이고, Q1은 생리적 pH에서 친수성이고 적어도 부분적으로 양이온성인 잔기이고, Q0은 접합가능한 또는 관능화가능한 잔기인 잔기이다. 특정 실시양태에서, m은 >0이고, n은 >0이고, Q1은 생리적 pH에서 친수성이고 실질적으로 중성인 잔기이고, Q0은 접합가능한 또는 관능화가능한 잔기인 잔기이다.
특정 실시양태에서, 하기 화학식 Ia를 갖는 제1 블록, 하기 화학식 Ib를 갖는 제2 블록인, 2개 이상의 블록을 갖는 공중합체가 본원에 제공되며, 여기에 기재된 용어는 각각 상기 기재된 바와 같다.
<화학식 Ia>
Figure 112010081450799-pct00002
<화학식 Ib>
Figure 112010081450799-pct00003
특정 실시양태에서, 하기 화학식 II의 화합물이 본원에 제공된다.
<화학식 II>
Figure 112010081450799-pct00004
몇몇 실시양태에서:
A0, A1, A2, A3 및 A4는 -C-C-, -C(O)(C)aC(O)O-, -O(C)aC(O)- 및 -O(C)bO-로 구성된 군에서 선택되고; 여기서,
a는 1 내지 4이고;
b는 2 내지 4이고;
Y0 및 Y4는 수소, (1C-10C)알킬, (3C-6C)시클로알킬, O-(1C-10C)알킬, -C(O)O(1C-10C)알킬, C(O)NR6(1C-10C) 및 아릴로 구성된 군에서 독립적으로 선택되며, 이들 중 임의의 것은 1개 이상의 불소 기로 임의로 치환되고;
Y1 및 Y2는 공유 결합, (1C-10C)알킬, -C(O)O(2C-10C)알킬-, -OC(O)(1C-10C)알킬-, -O(2C-10C)알킬- 및 -S(2C-10C)알킬-, -C(O)NR6(2C-10C)알킬-로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고;
Y3은 공유 결합, (1C-10C)알킬 및 (6C-10C)아릴로 구성된 군에서 선택되고; 여기서,
R1 내지 R5 및 Y0 내지 Y4로 완전히 치환되지 않은 A1 내지 A4의 4가 탄소 원자는 적절한 개수의 수소 원자로 완성되고;
R1, R2, R3, R4, R5, 및 R6은 각각 수소, -CN, 알킬, 알키닐, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고, 이들 중 임의의 것은 1개 이상의 불소 원자로 임의로 치환될 수 있고;
Q1 및 Q2는 아미노, 알킬아미노, 암모늄, 알킬암모늄, 구아니딘, 이미다졸릴 및 피리딜을 포함하나 이에 제한되지 않는, 생리적 pH에서 양으로 대전되는 잔기이고;
Q3은 카르복실, 술폰아미드, 보로네이트, 포스포네이트 및 포스페이트를 포함하나 이에 제한되지 않는, 생리적 pH에서 음으로 대전되나 더 낮은 pH에서 양성자화를 거치는 잔기이고;
m은 0 내지 약 0.49이고;
n은 약 0.51 내지 약 1.0이고; 여기서
m + n = 1이고,
p는 약 0.2 내지 약 0.5이고;
q는 약 0.2 내지 약 0.5이고; 여기서
p는 q와 실질적으로 동일하고;
r은 0 내지 약 0.6이고; 여기서
p + q + r = 1이고,
v는 약 5 내지 약 25 kDa이고;
w는 약 5 내지 약 50 kDa이다.
몇몇 실시양태에서, 하기 화학식 III을 갖는 (정상 생리적 pH에서) 이블록 공중합체가 본원에 제공된다.
<화학식 III>
Figure 112010081450799-pct00005
몇몇 실시양태에서:
A0, A1, A2, A3 및 A4는 -C-C-, -C(O)(C)aC(O)O-, -O(C)aC(O)- 및 -O(C)bO-로 구성된 군에서 선택되고; 여기서,
a는 1 내지 4이고;
b는 2 내지 4이고;
R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10 및 R11은 수소, (1C-5C)알킬, (3C-6C)시클로알킬 및 페닐로 구성된 군에서 독립적으로 선택되며, 이들 중 임의의 것은 1개 이상의 불소 원자로 임의로 치환될 수 있고;
Y0 및 Y4는 수소, (1C-10C)알킬, (3C-6C)시클로알킬, O-(1C-10C)알킬, -C(O)O(1C-10C)알킬 및 페닐로 구성된 군에서 독립적으로 선택되며, 이들 중 임의의 것은 1개 이상의 불소 기로 임의로 치환되고;
Y1 및 Y2는 공유 결합, (1C-10C)알킬, -C(O)O(2C-10C)알킬-, -OC(O)(1C-10C)알킬-, -O(2C-10C)알킬- 및 -S(2C-10C)알킬-로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고;
Y3은 공유 결합, (1C-5C)알킬 및 페닐로 구성된 군에서 선택되고; 여기서,
R7 내지 R11 및 Y0 내지 Y4로 완전히 치환되지 않은 A1 내지 A4의 4가 탄소 원자는 적절한 개수의 수소 원자로 완성되고;
Z는 생리적으로 허용되는 반대이온이고,
m은 0 내지 약 0.49이고;
n은 약 0.51 내지 약 1.0이고; 여기서
m + n = 1이고,
p는 약 0.2 내지 약 0.5이고;
q는 약 0.2 내지 약 0.5이고; 여기서
p는 q와 실질적으로 동일하고;
r은 0 내지 약 0.6이고; 여기서
p + q + r = 1이고,
v는 약 5 내지 약 25 kDa이고;
w는 약 5 내지 약 50 kDa이다.
본 발명의 한 측면에서,
A1은 -C-C-이고;
Y1은 -C(O)OCH2CH2-이고;
R6은 수소이고;
R7 및 R8은 각각 -CH3이고;
R2는 -CH3이다.
본 발명의 한 측면에서,
A2는 -C-C-이고;
Y2는 -C(O)OCH2CH2-이고;
R9는 수소이고;
R10 및 R11은 각각 -CH3이고;
R3은 -CH3이다.
본 발명의 한 측면에서,
A3은 -C-C-이고;
R3은 CH3CH2CH2-이고;
Y3은 공유 결합이고;
Z는 생리적으로 허용되는 음이온 (예를 들어, 다가양이온 또는 다수의 양이온)이다.
특정 실시양태에서,
A4는 -C-C-이고;
R5는 수소 및 -CH3으로 구성된 군에서 선택되고;
Y4는 -C(O)O(CH2)3CH3이다.
몇몇 실시양태에서,
A0은 C-C-이고;
R1은 수소 및 (1C-3C)알킬로 구성된 군에서 선택되고;
Y0은 -C(O)O(1C-3C)알킬로 구성된 군에서 선택된다.
몇몇 실시양태에서, m은 0이다. 특정 실시양태에서, r은 0이다. 몇몇 실시양태에서, m 및 r은 양자 모두 0이다.
특정 실시양태에서, 세포를 중합체:그의 폴리뉴클레오티드 복합체와 접촉시키는 것을 포함하는, 폴리뉴클레오티드를 세포로 전달하는 방법이 본원에 제공된다. 구체적 실시양태에서, 중합체:폴리뉴클레오티드 복합체는 비제한적 예로서, 이온 및 비이온 상호작용, 예컨대 하나 이상의 공유 결합, 이들의 조합 등을 포함하는 임의의 적합한 방식으로 부착된다. 구체적 실시양태에서, 세포를 중합체 및 폴리뉴클레오티드의 공유결합 접합체와 접촉시키는 것을 포함하는, 폴리뉴클레오티드를 세포로 전달하는 방법이 본원에 제공된다.
본 발명의 한 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA 및 그의 천연 및 합성 유사체로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명의 한 측면에서, DNA, RNA 또는 그의 천연 및 합성 유사체는 안티센스이다. 본 발명의 한 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 RNA이다. 본 발명의 한 측면에서, RNA는 siRNA이다. 본 발명의 한 측면에서, siRNA는 생체내에서 세포로 전달된다. 본 발명의 한 측면에서, 본 발명의 중합체는 표적화 부분에 부착되거나 이와 복합체를 형성한다. 본 발명의 한 측면에서, 표적화 부분은 공중합체 (예를 들어, 이블록 공중합체)의 α-말단에 공유결합으로 부착된다. 본 발명의 한 측면에서, 표적화 부분은 공중합체의 ω-말단에 공유결합으로 부착되거나, 또는 공중합체 (예를 들어, 이블록 공중합체)의 펜던트 기에 공유결합으로 부착된다. 본 발명의 한 측면에서, 표적화 부분은 항체, 항체 단편, 항체형 분자, 펩티드, 시클릭 펩티드 및 소분자에서 선택되나 이에 제한되지 않는다.
<참고문헌 도입>
본 명세서에 언급된 모든 공개 및 특허 출원은 각 개별 공개 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참고로 도입되는 것으로 명시된 바와 동일한 정도로 인용되는 목적을 위해 본원에 참고로 도입된다.
본 발명의 신규 특징은 첨부된 청구항에 구체적으로 기재되어 있다. 본 발명의 특징 및 장점은 본 발명의 원리가 사용된 예시적 실시양태를 기술하는 하기 상세한 설명 및 하기 첨부된 도면을 참고로 하여 더 잘 이해될 것이다:
도 1은 본원에 기재된 다양한 중합체의 예시적 요약이다.
도 2는 [PEGMAw]-[B-P-D]의 예시적 합성이다.
도 3은 P7-PEGMA100-40 kDa의 예시적 특징화이다.
도 4는 PEGMA-DMAEMA 공중합체의 조성 및 특성의 예시적 기재이다.
도 5는 [PEGMAw-MAA(NHS)]-[B-P-D]의 예시적 합성이다.
도 6은 PEGMA 및 MAA-NHS의 예시적 RAFT 공중합이다.
도 7은 DMAEMA 및 MAA-NHS의 예시적 RAFT 공중합이다.
도 8은 PDSMA의 예시적 합성이다.
도 9는 siRNA 접합을 위한 HPMA-PDSMA 공중합체의 예시적 합성이다.
도 10은 (A) 중합체 및 (B) 중합체/siRNA 구축물의 용혈을 예시한다.
도 11은 FAM-표지된 siRNA 및 중합체/siRNA 복합체의 HeLa 세포 내재화를 예시한다.
도 12는 siRNA 중합체 캐리어의 기능으로서 비특이적 HeLa 세포독성 (A) 및 GAPDH 녹다운(knockdown) (B)를 예시한다.
도 13은 HeLa에서 GAPDH 녹다운을 예시한다.
도 14는 폴리[HPMA]-b-[(PAA)(BMA)(DMAEMA)]에 대한 중합체 설계를 예시한다.
도 15는 피리딜 디술피드-CTA의 합성을 예시한다.
도 16은 펩티드 시스테인과 피리딜 디술피드 중합체 말단 기의 반응을 예시한다.
도 17은 펩티드-중합체 접합체의 특징화를 위한 SDS PAGE 겔을 예시한다.
도 18은 지질 이중층 막의 pH-의존적 붕괴를 촉발하는 중합체의 능력을 측정하는데 사용되는 막 붕괴 검정을 예시한다.
도 19는 중합체 접합 후 펩티드 세포내 편재화를 예시한다.
도 20은 pH-반응성 블록이 결핍된 접합체가 대조군 양자 모두와 유사하였고 유의한 독성을 초래하지 않았다는 것을 예시한다.
도 21은 펩티드 접합체의 생물활성을 예시한다.
<발명의 상세한 설명>
본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 표시되고 기재되어 있으나, 이러한 실시양태가 오직 예시할 목적으로 제공된다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 수많은 변동, 변화 및 치환이 본 발명에서 벗어나지 않고 당업자에게 일어날 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명의 실시에서 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 하기 청구항이 본 발명의 범위를 한정하고, 이들 청구항 및 그의 등가물의 범위 내의 방법 및 구조가 이에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
중합체
제공된 특정 실시양태에서, 본 발명은 담체 중합체 및 중합체:폴리뉴클레오티드 구축물을 제공한다. 특정 예에서, 이들 중합체 및 중합체:폴리뉴클레오티드 구축물은 세포로의 치료학적 폴리뉴클레오티드의 전달을 위한 안전하고 강건한 시스템에 대한 필요성을 충족시킨다.
특정 실시양태에서,
(a) 친수성 블록인 제1 블록; 및
(b) (i) 대략 생리적 pH에서 음이온성인 제1 대전가능한 종,
(ii) 대략 생리적 pH에서 양이온성인 제2 대전가능한 종
을 포함하는, 막 불안정화 소수성 블록인 제2 블록
을 포함하는, 세포막 불안정화 (예를 들어, 엔도솜용해성 또는 엔도솜-막 불안정화) 공중합체가 본원에 제공된다.
몇몇 실시양태에서,
(a) 대략 생리적 pH에서 양이온성인 제1 대전가능한 종을 포함하는 친수성 블록인 제1 블록;
(b) (i) 대략 중성의 pH에서 음이온성인 제2 대전가능한 종; 및
(ii) 대략 생리적 pH에서 양이온성인 제3 대전가능한 종
을 포함하는, 막 불안정화 소수성 블록인 제2 블록; 및
(c) 제1 블록과 회합된 올리고뉴클레오티드
를 포함하는, 세포막 불안정화 (예를 들어, 엔도솜용해성 또는 엔도솜-막 불안정화) 공중합체가 본원에 제공된다.
본원에 기재된 중합체의 구체적 실시양태에서, 각 대전가능한 종은 상이한 구성 단위 상에 존재한다. 몇몇 실시양태에서, 제1 구성 단위는 제1 대전가능한 종을 포함한다. 추가 또는 별법의 실시양태에서, 제2 구성 단위는 제2 대전가능한 종을 포함한다. 추가 또는 별법의 실시양태에서, 제3 구성 단위는 제3 대전가능한 종을 포함한다.
본 발명의 몇몇 구성 단위는 정상 생리적 pH에서 양이온성 또는 음이온성인 것으로 언급된다. 그러므로, 특정 예에서, 정상 생리적 pH에서, 종은 양성자화 (양이온성, 양으로 대전) 또는 탈양성자화 (음이온성, 음으로 대전)되도록 야기하는 pKa를 갖는다. 생리적 pH에서 본원에서 바람직한 양이온 종은 질소 종, 예컨대 암모늄, -NRR'R", 구아니디늄 (-NRC(=NR'H)+NR"R'", 당업자에게 공지된 기각 기준형 포함)이며, 여기서 R 기는 독립적으로 수소, 알킬, 시클로알킬 또는 아릴이거나, 또는 동일한 또는 인접한 질소 원자에 결합된 2개의 R 기는 또한 서로 결합되어 헤테로시클릭 종, 예컨대 피롤, 이미다졸, 인돌 등을 형성할 수 있다. 정상 생리적 pH에서 양이온성이라고 본원에 기재된 단량체 잔기 또는 구성 단위는 탈양성자화가능한 양이온 종을 포함하는 양이온으로 대전되거나 대전가능한 종을 포함한다.
본원에 기재된 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 생리적 pH에서 양이온성 또는 양으로 대전되는 구성 단위 (예를 들어, 특정 친수성 구성 단위 포함)는 하나 이상의 아미노 기, 알킬아미노 기, 구아니딘 기, 이미다졸릴 기, 피리딜 기 등, 또는 그의 양성자화된, 알킬화된 또는 다르게는 대전된 형태를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 본원에서 사용되는 정상 생리적 pH에서 양이온성인 구성 단위는 비제한적 예로서, 디알킬아미노알킬메타크릴레이트 (예를 들어, DMAEMA)의 단량체 잔기를 포함한다. 본원에 기재된 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 생리적 pH에서 음이온성이거나 음으로 대전되는 구성 단위 (예를 들어, 특정 친수성 구성 단위 포함)는 비제한적 예로서, 카르복실레이트, 술폰아미드, 보로네이트, 포스포네이트, 포스페이트 등을 포함하는 하나 이상의 산 기 또는 그의 짝염기를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 본원에서 사용되는 정상 생리적 pH에서 음이온성이거나 음으로 대전되는 구성 단위는 비제한적 예로서, 아크릴산, 알킬 아크릴산 (예를 들어, 메틸 아크릴산, 에틸 아크릴산, 프로필 아크릴산 등) 등의 단량체 잔기를 포함한다. 본원에 기재된 다양한 실시양태에서, 생리적 pH에서 중성인 친수성 구성 단위는 하나 이상의 친수성 기, 예를 들어 히드록시, 폴리옥실화된 알킬, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 티올 등을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 본원에서 사용되는 정상 생리적 pH에서 중성인 친수성 구성 단위는 비제한적 예로서, PEG화된 아크릴산, PEG화된 메타크릴산, 히드록시알킬아크릴산, 히드록시알킬알크아크릴산 (예를 들어, HPMA) 등의 단량체 잔기를 포함한다. 본원에 기재된 다양한 실시양태에서, 생리적 pH에서 쯔비터이온성인 친수성 구성 단위는 생리적 pH에서 음이온성 또는 음으로 대전되는 기 및 생리적 pH에서 양이온성 또는 양으로 대전되는 기를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 본원에서 사용되는 정상 생리적 pH에서 쯔비터이온성인 친수성 구성 단위는 비제한적 예로서, 제US 7,300,990호에 기재된 것과 같은 생리적 pH에서 포스페이트 기 및 암모늄 기를 포함하는 단량체 잔기 등을 포함하며, 상기 특허는 본원에 참고로 도입된다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 중합체는 접합가능한 또는 관능화가능한 측쇄 (예를 들어, 단량체 잔기의 펜던트 기)를 포함하는 하나 이상의 구성 단위를 추가로 포함한다. 몇몇 예에서, 접합가능한 또는 관능화가능한 측쇄는 화학분야에 공지된 방법, 예를 들어 "클릭" 화학을 통한 추가 관능성의 중합후 도입을 위해 사용될 수 있는 하나 이상의 반응성 기를 보유하는 기이다 ("클릭" 반응의 예에 대해, 문헌 [Wu, P.; Fokin, V. V. Catalytic Azide-Alkyne Cycloaddition: Reactivity and Applications. Aldrichim. Acta, 2007, 40, 7-17] 참조). 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 접합가능한 또는 관능화가능한 측쇄는 임의의 적합한 활성화된 기, 예컨대 제한 없이 N-히드로숙신이미드 (NHS)에스테르, HOBt (1-히드록시벤조트리아졸) 에스테르, p-니트로페닐 에스테르, 테트라플루오로페닐 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 피리딜 디술피드 기 등 중 하나 이상을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 정상 생리적 pH에서 음이온성인 구성 단위는 카르복실산, 예컨대, 제한없이, 2-프로필 아크릴산의 단량체 잔기를 포함하나 (즉, 이로부터 유도된 구성 단위, 2-프로필프로피온산, -CH2C((CH2)2CH3)(COOH)-(PAA)), 선택된 중합 공정에서 보호된 종 (예를 들어, 에스테르)으로서 또는 유리산으로서 존재할 수 있는 임의의 유기산 또는 무기산이 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본원에 기재된 음이온성 단량체 잔기 또는 구성 단위는 양성자화가능한 음이온 종을 포함하는 음이온으로 대전되거나 대전가능한 종을 포함한다. 특정 예에서, 음이온성 단량체 잔기는 중성 pH 7.0에서 음이온성일 수 있다.
단량체, 예컨대 말레산 무수물 (문헌 [Scott M. Henry, Mohamed E. H. El-Sayed, Christopher M. Pirie, Allan S. Hoffman, and Patrick S. Stayton "pH-Responsive Poly(styrene-alt-maleic anhydride) Alkylamide Copolymers for Intracellular Drug Delivery" Biomacromolecules 7:2407-2414, 2006])은 또한 제2 블록으로의 음으로 대전된 단위 (예를 들어, 제3 구성 단위)의 도입을 위해 사용될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 음으로 대전된 구성 단위는 말레산 무수물 단량체 잔기이다.
본 발명의 실시양태는 하기 화학식 I의 일반 구조를 갖는 중합체이다.
