WO2026014451A1 - タンパク質製造のための誘導剤 - Google Patents

Abstract

植物繊維および植物繊維以外の繊維を含む混紡繊維由来の植物繊維は、糸状菌培養によるタンパク質製造におけるタンパク質誘導能に優れていることから、糸状菌培養によるタンパク質製造の生産性を高めるための誘導剤として好適に利用することができる。

Description

タンパク質製造のための誘導剤

　本発明は、糸状菌培養によるタンパク質製造のための誘導剤および当該誘導剤を利用した糸状菌培養によるタンパク質の製造方法に関する。

　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌やＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属糸状菌に代表される糸状菌は、もともとタンパク質製造の生産性が高いことが知られており、また、糸状菌の遺伝子組換え技術は確立しており、遺伝子組換えによって任意のタンパク質を製造できるように改変できることから、タンパク質製造のためのプラットフォーム微生物としても注目されている（非特許文献１）。そのため、現在、糸状菌培養によるタンパク質製造の生産性を高める検討が盛んに行われている。

　糸状菌培養によるタンパク質製造の生産性を高める検討アプローチとしては、タンパク質製造に関わる糸状菌ゲノムの遺伝子改変や、タンパク質製造のための糸状菌培養条件の最適化検討が代表例として挙げられるが、これら検討アプローチに加えて、例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌は、グルコース、ラクトース、セルロース、キシランなどの誘導剤とともに培養することで、糖化酵素に分類されるセルラーゼの生産性が向上するという技術的特徴を有しており（非特許文献２）、この技術的特徴をベースとした、糸状菌培養によるタンパク質製造の生産性を高める誘導剤の開発も進められている。また、誘導剤の開発では、タンパク質製造コスト削減の観点から、入手コストも開発における重要な評価基準となっている。

　タンパク質製造の生産性向上およびコスト削減を目指した開発によって見出された、糸状菌培養によるタンパク質製造のための誘導剤の具体例としては、稲わらをはじめとするリグノセルロース（特許文献１）、コーンハル（特許文献２）、綿繊維（非特許文献３）が挙げられる。

国際公開第２０１３／１９００６４号 国際公開第２０２１／２３５４１９号

Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ，Ｈｅｌｅｎａ，ａｎｄ　Ｒｏｂｙｎ　Ｐｅｔｅｒｓｏｎ．"Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ．"Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１４．８９－１０２． Ｐｉｒａｙｒｅ，Ａｕｒｅｌｉｅ，ｅｔ　ａｌ．"Ｇｌｕｃｏｓｅ－ｌａｃｔｏｓｅ　ｍｉｘｔｕｒｅ　ｆｅｅｄｓ　ｉｎ　ｉｎｄｕｓｔｒｙ－ｌｉｋｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：ａ　ｇｅｎｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｎｅｔｗｏｒｋ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｈｙｐｅｒｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ｓｔｒａｉｎ　Ｒｕｔ－Ｃ３０．"ＢＭＣ　ｇｅｎｏｍｉｃｓ　２１　（２０２０）：１－１７． Ａｌｌｅｎ，Ａ．Ｌ．，ａｎｄ　Ｃ．Ｄ．Ｒｏｃｈｅ．"Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎ　ａｎｄ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ｂｙ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ．"（１９８９）：６５０－６５６．

　糸状菌培養によるタンパク質製造の生産性を高めるための新規な誘導剤を提供することを課題とする。

　本発明者は、入手の容易性という観点で衣服等に用いられている繊維製品を誘導剤の原料とすることを着想し、鋭意検討を重ねた結果、植物繊維および植物繊維以外の繊維を含む混紡繊維由来の植物繊維が、混紡繊維ではない植物繊維由来の植物繊維よりも誘導剤として予想外に優れており、特に、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌やＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属糸状菌を培養してセルラーゼを製造するための誘導剤として優れていることを見出し、本発明を完成するに至った。

　すなわち、本発明は、以下の（１）～（２６）で構成される。
（１）植物繊維および植物繊維以外の繊維を含む混紡繊維由来の植物繊維を有効成分として含む、糸状菌培養によるタンパク質製造のための誘導剤。
（２）前記植物繊維が、種子毛繊維、靭皮繊維、葉脈繊維または果実繊維である、（１）に記載の誘導剤。
（３）前記種子毛繊維が、綿繊維である、（２）に記載の誘導剤。
（４）前記植物繊維以外の繊維が、化学繊維である、（１）に記載の誘導剤。
（５）前記化学繊維が、少なくともポリエステル繊維を含む化学繊維である、（４）に記載の誘導剤。
（６）前記混紡繊維を酸処理、セルラーゼ処理または亜臨界加水分解処理して得られる植物繊維を有効成分として含む、（１）から（５）のいずれかに記載の誘導剤。
（７）前記酸が、無機酸または有機酸である、（６）に記載の誘導剤。
（８）前記無機酸が、リン酸である、（７）に記載の誘導剤。
（９）前記有機酸が、二価以上のカルボン酸である、（７）に記載の誘導剤。
（１０）前記二価以上のカルボン酸が、クエン酸またはシュウ酸である、（９）に記載の誘導剤。
（１１）（１）から（１０）のいずれかに記載の誘導剤を含む、培地。
（１２）タンパク質を製造する能力を有する糸状菌を、（１１）に記載の培地で培養する工程を含む、タンパク質の製造方法。
（１３）前記タンパク質が、酵素である、（１２）に記載のタンパク質の製造方法。
（１４）前記酵素が、セルラーゼである、（１３）に記載のタンパク質の製造方法。
（１５）前記糸状菌が、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌またはＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属糸状菌である、（１２）から（１４）のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
（１６）タンパク質、ならびに、植物繊維および植物繊維以外の繊維を含む混紡繊維に含まれる植物繊維以外の繊維由来成分を含む、タンパク質組成物。
（１７）前記植物繊維以外の繊維由来成分が、植物繊維以外の繊維断片である、（１６）に記載のタンパク質組成物。
（１８）前記植物繊維以外の繊維が、化学繊維である、（１６）または（１７）に記載のタンパク質組成物。
（１９）前記化学繊維が、ポリエステル繊維である、（１８）に記載のタンパク質組成物。
（２０）前記タンパク質が、酵素である、（１６）～（１９）のいずれかに記載のタンパク質組成物。
（２１）前記酵素が、セルラーゼである、（２０）に記載のタンパク質組成物。
（２２）セルロースを、（１４）に記載の方法で得られたセルラーゼ、または、（２１）に記載のタンパク質組成物で加水分解する工程を含む、糖液の製造方法。
（２３）前記セルロースが、植物繊維および植物繊維以外の繊維を含む混紡繊維に含まれるセルロースである、（２２）に記載の糖液の製造方法。
（２４）植物繊維および植物繊維以外の繊維を含む混紡繊維を、（１４）に記載の方法で得られたセルラーゼ、または、（２１）に記載のタンパク質組成物で加水分解処理する工程、ならびに、前記加水分解処理工程で得られた処理物から加水分解された植物繊維を除去する工程、を含む、植物繊維および植物繊維以外の繊維を含む混紡繊維から植物繊維以外の繊維を回収する方法。
（２５）（２２）または（２３）に記載の方法で得られた糖液を発酵原料として、化学品を製造する能力を有する微生物を培養する工程を含む、化学品の製造方法。
（２６）（２２）または（２３）に記載の方法で得られた糖液を発酵原料として、タンパク質を製造する能力を有する微生物を培養する工程を含む、タンパク質の製造方法。

