WO2025249482A1 - γ－アミノ酪酸の含有濃度が向上された植物及びその製造方法 - Google Patents

γ－アミノ酪酸の含有濃度が向上された植物及びその製造方法

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WO2025249482A1
WO2025249482A1 PCT/JP2025/019338 JP2025019338W WO2025249482A1 WO 2025249482 A1 WO2025249482 A1 WO 2025249482A1 JP 2025019338 W JP2025019338 W JP 2025019338W WO 2025249482 A1 WO2025249482 A1 WO 2025249482A1
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WO
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plant
gaba
gene
mutation
regulatory sequence
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PCT/JP2025/019338
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English (en)
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浩 江面
ピエトロ グラマツィオ
真理子 岡部
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Sanatech Life Science Co Ltd
University of Tsukuba NUC
Original Assignee
Sanatech Life Science Co Ltd
University of Tsukuba NUC
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Publication date
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/82—Solanaceae, e.g. pepper, tobacco, potato, tomato or eggplant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L19/00—Products from fruits or vegetables; Preparation or treatment thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity

Definitions

  • the present invention relates to plants with improved concentrations of gamma-aminobutyric acid (GABA) and methods for producing the same.
  • GABA gamma-aminobutyric acid
  • enhancing GABA biosynthesis or inhibiting GABA degradation are thought to be effective methods for increasing GABA accumulation in tomato fruit.
  • Reported methods for enhancing GABA biosynthesis include overexpressing the glutamic acid decarboxylase (GAD) gene, which is involved in GABA biosynthesis, using recombinant technology (Non-Patent Documents 1 and 2), and using genome editing to remove the autoinhibitory domain of the GAD protein and increase its activity (Non-Patent Document 3).
  • RNAi RNA interference
  • Non-Patent Document 4 While the suppression of GABA-T gene expression described in Non-Patent Document 4 was effective in increasing GABA accumulation in tomato fruit, it has been reported to result in undesirable traits such as sterility and dwarfism. For this reason, the approach of suppressing GABA breakdown has not yet been utilized in breeding plants with high GABA content.
  • the present invention was made in consideration of the problems inherent in the prior art, and aims to provide a method for producing plants with improved GABA concentrations that do not result in sterility or dwarfism, as well as to provide such plants.
  • Non-Patent Document 4 the sterility and dwarfism reported in the degradation of GABA-T mRNA by RNAi (Non-Patent Document 4) do not occur when a mutation is introduced into the regulatory sequence, leading to the completion of the present invention.
  • the present invention provides the following aspects:
  • GABA gamma-aminobutyric acid
  • a method for producing edible parts with an increased GABA concentration comprising the steps of producing a plant body with an increased GABA concentration by the method described in any one of [1] to [5], and obtaining edible parts from the plant body.
  • a plant with an improved GABA concentration in which a mutation has been artificially introduced into the regulatory sequence located upstream of the GABA-T gene, thereby suppressing expression of the gene.
  • the present invention makes it possible to provide a method for producing a plant with an improved GABA concentration without causing sterility or dwarfing, and to provide such a plant.
  • a method for producing a plant with an improved GABA concentration without causing sterility or dwarfing, and to provide such a plant.
  • FIG. 1 is a diagram outlining the locations of gRNA1 to gRNA4 in the regulatory sequence of the SlGABA-T1 gene and the introduced deletion mutations.
  • 1 is a graph showing the results of qRT-PCR analysis of the expression level of the SlGABA-T1 gene in fruit (immature, browning, and red ripe stages) for wild-type tomato, a genome-edited tomato (SlGAD3 ⁇ C) in which the C-terminal autoinhibitory domain of GAD3 has been deleted, and a tomato line (SlGAD3 ⁇ C+SlGABA-T1 ⁇ pro) in which the deletion mutation has been introduced into the regulatory sequence of the GABA-T1 gene in the SlGAD3 ⁇ C background.
  • the vertical axis indicates the relative expression level of the SlGABA-T1 gene to that of a housekeeping gene (ubiquitin gene).
  • 1 is a graph showing the results of measuring the GABA content in fruits (ripe red stage) of wild-type tomato, SlGAD3 ⁇ C, and SlGAD3 ⁇ C+SlGABA-T1 ⁇ pro.
  • the vertical axis represents the GABA content per 100 g of fresh fruit.
  • 1 is a graph showing the results of measuring the plant height of a wild-type tomato, SlGAD3 ⁇ C, and SlGAD3 ⁇ C+SlGABA-T1 ⁇ pro, where the vertical axis represents the length from the cotyledon to the growing point, measured while the plant was kept upright 80 days after sowing.
  • the present invention provides a method for producing a plant having an improved GABA concentration, comprising: (1) introducing a mutation into a regulatory sequence located upstream of a GABA-T gene in a plant cell to suppress expression of the gene; (2) a step of regenerating a plant from the plant cells in which the expression of the gene has been suppressed in the step (1).
  • plants that are the subject of this invention are not particularly limited as long as they are capable of biosynthesizing GABA, but include, for example, seed plants, including angiosperms and gymnosperms.
  • Angiosperms include dicotyledonous and monocotyledonous plants.
  • “Dicotyledonous plants” include, for example, Solanaceae, Cucurbitaceae, Legumes, Cruciferae, Convolvulaceae, Rosaceae, Asteraceae, Amaranthaceae, Polygonaceae, Mulberry, and Malvaceae.
  • Solanaceae plants include tomatoes, potatoes, eggplants, tobacco, and chili peppers.
  • “Cucurbitaceae plants” include melons, pumpkins, watermelons, Japanese cantaloupes, and cucumbers.
  • “Legumes” include soybeans, adzuki beans, kidney beans, peas, cowpeas, and alfalfa.
  • “Brassicaceae plants” include cabbage, cauliflower, radishes, Chinese cabbage, and rapeseed.
  • Examples of “Convolvulaceae plants” include sweet potato (sweet potato).
  • Examples of “Rosaceae plants” include strawberries and apples.
  • Examples of “Asteraceae plants” include lettuce.
  • Examples of “Amaranthaceae plants” include sugar beets (sugar beets).
  • Examples of “Polygonaceae plants” include buckwheat.
  • Examples of “Moraceae plants” include mulberry, fig, and rubber tree. Examples of “Mallow family plants” include cotton and kenaf. Examples of “monocotyledonous plants” include any species, such as grasses, lilies, Musaceae, Bromeliaceae, and orchids. Examples of “Gramineae plants” include rice, wheat, barley, corn, oats, turfgrass, sorghum, rye, foxtail millet, and sugarcane. Examples of “Liliaceae plants” include leeks and asparagus. Examples of “Musaceae plants” include bananas. Examples of “Bromeliaceae plants” include pineapples. Examples of “Orchidaceae plants” include orchids.
  • Examples of “gymnosperms” include ginkgo, pine, cedar, and cycads.
  • tomatoes, melons, rice, potatoes, soybeans, and pumpkins are preferred, with tomatoes being more preferred, from the viewpoint that GABA tends to be readily contained in the edible parts.
  • Plants according to the present invention may be wild species or cultivated species. Furthermore, they may be genetically modified or genome-edited versions of these plants (for example, disease-resistant crops, herbicide-resistant crops, pest-resistant crops, crops with improved taste, crops with improved shelf life, or crops with improved yield).
  • examples of plants that are the subject of the present invention include plants in which the function of the C-terminal autoinhibitory domain in GAD, described below, has been lost.
  • GABA the target of increased content
  • GABA is a type of amino acid, also known as gamma-aminobutyric acid or 4-aminobutyric acid.
  • Improved GABA concentration means, for example, that the GABA concentration is increased compared to the plant before the introduction of the mutation described below, and preferably that the GABA concentration is increased in the edible parts of the plant compared to the plant before the introduction of the mutation described below.
  • GABA concentration is preferably 1.2 times or more (e.g., 1.5 times or more, 1.7 times or more, 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more), more preferably 5 times or more (e.g., 6 times or more, 7 times or more, 8 times or more, 9 times or more), and even more preferably 10 times or more (e.g., 11 times or more, 12 times or more, 13 times or more, 14 times or more, 15 times or more) compared to the plant or its edible parts before the introduction of the mutation.
  • Edible parts refers to the parts of a plant that can be eaten.
  • a plant with an improved GABA concentration can also be described as a plant that contains a high concentration of GABA.
  • high concentration in terms of the GABA content in, for example, tomato fruit, is preferably 100 mg/100 g FW or more, more preferably 110 mg/100 g FW or more, even more preferably 120 mg/100 g FW or more, more preferably 130 mg/100 g FW or more, even more preferably 140 mg/100 g FW or more, and even more preferably 150 mg/100 g FW or more.
  • the unit "mg/100 g FW" used here represents the GABA content per 100 g of fresh fruit at the red fruit stage.
