WO2025159486A1 - 여러 가지 폴리(에스터 아마이드)의 제조방법 - Google Patents

여러 가지 폴리(에스터 아마이드)의 제조방법

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WO2025159486A1
WO2025159486A1 PCT/KR2025/001208 KR2025001208W WO2025159486A1 WO 2025159486 A1 WO2025159486 A1 WO 2025159486A1 KR 2025001208 W KR2025001208 W KR 2025001208W WO 2025159486 A1 WO2025159486 A1 WO 2025159486A1
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recombinant microorganism
poly
transferase
ester amide
coenzyme
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PCT/KR2025/001208
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Inventor
이상엽
최소영
안다희
채동언
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Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Original Assignee
Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant microbial enzyme metabolically engineered and a method for producing poly(ester amide) using the same, and more particularly, to a recombinant microorganism into which a gene encoding a coenzyme A transferase using an organic acid containing an amino acid as a substrate and a gene encoding a PHA synthase have been introduced or amplified, and a method for producing poly(ester amide) using the same.
  • Poly(ester amide) is a polymer that contains both ester and amide bonds. These properties give poly(ester amide) the advantages of both polyester and polyamide. Although there have been no successful cases of poly(ester amide) production to date, many studies have reported the production of naturally occurring polyesters known as polyhydroxyalkanoates using metabolic engineering (Choi et al., Adv. Mat. 32: 1-37, 2020). Furthermore, there have been reports of the biosynthesis of poly(lactate-ran-glycolate) and poly(3-hydroxybutyrate-ran-phenyllactate), polyesters that did not exist in nature, using microorganisms through systems metabolic engineering (Choi et al., Nat. Biotech. 34: 435-440, 2016; Yang et al., 9:79, 2018).
  • polyester amide can be biosynthesized using a recombinant microorganism into which genes for an enzyme that converts amino acid as a substrate into aminoacyl-CoA and an enzyme that polymerizes aminoacyl-CoA have been introduced, thereby completing the present invention.
  • the purpose of the present invention is to provide a recombinant microorganism capable of producing poly(ester amide) from various carbon sources.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing poly(ester amide) using the recombinant microorganism.
  • the present invention provides a recombinant microorganism having the ability to produce poly(ester amide) from a carbon source, in which a gene encoding coenzyme A transferase and a gene encoding polyhydroxyalkanoate synthase are introduced or amplified.
  • the present invention also provides a method for producing poly(ester amide), comprising the steps of: (a) culturing a recombinant microorganism of the present invention to produce poly(ester amide); and (b) recovering the produced poly(ester amide).
  • the present invention also comprises the steps of: (a) culturing the recombinant microorganism of the present invention in a medium supplemented with an organic acid that serves as a substrate for coenzyme A transferase to produce poly(ester amide); and
  • the present invention also provides a poly(ester amide) manufactured by the above manufacturing method.
  • Figure 1 illustrates the metabolic pathways that produce various poly(ester amides) and the amino acid monomers contained in these poly(ester amides).
  • Newly designed metabolic reactions that do not exist in nature for the biosynthesis of poly(ester amides) are indicated by red arrows.
  • Naturally occurring metabolic pathways that synthesize polyhydroxyalkanoates are indicated by black arrows.
  • Amino acid monomers that can be polymerized by these metabolic pathways are indicated in gray boxes.
  • Amine and amide functional groups are indicated in pink. Hydroxyl and ester functional groups are indicated in blue.
  • the indicated genes represent the following enzymes: act, ⁇ -alanine CoA transferase; pct540, engineered propionate CoA transferase; phaC, polyhydroxyalkanoate synthase.
  • Abbreviations for the chemicals are as follows: 3AB, 3-aminobutyrate; 3AIB, 3-aminoisobutyrate; 3AP, 3-aminopropionate; 3AV, 3-aminovalerate; 4AB, 4-aminobutyrate; 5AV, 5-aminovalerate.
  • Figure 2 shows the results of analyses to confirm the biosynthesis of poly(ester amide) containing various amino acid monomers.
  • a Schematic diagram of culturing PEA01 strain in MR medium supplemented with (RS)-3HB and target amino acids. Multiple metabolic pathways are indicated by black dotted arrows.
  • b Fractions of amino acid monomers in polymers obtained by culturing PEA00 and PEA01 strains according to the schematic diagram in (a).
  • c Mass spectra of 3AP, (R)-3AB, 3AIB, (R)-3AV, 4AB, and 5AV monomers and their corresponding standard chemicals.
  • the indicated genes represent the following enzymes, respectively: act, ⁇ -alanine CoA transferase; ldhA, (R)-lactate dehydrogenase; pct540, engineered propionate CoA transferase; phaC1437Ps6-19, engineered Pseudomonas sp. MBEL 6-19 polyhydroxyalkanoate synthase.
  • 3AB 3-aminobutyrate
  • 3AIB 3-aminoisobutyrate
  • 3AP 3-aminopropionate
  • 3AV 3-aminovalerate
  • 3HB 3-hydroxybutyrate
  • 4AB 4-aminobutyrate
  • 5AV 5-aminovalerate
  • 6AC 6-aminocaproate
  • 7AH 7-aminoheptanoate.
  • Figure 3 shows the results of an analysis confirming the biosynthesis of poly(ester amide) containing multiple amino acid monomers at once.
  • the fraction of 3AP, (R)-3AB, or (R)-3AV monomers was measured.
  • the fractions of 3AP, (R)-3AB, or (R)-3AV are indicated in pink, yellow, and orange, respectively.
  • Abbreviations for the chemicals are as follows: 3AP, 3-aminopropionate; 3AV, 3-aminovalerate.
  • Figure 4 shows the results of analyzing the reactivity of purified beta-alanine coenzyme A transferase to various substrates.
  • a Schematic diagram showing the in vitro assay of Act for various substrates classified as amino acids, hydroxy acids, or carboxylic acids.
  • b Enzymatic activity of Act for amino acids, hydroxy acids, or carboxylic acids.
  • c Chemical structures of substrates on which Act showed activity.
  • Figure 5 shows a schematic diagram of a strain producing poly(ester amide) using glucose as the sole carbon source, the results of analysis, and the production of poly(ester amide) through fed-batch fermentation.
  • a Schematic diagram of culturing the PEA06 strain in MR medium.
  • b The fraction of 3AP monomer in the polymer obtained by culturing the PEA06 strain according to the schematic diagram in (a).
  • c Schematic diagram of culturing the PEA07 strain in MR medium.
  • d The fraction of 4AB monomer in the polymer obtained by culturing the PEA07 strain according to the schematic diagram in (c). Multiple metabolic pathways are indicated by black dotted arrows. Inactivated reactions are indicated by red “X” marks.
  • e Fed-batch fermentation profile of the PEA06 strain using glucose as the sole carbon source.
  • Cell concentration, polymer content, and glucose concentration are indicated by gray, orange, white, and black circles, respectively.
  • Abbreviations for the chemicals are: 3-aminopropionate; 3HB, 3-hydroxybutyrate; 4AB, 4-aminobutyrate; AKG, ⁇ -ketoglutarate; PEP, phosphoenolpyruvate; LA, lactate.
  • Figure 6 shows the results showing that poly(3-hydroxybutyrate-ran-3-aminopropionate), a representative poly(ester amide), can be biosynthesized using various polyhydroxyalkanoate synthases.
  • the indicated genes represent the following enzymes: wild-type class I PhaCs (PhaCCne, PhaCAca, PhaCAhy, PhaCAsa, respectively) derived from C. necator, Aeromonas caviae, Aeromonas hydrophila, and Aeromonas salmonicida, and Pseudomonas sp.
  • MBEL 6-19 Pseudomonas sp.
  • PhaCs (PhaC1437Ps6-19, PhaC1437Ps61-3, PhaC1437Ppu, PhaC1437Pae, PhaC1437Pch, PhaC1437Pre, respectively) from strains 61-3, Pseudomonas putida KT2440, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Pseudomonas chlororaphis, and Pseudomonas resinovorans.
  • poly(ester amide) can be synthesized from various carbon sources (e.g., amino acids, sugars, organic acids, etc.) using a recombinant microorganism into which a gene encoding coenzyme A transferase using various amino acids as substrates and a gene encoding polyhydroxyalkanoate synthase were introduced.
  • various carbon sources e.g., amino acids, sugars, organic acids, etc.
  • a recombinant microorganism additionally introduced with a gene capable of synthesizing hydroxy acids and amino acids from glucose can synthesize poly(ester amide) using glucose as a single carbon source.
  • the present invention relates, from one aspect, to a recombinant microorganism having the ability to synthesize poly(ester amide) into which a gene encoding coenzyme A transferase and a gene encoding polyhydroxyalkanoate synthase are introduced or amplified.
  • the recombinant microorganism may be characterized in that a gene encoding one or more types of coenzyme A transferase and a gene encoding one or more types of PHA synthase (polyhydroxyalkanoate synthase) are introduced.
  • the recombinant microorganism can synthesize a poly(ester amide) containing an organic acid containing an amino acid as a precursor and a monomer thereof.
  • the recombinant microorganism of the present invention may be characterized in that i) Coenzyme A transferase introduced or amplified catalyzes the synthesis of acyl-CoA using an organic acid containing an amino acid as a precursor, and ii) PHA synthase catalyzes the synthesis of poly(ester amide) through polymerization of the synthesized acyl-CoA.
  • Coenzyme A transferase refers to a transferase that catalyzes the transfer reaction of a coenzyme A group from an acyl-CoA donor to a carboxylic acid.
  • the coenzyme A transferase may be characterized by catalyzing the synthesis of aminoacyl-CoA using an amino acid as a substrate.
  • the amino acid is used to mean both protein-forming amino acids and non-protein-forming amino acids that constitute proteins.
  • the amino acid may be a non-protein amino acid.
  • the non-protein amino acid means all organic acids containing an amino group (-NH2) and a carboxyl group (-COOH) in addition to the protein-forming amino acids.
  • the non-protein amino acid may be selected from the group consisting of, for example, 2-aminobutyrate, 3-aminopropionate, isoserine, 3-aminobutyrate, 3-aminovalerate, beta-phenylalanine (BPA), 4-aminobutyrate, 4-amino-3-methylbutyrate, 5-aminovalerate, 6-aminocaproate, 7-aminoheptanoate, 3-aminoisobutyrate, para-aminobenzoate (PAB) and isomers thereof. It is not limited to this.
  • BPA beta-phenylalanine
  • PAB para-aminobenzoate
  • the carboxylic acid may preferably be a hydroxy acid containing a hydroxyl group.
  • the hydroxy acid includes all organic acids containing a hydroxyl group (-OH) and a carboxyl group (-COOH) in addition to the protein constituent amino acids.
  • the hydroxy acid may be selected from the group consisting of, for example, glycolate, lactate, 2-hydroxybutyrate, 3-hydroxypropionate, 3-hydroxybutyrate, carboxylic acids containing a carbon chain longer than that, and isomers thereof, but is not limited thereto.
  • the carboxylic acid may be selected from the group consisting of, but is not limited to, amino acids and hydroxy acids, carboxylic acids and isomers thereof, including, for example, propionate, butyrate, isobutyrate, valerate, isovalerate, 2-methylbutyrate, caproate, malonate, succinate, and carboxylic acids having a carbon chain longer than or equal to that of the amino acid and the hydroxy acid.
  • the isomer may be a structural isomer or a stereoisomer.
  • the carboxylic acid is an amino acid or a hydroxy acid
  • the isomer includes, but is not limited to, a (R)-form or (S)-form stereoisomer.
  • the coenzyme A transferase includes a wild type, a naturally occurring mutant, or an artificially engineered mutant.
