WO2025258845A1 - 항산화 효능이 증가된 세포 및 이의 용도 - Google Patents

항산화 효능이 증가된 세포 및 이의 용도

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WO2025258845A1
WO2025258845A1 PCT/KR2025/005579 KR2025005579W WO2025258845A1 WO 2025258845 A1 WO2025258845 A1 WO 2025258845A1 KR 2025005579 W KR2025005579 W KR 2025005579W WO 2025258845 A1 WO2025258845 A1 WO 2025258845A1
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oxidative stress
disease
cell
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polynucleotide encoding
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이은주
김효수
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Seoul National University Hospital
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    • C12Y—ENZYMES
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    • C12Y603/02—Acid—amino-acid ligases (peptide synthases)(6.3.2)
    • C12Y603/02003—Glutathione synthase (6.3.2.3)

Definitions

  • the present invention relates to cells with increased antioxidant efficacy and uses thereof, and more particularly to cells overexpressing glutathione synthase and uses thereof.
  • ROS Reactive oxygen species
  • antioxidants that can prevent or treat various diseases such as aging, heart disease, and cancer by removing these reactive oxygen species.
  • Antioxidants can be effectively used to prevent, improve, or treat the symptoms of various diseases caused by oxidative stress by inhibiting or removing the production of reactive oxygen species in the body, thereby preventing oxidative stress that causes irreversible damage to cells (Korean Patent No. 10-1661650).
  • all antioxidants developed to date have shortcomings such as side effects on the human body, high prices, or low antioxidant efficacy. Therefore, there is an urgent need to develop new antioxidants that are safer, have excellent antioxidant efficacy, and are economical.
  • the present invention has been made to solve the problems of the prior art as described above, and its purpose is to provide an antioxidant composition, a pharmaceutical composition for preventing or treating oxidative stress-related diseases, a food composition for improving or preventing oxidative stress-related diseases, a cosmetic composition for improving or preventing skin diseases caused by oxidative stress, etc., which contain as an active ingredient a cell into which a polynucleotide encoding expressible glutathione synthetase has been introduced.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating oxidative stress-related diseases, which comprises, as an active ingredient, a cell into which a polynucleotide encoding an expressible glutathione synthetase has been introduced.
  • the present invention provides a food composition for improving or preventing oxidative stress-related diseases, which comprises, as an active ingredient, a cell into which a polynucleotide encoding expressible glutathione synthetase has been introduced.
  • the present invention provides a cosmetic composition for improving or preventing oxidative stress-related skin diseases, comprising, as an active ingredient, a cell into which a polynucleotide encoding expressible glutathione synthetase has been introduced.
  • Symptoms of the skin disease include aging, freckles, pigmentation, and wrinkles, but are not limited to symptoms induced by oxidative stress.
  • the present invention provides an antioxidant composition
  • an antioxidant composition comprising, as an active ingredient, a cell into which a polynucleotide encoding an expressible glutathione synthetase has been introduced.
  • the polynucleotide encoding the expressible glutathione synthetase can be of any type, as long as it can express glutathione synthetase in a cell, and can exhibit the same effect by causing glutathione synthetase to operate in the cell. Therefore, there is no limitation on the type thereof, and preferably, it can be in the form of mRNA, self-amplifying RNA (saRNA), synthetic RNA, cDNA, linear DNA, minicircle DNA, DNA, etc., and expression can also be induced in the cell through a plasmid, virus, etc.
  • the expressible glutathione synthetase can be produced in the form of a recombinant vector comprising a promoter and a polynucleotide encoding glutathione synthetase operably linked thereto.
  • the glutathione synthase may comprise an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO: 2 a variant of SEQ ID NO: 2 is included in the scope of the present invention. Specifically, it may comprise an amino acid sequence having a sequence homology of at least 80%, preferably at least 85%, more preferably at least 90%, more preferably at least 95%, and most preferably at least 98% with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the “% of sequence homology” is determined by comparing the optimally aligned sequence with the comparison region, and a portion of the polynucleotide sequence or amino acid sequence in the comparison region may include additions or deletions (i.e., gaps) compared to the reference sequence for the optimal alignment of the sequence (which does not include additions or deletions). However, it is not limited thereto as long as it is a type known as human glutathione synthase. Alignment for the purpose of determining the percent sequence identity can be accomplished in a variety of ways within the scope of those skilled in the art, for example, using publicly available computer software such as BLAST, BLAST-2, ALIGN, or MEGALIGNTM (DNASTAR) software. Those skilled in the art can determine appropriate parameters for measuring alignment, including any algorithms necessary to achieve maximal alignment over the full length of the sequences being compared.
  • the cell may preferably be a somatic cell, a mesenchymal stem cell, an adult stem cell, an induced pluripotent stem cell, an embryonic stem cell, an induced pluripotent stem cell, etc., and more preferably an embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cell, but is not limited thereto as long as it is a type of stem cell used as a stem cell therapeutic agent.
  • the recombinant vector must be prepared in a form that can be expressed in the human body, and may preferably include a promoter, an enhancer, an initiation codon, a termination codon, a polyadenylation signal, etc., but is not limited thereto as long as it is in a form known to be capable of being expressed in the body.
  • the oxidative stress-related disease refers to all diseases caused by reactive oxygen species, and preferably, may be aging, lipid metabolic disease, arteriosclerosis, heart failure, hypertensive heart disease, arrhythmia, myocardial infarction, angina pectoris, cancer, inflammatory disease, etc., but is not limited thereto if it is a disease whose symptoms can be prevented, alleviated, improved, or treated by an antioxidant effect.
  • the aging refers to aging-related diseases, that is, diseases that occur in the process of being born, growing, and aging as a natural phenomenon over time, and preferably may include dementia, osteopenia, amyotrophic lateral sclerosis, osteoporosis, osteoarthritis, obesity, Parkinson's disease, geriatric cardiovascular disease, geriatric pulmonary disease, geriatric ocular disease, skin aging, etc., but is not limited thereto if it is a disease caused or accelerated by oxidative stress.
  • aging-related diseases that is, diseases that occur in the process of being born, growing, and aging as a natural phenomenon over time, and preferably may include dementia, osteopenia, amyotrophic lateral sclerosis, osteoporosis, osteoarthritis, obesity, Parkinson's disease, geriatric cardiovascular disease, geriatric pulmonary disease, geriatric ocular disease, skin aging, etc., but is not limited thereto if it is a disease caused or accelerated by
  • the composition or cell acts as an antioxidant when administered into the body, thereby reducing oxidative stress, thereby suppressing inflammation, cell death, etc., and ultimately promoting cell regeneration and growth, thereby preventing, improving, alleviating, or treating symptoms caused by reactive oxygen species, and therefore there is no limitation on the type of oxidative stress-related disease.
  • the present invention also provides a cell therapeutic agent into which a polynucleotide encoding an expressible glutathione synthetase is introduced.
  • the present invention also provides a method for preventing, improving, alleviating, or treating symptoms or diseases related to oxidative stress, comprising administering to a subject a composition comprising, as an active ingredient, a cell into which a polynucleotide encoding an expressible glutathione synthetase has been introduced.
  • the present invention also provides a composition
  • a composition comprising a cell into which a polynucleotide encoding an expressible glutathione synthetase has been introduced as an active ingredient for use in preventing, improving, alleviating, or treating symptoms or diseases related to oxidative stress.
  • the present invention also provides a use for producing a drug for preventing, improving, alleviating, or treating oxidative stress-related symptoms or diseases of a cell into which a polynucleotide encoding an expressible glutathione synthetase has been introduced.
  • Cells introduced with a polynucleotide encoding an expressible glutathione synthetase according to the present invention can act as effective antioxidants in the body, thereby reducing oxidative stress, thereby suppressing inflammation and cell death, and ultimately promoting cell generation and recovery. Therefore, it is expected that the present invention can be effectively used in the treatment of various diseases induced by oxidative stress, such as dementia, wrinkles, freckles, osteopenia, amyotrophic lateral sclerosis, osteoporosis, obesity, aging diseases such as Parkinson's disease, cancer, skin damage, and heart disease.
  • diseases induced by oxidative stress such as dementia, wrinkles, freckles, osteopenia, amyotrophic lateral sclerosis, osteoporosis, obesity, aging diseases such as Parkinson's disease, cancer, skin damage, and heart disease.
  • Figure 1 is a drawing showing the results of confirming whether a CMV-GS plasmid according to one embodiment of the present invention exhibits an antioxidant effect in cells.
  • FIG. 2 is a drawing showing the results of confirming whether stem cells transformed with a CMV-GS plasmid according to one embodiment of the present invention exhibit an antioxidant effect in the muscles of mice induced with sarcopenia.
  • FIG. 3 is a drawing showing the results of confirming whether stem cells transformed with a CMV-GS plasmid according to one embodiment of the present invention exhibit an anti-inflammatory effect in the muscles of mice induced with sarcopenia.
  • FIG. 4 is a drawing showing the results of confirming whether stem cells transformed with a CMV-GS plasmid according to one embodiment of the present invention exhibit an effect of inhibiting cell death in the muscles of mice induced with sarcopenia.