  • ⁇ -aminobutyrate aminotransferase GABA-T
  • GABA-T is an enzyme (registered as EC number 2.6.1.96) that catalyzes the conversion of GABA to succinic semialdehyde (SSA).
  • SSA succinic semialdehyde
  • proteins belonging to the "Gamma aminobutyrate transaminase” group on UniProt and proteins encoded by genes belonging to the "GABA-TP” group.
  • a specific example, in the case of tomato is the protein identified by UniProt accession Q84P54.
  • GABA-T genes derived from various plants their respective registration IDs (gene IDs) are shown in Table 1, along with reference databases.
  • suppression of GABA-T gene expression means, for example, that the expression level of the GABA-T gene is reduced compared to the plant or edible parts thereof before the introduction of the mutation, as described below.
  • expression level may refer to the amount of mRNA (or cDNA), or the amount of protein reflecting this.
  • Reduction means that the expression level of the GABA-T gene is preferably 90% or less (e.g., 80% or less, 70% or less, 60% or less), more preferably 50% or less (e.g., 40% or less, 30% or less), and even more preferably 20% or less (e.g., 15% or less, 10% or less), compared to the plant or edible parts thereof before the introduction of the mutation.
  • the "regulatory sequence" located upstream of the GABA-T gene into which the mutations described below are introduced refers to the sequence 5' from the start codon in the DNA sequence encoding the GABA-T protein in the genomic sequence (preferably the sequence 5' from the transcription start point), and is a DNA sequence that can regulate the expression (transcription, etc.) of the gene.
  • regulatory sequences located upstream of the GABA-T gene in various plants include the DNA sequences specified by the respective SEQ ID NOs shown in Table 1.
  • an example is the DNA sequence consisting of positions 2056 to 2422 of SEQ ID NO: 1, and more preferably the DNA sequence consisting of positions 2056 to 2314 of SEQ ID NO: 1.
  • the TATA BOXes include TATABOX2 (PLACE ID: S000109, DNA sequence: TATAAAT), TATABOX3 (PLACE ID: S000110, DNA sequence: TATTAAT), and TATABOX5 (PLACE ID: S000203, DNA sequence: TTATTT).
  • the initiator also includes INRNTPSADB (PLACE ID: S000395, DNA sequence: YTCANTYY).
  • all of the DNA sequences specified by the above SEQ ID NOs: 16 to 30 contain such a TATA BOX and initiator. Therefore, these sequences can be suitable targets for mutagenesis.
  • DNA sequences can vary in nature. Furthermore, even sequences related to the same gene of the same species can differ (genetic polymorphisms). Therefore, in the present invention, the regulatory sequences into which the mutations described below are introduced are not limited to the above-mentioned typical DNA sequences, but can also include sequences corresponding to them.
  • corresponding sequences refers to DNA sequences that are identical to the above-mentioned typical DNA sequences (e.g., DNA sequences specified by the above-mentioned SEQ ID NOs or partial sequences thereof) or have high homology or identity thereto.
  • “high” refers to at least 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more (e.g., 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more), and even more preferably 95% or more (e.g., 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more).
  • Sequence homology or identity can be determined, for example, using the BLAST program (Altschul et al. J. Mol. Biol., 215:403-410, 1990). This program is based on the BLAST algorithm by Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci.
  • examples of mutations introduced into the above-mentioned regulatory sequence include deletion, insertion, and/or substitution of one or more DNA fragments, preferably deletion of one or more DNA fragments.
  • “multiple” is not particularly limited as long as it is possible to suppress the expression (transcription, etc.) of the GABA-T gene and improve the GABA content.
  • the lower limit may be 2 or more bases, 3 or more bases, 5 or more bases, 10 or more bases, 20 or more bases, 30 or more bases, 50 or more bases, 100 or more bases, 200 or more bases, 500 or more bases, 1000 or more bases, or 2000 or more bases.
  • the upper limit may be, for example, 2500 or less bases, 2000 or less bases, 1500 or less bases, 1000 or less bases, 500 or less bases, 200 or less bases, 100 or less bases, 50 or less bases, 40 or less, 20 or less, 10 or less bases, or 5 or less bases. More specific examples of the number of bases for deletion, insertion, and/or substitution introduced into the above-mentioned regulatory sequence include 2 to 2500 bases, 20 to 2000 bases, 50 to 1500 bases, 100 to 1000 bases, and 200 to 500 bases (250 to 450 bases, 300 to 400 bases, and 350 to 370 bases (particularly 367 bases)). Further examples include 2 to 300 bases, 3 to 200 bases, 5 to 100 bases, 10 to 50 bases, and 30 to 40 bases.
  • the number of mutations (number of sites) introduced into the regulatory sequence in the present invention is not particularly limited, as long as it is possible to suppress the expression (transcription, etc.) of the GABA-T gene and improve the GABA content, and may be one or more (e.g., 2, 3 or less, 5 or less, 10 or less, 20 or less, 30 or less, 40 or less, or 50 or less).
  • Those skilled in the art can introduce mutations into the regulatory sequences of the present invention using known mutagenesis methods.
  • Such known methods include, but are not limited to, genome editing, physical mutagenesis, methods using chemical mutagens, and methods of introducing transposons or the like into genomic DNA.
  • Gene editing is a method of modifying target genes using site-specific nucleases (e.g., zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activation-like effector nucleases (TALENs), CRISPR-Cas enzymes, and other DNA double-strand break enzymes).
  • site-specific nucleases e.g., zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activation-like effector nucleases (TALENs), CRISPR-Cas enzymes, and other DNA double-strand break enzymes.
  • ZFNs zinc finger nucleases
  • TALENs transcription activation-like effector nucleases
  • CRISPR-Cas enzymes e.g., CRISPR-Cas enzymes
  • fusion proteins such as ZFNs (U.S. Patent Nos. 6,265,196, 8,524,500, 7,888,121, and European Patent No. 1,720,995), TALENs (U.S. Patent Nos.
  • nuclease domain-fused pentatrichopeptiderepeat PPR
  • PPR nuclease domain-fused pentatrichopeptiderepeat
  • CRISPR-Cas9 U.S. Patent No. 8,697,359, and International Publication No. WO 2013/176772
  • CRISPR-Cpf1 Examples of such methods include a method using a guide RNA-protein complex, such as Target-AID (Zetsche B. et al., Cell, 163(3):759-71, (2015)) or Target-AID (K. Nishida et al., Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems, Science, DOI: 10.1126/science.aaf8729, (2016)), or a protein complex.
  • Target-AID Zetsche B. et al., Cell, 163(3):759-71, (2015)
  • Target-AID K. Nishida et al., Targeted
  • Cas enzyme there are no particular limitations on the "Cas enzyme” and it can be selected appropriately depending on the purpose, and examples include type I CRISPR enzymes, type II CRISPR enzymes, and type III CRISPR enzymes, with Cas9, a type II CRISPR enzyme, being preferred.
  • Cas9 there are no particular limitations on the "Cas9” and it can be selected appropriately depending on the purpose, and examples include Cas9 from Streptococcus pneumoniae, Cas9 from Streptococcus pyogenes, and Cas9 from S. Examples of Cas9 include Streptococcus thermophilus Cas9 and Staphylococcus aureus Cas9, but Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) is preferred.
  • It may also be a mutant of Cas9 derived from these organisms, or the D10A mutant of Cas9, which is known to function as a nickase (a DNA-cleaving enzyme that nicks only one DNA strand), or a Cas9 homolog or ortholog.
  • nickase a DNA-cleaving enzyme that nicks only one DNA strand
  • Cas9 homolog or ortholog a Cas9 homolog or ortholog.
  • Physical mutagenesis methods include, for example, heavy ion beam (HIB) irradiation, fast neutron irradiation, gamma ray irradiation, and ultraviolet irradiation (see Hayashi et al., Cyclotrons and Their Applications, 2007, 18th International Conference, pp. 237-239, and Kazama et al., Plant Biotechnology, 2008, Vol. 25, pp. 113-117).
  • HAB heavy ion beam
  • An example of a "method using a chemical mutagen” is a method in which seeds, etc. are treated with a chemical mutagen (see, for example, Zwar and Chandler, Planta, 1995, Vol. 197, pp. 39-48).
  • chemical mutagens include N-methyl-N-nitrosourea (MNU), ethyl methanesulfonate (EMS), N-ethyl-N-nitrosourea (ENU), sodium azide, sodium bisulfite, hydroxylamine, N-methyl-N'-nitro-N-nitroguanidine (MNNG), N-methyl-N'-nitrosoguanidine (NTG), O-methylhydroxylamine, nitrous acid, formic acid, and nucleotide analogs.