　本発明の誘導剤は、糸状菌培養によるタンパク質製造におけるタンパク質誘導能に優れていることから、タンパク質製造の生産性を高めるための誘導剤として利用できる。特に、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌またはＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属糸状菌を培養することによるセルラーゼ製造においては、酵素活性の優れたセルラーゼを製造するための誘導剤として利用できる。

コンゴーレッドで染色したＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌培養液の顕微鏡写真

　本発明は、植物繊維および植物繊維以外の繊維を含む混紡繊維由来の植物繊維を、糸状菌培養によるタンパク質製造のための誘導剤の有効成分として利用することを特徴とする。ここでいう誘導剤とは、タンパク質製造能力を有する糸状菌を培養してタンパク質を製造する際に、当該糸状菌によるタンパク質製造を促すための添加剤を意味する。

　混紡繊維とは、２種類以上の異なった短繊維を混ぜ合わせて紡績した繊維の総称である。混紡繊維の具体例としては、異種の天然繊維を混ぜ合わせた混紡繊維、天然繊維と化学繊維を混ぜ合わせた混紡繊維、異種の化学繊維を混ぜ合わせた混紡繊維が挙げられるが、本発明で用いられる混紡繊維は、天然繊維である植物繊維と植物繊維以外の繊維を混ぜ合わせた混紡繊維である。

　本発明で用いられる混紡繊維に含まれる植物繊維とは、植物の細胞壁の骨格成分であるセルロースを主成分とする繊維であり、具体例として、植物組織に由来する種子毛繊維、靭皮繊維、葉脈繊維、果実繊維や、セルロースを溶融紡糸して得られるセルロース繊維が挙げられるが、好ましくは種子毛繊維である。また、種子毛繊維の具体例として、綿繊維、カポック、パンヤなどが挙げられるが、好ましくは綿繊維である。

　本発明で用いられる混紡繊維に含まれる植物繊維以外の繊維は特に制限はなく、植物繊維以外の天然繊維、具体的には、動物繊維や鉱物繊維であってもよく、また、化学繊維であってもよいが、好ましくは化学繊維である。化学繊維の具体例としては、ポリエステル繊維、ポリウレタン繊維、ポリアミド繊維およびポリアクリロニトリル繊維（アクリル繊維）からなる群から選択される１種または２種以上が挙げられ、好ましくは少なくともポリエステル繊維を含む化学繊維、より好ましくはポリエステル繊維および／またはポリウレタン繊維、さらに好ましくはポリエステル繊維である。ポリエステル繊維の具体例としては、ポリエチレンテレフタレート繊維（ＰＥＴ繊維）、ポリブチレンテレフタレート繊維（ＰＢＴ繊維）、ポリトリメチレンテレフタレート繊維（ＰＴＴ繊維、別名：３ＧＴ繊維）、ポリ乳酸繊維（ＰＬＡ繊維）などが挙げられるが、好ましくはＰＥＴ繊維である。

　なお、本発明で用いられる混紡繊維を構成する繊維の最も好ましい組み合わせのひとつが、植物繊維である綿繊維とＰＥＴ繊維の混紡繊維であるが、綿繊維とＰＥＴ繊維の混紡繊維は、俗称としてＴ／Ｃ混紡繊維と呼ばれることがある。

　本発明の誘導剤の有効成分である前記混紡繊維由来の植物繊維とは、前記混紡繊維から分離した植物繊維である。前記混紡繊維を、植物繊維とそれ以外の繊維に分離するための処理方法は特に制限されず、当業者にとって公知の手法として、酸処理、亜臨界加水分解処理、セルラーゼ等を用いた酵素処理、マイクロ波処理、グリコール分解処理等が知られているが、本発明においては、前記混紡繊維を酸性水溶液に浸漬する酸処理、セルラーゼ処理、亜臨界加水分解処理が好ましく適用される。

　酸処理で用いられる酸は特に制限されず、無機酸であっても有機酸であってもよく、無機酸であれば、好ましくはリン酸、塩酸、硫酸、硝酸、ホウ酸、フッ化水素酸、より好ましくはリン酸であり、有機酸であれば、好ましくは２価以上のカルボン酸、より好ましくはクエン酸、シュウ酸、ギ酸、酢酸、乳酸、グリコール酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、さらに好ましくはクエン酸、シュウ酸である。また、加温しながら酸処理をすることが好ましく、酸処理時の温度条件は好ましくは５０～１３０℃、より好ましくは６０～１２０℃、さらに好ましくは７０～１２０℃である。また、ｐＨ条件は、好ましくはｐＨ５．０以下、より好ましくはｐＨ４．０以下、さらに好ましくはｐＨ３．０以下である。