  • FIG. 5 is a drawing showing the results of confirming whether stem cells transformed with a CMV-GS plasmid according to one embodiment of the present invention have an effect of promoting muscle generation in the muscles of mice induced with sarcopenia.
  • FIG. 6 is a drawing showing the results of confirming whether stem cells transformed with a CMV-GS plasmid according to one embodiment of the present invention have an effect of promoting muscle generation in the muscles of aged mice induced with sarcopenia.
  • FIG. 7 is a drawing showing the results of confirming whether stem cells transformed with a CMV-GS plasmid according to one embodiment of the present invention exhibit an anti-inflammatory effect in the muscles of aged mice induced with sarcopenia.
  • FIG. 8 is a drawing showing the results of confirming whether stem cells transformed with a CMV-GS plasmid according to one embodiment of the present invention have an effect of reducing the secretion of inflammatory cytokines in the serum of aged mice induced with sarcopenia.
  • FIG. 9 is a drawing showing the results of confirming whether stem cells transformed with a CMV-GS plasmid according to one embodiment of the present invention have the effect of increasing muscle strength in aged mice induced with sarcopenia.
  • step of ⁇ or “step of ⁇ ” does not mean “step for ⁇ .”
  • the term “combination of these” included in the expression in the Makushi format means one or more mixtures or combinations selected from the group consisting of the components described in the expression in the Makushi format, and means including one or more selected from the group consisting of the components.
  • active ingredient is used interchangeably with active drug, active ingredient, active preparation, drug and therapeutic preparation, and refers to any substance used to prevent, alleviate, improve or treat a target disease.
  • glutathione synthetase is an enzyme that produces glutathione, i.e., a crystalline peptide composed of glutamic acid, cysteine, and glycine.
  • glutathione synthetase may include an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO: 2 a variant of SEQ ID NO: 2 is included in the scope of the present invention. Specifically, it may include an amino acid sequence having a sequence homology of 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, and most preferably 98% or more to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the glutathione synthetase may be encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a variant thereof.
  • the above variant may include a base sequence having a sequence identity of 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, and most preferably 98% or more with the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the above variant means having substantial identity with glutathione synthase.
  • substantially identical means that when homology between amino acid sequences or nucleic acid sequences is compared using any of various algorithms in commercial computer programs such as BLASTN, BLASTP, Gap BLAST, and PSI-BLAST, if two sequences contain the same residue at corresponding positions, preferably at least 80% or more, at least 85% or more, at least 90% or more, at least 95% or more, at least 96% or more, at least 97% or more, at least 98% or more, or at least 99% or more sequence identity, they are generally considered to be “substantially identical.”
  • due to the "degeneracy of the genetic code it includes a nucleotide sequence that has been changed.
  • “Degeneracy of the genetic code” means that there are multiple different codons that code for one amino acid. For example, in the case of the amino acid leucine, it is identically encoded by various codons such as “CUU”, “CUC”, “CUA”, “CUG”, and “UUA”, and this is called the degeneracy of the genetic code. That is, the nucleic acid sequence for encoding the amino acid sequence of the present invention also includes a sequence that has been changed due to the degeneracy of the genetic code in addition to the sequence disclosed in the present specification.
  • vector refers to a general term for a vector capable of expressing a peptide or protein encoded by a heterologous nucleic acid inserted into the vector, and preferably refers to a vector in the form of an expression vector capable of expressing human glutathione synthase in a human body.
  • vector refers to a DNA fragment, nucleic acid molecule, etc.
  • expression vector refers to a general term for a recombinant DNA molecule that includes a desired coding sequence and appropriate nucleic acid sequences essential for expressing the coding sequence operably linked in a specific host organism, among vectors.
  • operably linked refers to a general term in which the desired coding sequence is sequentially linked to appropriate nucleic acid sequences in a form capable of expressing the same, and there is no limitation on the order and structure thereof.
  • RNA polymerase binds e.g., a CMV (cytomegalovirus) promoter, an adenovirus late promoter, a vaccinia virus 7.5K promoter, an SV40 promoter, a tk promoter of HSV, an RSV promoter, an EF1 alpha promoter, a metallothionine promoter, a beta-actin promoter, a promoter of a human IL-2 gene, a promoter of a human IFN gene, a promoter of a human IL-4 gene, a promoter of a human lymphotoxin gene, a promoter of a human GM-CSF gene for expression in a eukaryotic cell; a tac promoter, a lac promoter, a lacUV5 promoter, an lpp promoter, a pL promoter, a pR
  • the vector may include any commonly used transporter such as a plasmid, phage, cosmid, chromosome, virus, etc., and is preferably an expression vector capable of expressing the desired coding sequence in the human body. More preferably, it may include the base sequence represented by SEQ ID NO: 3. In addition, a variant of SEQ ID NO: 3 is included in the scope of the present invention. Specifically, it may include a base sequence having a sequence homology of 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, and most preferably 98% or more with the base sequence of the above SEQ ID NO: 3.
  • such a recombinant vector can be introduced into a host cell using a method known in the art to transform the host cell.
  • methods for introducing into a host cell include, but are not limited to, the calcium chloride method, microprojectile bombardment, electroporation, PEG-mediated fusion, microinjection, and liposome-mediated methods.
  • stem cell means both eukaryotic and prokaryotic cells, including human or non-human, and may include both somatic cells and stem cells.
  • stem cell refers to a broad concept that collectively refers to undifferentiated cells that have the ability to differentiate into various types of body tissue cells, i.e., stemness. These stem cells can be broadly divided into embryonic stem cells that can be produced using embryos, mesenchymal stem cells, adult stem cells, induced pluripotent stem cells, gametes, cancer stem cells, etc.
  • introduction refers to all methods of introducing a specific gene into a cell, tissue, or animal, including transformation, and in particular, any form of electroporation, conjugation, infection, transduction, or transfection.
  • “administration” means providing a transformed stem cell or composition of the present invention to an individual by any appropriate method.
  • prevention means any action that suppresses or delays the onset of a target disease, and preferably includes both primary prevention that prevents the onset in advance and secondary prevention that detects the onset early and treats it in a timely manner.
  • treatment in the present invention means any action that improves or beneficially changes a target disease and its resulting metabolic abnormality symptoms by administering a pharmaceutical composition according to the present invention, and “improvement” means any action that reduces a parameter related to a target disease, for example, the severity of a symptom, by administering a composition according to the present invention.
  • the term “subject” refers to a subject to which the composition of the present invention can be administered, and is preferably a mammal including a human, and may refer to mammals such as human or non-human primates, mice, rats, dogs, cats, horses, cows, pigs, etc., but the subject is not limited thereto.
  • the term “subject in need thereof” may preferably refer to a subject having a symptom or disease related to oxidative stress, or having a risk of a symptom or disease related to oxidative stress, and requiring prevention or treatment, but is not limited thereto.
  • the content of stem cells transformed with the recombinant vector in the composition of the present invention can be appropriately adjusted depending on the symptoms of the disease, the degree of progression of the symptoms, the condition of the patient, etc., and may be, for example, 0.0001 to 99.9 wt% or 0.001 to 50 wt% based on the total weight of the composition, but is not limited thereto.
  • the content ratio is a value based on the dry amount after removing the solvent.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further comprise suitable carriers, excipients, and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • the excipients may be, for example, one or more selected from the group consisting of diluents, binders, disintegrants, lubricants, adsorbents, moisturizers, film-coating materials, and controlled-release additives.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated and used in the form of external preparations such as powders, granules, sustained-release granules, enteric-coated granules, liquids, eye drops, ellipsoids, emulsions, suspensions, alcohols, troches, aromatic waters, limonades, tablets, sustained-release tablets, enteric-coated tablets, sublingual tablets, hard capsules, soft capsules, sustained-release capsules, enteric capsules, pills, tinctures, soft extracts, dry extracts, fluid extracts, injections, capsules, irrigation solutions, ointments, lotions, pastes, sprays, inhalants, patches, sterile injection solutions, or aerosols, according to a conventional method, and the external preparations may have formulations such as creams, gels, patches, sprays, ointments, ointments, lotions, liniments, pastes, or cataplasmas.
  • external preparations may have formulations such as cream
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical composition according to the present invention include lactose, dextrose, sucrose, oligosaccharides, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methyl hydroxybenzoate, propyl hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • Other pharmaceutically acceptable carriers may be referred to those described in the following literature (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
  • diluents or excipients such as fillers, bulking agents, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • the additives of the tablets, powders, granules, capsules, pills, and troches according to the present invention include excipients such as corn starch, potato starch, wheat starch, lactose, sucrose, glucose, fructose, D-mannitol, precipitated calcium carbonate, synthetic aluminum silicate, calcium hydrogen phosphate, calcium sulfate, sodium chloride, sodium bicarbonate, purified lanolin, microcrystalline cellulose, dextrin, sodium alginate, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, kaolin, urea, colloidal silica gel, hydroxypropyl starch, hydroxypropyl methylcellulose (HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, propylene glycol, casein, calcium lactate, and Primogel; Gelatin, gum arabic, ethanol, agar powder, cellulose acetate phthalate, carboxymethylcellulose, calcium carboxymethylcellulose, glucose, purified water, sodium caseinate, glycerin
  • water dilute hydrochloric acid, dilute sulfuric acid, sodium citrate, monostearate sucrose, polyoxyethylene sorbitol fatty acid esters (twin esters), polyoxyethylene monoalkyl ethers, lanolin ethers, lanolin esters, acetic acid, hydrochloric acid, ammonia water, ammonium carbonate, potassium hydroxide, sodium hydroxide, prolamine, polyvinylpyrrolidone, ethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, etc.