  • MNU N-methyl-N-nitrosourea
  • EMS ethyl methanesulfonate
  • ENU N-ethyl-N-nitrosourea
  • NSG N-methyl-N-nitro
  • TILLING Targeting Induced Local Lesions IN Genomes
  • Slade et al., Transgenic Res., 2005, Vol. 14, pp. 109-115, and Comai et al., Plant J., 2004, Vol. 37, pp. 778-786 the regulatory sequence of the present invention or a portion thereof can be amplified by PCR, and individuals having mutations in the amplification product can be selected using the aforementioned TILLING or similar method.
  • Plants with improved GABA concentrations due to the introduction of a mutation into the regulatory sequence of the present invention may be heterozygotes consisting of a wild-type and a mutation in the regulatory sequence of the present invention. In such cases, for example, such heterozygotes are crossed to obtain F1 plants, and homozygotes having the regulatory sequence of the GABA-T gene into which the mutation has been introduced are selected from the F1 plants.
  • homozygotes having the regulatory sequence of the GABA-T gene into which the mutation has been introduced includes not only plants having two regulatory sequences (alleles) of the GABA-T gene with identical mutations, but also plants having a regulatory sequence of a first GABA-T gene with a first mutation and a regulatory sequence of a second GABA-T gene with a second mutation.
  • Plant cells include not only cultured cells derived from plants, but also cells within the plant. Furthermore, plant-derived cells in various forms, such as suspension culture cells, protoplasts, leaf slices, callus, immature embryos, pollen, etc., are also included.
  • the above-mentioned DNA encoding the site-specific nuclease, fusion protein, or guide RNA-protein complex, DNA encoding a transposon, etc. may be introduced into plant cells in the form of being inserted into a vector.
  • the vector into which the DNA for introducing a mutation into the regulatory sequence of the present invention is inserted is not particularly limited as long as it is capable of expressing the inserted gene in plant cells, and may contain a promoter for constitutive or inducible expression of the DNA.
  • promoters for constitutive expression include the rice ubiquitin promoter, the cauliflower mosaic virus 35S promoter, the rice actin promoter, and the maize ubiquitin promoter.
  • promoters for inducible expression include promoters known to be expressed in response to external factors such as infection or invasion by filamentous fungi, bacteria, or viruses, low temperature, high temperature, drought, ultraviolet radiation, and spraying with specific compounds.
  • pol III promoters such as the U6 promoter are preferably used as promoters for expressing DNA encoding short RNAs such as guide RNAs as DNA of the present invention.
  • Methods for introducing the DNA or a vector into which the DNA has been inserted into plant cells include various methods known to those skilled in the art, such as the Agrobacterium-mediated method (Agrobacterium method), particle bombardment, polyethylene glycol method, and electroporation. Mutations can also be introduced into plant cells without taking the form of DNA; for example, the above-mentioned site-specific nucleases, fusion proteins, and transposons can be introduced as proteins, and the above-mentioned guide RNA can be introduced as RNA.
  • the present invention makes it possible to increase the GABA content in plants by using substances that target the regulatory sequence of the present invention, such as the DNA, the vector into which the DNA has been inserted, the protein, and the RNA. Therefore, the present invention can also provide a drug for increasing the GABA content in plants, which contains as an active ingredient at least one substance that targets the regulatory sequence of the GABA-T gene of the present invention, selected from the group consisting of the DNA, the vector into which the DNA has been inserted, the protein, and the RNA.
  • Such a pharmaceutical preparation may contain two active ingredients in a single composition, or may contain two active ingredients in separate compositions (a so-called kit). Furthermore, in addition to the above substances, the pharmaceutical preparation of the present invention may also contain other ingredients such as buffers, stabilizers, preservatives, and antiseptics.
  • plants with improved GABA content can be obtained by regenerating plants from cells into which a mutation has been introduced into the regulatory sequence of the present invention using the methods described above.
  • methods such as those described in Sun et al., Plant Cell Physiology, 2006; 47(3): 426-431 and Sonia Hamza and Yves Chupeau, J. Exp. Bot., 44: 1837-1845, 1993 can be used.
  • transformation and plant regeneration can be performed using methods such as those described in Tabei et al. ("Transformation Protocols [Plant Edition]," edited by Yutaka Tabei, published by Kagaku Dojin Co., Ltd. on September 20, 2012).
  • the present invention also provides a method for producing edible parts with an improved GABA concentration, which includes the steps of producing a plant body with an improved GABA concentration by the above-mentioned method, and obtaining edible parts from the plant body.
  • the edible parts are as described above, and those skilled in the art can obtain them from plants by making appropriate preparations depending on the type of plant or edible parts.
  • the present invention relates to a plant or edible portion thereof with an improved GABA concentration, in which a mutation has been artificially introduced into the regulatory sequence located upstream of the GABA-T gene, thereby suppressing expression of the gene.
  • sterility means that seeds capable of developing into plants of the next generation are not produced.
  • “Dwarfism” means that the plant matures while remaining small compared to the plant before the introduction of the mutation in this invention, and “no dwarfism” can also include a state in which the degree of dwarfism is small. More specifically, in tomatoes, for example, the plant height after flowering (approximately 40 days after sowing, for example 80 days after sowing), when the plant switches from vegetative growth to reproductive growth, is 70% or less compared to the plant before the introduction of the mutation in this invention.
  • the regulatory sequence of the present invention includes the progeny and clones of plants with an improved GABA concentration, as well as their propagation materials. Examples of propagation materials include seeds, stocks, callus, and protoplasts.
  • GAD glutamate decarboxylase
  • Glutamate decarboxylase is an enzyme (registered as EC number 4.1.1.15) that catalyzes the conversion of glutamate to GABA.
  • Examples include proteins belonging to the "Glutamate decarboxylase” category on UniProt, and proteins encoded by genes belonging to the "GAD” category.
  • a specific example is the tomato protein identified by UniProt accession number B1Q3F2.
  • Table 2 lists the GAD genes from various plants, along with their respective registration IDs (gene IDs) in reference databases.
  • the "C-terminal autoinhibitory domain" of GAD which is the target of loss of function, is a calmodulin-binding domain (CaM BD) consisting of approximately 30 amino acids (e.g., 22-25 amino acids) located at the C-terminus, and functions as an autoinhibitory domain that inactivates the enzymatic activity of GAD.
  • CaM BD calmodulin-binding domain
  • Examples of such loss of function include deletion of all or part of the C-terminal autoinhibitory domain.
  • those skilled in the art can appropriately prepare such loss-of-function plants or plant cells using known techniques such as genome editing, as well as the introduction of mutations targeting the regulatory sequence of the GABA-T gene (see, for example, Non-Patent Document 3).
  • gRNAs were designed using PAM sequences (NGG) located 81 bases, 448 bases, 1,103 bases, and 1,382 bases upstream from the start codon (SEQ ID NOs: 2, 3, 4, and 5), and vectors containing these four target sequences in the expression cassette were constructed ( Figure 1). Transformation was performed using the Agrobacterium method optimized for Micro-Tom (Sun et al., Plant cell psychiatry, 2006; 47(3): 426-431). Agrobacterium carrying the vectors was then used to infect cotyledon explants of Micro-Tom (wild-type), and the expression cassette shown in Figure 1 was introduced into the nuclear genome. Plants regenerated from a series of selective media containing kanamycin were initially selected as candidate transformants.
  • NVG PAM sequences
  • genomic DNA was extracted from young tomato leaves, and primers (SEQ ID NOs: 6 and 7) that specifically bind to the CRISPR/Cas9 vector were used to confirm whether the CRISPR/Cas9 vector had been introduced into the tomato nuclear genome.
  • Sanger sequencing was also performed to confirm whether mutations had occurred near the target sequence.
  • DNA fragments near the target sequence were PCR-amplified using genomic DNA extracted from tomato and primers designed around the target sequence (SEQ ID NOs: 8, 9, 10, and 11).
  • the amplified PCR fragments were used as sequencing templates and subjected to Sanger sequencing using primers specific to the SlGABA-T1 upstream sequence (SEQ ID NO: 8 was used to analyze gRNA1, SEQ ID NO: 9 for gRNA2, SEQ ID NO: 10 for gRNA3, and SEQ ID NO: 11 for gRNA4).
  • the C-terminal autoinhibitory domain of GAD3 has been deleted by genome editing. See Nonaka et al., Scientific reports, 2017;7(1),7057.
  • the SlGAD3 mutant will also be referred to as "SlGAD3 ⁇ C.”
  • the amino acid sequences of the wild-type and SlGAD3 ⁇ C are shown in SEQ ID NOs: 14 and 15, respectively.
  • the C-terminal autoinhibitory domain is the 30 amino acids from asparagine at position 455 to the last amino acid (cysteine) (position 484) in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14.
  • the obtained mutant homozygous nulligrant individuals were cultivated in a closed cultivation room, and the GABA content of the fruit was measured and the expression of the SlGABA-T1 gene was analyzed.