  • it may be characterized by being at least one selected from the group consisting of beta-alanine coenzyme A transferase, propionate coenzyme A transferase, and isocaprenyl coenzyme A:2-hydroxyisocaproyl coenzyme A transferase.
  • the sequence of the gene encoding the coenzyme A transferase can be easily obtained from a database widely used in the art or from the amino acid sequence of the coenzyme A transferase described above.
  • the sequence of the gene encoding the coenzyme A transferase can be codon optimized to be suitable for the host microorganism through a method well known in the art.
  • coenzyme A transferase comprising sequence number 1 can use various organic acids as substrates.
  • the substrate is a carboxylic acid, preferably an amino acid or a hydroxy acid, most preferably, glycine, alanine (preferably (S)-alanine), 2-aminobutyrate, 3-aminobutyrate, 3-aminoisobutyrate, 3-aminovalerate, beta-phenylalanine (BPA), 4-aminobutyrate, para-aminobenzoate (PAB), 5-aminovalerate, 6-aminocaproate, 7-aminoheptanoate, glycolate, lactate, 2-hydroxybutyrate, It may be characterized by being selected from the group consisting of 3-hydroxypropionate, 3-hydroxybutyrate, propionate, butyrate, isobutyrate, valerate, isovalerate, 2-methylbutyrate, caproate, malonate, succinate and isomers thereof, but is not
  • the isomer may be a structural isomer or a stereoisomer.
  • the isomer when the carboxylic acid is an amino acid or a hydroxy acid, the isomer may be, for example, an (R)-form or (S)-form stereoisomer, more preferably an (R)-form isomer.
  • polyhydroxyalkanoate synthase refers to an enzyme that synthesizes polyhydroxyalkanoate from hydroxyacyl-CoA.
  • the PHA synthase can synthesize poly(ester amide) using aminoacyl-CoA as a substrate.
  • the PHA synthase includes a wild type, a naturally occurring mutant, or an artificially engineered mutant.
  • the PHA synthase may be characterized as being Class I PhaC or Class II PhaC, but is not limited thereto.
  • the gene sequence of the engineered PHA synthase is described, for example, in Jung et al., Biotechnol. Bioeng., 105: 161-171, 2010, but is not limited thereto.
  • the gene encoding the PHA synthase may be characterized as being a phaC gene derived from various organisms or a mutant thereof.
  • the gene encoding the PHA synthase may be derived from various organisms.
  • the gene encoding the PHA synthase may be derived from any microorganism having PHA synthesis activity without limitation.
  • the gene encoding the PHA synthase is selected from the group consisting of Cupriavidus necator , Aeromonas caviae , Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida , Pseudomonas MBEL 6-19, Pseudomonas sp.
  • Pseudomonas putida KT2440 Pseudomonas aeruginosa PAO1
  • Pseudomonas chlororaphis Pseudomonas resinovorans.
  • the sequence of the gene encoding the PHA synthase can be easily obtained from a database widely used in the art or from the amino acid sequence of the PHA synthase described above.
  • the sequence of the gene encoding the PHA synthase can be codon optimized to suit the host microorganism using a method well known in the art.
  • poly(ester amide) in the present invention is used to mean, without limitation, a polymer having both an ester bond and an amide bond.
  • poly(ester amides) including amino acid-based poly(ester amides), are well known in the art (e.g., Polym. Chem., 2016, 7, 7039-7046).
  • the poly(ester amide) may be characterized in that it contains an organic acid that serves as a substrate for the coenzyme A transferase as a monomer.
  • the poly(ester amide) may be characterized in that it contains an amino acid that serves as a substrate for the coenzyme A transferase as a monomer.
  • the poly(ester amide) may be characterized by including an amino acid and a hydroxy acid as a substrate of the coenzyme A transferase as monomers.
  • the poly(ester amide) may be characterized by including a structure represented by the following chemical formula, but is not limited thereto:
  • R1 to R4 can each independently be any chemical moiety without limitation, preferably each independently hydrogen, alkyl, alcohol or amine,
  • x, y, n, and m are each independently integers greater than or equal to 0 or 1.
  • the poly(ester amide) may be characterized as being a polymer containing one or more monomers.
  • the monomers and their composition ratios included in the poly(ester amide) synthesized by the recombinant microorganism can be controlled depending on the level of organic acids (e.g., amino acids and hydroxy acids) that become monomers (i.e., precursors) of the poly(ester amide).
  • organic acids e.g., amino acids and hydroxy acids
  • the monomers and their composition ratios included in the poly(ester amide) synthesized by the recombinant microorganism can be controlled by the concentration and ratio of the supplied carbon source (sugar or organic acid).
  • the monomers and their composition ratios included in the poly(ester amide) synthesized by the recombinant microorganism can be controlled according to the precursor biosynthesis level of the recombinant microorganism, and the precursor biosynthesis level can be controlled through, but is not limited to, the creation, strengthening, weakening, or blocking of the precursor biosynthesis pathway through genetic engineering.
  • the host microorganism into which the gene encoding the coenzyme A transferase and the gene encoding the polyhydroxyalkanoate synthase are introduced or amplified is Escherichia coli , Rhizobium , Bifidobacterium , Rhodococcus , Candida , Erwinia , Enterobacter , Pasteurella , Mannheimia , Actinobacillus , Aggregatibacter , Xanthomonas , Vibrio , Pseudomonas, Azotobacter , and Acinaetobacter .
  • the host microorganism may be preferably selected from the group consisting of Escherichia coli , Bacillus subtilis , Corynebacterium glutamicum , Lactobacillus brevis , Lactobacillus casei, Lactobacillus reuteri , Lactococcus lactis, Aspergillus niger , Saccharomyces cerevisiae , and Saccharomyces pombe , but is not limited thereto.
  • the host microorganism may most preferably be E. coli, but is not limited thereto.
  • the recombinant microorganism may be characterized by having a biosynthetic pathway from a carbon source to an organic acid (preferably an amino acid) that serves as a substrate for coenzyme A transferase.
  • the organic acid may be characterized by being, for example, an amino acid.
  • the carbon source may be, for example, a sugar or an organic acid, but is not limited thereto.
  • the sugar as the carbon source may be selected from the group consisting of monosaccharides, disaccharides, and polysaccharides, including, for example, glucose, sucrose, galactose, maltose, xylose, glycerol, fructose, and sugar cane, but is not limited thereto.
  • the organic acid may be an organic acid (e.g., pyruvate, glutamate, etc.) produced in the metabolic pathway of the carbon source, but is not limited thereto.
  • organic acid e.g., pyruvate, glutamate, etc.
  • the recombinant microorganism may be characterized by having an innate biosynthetic pathway for an organic acid that serves as a substrate for coenzyme A transferase.
  • the recombinant microorganism may be engineered to have a biosynthetic pathway for an organic acid that serves as a substrate for coenzyme A transferase.
  • the recombinant microorganism may be characterized in that the biosynthetic pathway for an organic acid that serves as a substrate for coenzyme A transferase is newly established, strengthened, weakened, or blocked through the introduction, amplification, attenuation, or deletion of a gene related to the biosynthetic pathway.
  • the recombinant microorganism has enhanced production of hydroxyacyl-CoA and amino acids through additional engineering of one or more of deletion or attenuation of the ldhA gene; introduction or amplification of the phaAB gene; introduction or amplification of the davAB gene; introduction or amplification of the panD gene or gadB gene, but is not limited thereto.
  • host microorganism of the present invention means any microorganism capable of expressing functional genes and/or gene products derived from other cells or organs, and more specifically, means a microorganism before a gene encoding a coenzyme A transferase of the present invention and a gene encoding a PHA synthase are introduced or amplified.
  • recombinant in the present invention means including a polynucleotide or protein that does not occur naturally within the host cell.
  • introduction means that a gene is made replicable either as an extrachromosomal element or by completion of chromosomal integration.
  • the transformed gene may be either integrated into the chromosome of the microorganism or located extrachromosomally, as long as it can be expressed within the microorganism.
  • the gene may be a polynucleotide capable of encoding a protein, including DNA and RNA.
  • the term "gene” should be considered in its broadest sense and may encode a structural or regulatory protein. Regulatory proteins include transcription factors, heat shock proteins, or proteins involved in DNA/RNA replication, transcription, and/or translation.
  • amplification or “strengthening” is a concept encompassing increasing the activity of a corresponding enzyme or consequently strengthening the progression of a corresponding pathway by mutating, substituting, or deleting some bases of the corresponding gene, introducing some bases, or introducing a gene derived from another microorganism encoding the same enzyme.
  • “weakening” is a concept encompassing reducing the activity of an enzyme expressed by a corresponding gene by mutating, substituting, or deleting some bases of the corresponding gene or introducing some bases, and includes everything that blocks part or a significant part of a biosynthetic pathway in which the enzyme of the corresponding gene is involved.
  • 'deletion' is a concept that encompasses mutating, substituting, or deleting part or all of the bases of the corresponding gene, or introducing some bases to prevent the gene from being expressed, or to prevent the gene from exhibiting enzymatic activity even if expressed, and includes everything that blocks the biosynthetic pathway in which the enzyme of the corresponding gene is involved.
  • a "vector” refers to a DNA construct containing a DNA sequence operably linked to a suitable regulatory sequence capable of expressing the DNA in a suitable host.
  • the vector may be a plasmid, a phage particle, or simply a potential genomic insert. Once transformed into a suitable host, the vector can replicate and function independently of the host genome, or in some cases, can integrate into the genome itself. Since plasmids are currently the most commonly used form of vector, the terms “plasmid” and “vector” are sometimes used interchangeably herein. For the purposes of the present invention, the use of a plasmid vector is preferred.
  • a typical plasmid vector that can be used for this purpose has a structure that includes (a) an origin of replication to allow efficient replication, allowing for several to several hundred copies of the plasmid vector per host cell, (b) an antibiotic resistance gene to allow selection of host cells transformed with the plasmid vector, and (c) a restriction enzyme cleavage site into which a foreign DNA fragment can be inserted. Even if a suitable restriction enzyme cleavage site does not exist, the vector and the foreign DNA can be easily ligated using conventional synthetic oligonucleotide adapters or linkers. After ligation, the vector must be transformed into an appropriate host cell. Transformation can be readily accomplished using the calcium chloride method or electroporation (Neumann, et al. EMBO J., 1:841, 1982).
  • a base sequence is "operably linked" when it is placed in a functional relationship with another nucleic acid sequence.
  • This may be a gene and regulatory sequence(s) that are linked in such a way that gene expression is enabled when an appropriate molecule (e.g., a transcriptional activating protein) binds to the regulatory sequence(s).
  • DNA for a presequence or secretory leader is operably linked to DNA for a polypeptide if it is expressed as a preprotein that participates in the secretion of the polypeptide; a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence if it influences the transcription of the sequence; or a ribosome binding site is operably linked to a coding sequence if it influences the transcription of the sequence; or a ribosome binding site is operably linked to a coding sequence if it is positioned so as to facilitate translation.
  • "operably linked" means that the linked DNA sequences are in contact, and in the case of a secretory leader, are in contact and are in reading frame. However, an enhancer need not be in contact. These sequences are joined by ligation at convenient restriction enzyme sites. If such sites do not exist, conventional synthetic oligonucleotide adaptors or linkers are used.
  • genes can be introduced into a host microorganism together with an appropriate promoter.
  • the genes may be introduced together with a promoter selected from the group consisting of lac, lacUV5, trc, tac, trp, araBAD, T3, T5, T7, L10, I16, H30, H36, sod, tuf, eftu, Pm, and Ptet, but are not limited thereto.
  • the present invention relates to a method for producing poly(ester amide), comprising the steps of (a) culturing a recombinant microorganism of the present invention to produce poly(ester amide); and (b) recovering the produced poly(ester amide).