　セルラーゼ処理で用いられるセルラーゼは特に制限されず、セルロースおよびヘミセルロースの加水分解活性を有するセルラーゼおよびヘミセルラーゼを含むことを特徴とする。セルラーゼの具体例としては、セルロースを内部から加水分解するエンドグルカナーゼ（ＥＣ　３．２．１．４）、セルロースおよびセロオリゴ糖を末端から加水分解することによりセロビオースを遊離させるセロビオハイドロラーゼ（ＥＣ　３．２．１．９１）、セルロースおよびセロオリゴ糖を末端から加水分解することによりグルコースを遊離させるβ－グルコシダーゼ（ＥＣ　３．２．１．２１）などが挙げられる。セルラーゼに含まれうるヘミセルラーゼの具体例としては、キシランを内部から加水分解するエンドキシラナーゼ（ＥＣ　３．２．１．８）、キシロオリゴ糖を末端から加水分解するβ－キシロシダーゼ（ＥＣ　３．２．１．３７）などが挙げられる。また、セルラーゼは、糸状菌由来セルラーゼとすることを特徴とする。糸状菌由来セルラーゼは、市販のセルラーゼ製剤を用いてもよく、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属糸状菌やＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌のそれぞれの培養液から菌体を除去せずに培養液を直接用いてもよく、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属糸状菌やＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌のそれぞれの培養液から固液分離を経て菌体を除去しただけの粗精製セルラーゼを用いてもよく、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属糸状菌の培養液とＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌のそれぞれの培養液から固液分離を経た後、ろ液を膜やカラム処理した精製セルラーゼを混合して用いてもよい。市販のセルラーゼ製剤の例としては、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属糸状菌由来セルラーゼ製剤として、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓに由来するアクレモニウムセルラーゼ（ＭｅｉｊｉＳｅｉｋａファルマ）、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ｅｍｅｒｓｏｎｉｉに由来するフィルトラーゼ　ＮＬ（ＤＳＭ）が挙げられ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼ製剤として、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅに由来するメイセラーゼ（ＭｅｉｊｉＳｅｉｋａファルマ）、セルラーゼ　オノズカ　Ｒ－１０（ヤクルト薬品工業）、セルラーゼ　オノズカ　ＲＳ（ヤクルト薬品工業）、セルラーゼ　オノズカ　３Ｓ（ヤクルト薬品工業）、ベイクザイム　Ｒｅａｌ－Ｘ（ＤＳＭ）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍに由来するスクラーゼＸ（三菱ケミカル）、スクラーゼＣ（三菱ケミカル）、シトラーゼ　ＣＬ（ＤＳＭ）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉに由来するセルロシンＴＰ２５（エイチビィアイ）、Ｏｐｔｉｍａｓｅ　ＣＸ（ダニスコジャパン）、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ　ＧＣ（ダニスコジャパン）、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ　Ｂ（ダニスコジャパン）、ＧＯＤＯ－ＴＣＦ（合同酒精）、ＧＯＤＯ－ＴＣＬ（合同酒精）、ベッセレックス（合同酒精）、ベイクザイム　Ｘ－ＣＥＬＬ（ＤＳＭ）が挙げられる。

　Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属糸状菌やＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌の培養方法は、セルラーゼ活性を有する培養液を製造できる培養方法であれば特に限定されず、例えば、遠沈管、フラスコ、ジャーファーメンター、タンクなどを用いた液体培養や、プレートなどを用いた固体培養などで培養することができる。糸状菌は、好気的条件で培養する必要があり、これらの培養方法の中でも、特にジャーファーメンターや、タンク内に通気や撹拌を行いながら培養する深部培養が好ましい。通気量は、０．１～２．０ｖｖｍが好ましく、０．３～１．５ｖｖｍがより好ましく、０．５～１．０ｖｖｍが特に好ましい。培養温度は、２５～３５℃が好ましく、２５～３１℃がより好ましい。培養におけるｐＨの条件は、ｐＨ３．０～７．０が好ましく、ｐＨ４．０～６．０がより好ましい。培養時間は、タンパク質が製造される条件で、回収可能な量のタンパク質が蓄積されるまで行う。通常、２４～２８８時間程度であり、３６～２４０時間が好ましい。

　前記混紡繊維の酸処理またはセルラーゼ処理の処理物を水中で物理的作用を加えることにより、前記混紡繊維から粉末状の植物繊維を遊離させることができ、その植物繊維を本発明の誘導剤として好適に使用することができる。水中で物理的作用を加える方法としては、スターラーやタービンなどを用いた攪拌が好ましい。水中で物理的作用を加えた前記処理物を、ざるなどを用いてろ過することにより、化学繊維をろ別することができ、粉末状の植物繊維をろ液として回収することができる。分離された前記植物繊維粉末を含むろ液をそのまま誘導剤として利用してもよく、また、ろ液を乾燥させて前記植物繊維粉末を回収してから誘導剤の有効成分として利用してもよい。

　亜臨界加水分解処理とは、前記混紡繊維と亜臨界状態の水とを接触させることにより、前記混紡繊維に含まれる植物繊維以外の繊維を分解し、前記混紡繊維に含まれる植物繊維を分離する処理である。本発明においては、国際公開第２０１９／１４０２４５号に記載のアルカリ成分を使用した亜臨界加水分解処理が好適である。具体的には、植物繊維および植物繊維以外の繊維を含む混紡繊維を、アルカリ成分を使用して、亜臨界水反応器で、温度を１０５～１９０℃、温度の下限は好ましくは１３８℃以上、より好ましくは１４０℃以上、圧力を０．２～１０ＭＰａ、圧力の下限は好ましくは０．３ＭＰａ以上、より好ましくは０．４ＭＰａ以上、圧力の上限は好ましくは８．０ＭＰａ以下、より好ましくは６．０ＭＰａ以下、時間を０～１２０分間、時間の下限は好ましくは５分以上、より好ましくは１０分以上、時間の上限は好ましくは１８０分以下、より好ましくは１２０分以下にて処理をすることで、混紡繊維に含まれる植物繊維以外の繊維が溶出し、本発明の誘導剤として好適な植物繊維を回収することができる。

　亜臨界加水分解処理で使用するアルカリ成分の例としては、リチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属、アンモニウム等の水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩、アンモニアやトリメチルアミン等の有機アミン等が挙げられる。中でも、アルカリ金属塩が好ましい。

　アルカリ金属塩としては、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化セシウム等のアルカリ金属水酸化物、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、炭酸水素リチウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素セシウム等のアルカリ金属炭酸塩、リン酸リチウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸セシウム、リン酸水素二リチウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二セシウム、リン酸一水素リチウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸一水素カリウム、リン酸一水素セシウム等のアルカリ金属リン酸塩、ホウ酸リチウム、ホウ酸ナトリウム、ホウ酸カリウム、ホウ酸セシウム等のアルカリ金属ホウ酸塩等が挙げられる。中でも、アルカリ金属塩がアルカリ金属水酸化物、およびアルカリ金属炭酸塩から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。具体的には、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素リチウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムがより好ましい。

　前記混紡繊維の処理方法によっては、あらかじめ前記混紡繊維を解繊しておくことが好ましい。具体的には、処理方法が酸処理またはセルラーゼ処理である場合は、あらかじめ前記混紡繊維を解繊しておくことが好ましく、一方、処理方法が亜臨界加水分解処理である場合は、あらかじめ前記混紡繊維を解繊してもしなくてもよいため、工程簡略化の観点からは解繊しないことが好ましい。前記混紡繊維の解繊方法としては特に制限はなく、また、繊維同士が完全に解繊されている必要はなく、裁断、ピンミル、ハンマーミル、ジェットミル、ボールミルなどで解繊すればよく、また、これら手法を組み合わせて解繊してもよい。

　前記植物繊維は、副成分として前記混紡繊維に含まれる植物繊維以外の繊維由来成分を含んでいてもよい。前記混紡繊維に含まれる植物繊維以外の繊維由来成分とは、前記混紡繊維に含まれる植物繊維以外の繊維の断片または分解物であり、前記混紡繊維に含まれる植物繊維以外の繊維の分解物の具体例としては、前記混紡繊維に含まれる植物繊維以外の繊維を構成するポリマー、オリゴマー、モノマーが挙げられる。