<화학식 I>
Figure 112010081450799-pct00006
몇몇 실시양태에서:
A0, A1, A2, A3 및 A4는 -C-, -C-C-, -C(O)(C)aC(O)O-, -O(C)aC(O)- 및 -O(C)bO-로 구성된 군에서 선택되고; 여기서,
a는 1 내지 4이고;
b는 2 내지 4이고;
Y4는 수소, (1C-10C)알킬, (3C-6C)시클로알킬, O-(1C-10C)알킬, -C(O)O(1C-10C)알킬, C(O)NR6(1C-10C), (4C-10C)헤테로아릴 및 (6C-10C)아릴로 구성된 군에서 선택되며, 이들 중 임의의 것은 1개 이상의 불소 기로 임의로 치환되고;
Y0, Y1 및 Y2는 공유 결합, (1C-10C)알킬, -C(O)O(2C-10C)알킬-, -OC(O)(1C-10C)알킬, -O(2C-10C)알킬- 및 -S(2C-10C)알킬-, -C(O)NR6(2C-10C)알킬-, -(4C-10C)헤테로아릴- 및 -(6C-10C)아릴-로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고;
Y3은 공유 결합, -(1C-10C)알킬-, -(4C-10C)헤테로아릴- 및 -(6C-10C)아릴-로 구성된 군에서 선택되고; 여기서,
R1 내지 R5 및 Y0 내지 Y4로 완전히 치환되지 않은 A1 내지 A4의 4가 탄소 원자는 적절한 개수의 수소 원자로 완성되고;
R1, R2, R3, R4, R5 및 R6은 수소, -CN, 알킬, 알키닐, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고, 이들 중 임의의 것은 1개 이상의 불소 원자로 임의로 치환될 수 있고;
Q0은 생리적 pH에서 친수성이고 생리적 pH에서 적어도 부분적으로 양으로 대전되는 잔기 (예를 들어, 아미노, 알킬아미노, 암모늄, 알킬암모늄, 구아니딘, 이미다졸릴, 피리딜 등); 생리적 pH에서 적어도 부분적으로 음으로 대전되나 더 낮은 pH에서 양성자화를 거치는 잔기 (예를 들어, 카르복실, 술폰아미드, 보로네이트, 포스포네이트, 포스페이트 등); 생리적 pH에서 실질적으로 중성인 (또는 비대전되는) 잔기 (예를 들어, 히드록시, 폴리옥실화된 알킬, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 티올 등); 생리적 pH에서 적어도 부분적으로 쯔비터이온성인 잔기 (예를 들어, 생리적 pH에서 포스페이트 기 및 암모늄 기를 포함하는 단량체 잔기); 접합가능한 또는 관능화가능한 잔기 (예를 들어, 반응성 기를 포함하는 잔기, 예를 들어 아지드, 알킨, 숙신이미드 에스테르, 테트라플루오로페닐 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, p-니트로페닐 에스테르, 피리딜 디술피드 등); 또는 수소로 구성된 군에서 선택된 잔기이고;
Q1은 생리적 pH에서 친수성이고 생리적 pH에서 적어도 부분적으로 양으로 대전되는 잔기 (예를 들어, 아미노, 알킬아미노, 암모늄, 알킬암모늄, 구아니딘, 이미다졸릴, 피리딜 등); 생리적 pH에서 적어도 부분적으로 음으로 대전되나 더 낮은 pH에서 양성자화를 거치는 잔기 (예를 들어, 카르복실, 술폰아미드, 보로네이트, 포스포네이트, 포스페이트 등); 생리적 pH에서 실질적으로 중성인 잔기 (예를 들어, 히드록시, 폴리옥실화된 알킬, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 티올 등); 또는 생리적 pH에서 적어도 부분적으로 쯔비터이온성인 잔기 (예를 들어, 생리적 pH에서 포스페이트 기 및 암모늄 기를 포함하는 잔기)이고;
Q2는 아미노, 알킬아미노, 암모늄, 알킬암모늄, 구아니딘, 이미다졸릴 및 피리딜을 포함하나 이에 제한되지 않는, 생리적 pH에서 양으로 대전되는 잔기이고;
Q3은 카르복실, 술폰아미드, 보로네이트, 포스포네이트 및 포스페이트를 포함하나 이에 제한되지 않는, 생리적 pH에서 음으로 대전되나 더 낮은 pH에서 양성자화를 거치는 잔기이고;
m은 약 0 내지 1.0 미만 (예를 들어, 0 내지 약 0.49)이고;
n은 0 초과 내지 약 1.0 (예를 들어, 약 0.51 내지 약 1.0)이고; 여기서
m + n = 1이고,
p는 약 0.1 내지 약 0.9 (예를 들어, 약 0.2 내지 약 0.5)이고;
q는 약 0.1 내지 약 0.9 (예를 들어, 약 0.2 내지 약 0.5)이고; 여기서
r은 0 내지 약 0.8 (예를 들어, 0 내지 약 0.6)이고; 여기서
p + q + r = 1이고,
v는 약 1 내지 약 25 kDa, 또는 약 5 내지 약 25 kDa이고;
w는 약 1 내지 약 50 kDa, 또는 약 5 내지 약 50 kDa이다.
몇몇 실시양태에서, p 및 q에 의해 표시되는 단량체 잔기의 개수 또는 비율은 서로의 약 30％, 서로의 약 20％, 서로의 약 10％ 등 이내에 있다. 구체적 실시양태에서, p는 q와 실질적으로 동일하다. 특정 실시양태에서, 적어도 부분적으로 대전된은 일반적으로 미량보다 많은 양의 대전된 종을 포함하며, 예를 들어 잔기의 20％ 이상이 대전된, 잔기의 30％ 이상이 대전된, 잔기의 40％ 이상이 대전된, 잔기의 50％ 이상이 대전된, 잔기의 60％ 이상이 대전된, 잔기의 70％ 이상이 대전된 등을 포함한다.
특정 실시양태에서, m은 0이고, Q1은 생리적 pH에서 친수성이고 실질적으로 중성인 (또는 비대전되는) 잔기이다. 몇몇 실시양태에서, 실질적으로 비대전된은 예를 들어, 5％ 미만 대전된, 3％ 미만 대전된, 1％ 미만 대전된 등을 포함한다. 특정 실시양태에서, m은 0이고, Q1은 생리적 pH에서 친수성이고 적어도 부분적으로 양이온성인 잔기이다. 특정 실시양태에서, m은 0이고, Q1은 생리적 pH에서 친수성이고 적어도 부분적으로 음이온성인 잔기이다. 특정 실시양태에서, m은 >0이고, n은 >0이고, Q0 또는 Q1 중 하나는 생리적 pH에서 친수성이고 적어도 부분적으로 양이온성인 잔기이고, Q0 또는 Q1 중 다른 하나는 생리적 pH에서 친수성이고 실질적으로 중성인 잔기이다. 특정 실시양태에서, m은 >0이고, n은 >0이고, Q0 또는 Q1 중 하나는 생리적 pH에서 친수성이고 적어도 부분적으로 음이온성인 잔기이고, Q0 또는 Q1 중 다른 하나는 생리적 pH에서 친수성이고 실질적으로 중성인 잔기이다. 특정 실시양태에서, m은 >0이고, n은 >0이고, Q1은 생리적 pH에서 친수성이고 적어도 부분적으로 양이온성인 잔기이고, Q0은 접합가능한 또는 관능화가능한 잔기인 잔기이다. 특정 실시양태에서, m은 >0이고, n은 >0이고, Q1은 생리적 pH에서 친수성이고 실질적으로 중성인 잔기이고, Q0은 접합가능한 또는 관능화가능한 잔기인 잔기이다.
몇몇 실시양태에서, 생리적 pH에서 양으로 대전되거나 또는 적어도 부분적으로 양으로 대전되는 기는 -NR'R" 기이며, 여기서 R' 및 R"는 수소, 알킬, 시클로알킬 또는 헤테로알킬 (하나 이상의 할로겐, 아미노, 히드록실 기로 임의로 치환될 수 있고/거나 하나 이상의 불포화 결합을 포함할 수 있음)에서 독립적으로 선택되고; 몇몇 실시양태에서, R' 및 R"는 함께 결합하여 비치환된 헤테로아릴 또는 지환족 헤테로사이클의 치환된 형태를 형성한다. 몇몇 실시양태에서, 생리적 pH에서 양으로 대전되거나 또는 적어도 부분적으로 양으로 대전되는 것으로 본원에 기재된 기는 비제한적 예로서, 아미노, 알킬 아미노, 디알킬 아미노, 시클릭 아미노 (예를 들어, 피페리딘 또는 N-알킬화된 피페리딘), 지환족 이미노 (예를 들어, 디히드로-피리디닐, 2,3,4,5-테트라히드로-피리디닐 등), 헤테로아릴 이미노 (예를 들어, 피리디닐) 등을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 생리적 pH에서 음으로 대전되거나 또는 적어도 부분적으로 음으로 대전되나 더 낮은 pH에서 양성자화를 거치는 것으로 본원에 기재된 기는 예컨대, 비제한적 예로서, 카르복실산 (COOH), 술폰아미드, 보론산, 술폰산, 술핀산, 황산, 인산, 포스핀산, 아인산, 탄산, 그의 탈양성자화된 짝염기 등을 포함한다.
특정 실시양태에서, 하기 화학식 II의 화합물이 본원에 제공된다.
<화학식 II>
Figure 112010081450799-pct00007
몇몇 실시양태에서:
A0, A1, A2, A3 및 A4는 -C-C-, -C(O)(C)aC(O)O-, -O(C)aC(O)- 및 -O(C)bO-로 구성된 군에서 선택되고; 여기서,
a는 1 내지 4이고;
b는 2 내지 4이고;
Y0 및 Y4는 수소, (1C-10C)알킬, (3C-6C)시클로알킬, O-(1C-10C)알킬, -C(O)O(1C-10C)알킬, C(O)NR6(1C-10C) 및 아릴로 구성된 군에서 독립적으로 선택되며, 이들 중 임의의 것은 1개 이상의 불소 기로 임의로 치환되고;
Y1 및 Y2는 공유 결합, (1C-10C)알킬, -C(O)O(2C-10C)알킬-, -OC(O)(1C-10C)알킬-, -O(2C-10C)알킬- 및 -S(2C-10C)알킬-, -C(O)NR6(2C-10C)알킬-로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고;
Y3은 공유 결합, (1C-10C)알킬 및 (6C-10C)아릴로 구성된 군에서 선택되고; 여기서,
R1 내지 R5 및 Y0 내지 Y4로 완전히 치환되지 않은 A1 내지 A4의 4가 탄소 원자는 적절한 개수의 수소 원자로 완성되고;
R1, R2, R3, R4, R5 및 R6은 수소, -CN, 알킬, 알키닐, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고, 이들 중 임의의 것은 1개 이상의 불소 원자로 임의로 치환될 수 있고;
Q1 및 Q2는 아미노, 알킬아미노, 암모늄, 알킬암모늄, 구아니딘, 이미다졸릴 및 피리딜을 포함하나 이에 제한되지 않는, 생리적 pH에서 양으로 대전되는 잔기이고;
Q3은 카르복실, 술폰아미드, 보로네이트, 포스포네이트 및 포스페이트를 포함하나 이에 제한되지 않는, 생리적 pH에서 음으로 대전되나 더 낮은 pH에서 양성자화를 거치는 잔기이고;
m은 0 내지 약 0.49이고;
n은 약 0.51 내지 약 1.0이고; 여기서
m + n = 1이고,
p는 약 0.2 내지 약 0.5이고;
q는 약 0.2 내지 약 0.5이고; 여기서
p는 q와 실질적으로 동일하고;
r은 0 내지 약 0.6이고; 여기서
p + q + r = 1이고,
v는 약 1 내지 약 25 kDa, 또는 약 5 내지 약 25 kDa이고;
w는 약 1 내지 약 50 kDa, 또는 약 5 내지 약 50 kDa이다.
특정 실시양태에서, 블록 공중합체는 하기 화학식 III의 화학식을 갖는 (정상 생리적 pH 또는 대략 중성의 pH에서) 이블록 공중합체이다.
<화학식 III>
Figure 112010081450799-pct00008
특정 실시양태에서, 지시된 바와 같이 치환된 A0, A1, A2, A3 및 A4는 화학식 III의 중합체의 구성 단위 (본원에서 "단량체 단위" 및 "단량체 잔기"와 상호교환가능하게 사용됨)를 포함한다. 구체적 실시양태에서, 화학식 III의 A 기를 구성하는 단량체 단위는 적절한 조건하에 중합가능하게 상용성이 있다. 특정 예에서, 에틸렌계 주쇄 또는 구성 단위, -(C-C-)m- 중합체 (여기서, 각 C는 H 및/또는 임의의 다른 적합한 기로 이치환됨)는 탄소-탄소 이중 결합 (>C=C<)을 함유하는 단량체를 사용하여 중합된다. 특정 실시양태에서, 각 A 기 (예를 들어, 각 A0, A1, A2, A3 및 A4)는 -C-C- (즉, 에틸렌계 단량체 단위 또는 중합체 주쇄), -C(O)(C)aC(O)O- (즉, 폴리무수물 단량체 단위 또는 중합체 주쇄), -O(C)aC(O)- (즉, 폴리에스테르 단량체 단위 또는 중합체 주쇄), -O(C)bO- (즉, 폴리알킬렌 글리콜 단량체 단위 또는 중합체 주쇄) 등 (여기서, 각 C는 상기 기재된 바와 같은 R12 및/또는 R13을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 임의의 다른 적합한 기 및/또는 H로 이치환됨)일 수 있다 (즉, 독립적으로 선택될 수 있다). 구체적 실시양태에서, 용어 "a"는 1 내지 4의 정수이고, "b"는 2 내지 4의 정수이다. 특정 예에서, 화학식 III의 주쇄에 부착된 각 "Y" 및 "R" 기 (즉, Y0, Y1, Y2, Y3, Y4, R1, R2, R3, R4, R5 중 임의의 하나)는 특정 단량체 단위의 임의의 "C" (임의의 (C)a 또는 (C)b 포함)에 결합된다. 구체적 실시양태에서, 특정 단량체 단위의 Y 및 R 양자 모두는 동일한 "C"에 부착된다. 특정의 구체적 실시양태에서, 특정 단량체 단위의 Y 및 R 양자 모두는 동일한 "C"에 부착되며, 존재하는 경우 "C"는 단량체 단위의 카르보닐 기에 대해 알파이다.
구체적 실시양태에서, R1 내지 R11은 수소, 알킬 (예를 들어, 1C-5C 알킬), 시클로알킬 (예를 들어, 3C-6C 시클로알킬) 또는 페닐에서 독립적으로 선택되며, R1 내지 R11 중 임의의 것은 1개 이상의 불소, 시클로알킬 또는 페닐로 임의로 치환되고, 이는 임의로 하나 이상의 알킬 기로 추가로 치환될 수 있다.
특정의 구체적 실시양태에서, Y0 및 Y4는 수소, 알킬 (예를 들어, 1C-10C 알킬), 시클로알킬 (예를 들어, 3C-6C 시클로알킬), O-알킬 (예를 들어, O-(2C-10C)알킬, -C(O)O-알킬 (예를 들어, -C(O)O-(2C-10C)알킬) 또는 페닐에서 독립적으로 선택되며, 이들 중 임의의 것은 1개 이상의 불소 원자로 임의로 치환된다.
몇몇 실시양태에서, Y1 및 Y2는 공유 결합, 알킬, 본원에서 바람직하게는 (1C-10C)알킬, -C(O)O-알킬, 본원에서 바람직하게는 -C(O)O-(2C-10C)알킬, -OC(O)알킬, 본원에서 바람직하게는 -OC(O)-(2C-10C)알킬, O-알킬, 본원에서 바람직하게는 -O(2C-10C)알킬 및 -S-알킬, 본원에서 바람직하게는 -S-(2C-10C)알킬에서 독립적으로 선택된다. 특정 실시양태에서, Y3은 공유 결합, 알킬, 본원에서 바람직하게는 (1C-5C)알킬 및 페닐에서 선택된다.
몇몇 실시양태에서, Z-는 존재하거나 부재한다. 특정 실시양태에서, R1 및/또는 R4는 수소이고, Z-는 OH-이다. 특정 실시양태에서, Z-는 임의의 반대이온 (예를 들어, 하나 이상의 반대이온), 바람직하게는 생체적합성 반대이온, 예컨대, 비제한적 예로서, 클로라이드, 무기 또는 유기 포스페이트, 술페이트, 술포네이트, 아세테이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 발레레이트, 카프로에이트, 카프릴레이트, 카프레이트, 라우레이트, 미리스테이트, 팔메이트, 스테아레이트, 팔미톨레이트, 올레에이트, 리놀레이트, 아라키데이트, 가돌레에이트, 박시네이트, 락테이트, 글리콜레이트, 살리실레이트, 데스아미노페닐알라닌, 데스아미노세린, 데스아미노트레오닌, ε-히드록시카프로에이트, 3-히드록시부티레이트, 4-히드록시부티레이트 또는 3-히드록시발레레이트이다. 몇몇 실시양태에서, 각 Y, R 및 임의의 불소가 선택된 주쇄의 탄소에 공유결합으로 결합된 경우, 완전히 치환되지 않은 임의의 탄소는 적절한 개수의 수소 원자로 완성된다. 숫자 m, n, p, q 및 r은 그의 블록 내의 각 구성 단위의 몰분율을 나타내고, v 및 w는 각 블록의 분자량을 제공한다.
특정 실시양태에서,
A0, A1, A2, A3 및 A4는 -C-, -C-C-, -C(O)(CR12R13)aC(O)O-, -O(CR12R13)aC(O)- 및 O(CR12R13)bO로 구성된 군에서 선택되고; 여기서,
a는 1 내지 4이고;
b는 2 내지 4이고;
R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12 및 R13은 수소, (1C-5C)알킬, (3C-6C)시클로알킬, (5C-10C)아릴, (4C-10C)헤테로아릴로 구성된 군에서 독립적으로 선택되며, 이들 중 임의의 것은 1개 이상의 불소 원자로 임의로 치환될 수 있고;
Y0 및 Y4는 수소, (1C-10C)알킬, (3C-6C)시클로알킬, O-(1C-10C)알킬, -C(O)O(1C-10C)알킬 및 페닐로 구성된 군에서 독립적으로 선택되며, 이들 중 임의의 것은 1개 이상의 불소 기로 임의로 치환되고;
Y1 및 Y2는 공유 결합, (1C-10C)알킬-, -C(O)O(2C-10C)알킬-, -OC(O)(1C-10C)알킬-, -O(2C-10C)알킬- 및 -S(2C-10C)알킬-로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고;
Y3은 공유 결합, (1C-5C)알킬 및 페닐로 구성된 군에서 선택되고;
여기서, R1 내지 R5 및 Y0 내지 Y4로 완전히 치환되지 않은 A1 내지 A4의 4가 탄소 원자는 적절한 개수의 수소 원자로 완성되고;
Z는 하나 이상의 생리적으로 허용되는 반대이온이고,
m은 0 내지 약 0.49이고;
n은 약 0.51 내지 약 1.0이고; 여기서
m + n = 1이고,
p는 약 0.2 내지 약 0.5이고;
q는 약 0.2 내지 약 0.5이고; 여기서
p는 q와 실질적으로 동일하고;
r은 0 내지 약 0.6이고; 여기서
p + q + r = 1이고,
v는 약 1 내지 약 25 kDa, 또는 약 5 내지 약 25 kDa이고;
w는 약 1 내지 약 50 kDa, 또는 약 5 내지 약 50 kDa이다.
구체적 실시양태에서,
A0, A1, A2, A3 및 A4는 -C-C-, -C(O)(C)aC(O)O-, -O(C)aC(O)- 및 -O(C)bO-로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고; 여기서,
a는 1 내지 4이고;
b는 2 내지 4이고;
R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10 및 R11은 수소, (1C-5C)알킬, (3C-6C)시클로알킬 및 페닐로 구성된 군에서 독립적으로 선택되며, 이들 중 임의의 것은 1개 이상의 불소 원자로 임의로 치환될 수 있고;
Y0 및 Y4는 수소, (1C-10C)알킬, (3C-6C)시클로알킬, O-(1C-10C)알킬, -C(O)O(1C-10C)알킬 및 페닐로 구성된 군에서 독립적으로 선택되며, 이들 중 임의의 것은 1개 이상의 불소 기로 임의로 치환되고;
Y1 및 Y2는 공유 결합, (1C-10C)알킬, -C(O)O(2C-10C)알킬-, -OC(O)(1C-10C)알킬-, -O(2C-10C)알킬- 및 -S(2C-10C)알킬-로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고;
Y3은 공유 결합, (1C-5C)알킬 및 페닐로 구성된 군에서 선택되고;
여기서, R1 내지 R5 및 Y0 내지 Y4로 완전히 치환되지 않은 A1 내지 A4의 4가 탄소 원자는 적절한 개수의 수소 원자로 완성되고;
Z는 생리적으로 허용되는 반대이온이고,
m은 0 내지 약 0.49이고;
n은 약 0.51 내지 약 1.0이고;
여기서 m + n = 1이고,
p는 약 0.2 내지 약 0.5이고;
q는 약 0.2 내지 약 0.5이고; 여기서
p는 q와 실질적으로 동일하고;
r은 0 내지 약 0.6이고; 여기서
p + q + r = 1이고,
v는 약 5 내지 약 25 kDa이고;
w는 약 5 내지 약 25 kDa이다.