  • GABA content was measured using a GABA measurement kit (Enzyme Sensor Co., Ltd.). The method followed the instructions in the kit's manual.
  • the expression of the SlGABA-T1 gene was analyzed using qRT-PCR, with SlGABA-T1-specific primers (SEQ ID NOs: 12 and 13) as the primers.
  • the present invention by introducing a mutation into the regulatory sequence upstream of the GABA-T gene, it is possible to increase GABA content without causing any adverse traits. Therefore, the present invention is useful for suppressing elevated blood pressure, alleviating stress, improving sleep quality, maintaining skin elasticity, etc.

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Abstract

不稔及び矮化を伴わない、γ－アミノ酪酸の含有濃度が向上された植物の製造方法、及び、当該植物を提供することを目的とし、植物において、ＧＡＢＡ－Ｔ遺伝子上流の調節配列に変異を導入し、当該遺伝子の発現量を抑制することによって、不稔及び矮化を伴うことなく、γ－アミノ酪酸の含有量を高められることを見出した。

Description

γ－アミノ酪酸の含有濃度が向上された植物及びその製造方法
　本発明は、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の含有濃度が向上された植物及びその製造方法に関する。
　ＧＡＢＡは、ヒトの中枢神経系にて神経伝達物質として機能するアミノ酸であるが、経口摂取することにより、血圧上昇の抑制、ストレスの緩和、睡眠の質の改善、肌の弾力の維持等にも効果があることが知られている。そのため、トマトをはじめとしたＧＡＢＡ含有量の高い植物は需要が高く、植物体のＧＡＢＡ蓄積量をさらに高める技術の開発が求められている。
　例えば、トマト果実のＧＡＢＡ蓄積量を高める手法として、ＧＡＢＡ生合成の強化、あるいはＧＡＢＡ分解の抑制が有効と考えられる。ＧＡＢＡの生合成を強化する方法としては、ＧＡＢＡ生合成に関与するグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）遺伝子を組換え技術を用いて過剰発現させる方法（非特許文献１、２）、ゲノム編集技術によりＧＡＤタンパク質の自己抑制ドメインを除去し、活性を高める方法（非特許文献３）が報告されている。一方、ＧＡＢＡ分解を抑制する方法としては、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）法を用いてＧＡＢＡ分解酵素（γ－アミノ酪酸アミノ基転移酵素：ＧＡＢＡ－Ｔ）の発現を抑制する方法（非特許文献４）が報告されている。
　しかしながら、非特許文献４に記載のＧＡＢＡ－Ｔ遺伝子の発現抑制は、トマト果実のＧＡＢＡ蓄積を増加させるのに有効であったが、不稔や矮化といった不良形質を伴うことが報告されている。そのため、ＧＡＢＡの分解を抑制するというアプローチはＧＡＢＡ高含有植物の育種に活かされていないのが現状である。
Ｔａｋａｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ．　２０１５　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　５６，１５３３－１５４５ Ｔａｋａｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ．　２０１７　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ　３６，１０３－１１６ Ｎｏｎａｋａ　ｅｔ　ａｌ．　２０１７　Ｓｃｉ　Ｒｅｐ　７．１，　７０５７ Ｋｏｉｋｅ　ｅｔ　ａｌ．　２０１３　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　５４，７９３－８０７
　本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、不稔及び矮化を伴わない、ＧＡＢＡの含有濃度が向上された植物の製造方法、及び、当該植物を提供することを目的とする。
　本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、植物において、ＧＡＢＡ－Ｔ遺伝子上流の調節配列に変異を導入し、当該遺伝子の発現量を抑制することによって、ＧＡＢＡ含有量を高められることを見出した。一方、ＲＮＡｉによるＧＡＢＡ－Ｔ　ｍＲＮＡの分解（非特許文献４）では報告されていた不稔及び矮化は、前記調節配列への変異導入においては生じないことを明らかにし、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の態様を提供する。
　［１］　γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の含有濃度が向上された植物体の製造方法であって、
（１）植物細胞において、γ－アミノ酪酸アミノ基転移酵素（ＧＡＢＡ－Ｔ）遺伝子の上流に位置する調節配列に、変異を導入し、前記遺伝子の発現を抑制する工程と、
（２）前記工程（１）において前記遺伝子の発現が抑制された植物細胞から、植物体を再生する工程とを含む、製造方法。
　［２］　前記植物細胞がトマトの細胞であり、前記調節配列における配列番号：１に記載のＤＮＡ配列又はそれに対応する配列に、前記変異を導入する、［１］に記載の製造方法。
　［３］　前記植物細胞がトマトの細胞であり、前記調節配列における配列番号：１に記載の２０５６～２４２２位からなるＤＮＡ配列又はそれに対応するに、前記変異を導入する、［１］に記載の製造方法。
　［４］　前記植物細胞が、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）において、Ｃ末端自己抑制ドメインの機能が喪失している細胞である、［１］～［３］のうちのいずれか１項に記載の製造方法。
　［５］　（３）前記工程（２）において得られた植物体と、ＧＡＤにおいてＣ末端自己抑制ドメインの機能が喪失している植物体とを、交配させる工程を、更に含む、［１］～［３］のうちのいずれか１項に記載の製造方法。
　［６］　［１］～［５］のうちのいずれか１項に記載の方法によりＧＡＢＡの含有濃度が向上された植物体を製造する工程と、当該植物体から可食部を得る工程とを含む、ＧＡＢＡの含有濃度が向上された可食部の製造方法。
　［７］　ＧＡＢＡ－Ｔ遺伝子の上流に位置する調節配列に、人為的に変異が導入され、前記遺伝子の発現が抑制されている、ＧＡＢＡの含有濃度が向上された植物体。
　［８］　前記調節配列における配列番号：１に記載のＤＮＡ配列又はそれに対応する配列に、前記変異が導入されている、トマトの植物体である、［７］に記載の植物体。
　［９］　前記調節配列における配列番号：１に記載の２０５６～２４２２位からなるＤＮＡ配列又はそれに対応する配列に、前記変異が導入されている、トマトの植物体である、［７］に記載の植物体。
　［１０］　更に、ＧＡＤにおいてＣ末端自己抑制ドメインの機能が喪失している、［７］～［９］のうちのいずれか１項に記載の植物体。
　［１１］　［７］～［１０］のうちのいずれか１項に記載の植物体の可食部。
　本発明によれば、不稔及び矮化を伴わない、ＧＡＢＡの含有濃度が向上された植物の製造方法、及び、当該植物を提供することが可能となる。例えば、後述の実施例に示すとおり、約１５０ｍｇ／１００ｇＦＷ（野生型と比較して約１３倍）という高濃度にてＧＡＢＡを含有する赤熟期の果実及びそれらを実らせるトマトを提供することが可能となる。
トマトのγ－アミノ酪酸アミノ基転移酵素１遺伝子（ＳｌＧＡＢＡ－Ｔ１遺伝子）の上流に位置する調節配列をゲノム編集するための４種のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ１～ｇＲＮＡ４）と、Ｃａｓ９とを、発現させるためのカセットの概要を示す、図である。 図１に示すＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９発現カセットを保持するＴ０トマト個体から、前記調節配列に導入された変異をホモに有するヌルセグリガントを獲得するためのスキームの概要を示す、図である。 ＳｌＧＡＢＡ－Ｔ１遺伝子の調節配列における、ｇＲＮＡ１～ｇＲＮＡ４の位置と、導入された欠失変異との概要を示す、図である。 野生型のトマト、ＧＡＤ３においてＣ末端自己抑制ドメインが欠失しているゲノム編集トマト（ＳｌＧＡＤ３ΔＣ）、及び、ＳｌＧＡＤ３ΔＣをバックグラウンドとしてＧＡＢＡ－Ｔ１遺伝子の調節配列において前記欠失変異が導入されたトマト系統（ＳｌＧＡＤ３ΔＣ＋ＳｌＧＡＢＡ－Ｔ１Δｐｒｏ）について、果実（未熟期、催色期、赤熟期）におけるＳｌＧＡＢＡ－Ｔ１遺伝子の発現量を、ｑＲＴ－ＰＣＲ法により解析した結果を示す、グラフである。図中、縦軸は、ハウスキーピング遺伝子（ユビキチン遺伝子）に対するＳｌＧＡＢＡ－Ｔ１遺伝子の相対的な発現値を示す。 野生型のトマト、ＳｌＧＡＤ３ΔＣ、及び、ＳｌＧＡＤ３ΔＣ＋ＳｌＧＡＢＡ－Ｔ１Δｐｒｏについて、果実（赤熟期）のＧＡＢＡ含有量を測定した結果を示す、グラフである。図中、縦軸は、生果１００ｇあたりのＧＡＢＡ含有量を示す。 野生型のトマト、ＳｌＧＡＤ３ΔＣ、及び、ＳｌＧＡＤ３ΔＣ＋ＳｌＧＡＢＡ－Ｔ１Δｐｒｏについて、草丈を測定した結果を示す、グラフである。図中、縦軸は、播種後８０日目の植物体を、直立に保った状態で測定した子葉から成長点までの長さを示す。