  • step (a) can produce poly(ester amide) by culturing the culture medium by adding a carbon source from outside.
  • the carbon source may be characterized by being at least one selected from the group consisting of sugars, amino acids, and hydroxy acids, but is not limited thereto.
  • poly(ester amide) can be produced through culturing the recombinant microorganism of the present invention without adding a single carbon source or adding a separate carbon source from the outside.
  • the present invention relates to a method for producing poly(ester amide), comprising the following steps:
  • the culturing process of the recombinant microorganism can be performed using a commonly known culturing method, and in addition to the specific medium and specific culturing method used in the examples of the present invention, a saccharified liquid such as whey or CSL (corn steep liquor) and other media can be used, and various methods such as fed-batch culture and continuous culture can be used (Lee et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 26: 63, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 58: 663, 2002; Lee et al., Biotechnol. Lett., 25: 111, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 54: 23, 2000; Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 72: 41, 2001).
  • a saccharified liquid such as whey or CSL (corn steep liquor) and other media
  • various methods such
  • the term "cultivation" in the present invention refers to culturing microorganisms to derive a desired effect.
  • the desired effect refers to the production of a hydrophobic substance.
  • the cultivation can generally be performed in an incubator equipped with an appropriate culture medium optimized for the microorganism being used, containing at least one simple energy source and, if necessary, a co-substrate.
  • the term “cultivation” may be used interchangeably with “fermentation” in the sense of production of a hydrophobic substance through microbial culture.
  • the step of culturing the recombinant microorganism to produce a hydrophobic substance may be characterized in that it is performed through fed-batch fermentation.
  • fed-batch culture or “fed-batch fermentation” of the present invention means culturing/fermenting by intermittently supplying additional medium to control the concentration of the culture solution.
  • a “suitable culture medium” may include a carbon source or carbon substrate; a nitrogen source, such as peptone, glucose, glycerol, yeast extract, meat extract, malt extract, urea, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium nitrate, and ammonium phosphate; a phosphorus source, such as monopotassium phosphate or dipotassium phosphate; trace elements (e.g., metal salts), such as magnesium salts, cobalt salts, and/or manganese salts; as well as nutrients essential or beneficial to the maintenance and/or growth of cells, such as growth factors, amino acids, and vitamins; yeast extracts, antibiotics, and the like.
  • a nitrogen source such as peptone, glucose, glycerol, yeast extract, meat extract, malt extract, urea, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium nitrate, and ammonium phosphate
  • a phosphorus source such as monopot
  • the culture may be characterized in that it is cultured at a temperature in an appropriate range to produce a hydrophobic substance, and may be characterized in that it is cultured at, for example, 20°C to 40°C, preferably 25°C to 35°C, but is not limited thereto, and may be cultured under different conditions depending on the species of the host microorganism, the substance to be expressed, etc.
  • the term "vector” refers to a DNA construct containing a DNA sequence operably linked to suitable regulatory sequences capable of expressing the DNA in a suitable host.
  • the vector may be a plasmid, a phage particle, or simply a potential genomic insert. Once transformed into a suitable host, the vector can replicate and function independently of the host genome, or in some cases, integrate into the genome itself. Since plasmids are currently the most commonly used form of vector, the terms “plasmid” and “vector” are sometimes used interchangeably herein. However, the present invention encompasses other forms of vectors known or becoming known in the art that have equivalent functions. Typical expression vectors for mammalian cell culture expression are, for example, based on pRK5 (EP 307,247), pSV16B (WO 91/08291), and pVL1392 (Pharmingen).
  • control sequence refers to a DNA sequence essential for the expression of an operably linked coding sequence in a particular host organism.
  • control sequences include a promoter for initiating transcription, an optional operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and sequences that control the termination of transcription and translation.
  • a control sequence suitable for prokaryotes includes a promoter, optionally an operator sequence, and a ribosome binding site. For eukaryotes, this includes a promoter, a polyadenylation signal, and an enhancer. The factor most influencing the level of gene expression in a plasmid is the promoter.
  • Promoters suitable for high expression include the SR ⁇ promoter and cytomegalovirus-derived promoters.
  • any of a wide variety of expression control sequences may be used in the vector to express the DNA sequence of the present invention.
  • useful expression control sequences include, for example, the early and late promoters of SV40 or adenovirus, the lac system, the trp system, the TAC or TRC system, the T3 and T7 promoters, the major operator and promoter region of phage lambda, the regulatory region of the fd-encoded protein, the promoter for 3-phosphoglycerate kinase or other glycolytic enzymes, the promoters of the phosphatases, e.g., Pho5, the promoter of the yeast alpha-mating system, and any other sequence known to regulate the expression of genes in prokaryotes or eukaryotes or their viruses, and any combination thereof.
  • the T7 RNA polymerase promoter ⁇ 10 can be usefully used to express the protein NSP in E. coli.
  • a nucleic acid is "operably linked" when it is placed into a functional relationship with another nucleic acid sequence.
  • This can be a gene and regulatory sequence(s) that are linked in such a way that an appropriate molecule (e.g., a transcriptional activating protein) enables gene expression when bound to the regulatory sequence(s).
  • DNA for a pre-sequence or secretory leader is operably linked to DNA for a polypeptide if it is expressed as a preprotein that participates in the secretion of the polypeptide; a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence if it influences the transcription of the sequence; or a ribosome binding site is operably linked to a coding sequence if it influences the transcription of the sequence; or a ribosome binding site is operably linked to a coding sequence if it is positioned so as to facilitate translation.
  • "operably linked" means that the linked DNA sequences are in contact, and in the case of a secretory leader, are in contact and are in reading frame. However, an enhancer need not be in contact. These sequences are joined by ligation at convenient restriction enzyme sites. If such sites do not exist, synthetic oligonucleotide adaptors or linkers are used according to conventional methods.
  • heterologous DNA refers to heterologous DNA, which is DNA not naturally found in the host cell. Once within a host cell, the expression vector can replicate independently of the host chromosomal DNA, producing multiple copies of the vector and its inserted (heterologous) DNA.
  • the gene must be operably linked to transcriptional and translational expression control sequences that function within the selected expression host.
  • the expression control sequences and the gene are contained within a single expression vector that also includes a bacterial selection marker and an origin of replication. If the expression host is a eukaryotic cell, the expression vector must further include an expression marker useful in the eukaryotic expression host.
  • a host cell transformed or transfected with the expression vector described above constitutes another aspect of the present invention.
  • transformation refers to the introduction of DNA into a host cell, such that the DNA becomes replicable either as an extrachromosomal element or through chromosomal integration.
  • transfection refers to the uptake of an expression vector by a host cell, regardless of whether any coding sequence is actually expressed.
  • the host cell of the invention may be a prokaryotic or eukaryotic cell. Furthermore, a host cell with high DNA introduction efficiency and high expression efficiency of the introduced DNA is typically used.
  • host cells that can be used include well-known eukaryotic and prokaryotic hosts such as E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, fungi, and yeast; insect cells such as Spodoptera frugiperda (SF9); animal cells such as CHO and mouse cells; African green monkey cells such as COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, and BMT 10; and tissue-cultured human cells.
  • the plasmid containing the SV40 replication origin will exist as multiple copies of episomes in the cells, and higher expression than usual can be expected.
  • the introduced DNA sequence can be obtained from the same species as the host cell, can be from a different species from the host cell, or can be a hybrid DNA sequence containing any heterologous or homologous DNA.
  • the unicellular host should be selected by considering factors such as the selected vector, the toxicity of the product encoded by the DNA sequence of the present invention, secretion characteristics, the ability to accurately fold the protein, culture and fermentation requirements, and the ease of purifying the product encoded by the DNA sequence of the present invention from the host.
  • factors such as the selected vector, the toxicity of the product encoded by the DNA sequence of the present invention, secretion characteristics, the ability to accurately fold the protein, culture and fermentation requirements, and the ease of purifying the product encoded by the DNA sequence of the present invention from the host.
  • those skilled in the art can select various vector/expression control sequence/host combinations that can express the DNA sequence of the present invention in fermentation or large-scale animal culture.
  • the binding method, the panning method, the film emulsion method, etc. can be applied as screening methods.
  • substantially pure means that the polypeptide according to the present invention and the DNA sequence encoding the polypeptide are substantially free of other proteins derived from bacteria.
  • Prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis have been widely used as host cells for expressing recombinant proteins because they can be cultured at high concentrations in a short period of time, are easy to genetically manipulate, and have well-defined genetic and physiological characteristics.
  • higher organisms such as unicellular eukaryotic yeasts (Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, etc.), filamentous fungi, insect cells, plant cells, and mammalian cells have recently been utilized as host cells for recombinant protein production. Therefore, those skilled in the art can easily apply the use of other host cells in addition to the E. coli exemplified in the examples.
  • the present invention relates to a poly(ester amide) produced by the above method.
  • Example 1-1 pTac15k_davAB vector
  • the davAB gene fragment encoding 5-aminovaleramide aminohydrolase and L-lysine monooxygenase was constructed by PCR using pKE112_davAB vector (Park et al., Metab. Eng. 16:42-47 2013) as a DNA template and primers of sequence numbers 14 and 15.
  • the pTac15k (US patent 20110269183) plasmid which promotes strong gene expression of the davAB fragment and the tac promoter, was treated with restriction enzymes (EcoRI and BamHI), and then treated with T4 DNA ligase to conjugate the davAB fragment cut with the restriction enzyme and the pTac15k plasmid, thereby producing a recombinant plasmid, pTac15k_davAB.
  • restriction enzymes EcoRI and BamHI
  • Example 1-2 pTac15k_act_davAB vector
  • the davAB gene fragment encoding 5-aminovaleramide aminohydrolase and L-lysine monooxygenase was constructed by PCR using pKE112_davAB vector (Park et al., Metab. Eng. 16:42-47 2013) as a DNA template and primers of sequence numbers 16 and 17.
  • the pTac15k_act vector (Chae et al., Metab. Eng. 41: 82-91, 2017), which promotes strong gene expression of the davAB fragment and the tac promoter, was treated with restriction enzymes (SacI and PstI), and then treated with T4 DNA ligase to conjugate the davAB fragment cleaved with the restriction enzyme and the pTac15k_act vector, thereby constructing a recombinant plasmid, pTac15k_act_davAB.
  • Example 1-3 pTac15k_act_panD vector
  • a panD gene fragment encoding aspartate decarboxylase was produced by PCR using the chromosomal DNA of a Corynebacterium glutamicum strain as a template and primers of sequence numbers 18 and 19.
  • panD fragment and the pTac15k_act plasmid (Chae et al., Metab. Eng. 41: 82-91, 2017) were treated with restriction enzymes (SacI and KpnI), and then treated with T4 DNA ligase to ligate the panD fragment cut with the restriction enzyme and the pTac15k_act plasmid, thereby constructing a recombinant plasmid, pTac15k_act_panD.
  • Example 1-4 pPs619C1437PhaAB vector
  • PCR was performed with primers of sequence numbers 20 and 21 to produce a phaAB gene fragment encoding acetyl-CoA acetyltransferase and acetoacetyl-CoA reductase.
  • the phaAB fragment and the pPs619C1437Pct540 plasmid were treated with restriction enzymes (BstBI and SbfI), and then treated with T4 DNA ligase to conjugate the phaAB fragment cut with the restriction enzyme and the pPs619C1437Pct540 plasmid, thereby constructing a recombinant plasmid, pPs619C1437PhaAB.
  • Example 1-5 pCneCPct540 vector
  • a phaCCne gene fragment encoding polyhydroxyalkanoate synthase was produced by performing PCR using the chromosomal DNA of the Cupriavidus necator strain as a template and primers of sequence numbers 22 and 23.