　前記植物繊維を有効成分とする本発明の誘導剤を、タンパク質を製造する能力を有する糸状菌を培養するための培地に添加することで、タンパク質を製造するための誘導剤として機能させることができる。

　タンパク質を製造する能力を有する糸状菌を培養するための培地は、培養対象となる糸状菌がタンパク質を製造できるような培地組成となっていれば特に制限はなく、当業者にとって公知の培地組成を採用することができる。

　前記培地への本発明の誘導剤の添加量は、誘導剤としての機能が発揮できる添加量であれば特に制限はないが、本発明の誘導剤の有効成分である前記植物繊維の乾燥重量での終濃度が、好ましくは１～５０重量％、より好ましくは５～３０重量％、さらに好ましくは５～２５重量％となるように添加すればよい。

　前記培地には、培養する糸状菌の栄養となる炭素源としてグルコースおよび／またはラクトースが含まれていてもよく、グルコースおよびラクトースが両方含まれていることが好ましい。グルコースおよび／またはラクトースの培地への添加量は、それぞれ終濃度が１ｇ／Ｌ程度になるよう添加すればよい。

　また、グルコースおよび／またはラクトースをタンパク質製造のための誘導剤として併用利用してもよく、この場合、培養の途中で培地に添加することが好ましい。培養の途中からグルコースおよび／またはラクトースを追加する場合には、培養２４時間あたり培養液１Ｌに対して、好ましくはグルコース１０ｇ以上および／またはラクトース１ｇ以上、より好ましくはグルコース２５ｇ以上および／またはラクトース２．５ｇ以上、さらに好ましくはグルコース５０ｇ以上および／またはラクトース５ｇ以上を添加すればよい。培地に添加する際のグルコースおよび／またはラクトースの状態は液体でも固体でもよいが、水などに溶解させたものを用いることが好ましい。

　グルコースとラクトースの混合糖を培養の途中から添加する場合、グルコースとラクトースの比率は、等量または、ラクトース量よりもグルコース量を多く添加することが好ましい。また、液糖の添加を開始するタイミングは、培養開始から１４４時間までが好ましく、培養開始から７２時間までがより好ましく、培養開始から４８時間までが特に好ましい。糖の添加は、１回でもよいし、複数回でもよいし、連続的に添加してもよい。

　また、セルロースやキシランなどを、タンパク質製造を誘導するための誘導剤として併用利用してもよく、その場合、セルロースやキシランを含むバイオマスを誘導剤として添加してもよい。セルロールやキシランを含有するバイオマスの具体例としては、種子植物、シダ植物、コケ植物、藻類、水草などの植物の他、廃建材なども用いることができる。種子植物は、裸子植物と被子植物に分類されるが、どちらも好ましく用いることができる。被子植物はさらに単子葉植物と双子葉植物に分類されるが、単子葉植物の具体例としては、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、コーンコブ、コーンハル、稲わら、麦わらなどが挙げられ、双子葉植物の具体例としては、ビートパルプ、ユーカリ、ナラ、シラカバなどが好ましく用いられる。

　セルロースやキシランを含むバイオマスをタンパク質製造を誘導するための誘導剤として使用する場合は、前処理されたものを用いてもよい。前処理方法は特に限定されないが、例えば、酸処理、硫酸処理、希硫酸処理、アルカリ処理、水熱処理、亜臨界加水分解処理、微粉砕処理、蒸煮処理、など公知の手法を用いることができる。このような前処理をされたセルロールやキシランを含むバイオマスとして、パルプを用いてもよい。

　その他、前記培地には、培養する糸状菌の栄養となる窒素源として、例えば、ポリペプトン、肉汁、ＣＳＬ、大豆かすなどを添加してもよい。

　本発明の誘導剤が適用される糸状菌は、タンパク質製造能を有する糸状菌であれば特に制限はないが、好ましくは、タンパク質製造能が高い糸状菌であるＴｒｉｃｏｄｅｒｍａ属糸状菌またはＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属糸状菌である。

　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌は、Ｈｙｐｏｃｒｅａ属とも呼ばれるが、本明細書ではＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属と記載する。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌は、好ましくは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、より好ましくは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉである。

　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの具体例としては、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの先祖にあたるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｐａｒａｒｅｅｓｅｉ（ＡＴＣＣ　ＭＹＡ－４７７７）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉに由来する公知の変異株であるＱＭ６ａ株（ＮＢＲＣ３１３２６）、ＱＭ９１２３株（ＡＴＣＣ２４４４９）、ＱＭ９４１４株（ＮＢＲＣ３１３２９）、ＰＣ－３－７株（ＡＴＣＣ６６５８９）、ＱＭ９１２３株（ＮＢＲＣ３１３２７）、ＲｕｔＣ－３０株（ＡＴＣＣ５６７６５）、ＣＬ－８４７株（Ｅｎｚｙｍｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１０，３４１－３４６（１９８８））、ＭＣＧ７７株（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．Ｓｙｍｐ．，８，８９（１９７８））、ＭＣＧ８０株（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１２，４５１－４５９（１９８２））及びこれらの派生株などが挙げられる。なお、ＱＭ６ａ株、ＱＭ９４１４株、ＱＭ９１２３株はＮＢＲＣ（ＮＩＴＥ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｃｅｎｔｅｒ）より、ＲｕｔＣ－３０株はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より入手することができる。

　Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属糸状菌は、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属糸状菌とも呼ばれるが、本明細書ではＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属糸状菌と記載する。Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属糸状菌は、好ましくは、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ｍａｒｎｅｆｆｅｉ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｉｐｉｔａｔｕｓ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｇｕｌｏｓｕｓ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｉｎｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ａｍｅｓｔｏｌｋｉａｅ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ａｔｒｏｒｏｓｅｕｓ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｓ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ｉｓｌａｎｄｉｃｕｓ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ｗｏｒｔｍａｎｎｉｉ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｓ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｕｒｐｕｒｅｏｇｅｎｕｓ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｏｌｌｉｉ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ｅｍｅｒｓｏｎｉｉまたはＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ、より好ましくは、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓである。

　Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓの具体例としては、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓに由来する公知の変異株であるＹ－９４株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５８２６）、ＴＮ株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１４５２）、Ｃ１株（ＦＥＲＭ　Ｐ－１８５０８）、ＣＦ－２６１２株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０８４８）及びこれらの派生株が挙げられる。