　後述の実施例において示すとおり、植物において、ＧＡＢＡ－Ｔ遺伝子上流の調節配列に変異を導入し、当該遺伝子の発現量を抑制することによって、ＧＡＢＡ含有量を高められることを見出した。一方、不稔及び矮化は、前記調節配列への変異導入においては生じないことを明らかにし、本発明を完成するに至った。よって、本発明は、ＧＡＢＡの含有濃度が向上された植物体の製造方法であって、
（１）植物細胞において、ＧＡＢＡ－Ｔ遺伝子の上流に位置する調節配列に、変異を導入し、前記遺伝子の発現を抑制する工程と、
（２）前記工程（１）において前記遺伝子の発現が抑制された植物細胞から、植物体を再生する工程とを含む、製造方法に関する。
　本発明の対象となる「植物」としては、ＧＡＢＡを生合成し得る限り、特に制限はないが、例えば、被子植物及び裸子植物を含む種子植物である。被子植物には、双子葉植物及び単子葉植物が含まれる。「双子葉植物」としては、例えば、ナス科植物、ウリ科植物、マメ科植物、アブラナ科植物、ヒルガオ科植物、バラ科植物、キク科植物、ヒユ科植物、タデ科植物、クワ科植物、アオイ科植物、が挙げられる。「ナス科植物」としては、トマト、ジャガイモ、ナス、タバコ、トウガラシ等が挙げられる。「ウリ科植物」としては、メロン、カボチャ、スイカ、マクワウリ、キュウリ等が挙げられる。「マメ科植物」としては、ダイズ、アズキ、インゲンマメ、エンドウ、ササゲ、アルファルファ等が挙げられる。「アブラナ科植物」としては、キャベツ、カリフラワー、ダイコン、ハクサイ、ナタネ等が挙げられる。「ヒルガオ科植物」としては、サツマイモ（カンショ）等が挙げられる。「バラ科植物」としては、イチゴ、リンゴ等が挙げられる。「キク科植物」としては、レタス等が挙げられる。「ヒユ科植物」としては、テンサイ（サトウダイコン）等が挙げられる。「タデ科植物」としては、ソバ等が挙げられる。「クワ科植物」としては、クワ、イチジク、ゴムノキ等が挙げられる。「アオイ科植物」としては、ワタ、ケナフ等が挙げられる。「単子葉植物」としては、いずれの種類であってもよいが、例えば、イネ科植物、ユリ科植物、バショウ科植物、パイナップル科植物、ラン科植物が挙げられる。「イネ科植物」としては、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、エンバク、シバ、ソルガム、ライムギ、アワ、サトウキビ等が挙げられる。「ユリ科植物」としては、ネギ、アスパラガス等が挙げられる。「バショウ科植物」としては、バナナ等が挙げられる。「パイナップル科植物」としては、パイナップル等が挙げられる。「ラン科植物」としては、ラン等が挙げられる。「裸子植物」としては、イチョウ、マツ、スギ、ソテツ等が挙げられる。本発明にかかる植物としては、可食部にＧＡＢＡが含有し易い傾向にあるという観点から、トマト、メロン、イネ、ジャガイモ、ダイズ、カボチャが好ましく、トマトがより好ましい。
　本発明にかかる植物は、野生種であってもよく、栽培種であってもよい。さらに、これら植物の遺伝子組み換え体やゲノム編集体（例えば、病害耐性作物、除草剤耐性作物、害虫耐性作物、食味向上作物、保存性向上作物、収量向上作物）であっても良い。このように、本発明において、対象となる植物としては、後述の実施例に示すように、例えば、後述のＧＡＤにおいてＣ末端自己抑制ドメインの機能が喪失している植物が挙げられる。
　本発明において含有量向上の対象となる「ＧＡＢＡ」は、γ－アミノ酪酸又は４－アミノ酪酸とも称される、アミノ酸の１種である。「ＧＡＢＡの含有濃度の向上」は、例えば、後述の変異導入前の植物と比較して、ＧＡＢＡの含有濃度が向上していることであり、好ましくは、植物の可食部において、後述の変異導入前の植物のそれと比較して、ＧＡＢＡの含有濃度が向上していることが挙げられる。「向上」とは、変異導入前の植物又はその可食部と比較して、ＧＡＢＡの含有濃度が、好ましくは１．２倍以上（例えば、１．５倍以上、１．７倍以上、２倍以上、３倍以上、４倍以上）、より好ましくは５倍以上（例えば、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上）、さらに好ましくは１０倍以上（例えば、１１倍以上、１２倍以上、１３倍以上、１４倍以上、１５倍以上）となることである。「可食部」とは、植物において食べられる部分を意味し、各植物の種類に応じて適宜異なるが、例えば、果実、種子、茎（塊茎等）、根（塊根等）、葉、芽（例えば、幼芽（スプラウト等））、花が挙げられる。また、本発明において、ＧＡＢＡの含有濃度が向上された植物とは、ＧＡＢＡを高濃度で含有する植物とも言い換えることが出来る。ここで「高濃度」とは、例えばトマト果実におけるＧＡＢＡの含有量に関しては、好ましくは１００ｍｇ／１００ｇＦＷ以上、より好ましくは１１０ｍｇ／１００ｇＦＷ以上、さらに好ましくは１２０ｍｇ／１００ｇＦＷ以上、より好ましくは１３０ｍｇ／１００ｇＦＷ以上、さらに好ましくは１４０ｍｇ／１００ｇＦＷ以上、より好ましくは１５０ｍｇ／１００ｇＦＷ以上である。なお、ここでの単位「ｍｇ／１００ｇＦＷ」は、赤実期にある生果１００ｇあたりのＧＡＢＡ含有量を表す。
　本発明において、発現抑制の標的となる「γ－アミノ酪酸アミノ基転移酵素（ＧＡＢＡ－Ｔ）」は、ＧＡＢＡからコハク酸セミアルデヒド（ＳＳＡ）への転化反応を触媒する酵素（ＥＣ番号：２．６．１．９６として登録されている酵素）である。例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ上で「Ｇａｍｍａ　ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒａｔｅ　ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ」に属するタンパク質、「ＧＡＢＡ－ＴＰ」に属する遺伝子がコードするタンパク質が挙げられる。具体例として、トマト由来であれば、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション：Ｑ８４Ｐ５４によって特定されるタンパク質等が挙げられる。また、各種植物由来のＧＡＢＡ－Ｔ遺伝子に関し、参照データベースと共にそれらにおける各登録ＩＤ（遺伝子ＩＤ）を表１に示す。
　なお、「ＧＡＢＡ－Ｔ遺伝子の発現の抑制」は、例えば、後述の変異導入前の植物又はその可食部と比較して、ＧＡＢＡ－Ｔ遺伝子の発現量が低減していることである。ここで、「発現量」とは、ｍＲＮＡ（又はｃＤＮＡ）の量であってもよく、またそれを反映したタンパク質の量であってもよい。「低減」とは、変異導入前の植物又はその可食部と比較して、ＧＡＢＡ－Ｔ遺伝子の発現量が、好ましくは９０％以下（例えば、８０％以下、７０％以下、６０％以下）、より好ましくは５０％以下（例えば、４０％以下、３０％以下）、さらに好ましくは２０％以下（例えば、１５％以下、１０％以下）となることである。
　本発明において、後述の変異が導入される、ＧＡＢＡ－Ｔ遺伝子の上流に位置する「調節配列」とは、ゲノム配列上、ＧＡＢＡ－Ｔタンパク質をコードするＤＮＡ配列における、開始コドンより５’側の配列を意味し（好ましくは転写開始点より５’側の配列であり）、前記遺伝子の発現（転写等）を調節し得るＤＮＡ配列である。各種植物におけるＧＡＢＡ－Ｔ遺伝子の上流に位置する調節配列として、例えば、表１に示す各配列番号によって特定されるＤＮＡ配列が挙げられる。また、トマトに関しては、後述の実施例に示すとおり、配列番号：１に記載の２０５６～２４２２位からなるＤＮＡ配列が挙げられ、より好ましくは、配列番号：１に２０５６～２３１４位からなるＤＮＡ配列が挙げられる。
　また、後述の実施例に示す、配列番号：１に記載の２０５６～２４２２位からなるＤＮＡ配列には、転写量を調節し得る配列として、ＴＡＴＡ　ＢＯＸ及びイニシエーターが含まれている。具体的には、ＴＡＴＡ　ＢＯＸとして、ＴＡＴＡＢＯＸ２（ＰＬＡＣＥ　ＩＤ：Ｓ０００１０９、ＤＮＡ配列：ＴＡＴＡＡＡＴ）、ＴＡＴＡＢＯＸ３（ＰＬＡＣＥ　ＩＤ：Ｓ０００１１０、ＤＮＡ配列：ＴＡＴＴＡＡＴ）、ＴＡＴＡＢＯＸ５（ＰＬＡＣＥ　ＩＤ：Ｓ０００２０３、ＤＮＡ配列：ＴＴＡＴＴＴ）が含まれる。また、イニシエーターとして、ＩＮＲＮＴＰＳＡＤＢ（ＰＬＡＣＥ　ＩＤ：Ｓ０００３９５、ＤＮＡ配列：ＹＴＣＡＮＴＹＹ）が含まれる。一方、上記配列番号：１６～３０によって特定されるＤＮＡ配列のいずれにおいても、かかるＴＡＴＡ　ＢＯＸ及びイニシエーターは含まれている。よって、これら配列は、好適な変異導入の対象となり得る。