  • the phaCCne fragment and the pPs619C1437Pct540 plasmid were treated with restriction enzymes (BstBI and SbfI), and then treated with T4 DNA ligase to conjugate the phaCCne fragment cut with the restriction enzyme and the pPs619C1437Pct540 plasmid, thereby constructing a recombinant plasmid, pCneCPct540.
  • Example 1-6 pAcaCPct540, pAhyCPct540, pAsaCPct540 vectors
  • PCR was performed with primers of SEQ ID NO: 24 and 25 to produce phaCAca, phaCAhy, and phaCAsa gene fragments encoding polyhydroxyalkanoate synthase.
  • the phaCAca, phaCAhy, and phaCAsa gene fragments and the pPs619C1437Pct540 plasmid were treated with restriction enzymes (BstBI and SbfI), and then treated with T4 DNA ligase to conjugate the phaCAca, phaCAhy, and phaCAsa gene fragments cut with the restriction enzymes and the pPs619C1437Pct540 plasmid, thereby constructing recombinant plasmids pAcaCPct540, pAhyCPct540, and pAsaCPct540.
  • Example 2 Production of recombinant microorganisms
  • the pTac15k_act plasmid which was constructed to express the act gene encoding beta-alanine coenzyme A transferase in microorganisms (Chae et al., Metab. Eng. 41: 82-91, 2017), and the pPs619C1437Pct540 plasmid, which was constructed to express the phaC1437Ps6-19 gene encoding engineered polyhydroxyalkanoate synthase and the pct540 gene encoding engineered propionate coenzyme A transferase (Jung et al., Biotechnol.
  • Bioeng., 105: 161- 171, 2010 were introduced into Escherichia coli XL1-Blue (Stratagene) to produce a recombinant microorganism (PEA01), and E. coli (PEA00) into which the blank pTac15k was introduced was used as a control strain.
  • the pTac15k_act_davAB vector constructed in Example 1-2 was introduced into E. coli XL1-Blue/pPs619C1437Pct540 so that the act gene encoding beta-alanine coenzyme A transferase, the davA gene encoding 5-aminovaleramide aminohydrolase, and the davB gene encoding L-lysine monooxygenase were expressed in the microorganism, thereby producing a recombinant microorganism (PEA03), and E. coli (PEA02) into which pTac15k_davAB constructed in Example 1-1 was introduced was used as a control strain.
  • the pPs619C1437PhaAB plasmid constructed in Example 1 was introduced into E. coli XL1-Blue ⁇ ldhA so that the phaC1437Ps6-19 gene encoding engineered polyhydroxyalkanoate synthase, the phaA gene encoding acetyl-CoA acetyltransferase, and the phaB gene encoding acetoacetyl-CoA reductase were expressed, and a recombinant microorganism was produced (XL1-Blue ⁇ ldhA/pPs619C1437PhaAB).
  • the pTac15k_act_panD vector constructed in Example 1 or beta-alanine coenzyme A transferase was introduced so that the act gene encoding beta-alanine coenzyme A transferase and the panD gene encoding aspartate decarboxylase were expressed.
  • Escherichia coli strains (PEA06 and PEA07) containing pTac15k_act_gadB_mut (Chae et al., Metab. Eng. 41: 82-91, 2017), which was engineered to express the act gene encoding the panD gene and the gadB_mut gene encoding engineered glutamate decarboxylase, were used.
  • the vectors pCneCPct540, pAcaCPct540, pAhyCPct540, pAsaCPct540 constructed in Example 1 to express the phaC gene encoding polyhydroxyalkanoate synthase derived from (Pseudomonas resinovorans) and the vectors pPs619C1437Pct540, pPs613C1437Pct540, pPpuC1437Pct540, pPaeC1437Pct540, pPchC1437Pct540, pPreC1437Pct540 previously reported (Yang et al., Appl. Microbiol. Biotechnol.
  • Example 3 Confirmation of production of poly(ester amide) containing 3-aminopropionate and 4-aminobutyrate as monomers using recombinant microorganisms.
  • the recombinant microorganism (PEA00, PEA01) manufactured in Example 2 was inoculated into 10 mL of LB medium and pre-cultured at 37°C for 8 hours. 1.0 mL of the pre-cultured culture was inoculated into 100 mL of MR medium in a 350 mL flask and cultured.
  • the composition of MR medium (pH 7.0) is as follows: 20 g glucose, 6.67 g KH 2 PO 4 , 4.0 g (NH 4 ) 2 HPO 4 , 0.8 g citric acid, 0.8 g MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, 0.01 g CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, 5 mL trace metal solution (10 g FeSO 4 ⁇ 7H 2 O, 2.2 g ZnSO 4 ⁇ 4H 2 O, 0.58 g MnSO 4 ⁇ 4H 2 O, 1 g CuSO 4 ⁇ 5H 2 O, 0.1 g (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 ⁇ 4H 2 O, 0.02 g Na 2 B 4 O 7 ⁇ 10H 2 per liter of distilled water O) is a medium composed of the following components.
  • amino acids known as substrates of existing beta-alanine coenzyme A transferase, 3-aminopropionate, 4-aminobutyrate, 5-aminovalerate, 6-aminocaproate, and 7-aminoheptanoate were supplied as additional carbon sources at a concentration of 2 g/L.
  • 2 g/L of sodium (RS)-3-hydroxybutyrate was also additionally supplied.
  • Cultivation was performed in a shaking incubator (jSR, Korea) operating at 30°C and 200 rpm for 96 hours. After cultivation, the culture medium was centrifuged at 13,200 rpm for 10 minutes, and cells were collected and analyzed to confirm polyester amide production.
  • the recombinant microorganism according to the present invention produces a poly(ester amide) having 3-aminopropionate and 4-aminobutyrate as monomers.
  • the recombinant microorganism according to the present invention produces a poly(ester amide) having 3-aminopropionate and 4-aminobutyrate as monomers.
  • Example 4 Confirmation of production of poly(ester amide) containing 5-aminovalerate as a monomer using recombinant microorganisms.
  • the recombinant microorganism (PEA02, PEA03) manufactured in Example 2 was inoculated into 10 mL of LB medium and pre-cultured at 37°C for 8 hours. 1.0 mL of the pre-cultured culture was inoculated into 100 mL of MR medium in a 350 mL flask and cultured.
  • the composition of MR medium (pH 7.0) is as follows: 20 g glucose, 6.67 g KH 2 PO 4 , 4.0 g (NH 4 ) 2 HPO 4 , 0.8 g citric acid, 0.8 g MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, 0.01 g CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, 5 mL trace metal solution (10 g FeSO 4 ⁇ 7H 2 O, 2.2 g ZnSO 4 ⁇ 4H 2 O, 0.58 g MnSO 4 ⁇ 4H 2 O, 1 g CuSO 4 ⁇ 5H 2 O, 0.1 g (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 ⁇ 4H 2 O, 0.02 g Na 2 B 4 O 7 ⁇ 10H 2 per liter of distilled water O) is a medium composed of the following components.
  • L-lysine which can be converted to 5-aminovalerate by the davAB gene, was supplied as an additional carbon source at a concentration of 2 g/L.
  • 2 g/L of sodium (RS)-3-hydroxybutyrate was also additionally supplied. Cultivation was performed in a shaking incubator (jSR, Korea) operating at 30°C and 200 rpm for 96 h. After cultivation, the culture medium was centrifuged at 13,200 rpm for 10 minutes, and cells were collected and analyzed to confirm polyester amide production.
  • the recombinant microorganism according to the present invention produces a poly(ester amide) having 5-aminovalerate as a monomer using L-lysine as a carbon source.
  • Example 5 In vitro assay for identification of additional substrates for beta-alanine coenzyme A transferase.
  • Enzyme assays were performed in 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5). The substrates and enzymes required for the enzyme assay were added in the amounts shown below. 10 mM target substrate, 1 mM acetyl-CoA, and 2.5 ⁇ g of purified beta-alanine coenzyme A transferase were added, and the reaction was performed at 30°C for 2 hours.
  • beta-alanine coenzyme A transferase according to the present invention successfully converts various amino acids, hydroxy acids, and carboxylic acids, in addition to existing known substrates, into coenzyme A derivatives.
  • Example 6 Confirmation of production of poly(ester amide) containing (R)-3-aminobutyrate, 3-aminoisobutyrate, and (R)-3-aminovalerate as monomers using recombinant microorganisms.
  • the recombinant microorganism (PEA00, PEA01) manufactured in Example 2 was inoculated into 10 mL of LB medium and pre-cultured at 37°C for 8 hours. 1.0 mL of the pre-cultured culture was inoculated into 100 mL of MR medium in a 350 mL flask and cultured.
  • the composition of MR medium (pH 7.0) is as follows: 20 g glucose, 6.67 g KH 2 PO 4 , 4.0 g (NH 4 ) 2 HPO 4 , 0.8 g citric acid, 0.8 g MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, 0.01 g CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, 5 mL trace metal solution (10 g FeSO 4 ⁇ 7H 2 O, 2.2 g ZnSO 4 ⁇ 4H 2 O, 0.58 g MnSO 4 ⁇ 4H 2 O, 1 g CuSO 4 ⁇ 5H 2 O, 0.1 g (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 ⁇ 4H 2 O, 0.02 g Na 2 B 4 O 7 ⁇ 10H 2 per liter of distilled water O) is a medium composed of the following components.
  • amino acids known as substrates of beta-alanine coenzyme A transferase in Example 5 were additionally supplied as carbon sources at a concentration of 2 g/L.
  • 2 g/L of sodium (RS)-3-hydroxybutyrate was additionally supplied.
  • the culture was performed in a shaking incubator (jSR, Korea) operating at 30°C and 200 rpm for 96 hours. After the culture was completed, the culture solution was centrifuged at 13,200 rpm for 10 minutes, and the cells were collected and analyzed to confirm polyester amide production.
  • the recombinant microorganism according to the present invention produces a poly(ester amide) having (R)-3-aminobutyrate, 3-aminoisobutyrate, and (R)-3-aminovalerate as monomers.
  • the recombinant microorganism according to the present invention produces a poly(ester amide) having (R)-3-aminobutyrate, 3-aminoisobutyrate, and (R)-3-aminovalerate as monomers.
  • Example 7 Confirmation of production of poly(ester amide) containing various amino acids as monomers using recombinant microorganisms.
  • the recombinant microorganism (PEA00, PEA01) manufactured in Example 2 was inoculated into 10 mL of LB medium and pre-cultured at 37°C for 8 hours. 1.0 mL of the pre-cultured culture was inoculated into 100 mL of MR medium in a 350 mL flask and cultured.
  • the composition of MR medium (pH 7.0) is as follows: 20 g glucose, 6.67 g KH 2 PO 4 , 4.0 g (NH 4 ) 2 HPO 4 , 0.8 g citric acid, 0.8 g MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, 0.01 g CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, 5 mL trace metal solution (10 g FeSO 4 ⁇ 7H 2 O, 2.2 g ZnSO 4 ⁇ 4H 2 O, 0.58 g MnSO 4 ⁇ 4H 2 O, 1 g CuSO 4 ⁇ 5H 2 O, 0.1 g (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 ⁇ 4H 2 O, 0.02 g Na 2 B 4 O 7 ⁇ 10H 2 per liter of distilled water O) is a medium composed of the following components.
  • the recombinant microorganism according to the present invention produces poly(ester amide) having two (3-aminopropionate and (R)-3-aminobutyrate) and three (3-aminopropionate, (R)-3-aminobutyrate, and (R)-3-aminoisobutyrate) monomers simultaneously.
  • the recombinant microorganism according to the present invention produces a poly(ester amide) having various amino acids as monomers.
  • Example 8 Confirmation of poly(ester amide) production using glucose as the sole carbon source using recombinant microorganisms.