　本発明の誘導剤が適用される糸状菌は、野生株に制限されず、タンパク質製造能が高まるように改良された変異株も好ましく用いることができる。例えば、薬剤、紫外線照射、重イオンビーム照射などで変異処理を施し、培養した際の培養液の粘度が低下したり、タンパク質の製造性が向上した変異株を利用することができる。また、遺伝子組換え技術を用い、菌株を培養した際の培養液の粘度が低下した遺伝子組換え株や、タンパク質の製造性が向上した遺伝子組換え株も利用することができる。また、上記の薬剤、紫外線照射、重イオンビーム照射などによる変異処理と遺伝子組換え技術を組み合わせて得られた変異株を用いてもよい。

　本発明の誘導剤が適用される糸状菌の培養方法は特に限定されず、例えば遠沈管、フラスコ、ジャーファーメンター、タンクなどを用いた液体培養や、プレートなどを用いた固体培養などで培養することができる。好気的条件で培養する必要がある場合、これらの培養方法の中でも、特にジャーファーメンターや、タンク内に通気や撹拌を行いながら培養する深部培養が好ましい。通気量は、好ましくは０．１～２．０ｖｖｍ、より好ましくは０．３～１．５ｖｖｍ、さらに好ましくは０．５～１．０ｖｖｍである。培養温度は、好ましくは２５～３５℃、より好ましくは２５～３１℃である。培養におけるｐＨの条件は、好ましくはｐＨ３．０～７．０、より好ましくはｐＨ４．０～６．０である。培養時間は、タンパク質が製造される条件で、回収可能な量のタンパク質が蓄積されるまで培養すればよく、通常、２４～２８８時間程度であり、好ましくは３６～２４０時間である。

　本発明の誘導剤を利用して製造するタンパク質は特に制限はないが、菌体外に分泌されるタンパク質の製造に適しており、好ましくは酵素であり、より好ましくはセルラーゼ、アミラーゼ、インベルターゼ、キチナーゼ、ペクチナーゼなどの糖化酵素であり、さらに好ましくはセルラーゼである。

　本発明で製造されるセルラーゼには、様々な加水分解酵素が含まれており、キシラン、セルロース、ヘミセルロースに対する分解活性を持つ酵素などが含まれている。具体例としては、セルロース鎖の加水分解によりセロビオースを製造するセロビオハイドラーゼ（ＥＣ　３．２．１．９１）、セルロース鎖の中央部分から加水分解するエンドグルカナーゼ（ＥＣ　３．２．１．４）、セロオリゴ糖およびセロビオースを加水分解するβ－グルコシダーゼ（ＥＣ　３．２．１．２１）、ヘミセルロースや特にキシランに作用することを特徴とするキシラナーゼ（ＥＣ　３．２．１．８）、キシロオリゴ糖を加水分解するβ－キシロシダーゼ（ＥＣ　３．２．１．３７）などが挙げられる。本発明のタンパク質の製造方法によれば、上記のセルラーゼについて、タンパク質濃度や活性が向上し、特に、β－グルコシダーゼ活性にて当該効果が顕著に表れる。

　タンパク質濃度は以下の通り測定を行う。本発明の方法でＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌を培養することにより得られた培養液を１５，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清をタンパク質溶液とする。セルラーゼＱｕｉｃｋ　Ｓｔａｒｔ　Ｂｒａｄｆｏｒｄ　プロテインアッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）２５０μＬに希釈したセルラーゼ溶液を５μＬ添加し、室温で１５分間静置後の５９５ｎｍで用いる吸光度を測定する。牛血清アルブミン溶液を標準液とし、検量線に基づいて糖化酵素溶液に含まれるタンパク質濃度を算出する。また、セルラーゼのタンパク質濃度を測定する場合には、当該タンパク質溶液をセルラーゼ溶液として取り扱えばよい。

　β－グルコシダーゼ活性は、以下の方法で測定する。まず、１ｍＭ　４－ニトロフェニル－β－グルコピラノシド（シグマアルドリッチジャパン）を含有する５０ｍＭ　酢酸バッファー９０μＬに酵素希釈液１０μＬを添加して３０℃で１０分間反応させる。次に２Ｍ　炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定する。最後に１分間あたり１μｍｏｌの４－ニトロフェノールを遊離する活性を１Ｕとして活性を算出する。

　本発明の誘導剤を用いて糸状菌を培養してタンパク質を製造する場合、糸状菌体を含む培養液をそのままタンパク質組成物として利用してもよく、その際、必要に応じて糸状菌体が生育できないような処理、具体的には、熱処理、薬剤処理、酸・アルカリ処理、ＵＶ処理などの処理をしてもよい。また、糸状菌体を含む培養液を固液分離等の処理によって糸状菌体を除去した培養上清をタンパク質組成物として利用してもよい。また、糸状菌体を含む培養液からタンパク質以外の不要な物質を除去して得られる精製物をタンパク質組成物として利用してもよい。

　本発明の誘導剤を用いて製造される前記タンパク質組成物には、本発明の誘導剤の原料である、混紡繊維に含まれる植物繊維以外の繊維由来成分（以下、植物以外の繊維由来成分、と略す。）が含まれていてもよい。植物繊維以外の繊維由来成分とは、植物繊維以外の繊維の断片または分解物であり、これらのうち、前記タンパク質組成物には、植物繊維以外の繊維断片が高頻度で含まれうる。前記タンパク質組成物に、植物繊維以外の繊維の断片が含まれているかどうかは、顕微鏡による目視で確認することができ、その際、顕微鏡として、デジタル顕微鏡や実体顕微鏡などの光学顕微鏡、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を利用することができる。また、前記植物繊維以外の繊維の分解物が含まれているかどうか、各種クロマトグラフ法によって当該分解物を検出することで確認することができる。なお、本発明の誘導剤を用いたタンパク質の製造方法以外でタンパク質を製造した場合、得られるタンパク質組成物に、植物繊維以外の繊維由来成分が含まれることは考えられないため、タンパク質組成物に植物繊維以外の繊維由来成分が含まれている場合、当該タンパク質組成物は、本発明の誘導剤を用いて製造されたものであると判断することができる。

　本発明の誘導剤を用いたタンパク質の製造方法の製造対象がセルラーゼの場合には、当該セルラーゼを用いてセルロースを加水分解することで、糖液を製造することができる。糖液を製造するための原料となるセルロースとしては、本発明の誘導剤以外の誘導剤として記載したセルロースを含むバイオマスに含まれるセルロースを利用することができ、また、植物繊維と植物繊維以外の繊維を含む混紡繊維に含まれるセルロースを利用をすることができる。植物繊維と植物繊維以外の繊維を含む混紡繊維に含まれるセルロースを原料として糖液を製造する場合、植物繊維と植物繊維以外の繊維を含む混紡繊維としては、後述の実施例に示されるとおり、本発明の誘導剤の原料となる混紡繊維と同一の構成の混紡繊維を原料とすることで加水分解効率が高まることから、本発明の誘導剤の原料となる混紡繊維と同一の構成の混紡繊維が好ましく用いられる。