몇몇 실시양태에서,
A1은 -C-C-이고;
Y1은 -C(O)OCH2CH2-이고;
R6은 수소이고;
R7 및 R8은 각각 -CH3이고;
R2는 -CH3이다.
몇몇 실시양태에서,
A2는 -C-C-이고;
Y2는 -C(O)OCH2CH2-이고;
R9는 수소이고;
R10 및 R11은 각각 -CH3이고;
R3은 -CH3이다.
몇몇 실시양태에서,
A3은 -C-C-이고;
R4는 CH3CH2CH2-이고;
Y3은 공유 결합이고;
Z-는 생리적으로 허용되는 음이온이다.
몇몇 실시양태에서,
A4는 -C-C-이고;
R5는 수소 및 -CH3으로 구성된 군에서 선택되고;
Y4는 -C(O)O(CH2)3CH3이다.
몇몇 실시양태에서,
A0은 C-C-이고;
R1은 수소 및 (1C-3C)알킬로 구성된 군에서 선택되고;
Y0은 -C(O)O(1C-3C)알킬로 구성된 군에서 선택된다.
몇몇 실시양태에서, m은 0이다.
몇몇 실시양태에서, r은 0이다.
몇몇 실시양태에서, m 및 r은 양자 모두 0이다.
제공된 몇몇 실시양태에서, 예시적이나 비제한적인 본 발명의 중합체는 아래와 같다:
<화학식 IV1>
Figure 112010081450799-pct00009
특정 예에서, 화합물 1의 구성 단위는 왼쪽 꺾쇠 괄호 및 오른쪽 둥근 괄호 내에 나타낸 바와 같고, 이는 하기 단량체로부터 유도된다:
Figure 112010081450799-pct00010
문자 p, q 및 r은 그의 블록 내의 각 구성 단위의 몰분율을 나타낸다. 문자 v 및 w는 이블록 공중합체에서 각 블록의 분자량 (수평균)을 나타낸다.
제공된 몇몇 실시양태에서, 본원에 제공된 화합물은 하기 구조를 갖는 화합물이다.
<화학식 IV2>
Figure 112010081450799-pct00011
상기 논의된 바와 같이, 문자 p, q 및 r은 그의 블록 내의 각 구성 단위의 몰분율을 나타낸다. 문자 v 및 w는 이블록 공중합체에서 각 블록의 분자량 (수평균)을 나타낸다.
몇몇 실시양태에서, 아래 중합체가 본원에 제공된다:
<화학식 IV3>
Figure 112010081450799-pct00012
<화학식 IV4>
Figure 112010081450799-pct00013
<화학식 IV5>
Figure 112010081450799-pct00014
<화학식 IV6>
Figure 112010081450799-pct00015
<화학식 IV7>
Figure 112010081450799-pct00016
<화학식 IV8>
Figure 112010081450799-pct00017
<화학식 IV9>
Figure 112010081450799-pct00018
몇몇 실시양태에서, B는 부틸 메타크릴레이트 잔기이고; P는 프로필 아크릴산 잔기이고; D 및 DMAEMA는 디메틸아미노에틸 메타크릴레이트 잔기이고; PEGMA는 폴리에틸렌글리콜 메타크릴레이트 잔기 (예를 들어, 1 내지 20개의 에틸렌 옥시드 단위 (예컨대 화합물 IV2에 예시됨), 또는 4 내지 5개의 에틸렌 옥시드 단위, 또는 7 내지 8개의 에틸렌 옥시드 단위를 가짐)이고; MAA(NHS)는 메틸아크릴산-N-히드록시 숙신이미드 잔기이고; HPMA는 N-(2-히드록시프로필) 메타크릴아미드 잔기이고; PDSM은 피리딜 디술피드 메타크릴레이트 잔기이다. 특정 실시양태에서, 용어 m, n, p, q, r, w 및 v는 본원에 기재된 바와 같다. 구체적 실시양태에서, w는 v의 약 0.1배 내지 약 5배, 또는 v의 약 1배 내지 약 5배이다.
중합체 IV1 내지 IV9는 중합체의 제1 블록을 구성하는 다양한 구성 단위(들)를 포함하는 본원에 기재된 중합체의 예이다. 더욱이, 도면 및 표에 기재된 중합체, 뿐만 아니라 구조적으로 관련된 중합체 (예컨대, MW 및/또는 단량체 잔기 비율의 변동)는 본원에 구체적으로 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 제1 블록의 구성 단위(들)는 다양하거나, 또는 제1 블록이 중성 (예를 들어, PEGMA), 양이온성 (예를 들어, DMAEMA), 음이온성 (예를 들어, PEGMA-NHS (여기서, NHS는 산으로 가수분해됨) 또는 아크릴산), 양쪽성 (예를 들어, DMAEMA-NHS (여기서, NHS는 산으로 가수분해됨)) 또는 쯔비터이온성 (예를 들어, 폴리[2-메타크릴로일옥시-2'-트리메틸암모늄에틸 포스페이트])인 구성 단위이거나 이를 포함하는 중합체를 제조하기 위해 화학적으로 처리된다. 몇몇 실시양태에서, 제1 블록 내에 피리딜 디술피드 관능기를 포함하는 중합체, 예를 들어 [PEGMA-PDSM]-[B-P-D]는 중합체-siRNA 접합체를 형성하기 위해 티올화된 siRNA와 반응될 수 있고 임의로 반응된다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 중합체는 "이블록 공중합체"이다. 용어 "공중합체"는 중합체가 2종 이상의 상이한 단량체의 중합의 결과인 것을 의미한다. 몇몇 예에서, "블록" 공중합체는 구성 단위의 독특한 하위조합이 함께 결합된 구조를 지칭한다. 특정 예에서, "블록"은 특정 특징을 갖는 중합체의 세그먼트 또는 부분 (예를 들어, 구배 공중합체의 친수성 세그먼트 또는 소수성 세그먼트)을 지칭한다. 몇몇 예에서, 이블록 공중합체는 오직 2개의 블록을 포함하며; 이러한 중합체의 도식적 일반화는 하기에 의해 표시된다: [AaBbCc ...]m - [XxYyZz ...]n (여기서, 각 문자는 구성 단위를 상징하고, 구성 단위에 대한 각 아래첨자는 특정 블록의 상기 단위의 몰분율을 나타내고, 3개의 점은 각 블록에 더 많은 구성 단위가 존재할 수 있다 (또한 더 적은 구성 단위가 존재할 수 있다)는 것을 나타내고, m 및 n은 이블록 공중합체에서 각 블록의 분자량을 나타냄). 상기 도식에 의해 제안된 바와 같이, 각 구성 단위의 개수 및 성질은 각 블록에 대해 별개로 제어된다. 도식은 각 블록 내의 구성 단위의 개수 또는 상이한 유형의 구성 단위의 개수 간의 어떠한 관계를 추론하는 것으로 전혀 의도되지 않고 그렇게 해석되어서도 안되는 것으로 이해된다. 또한, 도식은 특정 블록 내의 구성 단위의 임의의 특정 개수 또는 배열을 기술하는 것으로 의도되지 않는다. 즉, 각 블록에서, 구성 단위는 명시적으로 별도의 언급이 없는 경우 완전 무작위, 교대 무작위, 규칙 교대, 규칙 블록 또는 무작위 블록 배열로 배치될 수 있다. 예를 들어, 완전 무작위 배열은 x-x-y-z-x-y-y-z-y-z-z-z... 또는 y-z-x-y-z-y-z-x-x... 일 것이다. 교대 무작위 배열은 x-y-x-z-y-x-y-z-y-x-z... 일 것이고, 규칙 교대 배열은 x-y-z-x-y-z-x-y-z... 일 것이다. 규칙 블록 배열은 하기 일반 배열: ...x-x-x-y-y-y-z-z-z-x-x-x... 을 가지나, 무작위 블록 배열은 일반 배열: ...x-x-x-z-z-x-x-y-y-y-y-z-z-z-x-x-z-z-z-... 을 갖는다. 상기 일반적 예 중 어떠한 것에서도, 개별 구성 단위 또는 블록의 특정 병치 또는 블록 내의 구성 단위의 개수 또는 블록의 개수가 본 발명의 이블록 공중합체의 실제 구조와 관계가 있거나 이를 제한하는 것으로 의도되지 않으며 또한 어떠한 방식으로도 이렇게 해석되어서도 안된다.
구성 단위를 묶는 둥근 괄호는 구성 단위 그 자체가 블록을 형성한다는 것을 의미하지 않으며, 이를 의미하는 것으로 해석되지 않는 것으로 추가로 이해된다. 즉, 꺾쇠 괄호 내의 구성 단위는 블록 내의 다른 구성 단위와 임의의 방식으로, 즉, 완전 무작위, 교대 무작위, 규칙 교대, 규칙 블록 또는 무작위 블록 배열로 조합될 수 있다. 그러므로, 이블록 공중합체에서, l, p, q 및 r은 블록 내의 상기 구성 단위의 몰분율을 나타내고, 괄호 내의 구성 단위가 블록 내의 블록을 포함하는 것을 나타내거나 제안하는 것으로 의도되지 않고 그렇게 해석되어서도 안된다.
그러므로, 전하 중성 구성 단위가 본 발명의 이블록 공중합체의 제1 블록의 제1 구성 단위 중에 "무작위로 산재"될 수 있는 것으로 본원에 언급된 경우, 이는 제1 블록이 완전 무작위 배열에 대해 상기 기재된 바와 일반적으로 유사한 구조를 갖는다는 것을 의미한다.
몇몇 실시양태에서, 대략 중성의 pH에서 수용액 또는 매질 중 본원에 기재된 임의의 블록 공중합체의 용해도는 1 mg/mL 초과, 5 mg/mL 초과, 10 mg/mL 초과, 25 mg/mL 초과, 50 mg/mL 초과, 100 mg/mL 초과 및 500 mg/mL 초과이다. 몇몇 실시양태에서, 구체적으로, 친수성 (예를 들어, 양이온성 친수성) 제1 블록을 갖는 이블록 중합체의 경우, 소수성 블록에 존재하는 3개의 종 (음이온성, 양이온성 및 소수성)은 무작위 공중합체 블록으로서 존재하거나, 또는 다르게는 블록이 그의 길이를 가로질러 대략 순 중성 전하가 되도록 산재된 순서로 존재한다. 몇몇 예에서, 이 배향은 블록 공중합체의 증가된 용해도를 제공한다.
특정 실시양태에서, 표 1에 기재된 이블록 공중합체가 본원에 제공되며; 특정 예에서, 이러한 중합체는 폴리뉴클레오티드 복합체형성 작용제 및 담체로서 사용된다. 표 1 및 본원의 다른 곳에 기재된 이블록 공중합체의 특징은 본원의 개시내용을 기초로 하여 당업자가 이러한 공중합체를 제조할 수 있도록 그의 다른 이블록 공중합체로 번역가능할 것이며, 그러므로 본 발명의 범위 내에 포함된다는 것이 이해된다.
예시적 이블록 공중합체의 제1 블록은 디메틸아미노에틸메타크릴레이트 (DMAEMA)의 단량체 잔기로 구성되며, 이는 효율적으로 생리적 pH에서 핵산에 결합하고 축합한다. 본원에 기재된 예시적 중합체의 제2 블록은 양이온성 구성 단위로서 DMAEMA의 단량체 잔기; 음이온성 구성 단위로서 프로필 아크릴산 (PAA)의 단량체 잔기, 및 소수성 프로필 치환체로 인한, 소수성 향상 부분에 대한 기여제; 및 소수성 향상 부분을 구성하거나 포함하는 별개 구성 단위로서 부틸 메틸아크릴레이트 (BMA)의 단량체 잔기를 함유한다. 특정 예에서, 제2 블록은 pH-유도된 형태 변화를 통해 결합된 핵산의 엔도솜 탈출을 가능하게 하며, 이는 몇몇 예에서 막 불안정화를 초래한다. 몇몇 예에서, 생리적 조건하에, 제2 또는 소수성 코어 블록은 양성 (예를 들어, 양성자화된 DMAEMA) 잔기 및 음성 (예를 들어, 탈양성자화된 PAA) 잔기 양자 모두를 유사한 양으로 갖고, 이는 이온 쌍의 형성에 의해 코어의 대략 전하 중화 및 전하 안정화를 초래한다. 특정 예에서, 세포의 엔도솜 구획으로의 본원에 기재된 중합체-핵산 조성물의 유입시, 엔도솜 환경의 더 낮은 pH는 제3 구성 단위의 음이온성 잔기 (예를 들어, PAA 카르복실레이트 기)가 양성자화되게 하고 이에 의해 막 붕괴성이 되도록 야기한다. 몇몇 예에서, 음이온성 잔기의 일부 또는 전체의 양성자화 또는 중화는 PAA 산성 잔기의 전하 중화를 초래하고, 특정 예에서, 소수성 막-불안정화 형태로의 중합체의 형태 변화를 초래한다.
<표 1>
Figure 112010081450799-pct00019
본원에서 사용되는 폴리(DMAEMA) 및 다른 중합체성 실체 (예를 들어, BMA, DMAEMA 및 PAA의 공중합체 또는 공중합체 블록)는 임의의 적합한 방식으로 제조된다. 한 예에서, RAFT CTA, ECT 및 라디칼 개시제의 존재하에 DMAEMA를 중합함으로써 폴리(DMAEMA)를 제조하였다. 몇몇 예에서, 블록, 폴리(DMAEMA) (9,100 g/mol, DP 58)를 사용하여 일련의 이블록 공중합체를 제조하였으며, 여기서 BMA 함량이 증가되고 DMAEMA 및 PAA의 등몰량이 유지되었다. 생성된 중합체의 특징은 표 1에 나타낸다. 모든 7종의 이블록에 대해 유사한 블록 크기가 관찰되었으며, 중합체에 대략 20,000 g/mol의 전체 분자량을 제공하였다. 특정 실시양태에서, 더 낮은 분자량이 선택된다. 몇몇 예에서, 더 낮은 분자량 중합체는 중합체 독성을 최소화하고, 생체내 시험에 대한 순종적인 번역을 가능하게 하기 위해 중합체의 신장 배설을 가능하게 한다. 또한, 제2 블록의 이론적인 및 실험적으로 유도된 단량체 조성이 표 1에 표시되어 있다. 나열된 각 중합체는 관련 중합체의 부류의 예이다. 예를 들어 P7 부류의 중합체는 여러 버전을 가지며, 이중 하나는 표 1에서 특징화된다. 모든 중합체가 이론적인 조성에 상대적으로 근접한 반면, 모든 경우에 몇몇 편차가 관찰되며, 이는 단량체 반응성 비율의 차이로 인한 것일 가능성이 있다.
별법으로, 중합체의 ω 말단이 친수성 블록이 되도록 이블록 중합체 상의 블록의 배향이 반전된다. 다양한 실시양태에서, 이는 수많은 합성 방법을 포함하는 임의의 적합한 방식으로 달성된다. 예를 들어, 본 발명의 블록 공중합체의 합성은 PAA/BMA/DMAEMA 소수성 블록의 제조와 함께 시작되고, 생성된 PAA/BMA/DMAEMA 매크로CTA의 제2 RAFT 중합 단계로의 처리에 의한 제2 합성 단계에서 PAA/BMA/DMAEMA 소수성 블록 및 친수성 대전된 블록이 첨가된다. 별법의 접근법은 PAA/BMA/DMAEMA 매크로CTA를 환원시켜 티올 말단을 형성시킨 후, 예비형성된 친수성 대전된 중합체를 형성된 티올에 공유결합으로 부착시키는 것을 포함한다. 이 합성 접근법은 중합체 사슬의 친수성 말단의 ω-말단 상의 반응성 기의 도입 방법을 제공하며, 그러므로 중합체로의 화학적 접합에 대한 별법의 접근법을 제공한다.
본 발명의 중합체의 한 예인 이블록 공중합체 P7은 2개의 블록으로 구성되며, 한 블록은 생리적 pH에서 친수성이고 대전되는 폴리(DMAEMA)이고, 다른 블록은 단량체 단위:소수성 (BMA) 및 이온화된/소수성 또는 이온화가능한/소수성 단위 (PAA, DMAEMA)의 무작위 공중합체이다.
정의 및 실시양태
본원에 관해, 명시적으로 별도의 언급이 없는 경우 단수형의 사용은 복수형을 포함하고 역도 또한 같은 것으로 이해된다. 즉, "a" 및 "the"는 단어 변형에 상관없이 하나 이상의 대상을 지칭한다. 예를 들어, "중합체" 또는 "뉴클레오티드"는 하나의 중합체 또는 뉴클레오티드 또는 다수의 중합체들 또는 뉴클레오티드들을 지칭할 수 있다. 같은 이유로, "중합체들" 및 "뉴클레오티드들"은 다시 이러한 의도가 아니라고 명시적으로 언급되지 않는 한 또는 문맥상 명백하지 않는 한, 하나의 중합체 또는 하나의 뉴클레오티드 뿐만 아니라 다수의 중합체들 또는 뉴클레오티드들을 지칭할 것이다.
본원에서 사용되는 근사의 단어, 예컨대 제한 없이, "약", "실질적으로", "본질적으로" 및 "대략"은 이렇게 변형된 제한의 요소가 적힌 것과 정확히 같을 필요는 없으나 적힌 기재로부터 어느 정도로 달라질 수 있다는 것을 의미한다. 기재가 달라질 수 있는 정도는 당업자가 상기 요소 또는 제한의 특징 및 능력을 갖는 요소를 수용하고 여전히 고려할 변화 정도에 의존할 것이다. 일반적으로 (그러나 상기 논의에 대한 대상체), 근사 단어에 의해 변형되는 본원의 수치는 언급된 값으로부터 적어도 ±15％, 약 ±15％, 약 ±10％, 약 ±5％, 약 ±3％, 약 ±2％ 또는 약 ±1％만큼 달라질 수 있다. 본 발명으로부터의 특정 비제한적 예로서, 정상 생리적 pH에서 양이온 종 및 음이온 종 양자 모두를 함유하는 본 발명의 이블록 공중합체의 제2 블록은 "전체 전하로 실질적으로 중성" 및 실질적으로 소수성인 것으로 기재되어 있다. 그러나, 실험적으로 정확히 중성을 달성하는 것은 극히 어렵고, 양이온성 또는 음이온 종은 표 1에 예시된 바와 같이 어느 정도로 우세할 수 있다. 그러나, 당업자는 약간 과량의 한 또는 다른 대전된 종을 갖는 제2 블록을 여전히 "실질적으로 중성"인 것으로 수용할 것이다.
본원에서 사용되는 "중합체"는 "단량체"라고 불리는 하나 이상의 더 작은 분자로 구성된 분자를 지칭한다. 단량체는 그 자체와 반응하여 단독중합체를 생성할 수 있거나, 하나 이상의 다른 단량체와 반응하여 공중합체를 생성할 수 있다. 단량체의 기는 반응하여 "예비중합체"를 형성한 후 조합되어 중합체를 형성할 수 있다. 단량체는 중합체의 "구성 단위"를 포함한다.
"전하 중성" 또는 "비대전된" 구성 단위는 원자가 생리적 pH에서 완전 양전하 또는 음전하를 보유하지 않는 것을 지칭하며, 즉 이극성 분자는 여전히 "전하 중성" 또는 "비대전된"으로 고려된다. 전하 중성 구성 단위의 비제한적 예는 부틸 메타크릴레이트, CH2=C(CH3)C(O)O(CH2)3CH3 단량체로부터 유도된 것이다.