  • water dilute hydrochloric acid, dilute sulfuric acid, sodium citrate, monostearate sucrose, polyoxyethylene sorbitol fatty acid esters (twin esters), polyoxyethylene monoalkyl ethers, lanolin ethers, lanolin esters, acetic acid, hydrochloric acid, ammonia water, ammonium carbonate, potassium hydroxide, sodium hydroxide, prolamine, polyvinylpyrrolidone, ethylcellulose,
  • the syrup according to the present invention may include a solution of white sugar, other sugars, or sweeteners, and may also include a fragrance, a coloring agent, a preservative, a stabilizer, a suspending agent, an emulsifier, a viscosity modifier, and the like, as needed.
  • Purified water may be used in the emulsion according to the present invention, and emulsifiers, preservatives, stabilizers, fragrances, etc. may be used as needed.
  • the suspension according to the present invention may include suspending agents such as acacia, tragacanth, methylcellulose, carboxymethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, microcrystalline cellulose, sodium alginate, hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, and HPMC 2910, and surfactants, preservatives, stabilizers, colorants, and fragrances may be used as needed.
  • suspending agents such as acacia, tragacanth, methylcellulose, carboxymethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, microcrystalline cellulose, sodium alginate, hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, and HPMC 2910
  • surfactants preservatives, stabilizers, colorants, and fragrances may be used as needed.
  • the injection according to the present invention includes a solvent such as distilled water for injection, 0.9% sodium chloride injection, Ringer's injection, dextrose injection, dextrose + sodium chloride injection, PEG, lactated Ringer's injection, ethanol, propylene glycol, non-volatile oils - sesame oil, cottonseed oil, peanut oil, soybean oil, corn oil, ethyl oleate, isopropyl myristate, and benzene benzoate; a solubilizing agent such as sodium benzoate, sodium salicylate, sodium acetate, urea, urethane, monoethylacetamide, butazolidine, propylene glycol, tween, nitrile acid amide, hexamine, and dimethylacetamide; a buffer such as weak acids and their salts (acetic acid and sodium acetate), weak bases and their salts (ammonia and ammonium acetate), organic compounds, proteins, albumin, peptone, and
  • the suppository according to the present invention comprises cocoa butter, lanolin, withepsol, polyethylene glycol, glycerogelatin, methylcellulose, carboxymethylcellulose, a mixture of stearic acid and oleic acid, Subanal, cottonseed oil, peanut oil, palm oil, cocoa butter + cholesterol, lecithin, ranet wax, glycerol monostearate, Tween or Span, Imhausen, monolene (propylene glycol monostearate), glycerin, Adeps solidus, Buytyrum Tego-G, Cebes Pharma 16, hexalide base 95, Cotomar, Hydroxocote SP, S-70-XXA, S-70-XX75 (S-70-XX95), Mechanisms such as Hydrokote 25, Hydrokote 711, Idropostal, Massa estrarium (A, AS, B, C, D, E, I, T), Massa-MF, Masupol, Masupol-15, Neos
  • Solid dosage forms for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid dosage forms are prepared by mixing the extract with at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, etc.
  • excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, etc.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, and syrups.
  • simple diluents such as water and liquid paraffin, they may contain various excipients such as wetting agents, sweeteners, flavoring agents, and preservatives.
  • Preparations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspensions can include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents. It can be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, or in single or multiple doses. Taking all of the above factors into account, it is important to administer an amount that achieves maximum efficacy with minimal side effects. This amount can be readily determined by those skilled in the art to which the present invention pertains.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a subject via various routes. All modes of administration are conceivable, including oral ingestion, subcutaneous injection, intraperitoneal administration, intravenous injection, intramuscular injection, intrathecal injection, sublingual administration, buccal mucosal administration, rectal insertion, vaginal insertion, ocular administration, otic administration, nasal administration, inhalation, oral or nasal spraying, dermal administration, and transdermal administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is determined according to the type of drug as an active ingredient, along with various related factors such as the disease to be treated, the route of administration, the patient's age, sex, weight, and the severity of the disease.
  • the effective dose of the composition according to the present invention may vary depending on the patient's age, sex, and weight, and is generally 0.001 to 500 mg per 1 kg of body weight, preferably 0.01 to 100 mg, administered daily or every other day, or divided into 1 to 3 times a day.
  • the dosage may increase or decrease depending on the route of administration, the severity of the disease, sex, weight, age, etc., the above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the “food composition” can be used in various foods, such as beverages, gum, tea, vitamin complexes, health supplements, etc., and can be used in the form of pills, powders, granules, infusions, tablets, capsules, or beverages.
  • the food composition includes a health functional food composition.
  • the amount of the cells in the food or beverage can generally be added in an amount of 0.01 to 30 wt% of the total food weight in the case of the food composition of the present invention, and in an amount of 0.02 to 10 g, preferably 0.3 to 1 g, based on 100 mL in the case of a health beverage composition.
  • the food composition of the present invention has no particular limitation on the components added in addition to the cells as essential components, and may include conventional food additives used in the art, such as natural carbohydrates, flavoring agents, coloring agents, fillers, stabilizers, various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), etc.
  • natural carbohydrates include conventional sugars such as monosaccharides, such as glucose, fructose, etc.; disaccharides, such as maltose, sucrose, etc.; polysaccharides, such as dextrin, cyclodextrin; and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • the flavoring agent examples include natural flavoring agents (thaumatin, stevia extracts (e.g., rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.)) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.).
  • examples of the flavoring agent include honey, D-mannitol, maltitol solution, krill concentrate, etc.
  • the composition may contain pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonating agents used in carbonated beverages, etc. These ingredients may be used independently or in combination.
  • the proportion of these additives is not particularly critical, but is typically selected within the range of 0 to about 20 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • the cells of the present invention When the cells of the present invention are used as food additives, the cells can be added as is or used together with other foods or food ingredients, and can be used appropriately according to conventional methods.
  • the amount of the active ingredient mixed can be appropriately determined depending on the purpose of use (prevention, health, or therapeutic treatment). Generally, when manufacturing food or beverages, the compound of the present invention can be added in an amount of 15% by weight or less, or 10% by weight or less, based on the raw material. However, in the case of long-term intake for the purpose of health and hygiene or health control, the amount can be below the above range, and since there is no problem in terms of safety, the active ingredient can also be used in an amount exceeding the above range.
  • foods to which the above substances can be added include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, alcoholic beverages, and vitamin complexes, and all health functional foods in the conventional sense are included.
  • the health beverage composition according to the present invention may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients, like conventional beverages.
  • the natural carbohydrates mentioned above are monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • a sweetener natural sweeteners such as thaumatin and stevia extract, or synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame can be used.
  • the proportion of the natural carbohydrate is generally about 0.01-0.20 g, or about 0.04-0.10 g, per 100 mL of the composition of the present invention.
  • the food composition of the present invention may contain various nutrients, vitamins, electrolytes, flavoring agents, coloring agents, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonating agents used in carbonated beverages, etc.
  • the composition of the present invention may contain fruit pulp for the production of natural fruit juice, fruit juice drinks, and vegetable drinks. These ingredients may be used independently or in combination. The proportion of these additives is not particularly critical, but is generally selected in the range of 0.01-0.20 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • the food composition of the present invention includes a health functional food composition.
  • health functional food is the same term as food for special health use (FoSHU), and means a food with high medical or therapeutic effects that is processed to efficiently exhibit a bioregulatory function in addition to providing nutrition.
  • the food can be manufactured in various forms such as tablets, capsules, powders, granules, liquids, and pills to obtain a useful effect in preventing or improving diseases.
  • the health functional food of the present invention can be manufactured using methods commonly used in the art, and can be manufactured by adding raw materials and ingredients commonly used in the art. Furthermore, unlike conventional drugs, it has the advantage of being food-based, eliminating the side effects that can occur with long-term use of drugs, and can be highly portable.
  • the "cosmetic composition” contains the cells in an amount of 0.0005 to 50 wt% based on the total weight of the composition.
  • the composition of the present invention may contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar function as the cells.
  • Cosmetics manufactured using the cosmetic composition of the present invention may be manufactured in the form of a general emulsified formulation or a solubilized formulation.
  • Products to which the cosmetic composition of the present invention can be added include, for example, cosmetics such as astringent toner, emollient toner, nourishing toner, various creams, essences, packs, foundations, etc., and cleansing, facial cleansers, soaps, treatments, beauty solutions, etc.