　糖化反応の条件は、特に限定されないが、糖化反応の温度は、好ましくは２５～６０℃、より好ましくは３０～５５℃の範囲である。糖化反応の時間は、好ましくは２～２００時間の範囲である。糖化反応のｐＨは、好ましくはｐＨ３．０～７．０、より好ましくはｐＨ４．０～６．０の範囲である。糸状菌由来セルラーゼの場合、その反応最適ｐＨはｐＨ５．０である。さらに、加水分解の過程でｐＨの変化が起きるため、反応液に緩衝液を添加する、あるいは、酸やアルカリを用いて一定ｐＨを保持しながら実施することが好ましい。

　糖化液からセルラーゼ等を分離回収する場合には、糖化液を限外ろ過膜などでろ過し、非透過側に回収することができる、必要に応じてろ過の前工程として、糖化液から固形分を取り除いておいてもよい。回収した酵素は、再び糖化反応に用いることができる。

　また、植物繊維と植物繊維以外の繊維を含む混紡繊維をセルラーゼ処理すると、植物繊維は完全にまたは部分的に加水分解され、一方で、植物繊維以外の繊維は加水分解されずに繊維の形状を保ったまま残存する。従って、本発明の誘導剤を用いて得られたセルラーゼで植物繊維と植物繊維以外の繊維を含む混紡繊維を加水分解処理して得られる処理物から、加水分解された植物繊維を除去することによって、植物繊維と植物繊維以外の繊維を含む混紡繊維から植物繊維以外の繊維を回収することができる。そして、本発明の誘導剤を用いて得られたセルラーゼは、前述の通り、本発明の誘導剤の原料となる混紡繊維と同一の構成の混紡繊維の加水分解効率に優れることから、本発明の誘導剤の原料となる混紡繊維と同一の構成の混紡繊維から植物繊維以外の繊維を回収する場合に好ましく適用される。

　植物繊維が完全に加水分解されると、糖が主成分である加水分解物が得られるので、この場合、植物繊維と植物繊維以外の繊維を含む混紡繊維のセルラーゼ処理物を、当業者に公知の固液分離処理することで、植物繊維以外の繊維を回収することができる。植物繊維が部分的に加水分解されると、結晶性セルロースが主成分である加水分解物が得られるので、この場合、植物繊維と植物繊維以外の繊維を含む混紡繊維のセルラーゼ処理物を、ざるなどを用いてろ別することで、植物繊維以外の繊維を回収することができる。

　植物繊維と植物繊維以外の繊維を含む混紡繊維からセルラーゼ処理により植物繊維以外の繊維を回収する場合、セルラーゼ処理の前に前述の解繊処理をしておくことが好ましい。また、セルラーゼ処理条件は特に制限はなく、前述のセルロースを糖化するための加水分解条件が好ましく適用される。

　回収される植物繊維以外の繊維は、当業者に公知のケミカルリサイクル方法やマテリアルリサイクル方法にしたがって再利用することができ、特に、植物繊維以外の繊維が化学繊維である場合は、繊維製品や樹脂製品の原料として再利用することができる。

　前述の方法で得られた糖液を発酵原料として使用し、微生物発酵することによって化学品やタンパク質を製造することができる。化学品やタンパク質を製造する際に利用する微生物は、目的とする化学品やタンパク質を製造する能力を有する微生物であれば特に制限はなく、パン酵母をはじめとする酵母、大腸菌、コリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌などが挙げられる。微生物は自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換え技術により、性質が改変されたものであってもよい。

　前記微生物発酵によって得られる化学品は特に制限はなく、具体例として、アルコール、有機酸、アミノ酸、核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。例えば、アルコールとしては、エタノール、ブタノール、１，３－プロパンジオール、１，３－ブタンジオール、２，３－ブタンジオール、１，４－ブタンジオール、グリセロールなど、有機酸としては、ギ酸、酢酸、乳酸、コハク酸、リンゴ酸など、アミノ酸としては、リジン、グルタミン酸など、核酸としては、イノシン酸、グアニル酸、イノシン、グアノシンなどを挙げることができる。

　前記微生物発酵によって得られる化学品は、最終目的物の原料であってもよく、具体例として、微生物発酵により得られるアルコールを原料として、公知の技術に従って航空燃料を製造することが挙げられる。非石油由来の化学品を原料とする航空燃料は、持続可能な代替航空燃料（ＳＡＦ：Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ　Ａｖｉａｔｉｏｎ　Ｆｕｅｌ）とも呼ばれ、ＡＳＴＭ　Ｄ７５６６規格としてＡｎｎｅｘ１～７が承認されている。前記微生物発酵によって得られた化学品を原料とすることで、ＡＳＴＭ　Ｄ７５６６規格のＡｎｎｅｘ１～７のいずれかのＳＡＦを製造することができる。

　前記微生物発酵によって得られるタンパク質は特に制限はなく、その用途も特に制限はなく、具体例としては、産業用途、医療用途または食品・飼料用途で利用可能な酵素、ペプチド、タンパク質素材などを挙げることができる。

　以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。

　＜参考例１＞タンパク質濃度測定条件
使用するタンパク質濃度測定試薬：Ｑｕｉｃｋ　Ｓｔａｒｔ　Ｂｒａｄｆｏｒｄプロテインアッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）
測定条件
測定温度：室温
タンパク質濃度測定試薬：２５０μＬ
糸状菌の培養液：５μＬ
反応時間：５分
吸光度：５９５ｎｍ
標準品：ＢＳＡ。

　＜参考例２＞β－グルコシダーゼ活性測定条件
基質：４－ニトロフェニル－β－グルコピラノシド（シグマアルドリッチジャパン）
反応液：１ｍＭ　４－ニトロフェニル－β－グルコピラノシドを含有する、５０ｍＭ　酢酸バッファー９０μＬ
酵素希釈液：１０μＬ
反応温度：３０℃
反応時間：１０分間
反応停止剤：２Ｍ　炭酸ナトリウム１０μＬ
吸収度：４０５ｎｍ。

　＜参考例３＞植物繊維の調製
　１．酸処理
　１００％綿繊維生地、Ｔ／Ｃ混紡繊維生地、脱脂綿から植物繊維粉末を調製した。１００％綿繊維生地、Ｔ／Ｃ混紡繊維生地（ＴＹ＿ＨＴ－８０５０Ｗ；豊島）については、あらかじめそれぞれハサミにて約１ｃｍ角に裁断したものを、それぞれ、ブレンダーにて解繊処理した。解繊処理物、脱脂綿をそれぞれ２０％リン酸溶液に浸漬して、９０℃で４時間加温処理後、スターラーで攪拌して酸処理物を得た。酸処理物をざるに移し替えて水で酸処理物を数回洗浄し、ざるを通過した洗浄液を回収してろ紙（ＦＩＬＴＥＲ　ＰＡＰＥＲ　１８５ｍｍ；ＡＤＶＡＮＴＥＣ）を敷いたブフナー漏斗へ注ぎ、吸引ポンプ（ＤＡＰ－１５；ＵＬＶＡＣ）を用いて吸引ろ過し、ろ紙上に残存した粉末状の植物繊維を回収した。