본원에서 사용되는 "알킬"은 직쇄 또는 분지쇄 완전 포화 (이중 또는 삼중 결합 없음) 탄화수소 (오직 탄소 및 수소) 기를 지칭한다. 알킬 기의 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, 삼차 부틸, 펜틸 및 헥실을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용되는 "알킬"은 다른 기로의 결합을 위한 1개가 아닌 2개의 개방 원자가를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 완전 포화 탄화수소 기를 지칭하는 "알킬렌" 기를 포함한다. 알킬렌 기의 예로는 메틸렌, -CH2-, 에틸렌, -CH2CH2-, 프로필렌, -CH2CH2CH2-, n-부틸렌, -CH2CH2CH2CH2-, sec-부틸렌, -CH2CH2CH(CH3)- 등을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 알킬 기는 1개 이상의 불소 기로 임의로 치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 "mC 내지 nC" (여기서, m 및 n은 정수임)는 지정된 기 내의 가능한 탄소 원자의 개수를 지칭한다. 즉, 기는 "m" 내지 "n" (양끝 숫자 포함)개의 탄소 원자를 함유할 수 있다. 본 발명의 알킬 기는 1 내지 10개의 탄소 원자를 포함할 수 있으며, 즉 m은 1이고, n은 10이다. 물론, 특정 알킬 기는 더 제한될 수 있다. 예를 들어 제한 없이, 본 발명의 알킬 기는 3 내지 8개의 탄소 원자로 구성될 수 있으며, 이 경우에 (3C-8C)알킬 기라고 표시될 것이다. 숫자는 포괄적이고, 지정된 숫자의 탄소 원자를 갖는 모든 직쇄 또는 분지쇄 구조를 통합한다. 예를 들어 제한 없이, "C1 내지 C4 알킬" 기는 1 내지 4개의 탄소를 갖는 모든 알킬 기, 즉, CH3-, CH3CH2-, CH3CH2CH2-, CH3CH(CH3)-, CH3CH2CH2CH2-, CH3CH2CH(CH3)-, (CH3)2CHCH2- 및 (CH3)3CH-를 지칭한다.
본원에서 사용되는 시클로알킬 기는 알킬 사슬의 말단 탄소 원자가 서로 공유결합으로 결합된 알킬 기를 지칭한다. 숫자 "m" 및 "n"은 형성된 고리 내의 탄소 원자의 개수를 지칭한다. 그러므로 예를 들어, (3C-8C) 시클로알킬 기는 3, 4, 5, 6, 7 또는 8원 고리, 즉, 시클로프로판, 시클로부탄, 시클로펜탄, 시클로헥산, 시클로헵탄 및 시클로옥탄을 지칭한다. 본 발명의 시클로알킬 기는 1개 이상의 불소 기 및/또는 하나 이상의 알킬 기로 임의로 치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 "페닐"은 나타낸 바와 같이 1개 이상의 불소 기로 임의로 치환될 수 있는
Figure 112010081450799-pct00020
기를 지칭한다.
본원에서 사용되는 "소수성-향상 부분"은 본원에서 "소수성 종"과 상호교환가능하게 사용되고, 이블록 공중합체의 구성 단위에 공유결합으로 결합된 치환체를 지칭하며, 상기 소수성-향상 부분을 보유하는 이러한 구성 단위는 이블록 공중합체가 상기 부분이 첨가되지 않은 것보다 더 막 붕괴성 또는 다르게는 더 막 불안정화성이 되게 한다. 이러한 부분의 예로는 제한 없이, 알킬 기, 시클로알킬 기 및 페닐 기를 들 수 있으며, 이들 중 임의의 것은 1개 이상의 불소 원자로 치환될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 소수성-향상 부분은 약 1 이상의 π 값을 갖는다. 화합물의 π 값은 그의 상대 친수성-친유성 값의 측정이다 (예를 들어, 문헌 [Cates, L.A., "Calculation of Drug Solubilities by Pharmacy Students" Am. J. Pharm. Educ. 45:11-13 (1981)] 참조). 본원에 기재된 소수성 단량체 잔기 또는 구성 단위는 하나 이상의 소수성 종을 포함한다. 더욱이, 친수성 단량체 잔기는 하나 이상의 친수성 종을 포함한다.
본 발명의 비제한적 예시적 중합체에 관하여, 상기 나타낸 이러한 중합체 IV1은 구성 단위가 각 단량체의 에틸렌 -C=C- 관능성의 반응으로부터 유도된 "에틸렌계"인 것으로 특징화될 것이다. 상기 예의 특정 에틸렌계 단량체는 이것이 모두 아크릴산 CH2=CHC(O)OH의 유도체인 "아크릴계"로서 추가로 기재될 수 있으며, 여기서 상기 제1 단량체는 디메틸아미노에틸 메타크릴레이트이고, 제2 단량체는 2-프로필아크릴산이고 제3 단량체는 부틸 메타크릴레이트이다.
본원에서 사용되는 "정상 생리적 pH"는 포유동물의 우세한 체액, 예컨대 혈액, 혈청, 정상적인 세포의 사이토졸 등의 pH를 지칭한다. 더욱이, 본원에서 사용되는 "정상 생리적 pH" ("대략 생리적 pH" 또는 "대략 중성의 pH"와 상호교환가능하게 사용됨)는 일반적으로 예를 들어, 약 7.2 내지 약 7.4의 pH를 포함하는 대략 중성의 pH (즉, 약 pH 7)를 지칭한다. 특정한 예에서, "정상 생리적 pH"는 수성 매질, 예컨대 혈액, 혈청 등에서 약 중성인 pH를 지칭한다.
본원에서 사용되는 RNA는 A, C, G 또는 U 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭하고, DNA는 dA, dC, dG 및 dT를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭하며, 여기서 "d"는 당이 데옥시리보스인 것을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "천연 DNA 유사체" 또는 "천연 RNA 유사체"는 하나 이상의 천연 뉴클레오티드가 특정 DNA 또는 RNA의 천연 뉴클레오티드 대신 치환되었으나 원래 DNA 또는 RNA의 기능성을 여전히 나타내는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 이는 비자연 환경에서 천연 뉴클레오티드, 예를 들어 DNA 분자에서 데옥시리보뉴클레오티드 대신 치환된 리보뉴클레오티드 또는 RNA 분자에서 리보뉴클레오티드 대신 치환된 데옥시리보뉴클레오티드를 포함한다.
본원에서 사용되는 "합성 DNA 유사체" 또는 "합성 RNA 유사체"는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. "변형된 뉴클레오티드"는 화학적으로 변형된 염기, 당 및/또는 포스포디에스테르 연결을 포함하는 비천연 뉴클레오티드를 지칭한다. 화학적 변형은 천연 뉴클레오티드의 개별 원자의 부가, 결실 또는 치환 또는 뉴클레오티드의 전체 관능기의 부가, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 변형된 뉴클레오티드는 실제로 천연 뉴클레오티드를 거의 닮지 않거나 전혀 닮지 않았으나 그럼에도 불구하고 상기 기재된 일반 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드에 혼입될 수 있는 분자를 포함할 수 있다. 전형적으로 유지되는 합성 DNA 또는 RNA 유사체의 한 특성은 모든 천연 폴리뉴클레오티드가 그렇듯이 본 발명의 이블록 공중합체와 복합체를 형성할 수 있도록 분자가 일반적으로 음으로 대전된다는 것이다.
청구항에 명시적으로 인용되지 않은 이론에 의해 얽매이지 않고, 막 불안정화 중합체는 세포막 구조 (예를 들어, 엔도솜 막)의 변화 (예를 들어, 투과성 변화)를 직접적으로 또는 간접적으로 유발하여, 중합체와 관련하여 또는 이와 독립적으로 작용제 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드)가 이러한 막 구조를 통해 통과하게 (예를 들어, 세포로 진입하거나 세포 소포 (예를 들어, 엔도솜)로부터 배출되게) 할 수 있다. 막 불안정화 중합체는 막 붕괴성 중합체일 수 있다 (그러나 반드시 막 붕괴성 중합체인 것은 아니다). 막 붕괴성 중합체는 세포 소포의 용해 또는 세포막의 붕괴를 직접적으로 또는 간접적으로 유발할 수 있다 (예를 들어, 세포막의 집단의 실질적 분획에 대해 관찰된 바와 같음).
일반적으로, 중합체의 막 불안정화 또는 막 붕괴성 특성은 다양한 수단에 의해 평가될 수 있다. 한 비제한적 접근법에서, 세포막 구조의 변화는 세포막 (예를 들어, 엔도솜 막)으로부터 작용제 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드)의 방출을 (직접적으로 또는 간접적으로) 측정하는 검정에서 평가에 의해 (예를 들어, 이러한 막의 외부 환경에서 이러한 작용제의 존재 또는 부재 또는 이러한 작용제의 활성의 측정에 의해) 관찰될 수 있다. 다른 비제한적 접근법은 예를 들어, 관심있는 세포막에 대한 대용 검정으로서 적혈구 용해 (용혈)의 측정을 포함한다. 검정은 단일 pH 값에서 또는 일정 범위의 pH 값에 걸쳐 수행될 수 있다.
본원에 제공된 블록 공중합체가 생체적합성인 것이 바람직하다. 본원에서 사용되는 "생체적합성"은 중합체 또는 그의 생체내 분해 생성물이 살아있는 조직에 유해하지 않거나 적어도 최소로 및/또는 복구가능하게 유해하고/거나; 살아있는 조직에서 면역학적 반응을 유발하지 않거나 적어도 최소로 및/또는 제어가능하게 유발하는, 중합체의 특성을 지칭한다. 염에 관하여, 양이온 종 및 음이온 종 양자 모두가 생체적합성인 것이 본원에서 바람직하다. 본원에서 사용되는 "생리적으로 허용되는"은 생체적합성과 상호교환가능하다.
특정 측면에서, 본원에 기재된 조성물 및/또는 작용제는 생체내 치료제로서 사용된다. "생체내"는 이러한 치료요법을 필요로 하는 대상체에게 투여되는 것을 의미한다. "대상체"는 본 발명의 복합체를 사용한 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 임의의 살아있는 실체를 지칭한다. 본원에서 사용되는 "대상체" 및 "환자"는 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 대상체 또는 환자는 특히 포유동물, 예컨대 제한 없이, 고양이, 개, 말, 소, 양, 토끼 등 및 본원에서 바람직하게는, 인간을 지칭한다.
본원에서 사용되는 "치료제"는 질병을 앓는 대상체에게 치료 유효량으로 투여시 대상체의 건강 및 안녕에 대한 치료학적 유익한 효과를 갖는 그의 복합체를 지칭한다. 대상체의 건강 및 안녕에 대한 치료학적 유익한 효과는 (1) 질병 치유, (2) 질병 진행의 둔화, (3) 질병 후퇴의 유발 또는 (4) 질병의 하나 이상의 증상의 경감을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용되는 치료제는 본원에서 또한 질병, 특히 본원에서 유전병에 대해 특히 감수성인 것으로 공지되거나 의심되는 환자에게 투여시 대상체의 건강 및 안녕에 대한 예방학적 유익한 효과를 갖는 임의의 복합체를 포함한다. 환자의 건강 및 안녕에 대한 예방학적 유익한 효과는 (1) 우선 질병의 발병개시의 예방 또는 지연, (2) 치료 유효량의 복합체에 의해 후퇴 수준이 달성된 경우 후퇴 수준에서 질병의 유지, 또는 (3) 치료 유효량의 복합체에 의한 치료 과정이 완료된 후 질병 재발의 예방 또는 지연을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 몇몇 예에서, 치료제는 치료학적으로 효과적인 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 폴리뉴클레오티드), 치료학적으로 효과적인 펩티드, 치료학적으로 효과적인 폴리펩티드 또는 몇몇 다른 치료학적으로 효과적인 생체분자이다. 구체적 실시양태에서, RNAi 폴리뉴클레오티드는 RNAi 메카니즘을 통해 유전자 발현의 억제를 매개할 수 있는 폴리뉴클레오티드이며, 전령 RNA (mRNA), siRNA 마이크로RNA (miRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 비대칭 간섭 RNA (aiRNA), 다이서(dicer) 기질 및 그의 전구체를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 "리빙 중합"은 첨가 중합의 익히 공지된 개념을 이용한 중합체의 합성 방법, 즉, 단량체가 성장하는 중합체 사슬 상의 활성 부위에 하나씩 첨가되나, 다른 단량체의 첨가 계속을 위한 활성 부위가 고의가 아니고서는 결코 완전히 제거되지 않는 중합을 지칭한다. 즉, 중합체 사슬은 중합체가 캡핑되지 않는 한 반응 혼합물에 더 많은 단량체의 첨가에 의해 추가로 연장하는 것이 실제로 항상 가능하며, 이는 중합이 계속되거나 중단되도록 하기 위해 가역적일 수 있으며, 통상적으로 영구적이다. 수많은 부류의 리빙 중합이 공지되어 있으나, 현재 우세한 유형은 음이온, 양이온 및 라디칼 리빙 중합이다. 이들 중에서, 현재 라디칼 중합이 본 발명에 관하여 특히 관심있다. 라디칼 중합은 에틸렌계 단량체의 이중 결합의 파이 전자 중 하나를 추출하여, 개시제가 반응된 것으로부터의 전자 이중 결합의 다른 말단에서 탄소 상의 반응성 홑전자를 초래하는 자유 라디칼 개시제를 포함한다. 그 후, 홑전자는 다른 단량체의 이중 결합과 반응하여, 안정한 시그마 결합 및 다른 자유 라디칼 등을 생성시킨다. 통상적인 개시제의 경우, 연속진행은 종결 반응, 일반적으로 2개의 성장하는 사슬의 홑전자가 조합되어 안정한 시그마 결합을 형성하는 조합 반응, 또는 활성 사슬 상의 라디칼이 다른 활성 사슬로부터 또는 반응 혼합물 중 불순물로부터 수소 원자를 제거하여 안정한 비반응성 분자 및 이중 결합을 함유하는 분자를 생성하는 불균등화에 의해 결국 중지된다. 리빙 중합에서, 종결 반응으로 진입하는 성장하는 사슬의 능력은 제거되며, 존재하는 단량체의 양에 의해서만 중합을 효과적으로 제한한다, 즉, 중합은 단량체 공급이 소모될 때까지 계속된다. 이 점에서, 나머지 자유 라디칼 종은 제한 없이, 니트록실 라디칼, 할로겐 분자, 산소 종, 예컨대 퍼옥시드 및 금속과 같은 실체에 의한 자유 라디칼 말단 기의 캡핑에 의해 또는 단순히 용매 등과의 상호작용에 의해 실질적으로 덜 활성이 된다. 그러나, 더 많은 단량체가 용액에 첨가된 경우, 상기 주목된 바를 제외하고 중합 반응이 재개될 것이다.
합성
본원에 기재된 중합체는 임의의 적합한 방식으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 본 발명의 중합체 (이러한 중합체에 관하여 에틸렌계 종으로 제한되지 않음)는 "리빙 중합"에 의해 제조되는 것이 본원에서 특히 바람직하다.
리빙 중합을 이용하여, 매우 낮은 다분산도 또는 사슬 길이의 차이의 중합체가 얻어질 수 있다. 다분산도는 통상적으로 중합체 사슬의 중량 평균 분자량을 그의 수평균 분자량으로 나눔으로써 측정된다. 수평균 분자량은 사슬의 개수로 나눈 개별 사슬 분자량의 합이다. 중량 평균 분자량은 분자량의 분자의 개수로 나눈 분자량의 제곱에 비례한다. 중량 평균 분자량이 항상 수평균 분자량보다 더 크기 때문에, 다분산도는 항상 1 이상이다. 숫자가 점점 더 가까워져서 동일하게 될수록, 즉 다분산도가 1의 값에 접근할수록, 중합체는 모든 사슬이 정확히 동일한 개수의 구성 단위를 갖는 단순분산에 더 가깝게 된다. 1에 접근하는 다분산 값은 라디칼 리빙 중합을 이용하여 달성가능하다. 다분산도의 측정 방법, 예컨대 제한없이 크기 배제 크로마토그래피, 동적 광산란, 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 크로마토그래피 및 전기분무 질량 크로마토그래피가 당분야에 익히 공지되어 있으며, 본원에 추가로 기재되지 않을 것이다.
가역적 부가-쪼개짐 사슬 이동 또는 RAFT가 본 발명의 에틸렌계 주쇄 중합체의 합성에서 사용하기 위한 본원에서 바람직한 리빙 중합 기술이다. RAFT는 당업자에게 익히 공지되어 있고, 본원에서는 오직 간단히 기재될 것이다. RAFT는 자유 라디칼 퇴행 사슬 이동 공정을 포함한다. 대부분의 RAFT 방법은 가역적 사슬 이동 메카니즘에 의해 중합을 매개하기 위해 티오카르보닐티오 화합물, 예컨대 제한 없이, 디티오에스테르, 디티오카르바메이트, 트리티오카르보네이트 및 크산테이트를 사용한다. 상기 화합물 중 임의의 화합물의 C=S 기와 중합체 라디칼의 반응은 안정화된 라디칼 중간체의 형성을 초래한다. 이들 안정화된 라디칼 중간체는 표준 라디칼 중합의 전형적인 종결 반응을 거치지 않으나, 오히려 단량체와 재개시하거나 전파시킬 수 있는 라디칼을 재도입하여 공정에서 C=S 결합을 재형성한다. C=S 결합으로의 첨가, 이어서 다음 라디칼의 쪼개짐의 이러한 주기는 모든 단량체가 소모되거나 반응이 켄칭될 때까지 계속된다. 임의의 특정 시간에 활성 라디칼의 저농도는 정상적 종결 반응을 제한한다. 다른 실시양태에서, 중합체는 크산테이트의 가역적 부가-쪼개짐 사슬 이동을 통한 거대분자 설계 (MADIX)에 의해 합성된다 (문헌 [Direct Synthesis of Double Hydrophilic Statistical Di- and Triblock Copolymers Comprised of Acrylamide and Acrylic Acid Units via the MADIX Process", Daniel Taton, et al., Macromolecular Rapid Communications, 22, No. 18, 1497-1503 (2001)]).
중합체:생체분자 구축물
특정 실시양태에서, 중합체:폴리뉴클레오티드 구축물, 또는 예를 들어, 중합체:펩티드 구축물, 중합체:폴리펩티드 구축물, 또는 다른 유형의 중합체:생체분자 구축물을 포함하는 다른 구축물이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, siRNA)는 본원에 기재된 임의의 중합체와 회합된다. 다양한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드 또는 다른 생체분자는 임의의 적합한 방식으로 (예를 들어, 공유결합 및/또는 비공유결합 상호작용에 의해) 중합체에 접합되고, 이러한 접합은 임의의 적합한 위치에서, 예를 들어 중합체의 알파 말단, 중합체의 오메가 말단, 중합체의 친수성 말단, 중합체의 소수성 말단에서 또는 중합체의 단량체 측쇄에 부착된 펜던트 기에 존재한다.
본원에서 사용되는 폴리뉴클레오티드는 사슬에서 공유결합으로 결합된 뉴클레오티드 단량체의 선형 사슬로 구성된 유기 중합체 분자의 속의 구성원을 지칭하며, 이는 당업자에게 익히 공지되어 있다. 간단히, 뉴클레오티드는 단일 포스페이트 기에 연결된 뉴클레오시드를 포함한다 (또는, 관행에 의해 폴리뉴클레오티드로의 그의 혼입을 언급하는 경우, 실제로 폴리머라제의 존재하에 중합을 거치는 종인 뉴클레오시드 트리포스페이트에 대한 속기). 결과적으로, 뉴클레오시드는 당 부분에 연결된 염기를 포함한다. 천연 폴리뉴클레오티드, 즉, 변형되지 않은 살아있는 실체에 의해 생성된 폴리뉴클레오티드의 경우, 당 부분은 리보핵산 또는 RNA를 발생시키는 리보스, 또는 데옥시리보핵산 또는 DNA를 발생시키는 데옥시리보스이다. 천연 염기는 아데닌 (A), 구아닌 (G) 또는 그의 천연 치환체 이노신 (I), 시토신 (C) 또는 티민 (T) 또는 그의 천연 치환체 우라실 (U)이다. 그러므로, 폴리뉴클레오티드는 한 뉴클레오시드의 당 부분의 3'-히드록실 기와 제2 뉴클레오시드의 당 부분의 5'-히드록실 (이는 다시 그의 3'-히드록실을 통해 또 다른 뉴클레오시드의 5'-에 연결됨) 간의 포스포디에스테르 연결에 의해 연결된 다수의 뉴클레오시드를 포함한다.