  • the recombinant microorganism (PEA05, PEA06, or PEA07) manufactured in Example 2 was inoculated into 10 mL of LB medium and pre-cultured at 37°C for 8 hours, and 1.0 mL of the pre-cultured culture was inoculated into 100 mL of MR medium in a 350 mL flask and cultured.
  • the PEA06 and PEA07 strains are strains in which the panD and gadB_mut genes are overexpressed to increase the metabolic flux for biosynthesizing 3-aminopropionate and 4-aminobutyrate, respectively.
  • the phaAB genes are introduced into both strains to enable biosynthesis of 3-hydroxybutyryl coenzyme A from glucose, thereby providing hydroxy acid monomers without the introduction of external hydroxy acids. Additionally, to prevent lactate from polymerizing into hydroxy acid monomers other than the targeted 3-hydroxybutyrate, a strain lacking the ldhA gene required for lactate biosynthesis was used.
  • the composition of MR medium (pH 7.0) is as follows: 20 g glucose, 6.67 g KH 2 PO 4 , 4.0 g (NH 4 ) 2 HPO 4 , 0.8 g citric acid, 0.8 g MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, 0.01 g CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, 5 mL trace metal solution (10 g FeSO 4 ⁇ 7H 2 O, 2.2 g ZnSO 4 ⁇ 4H 2 O, 0.58 g MnSO 4 ⁇ 4H 2 O, 1 g CuSO 4 ⁇ 5H 2 O, 0.1 g (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 ⁇ 4H 2 O, 0.02 g Na 2 B 4 O 7 ⁇ 10H 2 per liter of distilled water O) is a medium composed of components.
  • the composition no amino acids or sodium (RS)-3-hydroxybutyrate were additionally supplied, allowing glucose to be used as the sole carbon source. Cultivation was performed in a shaking incubator (jSR, Korea) operating at 30°C and 200 rpm for 96 hours. After cultivation, the culture medium was centrifuged at 13,200 rpm for 10 minutes, and cells were collected and analyzed to confirm polyester amide production.
  • jSR shaking incubator
  • the recombinant microorganism according to the present invention produces a poly(ester amide) having 3-aminopropionate (FIGS. 5a,b) or 4-aminobutyrate (FIGS. 5c,d) as a monomer.
  • the recombinant microorganism according to the present invention produces poly(ester amide) using glucose as the sole carbon source.
  • Example 9 Confirmation of high-efficiency production of poly(ester amide) containing 3-aminopropionate as a monomer using fed-batch fermentation of recombinant microorganisms.
  • the recombinant microorganism (PEA06) manufactured in Example 2 was inoculated into 200 mL of LB medium and pre-cultured at 37°C for 8 hours. 200 mL of the pre-cultured culture was inoculated into 2 L of MR medium in a 6.6 L fermenter to perform fed-batch fermentation.
  • the composition of MR medium (pH 7.0) is as follows: 20 g glucose, 6.67 g KH 2 PO 4 , 4.0 g (NH 4 ) 2 HPO 4 , 0.8 g citric acid, 0.8 g MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, 0.01 g CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, 5 mL trace metal solution (10 g FeSO 4 ⁇ 7H 2 O, 2.2 g ZnSO 4 ⁇ 4H 2 O, 0.58 g MnSO 4 ⁇ 4H 2 O, 1 g CuSO 4 ⁇ 5H 2 O, 0.1 g (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 ⁇ 4H 2 O, 0.02 g Na 2 B 4 O 7 ⁇ 10H 2 per liter of distilled water O) is a medium composed of the following components.
  • a feeding solution consisting of 700 g glucose and 8 g MgSO 4 ⁇ 7H 2 O per liter was additionally supplied. Cultivation was performed in a bioreactor (New Brunswick Scientific Co, NJ) operated to maintain 30°C and a dissolved oxygen level of 40% for 96 hours. After cultivation, the culture medium was centrifuged at 13,200 rpm for 10 minutes, and cells were collected and analyzed to confirm polyester amide production.
  • the recombinant microorganism according to the present invention produces poly(ester amide) having 3-aminopropionate as a monomer at a high production concentration, productivity, and yield.
  • Example 10 Confirmation of poly(ester amide) production using polyhydroxyalkanoates derived from various microorganisms.
  • the recombinant microorganisms (PEA08, PEA09, PEA10, PEA11, PEA04, PEA12, PEA13, PEA14, PEA15, PEA16) manufactured in Example 2 were inoculated into 10 mL of LB medium and pre-cultured at 37°C for 8 hours. 1.0 mL of the pre-cultured culture was inoculated into 100 mL of LB medium in a 350 mL flask and cultured.
  • the composition of LB medium is a medium composed of 10 g tryptone, 5 g yeast extract, and 10 g NaCl per liter of distilled water.
  • 3-aminopropionate an amino acid known as a substrate for beta-alanine coenzyme A transferase
  • 50 g/L of sodium (RS)-3-hydroxybutyrate was also supplied.
  • Cultivation was performed for 96 h in a shaking incubator (jSR, Korea) operating at 30°C and 200 rpm. After cultivation, the culture medium was centrifuged at 13,200 rpm for 10 minutes, and cells were collected and analyzed to confirm polyester amide production.
  • the recombinant microorganism of the present invention is capable of biosynthesizing poly(ester amide) polymers from various carbon sources such as glucose, amino acids, hydroxy acids, carboxylic acids, etc., and is therefore useful for the industrial production of poly(ester amide).

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Abstract

대사공학적으로 엔지니어링된 재조합 미생물효소 및 이를 이용한폴리(에스터 아마이드)의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 재조합 미생물 및 이를 이용한 폴리(에스터 아마이드)의 제조방법은 포도당, 아미노산, 하이드록시산, 카르복실산 등과 같은 다양한 탄소원으로부터 다양한 폴리에스터 아마이드폴리(에스터 아마이드) 고분자를 생합성할 수 있으므로들을 제조할 수 있어, 폴리에스터 아마이드폴리(에스터 아마이드)의 산업적 생산에 유용하다.

Description

여러 가지 폴리(에스터 아마이드)의 제조방법
본 발명은 대사공학적으로 엔지니어링된 재조합 미생물효소 및 이를 이용한 폴리(에스터 아마이드)의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 아미노산을 포함하는 유기산을 기질로 하는 코엔자임 A 전이효소를 코딩하는 유전자 및 PHA 합성효소를 코딩하는 유전자가 도입 또는 증폭되어 있는 재조합 미생물 및 이를 이용한 폴리(에스터 아마이드)의 제조방법에 관한 것이다.
최근 석유 고갈문제와 환경 문제로 인해 미생물을 이용한 지속가능한 다양한 부가가치 화학제품 및 고분자 생산에 큰 이목이 집중되고 있다. 특히 석유화학기반의 플라스틱을 대체하기 위하여 여러 가지 종류의 바이오 고분자들이 생산 연구가 진행되고 있으나, 현재까지 재조합 미생물을 이용한 다양한 폴리(에스터 아마이드)들의 생산 성공 사례는 없다.
폴리(에스터 아마이드)는 에스터 결합과 아마이드 결합을 모두 갖고 있는 고분자이다. 이러한 특성으로 폴리(에스터 아마이드)는 폴리에스터의 장점과 폴리아마이드의 장점을 모두 갖고 있다. 비록 현재까지 폴리(에스터 아마이드) 생산 성공 사례는 없지만, 기존에 대사공학을 이용하여 폴리하이드록시알카노에이트 (Polyhydroxyalkanoate)라 알려진 자연계에 존재하는 폴리에스터를 생산하는 연구는 보고된 바가 많다 (Choi et al., Adv. Mat. 32: 1-37, 2020). 또한 시스템 대사공학을 통하여 미생물을 이용하여 자연계에 존재하지 않았던 폴리에스터인 poly(lactate-ran-glycolate), poly(3-hydroxybutyrate-ran-phenyllactate)의 생합성한 보고가 있다 (Choi et al., Nat. Biotech. 34: 435-440, 2016; Yang et al., 9:79, 2018).
이에, 본 발명자들은 미생물을 이용하여 다양한 탄소원으로부터 폴리(에스터 아마이드)를 효율적으로 생산하는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 아미노산(amino acid)을 기질(substrate)로 하여 아미노아실-CoA로 전환하는 효소와 아미노아실-CoA를 고분자화하는 효소의 유전자가 도입된 재조합 미생물을 이용하여 폴리에스터아마이드를 생합성할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 다양한 탄소원으로부터 폴리(에스터 아마이드)를 제조할 수 있는 재조합 미생물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용하여, 폴리(에스터 아마이드)를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 코엔자임 A 전이효소(Coenzyme A transferase)를 코딩하는 유전자 및 PHA 합성효소(polyhydroxyalkanoate synthase)를 코딩하는 유전자가 도입 또는 증폭되어 있는, 탄소원으로부터 폴리(에스터 아마이드) 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 본 발명의 재조합 미생물을 배양하여 폴리(에스터 아마이드)를 생성하는 단계 및; (b) 상기 생성된 폴리(에스터 아마이드)를 회수하는 단계를 포함하는 폴리(에스터 아마이드)의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 본 발명의 재조합 미생물을 코엔자임 A 전이효소의 기질이 되는 유기산이 첨가된 배지에서 배양하여 폴리(에스터 아마이드)를 생산하는 단계; 및
(b) 상기 생성된 폴리(에스터 아마이드)를 회수하는 단계를 포함하는 폴리(에스터 아마이드)의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 제조방법으로 제조된 폴리(에스터 아마이드)를 제공한다.
도 1은 다양한 폴리(에스터 아마이드)를 생산하는 대사경로와 이러한 폴리(에스터 아마이드)에 포함되어 있는 아미노산 단량체를 나타낸 것이다. 폴리(에스터 아마이드)를 생합성하기 위해 새롭게 디자인된 자연계에 존재하지 않던 대사 반응은 빨간 화살표로 표기하였다. Polyhydroxyalkanoate를 생합성하는 자연계에 존재하던 대사회로들은 검정 화살표로 표기하였다. 해당 대사회로로 고분자화 할수 있는 아미노산 단량체들은 회색 박스에 표기하였다. 아민과 아마이드 작용기는 핑크로 표기하였다. 하이드록시와 에스터 작용기는 파랑으로 표기하였다. 표기된 유전자들은 각자 아래의 효소를 나타낸다: act, β-alanine CoA transferase; pct540, engineered propionate CoA transferase; phaC, polyhydroxyalkanoate synthase. 화학물질의 약어는 다음과 같다: 3AB, 3-aminobutyrate; 3AIB, 3-aminoisobutyrate; 3AP, 3-aminopropionate; 3AV, 3-aminovalerate; 4AB, 4-aminobutyrate; 5AV, 5-aminovalerate.
도 2은 다양한 아미노산 단량체를 포함하는 폴리(에스터 아마이드)의 생합성 확인을 위한 분석 결과이다. a, PEA01 균주를 MR배지에 (RS)-3HB와 타겟 아미노산이 첨가된 배지서 배양하는 모식도. 여러개의 대사회로의 경우 검정 점선 화살표로 표기하였다. b, (a)에 나타낸 모식도에 따라 PEA00과 PEA01 균주들을 배양하여 얻은 고분자의 아미노산 단량체의 분률. c, 3AP, (R)-3AB, 3AIB, (R)-3AV, 4AB, 5AV 단량체 및 해당 스탠다드 화학물질의 mass spectrum. 표기된 유전자들은 각자 아래의 효소를 나타낸다: act, β-alanine CoA transferase; ldhA, (R)-lactate dehydrogenase; pct540, engineered propionate CoA transferase; phaC1437Ps6-19, engineered Pseudomonas sp. MBEL 6-19 polyhydroxyalkanoate synthase. 화학물질의 약어는 다음과 같다: 3AB, 3-aminobutyrate; 3AIB, 3-aminoisobutyrate; 3AP, 3-aminopropionate; 3AV, 3-aminovalerate; 3HB, 3-hydroxybutyrate; 4AB, 4-aminobutyrate; 5AV, 5-aminovalerate; 6AC, 6-aminocaproate; 7AH, 7-aminoheptanoate.