　２．セルラーゼ処理
　Ｔ／Ｃ混紡繊維生地から植物繊維粉末を調製した。あらかじめハサミにて１ｃｍ角に裁断したものを、ブレンダーにて解繊処理し、解繊処理物１ｋｇに対して、後述の実施例１の誘導剤３で培養したＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌の本培養液由来のセルラーゼをタンパク量として４ｇになるように添加し、５０℃条件にて攪拌しながら反応処理を行い、セルラーゼ処理物を得た。前述の酸処理物からの植物繊維粉末の回収と同様に、セルラーゼ処理物から粉末状の植物繊維を回収した。

　３．亜臨界加水分解処理
　撹拌機を具備したＳＵＳ３１６Ｌ製オートクレーブに、Ｔ／Ｃ混紡繊維生地６．０ｇ、脱イオン水６０ｇ、水酸化ナトリウム（富士フイルム和光純薬）２．１ｇを加えた。反応容器内の窒素置換を行い、窒素加圧１．０ＭＰａにて密閉下、１８０℃にて３０分間２００ｒｐｍで攪拌した。反応時、系内の圧力は０．４ＭＰａであった。反応後、８０℃にまで冷却し、植物繊維が分散した水溶液をろ過し、植物繊維を回収した。

　＜参考例４＞糖化反応
　参考例３で調製したＴ／Ｃ混紡繊維生地由来の植物繊維粉末０．１ｇを糖化対象物として、後述の実施例１で得られたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌の本培養液由来のセルラーゼ溶液を糖化対象物１ｇに対しタンパク質量として２ｍｇになるよう添加し、５０ｍＬ　サーモブロックローテ―ター　ＳＮ－０６ＢＮ（日神理化）を用い、加水分解処理（５０℃、２４時間）した。

　＜参考例５＞グルコース濃度の測定
　糖化反応後の糖液を１５，０００×ｇ、４℃の条件下で１０分間遠心分離により得られた上清を０．４５μｍのフィルターでろ過したものに対して１０％量になるように１Ｎ　ＮａＯＨ溶液を添加して反応を停止させ、以下の条件で定量分析した。

　グルコースを、高速液体クロマトグラフ（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ；島津製作所）を用いて、以下の条件で検出し、グルコースの標品で作製した検量線をもとに、定量分析した。
ガードカラム：Ｓｈｏｄｅｘ　ＨＩＬＩＣｐａｋ　ＶＧ－５０Ｇ　４Ａ　４．６ｍｍ×１０ｍｍ
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　ＨＩＬＩＣｐａｋ　ＶＧ－５０Ｇ　４Ｅ　４．６ｍｍ×２５０ｍｍ
分離法：ＨＩＬＩＣ
移動相：ＭｉｌｌｉＱ水：アセトニトリル＝２５：７５（ｖ／ｖ）
検出器：ＲＩ
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
カラムオーブン温度：４０℃
サンプル希釈：５０％　アセトニトリル。

　＜実施例１＞Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌の培養
　（前培養）
　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＰＣ－３－７株（ＡＴＣＣ＃６６５８９）の胞子を１．０×１０^７／ｍＬになるように生理食塩水で希釈し、その希釈胞子溶液１ｍＬを、５００ｍＬバッフル付きフラスコ中の１００ｍＬの前培養培地（表１）に植菌し、振盪培養機にて２８℃、１２０ｒｐｍの条件にて７２時間培養した。

　（本培養）
　５００ｍＬバッフル付きフラスコ中の１００ｍＬの本培養培地（表２）に対し、前培養液１０ｍＬを植菌し、振盪培養機にて２８℃、１２０ｒｐｍの条件にて１６８時間培養した。

　本培養培地に添加したタンパク質製造を誘導するための各種誘導剤は、以下の誘導剤１～８を使用した。
（誘導剤１）参考例３の酸処理で調製したＴ／Ｃ混紡繊維由来植物繊維粉末
（誘導剤２）ラクトース（富士フイルム和光純薬）
（誘導剤３）工業パルプ（Ａｒｂｏｃｅｌ　Ｂ８００；レッテンマイヤージャパン）
（誘導剤４）脱脂綿
（誘導剤５）参考例３の酸処理で調製した脱脂綿由来植物繊維粉末
（誘導剤６）１００％綿繊維生地（約１ｃｍ角に裁断）
（誘導剤７）参考例３の酸処理で調製した１００％綿繊維生地由来植物繊維粉末
（誘導剤８）国際公開第２０２１／２３５４１９号に記載の方法に従って調製したコーンハル粉砕物（レーザー回折・散乱法による測定方法で得られた体積基準の粒度分布において粒子径７５μｍに相対粒子量ピークを有する）。

　（培養液の採取）
　培養開始１６８時間後に１ｍＬ培養液を採取した。培養液を１５，０００×ｇ、４℃の条件下で１０分間遠心分離して得られた上清を、細孔径０．４５μｍのフィルターでろ過し、得られたろ液をセルラーゼ溶液として、以下の実験に用いた。

　（タンパク質濃度の測定）
　参考例１に従って、各種セルラーゼ溶液のタンパク質濃度を測定した。その結果、誘導剤１と３を用いた培養で得られたセルラーゼ溶液のタンパク質濃度は２．４ｇ／Ｌで最も高かった。また、誘導剤１、４～７はいずれも綿繊維に由来するセルロースを主成分とするにもかかわらず、これらの中でもＴ／Ｃ混紡繊維由来の誘導剤１が顕著に優れたタンパク質製造の誘導能を有していた。結果の詳細を表３に示す。

　（β－グルコシダーゼ活性の測定）
　参考例２に従って、培養開始１６８時間目のそれぞれの培養液におけるβ－グルコシダーゼの活性を測定した。活性は、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定し、１分間あたり１μｍｏｌの基質を遊離する活性を１Ｕとして算出した。その結果、誘導剤１を用いた培養で得られた培養液の活性は２．５Ｕ／ｍＬで最も高かった。結果の詳細を表３に示す。

　＜実施例２＞糖化反応
　実施例１で得られた各種セルラーゼ溶液を用いて、参考例４の方法にしたがって糖化反応を行い、参考例５に記載の方法にしたがって糖化反応液に含まれるグルコース量を定量した。その結果、誘導剤１を用いた培養で得られたセルラーゼ溶液で糖化反応を行った場合が最も遊離グルコース濃度が高かった。結果を表４に示す。