본 발명의 DNA 또는 RNA는 센스 또는 안티센스일 수 있다. DNA는 이중 가닥이며, 한 가닥은 센스 가닥이고, 다른 한 가닥은 그의 상보적 또는 안티센스 가닥이다. 센스 가닥은 동일한 서열의 RNA 버전이 단백질로 번역될 수 있다는 사실을 특징으로 한다. 안티센스 가닥은 동일한 서열에서 참여할 수 없다. 이 결과로서, 특정 DNA 또는 그의 전령 RNA에 의한 단백질 생성이 단백질 생성의 적절한 단계에서 상보적 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드의 도입에 의해 방해받을 수 있다.
간단히, 단백질 생성은 2개의 단계, 즉 전사 및 번역에서 일어난다. 전사에서, DNA가 템플레이트로서 사용되어 전령 RNA 또는 mRNA를 생성시킨다. 번역 단계에서, mRNA는 세포 영역으로 이동하며, 여기서 mRNA는 DNA에 의해 제공된 유전 메시지를 리보솜으로 보내며, 리보솜은 DNA에 의해 코딩되는 단백질을 실제로 조립하는 세포 기구이다. mRNA의 서열과 상보적인 핵산 서열을 포함하는 안티센스 폴리뉴클레오티드는 mRNA에 결합하거나 혼성화할 수 있고, 혼성화된 mRNA는 하나 이상의 생화학적 메카니즘에 의해 후속적으로 분해되며, 이에 의해 mRNA의 지시사항이 리보솜에 도달하는 것을 방해한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 RNA인 것이 본원에서 바람직하다.
본 발명의 RNA는 센스 또는 안티센스 mRNA, 마이크로 또는 miRNA 또는 짧은 간섭 RNA, siRNA일 수 있다. mRNA는 상기 논의되어 있다. miRNA는 길이가 약 21 내지 23개 뉴클레오티드인 단일 가닥 RNA 분자이다. 그의 기능은 유전자 발현을 조절하는 것이다. miRNA는 DNA로부터 전사되나 단백질로 번역되지 않는 유전자에 의해 코딩된다. 오히려, miRNA는 일차 전사체 (프라이-miRNA라고 공지됨)로부터 프리-miRNA라고 불리는 짧은 스템-루프 구조로 및 최종적으로 기능성 miRNA로 프로세싱된다. 기능성 miRNA는 하나 이상의 mRNA와 부분적으로 상보적이다. 이와 같이, 이는 상기 논의된 안티센스 폴리뉴클레오티드와 유사한 기능을 수행하고, mRNA 지시사항이 리보솜에 도달하는 것을 방해한다. 그러므로, 이는 유전자 발현을 하향조절한다.
miRNA는 게놈 그 자체로부터 전사되나, siRNA (작은 간섭 RNA 또는 짧은 간섭 RNA)는 그렇지 않다. siRNA는 1999년에 그의 발견 이래로 분자 생물학자의 보고에서 가장 많이 연구된 폴리뉴클레오티드 중 하나가 되었고, 실제로 임의의 유전자의 발현을 잠재적으로 침묵시킬 수 있기 때문에 차세대 약물에 대한 주요 후보로 현재 고려된다. 본 발명의 목적을 위해, 현재 공지되어 있거나 미래에 공지될 수 있는 임의의 siRNA는 제한 없이, 치료학적, 예방학적 또는 진단학적 목적을 위해 살아있는 세포의 내부로 수송될 수 있는 내부 및 표면에 이블록 공중합체를 갖는 본 발명의 복합체를 형성하는데 사용될 수 있다. 초기에, 외인성으로 첨가된 siRNA가 특정 길이 (21 내지 23 bp)이어야 하며, 매우 특이적 2-염기 오버행(overhang)이 siRNA로서 활성이라고 생각되었으나, 더 긴 또는 더 짧은 평활-말단, 뿐만 아니라 27+bp RNA가 포유동물 세포에서 유전자 침묵에서 단지 효과적이라는 것이 현재 명백하다. 더 짧은 siRNA는 RNA-유도된 침묵 복합체 (RISC)에 직접적으로 로딩될 수 있으나, 더 긴 이중 가닥 RNA은 세포질에서 세포질 멀티도메인 엔도뉴클레아제 다이서에 의해 더 짧은 siRNA로 절단될 수 있다. 간단히, 긴 이중 가닥 RNA는 세포의 세포질에 진입한다. 긴 이중 가닥 RNA는 다이서라고 불리는 RNase III형 효소에 의해 20 내지 25개 뉴클레오티드 siRNA로 프로세싱된다. 그 후, siRNA는 RNA-유도된 침묵 복합체 또는 RISC라고 공지된 엔도리보뉴클레아제-함유 복합체로 조립된다. RISC로의 통합 후, 이중 가닥 siRNA의 센스 가닥은 풀리고/거나 절단되어, RISC를 상보적 mRNA 분자로 안내하는 siRNA 안티센스 가닥을 남긴다. 그 후, siRNA는 상보적 mRNA에 결합하고, 결합하면 RISC는 표적 mRNA를 절단하고, 상기 RNA와 회합된 유전자를 효과적으로 침묵시킨다. 본 발명의 이블록 공중합체와 복합체를 형성할 수 있고 이에 의해 살아있는 세포로 수송되는 다른 하위속의 폴리뉴클레오티드는 소위 "잠금 핵산" 또는 LNA 폴리뉴클레오티드이다. 잠금 핵산 폴리뉴클레오티드는 수많은 메카니즘에 의해 제조될 수 있고, 그 중 하나는 뉴클레오시드의 당 부분에서 2'-산소 대 4'-탄소 메틸렌 결합의 형성이나, 임의의 잠금 핵산 폴리뉴클레오티드의 사용은 본 발명의 범위 내에 포함된다. LNA의 한 특징은 변형되지 않은 DNA:DNA 또는 DNA:RNA 이중나선과 비교하여 상보적 DNA 또는 RNA와 혼성화된 경우 그의 향상된 열 안정성, 뿐만 아니라 향상된 핵산 인식이다. 이들 특성은 분자 적용의 숙주에서 LNA 폴리뉴클레오티드를 잠재적으로 유용하게 만든다. 예를 들어, Cos-7 세포에서의 바닐로이드 수용체 서브타입 1 (VR1)의 발현에 대한 siRNA, 포스포로티오에이트 및 2'-O-메틸 RNA-DNA 구축물과 LNA-DNA-LNA 구축물의 비교는, siRNA가 VR1 발현에 대한 가장 강력한 안티센스 작용제이나, LNA-DNA-LNA 구축물이 동위서열적 포스포로티오에이트 및 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드보다 VR1의 억제에 175배 및 550배 더 강력하였다는 것을 나타내었다 (문헌 [Grunweller, A., et al., 2003, NAR, 31:2185-3193]).
본 발명의 한 측면은 본원에 기재된 임의의 중합체에 (예를 들어, 공유결합 및/또는 비공유결합 방식 (이온 상호작용, 수소결합 상호작용 및/또는 반데르 발스 상호작용 포함)으로) 부착되거나 이와 회합된 폴리뉴클레오티드 또는 다수의 폴리뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 중합체 및 폴리뉴클레오티드 간의 회합은 공유 결합, 비공유결합 상호작용 또는 이들의 조합에 의해 달성된다. 구체적 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드와 중합체 (예를 들어, 그의 제1 블록)의 비공유 결합이 사용된다. 비공유결합 상호작용은 제한 없이, 이온 상호작용, 수소 결합 및 반데르 발스 힘을 포함하나, 본 발명의 목적을 위해, 비공유결합 상호작용은 이온 상호작용을 포함한다. 이온 상호작용은 중합체 (예를 들어, 그의 제1 블록)의 양이온성 구성 단위 및 포스포디에스테르 결합 때문에 자연적으로 음으로 대전되는 폴리뉴클레오티드 사이에서 발생한다.
Figure 112010081450799-pct00021
비공유 결합은 여러 첨가 방법에 의해 달성될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 및/또는 중합체는 서로에 대해 친화성을 갖도록 유발시키는 화학적 부분, 예컨대 연결, 아릴보론산-살리실히드록삼산, 류신 지퍼 또는 다른 펩티드 모티프, 중합체 및 폴리뉴클레오티드 상의 양전하 및 음전하 간의 이온 상호작용, 또는 다른 유형의 비공유결합 화학적 친화성 연결로 변형될 수 있다. 또한, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는 작은 홈 결합제를 갖는 중합체 또는 중합체에 공유결합으로 부착된 삽입성 작용제를 형성함으로써 본 발명의 중합체로 복합체를 형성할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 임의의 표준 화학적 접합 기술에 의해 중합체에 화학적으로 접합될 수 있다. 중합체 및 폴리뉴클레오티드 간의 공유 결합은 절단불가능할 수 있거나, 또는 절단가능한 결합이 사용될 수 있다. 특히 바람직한 절단가능한 결합은 세포질의 환원 환경에서 해리하는 디술피드 결합이다. 공유 결합은 아민-카르복실 링커(linker), 아민-술프히드릴 링커, 아민-탄수화물 링커, 아민-히드록실 링커, 아민-아민 링커, 카르복실-술프히드릴 링커, 카르복실-탄수화물 링커, 카르복실-히드록실 링커, 카르복실-카르복실 링커, 술프히드릴-탄수화물 링커, 술프히드릴-히드록실 링커, 술프히드릴-술프히드릴 링커, 탄수화물-히드록실 링커, 탄수화물- 탄수화물 링커 및 히드록실-히드록실 링커를 포함하나 이에 제한되지 않는 화학적 접합 방법을 통해 달성된다. 접합은 또한 히드라존 및 아세탈 연결을 포함하나 이에 제한되지 않는 pH-민감성 결합 및 링커로 수행될 수 있다. 많은 다양한 접합 화학이 당분야에서 확립되었다 (예를 들어, 문헌 [Bioconjugation, Aslam and Dent, Eds, Macmillan, 1998] 및 이에 포함된 챕터 참조). 폴리뉴클레오티드는 중합체의 알파 또는 오메가 말단에 또는 중합체 단량체 상의 펜던트 기에 접합될 수 있다.
일련의 중합체 및 그의 각 siRNA-축합된 입자는 크기 및 표면 전하에 대해 특징화되며, 얻은 데이터는 표 2에 나타낸다.
특정 예에서, 중합체는 용액에서 단합체(unimer) (< 10 nm)인 것으로 보인다. 4:1의 이론적인 전하 비율에서 중합체 및 siRNA로부터 형성된 복합체는 크기가 85 내지 236 nm의 범위였다. BMA 함량에 관하여 복합체 크기에 대한 명확한 경향은 존재하지 않는 것으로 보였다. 그러나, 엔도솜용해성 블록 내에 48％ BMA 함량을 갖는 중합체 P7은 85 nm ± 0.20의 가장 작은 입자 크기를 나타내었다. 입자의 나머지는 144 내지 236 nm의 크기를 가졌으며, 여기서 엔도솜용해성 블록 내에 27％ BMA 함량을 갖는 중합체 6으로부터 가장 큰 크기의 입자가 형성되었다. 1:1 내지 8:1 범위의 전하 비율로 중합체 P7/siRNA 입자 크기를 추가로 검사하였으며, 데이터는 표 3에 나타낸다. 중합체/siRNA 입자 크기는 전하 비율이 증가함에 따라 극적으로 감소하였으며, 값은 1:1에서 643 nm ± 0.09 내지 8:1에서 54 nm ± 0.27이었다.
<표 2>
Figure 112010081450799-pct00022
<표 3>
Figure 112010081450799-pct00023
특정 예에서, ζ-전위 측정을 기준으로 siRNA/중합체 복합체의 표면 전하는 모든 중합체에 대해 유사하고 약간 양성인 것으로 발견되었다 (0.13 내지 1.1 mV의 범위로 약 0.5 mV). 더욱이, 몇몇 예에서, 중합체 7을 사용하여 1:1, 2:1, 4:1 및 8:1의 +/-에서 형성된 복합체는 표면 전하의 차이를 나타내지 않았고, 다시 약간 양성 값 (0.18-0.99 mV)이며, 전하 비율에 관하여 경향이 없었다. 몇몇 예에서, 1:1 전하 비율에서, 제2 블록 내의 PAA 및 DMAEMA 전하가 서로 반대로 균형을 잡기 때문에 입자는 매우 적은 표면 전하를 가질 것으로 예상된다. 다양한 예에서, 전하 비율이 2:1, 4:1 및 8:1로 증가함에 따라, 양성 표면 전하의 증가가 나타날 것으로 예상될 것이나, 흥미롭게도 이러한 증가는 관찰되지 않았다. 몇몇 예에서, 중합체의 양의 증가와 함께 입자는 형태를 변화시켜, 더 단단하게 패킹되었다. 전하 비율의 증가와 함께, 많은 중합체 사슬 및 siRNA가 입자의 코어 내에 패킹되기 때문에, DMAEMA 양전하의 효과적인 차폐화로 인해 표면 전하가 영향을 받지 않는 것이 가능하다.
특정 실시양태에서, 입자 크기 및 표면 전하의 변화는 세포에 의한 복합체 유입에 관하여 관련 설계 기준일 수 있다. 몇몇 예에서, 양성 표면 전하를 보유하는 나노입자는 음으로 대전된 세포 막과의 정전기 상호작용에 의해 유입을 촉진한다.
중합체 및 siRNA/중합체 복합체 양자 모두를, 엔도솜/리소좀 트래픽킹 경로와 관련된 pH 값에서 적혈구 용혈을 유도하는 그의 능력에 대해 평가하였다. 중합체 1 내지 3에서 유의한 용혈이 발생하지 않았다. 그러나, 중합체 4의 경우 관련 pH-의존적 용혈 활성이 명백하였고, 엔도솜용해성 블록의 BMA 함량이 증가하였기 때문에 향상된 반응성이 발견되었다. 중합체 7은 가장 큰 pH-의존적 용혈을 나타내었다 (pH = 7.4에서 본질적으로 활성 없음, pH = 6.6에서 약 25％ 용혈, 및 pH = 5.8에서 85％ 용혈). 중합체 5 내지 7을 그의 siRNA-복합체 형태에서 용혈 활성에 대해 후속적으로 평가하였다. 시험된 모든 전하 비율에서 중합체 5 내지 7로 형성된 복합체는 관련 pH-의존적 경향으로 용혈성인 것으로 발견되었다. 더욱이, 복합체에 의해 나타난 용혈은 유리 중합체와 비교시 증가하였고, 1:1에 비해 4:1의 전하 비율에서 더 컸다. 중합체 7은 4:1의 전하 비율에서 가장 큰 용혈 활성을 나타내었다 (pH = 7.4에서 본질적으로 용혈 없음, pH = 6.8에서 60％ 용혈, 및 pH = 5.8에서 100％ 용혈). 이들 데이터는 이들 중합체의 pH-반응성 용혈 활성이 소수성 향상 부분, 부틸 메타크릴레이트의 혼입과 관련되어 있다는 것을 제안한다. 이러한 발견은 카르복실레이트 관능화된 중합체의 pH-의존적 소수성 전이를 향상시키기 위해 소수성 부분, 예컨대 알킬 아민 또는 방향족 기의 혼입을 사용한 pH-반응성 막 불안정화 중합체에 대한 이전 보고와 상관관계가 있었다.
막 붕괴 및/또는 막 불안정화
특정 실시양태에서, 중합체 또는 중합체:폴리뉴클레오티드 구축물 (즉, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드와 회합된 본원에 기재된 임의의 중합체를 포함함)은 세포막 불안정화 또는 붕괴성 중합체 (즉, 세포막을 불안정화시키거나 또는 붕괴시킴)이다. 특정 실시양태에서, 세포막은 비제한적 예로서, 세포외 막, 세포내 막, 소포, 소기관, 엔도솜, 리포솜 또는 적혈구이다. 몇몇 실시양태에서, 세포에 투여되는 경우, 막 붕괴성 중합체 또는 중합체:폴리뉴클레오티드는 세포로 전달된다. 특정 실시양태에서, siRNA는 본 발명의 중합체와 회합되고 후속적으로 살아있는 세포의 내부로 중합체에 의해 세포내이입되는 바람직한 폴리뉴클레오티드이다.
세포내이입은 물질 (예를 들어, 본 발명의 중합체 또는 핵산)이 형질막을 횡단하지 않고 세포로 진입하게 하는 프로세스이다. 물질은 세포 막의 부분에 의해 둘러싸여 지고, 그 후 떨어져 나가 세포내 소포를 형성한다. 물질이 세포내이입되고 엔도솜이 산성화되면, 성숙 엔도솜 내의 pH (대략 5 내지 6.5)에서 산성 단위, 즉, 본 발명의 중합체의 음이온성 구성 단위의 비이온화 형태와 이온화 형태 간의 평형이 비이온화 형태로 이동하도록 중합체의 pKa가 선택되기 때문에, 중합체의 화학적 조성이 변화된다. 상대적으로 친수성인 중합체의 이온화 형태와 대조적으로 비이온화 형태는 실질적으로 소수성이고, 상호작용 (즉, 사이토졸로의 물질의 방출을 초래하는 엔도솜 막의 붕괴)할 수 있다.
중합체 P4 내지 P7에 대해 그의 관련 pH-반응성 엔도솜용해성 특징을 기초로 하여 4:1 전하 비율에서 siRNA 복합체의 세포 내재화를 유동세포계측법을 이용하여 연구하였다. 중합체-복합체형성된 siRNA의 25 nM로의 4시간 노출 후, 세포내 유입은 제2 블록의 BMA 함량과 긍정적 상관관계가 있는 것으로 발견되었으며, 중합체 P7이 이러한 시간틀 동안 가장 높은 수준의 유입 (23％ siRNA 양성 세포)을 나타내었다. 양으로 대전된 복합체는 이전에 양이온성 중합체/핵산 복합체의 내재화에 영향을 미치는 것으로 나타났으며, 양으로 대전된 복합체는 더 높은 내재화 속도 및 트랜스진(transgene) 발현을 달성하였다. 모든 입자가 비특이적 세포내이입에 대한 한계 내에 잘 포함되는 동일하게 약간 양성 순 전하 및 크기 (85 내지 236 nm)를 나타내기 때문에 (표 2), 이들 결과는 표면 전하 또는 크기의 함수일 가능성이 없다. 오히려, 유입에 대한 효과는 BMA-함유 블록의 엔도솜용해성 유효성의 함수일 수 있다. 용혈 결과를 기초로 하여, BMA 함량이 증가함에 따라, 엔도솜 탈출이 더 큰 정도로 일어나므로, 다른 프로필아크릴산-함유 생체접합체와 유사하게 세포로부터의 재순환이 감소하고 세포 내의 siRNA의 순 축적이 증가한다. siRNA 및 세포 막 간의 정전기 반발을 기초로 하여, 모든 중합체 제형은 담체와 복합체를 형성하지 않은 siRNA (순수한 siRNA)보다 세포에 의한 훨씬 더 큰 유입 (최대 25x)을 나타내었다. 오직 4시간 후 세포의 23％ 이하에 의한 복합체형성된 siRNA의 내재화는 치료학적 효능에 대해 매우 유망하며, 이는 누적 유입이 완전 48시간 처리 후 훨씬 더 높을 가능성이 있기 때문이다. 또한, siRNA 활성은 촉매적인 것으로 고려되며, 이는 세포질 내에서 재순환되어 다중 mRNA 전사체를 파괴하여, 그러므로 장기간 다세대 효과를 가질 수 있다.
24시간 동안 4:1의 전하 비율에서 복합체의 존재하에 HeLa 세포를 인큐베이션함으로써 중합체 캐리어의 비특이적 세포독성을 연구하였다. 시험된 모든 중합체에 대해 높은 상대 생존이 관찰되었다 (>90％ 24시간 후). 합성 중합체, 특히 양이온성 중합체는 현저한 세포독성과 관련될 수 있다. 예를 들어, PEI는 다양한 세포주에서 세포자멸(apoptosis) 및/또는 괴사를 촉발시키는 것으로 나타났다. 이러한 독성은 다가양이온 세그먼트를 친수성 세그먼트로 화학적으로 변형시켜 감소될 수 있으나, 통상적으로 효능 및 독성 간에 상충(tradeoff)이 존재한다. 이 접근법에서, 중합체 전달 비히클의 전하-중화된 제2 블록의 사용은 추측컨대 시험관내 배양된 HeLa 세포의 높은 생존성을 유지시켰다.