도 3은 여러개의 아미노산 단량체를 한번에 포함하는 폴리(에스터 아마이드)의 생합성을 확인한 분석 결과이다. PEA01 균주를 MR배지에 (RS)-3HB와 3AP, 3AP/(RS)-3AB 혹은 3AP/(RS)-3AB/(RS)-3AV 첨가하여 배양하였을 때 3AP, (R)-3AB 혹은 (R)-3AV 단량체 분률. 3AP, (R)-3AB 혹은 (R)-3AV의 분률은 각각 핑크, 노랑 및 오렌지색으로 표기하였다. 화학물질의 약어는 다음과 같다: 3AP, 3-aminopropionate; 3AV, 3-aminovalerate.
도 4은 정제된 beta-alanine coenzyme A transferase를 이용하여 다양한 기질에 반응성을 분석한 결과이다. a, 아미노산, 하이드록시산 혹은 카르복실산으로 분류되는 여러가지 기질에 대한 Act의 in vitro assay를 보여주는 모식도. b, 아미노산, 하이드록시산 혹은 카르복실산에 대한 Act의 효소 활성. c, Act가 활성을 보인 기질들의 화학구조. 화학물질의 약어는 다음과 같다: 2AB, 2-aminobutyrate; 3AB, 3-aminobutyrate; 3AIB, 3-aminoisobutyrate; 3AP, 3-aminopropionate; 3AV, 3-aminovalerate; 3HB, 3-hydroxybutyrate; 4AB, 4-aminobutyrate; 5AV, 5-aminovalerate; 6AC, 6-aminocaproate; 7AH, 7-aminoheptanoate; ALA, alanine; BPA, β-phenylalanine; GLY, glycine; PAB, p-aminobenzoate.
도 5는 포도당을 유일한 탄소원으로 이용하여 폴리(에스터 아마이드)를 생산하는 균주의 도식도 및 분석 결과 및 유가식 배양 발효를 통한 폴리(에스터 아마이드)의 생산을 보여주는 결과이다. a, PEA06 균주를 MR배지서 배양하는 모식도. b, (a)에 나타낸 모식도에 따라 PEA06 균주를 배양하여 얻은 고분자의 3AP 단량체의 분률. c, PEA07 균주를 MR배지서 배양하는 모식도. d, (c)에 나타낸 모식도에 따라 PEA07 균주를 배양하여 얻은 고분자의 4AB 단량체의 분률. 여러개의 대사회로의 경우 검정 점선 화살표로 표기하였다. 비활성화된 반응은 빨간 “X” 마크로 표기하였다. e, PEA06 균주를 포도당을 유일한 탄소원으로 사용하였을 때 유가 배양식 발효 프로파일. 세포 농도, 고분자 함량, 포도당 농도는 각각 회색, 오렌지색, 흰색, 검정색 동그라미로 표기되었다. 화학물질의 약어는 다음과 같다: 3-aminopropionate; 3HB, 3-hydroxybutyrate; 4AB, 4-aminobutyrate; AKG, α-ketoglutarate; PEP, phosphoenolpyruvate; LA, lactate.
도 6은 대표적인 폴리(에스터 아마이드)인 폴리(3-하이드록시뷰티레이트-ran-3-아미노프로피오네이트)를 여러가지 polyhydroxyalkanoate synthase를 이용하여 생합성할 수 있다는 것을 보여주는 결과이다. 표기된 유전자들은 각자 아래의 효소를 나타낸다: C. necator, Aeromonas caviae, Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida으로부터 유래된 야생형 class I PhaC들 (각각 PhaCCne, PhaCAca, PhaCAhy, PhaCAsa) 그리고 Pseudomonas sp. MBEL 6-19, Pseudomonas sp. 61-3, Pseudomonas putida KT2440, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas resinovorans균주 유래의 엔지니어링된 (E130D, S325T, S477G, Q481K 변형 포함) class II PhaC들 (각각 PhaC1437Ps6-19, PhaC1437Ps61-3, PhaC1437Ppu, PhaC1437Pae, PhaC1437Pch, PhaC1437Pre).
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 일 실시예에서, 다양한 아미노산을 기질로 하는 코엔자임 A 전이효소(coenzyme A transferase)를 코딩하는 유전자 및 PHA 합성효소(polyhydroxyalkanoate synthase)를 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 미생물을 사용하여, 다양한 탄소원(예, 아미노산, 당, 유기산 등)으로부터 폴리(에스터 아마이드)를 합성할 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명의 다른 실시예에서, 글루코스로부터 하이드록시 산 및 아미노산을 합성능을 갖도록 추가적으로 유전자 도입된 재조합 미생물에서 글루코스를 단일 탄소원으로 폴리(에스터 아마이드)를 합성할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 코엔자임 A 전이효소(Coenzyme A transferase)를 코딩하는 유전자 및 PHA 합성효소(polyhydroxyalkanoate synthase)를 코딩하는 유전자가 도입 또는 증폭되어 있는 폴리(에스터 아마이드)의 합성능을 갖는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 1종 이상의 코엔자임 A 전이효소(Coenzyme A transferase)를 코딩하는 유전자 및 1종 이상의 PHA 합성효소(polyhydroxyalkanoate synthase)를 코딩하는 유전자가 도입된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 재조합 미생물은 아미노산을 포함하는 유기산을 전구체로 하여 이를 단량체로 포함하는 폴리(에스터 아마이드)를 합성할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서, 상기 재조합 미생물은 아미노산 및 하이드록시산을 전구체로 하여 이들을 포함하는 폴리(에스터 아마이드)를 합성할 수 있다.
본 발명의 재조합 미생물에 도입 또는 증폭된 i) 코엔자임 A 전이효소(Coenzyme A transferase)는 아미노산을 포함하는 유기산을 전구체로 아실-CoA의 합성을 촉매하며, ii) PHA 합성효소는 합성된 아실-CoA의 중합을 통한 폴리(에스터 아마이드)의 합성을 촉매하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어, “코엔자임 A 전이효소(Coenzyme A transferase)”는 아실-CoA 공여체에서 카르복실산으로 코엔자임 A 그룹의 전이 반응을 촉매하는 전이효소를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 코엔자임 A 전이효소(Coenzyme A transferase)는 아미노산을 기질로 하여, 아미노 아실-CoA의 합성을 촉매하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 아미노산은 단백질을 구성하는 단백질 구성 아미노산 및 비단백 아미노산을 모두 포함하는 의미로 사용된다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질 구성 아미노산은 예를 들어 진핵 생물에서 발견되는 21종의 천연 아미노산 또는 이의 이성질체 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 보다 바람직하게는 상기 아미노산은 비단백 아미노산일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 비단백 아미노산은 상기 단백질 구성 아미노산 외에 아미노기(-NH2) 및 카르복실기(-COOH)를 포함하는 모든 유기산을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 비단백 아미노산은 예를 들어, 2-아미노뷰티레이트(2-aminobutyrate), 3-아미노프로피오네이트(3-aminopropionate), 아이소세린(Isoserine), 3-아미노뷰티레이트(3-aminobutyrate), 3-아미노발러레이트(3-aminovalerate), 베타-페닐알라닌 (beta-phenylalanine; BPA), 4-아미노뷰티레이트(4-aminobutyrate), 4-아미노-3-메틸뷰티레이트(4-amino-3-methylbutyrate), 5-아미노발러레이트(5-aminovalerate), 6-아미노카프로에이트(6-aminocaproate), 7-아미노헵타노에이트(7-aminoheptanoate), 3-아미노아이소뷰티레이트(3-aminoisobutyrate), 파라-아미노벤조에이트(para-aminobenzoate; PAB) 및 이의 이성질체로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 코엔자임 A 전이효소(Coenzyme A transferase)는 아미노산 외에도 다른 카르복실산을 기질로 하여, 아실-CoA를 합성하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 카르복실산은 바람직하게는 수산화기를 포함하는 하이드록시산일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 하이드록시산은 상기 단백질 구성 아미노산 외에 하이드록실기(-OH) 및 카르복실기(-COOH)를 포함하는 모든 유기산을 포함한다. 본 발명에 있어서, 상기 하이드록시산은 예를 들어, 글리콜레이트(glycolate), 락테이트(lactate), 2-하이드록시뷰티레이트(2-hydroxybutyrate), 3-하이드록시프로피오네이트(3-hydroxypropionate), 3-하이드록시뷰티레이트(3-hydroxybutyrate), 그 이상의 탄소 사슬을 포함하는 카르복실산 및 이의 이성질체로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 카르복실산은 아미노산 및 하이드록시산 외의 예를 들어, 프로피오네이트(propionate), 뷰티레이트(butyrate), 이소뷰티레이트(isobutyrate), 발러레이트(valerate), 이소발러레이트(isovalerate), 2-메틸뷰티레이트(2-methylbutyrate), 카프로에이트(caproate), 말로네이트(malonate), 숙시네이트(succinate), 그 이상의 탄소 사슬을 포함하는 카르복실산 및 이의 이성질체로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 이성질체는 구조 이성질체 또는 입체 이성질체 일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 카르복실산이 아미노산 또는 하이드록시산인 경우, 상기 이성질체는 예를 들어 (R)-형 또는 (S)-형 입체 이성질체를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
특히, 본 발명에 있어서, 상기 이성질체는 바람직하게는 (R)-형 입체 이성질체일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 코엔자임 A 전이효소는 야생형, 자연 발생 변이체 또는 인위적으로 엔지니어링된 변이체를 포함한다. 바람직하게는 베타-알라닌 코엔자임 A 전이효소, 프로피오네이트 코엔자임 A 전이효소, 및 아이소카프레닐 코엔자임 A:2-하이드록시아이소카프로일 코엔자임 A 전이효소로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 코엔자임 A 전이효소의 유전자는 다양한 생물로부터 유래한 것일 수 있다. 보다 바람직한 예를 들어, 클로스트리듐 프로피오니쿰(Clostridium propionicum) 유래의 act 유전자, 클로스트리듐 프로피오니쿰 유래의 엔지니어링된 pct유전자 (pct540), 및 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile) 유래의 hadA 유전자로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 바람직한 예를 들어, 상기 코엔자임 A 전이효소는 서열번호 1 내지 3에서 선택되는 서열 또는 이와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 상동성을 갖는 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 코엔자임 A 전이효소를 코딩하는 유전자의 서열은 본 기술분야에서 널리 사용되는 데이터 베이스 또는 상기한 코엔자임 A 전이효소의 아미노산 서열로부터 쉽게 수득할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 코엔자임 A 전이효소를 코딩하는 유전자의 서열은 본 기술분야에 잘 알려진 방법을 통해, 숙주 미생물에 적합하도록 코돈 최적화(codon optimization)될 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 서열번호 1을 포함하는 코엔자임 A 전이효소는 다양한 유기산을 기질로 할 수 있음을 확인하였다. 예를 들어, 상기 기질은 카르복시산, 바람직하게는 아미노산 또는 하이드록시산, 가장 바람직하게는, 글리신, 알라닌(바람직하게는 (S)-알라닌), 2-아미노뷰티레이트(2-aminobutyrate), 3-아미노뷰티레이트(3-aminobutyrate), 3-아미노아이소뷰티레이트(3-aminoisobutyrate), 3-아미노발러레이트(3-aminovalerate), 베타-페닐알라닌 (beta-phenylalanine; BPA), 4-아미노뷰티레이트(4-aminobutyrate), 파라-아미노벤조에이트(para-aminobenzoate; PAB), 5-아미노발러레이트(5-aminovalerate), 6-아미노카프로에이트(6-aminocaproate), 7-아미노헵타노에이트(7-aminoheptanoate), 글리콜레이트, 락테이트, 2-하이드록시뷰티레이트(2-hydroxybutyrate), 3-하이드록시프로피오네이트(3-hydroxypropionate), 3-하이드록시뷰티레이트(3-hydroxybutyrate), 프로피오네이트(propionate), 뷰티레이트(butyrate), 이소뷰티레이트(isobutyrate), 발러레이트(valerate), 이소발러레이트(isovalerate), 2-메틸뷰티레이트(2-methylbutyrate), 카프로에이트(caproate), 말로네이트(malonate), 숙시네이트(succinate) 및 이의 이성질체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 이성질체는 구조 이성질체 또는 입체 이성질체 일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 카르복실산이 아미노산 또는 하이드록시산인 경우, 상기 이성질체는 예를 들어 (R)-형 또는 (S)-형 입체 이성질체, 보다 바람직하게는 (R)-형 이성질체인 것일 수 있다.