　＜実施例３＞タンパク質組成物に含まれる植物繊維以外の繊維由来成分
　実施例１にて、誘導剤１を用いて培養して得られた培養液３ｍＬに対し、コンゴーレッド（富士フイルム和光純薬）が終濃度０．２％になるように水で希釈したコンゴーレッド溶液を０．１ｍＬ添加し、常温で放置したのちに、光学顕微鏡で検鏡を行った。図１のとおり、数多のＴ／Ｃ混紡繊維由来の植物繊維の存在を確認することができ、それらはコンゴーレッドにより特異的に染色されていたが、コンゴーレッドにより特異的に染まらない繊維断片であるＴ／Ｃ混紡繊維由来の化学繊維の存在も同時に確認することができた。

　＜実施例４＞Ｔ／Ｃ混紡繊維の酸処理物、セルラーゼ処理物、亜臨界加水分解処理物を用いたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌の培養
　（前培養）
　実施例１と同様の手順にて前培養液を調製した。

　（本培養）
　実施例１と同様の本培養培地（表２）に対し、前培養液を植菌し、同様の条件にて１９２時間培養した。

　本培養培地に添加したタンパク質製造を誘導するための各種誘導剤は、以下の誘導剤１、３、９、１０を使用した。
（誘導剤１）参考例３の酸処理で調製したＴ／Ｃ混紡繊維由来植物繊維粉末
（誘導剤３）工業パルプ（Ａｒｂｏｃｅｌ　Ｂ８００；レッテンマイヤージャパン）
（誘導剤９）参考例３のセルラーゼ処理で調製したＴ／Ｃ混紡繊維由来植物繊維粉末
（誘導剤１０）参考例３の亜臨界加水分解処理で調製したＴ／Ｃ混紡繊維由来植物繊維。

　（培養液の採取）
　実施例１と同様の手順にて、培養開始１９２時間目に採取した培養液から、各種セルラーゼ溶液を調製し、以下の実験に用いた。

　（タンパク質濃度の測定）
　実施例１と同様の手順にて、各種セルラーゼ溶液のタンパク質濃度を測定した。その結果は表５に示すとおりであり、Ｔ／Ｃ混紡繊維由来の誘導剤１、９および１０と、工業パルプ由来の誘導剤３のタンパク質誘導能は同程度であった。

　（β－グルコシダーゼ活性の測定）
　実施例１と同様の手順にて、培養開始１９２時間目のそれぞれの培養液におけるβ－グルコシダーゼの活性を測定した。その結果は表５に示すとおりであり、Ｔ／Ｃ混紡繊維由来の誘導剤９を用いた培養で得られた培養液の活性は２．４Ｕ／ｍＬで最も高かった。また、Ｔ／Ｃ混紡由来の誘導剤１や１０を用いた培養で得られた培養液の活性も、工業パルプ由来の誘導剤３を用いた培養で得られた培養液の活性より約２倍高かった。

１　コンゴーレッド染色部（植物繊維）
２　コンゴーレッドで染色されない繊維断片（化学繊維）
３　植物繊維と化学繊維の凝集部

Claims (26)

1. 　植物繊維および植物繊維以外の繊維を含む混紡繊維由来の植物繊維を有効成分として含む、糸状菌培養によるタンパク質製造のための誘導剤。
2. 　前記植物繊維が、種子毛繊維、靭皮繊維、葉脈繊維または果実繊維である、請求項１に記載の誘導剤。
3. 　前記種子毛繊維が、綿繊維である、請求項２に記載の誘導剤。
4. 　前記植物繊維以外の繊維が、化学繊維である、請求項１に記載の誘導剤。
5. 　前記化学繊維が、少なくともポリエステル繊維を含む化学繊維である、請求項４に記載の誘導剤。
6. 　前記混紡繊維を酸処理、セルラーゼ処理または亜臨界加水分解処理して得られる植物繊維を有効成分として含む、請求項１に記載の誘導剤。
7. 　前記酸が、無機酸または有機酸である、請求項６に記載の誘導剤。
8. 　前記無機酸が、リン酸である、請求項７に記載の誘導剤。
9. 　前記有機酸が、二価以上のカルボン酸である、請求項７に記載の誘導剤。
10. 　前記二価以上のカルボン酸が、クエン酸またはシュウ酸である、請求項９に記載の誘導剤。
11. 　請求項１から１０のいずれかに記載の誘導剤を含む、培地。
12. 　タンパク質を製造する能力を有する糸状菌を、請求項１１に記載の培地で培養する工程を含む、タンパク質の製造方法。
13. 　前記タンパク質が、酵素である、請求項１２に記載のタンパク質の製造方法。
14. 　前記酵素が、セルラーゼである、請求項１３に記載のタンパク質の製造方法。
15. 　前記糸状菌が、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌またはＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属糸状菌である、請求項１２に記載のタンパク質の製造方法。
16. 　タンパク質、ならびに、植物繊維および植物繊維以外の繊維を含む混紡繊維に含まれる植物繊維以外の繊維由来成分を含む、タンパク質組成物。
17. 　前記植物繊維以外の繊維由来成分が、植物繊維以外の繊維断片である、請求項１６に記載のタンパク質組成物。
18. 　前記植物繊維以外の繊維が、化学繊維である、請求項１６に記載のタンパク質組成物。
19. 　前記化学繊維が、ポリエステル繊維である、請求項１８に記載のタンパク質組成物。
20. 　前記タンパク質が、酵素である、請求項１６に記載のタンパク質組成物。
21. 　前記酵素が、セルラーゼである、請求項２０に記載のタンパク質組成物。
22. 　セルロースを、請求項１４に記載の方法で得られたセルラーゼ、または、請求項２１に記載のタンパク質組成物で加水分解する工程を含む、糖液の製造方法。
23. 　前記セルロースが、植物繊維および植物繊維以外の繊維を含む混紡繊維に含まれるセルロースである、請求項２２に記載の糖液の製造方法。
24. 　植物繊維および植物繊維以外の繊維を含む混紡繊維を、請求項１４に記載の方法で得られたセルラーゼ、または、請求項２１に記載のタンパク質組成物で加水分解処理する工程、ならびに、前記加水分解処理工程で得られた処理物から加水分解された植物繊維を除去する工程、を含む、植物繊維および植物繊維以外の繊維を含む混紡繊維から植物繊維以外の繊維を回収する方法。
25. 　請求項２２に記載の方法で得られた糖液を発酵原料として、化学品を製造する能力を有する微生物を培養する工程を含む、化学品の製造方法。
26. 　請求項２２に記載の方法で得られた糖液を発酵原料として、タンパク質を製造する能力を有する微生物を培養する工程を含む、タンパク質の製造方法。