4:1의 이론적인 전하 비율에서 모든 중합체로부터 형성된 복합체로 GAPDH에 대한 녹다운 실험으로 siRNA를 효과적으로 전달하는 담체의 능력을 연구하였다. 복합체에 의한 처리후 48시간에 GAPDH 단백질 수준을 평가하였다. 중합체 캐리어 1 내지 3은 단백질 수준의 감소를 수행하는데 있어서 비효과적이었으며, 이는 엔도솜 탈출을 매개하지 못하는 그의 무능력으로 인한 것일 가능성이 있다. 그러나, GAPDH 단백질 감소는 siRNA 담체로서 중합체 4의 사용으로 명백하게 되었다. 담체의 BMA 함량이 엔도솜용해성 블록 (중합체 P7)의 48％로 증가되었기 때문에, 단백질의 녹다운이 추가로 증가되었다. 중합체 P7은 단백질의 siRNA 녹다운을 매개하는 가장 큰 능력을 나타내었으며, 여기서 GAPDH는 대조의 32％로 감소되었다. 또한, 대조 siRNA는 GAPDH 단백질 수준의 무시가능한 감소를 나타내었다.
캐리어 효능을 추가로 특징화하기 위해, GAPDH mRNA 수준을 녹다운시키는 능력에 대해 중합체를 분석하였다. 단백질 측정과 유사하게, 중합체 1 내지 3은 mRNA 신호의 매우 적은 감소 (RT-PCR에 의해 평가됨)를 나타내었다. 다시, 중합체 P4 내지 P7은 엔도솜용해성 블록의 BMA 함량이 증가함에 따라 GAPDH의 증가된 녹다운을 나타내었다. 구체적으로, GAPDH 녹다운은 4:1의 전하 비율에서 중합체 P4, P5, P6 및 P7에 대해 각각 대조의 39％, 30％, 31％ 및 21％로 감소되었다. 전체적으로, 결과는 소수성 도메인, 구체적으로 N-올레일 부분, 페닐알라닌 잔기 및 부틸 메타크릴레이트 (여기서 사용됨)의 첨가가 형질감염을 향상시킨다는 것을 발견한, DNA에 대한 전달 전략을 탐색하는 다른 군으로부터의 발견과 일치한다.
전하 비율 및 siRNA 용량과 관련하여 유전자 녹다운을 매개하는 표 2의 중합체를 포함하는 P7 및 유사한 구조 (P7의 다양한 버전, 예컨대 P7v6 포함, 본원에서 PRx0729v6과 상호교환가능하게 사용됨)의 능력에 대한 추가 연구를 수행하였다. 이론적인 전하 비율의 변화는 유전자 녹다운에 대해 크게 영향을 미치는 것으로 발견되었다. GAPDH는 1:1, 2:1, 4:1 및 8:1의 전하 비율에서 각각 대조 수준의 51％, 42％, 21％ 및 14％로 감소되었다. 특히, 4:1 및 8:1의 전하 비율에서, 시판되는 담체 하이퍼펙트(HiPerFect)와 유전자 녹다운은 유사하였으며, 여기서 GAPDH 수준은 80％ 초과만큼 감소되었다. 중요하게는, 대조 siRNA가 8:1의 전하 비율에서 사용된 경우 GAPDH 수준에 대한 유의한 효과가 없었기 때문에, GAPDH 수준에 대한 효과는 전달되는 siRNA에 대해 특이적이다. 전하 비율의 변화는 나노입자 내의 siRNA의 축합 수준의 변화를 초래할 수 있다. DLS 실험은 복합체 내의 증가하는 공중합체 함량이 더 축합된 입자를 초래하였다는 것을 나타내었고 (표 3), 이들 기능 연구는 더 밀집된 입자가 더 효율적으로 내재화될 수 있거나 siRNA 생체이용율이 증가될 수 있다는 것을 제안한다. 이들 발견은 더 밀집된 DNA/폴리에틸렌이민 및 DNA/폴리리신 복합체가 더 높은 속도로 내재화하고 더 높은 형질감염 효율을 달성한다는 것을 나타내는 이전 연구와 일치한다. 4:1의 전하 비율에서 P7을 사용하여 용량-반응 연구를 수행하였다. 1 nM 또는 5 nM siRNA에서 GAPDH 유전자 발현에서 거의 반응이 없었으나, 중합체 7을 사용하여 10 nM, 25 nM 또는 50 nM의 siRNA를 전달한 경우 발현은 대조의 77％, 21％ 및 12％로 감소되었다. 녹다운의 이러한 수준은 시판되는 양성 대조군인 50 nM 하이퍼펙트를 사용하여 관찰된 수준에 접근하였다. 그러나, 모든 중합체 (중합체 7 포함)는 하이퍼펙트와 비교하여 향상된 생체적합성 (비특이적 세포독성에 의해 측정됨)을 나타내었다. 더 높은 용량의 siRNA (25 내지 50 nM)에서 유전자 녹다운의 유의한 수준이 달성되었으나, 생체내 적용에 대한 번역을 위해, 목적하지 않은 효과를 회피하기 위해 더 낮은 용량의 siRNA를 사용하여 유의한 감소를 달성하는 것이 더 바람직할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 이는 중합체/siRNA 입자의 더 효율적인 유입에 의해 달성되며, 아마도 표적화 리간드에 의해 달성하는 것이 최선일 것이다.
용도
특정 실시양태에서, 대상체에게 투여되고 궁극적으로 대상체의 세포로 전달되는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 DNA, RNA 또는 그의 천연 및 합성 유사체이다. 표적 유전자의 발현을 억제시킬 수 있는 DNA/RNA 및 그의 유사체에 관하여, 이들은 제한 없이, 안티센스 폴리뉴클레오티드, miRNA 및 siRNA와 같은 종을 포함한다.
본 발명의 중합체 및/또는 중합체 폴리뉴클레오티드 복합체를 사용하여 임의로 치료되는 질병에는 제한 없이, 병원성 질환, 암, 염증성 질병, 효소 결핍, 선청성 대사 이상, 감염, 자가면역 질병, 심혈관 질병, 신경계 신경변성 질병, 신경근 질병, 혈액 질환 및 응고 질환이 포함된다.
하기 실시예는 예시 목적을 위한 것이며, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않는다. 본원에 인용된 모든 공개는 공개가 인용된 정보에 대해 본원에 참고로 도입된다.
실시예
본 발명의 기재 전반에 걸쳐, 단량체 또는 이러한 단량체의 중합으로부터 유도된 단량체 잔기를 기술하기 위해 다양한 공지된 두문자어 및 약어가 사용된다. 제한 없이, 별도의 표시가 없는 경우: "BMA" (또는 동의 줄임 표기로서 문자 "B")는 부틸 메타크릴레이트 또는 이로부터 유도된 단량체 잔기를 나타내고; "DMAEMA" (또는 동의 줄임 표기로서 문자 "D")는 N,N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트 또는 이로부터 유도된 단량체 잔기를 나타내고; "Gal"은 갈락토스 또는 갈락토스 잔기 (임의로 히드록실-보호 부분 (예를 들어, 아세틸) 포함) 또는 PEG화된 그의 유도체 (하기 기재된 바와 같음)를 지칭하고; HPMA는 2-히드록시프로필 메타크릴레이트 또는 이로부터 유도된 단량체 잔기를 나타내고; "MAA"는 메틸아크릴산 또는 이로부터 유도된 단량체 잔기를 나타내고; "MAA(NHS)"는 메타크릴산의 N-히드록실-숙신이미드 에스테르 또는 이로부터 유도된 단량체 잔기를 나타내고; "PAA" (또는 동의 줄임 표기로서 문자 "P")는 2-프로필아크릴산 또는 이로부터 유도된 단량체 잔기를 나타내고; "PEGMA"는 PEG화된 메타크릴계 단량체, CH3O(CH2O)7-8OC(O)C(CH3)CH2 또는 이로부터 유도된 단량체 잔기를 지칭한다. 각 경우에, 임의의 이러한 지칭은 단량체 (그의 모든 염 또는 이온성 유사체 포함) 또는 단량체의 중합으로부터 유도된 단량체 잔기 (그의 모든 염 또는 이온성 유사체 포함)를 나타내고, 특정 표시 형태는 문맥상 당업자에게 명백하다.
실시예 1: 이블록 중합체 및 공중합체의 제조
하기 일반식의 이블록 중합체 및 공중합체를 제조하였다:
Figure 112010081450799-pct00024
여기서, [A1-A2]는 단량체 A1 및 A2의 잔기로 구성된 제1 블록 공중합체이고,
[B1-B2-B3]은 단량체 B1, B2, B3의 잔기로 구성된 제2 블록 공중합체이고,
x, y, z는 단량체 잔기의 중합체 조성 (몰％)이고,
n은 분자량이다.
예시적 이블록 공중합체:
Figure 112010081450799-pct00025
여기서:
B는 부틸 메타크릴레이트이고,
P는 프로필 아크릴산이고,
D 및 DMAEMA는 디메틸아미노에틸 메타크릴레이트이고,
PEGMA는 폴리에틸렌글리콜 메타크릴레이트 (여기서, 예를 들어 w = 4 내지 5개 또는 7 내지 8개의 에틸렌 옥시드 단위)이고,
MAA(NHS)는 메틸아크릴산-N-히드록시 숙신이미드이고,
HPMA는 N-(2-히드록시프로필) 메타크릴아미드이고,
PDSM은 피리딜 디술피드 메타크릴레이트이다.
이들 중합체는, 중합체 또는 공중합체의 제1 블록의 조성물이 제1 블록이 중성 (예를 들어, PEGMA), 양이온성 (예를 들어, DMAEMA), 음이온성 (예를 들어, PEGMA-NHS (여기서, NHS는 산으로 가수분해됨)), 양쪽성 (예를 들어, DMAEMA-NHS (여기서, NHS는 산으로 가수분해됨)) 또는 쯔비터이온성 (예를 들어, 폴리[2-메타크릴로일옥시-2'-트리메틸암모늄에틸 포스페이트])인 중합체를 제조하기 위해 변경되거나 화학적으로 처리되는 구조를 나타낸다. 또한, [PEGMA-PDSM]-[B-P-D] 중합체는 중합체-siRNA 접합체를 형성하기 위해 티올화된 siRNA와 반응될 수 있는 제1 블록 내 피리딜 디술피드 관능기를 함유한다.
실시예 1.1: RAFT에 의한 블록 공중합체의 제조를 위한 일반 합성 절차.
A. RAFT 사슬 이동제.
후속 RAFT 중합에서 사용되는 사슬 이동제 (CTA)인 4-시아노-4-(에틸술파닐티오카르보닐) 술파닐펜탄산 (ECT)의 합성을 문헌 [Moad et al., Polymer, 2005, 46(19): 8458-68]에 의한 절차로부터 변형시켰다. 간단히, 에탄 티올 (4.72 g, 76 mmol)을 0℃에서 디에틸 에테르 (150 ml) 중 수소화나트륨 (오일 중 60％) (3.15 g, 79 mmol)의 교반된 현탁액에 10분에 걸쳐 첨가하였다. 그 후, 용액을 10분 동안 교반한 후 이황화탄소 (6.0 g, 79 mmol)를 첨가하였다. 조 나트륨 S-에틸 트리티오카르보네이트 (7.85 g, 0.049 mol)를 여과에 의해 수집하고, 디에틸 에테르 (100 mL)에서 현탁하고, 요오드 (6.3 g, 0.025 mol)와 반응시켰다. 1시간 후, 용액을 여과하고, 수성 티오황산나트륨으로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 그 후, 조 비스(에틸술파닐티오카르보닐) 디술피드를 회전식 증발에 의해 단리하였다. 에틸 아세테이트 (50 mL) 중 비스(에틸술파닐티오카르보닐) 디술피드 (1.37 g, 0.005 mol) 및 4,4'-아조비스(4-시아노펜탄산) (2.10 g, 0.0075 mol)의 용액을 환류에서 18시간 동안 가열하였다. 용매의 회전식 증발 후, 조 4-시아노-4-(에틸술파닐티오카르보닐) 술파닐-펜탄산 (ECT)을, 정지상으로서 실리카 겔 및 용리액으로서 50:50 에틸 아세테이트 헥산을 사용하여 컬럼 크로마토그래피에 의해 단리하였다.
B. 폴리(N,N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트) 매크로 사슬 이동제 (폴리DMAEMA 매크로CTA).
라디칼 개시제로서 ECT 및 2,2'-아조비스(4-메톡시-2.4-디메틸 발레로니트릴) (V-70) (와코 케미칼스(Wako chemicals))을 사용하여 30℃에서 질소 분위기하에 18시간 동안 DMF에서 DMAEMA의 RAFT 중합을 수행하였다. 초기 단량체 대 CTA 비율 ([CTA]0/[M]0)은 100％ 전환에서 이론적인 Mn이 10,000 (g/mol)이 되도록 하는 것이었다. 초기 CTA 대 개시제 비율 ([CTA]0/[I]0)은 10 대 1이었다. 생성된 폴리DMAEMA 매크로 사슬 이동제를 침전에 의해 50:50 v:v 디에틸 에테르/펜탄으로 단리하였다. 생성된 중합체를 아세톤에 재용해시키고, 후속적으로 펜탄 (x3)으로 침전시키고, 밤새 진공에서 건조시켰다.
C. 폴리(DMAMEA) 매크로CTA로부터의 DMAEMA, PAA 및 BMA의 블록 공중합.
N,N-디메틸포름아미드에 용해된 폴리(DMAEMA) 매크로CTA에 원하는 화학량론적 양의 DMAEMA, PAA 및 BMA를 첨가하였다 (용매에 대한 25 wt％ 단량체 및 매크로CTA). 모든 중합에서, [M]0/[CTA]0 및 [CTA]0/[I]0는 각각 250:1 및 10:1이었다. V70의 첨가 후, 용액을 질소로 30분 동안 퍼징하고, 30℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 생성된 이블록 공중합체를 침전에 의해 50:50 v:v 디에틸 에테르/펜탄으로 단리하였다. 그 후, 침전된 중합체를 아세톤에 재용해시키고, 후속적으로 펜탄 (x3)으로 침전시키고, 밤새 진공에서 건조시켰다. 겔 투과 크로마토그래피 (GPC)를 이용하여, 폴리메틸 메타크릴레이트 표준물에 대한 DMF 중 폴리(DMAEMA) 매크로CTA 및 이블록 공중합체 샘플 양자의 분자량 및 다분산도 (PDI, Mw/Mn)를 측정하였다 (비스코텍 GPCmax VE2001 및 굴절계 VE3580 (비스코텍, 미국 텍사스주 휴스턴)에 직렬로 연결된 SEC 토소 TSK-GEL R-3000 및 R-4000 컬럼 (토소 바이오사이언스, 미국 펜실베니아주 몽고메리빌)). 1.0 wt％ LiBr을 함유하는 HPLC-등급 DMF를 이동상으로서 사용하였다. 도 1A는 몇몇 RAFT 합성된 중합체의 분자량 및 조성을 요약한다. (PRx0729v6은 본원 및 다양한 우선권 출원에서 P7v6과 상호교환가능하게 사용된다.) 도 1B는 몇몇 RAFT 합성된 중합체의 분자량, 입자 크기 및 조성을 요약한다.
실시예 1.2. 폴리(PEGMA) 매크로CTA로부터의 DMAEMA, PAA 및 BMA의 제2 블록 (B1-B2-B3) 공중합의 제조.
N,N-디메틸포름아미드에 용해된 폴리(PEGMA) 매크로CTA에 원하는 화학량론적 양의 DMAEMA, PAA 및 BMA를 첨가하였다 (용매에 대한 25 wt％ 단량체 및 매크로CTA). 모든 중합에서, [M]0/[CTA]0 및 [CTA]0/[I]0는 각각 250:1 및 10:1이었다. AIBN의 첨가 후, 용액을 질소로 30분 동안 퍼징하고, 68℃에서 6 내지 12시간 동안 반응시켰다 (도 2). 생성된 이블록 공중합체를 침전에 의해 50:50 v:v 디에틸 에테르/펜탄으로 단리하였다. 그 후, 침전된 중합체를 아세톤에 재용해시키고, 후속적으로 펜탄 (x3)으로 침전시키고, 밤새 진공에서 건조시켰다. 겔 투과 크로마토그래피 (GPC)를 이용하여, 비스코텍 GPCmax VE2001 및 굴절계 VE3580 (비스코텍, 미국 텍사스주 휴스턴)을 이용하여 DMF 중 폴리(PEGMA) 매크로CTA 및 이블록 공중합체 샘플 양자의 분자량 및 다분산도 (PDI, Mw/Mn)를 측정하였다. 1.0 wt％ LiBr을 함유하는 HPLC-등급 DMF를 이동상으로서 사용하였다. CDCl3 중 NMR 분광법을 이용하여, 중합체 구조를 확인하고 제2 블록의 조성을 계산하였다. 도 2는 [PEGMAw]-[B-P-D] 중합체 (여기서, w = 7 내지 8)의 합성을 요약한다. 도 3A, 3B 및 3C는 [PEGMAw]-[B-P-D] 중합체 (여기서, w = 7 내지 8)의 특징화를 요약한다.
실시예 1.3. PEGMA-DMAEMA 공중합체의 제조 및 특징화.
실시예 1.1 및 1.2에 기재된 바와 유사한 절차를 이용하여 중합체 합성을 수행하였다. 개별 단량체의 상이한 공급비를 사용하여 제1 블록 내의 PEGM 및 DMAEMA의 비율을 변화시켜 도 4에 기재된 공중합체를 제조하였다.
실시예 1.4. PEGMA-MAA(NHS) 공중합체의 제조 및 특징화.
제1 블록 공중합체의 원하는 조성을 얻기 위한 단량체 공급비를 사용하여 실시예 1.1 및 1.2에 기재된 바와 같이 (및 도 5에 요약된 바와 같이) 중합체 합성을 수행하였다. 도 6A, 6B 및 6C는 제1 블록 내의 단량체의 공중합체 비율이 70:30인 [PEGMAw-MAA(NHS)]-[B-P-D] 중합체의 합성 및 특징화를 요약한다. NHS 함유 중합체를 수성 완충액 (포스페이트 또는 바이카르보네이트)에서 7.4 내지 8.5의 pH에서 1 내지 4시간 동안 실온 또는 37℃에서 인큐베이션하여, 가수분해된 (산성) 형태를 제조할 수 있었다.
실시예 1.5. DMAEMA-MAA(NHS) 공중합체의 제조 및 특징화.
제1 블록 공중합체의 원하는 조성을 얻기 위한 단량체 공급비를 사용하여 실시예 1.1 및 1.2에 기재된 바와 같이 중합체 합성을 수행하였다. 도 7A, 7B 및 7C는 제1 블록 내의 단량체의 공중합체 비율이 70:30인 [DMAEMA-MAA(NHS)]-[B-P-D] 중합체의 합성 및 특징화를 요약한다. NHS 함유 중합체를 수성 완충액 (포스페이트 또는 바이카르보네이트)에서 7.4 내지 8.5의 pH에서 1 내지 4시간 동안 실온 또는 37℃에서 인큐베이션하여, 가수분해된 (산성) 형태를 제조할 수 있었다.
실시예 2. siRNA 약물 전달을 위한 HPMA-PDS(RNA) 공중합체 접합체의 제조 및 특징화.
A. 피리딜 디술피드 메타크릴레이트 단량체 (PDSMA)의 합성.
PDSMA에 대한 합성 반응식은 도 8에 요약되어 있다. 알드리티올-2(Aldrithiol-2)™ (5 g, 22.59 mmol)를 메탄올 40 ml 및 AcOH 1.8 ml에 용해시켰다. 30분에 걸쳐 메탄올 20 ml 중 2-아미노에탄티올.HCl (1.28 g, 11.30 mmol)의 용액으로서 용액을 첨가하였다. 반응물을 N2 하에 48시간 동안 R.T.에서 교반하였다. 용매의 증발 후, 잔류 오일을 디에틸 에테르 40 ml로 2회 세척하였다. 조 화합물을 메탄올 10 ml에 용해시키고, 생성물을 디에틸 에테르 50 ml로 2회 침전시켜, 원하는 화합물 1을 약한 황색 고체로서 얻었다. 수율: 95％.