　なお、自然界においてＤＮＡ配列は変異し得る。また、同一種の同一遺伝子に関する配列でも異なり得る（遺伝的多型）。よって、本発明において、後述の変異が導入される調節配列には、上記典型的なＤＮＡ配列に限定されることなく、それらに対応する配列も含まれ得る。ここで「対応する配列」とは、上記典型的なＤＮＡ配列（例えば、上記各配列番号によって特定されるＤＮＡ配列又はその部分配列）と同一であるか、それと高い相同性又は同一性を有するＤＮＡ配列を意味する。ここで「高い」とは、少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上）、さらに好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）のことである。配列の相同性又は同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴのプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３－４１０，１９９０）を利用して決定することができる。該プログラムは、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４－２２６８，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３－５８７７，１９９３）に基づいている。かかる解析方法の具体的な手法は公知であるが、ＢＬＡＳＴによってＤＮＡ配列を解析する場合には、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴプログラムの実施においては、当該プログラムのデフォルトパラメーターを用いることも出来る。
　本発明において、上述の調節配列に導入される変異としては、例えば、１若しくは複数のＤＮＡの欠失、挿入及び／又は置換が挙げられるが、好ましくは１若しくは複数のＤＮＡの欠失である。ここで「複数」とは、ＧＡＢＡ－Ｔ遺伝子の発現（転写等）を抑制し、ＧＡＢＡ含有量を向上し得る限り特に制限はないが、例えば、下限としては、２塩基以上、３塩基以上、５塩基以上、１０塩基以上、２０塩基以上、３０塩基以上、５０塩基以上、１００塩基以上、２００塩基以上、５００塩基以上、１０００塩基以上、２０００塩基以上が挙げられる。上限としては、例えば、２５００塩基以下、２０００塩基以下、１５００塩基以下、１０００塩基以下、５００塩基以下、２００塩基以下、１００塩基以下、５０塩基以下、４０塩基以下、２０塩基以下、１０塩基以下、５塩基以下が挙げられる。上述の調節配列に導入される欠失、挿入及び／又は置換の塩基数として、より具体的には、例えば、２～２５００塩基、２０～２０００塩基、５０～１５００塩基、１００～１０００塩基、２００～５００塩基（２５０～４５０塩基、３００～４００塩基、３５０～３７０塩基（特に３６７塩基））が挙げられる。さらにまた、２～３００塩基、３～２００塩基、５～１００塩基、１０～５０塩基、３０～４０塩基が挙げられる。また、本発明において調節配列に導入される変異の個数（箇所数）としても、ＧＡＢＡ－Ｔ遺伝子の発現（転写等）を抑制し、ＧＡＢＡ含有量を向上し得る限り、特に制限はなく、１個でもよく、また複数個（例えば、２個、３個以下、５個以下、１０個以下、２０個以下、３０個以下、４０個以下、５０個以下）でもよい。
　本発明にかかる調節配列への変異の導入は、当業者であれば公知の変異導入方法により達成することができる。かかる公知の方法としては、ゲノム編集法、物理的変異導入法、化学的変異剤を用いる方法、トランスポゾン等をゲノムＤＮＡに導入する方法が挙げられるが、これらに限定はされない。
　「ゲノム編集法」は、部位特異的なヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素等のＤＮＡ二本鎖切断酵素）を利用して、標的遺伝子を改変する方法である。例えば、ＺＦＮｓ（米国特許６２６５１９６号、８５２４５００号、７８８８１２１号、欧州特許１７２０９９５号）、ＴＡＬＥＮｓ（米国特許８４７０９７３号、米国特許８５８６３６３号）、ヌクレアーゼドメインが融合されたＰＰＲ（ｐｅｎｔａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅｒｅｐｅａｔ）（Ｎａｋａｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　５３：１１７１－１１７９（２０１２））等の融合タンパク質や、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９（米国特許８６９７３５９号、国際公開２０１３／１７６７７２号）、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１（Ｚｅｔｓｃｈｅ　Ｂ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６３（３）：７５９－７１，（２０１５））やＴａｒｇｅｔ－ＡＩＤ（Ｋ．Ｎｉｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｕｓｉｎｇ　ｈｙｂｒｉｄ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ａｎｄ　ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　ａｄａｐｔｉｖｅ　ｉｍｍｕｎｅ　ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ８７２９，（２０１６））等のガイドＲＮＡとタンパク質の複合体、あるいはタンパク質の複合体を用いる方法が挙げられる。
　「Ｃａｓ酵素」としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素、II型ＣＲＩＳＰＲ系酵素、III型ＣＲＩＳＰＲ系酵素等が挙げられるが、II型ＣＲＩＳＰＲ系酵素であるＣａｓ９が好ましい。「Ｃａｓ９」としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のＣａｓ９、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９、Ｓ．サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９等が挙げられるが、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）が好ましい。また、これらの生物に由来するＣａｓ９の変異体であってもよく、ニッカーゼ（一方のＤＮＡ鎖のみにｎｉｃｋを入れるＤＮＡ切断酵素）として機能することが知られているＣａｓ９のＤ１０Ａ変異体であってもよく、Ｃａｓ９ホモログ、又はオルソログであってもよい。
　「物理的変異導入法」としては、例えば、重イオンビーム（ＨＩＢ）照射、速中性子線照射、ガンマ線照射、紫外線照射が挙げられる（Ｈａｙａｓｈｉら、Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｉｒ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２００７年、第１８回国際会議、２３７～２３９ページ、及び、Ｋａｚａｍａら、Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００８年、２５巻、１１３～１１７ページ　参照）。
　「化学的変異剤を用いる方法」としては、例えば、化学変異剤によって種子等を処理する方法（Ｚｗａｒ及びＣｈａｎｄｌｅｒ、Ｐｌａｎｔａ、１９９５年、１９７巻、３９～４８ページ等　参照）が挙げられる。化学変異剤としては特に制限はないが、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソウレア（ＭＮＵ）、エチルメタンスルホート（ＥＭＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－ニトロソウレア（ＥＮＵ）、アジ化ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、ヒドリキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトログアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、Ｏ－メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、蟻酸及びヌクレオチド類似体が挙げられる。
　「トランスポゾン等をゲノムＤＮＡに導入する方法」としては、例えば、ＴＯＳ１７等のトランスポゾン、Ｔ－ＤＮＡ等を植物のゲノムＤＮＡに挿入する方法が挙げられる（Ｋｕｍａｒら、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ．、２００１年、６巻、３号、１２７～１３４ページ、及び、Ｔａｍａｒａら、Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年、４巻、３号、９０～９６ページ　参照）。
　以上の方法により変異が導入された植物については、公知の方法により、本発明にかかる調節配列に変異が導入されていることを確認することができる。かかる公知の方法としては、例えば、ＤＮＡシークエンス法（次世代シークエンシング法等）、ＰＣＲ法、マイクロアレイを用いた解析法、サザンブロット法が挙げられる。かかる方法によれば、本発明にかかる調節配列に変異が導入されているか否かを、変異導入前後の当該調節配列又はその長さを比較することによって判断することができる。
　また、本発明にかかる調節配列に変異が導入されていることを確認する他の方法として、ＴＩＬＬＩＮＧ（標的誘導型ゲノム特定位傷害、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　Ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｌｏｃａｌ　Ｌｅｓｉｏｎｓ　ＩＮ　Ｇｅｎｏｍｅｓ）が挙げられる（Ｓｌａｄｅら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓ．、２００５年、１４巻、１０９～１１５ページ、及び、Ｃｏｍａｉら、Ｐｌａｎｔ　Ｊ．、２００４年、３７巻、７７８～７８６ページ　参照）。特に、前述の重イオンビーム照射や化学的変異剤等を用いて植物のゲノム中に非選択的変異を導入した場合には、本発明にかかる調節配列又はその一部をＰＣＲで増幅した後に、該増幅産物に変異を有する個体を、前記ＴＩＬＬＩＮＧ等により選抜することができる。