  • specific formulations of the cosmetic composition of the present invention include, for example, skin lotions, skin softeners, skin toners, astringents, lotions, milk lotions, moisture lotions, nourishing lotions, massage creams, nourishing creams, moisture creams, hand creams, essences, nourishing essences, packs, soaps, shampoos, cleansing foams, cleansing lotions, cleansing creams, body lotions, body cleansers, milky lotions, pressed powders, loose powders, eye shadows, hair tonics, hair conditioners, hair essences, hair lotions, hair nourishing lotions, hair shampoos, hair rinses, hair treatments, hair creams, hair nourishing creams, hair moisture creams, It includes formulations
  • Suitable cosmetic formulations may be, for example, solutions, gels, solid or paste anhydrous products, emulsions obtained by dispersing an oil phase in an aqueous phase, suspensions, microemulsions, microcapsules, microgranules or ionic (liposomes) or non-ionic vesicular dispersions, creams, toners, lotions, powders, ointments, sprays, microneedles or concealer sticks. They may also be prepared in the form of foams or aerosol compositions further containing compressed propellants.
  • the cosmetic composition of the present invention may further contain adjuvants commonly used in the field of cosmetology or dermatology, such as fatty substances, organic solvents, solubilizers, thickeners, gelling agents, emollients, antioxidants, suspending agents, stabilizers, foaming agents, fragrances, surfactants, water, ionic or nonionic emulsifiers, fillers, metal ion sequestering agents, chelating agents, preservatives, vitamins, blocking agents, humectants, essential oils, dyes, pigments, hydrophilic or lipophilic active agents, lipid vesicles or any other ingredients commonly used in cosmetics.
  • the above ingredients are introduced in amounts commonly used in the field of dermatology.
  • the cosmetic composition of the present invention may further comprise a composition selected from the group consisting of water-soluble vitamins, oil-soluble vitamins, polymeric peptides, polymeric polysaccharides, and sphingolipids.
  • any water-soluble vitamin that can be mixed into cosmetics may be used, but examples thereof include vitamin B1, vitamin B2, vitamin B6, pyridoxine, pyridoxine hydrochloride, vitamin B12, pantothenic acid, nicotinic acid, nicotinamide, folic acid, vitamin C, vitamin H, etc.
  • Their salts thiamine hydrochloride, sodium ascorbate, etc.
  • derivatives sodium ascorbate-2-phosphate, magnesium ascorbate-2-phosphate, etc.
  • Water-soluble vitamins can be obtained by conventional methods such as microbial transformation, purification from microbial culture, enzymatic method, or chemical synthesis method.
  • any useful vitamin that can be mixed into cosmetics may be used, but examples thereof include vitamin A, carotene, vitamin D2, vitamin D3, vitamin E (d1-alpha tocopherol, d-alpha tocopherol, d-alpha tocopherol), and their derivatives (ascorbic acid palmitate, ascorbic acid stearate, ascorbic acid dipalmitate, dl-alpha tocopherol acetate, dl-alpha tocopherol nicotinate, vitamin E, DL-pantothenyl alcohol, D-pantothenyl alcohol, pantothenyl ethyl ether, etc.) are also included in the useful vitamins used in the present invention.
  • the useful vitamins can be obtained by conventional methods such as microbial transformation, purification from a microbial culture, enzymatic or chemical synthesis, etc.
  • polymer peptide that can be incorporated into cosmetics may be used, but examples include collagen, hydrolyzed collagen, gelatin, elastin, hydrolyzed elastin, and keratin.
  • Polymer peptides can be purified and obtained by conventional methods such as purification from microbial cultures, enzymatic methods, or chemical synthesis methods, or can be purified and used from natural products such as the dermis of pigs or cows, or silkworm fibers.
  • Any polymeric polysaccharide that can be incorporated into cosmetics may be used, but examples include hydroxyethyl cellulose, xanthan gum, sodium hyaluronate, chondroitin sulfate, or its salts (sodium salt, etc.).
  • chondroitin sulfate or its salts can usually be purified from mammals or fish and used.
  • sphingolipid that can be incorporated into cosmetics may be used, but examples include ceramide, phytosphingosine, and sphingoglycolipids. Sphingolipids can be purified by conventional methods from mammals, fish, shellfish, yeast, or plants, or obtained by chemical synthesis.
  • the cosmetic composition of the present invention may contain other ingredients commonly incorporated into cosmetics as needed.
  • compounding ingredients that may be added include oil components, moisturizers, emollients, surfactants, organic and inorganic pigments, organic powders, ultraviolet absorbers, preservatives, bactericides, antioxidants, plant extracts, pH adjusters, alcohol, pigments, fragrances, blood circulation promoters, cooling agents, antiperspirants, purified water, etc.
  • maintenance ingredients include ester-based oils, hydrocarbon-based oils, silicone-based oils, fluorine-based oils, animal oils, and plant oils.
  • hydrocarbon-based fats examples include squalene, liquid paraffin, alpha-olefin oligomer, isoparaffin, ceresin, paraffin, liquid isoparaffin, polybutene, microcrystalline wax, and vaseline.
  • silicone-based oils include polymethylsilicone, methylphenylsilicone, methylcyclopolysiloxane, octamethylpolysiloxane, decamethylpolysiloxane, dodecamethylcyclosiloxane, dimethylsiloxane/methylcetyloxysiloxane copolymer, dimethylsiloxane/methyl stearoxysiloxane copolymer, alkyl-modified silicone oil, and amino-modified silicone oil.
  • fluorine-based oils examples include perfluoropolyether.
  • animal or plant fats include avocado oil, almond oil, olive oil, sesame oil, rice bran oil, sunflower oil, soybean oil, corn oil, rapeseed oil, almond oil, palm kernel oil, palm oil, castor oil, sunflower oil, grape seed oil, cottonseed oil, coconut oil, kukui nut oil, wheat germ oil, rice germ oil, shea butter, colostrum oil, marc deimia nut oil, meadowsweet oil, egg yolk oil, beef tallow, horse oil, mink oil, orange rapeseed oil, jojoba oil, candelilla wax, carnauba wax, liquid lanolin, and hydrogenated castor oil.
  • moisturizers include water-soluble low-molecular-weight moisturizers, fat-soluble molecular-weight moisturizers, water-soluble polymers, and fat-soluble polymers.
  • fat-soluble low-molecular-weight moisturizers examples include cholesterol and cholesterol esters.
  • cell therapy refers to a general term for a pharmaceutical product (as defined by the US FDA) used for the purposes of treatment, diagnosis, and prevention, which is a cell or tissue isolated, cultured, and manufactured through special manipulation. Preferably, it refers to a pharmaceutical product used for the purposes of treatment, diagnosis, and prevention through a series of actions such as proliferating and selecting homologous or heterologous cells in vitro to restore the function of cells or tissues, or changing the biological characteristics of cells through other methods.
  • Cell therapy products are broadly classified into somatic cell therapy products and stem cell therapy products depending on the degree of cell differentiation, and preferably refer to a stem cell therapy product or a therapy product comprising cells differentiated from the stem cells of the present invention.
  • the cell therapy product of the present invention may additionally contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar function.
  • the cell therapy of the present invention may vary depending on various factors including the activity of the cell therapy used, age, body weight, general health, sex, dosage, administration time, administration route, excretion rate, drug combination, and the severity of the specific disease to be prevented or treated, and may be appropriately selected by a person skilled in the art.
  • it may be administered at a dose of 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 10 cells/kg, preferably 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 9 cells/kg.
  • the administration may be administered once a day or divided into several times.
  • when formulated as a liquid unit preparation such as a solution, suspension, or emulsion, it may also be administered to a patient at the above cell concentration.
  • GS glutathione synthetase
  • DNA sequence of SEQ ID NO: 1, amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 was inserted into pCMV6-AC Mammalian Expression Vector (OriGene Technologies, Inc.) to produce a GS expression vector (CMV-GS plasmid, SEQ ID NO: 3).
  • GS expression vector effectively exhibits an antioxidant effect in cells
  • human embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cells hES-MSC, SETMCELL Technologies TM
  • hES-MSC human embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cells
  • SETMCELL Technologies TM human embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cells
  • Example 2 Confirmation of therapeutic effect in an animal model induced with sarcopenia
  • the weight of all obtained gastrocnemius muscles was measured. Then, the obtained gastrocnemius tissues were prepared into several paraffin tissue slides and the following experiments were performed.
  • Example 3 Confirmation of therapeutic effect in an aging animal model
  • mice were treated with stem cells transformed with a mock plasmid in which the GS gene was not inserted.
  • the normal mouse experimental group was 5 mice
  • the IM mouse experimental group was 8 mice
  • the IM+RM mouse experimental group was 7 mice
  • the mouse experimental group injected with stem cells transformed with a mock plasmid was 5 mice
  • the mouse experimental group injected with stem cells transformed with CMV-GS plasmid was 9 mice.
  • the experimental group injected with stem cells transformed with CMV-GS plasmid showed muscle weights almost identical to those of the normal aged mouse group or the contralateral limb in which sarcopenia was not induced. Furthermore, it was confirmed that muscle production was promoted compared to the experimental group injected with stem cells transformed with mock plasmid.
  • the experimental group injected with stem cells transformed with CMV-GS plasmid showed almost the same cross-sectional area distribution as the normal aging mouse experimental group. It is generally known that when aging occurs, the cross-sectional area of the muscle decreases, and along with this, muscle loss accompanied by inflammatory response and fibrosis induction and muscle cell death occurs, and muscle strength also decreases. Therefore, it was confirmed that the stem cells transformed with the CMV-GS plasmid of the present invention can prevent or treat aging, thereby preventing muscle loss and improving muscle strength.