피리딘 디티오에틸아민 (1, 6.7 g, 30.07 mmol) 및 트리에틸아민 (4.23 ml, 30.37 mmol)을 DMF (25 ml) 및 피리딘 (25 ml)에서 용해시키고, 메타크릴로일 클로라이드 (3.33 ml, 33.08 mmol)를 0℃에서 주사기를 통해 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 R.T.에서 교반하였다. 반응 후, 반응물을 포화 NaHCO3 (350 ml)에 의해 켄칭하고, 에틸 아세테이트 (350 ml)에 의해 추출하였다. 합한 유기층을 10％ HCl (100 ml, 1회) 및 순수한 물 (100 ml, 2회)에 의해 추가로 세척하고, MaSO4에 의해 건조시켰다. 순수한 생성물을 컬럼 크로마토그래피 (EA/Hex : 1/10 내지 2/1)에 의해 황색 시럽으로서 정제하였다. Rf = 0.28 (EA/Hex = 1/1). 수율: 55％.
B. HPMA-PDSMA 공중합체 합성
자유 라디칼 개시제로서 2,2'-아조-비스-이소부티릴니트릴 (AIBN)을 사용하여 DMF (50 중량％ 단량체:용매)에서 68℃에서 질소 분위기하에 8시간 동안 N-(2-히드록시프로필) 메타크릴아미드 (HPMA) 및 피리딜 디술피드 메타크릴레이트의 RAFT 중합 (전형적으로 70:30 단량체 비율로)을 수행하였다 (도 9). CTA 대 AIBN의 몰비는 10 대 1이었고, 100％ 전환에서 25,000 g/mol의 분자량이 달성되도록 단량체 대 CTA 비율을 설정하였다. 폴리(HPMA-PDS) 매크로-CTA를 메탄올로부터 디에틸 에테르로 반복적 침전에 의해 단리하였다.
매크로-CTA를 진공하에 24시간 동안 건조시킨 후, 디메틸아미노에틸 메타크릴레이트 (DMAEMA), 프로필아크릴산 (PAA) 및 부틸 메타크릴레이트 (BMA)의 블록 공중합을 위해 사용하였다. N,N-디메틸포름아미드에 용해된 HPMA-PDS 매크로CTA에 등몰량의 DMAEMA, PAA 및 BMA ([M]0/[CTA]0 = 250)를 첨가하였다 (용매에 대한 25 wt％ 단량체 및 매크로CTA). 10 대 1의 CTA 대 개시제 비율로 라디칼 개시제 AIBN을 첨가하였다. 질소 분위기하에 8시간 동안 68℃에서 중합을 진행시켰다. 그 후, 생성된 이블록 중합체를 50:50 디에틸 에테르/펜탄으로 4회 침전 (침전 사이에 에탄올에 재용해시킴)에 의해 단리하였다. 그 후, 생성물을 디에틸 에테르로 1회 세척하고, 밤새 진공에서 건조시켰다.
C. HPMA-PDSMA 공중합체로의 siRNA 접합
디술피드 변형된 5'-센스 가닥을 갖는 이중나선 RNA로서 시판되는 (애질런트(Agilent), 미국 콜로라도주 볼더) 티올화된 siRNA를 얻었다. 동결건조된 화합물을 물에 용해시켜 접합을 위한 유리 티올 형태를 제조하고, 아가로스 겔 내에 고정된 디술피드 환원제 TCEP로 1시간 동안 처리하였다. 그 후, 환원된 RNA (400 μM)를 5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)를 함유하는 포스페이트 완충액 (pH 7)에서 피리딜 디술피드-관능화된 중합체와 24시간 동안 반응시켰다 (도 9).
RNA 티올과 피리딜 디술피드 중합체의 반응은 2-피리딘티온을 생성시켰으며, 이를 분광광도법으로 측정하여 접합 효율을 특징화할 수 있었다. 디술피드 교환을 추가로 확인하기 위해, 접합체를 SDS-PAGE 16.5％ 트리신 겔 상에서 실행하였다. 병행하여, 환원 환경에서 중합체로부터 RNA의 방출을 입증하기 위해 접합 반응의 분취액을 SDS-PAGE 전에 고정된 TCEP로 처리하였다. 접합 반응을 1, 2 및 5의 중합체/RNA 화학량론에서 수행하였다. 접합 효율을 측정하기 위해 2-피리딘티온 방출에 대한 343 nm에서의 UV 분광광도법 흡광도 측정치를 사용하였다.
실시예 3: siRNA/중합체 복합체 특징화.
아가로스 겔 지연을 통해 완전 혈청-안정한 siRNA 복합체화를 확인한 후, 제타팔스(ZetaPALS) 검출기 (브룩해븐 인스트루먼츠 코포레이션(Brookhaven Instruments Corporation), 미국 뉴욕주 홀츠빌, 15 mW 레이저, 입사 빔 = 676 nm)를 이용하여 크기 및 제타 전위에 대해 siRNA/중합체 복합체를 특징화하였다. 간단히, 중합체를 포스페이트 완충된 염수 (PBS, 깁코(Gibco))에서 0.1 mg/ml로 제제화하고, 양으로 대전된 DMAEMA (pH=7.4에서 50％ 양성자화됨) 및 음으로-대전된 siRNA를 기재로 하는, 지정된 이론적인 전하 비율에서 GAPDH siRNA (암비온(Ambion))에 중합체를 첨가하여 복합체를 형성시켰다. 90°의 산란각에서 상관 함수를 수집하고, 25℃에서의 물의 점도 및 굴절률을 이용하여 입자 크기를 계산하였다. 입자 크기는 로그-정규 분포를 가정하여 유효 직경으로서 표시하였다. 제타팔스 제타 전위 분석 소프트웨어를 이용하여 25℃에서 평균 전기영동 이동도를 측정하고, 수성 현탁액에 대한 스몰루코우스키(Smoluchowsky) 모델을 이용하여 제타 전위를 계산하였다.
실시예 4: HeLa 세포 배양
HeLa, 인간 자궁경부 암종 세포 (ATCC CCL-2)를 37℃ 및 5％ CO2에서 L-글루타민 (깁코), 1％ 페니실린-스트렙토마이신 (깁코) 및 10％ 소 태아 혈청 (FBS, 인비트로젠(Invitrogen))을 함유하는 최소 필수 배지 (MEM)에서 유지시켰다.
실시예 5: 담체 및 siRNA/중합체 복합체의 pH-의존적 막 붕괴.
엔도솜 트래픽킹을 모방하는 pH 값 (세포외 pH = 7.4, 초기 엔도솜 pH = 6.6, 후기 엔도솜 pH = 5.8)에서 유리 중합체 및 siRNA/중합체 접합체 양자 모두의 잠재적 엔도솜용해성 활성을 측정하기 위해 용혈을 이용하였다. 간단히, EDTA를 함유하는 배큐테이너(vaccutainer)에 인간 전혈을 수집하였다. 혈액을 원심분리하고, 혈장을 흡인하고, 150 mM NaCl에서 3회 세척하여, 적혈구 (RBC)를 단리하였다. 그 후, pH 7.4, pH 6.6 또는 pH 5.8에서 포스페이트 완충액 (PB)에 RBC를 재현탁하였다. 그 후, 중합체 (10 ug/ml) 또는 중합체/siRNA 복합체를 3개의 pH 값에서 1시간 동안 37℃에서 RBC와 함께 인큐베이션하였다. 그 후, 무손상 RBC를 원심분리하고, pH-의존적 RBC 막 용해의 표시로서 541 nm에서의 흡광도에 의해 상등액으로 방출된 헤모글로빈을 측정하였다. 도 10A는 10 ㎍/ml의 농도에서의 중합체의 용혈을 나타내고, 도 10B는 1:1 및 4:1의 이론적인 전하 비율에서 중합체 5 내지 7의 중합체/siRNA 복합체를 나타낸다. 양성 대조군인 1％ v/v 트리톤(Triton) X-100에 대해 용혈 활성을 표준화하였으며, 이는 세 벌로 수행된 단일 실험으로부터의 대표적인 데이터 ± 표준 편차였다.
실시예 6: 담체-매개 siRNA 유입의 측정
유동세포계측법 (벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson) LSR 벤치탑 분석기)을 이용하여 siRNA/중합체 복합체의 세포내 유입을 측정하였다. 15,000개 세포/㎠로 Hela를 시딩하고, 밤새 접착시켰다. FAM (5-카르복시플루오레신) 표지된 siRNA (암비온)를 중합체와 30분 동안 실온에서 4:1의 이론적인 전하 비율로 복합체를 형성시킨 후, 25 nM의 최종 siRNA 농도로 플레이팅된 HeLa에 첨가하였다. 4시간 동안 복합체와 인큐베이션한 후, 세포를 트립신화하고, 0.5％ BSA 및 0.001％ 트립판 블루를 갖는 PBS에서 재현탁하였다. 세포외 형광의 켄칭 및 세포에 의해 세포내이입된 복합체의 판별에 대해 상기 기재된 바와 같이 트립판 블루를 사용하였다. 샘플 당 10,000개 세포를 분석하고, 처리받지 않은 샘플 및 FAM 표지된 siRNA와 복합체를 형성하지 않은 중합체를 사용하여 형광 게이팅을 측정하였다. 도 11은 중합체 4 내지 7로 형성되고 4시간 동안 전달된 FAM-표지된 siRNA 및 중합체/siRNA 복합체의 HeLa 세포 내재화를 나타낸다. 데이터는 세 벌로 수행된 3개의 독립적 실험으로부터의 데이터이며, 여기서 오차 막대는 평균의 표준 오차 (SEM)를 나타낸다.
실시예 7: siRNA/중합체 복합체 세포독성
락테이트 데히드로게나제 (LDH) 세포독성 검출 키트 (로슈(Roche))를 사용하여 siRNA/중합체 복합체 세포독성을 측정하였다. HeLa 세포를 96-웰 플레이트에서 웰 당 12,000개 세포의 밀도로 시딩하고, 밤새 접착시켰다. 중합체 (0.1 mg/ml 스톡 용액)를 GAPDH siRNA에 4:1의 이론적인 전하 비율로 첨가하여 복합체를 형성시키고, 25 nM siRNA/웰의 농도를 얻었다. 복합체 (전하 비율 = 4:1)를 웰에 세 벌로 첨가하였다. 세포를 24시간 동안 중합체 복합체와 인큐베이션한 후, 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 그 후, 세포를 1시간 동안 4℃에서 용해 완충액 (100 ㎕/웰, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1％ 트리톤, 25 mM 피로인산나트륨, 1 mM β-글리세로포스페이트, 1 mM 나트륨 오르토바나데이트)으로 용해시켰다. 피펫팅에 의해 혼합한 후, 세포 용해물 20 ㎕를 PBS에서 1:5로 희석하고, LDH 기질 용액 100 ㎕와 혼합하여 락테이트 데히드로게나제 (LDH)에 대해 정량하였다. 색상 형성을 위해 10 내지 20분 인큐베이션 후, 흡광도를 490 nm에서 측정하였으며, 기준은 650 nm에서 설정하였다.
도 12A는 비특이적 HeLa 세포독성을 나타내고, 도 12B는 siRNA 중합체 캐리어의 함수로서 GAPDH 녹다운을 나타낸다. 4:1의 이론적인 전하 비율로 제제화된 중합체/siRNA 복합체를 사용하여 25 nM에서의 GAPDH에 대한 siRNA로 HeLa 세포를 형질감염시켰다. (A) 24시간 후, 세포 용해물을 수집하고, 세포 생존성의 측정인 락테이트 데히드로게나제에 대해 검정하였으며, 데이터는 처리되지 않은 세포와 비교하여 나타낸다. (B) 48시간 후, 단백질 (흑색) 및 mRNA 수준 (백색) 양자 모두를 GAPDH 효소 활성 검정 및 RT-PCR을 이용하여 각각 검사하였으며, 데이터는 처리받지 않은 세포와 비교하여 나타낸다. 데이터는 세 벌로 수행된 3개의 독립적 실험으로부터의 데이터이며, 여기서 오차 막대는 평균의 표준 오차 (SEM)를 나타낸다.
실시예 8: siRNA/중합체 복합체에 의한 GAPDH 단백질 및 유전자 녹다운의 평가
GAPDH 활성 검정 (암비온)을 이용하여 siRNA 전달에 대한 일련의 중합체의 효능을 스크리닝하였다. HeLa (12,000개 세포/㎠)를 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 24시간 후, 복합체 (전하 비율 = 4:1)를 10％ 혈청의 존재하에 25 nM의 최종 siRNA 농도로 세포에 첨가하였다. 형질감염 48시간 후 siRNA-매개 GAPDH 단백질 환원의 정도를 평가하였다. 양성 대조군으로서, 제조자의 조건에 따라 하이퍼펙트 (퀴아젠(Qiagen))를 이용하여 병행 녹다운 실험을 실행하였다. 운동 형광 증가 방법을 이용하여 제조자에 의해 기재된 바와 같이 나머지 GAPDH 활성을 5분에 걸쳐 측정하고, 하기 식에 따라 계산하였다: 나머지 발현 ％ = 형광, GAPDH / 형광, 처리 없음, 여기서 _형광 = 형광-5분-형광 1분. siRNA의 비표적화 서열을 사용한 경우, 형질감염 절차는 GAPDH 발현에 유의한 영향을 미치지 않았다. 도 13A는 전하 비율 (1:1-8:1)의 함수로서 복합체에 의한 처리 후 48시간에 실시간 RT-PCR을 통해 측정된 HeLa에서의 GAPDH 녹다운을 나타내고, 도 13B는 캐리어로서 중합체 7을 갖는 siRNA 용량 (1 내지 50 nM)의 함수로서 복합체에 의한 처리 후 48시간에 실시간 RT-PCR을 통해 측정된 HeLa에서의 GAPDH 녹다운을 나타낸다. 음성 대조군 siRNA #1 (암비온) 및 시판되는 형질감염 시약인 하이퍼펙트 (퀴아젠)를 각각 음성 대조군 및 양성 대조군으로서 사용하였다.
가장 강한 siRNA-매개 GAPDH 녹다운을 생성시킨 캐리어를 확인하기 위한 초기 스크리닝 후, 실시간 역전사 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR)을 이용하여 siRNA 전달을 직접적으로 평가하였다. 상기 형성된 바와 같은 복합체와 인큐베이션 48시간 후, 세포를 PBS로 헹궜다. 퀴아젠의 퀴아쉬레더(Qiashredder) 및 RNeasy 미니 키트를 이용하여 총 RNA를 단리하였다. 샘플 내의 임의의 잔류 게놈 DNA를 소화시키고 (RNase-비함유 DNase 세트, 퀴아젠), 제조자의 지시사항을 기초로 하여 리보그린(RiboGreen) 검정 (몰레큘라 프로브스(Molecular Probes))을 이용하여 RNA를 정량하였다.
옴니스크립트(Omniscript) RT 키트 (퀴아젠)를 이용하여 역전사를 수행하였다. cDNA 합성을 위해 RNA 샘플 총 25 ng을 사용하였고, GAPDH를 위한 예비설계된 프라이머 및 프로브 세트 (에세이즈 온 디맨드(Assays on Demand), 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)) 및 하우스키핑 유전자로서 베타-액틴을 사용하여 ABI 서열 검출 시스템 7000을 이용하여 PCR을 수행하였다. 반응물 (총 20 ㎕)은 2X 태크맨(Taqman) 유니버셜(Universal) PCR 매스터믹스(Mastermix) 10 ㎕, 프라이머/프로브 1 ㎕ 및 cDNA 2 ㎕로 구성되었으며, 뉴클레아제-비함유 물 (암비온)로 20 ㎕에 이르게 하였다. 하기 PCR 파라미터를 사용하였다: 90초 동안 95℃, 이어서 30초 동안 95℃ 및 60초 동안 55℃의 45회 순환. 역치 주기 (CT) 분석을 이용하여, 베타-액틴으로 표준화되고 처리되지 않은 HeLa의 발현과 비교된 GAPDH를 정량하였다.
실시예 9. 폴리[HPMA]-b-[(PAA)(BMA)(DMAEMA)]의 관능성 설계.
도 14는 폴리[HPMA]-b-[(PAA)(BMA)(DMAEMA)]에 대한 중합체 설계를 나타낸다. 피리딜 디술피드 말단-관능화된 CTA를 사용하여 RAFT 중합체 합성 전략을 통해 다관능성 특성을 혼입시켜, 수용성 및 pH-의존적 막 불안정화 특성을 보유하도록 설계된 이블록 구조물을 형성하였다. 각 중합체 블록에 대한 원하는 특성을 생성하기 위해 도 14에서 강조된 단량체 화학적 관능성을 선택하였다. 중요하게는, 생리적 pH에서 거의 중성 전하이고 (대략 50％ DMAEMA 양성자화 및 50％ PAA 탈양성자화 예측), 더 낮은 pH 환경에서 더 소수성이고 양으로 대전된 상태로의 전이를 거치는 모듈 3을 설계하였다.
실시예 10. 피리딜 디술피드-CTA의 합성.
도 15에 나타낸 바와 같이 4-시아노-4-(에틸술파닐티오카르보닐) 술파닐펜탄산 (ECT) 전구체를 합성하였다. 먼저 ECT를 NHS 에스테르로 전환시킨 후 피리딜디티오-에틸아민과 반응시켜, 피리딜 디술피드 관능화된 RAFT 사슬 이동제 (CTA)를 합성하였다. ECT (1.05 g, 4 mmol) 및 N-히드록시숙신이미드 (0.460 g, 4 mmol)를 클로로포름 100 mL에 용해시켰다. 그 후, 혼합물을 0℃로 냉각하고, 이 때 N,N' 디시클로헥실카르보디이미드 (0.865 mg, 4.2 mmol)를 첨가하였다. 용액을 0℃에서 1시간 동안 유지한 후, 실온에서 22시간 동안 반응시켰다. 그 후, 디시클로헥실 우레아를 제거하기 위해 용액을 여과하고, 회전식 증발을 통해 용액을 농축시켰다. 그 후, 생성된 고체를 진공하에 건조시키고, 임의의 추가 정제 없이 사용하였다. NHS ECT (1.80 g, 5.0 mmol) 및 피리딜디티오-에틸아민 (0.90 g, 5.0 mmoL)을 별개로 클로로포름 200 및 300 mL에 각각 용해시킨 후, 20분 간격으로 3개의 분획으로서 피리딜디티오-에틸아민의 용액을 적가하였다. 그 후, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 용매 제거 후, 2개의 연속 컬럼 크로마토그래피 (실리카 겔 60, 머크(Merk))를 수행하여 (에틸 아세테이트:헥산 50:50; 에틸 아세테이트:헥산 70:30 v/v), 점성 오렌지 고체를 수득하였다.
Figure 112010081450799-pct00026
티올 반응성 중합체의 제조: 피리딜 디술피드 관능화된 폴리[HPMA]-b-[(PAA)(BMA)(DMAEMA)]의 RAFT 중합. 자유 라디칼 개시제로서 2,2'-아조-비스-이소부티릴니트릴 (AIBN)을 사용하여 메탄올 (50 중량％ 단량체:용매)에서 70℃에서 질소 분위기하에 8시간 동안 N-(2-히드록시프로필) 메타크릴아미드 (HPMA)의 RAFT 중합을 수행하였다. CTA 대 AIBN의 몰비는 10 대 1이었고, 100％ 전환에서 25,000 g/mol의 분자량이 달성되도록 단량체 대 CTA 비율을 설정하였다. 폴리(HPMA) 매크로-CTA를 메탄올로부터 디에틸 에테르로 반복적 침전에 의해 단리하였다. 매크로-CTA를 진공하에 24시간 동안 건조시킨 후, 디메틸아미노에틸 메타크릴레이트 (DMAEMA), 프로필아크릴산 (PAA) 및 부틸 메타크릴레이트 (BMA)의 블록 공중합을 위해 사용하였다. N,N-디메틸포름아미드에 용해된 HPMA-PDS 매크로CTA에 등몰량의 DMAEMA, PAA 및 BMA ([M]0/[CTA]0 = 250)를 첨가하였다 (용매에 대한 25 wt％ 단량체 및 매크로CTA). 10 대 1의 CTA 대 개시제 비율로 라디칼 개시제 V70을 첨가하였다. 질소 분위기하에 18시간 동안 30℃에서 중합을 진행시켰다. 그 후, 생성된 이블록 중합체를 50:50 디에틸 에테르/펜탄으로 4회 침전 (침전 사이에 에탄올에 재용해시킴)에 의해 단리하였다. 그 후, 생성물을 디에틸 에테르로 1회 세척하고, 밤새 진공에서 건조시켰다.