　また、上述の方法により変異が導入された植物と野生型のそれとを交配させ、戻し交配を行うことにより、目的とする本発明にかかる調節配列以外に導入された変異を除去することもできる。
　本発明にかかる調節配列に変異を導入することにより、ＧＡＢＡの含有濃度が向上された植物が、野生型と本発明にかかる調節配列における変異からなるヘテロ接合体である場合がある。そのような場合、例えば、かかるヘテロ同士を交配してＦ１植物体を得ることにより、当該Ｆ１植物体から当該変異が導入されたＧＡＢＡ－Ｔ遺伝子の調節配列を有するホモ接合体を選抜する。この場合、「当該変異が導入されたＧＡＢＡ－Ｔ遺伝子の調節配列を有するホモ接合体である植物」には、互いに同一である変異を有するＧＡＢＡ－Ｔ遺伝子の調節配列（ａｌｌｅｌｅ）を２つ有する植物だけでなく、第１の変異を有する第１のＧＡＢＡ－Ｔ遺伝子の調節配列と、第２の変異を有する第２のＧＡＢＡ－Ｔ遺伝子の調節配列とを有する植物が含まれる。
　本発明において、本発明にかかる調節配列への変異の導入は、上述の方法等に応じ、植物体、種子又は植物細胞に対して行うことができる。植物細胞には、植物由来の培養細胞の他、植物体中の細胞も含まれる。さらに、種々の形態の植物由来の細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルス、未熟胚、花粉等が含まれる。
　また、本発明において、上述の、部位特異的ヌクレアーゼ、融合タンパク質又はガイドＲＮＡとタンパク質の複合体をコードするＤＮＡ、トランスポゾンをコードするＤＮＡ等を、ベクターに挿入した形態にて、植物の細胞に導入してもよい。
　本発明にかかる調節配列に変異を導入するための前記ＤＮＡが挿入されるベクターとしては、植物の細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はないが、前記ＤＮＡを恒常的又は誘導的に発現させるためのプロモーターを含有しうる。恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、イネのユビキチンプロモーター、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター、イネのアクチンプロモーター、トウモロコシのユビキチンプロモーター等が挙げられる。また、誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布等の外因によって発現することが知られているプロモーター等が挙げられる。さらに、本発明にかかるＤＮＡとしてガイドＲＮＡ等の短いＲＮＡをコードするＤＮＡを発現させるためのプロモーターとしては、Ｕ６プロモーター等ｐｏｌIII系のプロモーターが好適に用いられる。
　植物細胞へ前記ＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されたベクター等を導入する方法としては、例えば、アグロバクテリウムを介する方法（アグロバクテリウム法）、パーティクルボンバードメント法、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）等、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。なお、ＤＮＡの形態をとらずとも、上述の部位特異的ヌクレアーゼ、融合タンパク質、トランスポゾンは、タンパク質として、上述のガイドＲＮＡは、ＲＮＡとして、植物の細胞に導入しても、変異を導入することはできる。
　このように、本発明においては、前記ＤＮＡ、該ＤＮＡが挿入されたベクター、前記タンパク質、前記ＲＮＡといった、本発明にかかる調節配列を標的とする物質を用いることにより、植物におけるＧＡＢＡ含有量を向上させることができる。したがって、本発明は、前記ＤＮＡ、該ＤＮＡが挿入されたベクター、前記タンパク質及び前記ＲＮＡからなる群から選択される、本発明にかかるＧＡＢＡ－Ｔ遺伝子の調節配列を標的とする少なくとも１の物質を有効成分として含む、植物においてＧＡＢＡ含有量を向上させるための薬剤も提供し得る。
　かかる薬剤においては、２種の有効成分を１つの組成物中に含む態様であってもよく、２種の有効成分を別々の組成物中に含む態様（所謂、キット）であってもよい。また、本発明の薬剤においては、上記物質の他、緩衝液、安定剤、保存剤、防腐剤等の他の成分が添加してあってもよい。
　また、上述の方法等により本発明にかかる調節配列に変異を導入された細胞から植物体を再生することにより、ＧＡＢＡ含有量を向上させた植物を得ることができる。例えば、トマトであれば、Ｓｕｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　ｃｅｌｌ　ｐｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００６；４７（３）：４２６－４３１、Ｓｏｎｉａ　Ｈａｍｚａ，Ｙｖｅｓ　Ｃｈｕｐｅａｕ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．，４４：１８３７－１８４５，１９９３に記載された方法が挙げられる。さらに、他の植物種であっても、Ｔａｂｅｉら（田部井豊　編、「形質転換プロトコール［植物編］」、株式会社化学同人、２０１２年９月２０日出版）に記載の方法等を用い、形質転換及び植物体への再生を行なうことができる。
　さらに、このようにして得られる植物体から、ＧＡＢＡの含有濃度が向上された可食部を得ることも出来る。したがって、本発明は、上述の方法によりＧＡＢＡの含有濃度が向上された植物体を製造する工程と、当該植物体から可食部を得る工程とを含む、ＧＡＢＡの含有濃度が向上された可食部の製造方法も、提供する。なお、可食部については、上述のとおりであり、その植物体からの取得は、当業者であれば、各種植物又は可食部の種類に応じて適宜調製して行うことが出来る。
　また、上述の方法等により、本発明にかかる調節配列に人為的に変異が導入され、ＧＡＢＡの含有濃度が向上された植物を得ることができる。したがって、本発明は、ＧＡＢＡ－Ｔ遺伝子の上流に位置する調節配列に、人為的に変異が導入され、前記遺伝子の発現が抑制されている、ＧＡＢＡの含有濃度が向上された植物体又はその可食部に関する。
　なお、かかる植物体は、ＲＮＡｉによるＧＡＢＡ－Ｔ　ｍＲＮＡの分解（非特許文献４）では報告されていた不稔及び矮化は生じない。ここで、「不稔」とは、次の世代の植物として発達し得る種子が生じないことを意味する。また「矮化」とは、本発明における変異導入前の植物と比較して、小型のまま成熟することを意味し、「矮化が生じない」とは矮化の程度が小さい状態も含み得る。より具体的には、例えば、トマトにおいては、栄養成長から生殖成長に切り替わった、開花期以降（播種後およそ４０日以降、例えば播種後８０日目）における草丈が、本発明における変異導入前の植物と比較して、７０％以下となることが挙げられる。
　また、本発明にかかる調節配列、それへの変異の導入、該変異導入によってＧＡＢＡの含有濃度が向上された植物体又はその可食部については、上述のとおりである。また、一旦、本発明にかかる調節配列に人為的に変異が導入され、ＧＡＢＡの含有濃度が向上された植物体が得られれば、該植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることが可能である。さらに、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、切穂、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。したがって、本発明には、ＧＡＢＡの含有濃度が向上された植物の子孫及びクローン、並びに、それらの繁殖材料が含まれる。なお、繁殖材料としては、例えば、種子、株、カルス、プロトプラストが挙げられる。
　また、前記有性生殖においては、他の系統（他の品種等）と交配させることにより、ＧＡＢＡの含有濃度の向上を更に高めたり、また他の形質（例えば、病害耐性、除草剤耐性、害虫耐性、食味向上、保存性向上、収量向上）が付与された子孫を得ることも可能である。ＧＡＢＡの含有濃度の向上を更に高めるという観点からは、例えば、後述の実施例に示すとおり、ＧＡＤにおいてＣ末端自己抑制ドメインの機能が喪失している植物体との交配が、挙げられる。当該交配によって、ＧＡＢＡ－Ｔ遺伝子の上流に位置する調節配列に、人為的に変異が導入され、前記遺伝子の発現が抑制されており、ＧＡＤにおいてＣ末端自己抑制ドメインの機能が喪失している、ＧＡＢＡの含有濃度が向上された植物体を、得ることが出来る。