  • the cell into which the polynucleotide encoding the expressible glutathione synthetase of the present invention acts as an effective antioxidant by expressing glutathione synthetase in the body, thereby reducing oxidative stress, thereby suppressing inflammation and cell death, and ultimately promoting cell generation and recovery, thereby effectively preventing or treating symptoms of oxidative stress-related diseases including aging, such as cell damage, sarcopenia, and muscle loss.
  • the cell into which the polynucleotide encoding the expressible glutathione synthetase of the present invention was introduced can be widely used for the prevention or treatment of various oxidative stress-related disease symptoms, including aging increased by oxidative stress.
  • the cell into which the polynucleotide encoding the expressible glutathione synthetase of the present invention is introduced acts as an effective antioxidant in the body, thereby reducing oxidative stress and suppressing inflammation and cell death through a mechanism, and can be widely used for the prevention or treatment of various diseases or symptoms caused by oxidative stress, such as dementia, osteopenia, amyotrophic lateral sclerosis, osteoporosis, osteoarthritis, obesity, Parkinson's disease, geriatric cardiovascular disease, geriatric pulmonary disease, geriatric ocular disease, lipid metabolic disease, arteriosclerosis, heart failure, hypertensive heart disease, arrhythmia, myocardial infarction, angina pectoris, cancer, inflammatory disease, skin aging, etc.
  • diseases or symptoms caused by oxidative stress such as dementia, osteopenia, amyotrophic lateral sclerosis, osteoporosis, osteoarthritis, obesity, Parkinson's disease, geriatric cardiovascular disease, g

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Abstract

본 발명은 항산화 효능이 증가된 중간엽줄기세포 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 자세하게는 글루타티온 합성효소가 과발현되는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 산화적 스트레스 관련 질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

항산화 효능이 증가된 세포 및 이의 용도
본 발명은 항산화 효능이 증가된 세포 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 글루타티온 합성효소가 과발현되는 세포 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 출원은 2024년 6월 12일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2024-0076224호에 기초한 우선권을 주장하며, 상기 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
활성산소종(reactive oxygen species; ROS)이란, 산소 원자를 포함하고 있는 화학적으로 반응성을 가지는 분자를 의미하며, 체내에서 산소가 4개의 전자를 받으면서 독성이 없는 H2O로 전환되는 도중에 자연적으로 생성되는 부산물로, H2O2, OH, superoxide 등이 있다. 일반적으로 활성산소종은 체내에서 생성되고 나면 제거 과정을 거치게 되어 일정 농도를 유지하고 있다. 그러나 체내의 활성산소종이 제대로 제거되지 않아 양이 증가하게 되면, 산화스트레스로 인하여, DNA를 산화시켜 DNA 부가물(DNA adduct)을 생성하거나, 지질을 산화시켜 lipid peroxidase 등을 생성함으로써 세포를 손상시키거나, 생체조직을 공격함으로써, 비가역적인 파괴작용이 유도되어, 치매, 주름, 기미, 골감소증, 근위축성 측삭경화증, 골다공증, 비만, 파킨슨씨 병 등의 노화 관련 질환, 암, 염증성 질환, 피부 손상, 심장질환 등 다양한 질병을 유발시키는 주요 원인으로 지목되고 있다.
따라서, 이러한 활성산소종을 제거함으로써 노화, 심장질환, 암 등 다양한 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 효과적인 항산화제를 개발하고자 하는 연구들이 활발히 진행되고 있다. 항산화제는 생체 내에서 활성산소종의 생성을 억제하거나, 제거함으로써 세포에 회복불가능한 손상을 유도하는 산화스트레스를 방지하는 역할을 함으로써, 산화스트레스로 인해 유도되는 다양한 질환의 증상들을 예방, 개선, 또는 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있다(대한민국 등록특허 10-1661650). 그러나 지금까지 개발된 항산화제들은 모두 인체의 부작용, 고가의 제품, 또는 낮은 항산화 효과 등의 단점을 가지고 있기 때문에, 보다 안전하고, 항산화 효능이 탁월하면서도 경제성이 있는 새로운 항산화제 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 발현가능한 글루타티온 합성효소(glutathione synthetase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포를 유효성분으로 포함하는, 항산화 조성물, 산화적 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 산화적 스트레스 관련 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물, 산화적 스트레스에 의한 피부 질환의 개선 또는 예방용 화장료 조성물 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 발현가능한 글루타티온 합성효소(glutathione synthetase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포를 유효성분으로 포함하는 산화적 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 발현가능한 글루타티온 합성효소(glutathione synthetase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포를 유효성분으로 포함하는 산화적 스트레스관련 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 발현가능한 글루타티온 합성효소(glutathione synthetase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포를 유효성분으로 포함하는 산화적 스트레스 관련 피부 질환의 개선 또는 예방용 화장료 조성물을 제공한다. 상기 피부 질환의 증상으로는 노화, 기미, 착색, 주름 등이 있으나, 산화스트레스에 의해 유도되는 증상이라면 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 발현가능한 글루타티온 합성효소(glutathione synthetase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포를 유효성분으로 포함하는 항산화 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 발현가능한 글루타티온 합성효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 세포 내에서 글루타티온 합성효소를 발현할 수 있는 형태라면, 세포 내에서 글루타티온 합성효소가 작동함으로써 동일한 효과를 나타낼 수 있기 때문에 그 종류에는 제한이 없으며, 바람직하게는 mRNA, self-amplifying RNA(saRNA), synthetic RNA, cDNA, linear DNA, minicircle DNA, DNA 등의 형태일 수 있으며, 세포에서 플라스미드, 바이러스 등을 통해 발현이 유도될 수도 있다. 또한, 상기 발현가능한 글루타티온 합성효소는 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 글루타티온 합성효소(glutathione synthetase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터의 형태로 제작될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 글루타티온 합성효소는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 서열번호 2의 변이체가 본 발명의 범위에 포함된다. 구체적으로, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. “서열 상동성의 %”는 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서 폴리뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열의 일부는 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다. 그러나 인간의 글루타티온 합성효소로 알려져 있는 종류라면 이에 제한되지 않는다. 서열 동일성의 퍼센트를 결정하려는 목적으로 행하는 정렬은, 당업계의 숙련자의 상식 내에 있는 다양한 방식으로, 예를 들어, 공공연하게 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 MEGALIGNTM (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 세포는 바람직하게는 체세포, 중간엽줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포, 배아줄기세포, 유도만능줄기세포 등 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 배아줄기세포 유래 중간엽줄기세포이나, 줄기세포 치료제로 사용되고 있는 줄기세포의 종류라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 인간의 체내에서 발현가능한 형태로 제조되어야 하며, 바람직하게는 프로모터, 인헨서, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 등이 포함될 수 있으나, 체내에서 발현될 수 있도록 알려져 있는 형태라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 산화적 스트레스 관련 질환은 활성 산소종에 의하여 발생되는 모든 질환을 총칭하며, 바람직하게는, 노화, 지질대사질환, 동맥경화증, 심부전증, 고혈압성 심장질환, 부정맥, 심근경색증, 협심증, 암, 염증성 질환 등일 수 있으나, 항산화 효과에 의하여 증상이 예방, 완화, 개선 또는 치료될 수 있는 질환이라면 이에 제한되지 않는다. 그리고 상기 노화는 노화 관련 질환, 즉, 시간경과에 따른 자연적 현상으로 태어나서 성장하고 늙어 가는 과정에서 발생하는 질환을 총칭하며, 바람직하게는 치매, 골감소증, 근위축성 측삭경화증, 골다공증, 골관절염, 비만, 파킨슨씨병, 노인성 심혈관 질환, 노인성 폐질환, 노인성 안구 질환, 피부 노화 등을 포함할 수 있으나, 산화적 스트레스에 의하여 발생되는, 또는 촉진되는 질환이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 조성물 또는 세포는 체내에 투여되었을 때 항산화제로 작용하여, 산화스트레스를 감소시키고, 이를 통하여 염증, 세포 사멸 등을 억제하고, 최종적으로 세포의 재생 및 성장을 촉진시켜, 활성산소종으로 인해 발생하는 증상들을 예방, 개선, 완화, 또는 치료할 수 있기 때문에, 산화적 스트레스 관련 질환의 종류에는 제한이 없다.
또한 본 발명은 발현가능한 글루타티온 합성효소(glutathione synthetase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포 치료제를 제공한다.
또한 본 발명은 발현가능한 글루타티온 합성효소(glutathione synthetase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 산화적 스트레스 관련 증상 또는 질환의 예방, 개선, 완화, 또는 치료 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 발현가능한 글루타티온 합성효소(glutathione synthetase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포를 유효성분으로 포함하는 조성물의 산화적 스트레스 관련 증상 또는 질환의 예방, 개선, 완화, 또는 치료 용도를 제공한다.