본 발명의 용어, “PHA 합성효소(polyhydroxyalkanoate synthase)”는 하이드록시 아실-CoA로부터 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoate)를 합성하는 효소를 의미한다. 본 발명에서는 상기 PHA 합성효소가 아미노 아실-CoA을 기질로 하여 폴리(에스터 아마이드)를 합성할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 PHA 합성효소는 야생형, 자연 발생 변이체 또는 인위적으로 엔지니어링된 변이체를 포함한다. 본 발명에 있어서, 상기 PHA 합성 효소는 Class I PhaC 또는 Class II PhaC인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 엔지니어링된 PHA 합성효소의 유전자 서열은 예를 들어 Jung et al., Biotechnol. Bioeng., 105: 161- 171, 2010에 기재되어 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 PHA 합성효소를 코딩하는 유전자는 다양한 생물로부터 유래한 phaC 유전자 또는 이의 변이체인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 PHA 합성효소를 코딩하는 유전자는 다양한 생물로부터 유래한 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 PHA 합성효소를 코딩하는 유전자는 PHA 합성 활성을 갖고 있는 미생물이라면 제한없이 이로부터 유래할 수 있다. 바람직한 예를 들어, 상기 PHA 합성효소를 코딩하는 유전자는 큐프리아비더스 네케터 (Cupriavidus necator), 에어로모나스 케비에 (Aeromonas caviae), 에어로모나스 하이드로필리아 (Aeromonas hydrophila), 에어로모나스 살모니시다 (Aeromonas salmonicida), 슈도모나스 MBEL 6-19 (Pseudomonas sp. MBEL 6-19), 슈도모나스 61-3 (Pseudomonas sp. 61-3), 슈도모나스 푸티다 KT2440 (Pseudomonas putida KT2440), 슈도모나스 아르지노사 PAO1 (Pseudomonas aeruginosa PAO1), 슈도모나스 클로로라피스 (Pseudomonas chlororaphis), 및 슈도모나스 레시노보렌스 (Pseudomonas resinovorans)로 구성된 군에서 선택되는 균주로부터 유래한 phaC 유전자인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 바람직한 예를 들어, 상기 PHA 합성효소의 단백질 서열은 서열번호 4 내지 13에서 선택되는 서열 또는 이와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 상동성을 갖는 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 PHA 합성효소를 코딩하는 유전자의 서열은 본 기술분야에서 널리 사용되는 데이터 베이스 또는 상기한 PHA 합성효소의 아미노산 서열로부터 쉽게 수득할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 PHA 합성효소를 코딩하는 유전자의 서열은 본 기술분야에 잘 알려진 방법을 통해, 숙주 미생물에 적합하도록 코돈 최적화(codon optimization)될 수 있다.
본 발명의 용어, “폴리(에스터 아마이드) (Poly(ester aminde))는 에스터 결합 (ester bond)와 아마이드 결합 (amide bond)을 모두 가지고 있는 고분자를 제한없이 포함하는 의미로 사용된다. 아미노산 기반의 폴리(에스터 아마이드)를 포함하는 다양한 폴리(에스터 아마이드)의 구조 및 유용성은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다(예, Polym. Chem., 2016, 7, 7039-7046).
본 발명에 있어서, 상기 폴리(에스터 아마이드)는 상기 코엔자임 A 전이효소의 기질이 되는 유기산을 단량체로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리(에스터 아마이드)는 상기 코엔자임 A 전이효소의 기질이 되는 아미노산을 단량체로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리(에스터 아마이드)는 상기 코엔자임 A 전이효소의 기질이 되는 아미노산 및 하이드록시산을 단량체로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 비제한적인 예를 들어, 상기 폴리(에스터 아마이드)는 하기 화학식으로 표시되는 구조를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나,이에 제한되는 것은 아니다:
여기서, R1 내지 R4는 각각 독립적으로 제한 없는 임의의 화학적 잔기일 수 있으며, 바람직하게는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 알콜 또는 아민이고,
x, y, n, 및m은 각각 독립적으로 0 또는 1 이상의 정수임.
(0은 존재하지 않음을 의미함)
본 발명에 있어서, 상기 폴리(에스터 아마이드)는 1종 이상의 단량체를 포함하는 중합체인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물에 의해 합성되는 폴리(에스터 아마이드)에 포함되는 단량체 및 이의 구성비율은 폴리(에스터 아마이드)의 단량체(즉, 전구체)가 되는 유기산(예, 아미노산 및 하이드록시산)의 수준에 따라 조절될 수 있음은 통상의 기술자에게 자명하다 할 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, 예를 들어, 상기 재조합 미생물에 의해 합성되는 폴리(에스터 아마이드)에 포함되는 단량체 및 이의 구성비율은 공급되는 탄소원(당 도는 유기산)의 농도 및 비율에 의해 조절될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 예를 들어, 상기 재조합 미생물에 의해 합성되는 폴리(에스터 아마이드)에 포함되는 단량체 및 이의 구성비율은 상기 재조합 미생물의 전구체 생합성 수준에 따라 조절될 수 있으며, 상기 전구체 생합성 수준은 유전자 엔지니어링을 통한 전구체 생합성 경로의 신설, 강화, 약화, 차단을 통해 조절될 수도 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 코엔자임 A 전이효소(Coenzyme A transferase)를 코딩하는 유전자 및 PHA 합성효소(polyhydroxyalkanoate synthase)를 코딩하는 유전자가 도입 또는 증폭되는 숙주 미생물은 대장균(Escherichia coli), 리조비움(Rhizobium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 로도코커스 (Rhodococcus), 칸디다 (Candida), 에르위니아(Erwinia), 엔테로박터(Enterobacter), 파스테렐라(Pasteurella), 맨하이미아(Mannheimia), 액티노바실러스(Actinobacillus), 아그레가티박터(Aggregatibacter), 잔토모나스(Xanthomonas), 비브리오(Vibrio), 슈도모나스(Pseudomonas), 아조토박터(Azotobacter), 애시네토박터(Acinetobacter), 랄스토니아(Ralstonia), 아그로박테리움(Agrobacterium), 아스퍼질러스(Aspergillus). 로도박터(Rhodobacter), 자이모모나스(Zymomonas), 바실러스(Bacillus), 스테필로코커스(Staphylococcus), 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 사이아노박테리움(Cyanobacterium), 사카로마이세스 (Saccharomyceses) 및 사이클로박테리움(Cyclobacterium)로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 예를 들어 상기 숙주 미생물은 바람직하게는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 아스퍼질러스 나이저(Aspergillus niger), 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyceses cerevisiae) 및 사카로마이세스 폼베(Saccharomyces pombe)로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 숙주 미생물은 가장 바람직하게는 대장균일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 재조합 미생물에 다양한 탄소원(하이드록시산, 당, 아미노산)을 공급하는 경우, 이를 기질로 하여 폴리(에스터 아마이드)를 합성할 수 있음을 확인하였으며, 상기 재조합 미생물의 추가적인 유전자 변형을 통해 전구체(예, 하이드록시산 및 아미노산)을 합성능을 갖도록 엔지니어링하는 경우 하나의 탄소원(예, 포도당)으로부터 폴리(에스터 아마이드)를 합성할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 재조합 미생물은 코엔자임 A 전이효소 또는 pha의 기질 생성능을 갖지 않는 것을 특징으로 할 수 있다. 이 코엔자임 A 전이효소 또는 pha의 기질을 외부로부터 공급하여 폴리(에스터 아마이드)를 합성할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 재조합 미생물은 탄소원으로부터 코엔자임 A 전이효소의 기질이 되는 유기산(바람직하게는 아미노산)으로의 생합성 경로를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 유기산은 예를 들어, 아미노산인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 탄소원은 예를 들어, 당 또는 유기산일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 탄소원으로서 당은 예를 들어, 글루코오스, 수크로오스, 갈락토오스, 말토오스, 자일로오스, 글리세롤, 프럭토오스 및 슈가케인(sugar cane)을 포함하는 단당류, 이당류, 다당류로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 유기산은 상기 탄소원의 대사 경로에서 생성되는 유기산(예, 피루베이트, 글루타메이트 등)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, ‘생합성 경로’는 상기 유기산의 전구체로부터 효소 반응을 통해 목적 물질을 생성할 수 있는 생물학적 경로를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 선천적으로 코엔자임 A 전이효소의 기질이 되는 유기산의 생합성 경로를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 코엔자임 A 전이효소의 기질이 되는 유기산의 생합성 경로를 갖도록 엔지니어링될 수 있다. 예를 들어, 상기 생합성 경로 관련 유전자의 도입, 증폭, 약화 또는 결실을 통해 코엔자임 A 전이효소의 기질이 되는 유기산의 생합성 경로가 신설, 강화, 약화 또는 차단된 것을 특징으로 할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 실시예의 표 2와 같이, 같이 상기 재조합 미생물은 ldhA 유전자의 결실 또는 약화; phaAB 유전자의 도입 또는 증폭; davAB 유전자의 도입 또는 증폭; panD 유전자 또는 gadB 유전자의 도입 또는 증폭 중 어느 하나 이상의 추가 엔지니어링을 통해 하이드록시 아실-CoA 및 아미노산의 생성을 강화하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, “숙주 미생물”은 다른 세포 또는 기관에서 유래된 기능성 유전자 및/또는 유전자 산물을 발현할 수 있는 임의의 미생물을 의미하며, 보다 구체적으로는 본 발명의 코엔자임 A 전이효소를 코딩하는 유전자 및 PHA 합성효소를 코딩하는 유전자가 도입 또는 증폭되기 전의 미생물을 의미한다.
본 발명의 용어, "재조합"은 숙주세포 내에서 자연적으로 발생하지 않은 폴리뉴클레오티드 또는 단백질을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명에서 도입은 유전자가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 유전자가 형질전환된 것으로, 형질 전환된 유전자는 미생물 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 미생물의 염색체 내에 삽입된 것이든 염색체 외에 위치하고 있는 것이든 어느 것이든지 포함될 수 있다. 또한, 상기 유전자는 단백질을 코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드로 DNA 및 RNA를 포함할 수 있다.
본원에서, "유전자"란 최광의의 의미로 간주되어야 하며, 구조 단백질 또는 조절 단백질을 암호화할 수 있다. 이때, 조절단백질은 전사인자, 열 충격단백질 또는 DNA/RNA 복제, 전사 및/또는 번역에 관여하는 단백질을 포함한다.