겔 투과 크로마토그래피 (GPC)를 이용하여, DMF 중 폴리(DMAEMA) 매크로CTA 및 이블록 공중합체 양자 모두의 분자량 및 다분산도 (Mw/Mn, PDI)를 측정하였다. 분자량 계산은, 0.1 wt％ LiBr을 함유하는 HPLC-등급 DMF를 이동상으로서 사용하여 폴리메틸 메타크릴레이트 표준물에 대해 상대적인 컬럼 용리 시간을 기초로 하였다. 트리스(2-카르복시에틸) 포스핀 히드로클로라이드 (TCEP)를 사용하여, 중합체 말단 피리딜 디술피드를 환원시켜 2-피리딘티온을 방출시켰다. 실험으로 측정된 중합체 분자량 및 수성 용매 중 343 nm (8080 M-1cm-1)에서 2-피리딘티온의 몰 흡광 계수를 기초로 하여, 폴리(HPMA) 매크로CTA 및 이블록 공중합체에 대한 말단 기 보존 ％를 측정하였다.
실시예 11. 중합체-펩티드 접합
펩티드 형질도입 도메인 펩티드 트랜스포틴 (또한 안테나페디아 펩티드 (Antp) 서열이라고 공지됨)과의 융합을 이용하여, 카르복시-말단 시스테인 잔기를 함유하는 Bak-BH3 펩티드(Antp-BH3)의 세포 내재화 형태를 합성하였다 (
Figure 112010081450799-pct00027
). 접합을 위한 유리 티올을 확실하게 하기 위해, 펩티드를 물에서 재구성하고, 아가로스 겔 내에 고정된 디술피드 환원제 TCEP로 1시간 동안 처리하였다. 그 후, 환원된 펩티드 (400 μM)를, 5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)을 함유하는 포스페이트 완충액 (pH 7)에서 피리딜 디술피드 말단-관능화된 중합체와 24시간 동안 반응시켰다.
도 16에 나타낸 바와 같이, 펩티드 시스테인과 피리딜 디술피드 중합체 말단 기의 반응은 2-피리딘티온을 생성시켰으며, 이를 분광광도법으로 측정하여 접합 효율을 특징화할 수 있었다. 디술피드 교환을 추가로 확인하기 위해, 접합체를 SDS-PAGE 16.5％ 트리신 겔 상에서 실행하였다. 병행하여, 환원 환경에서 중합체로부터 펩티드의 방출을 입증하기 위해 접합 반응의 분취액을 SDS-PAGE 전에 고정된 TCEP로 처리하였다.
접합 반응을 1, 2 및 5의 중합체/펩티드 화학량론에서 수행하였다. 2-피리딘티온 방출에 대한 343 nm에서의 UV 분광광도법 흡광도 측정치는 각각 40％, 75％ 및 80％의 접합 효율 (2-피리딘티온 몰/펩티드 몰)을 나타내었다. 펩티드-중합체 접합체를 추가로 특징화하기 위해 SDS PAGE 겔을 사용하였다 (도 17). 1의 중합체/펩티드 몰비에서, 검출가능한 양의 펩티드는 말단 시스테인을 통한 디술피드 결합을 통해 이량체를 형성하였다. 그러나, 피리딜 디술피드로의 티올 반응이 유리하였고, 유리 펩티드 밴드는 2 이상의 중합체/펩티드 비율에서 더이상 가시적이 아니었다 (도 17A). 접합체를 환원제 TCEP로 처리함으로써, 이들 샘플에서 펩티드 밴드의 출현에 의해 표시되는 바와 같이, 중합체-펩티드 디술피드 결합을 절단하는 것이 가능하였다 (도 17B).
실시예 12. 폴리[HPMA]-b-[(PAA)(BMA)(DMAEMA)]의 pH-의존적 막 불안정화 특성
엔도솜용해성 활성에 대한 중합체의 잠재성을 평가하기 위해, 막 붕괴 검정을 이용하여, 도 18에 나타낸 바와 같이 지질 이중층 막의 pH-의존적 붕괴를 촉발시키는 중합체의 능력을 측정하였다. 인간 전혈을 회수하고, 혈장 제거를 위해 원심분리하였다. 나머지 적혈구를 150 mM NaCl로 3회 세척하고, 생리적 (pH 7.4), 초기 엔도솜 (pH 6.6) 및 후기 엔도솜 (pH 5.8) 환경에 상응하는 포스페이트 완충액로 재현탁하였다. 중합체 (1 내지 40 ㎍/mL) 또는 1％ 트리톤 X-100을 적혈구 현탁액에 첨가하고, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 원심분리를 통해 무손상 적혈구를 펠렛화하고, 541 nm에서의 흡광도를 통해 상등액 내의 헤모글로빈 함량을 측정하였다. 트리톤 X-100에 대해 상대적인 용혈 ％를 측정하였다. 1 내지 40 ㎍/mL 범위의 농도에서 1％ v/v 트리톤 X-100에 대해 상대적인 중합체 용혈을 정량하였다. 이 실험을 세 벌로 2회 완료하여, 유사한 결과를 얻었다. 나타낸 데이터는 세 벌로 수행된 단일 실험 ± 표준 편차를 나타낸다.
적혈구 용혈은 생리적 (7.4), 초기 엔도솜 (6.6) 및 후기 엔도솜 (5.8) 환경을 모방하는 pH 값에서 이블록 공중합체의 pH-의존적 막 붕괴 특성을 측정하였다. 생리적 pH에서, 심지어 40 ㎍/mL만큼 높은 중합체 농도에서도 유의한 적혈구 막 붕괴가 관찰되지 않았다 (도 18). 그러나, pH가 엔도솜 값으로 저하되기 때문에, 용혈의 유의한 증가가 검출되었으며, pH 6.6과 비교하여 pH 5.8에서 더 큰 막 붕괴가 있었다. 중합체의 용혈성 거동 중합체 농도와 상관관계가 있었으며, pH 5.8 완충액에서 40 ㎍/mL 중합체에서 거의 70％ 적혈구 용해가 일어났다. 생리적 pH 범위에서 무시가능한 막 활성과 조합된 엔도솜 pH에서 막 불안정화 형태로의 이러한 급격한 "전환(switch)"은 무독성 세포내 전달 비히클로서의 이 중합체에 대한 잠재성을 나타낸다.
실시예 13. HELA 세포에서 세포내 전달의 특징화
HeLa, 인간 자궁경부 암종 세포 (ATCC CCL-2)를 L-글루타민, 1％ 페니실린-스트렙토마이신 및 10％ FBS를 함유하는 최소 필수 배지 (MEM)에서 유지시켰다. 실험 전에, HeLa를 현미경검사를 위해 8-웰 챔버 슬라이드 (20,000개 세포/웰) 또는 다른 검정을 위해 96-웰 플레이트 (10,000개 세포/웰)에서 밤새 접착시켰다. 중합체-펩티드 접합체 및 대조를 1％ FBS를 갖는 MEM에 첨가하였다.
Antp (페네트라틴) 세포 투과성 펩티드와 융합된 Bak-BH3 펩티드로 생체접합 후 중합체 세포내 전달 잠재성을 평가하였다. Antp로의 BH3 융합은 세포 전위 도메인으로서 광범위하게 연구되었으며, 이는 이전에 세포자멸 신호전달을 촉발하는 것으로 발견되었다 (문헌 [Li et al. Neoplasia (New York, N.Y. 2007;9(10):801-811]). 그러나, 펩티드성 형질도입 도메인을 통해 전달된 치료제가 세포내 소포 내에 격리되어 효력이 방해받을 수 있다고 믿어진다 (문헌 [Sugita et al. British Journal of Pharmacology. 2008, 153(6):1143-1152]). 하기 시험관내 연구는 조합된 Antp-BH3 펩티드 세포질 전달 및 전-세포자멸(pro-apoptosis) 기능성이 이블록 중합체로의 접합에 의해 향상되었다는 것을 나타내었다.
접합체 엔도솜 탈출의 현미경 분석. 아민 반응성 알렉사(Alexa)-488 숙신이미딜 에스테르를 무수 디메틸 포름아미드 (DMF)에서 Antp-BH3 펩티드와 1 대 1 몰비로 혼합하였다. PD10 탈염화 컬럼을 이용하여 미반응 형광단 및 유기 용매를 제거하고, 형광으로 표지된 펩티드를 동결건조시켰다. 알렉사-488 표지된 Antp-BH3을 상기 기재된 바와 같이 중합체에 접합시켰다. 유리 펩티드 또는 중합체-펩티드 접합체를 25 μM Antp-BH3의 농도에서 챔버에 둔 현미경 슬라이드 상에서 성장된 HeLa에 적용하였다. 세포를 15분 동안 처리하고, PBS로 2회 세척하고, 추가 30분 동안 신선한 배지에서 인큐베이션하였다. 샘플을 다시 세척하고, 37℃에서 10분 동안 4％ 파라포름알데히드로 고정시켰다. 슬라이드에 DAPI를 함유하는 프롤롱 골드 안티페이드(ProLong Gold Antifade) 시약을 탑재하고, 형광 현미경을 이용하여 영상화하였다.
펩티드 엔도솜 탈출에 대한 중합체 접합의 효과를 연구하기 위해, 알렉사-488 표지된 펩티드를 형광 현미경검사에 의해 분석하였다. 형광으로 표지된 펩티드를 단독으로 또는 중합체 생체접합체로서 전달하였다. 현미경검사 분석은 중합체 접합 후 펩티드 세포내 편재화의 명확한 차이를 나타내었다 (도 19). 펩티드 단독은 반점 염색을 나타내었으며, 이는 엔도솜 분획화를 나타내었다. 샘플 전달된 중합체-펩티드 접합체는 분산된 형광 패턴을 나타내었으며, 이는 세포질에 전반에 걸친 펩티드 확산과 일치하였다. 대표적인 영상은 샘플 전달된 펩티드 단독에서 반점 펩티드 염색 (녹색) (도 19A) 및 펩티드-중합체 접합체의 전달 후 사이토졸 내에 분산된 펩티드 형광 (도 19B)을 예시한다. 샘플을 25 μM 펩티드로 15분 동안 처리하고, DAPI 핵 염색 (청색) 후 현미경검사를 위해 준비하였다.
접합체 세포독성의 측정. 락테이트 데히드로게나제 (LDH) 세포독성 검정을 이용하여 종양 세포 사멸의 촉발에 대한 생체접합체 효능을 측정하였다. 각 시점의 끝에, 세포를 PBS로 2회 세척한 후, 1시간 동안 4℃에서 세포 용해 완충액 (100 ㎕/웰, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1％ 트리톤, 25 mM 피로인산나트륨, 1 mM β-글리세로포스페이트, 1 mM 나트륨 오르토바나데이트)으로 용해시켰다. 각 샘플로부터의 용해물 20 ㎕를 PBS 80 ㎕로 희석하고, LDH 기질 용액 100 ㎕와 혼합하여 LDH를 정량하였다. 10분 인큐베이션 후, 490 nm에서 흡광도를 측정함으로써 LDH를 측정하였다. 생존성 ％는 처리 받지 않은 샘플을 기준으로 표시하였다.
중합체-펩티드 접합체 생물활성을 평가하기 위해, HeLa 자궁경부암 세포에서 세포독성 연구를 수행하였다. Antp-BH3 중합체 접합체는 용량 의존적 방식으로 HeLa 세포 사멸을 강하게 촉발시키는 것으로 발견되었다. 10 μM 펩티드 접합체에 의한 6시간 처리 후 50％ 이상 HeLa 생존성이 검출되었고 (도 20A), 25 μM 펩티드 접합체를 투여받은 샘플 (도 20B)은 4시간 노출만큼 적은 시간 후 (존재한다면) 생존가능한 세포가 거의 없음을 나타내었다. 펩티드 또는 중합체 단독을 투여받은 대조 샘플은 무시가능한 처리 효과를 나타내었고, 이들 대조군과 처리군 간에 차이가 없었다. 중요하게는, pH-반응성 블록이 결핍된 Antp-BH3 폴리(HPMA) 접합체는 대조군 양자 모두에서 유사하였고, 유의한 독성을 초래하지 않았으며, 이는 추가로 엔도솜용해성 블록의 기능성을 입증하였다 (도 20).
미토콘드리아 막 전위의 유동세포계측법 평가. 세포자멸에 대한 공지된 표시자인 미토콘드리아 막 전위의 손실을 JC-1 염료를 사용하여 평가하였다. JC-1은 사이토졸 및 건강한 세포에서 분산되는 경우 녹색 형광을 나타내고, 미토콘드리아 막에서 적색-형광 응집물을 형성한다 (문헌 [Cossarizza et al. Biochemical and biophysical research communications. 1993;197(1):40-45]). HeLa를 10 μM 펩티드 또는 등가 접합체 또는 중합체 단독과 함께 2시간 동안 인큐베이션하였다. JC-1을 5 ㎍/mL의 최종 농도로 첨가하고, 15분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고, 트립신화하고, 유동세포계측법 분석을 위해 0.5％ BSA에서 재현탁하였다. 적색 형광에 대해 음성인 녹색 형광 세포의 개수를 기초로 하여 미토콘드리아 탈분극을 나타내는 세포의 백분율을 정량하였다. 여기서, 적색 형광 JC-1 응집물의 유의한 손실 및 그러므로 미토콘드리아 분극의 손실을, Antp-BH3 펩티드 및 중합체 펩티드 접합체 양자 모두에 의한 처리 후 검출하였다 (도 21A). 중합체 대조는 미토콘드리아 극성의 손실을 나타내는 세포의 백분율에서 처리받지 않은 세포와 유사하였으나, Antp-BH3 단독 및 중합체 접합체는 각각 대략 4배 및 10배 증가를 초래하였다.
카스파제 3/7 활성 검정. 시판되는 검정 키트를 이용하여 카스파제 3/7 활성화를 측정하였다. 이 검정은 효소적으로 절단되면 형광이 되는 전형광 카스파제 3/7 기질을 사용하였으며, 형광 플레이트 판독기를 이용하여 상대적 효소 활성을 측정하였다. 여기서, HeLa를 중합체 단독 이외에 접합체 샘플과 등가량으로 25 μM 펩티드 (단독 또는 중합체 접합체로서)와 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 카스파제 3/7 형광발생 표시자를 각 샘플을 위한 배양 배지에 직접적으로 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 진탕한 후, 형광 플레이트 판독기를 이용하여 검정하였다. 데이터는 처리받지 않은 샘플에 대한 카스파제 활성 ％로서 표시하였다.
이들 프로테아제에 대해 특이적인 전형광 기질을 사용하여 전-세포자멸 신호전달을 나타내는 카스파제 3 및 7의 활성화를 측정할 수 있었다. 도 21B는 중합체 단독을 함유하는 대조가 처리받지 않은 음성 대조군에 대해 상대적인 등가 카스파제 활성을 나타내었다는 것을 나타낸다. 그러나, Antp-BH3 펩티드 (그 자체 또는 중합체 접합체 형태)에 의한 처리 후 급속 카스파제 활성화 (대략 2.5배)가 검출되었다. Antp-BH3단독 또는 중합체 접합체로서의 Antp-BH3의 유사한 효과는 카스파제 신호전달이 펩티드 단독에 의한 처리에 의해 포화되거나, 또는 카스파제 활성화 상태의 동요의 증폭을 위한 다른 양성 피드백 메카니즘이 존재한다는 것을 나타낼 수 있다. 최소로, 이들 결과는 중합체로의 접합의 결과로서 입체 장애 또는 펩티드-유도된 카스파제 활성의 다른 감소가 없었다는 것을 제안한다.
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Claims (39)

  1. 하기 화학식 I을 포함하는 공중합체.
    <화학식 I>
    Figure 112016022201581-pct00028

    A0, A1, A2, A3 및 A4는 -C-, -C-C-, -C(O)(C)aC(O)O- 및 -O(C)aC(O)-로 구성된 군에서 선택되고; 여기서,
    a는 1 내지 4이고;
    Y4는 수소, -(1C-10C)알킬, -(3C-6C)시클로알킬, -O-(1C-10C)알킬, -C(O)O(1C-10C)알킬, -C(O)NR6(1C-10C), -(4C-10C)헤테로아릴 및 -(6C-10C)아릴로 구성된 군에서 선택되며, 이들 중 하나 이상은 1개 이상의 불소 기로 치환될 수 있고;
    Y0, Y1 및 Y2는 공유 결합, -(1C-10C)알킬렌-, -C(O)O(2C-10C)알킬렌-, -OC(O)(1C-10C)알킬렌-, -O(2C-10C)알킬렌-, -S(2C-10C)알킬렌-, -C(O)NR6(2C-10C)알킬렌-, -(4C-10C)헤테로아릴렌- 및 -(6C-10C)아릴렌-으로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고;
    Y3은 공유 결합, -(1C-10C)알킬렌-, -(4C-10C)헤테로아릴렌- 및 -(6C-10C)아릴렌-으로 구성된 군에서 선택되고; 여기서,
    R1 내지 R5 및 Y0 내지 Y4로 완전히 치환되지 않은 A0 내지 A4의 4가 탄소 원자는 적절한 개수의 수소 원자로 완성되고;
    R1, R2, R3, R4, R5 및 R6은 수소, -CN, 알킬, 알키닐, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고, 이들 중 하나 이상은 1개 이상의 불소 원자로 치환될 수 있고;
    Q0은 히드록시, 폴리옥실화된 알킬, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 티올, 아지드, 알킨, 피리딜 디술피드 및 수소로 구성된 군에서 선택된 잔기이고;
    Q1은 히드록시, 폴리옥실화된 알킬, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 티올로 구성된 군에서 선택된 잔기이고;
    Q2는 정상 생리적 pH에서 양으로 대전되는 잔기이고;
    Q3은 정상 생리적 pH에서 음으로 대전되나 더 낮은 pH에서 양성자화를 거치는 잔기이고;
    m은 0 내지 1.0 미만이고;
    n은 0 초과 내지 1.0이고; 여기서
    m + n = 1이고,
    p는 0.1 내지 0.9이고;
    q는 0.1 내지 0.9이고;
    r은 0 내지 0.8이고; 여기서
    p + q + r = 1이고,
    v는 1 kDa 내지 25 kDa이고;
    w는 1 kDa 내지 50 kDa이다.
  2. 제1항에 있어서, n이 0.51 내지 1.0인 것인 공중합체.
  3. 제1항에 있어서, v가 5 kDa 내지 25 kDa인 것인 공중합체.
  4. 제1항에 있어서, w가 5 kDa 내지 50 kDa인 것인 공중합체.
  5. 제1항에 있어서, Q2는 아미노, 알킬아미노, 구아니딘, 이미다졸릴 및 피리딜로 구성된 군에서 선택된 잔기인 것인 공중합체.
  6. 제1항에 있어서, Q3은 카르복실, 보로네이트, 포스포네이트 및 포스페이트로 구성된 군에서 선택된 잔기인 것인 공중합체.
  7. 제1항에 있어서, R3-A2-Y2-Q2가 C1-6 디알킬아미노(C1-6)알킬메타크릴레이트, C1-6 알킬아미노(C1-6)알킬메타크릴레이트, 아미노(C1-6)알킬아크릴레이트, C1-6 디알킬아미노(C1-6)알킬에타크릴레이트, C1-6 알킬아미노(C1-6)알킬에타크릴레이트, 아미노(C1-6)알킬에타크릴레이트, C1-6 디알킬아미노(C1-6)알킬아크릴레이트, C1-6 알킬아미노(C1-6)알킬아크릴레이트 또는 아미노(C1-6)알킬아크릴레이트의 잔기인 공중합체.
  8. 제1항에 있어서, R4-A3-Y3-Q3이 C1-6 알킬아크릴산의 잔기인 공중합체.
  9. 제1항에 있어서, R5-A4-Y4가 C1-6 알킬아크릴레이트, C1-C6 알킬메타크릴레이트 또는 C1-C6 알킬에타크릴레이트의 잔기인 공중합체.
  10. 제1항에 있어서, v:w의 수평균 분자량 비율이 1:1 내지 1:3인 공중합체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 공중합체 및 치료제를 포함하는 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 치료제가 siRNA인 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 치료제가 폴리펩티드인 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 치료제가 공중합체에 공유결합으로 부착된 것인 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 치료제가 공중합체에 공유결합으로 부착된 것인 조성물.
  16. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 다수의 공중합체를 포함하는 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 다수의 공중합체가 1.2의 다분산 지수 (PDI)를 갖는 것인 조성물.
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