또한 본 발명은 발현가능한 글루타티온 합성효소(glutathione synthetase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포의 산화적 스트레스 관련 증상 또는 질환의 예방, 개선, 완화, 또는 치료에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 발현가능한 글루타티온 합성효소(glutathione synthetase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포는 체내에서 효과적인 항산화제로 작용함으로써, 산화스트레스를 감소시키고, 이를 통해 염증 및 세포 사멸을 억제하고, 최종적으로는 세포의 생성 및 회복을 촉진시킬 수 있다. 따라서, 산화스트레스로 인해 유도되는 다양한 질환, 예를 들어, 치매, 주름, 기미, 골감소증, 근위축성 측삭경화증, 골다공증, 비만, 파킨슨씨 병 등의 노화 질환, 암, 피부 손상, 심장질환 등에 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 CMV-GS plasmid가 세포 내에서 항산화 효과를 나타내는지 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 CMV-GS plasmid로 형질전환된 줄기세포가 근감소증이 유도된 마우스의 근육 내에서 항산화 효과를 나타내는지 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 CMV-GS plasmid로 형질전환된 줄기세포가 근감소증이 유도된 마우스의 근육 내에서 항염증 효과를 나타내는지 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 CMV-GS plasmid로 형질전환된 줄기세포가 근감소증이 유도된 마우스의 근육 내에서 세포 사멸 억제 효과를 나타내는지 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 CMV-GS plasmid로 형질전환된 줄기세포가 근감소증이 유도된 마우스의 근육 내에서 근육 생성을 촉진시키는 효과를 나타내는지 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 CMV-GS plasmid로 형질전환된 줄기세포가 근감소증이 유도된 노화 마우스의 근육 내에서 근육 생성을 촉진시키는 효과를 나타내는지 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 CMV-GS plasmid로 형질전환된 줄기세포가 근감소증이 유도된 노화 마우스의 근육 내에서 항염증 효과를 나타내는지 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 CMV-GS plasmid로 형질전환된 줄기세포가 근감소증이 유도된 노화 마우스의 혈청 내 염증성 싸이토카인의 분비를 감소시키는 효과를 나타내는지 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 CMV-GS plasmid로 형질전환된 줄기세포가 근감소증이 유도된 노화 마우스에서 근력을 증가시키는 효과를 나타내는지 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
본 명세서에 있어서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서에 있어서, 정도의 용어인 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에서 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로서 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 언급된 정확하거나 절대적인 수치에 대한 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
본 명세서에 있어서, "~하는 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본 명세서에 있어서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 “이들의 조합”이란 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본 명세서에 있어서, "A 및/또는 B"의 기재는, "A 또는 B, 또는 A 및 B"를 의미한다.
본 명세서에 있어서, "유효 성분(active ingredient)"이란 활성 약물, 활성 성분, 활성 제제, 약물 및 치료학적 제제와 상호교환 가능하게 사용되며, 목적 질환을 예방, 완화, 개선 또는 치료하는 데 사용되는 임의의 물질을 일컫는다.
본 명세서에 있어서, “글루타티온 합성효소(glutathione synthetase)”란 글루타티온, 즉, 글루탐산, 시스테인, 및 글리신으로 이루어지는 결정성 펩타이드를 생산하는 효소이다. 인간의 체내에 존재하는 것으로 알려져있는 글루타티온 합성효소라면 제한이 없지만, 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 서열번호 2의 변이체가 본 발명의 범위에 포함된다. 구체적으로, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 글루타티온 합성효소는 서열번호 1로 표시되는 염기서열 또는 이의 변이체로부터 인코딩될 수도 있다. 상기 변이체는 서열번호 1의 염기서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 변이체는 글루타티온 합성효소와 실질적 동일성을 가지고 있는 것을 의미한다. 본 명세서에 있어서, “실질적 동일성(substantial identity)”이란 BLASTN, BLASTP, 갭 BLAST 및 PSI-BLAST와 같은 상업적 컴퓨터 프로그램에서 임의의 다양한 알고리즘을 사용하여 아미노산 서열 또는 핵산 서열 간의 상동성을 비교하였을 때, 2개의 서열이 상응하는 위치에 동일한 잔기를 함유하는 경우, 바람직하게는 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 적어도 95% 이상, 적어도 96% 이상, 적어도 97% 이상, 적어도 98% 이상, 적어도 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 경우 이들은 "실질적으로 동일한" 것으로 일반적으로 간주된다. 또한, "유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)"으로 인하여, 뉴클레오티드 서열이 변경된 것을 포함한다. "유전자 코드의 축퇴성"이란, 하나의 아미노산을 코딩하는 여러개의 서로 다른 코돈이 존재하는 것을 의미한다. 예를 들어, 아미노산 류신의 경우 " "CUU", "CUC", "CUA", "CUG", "UUA" 등 다양한 코돈에 의하여 동일하게 인코딩되며, 이를 유전자 코드의 축퇴성이라 한다. 즉, 본 발명의 아미노산 서열을 인코딩하기 위한 핵산 서열은 본원 명세서에 개시된 서열 이외에 유전자 코드의 축퇴성으로 변경된 서열 또한 포함된다.
본 명세서에 있어서, “재조합 벡터(recombinant vector)”란 벡터 내에 삽입된 이종의 핵산에 의해 코딩되는 펩타이드 또는 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 총칭하는 것으로, 바람직하게는 인간의 글루타티온 합성효소를 인간의 체내에서 발현할 수 있는 발현 벡터의 형태를 가지는 것을 의미한다. 본 명세서에 있어서, “벡터(vector)”란 숙주 세포 내로 전달되는 DNA 단편, 핵산 분자 등을 의미하며, 상기 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재제조될 수 있으며, 용어 "전달체"와 호환하여 사용될 수도 있다. 그리고 "발현 벡터(expression vector)"란 벡터 중에서도 목적하는 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열들을 포함하는 재조합 DNA 분자를 총칭한다. 상기 “작동가능하게 연결된(operatively linked)”이란, 목적하는 코딩 서열이 발현가능한 형태로 적정 핵산 서열들과 순서대로 연결되어 있는 형태를 총칭하며, 그 순서 및 구조에는 제한이 없다. 상기 적정 핵산 서열에는 이에 제한되지는 않지만, 일례로 RNA 중합효소가 결합하는 전사 개시 인자인 프로모터(promoter) 서열(예를 들어, 진핵세포에서의 발현을 위한 CMV(cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터; 원핵세포에서의 발현을 위한 tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pL프로모터, pR프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터, T7 프로모터 등), 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터(operator) 서열, 발현량을 조절하는 인헨서(enhancer) 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 개시코돈 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 종결코돈 서열, 폴리아데닐화 시그널 서열(예를 들어, 소 성장 호르몬 터미네이터, SV40 유래 폴리 아데닐화 서열 등), 선별을 위한 선택성 마커 서열(예를 들어, 항생제 내성 유전자, 약물 내성 유전자, 영양요구성 유전자 등) 발현된 재조합 단백질을 용이하게 분리할 수 있는 태깅 서열 등을 포함할 수 있다. 벡터로는 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스 등 일반적으로 사용되고 있는 모든 전달체를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 인간의 체내에서 목적하는 코딩 서열을 발현할 수 있는 발현 벡터이다. 더욱 바람직하게는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 서열번호 3의 변이체가 본 발명의 범위에 포함된다. 구체적으로, 상기 서열번호 3의 염기서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 그러나 인간의 체내에서 글루타티온 합성효소를 발현할 수 있는 형태라면 이에 제한되지 않는다. 그리고 이러한 재조합 벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 숙주 세포에 도입하여 숙주세포를 형질전환시킬 수 있다. 숙주 세포로의 도입 방법의 예로는 염화칼슘법, 미세사출법(microprojectile bombardment), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method) 등이 알려져 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서에 있어서, “세포(cell)”란 인간 또는 비-인간을 포함하는 진핵세포와 원핵세포를 모두 포함하는 의미이며, 체세포와 줄기세포를 모두 포함할 수 있다. 상기 "줄기세포(stem cell)"란 여러 종류의 신체 조직 세포로 분화할 수 있는 능력, 즉, 줄기세포성(stemness)을 가진 미분화 세포를 총칭하는 광의의 개념을 말한다. 이러한 줄기세포는 크게 배아를 이용하여 제조할 수 있는 배아줄기세포(embryonic stem cell), 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell), 성체줄기세포(adult stem cell), 역분화줄기세포(induced pluripotent stem cell), 생식세포(gamete), 암줄기세포(cancer stem cell) 등으로 나눌 수 있다.
본 명세서에 있어서, “도입(introduction)”이란 형질전환, 및 특히 임의의 형태의 전기천공, 접합, 감염, 형질도입, 형질주입 등 특정 유전자를 세포, 조직, 또는 동물에 주입하는 것을 모두 총칭한다.