　本発明において、「グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）」は、グルタミン酸からＧＡＢＡへの転化反応を触媒する酵素（ＥＣ番号：４．１．１．１５として登録されている酵素）である。例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ上で「Ｇｌｕｔａｍａｔｅ　ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ」に属するタンパク質、「ＧＡＤ」に属する遺伝子がコードするタンパク質が挙げられる。具体例として、トマト由来であれば、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション：Ｂ１Ｑ３Ｆ２によって特定されるタンパク質等が挙げられる。また、各種植物由来のＧＡＤ遺伝子に関し、参照データベースと共にそれらにおける各登録ＩＤ（遺伝子ＩＤ）を表２に示す。また、ＧＡＤにおいて機能喪失の対象となる「Ｃ末端自己抑制ドメイン」とは、Ｃ末端に位置する約３０アミノ酸（例えば、２２～２５アミノ酸）からなる、カルモジュリン結合ドメイン（ＣａＭ　ＢＤ）であり、ＧＡＤの酵素活性を非活性化するための自己抑制（自己阻害）ドメインとして機能する。かかる機能喪失としては、例えば、Ｃ末端自己抑制ドメインの全部又は一部の欠失が挙げられる。また、かかる機能喪失した植物体又は植物細胞は、当業者であれば、上記ＧＡＢＡ－Ｔ遺伝子の調節配列を標的とする変異導入同様に、ゲノム編集等の公知の手法を用いて適宜調製することが出来る（例えば、非特許文献３）。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、以下に示す各実験にて用いたｇＲＮＡをコードするＤＮＡ及びプライマーの配列を表３に示す。
　＜ＧＡＢＡ代謝関連遺伝子の上流配列を標的としたゲノム編集＞
　供試植物として、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ　Ｌ．）の矮性モデル品種であるＭｉｃｒｏ－Ｔｏｍを用いた。Ｓｏｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　Ｎｅｔｗｏｒｋ（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｏｌｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｎｅｔ）を用い、ＧＡＢＡ代謝関連遺伝子（トマト由来γ－アミノ酪酸アミノ基転移酵素（ＧＡＢＡ－Ｔ）遺伝子（ＳｌＧＡＢＡ－Ｔ１（Ｓｏｌｙｃ０７ｇ０４３３１０）遺伝子））の開始コドンより上流２５００塩基のゲノム配列を取得した（配列番号：１）。
　開始コドンより８１塩基、４４８塩基、１，１０３塩基、１，３８２塩基上流に位置するＰＡＭ配列（ＮＧＧ）を利用して４つのｇＲＮＡを設計し（配列番号：２、３、４及び５）、これら４つの標的配列を発現カセットに含むベクターを構築した（図１）。形質転換にはＭｉｃｒｏ－Ｔｏｍに最適化したアグロバクテリウム法（Ｓｕｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　ｃｅｌｌ　ｐｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００６；４７（３）：４２６－４３１）を用い、前記ベクターを導入したアグロバクテリウムを、Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ（野生型）の子葉外植片に感染させ、その核ゲノムに図１に示す発現カセットを導入した。カナマイシンを含む一連の選抜培地から再分化した植物体を形質転換体の候補として一次選抜した。
　続いて、形質転換体であることを確認するため、トマトの若葉からゲノムＤＮＡを抽出し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターに特異的に結合するプライマー（配列番号：６及び７）を用いて、トマト核ゲノムにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターが導入されているかを確認した。
　また、標的配列の近傍に変異が生じているかを確認するため、サンガーシークエンスを行った。先ず、トマトから抽出したゲノムＤＮＡと標的配列の周辺に設計したプライマー（配列番号：８、９、１０及び１１）を用いて標的配列近傍のＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。増幅したＰＣＲ断片をシーケンスのテンプレートとし、ＳｌＧＡＢＡ－Ｔ１上流配列特異的プライマーを用いたサンガーシーケンスに供試した（ｇＲＮＡ１の解析には配列番号：８を、ｇＲＮＡ２の解析には配列番号：９を、ｇＲＮＡ３の解析には配列番号：１０を、ｇＲＮＡ４の解析には配列番号：１１をそれぞれ使用した）。
　その結果、１系統においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターの導入と変異の導入が確認された。
　＜ＧＡＢＡ代謝関連遺伝子ゲノム編集体の解析＞
　次に、変異アリルのバリエーションを増やすため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを保持するＴ０個体１系統と野生型のＭｉｃｒｏ－ＴｏｍあるいはＳｌＧＡＤ３のゲノム編集により果実のＧＡＢＡ蓄積量が向上したＭｉｃｒｏ－Ｔｏｍ　ＳｌＧＡＤ３変異体とを交配させた。交配によって獲得したＦ１系統をさらに自殖させ、その後代において変異をホモに有し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターが抜け落ちたヌルセグリガントを獲得した（図２）。
　なお、ＳｌＧＡＤ３変異体においては、ゲノム編集によって、ＧＡＤ３のＣ末端自己抑制ドメインが欠失している。Ｎｏｎａｋａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１７；７（１），７０５７　参照。以下、ＳｌＧＡＤ３変異体については、「ＳｌＧＡＤ３ΔＣ」とも称する）。野生型及びＳｌＧＡＤ３ΔＣのアミノ酸配列を、配列番号：１４及び１５に各々示す。Ｃ末端自己抑制ドメインは、配列番号：１４に記載のアミノ酸配列において、４５５位のアスパラギンから最後（４８４位）のアミノ酸（システイン）までの３０アミノ酸である。
　続いて、獲得した変異ホモのヌルセグリガント個体を、閉鎖系栽培室にて栽培し、果実のＧＡＢＡ含有量の測定とＳｌＧＡＢＡ－Ｔ１遺伝子の発現解析を行なった。ＧＡＢＡ含有量の測定にはＧＡＢＡ測定キット（株式会社エンザイム・センサ）を用いた。方法はキットに付属のマニュアルに準拠した。また、ＳｌＧＡＢＡ－Ｔ１遺伝子の発現解析にはｑＲＴ－ＰＣＲ法を用い、プライマーにはＳｌＧＡＢＡ－Ｔ１特異的プライマー（配列番号１２及び１３）を用いた。
　そして、ＳｌＧＡＤ３ΔＣをバックグラウンドとし、ｇＲＮＡ１及びｇＲＮＡ２に挟まれた領域（開始コドンより７９～４４５塩基からなる領域（配列番号：１に記載の塩基配列においては２０５６～２４２２塩基からなる領域）：３６７塩基）が欠失している系統（図３、以下「ＳｌＧＡＤ３ΔＣ＋ＳｌＧＡＢＡ－Ｔ１Δｐｒｏ」とも称する）を解析した結果、果実においてＳｌＧＡＢＡ－Ｔ１遺伝子の発現抑制が認められた（図４、野生型と比較して未熟期で７９％、催色期で６６％、赤熟期で３３％の低下）。さらに、果実におけるＧＡＢＡの蓄積量については増加が認められた（図５、赤熟期で野生型の１３倍、ＳｌＧＡＤ３ΔＣの２倍の増加）。一方、ＳｌＧＡＤ３ΔＣ＋ＳｌＧＡＢＡ－Ｔ１Δｐｒｏにおいて矮化や不稔形質は確認されなかった（図６）。
　以上説明したように、本発明によれば、ＧＡＢＡ－Ｔ遺伝子上流の調節配列に変異を導入することによって、不良形質を伴わずにＧＡＢＡ含有量を高められることが可能となる。したがって、本発明は、血圧上昇の抑制、ストレスの緩和、睡眠の質の改善、肌の弾力の維持等において有用である。

Claims (10)

  1. 　γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の含有濃度が向上された植物体の製造方法であって、
    （１）植物細胞において、γ－アミノ酪酸アミノ基転移酵素（ＧＡＢＡ－Ｔ）遺伝子の上流に位置する調節配列に、変異を導入し、前記遺伝子の発現を抑制する工程と、
    （２）前記工程（１）において前記遺伝子の発現が抑制された植物細胞から、植物体を再生する工程とを含む、製造方法。
  2. 　前記植物細胞がトマトの細胞であり、前記調節配列における配列番号：１に記載のＤＮＡ配列又はそれに対応する配列に、前記変異を導入する、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記植物細胞がトマトの細胞であり、前記調節配列における配列番号：１に記載の２０５６～２４２２位からなるＤＮＡ配列又はそれに対応する配列に、前記変異を導入する、請求項１に記載の製造方法。
  4. 　（３）前記工程（２）において得られた植物体と、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）においてＣ末端自己抑制ドメインの機能が喪失している植物体とを、交配させる工程を、更に含む、請求項１に記載の製造方法。
  5. 　請求項１～４のうちのいずれか１項に記載の方法によりＧＡＢＡの含有濃度が向上された植物体を製造する工程と、当該植物体から可食部を得る工程とを含む、ＧＡＢＡの含有濃度が向上された可食部の製造方法。
  6. 　ＧＡＢＡ－Ｔ遺伝子の上流に位置する調節配列に、人為的に変異が導入され、前記遺伝子の発現が抑制されている、ＧＡＢＡの含有濃度が向上された植物体。
  7. 　前記調節配列における配列番号：１に記載のＤＮＡ配列又はそれに対応する配列に、前記変異が導入されている、トマトの植物体である、請求項６に記載の植物体。
  8. 　前記調節配列における配列番号：１に記載の２０５６～２４２２位からなるＤＮＡ配列又はそれに対応する配列に、前記変異が導入されている、トマトの植物体である、請求項６に記載の植物体。
  9. 　更に、ＧＡＤにおいてＣ末端自己抑制ドメインの機能が喪失している、請求項６に記載の植物体。
  10. 　請求項６～９のうちのいずれか１項に記載の植物体の可食部。
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