본 발명에서 "투여(administration)"란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 형질전환된 줄기세포 또는 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 "예방(prevention)"이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하며, 바람직하게는 발병 이전에 미리 방지하는 1차 예방과, 발병을 조기에 발견하고 적시에 치료하는 2차 예방을 모두 포함한다. 그리고 본 발명에서 "치료(treatment)"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, "개선(improvement)"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에 있어서, “개체(subject)”란 본 발명의 조성물이 투여될 수 있는 대상을 말하며, 바람직하게는 인간을 포함하는 포유동물이며, 일례로 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 소, 돼지 등의 포유류를 의미할 수 있으나, 그 대상에는 제한이 없다. 그리고 “이를 필요로 하는 개체(subject in need thereof)”란, 바람직하게는 산화적 스트레스 관련 증상 또는 질환을 가지고 있는, 또는 산화적 스트레스 관련 증상 또는 질환의 위험성을 가지고 있는 개체로 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체를 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물 내의 상기 재조합 벡터로 형질전환된 줄기세포의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물(pharmaceutical composition)은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜(PEG) 4000, PEG 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9% 염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO3) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na2S2O5), 아황산나트륨(Na2SO3), 질소가스(N2), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈(Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입(AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈(N, Es), 웨코비(W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제(TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다. 구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.001 내지 500 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 명세서에 있어서, “식품 조성물(food composition)”은 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등에 사용할 수 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태로 사용할 수 있다. 상기 식품 조성물은 건강기능식품 조성물을 포함한다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 세포의 양은, 일반적으로 본 발명의 식품 조성물의 경우 전체 식품 중량의 0.01 내지 30 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물의 경우 100mL를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 필수 성분으로서 상기 세포 외에 첨가되는 성분에는 특별한 제한은 없으며, 당업계에서 사용되는 통상적인 식품첨가제, 예를 들어 천연 탄수화물, 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제, 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질) 등을 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린; 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜을 사용할 수 있다. 상기 향미제의 예로는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 풍미제의 예로는 꿀, D-만니톨, 말티톨액, 크릴 농축액 등을 사용할 수 있다. 이외에도 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 세포를 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 세포를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 화합물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 또는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 0.01-0.20g, 또는 약 0.04-0.10g 이다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품 조성물(health functional food composition)을 포함한다.
본 명세서에 있어서, "건강기능식품"이란 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하는데, 상기 식품은 질병의 예방 또는 개선에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.
본 명세서에 있어서, "화장료 조성물(cosmetic composition)"은 상기 세포를 조성물 총 중량에 대하여 0.0005 내지 50 중량%으로 함유된다. 또한, 본 발명의 조성물은 상기 세포에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물로 제조되는 화장품은 일반적인 유화 제형 또는 가용화 제형의 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종 크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있고, 본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로는 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도, 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션,헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어마사지크림, 헤어왁스, 헤어에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어무스, 헤어파우더, 헤어스프레이 등의 제형을 포함한다. 또한, 피부 과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소 또는 전신 적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수도 있다.
적합한 화장품의 제형으로는 예를 들면, 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이, 마이크로 니들 또는 콘실 스틱(conceal stick)의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 폼(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 추가로 함유할 수 있다. 그리고, 상기 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.
제한없는 예로서, 본 발명의 화장료 조성물은 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 및 스핑고 지질로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 더 포함할 수 있다.
수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 예를 들어 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염(티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체(아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.
유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 예를 들어 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E(d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체(팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산dl-알파 토코페롤, 니코틴산dl-알파 토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.
고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 예를 들어 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.
고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 예를 들어 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 (나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유 동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.
스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 예를 들어 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장품에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.
이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.
유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.
에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.
탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.
실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.
불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.
동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.
보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.
수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.
지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, “세포 치료제(cell therapy)”란 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로서, 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA 규정)을 총칭한다. 바람직하게는, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 동종 또는 이종세포를 체외에서 증식 및 선별하거나, 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포 치료제는 세포의 분화(differentiation) 정도에 따라 크게 체세포 치료제와 줄기세포 치료제로 분류되며, 바람직하게는 줄기세포 치료제, 또는 본 발명의 줄기세포로부터 분화된 세포를 포함하는 치료제를 의미한다. 본 발명의 세포 치료제에는 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1 종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 세포 치료제는 사용된 세포 치료제의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여 시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 1×106 내지 1×1010 cells/kg의 용량, 바람직하게는 1×107 내지 1×109 cells/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여될 수도 있다. 또한, 액제, 현탁액, 에멀젼 등의 액상 단위 제제로 제제화될 경우, 역시 상기 세포 농도로 환자에게 투여될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 글루타티온 합성효소 발현 벡터의 제조
글루타티온 합성효소(glutathione synthetase; GS) 발현 벡터를 제조하기 위하여, pCMV6-AC Mammalian Expression Vector(OriGene Technologies, Inc.)에 GS 유전자(서열번호 1의 DNA 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열)를 삽입하여, GS 발현 벡터(CMV-GS plasmid, 서열번호 3)를 제조하였다.
그리고 제조된 GS 발현 벡터가 세포 내에서 항산화 효과를 효과적으로 나타내는지 확인하기 위하여, 인간 배아줄기세포 유래 중간엽줄기세포(human embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cell; hES-MSC, SETMCELL TechnologiesTM)를 24시간 동안 배양한 후에, Lipofectamine™ Stem Transfection Reagent(ThermoFisher Scientific)을 이용하여 CMV-GS plasmid 또는 GS 유전자가 삽입되지 않은 Mock plasmid를 형질주입시켰다. 그리고 24시간 동안 다시 배양한 후에, 100 μM의 H2O2를 처리하고 산화스트레스(oxidative stress)를 유도하였다. 12시간 동안 산화스트레스를 유도한 후에, 2'7'-Dichlorofluorescin Diacetate(DCFDA, Sigma-Aldrich®)를 이용하여 세포를 염색한 후에 형광현미경으로 ROS의 이미지를 획득하고, Image J를 이용하여 형광값을 정량하였다. 이후 모든 실험은 최소 세 번 이상 반복하였으며, 결과는 평균값 ± 표준편차로 나타내었다. 통계적 유의성은 Student's t-test로 확인하였고, P < 0.05이면, 통계적으로 유의성이 있다고 판단하였다. 이하, *는 P < 0.05, **는 P < 0.01, ***는 P < 0.001, ****는 P < 0.0001을 나타낸다. 그 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, CMV-GS plasmid로 형질전환된 세포에서는 산화스트레스를 유도하지 않은 세포와 거의 동일한 형광값을 나타내는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, CMV-GS plasmid가 세포 내에서 항산화 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 근감소증이 유도된 동물모델에서의 치료 효과의 확인
CMV-GS plasmid로 형질전환된 줄기세포가 노화 치료에 효과를 가지는지 확인하기 위하여, 일차적으로 hES-MSC를 24시간 동안 배양한 후에, Lipofectamine™ Stem Transfection Reagent를 이용하여 CMV-GS plasmid를 형질주입시키고, 24시간 동안 배양한 후에, 세포를 수거하고 세포수를 계수하여 CMV-GS plasmid로 형질전환된 줄기세포를 준비하였다. 그리고 24주령의 BALB/c 수컷 마우스(㈜코아텍)의 뒤쪽 다리 중 하나를 e-tube에 끼우고 고정시켜 2주 동안 다리를 사용하지 못하도록 함으로써 노화 증상 중의 한 종류인 근감소증(sarcopenia) 동물모델을 제작하였다(n=4). 2주 후에는 고정시켜두었던 e-tube를 제거하고, 24시간 후에 이두박근(biceps) 한 곳에, 그리고 비복근(gastrocnemius) 두 곳에 형질전환된 hES-MSC를 5X105 cells를 주사하였다. 그리고 2주 후에 마우스를 안락사시킨 후에 마우스의 양쪽 뒷다리 비복근을 획득하였다. 대조군으로는 근감소증을 유도하지 않은 정상 마우스 실험군(n=2)과 14일 동안 다리를 고정하는 과정을 거친 후에 24시간 동안 고정을 풀어주고 안락사시킨 마우스 실험군(immobilization; IM, n=3), 14일 동안 다리를 고정한 후에 고정을 풀어주고 동일하게 실험이 종료되는 시점에 안락사시킨 마우스 실험군(immobilization/remobilization; remobilization; IM+RM, n=4)을 사용하였다. 그리고 우선 획득된 비복근의 무게를 모두 측정하였다. 그리고 획득된 비복근 조직을 여러 개의 파라핀 조직 슬라이드로 준비한 후에 다음 실험들을 진행하였다. 준비된 파라핀 조직 슬라이드를 4-Hydroxynonenal(4-HNE, MedChemExpress)로 염색한 후, 형광현미경으로 ROS의 이미지를 획득하고, Image J를 이용하여 동일한 범위 내에서 ROS의 형광이 차지하는 면적을 백분율(%)로 정량하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다. 또한, 다른 파라핀 조직 슬라이드를 H&E Staining Kit(Abcam Limited)를 이용하여 염색한 후, 현미경으로 이미지를 획득하고, Image J를 이용하여 세포충실도(cellularity)를 정량화함으로써 염증(inflammation) 정도를 확인하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다. 또한, 다른 파라핀 조직 슬라이드는 Anti-gamma H2A.X antibody(Anti-γ, Abcam Limited)와 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI, Sigma-Aldrich®)를 이용하여 염색한 후, 형광현미경으로 이미지를 획득하고, Image J를 이용하여 DAPI로 염색된 전체 세포수와 Anti-γH2A.X로 염색된 세포수를 계수하여 세포사멸(apoptosis)이 유도된 세포의 수를 백분율(%)로 나타내었다. 그 결과는 도 4에 나타내었다. 그리고 마지막으로 근감소증이 유도된 다리의 비복근 무게를 근감소증이 유도되지 않은 반대편 다리의 비복근 무게로 나누어 증가 또는 감소된 근육의 무게를 백분율(%)로 나타내었다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, CMV-GS plasmid로 형질전환된 줄기세포를 투여한 근감소증 동물모델에서는 근감소증이 유도되지 않은 정상 동물모델과 거의 동일한 형광값을 나타내는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, CMV-GS plasmid로 형질전환된 세포가 체내에서 항산화 효과를 나타내어, 산화스트레스가 감소된 것을 확인할 수 있었다.
또한 도 3에 나타난 바와 같이, CMV-GS plasmid로 형질전환된 줄기세포를 투여한 근감소증 동물모델에서는 근감소증이 유도되지 않은 정상 동물모델과 거의 동일한 세포충실도를 나타내는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, CMV-GS plasmid로 형질전환된 세포가 체내에서 항산화 효과를 나타냄으로써 염증을 억제하였다는 것을 확인할 수 있었다.
또한 도 4에 나타난 바와 같이, CMV-GS plasmid로 형질전환된 줄기세포를 투여한 근감소증 동물모델에서는 근감소증이 유도되지 않은 정상 동물모델과 거의 동일한 세포 사멸 정도를 나타내는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, CMV-GS plasmid로 형질전환된 세포가 체내에서 항산화 및 항염증 효과를 나타냄으로써 세포 사멸을 억제하였다는 것을 확인할 수 있었다.
또한 도 5에 나타난 바와 같이, CMV-GS plasmid로 형질전환된 줄기세포를 투여한 경우에는 근감소증이 유도되지 않은 정상 동물모델, 또는 근감소증이 유도되지 않은 반대쪽 다리와 거의 동일한 근육 무게를 나타내는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, CMV-GS plasmid로 형질전환된 줄기세포가 체내에서 근육 생성을 촉진시키는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 노화 동물모델에서의 치료 효과의 확인
노화된 마우스에서도 동일한 치료 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, 노화된 37주령의 BALB/c 수컷 마우스를 이용하여 실시예 2와 동일한 방법으로 실험을 진행하였다. 그리고 대조군으로는 GS 유전자가 삽입되지 않은 Mock plasmid로 형질전환된 줄기세포를 사용하였다. 정상 마우스 실험군은 5마리, IM 마우스 실험군은 8마리, IM+RM 마우스 실험군은 7마리, Mock plasmid로 형질전환된 줄기세포를 주사한 마우스 실험군은 5마리, CMV-GS plasmid로 형질전환된 줄기세포를 주사한 마우스 실험군은 9마리를 이용하였다. CMV-GS plasmid로 형질전환된 줄기세포가 근감소증이 유도된 노화 마우스의 근육 내에서 근육 생성을 촉진시키는지를 확인한 결과는 도 6에 나타내었고, 항염증 효과를 나타내는지 확인한 결과는 도 7에 나타내었다. 또한 추가적으로 염증성 싸이토카인의 분비가 감소되었는지 확인하기 위하여, 마우스를 안락사시킨 후에 혈청을 획득하고, IL-6 ELISA Kit(Thermo Fisher Scientific Inc.)를 이용하여 혈청 내의 IL-6의 양을 확인하였다. 그 결과는 도 8에 나타내었다. 또한, 근섬유에 수직인 근육의 단면적(cross-sectional area; CSA)을 현미경으로 관찰한 결과는 도 9에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, CMV-GS plasmid로 형질전환된 줄기세포를 주사한 실험군 경우에는 정상 노화 마우스 실험군, 또는 근감소증이 유도되지 않은 반대쪽 다리와 거의 동일한 근육 무게를 나타내는 것을 확인하였다. 또한, Mock plasmid로 형질전환된 줄기세포를 주사한 실험군과 비교해서도 근육의 생성을 촉진시키는 것을 확인하였다.
또한 도 7에 나타난 바와 같이, CMV-GS plasmid로 형질전환된 줄기세포를 주사한 실험군의 경우에는 정상 노화 마우스 실험군과 거의 동일한 세포충실도를 나타내며, 이를 통하여 다른 실험군들과 비교하여 염증이 효과적으로 억제되어 있는 것을 확인하였다.
또한 도 8에 나타난 바와 같이, CMV-GS plasmid로 형질전환된 줄기세포를 주사한 실험군의 경우에는 혈청 내 염증성 싸이토카인이 낮은 농도로 존재하는 것을 확인하였으며, 이를 통하여 다른 실험군들과 비교하여 CMV-GS plasmid로 형질전환된 줄기세포가 체내에서 염증을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.
또한 도 9에 나타난 바와 같이, CMV-GS plasmid로 형질전환된 줄기세포를 주사한 실험군의 경우에는 정상 노화 마우스 실험군과 거의 동일한 단면적 분포를 나타내는 것을 확인하였다. 일반적으로 노화가 일어나면, 근육의 단면적이 감소되며 이와 함께염증 반응과 섬유화의 유도 및 근세포의 사멸과 동반된 근육의 감소가 일어나고 근력도 감소되는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명의 CMV-GS plasmid로 형질전환된 줄기세포는 노화를 예방 또는 치료하여 근 감소의 예방 및 근력을 향상시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통하여, 본 발명의 발현가능한 글루타티온 합성효소(glutathione synthetase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포는 체내에서 글루타티온 합성효소를 발현함으로써 효과적인 항산화제로 작용하여, 산화스트레스를 감소시키고, 이를 통해 염증 및 세포 사멸을 억제하고, 최종적으로는 세포의 생성 및 회복을 촉진시킴으로써 세포손상, 근감소, 근력감소 등 노화를 포함하는 산화적 스트레스 관련 질환의 증상을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 발현가능한 글루타티온 합성효소(glutathione synthetase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포는 산화스트레스로 증가되는 노화를 포함한 다양한 산화적 스트레스 관련 질환 증상들의 예방 또는 치료에 폭넓게 사용될 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명의 발현가능한 글루타티온 합성효소(glutathione synthetase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포는 체내에서 효과적인 항산화제로 작용함으로써, 산화스트레스를 감소시키고, 이를 통해 염증 및 세포 사멸을 억제하는 기작을 통하여, 다양한 산화스트레스로 인한 질환 또는 증상들, 예를 들어, 치매, 골감소증, 근위축성 측삭경화증, 골다공증, 골관절염, 비만, 파킨슨씨병, 노인성 심혈관 질환, 노인성 폐질환, 노인성 안구 질환, 지질대사질환, 동맥경화증, 심부전증, 고혈압성 심장질환, 부정맥, 심근경색증, 협심증, 암, 염증성 질환, 피부 노화 등을 포함하는 질환 또는 증상들의 예방 또는 치료에 폭넓게 사용될 수 있다.

Claims (14)

  1. 글루타티온 합성효소(glutathione synthetase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포를 유효성분으로 포함하는, 산화적 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 글루타티온 합성효소는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포는 체세포, 중간엽줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포, 배아줄기세포, 및 유도만능줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 약학적 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 글루타티온 합성효소(glutathione synthetase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 인간의 체내에서 발현가능한 형태로 제조되는 것인, 약학적 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 산화적 스트레스 관련 질환은 노화, 치매, 골감소증, 근위축성 측삭경화증, 골다공증, 골관절염, 비만, 파킨슨씨병, 노인성 심혈관 질환, 노인성 폐질환, 노인성 안구 질환, 지질대사질환, 동맥경화증, 심부전증, 고혈압성 심장질환, 부정맥, 심근경색증, 협심증, 암, 염증성 질환 및 피부 노화로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 약학적 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 체내에서 산화스트레스를 감소시켜 활성산소종으로 인한 증상을 예방 또는 치료하는 것인, 약학적 조성물.
  7. 글루타티온 합성효소(glutathione synthetase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포를 유효성분으로 포함하는, 산화적 스트레스 관련 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 식품 조성물은 체내에서 산화스트레스를 감소시켜 활성산소종으로 인한 증상을 개선 또는 예방하는 것인, 식품 조성물.
  9. 글루타티온 합성효소(glutathione synthetase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포를 유효성분으로 포함하는, 산화적 스트레스 관련 피부 질환의 개선 또는 예방용 화장료 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 화장료 조성물은 피부 세포의 산화스트레스를 감소시켜 피부 노화로 인한 증상을 개선 또는 예방하는 것인, 화장료 조성물.
  11. 글루타티온 합성효소(glutathione synthetase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포를 유효성분으로 포함하는, 항산화 조성물.
  12. 글루타티온 합성효소(glutathione synthetase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 산화적 스트레스 관련 증상 또는 질환의 예방, 개선, 완화, 또는 치료 방법.
  13. 글루타티온 합성효소(glutathione synthetase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포를 유효성분으로 포함하는 조성물의 산화적 스트레스 관련 증상 또는 질환의 예방, 개선, 완화, 또는 치료 용도.
  14. 글루타티온 합성효소(glutathione synthetase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포의 산화적 스트레스 관련 증상 또는 질환의 예방, 개선, 완화, 또는 치료에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도.
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