본 발명에서 "증폭" 또는 “강화”란 해당 유전자의 일부 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나, 일부 염기를 도입시키거나, 또는 동일한 효소를 코딩하는 다른 미생물 유래의 유전자를 도입시켜 대응하는 효소의 활성을 증가시키거나, 결과적으로 해당 경로의 진행을 강화시키는 것을 포괄하는 개념이다.
본 발명에서 "약화"란 해당 유전자의 일부 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나 일부 염기를 도입시켜 해당유전자에 의해 발현되는 효소의 활성을 감소시키는 것을 포괄하는 개념으로, 해당 유전자의 효소가 관여하는 생합성경로의 일부 또는 상당부분을 차단하는 모든 것을 포함한다.
본 발명에서 '결실'이란 해당 유전자의 일부 또는 전체 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나, 일부 염기를 도입시켜 해당유전자가 발현되지 않도록 하거나 발현되더라도 효소 활성을 나타내지 못하도록 하는 것을 포괄하는 개념으로, 해당 유전자의 효소가 관여하는 생합성경로를 차단하는 모든 것을 포함한다.
본 발명에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수 개에서 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 원점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단 부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다. 라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 형질전환은 칼슘 클로라이드 방법 또는 전기천공법(electroporation) (Neumann, et al. EMBO J., 1:841, 1982) 등을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다.
본 발명에서 염기서열은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동 가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본 발명에 있어서, 모든 유전자는 적절한 프로모터와 함께 숙주 미생물로 도입될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 있어서, 상기 유전자들은 lac, lacUV5, trc, tac, trp, araBAD, T3, T5, T7, L10, I16, H30, H36, sod, tuf, eftu, Pm 및 Ptet 로 구성된 군에서 선택된 프로모터와 함께 도입되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 다른 관점에서, (a) 본 발명의 재조합 미생물을 배양하여 폴리(에스터 아마이드)를 생성하는 단계 및; (b) 상기 생성된 폴리(에스터 아마이드)를 회수하는 단계를 포함하는 폴리(에스터 아마이드)의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 외부로부터 배양액에 탄소원을 첨가하여 배양함으로써, 폴리(에스터 아마이드)를 생산할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 탄소원은 당, 아미노산 및 하이드록시산으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 앞서 재조합 미생물과 관련하여 설명한 것과 같이 숙주 미생물이 선천적으로, 또는 추가적인 유전자 엔지니어링을 통해 본 발명의 코엔자임 A 전이요소의 기질이되는 유기산 (예, 하이드록시산 또는 아미노산)의 생합성 경로를 갖는 경우, 단일 탄소원 첨가 또는 외부로부터 별도의 탄소원 첨가 없이도 본 발명의 재조합 미생물의 배양을 통해 폴리(에스터 아마이드)를 생산할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서. 다음의 단계를 포함하는 폴리(에스터 아마이드)의 제조방법에 관한 것이다:
(a) 본 발명의 재조합 미생물을 코엔자임 A 전이효소의 기질이 되는 유기산이 첨가된 배지에서 배양하여 폴리(에스터 아마이드)를 생산하는 단계; 및
(b) 상기 생성된 폴리(에스터 아마이드)를 회수하는 단계.
본 발명에 있어서, 재조합 미생물의 배양과정은 통상적으로 알려진 배양방법을 사용하여 수행될 수 있고, 본 발명의 실시예에서 사용된 특정 배지 및 특정 배양방법 이외에도 유청(whey), CSL(corn steep liquor) 등의 당화액과 다른 배지를 사용할 수 있고, 유가배양(fed-batch culture), 연속배양 등 다양한 방법을 사용할 수 있다(Lee et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 26: 63, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 58: 663, 2002; Lee et al., Biotechnol. Lett., 25: 111, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 54: 23, 2000; Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 72: 41, 2001).
본 발명의 용어 “배양”은 미생물을 배양하여, 목적하고자 하는 효능을 이끌어 내는 것을 의미하며, 본 발명에서 목적하고자 하는 효능은 소수성 물질의 생산을 의미한다. 상기 배양은 사용되는 미생물에 최적화되고 적어도 1종의 단순 에너지 공급원 및 필요한 경우에 공동-기질을 함유하는 적절한 배양 배지를 갖는 배양기에서 일반적으로 수행될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 “배양”은 미생물 배양을 통한 소수성 물질의 생산의 의미에서, “발효”와 상호호환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물을 배양하여 소수성 물질을 생산하는 단계는 유가식 발효를 통해 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어 “유가식 배양” 또는 “유가식 발효”는 배지를 간헐적으로 추가 공급하여 배양액의 농도를 제어하여 배양/발효 시키는 것을 의미한다.
"적절한 배양 배지"는 탄소 공급원 또는 탄소 기질, 질소 공급원, 예를 들어 펩톤, 포도당, 글리세롤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 우레아, 황산암모늄, 염화암모늄, 질산암모늄 및 인산암모늄; 인 공급원, 예를 들어 인산일칼륨 또는 인산이칼륨; 미량 원소 (예를 들어, 금속 염), 예를 들어 마그네슘 염, 코발트 염 및/또는 망가니즈 염; 뿐만 아니라 성장 인자, 예컨대 아미노산 및 비타민과 같이, 세포의 유지 및/또는 성장에 필수적이거나 유익한 영양소; 효모 추출물, 항생제 등을 포함할 수 있다.본 발명에 있어서, 상기 배양은 소수성 물질을 생산하기 위해 적절한 범위의 온도에서 배양되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 예를 들어20 ℃ 내지 40 ℃, 바람직하게는 25 ℃ 내지 35 ℃에서 배양되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 숙주 미생물의 종, 발현하고자 하는 물질 등에 따라 상이한 조건으로 배양될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환 되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다. 포유동물 세포 배양물 발현을 위한 전형적인 발현 벡터는 예를 들면 pRK5 (EP 307,247호), pSV16B (WO 91/08291호) 및 pVL1392 (Pharmingen)을 기초로 한다.
"발현 조절 서열 (expression control sequence)"이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열 중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 RNA 폴리메라아제 프로모터 Φ10은 이. 콜라이에서 단백질 NSP를 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결 (operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열 (pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본원 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능 하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질 감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.
발명의 숙주 세포는 원핵 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 또한, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 이. 콜라이, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO 및 생쥐 세포같은 동물 세포, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 그린 원숭이 세포, 및 조직배양된 인간 세포는 사용될 수 있는 숙주 세포의 예이다. 본 발명의 NSP 단백질을 코딩하는 cDNA를 클로닝할 때에는 동물세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다. COS 세포를 이용하는 경우에는 COS 세포에서 SV40 라지 T안티겐(large T antigen)이 발현하고 있으므로 SV40의 복제개시점을 갖는 플라스미드는 세포중에서 다수 카피(copy)의 에피솜(episome)으로 존재하도록 되고 통상보다 고 발현이 기대될 수 있다. 도입된 DNA 서열은 숙주 세포와 동일한 종으로부터 얻을 수 있거나, 숙주 세포와 다른 종의 것일 수 있거나, 또는 그것은 어떠한 이종 또는 상동성 DNA를 포함하는 하이브리드 DNA 서열일 수 있다.
물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나 당업자라면 과도한 실험적 부담 없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위 내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 NSP 단백질의 cDNA를 클로닝 하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.
본 발명의 정의상 "실질적으로 순수한"이란 본 발명에 따른 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열이 박테리아로부터 유래된 다른 단백질을 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다.
재조합 단백질을 발현하기 위한 숙주세포는 짧은 시간 내 고농도 균체 배양이 가능하고 유전자 조작이 용이하고 유전학적, 생리적 특징이 잘 밝혀져 있는 대장균 (Escherichia coli), 고초균 (Bacillus subtillis) 등과 같은 원핵세포가 널리 이용되어 왔다. 그러나, 단백질의 번역 후 수식 (post-translational modification), 분비과정 및 활성형의 3차원 구조, 단백질의 활성상태의 문제점들을 해결하기 위해 최근 단세포 진핵세포인 효모 계열 (Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha 등), 사상성 진균류 (filamentous fungi), 곤충세포 (insect cells), 식물세포, 포유동물세포 (mammalian cells) 등 고등생물에 이르기까지 재조합 단백질 생산의 숙주세포로 활용하고 있으므로, 실시예에서 예시된 대장균뿐만 아니라 다른 숙주세포를 이용하는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 용이하게 적용 가능하다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법으로 제조된 폴리(에스터 아마이드)에 관한 것이다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 유전자 엔지니어링을 위한 백터의 제작
실시예 1-1: pTac15k_davAB 백터
pKE112_davAB 백터(Park et al., Metab. Eng. 16:42-47 2013)를 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 14 및 15의 프라이머로 PCR을 수행하여, 5-aminovaleramide aminohydrolase와 L-lysine monooxygenase를 코딩하는 davAB 유전자 절편을 제작하였다.
[서열번호 14] P1:
5'-AGACAGGAATTCATGCGCATCGCTCTGTACC-3'
[서열번호 15] P2:
5'-AGACAGGGATCCTCAATCCGCCAG-3'
다음으로, 상기 davAB 절편과 tac 프로모터의 강한 유전자 발현을 진행하는 pTac15k(US patent 20110269183) 플라스미드에 제한효소(EcoRI 및 BamHI)를 처리한 후, T4 DNA 라이게이즈를 처리하여, 제한효소로 절단된 davAB절편 및 pTac15k 플라스미드를 접합시킴으로써, 재조합 플라스미드인 pTac15k_davAB를 제작하였다.
실시예 1-2: pTac15k_act_davAB 백터
pKE112_davAB 백터(Park et al., Metab. Eng. 16:42-47 2013)를 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 16 및 17의 프라이머로 PCR을 수행하여, 5-aminovaleramide aminohydrolase와 L-lysine monooxygenase를 코딩하는 davAB 유전자 절편을 제작하였다.
[서열번호 16] P3:
5'-AGACAGGAGCTCTTTCACACAGGAAACAATGCGCATCGCTCTGTACC-3'
[서열번호 17] P4:
5'-AGACAGCTGCAGTCAATCCGCCAGGGCG-3'
다음으로, 상기 davAB 절편과 tac 프로모터의 강한 유전자 발현을 진행하는 pTac15k_act 백터(Chae et al., Metab. Eng. 41: 82-91, 2017)에 제한효소(SacI 및 PstI)를 처리한 후, T4 DNA 라이게이즈를 처리하여, 제한효소로 절단된 davAB절편 및 pTac15k_act 백터를 접합시킴으로써, 재조합 플라스미드인 pTac15k_act_davAB를 제작하였다.
실시예 1-3: pTac15k_act_panD 백터
코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 18과 19의 프라이머로 PCR을 수행하여, aspartate decarboxylase를 코딩하는 panD 유전자 절편을 제작하였다.
[서열번호 18] P5:
5'-AGACAGGAGCTCTTTCACACAGGAAACAATGCTGCGCACCATCC-3'
[서열번호 19] P6:
5'-AGACAGGGTACCCTAAATGCTTCTCGACGTCAAAAG-3'
다음으로, 상기 panD 절편과 pTac15k_act 플라스미드(Chae et al., Metab. Eng. 41: 82-91, 2017) 플라스미드에 제한효소(SacI 및 KpnI)를 처리한 후, T4 DNA 라이게이즈를 처리하여, 제한효소로 절단된 panD편 및 pTac15k_act플라스미드를 접합시킴으로써, 재조합 플라스미드인 pTac15k_act_panD 제작하였다.
실시예 1-4: pPs619C1437PhaAB 백터
큐프리아비더스 네케터 (Cupriavidus necator) 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 20과 21의 프라이머로 PCR을 수행하여, acetyl-CoA acetyltransferase와 acetoacetyl-CoA reductase를 코딩하는 phaAB 유전자 절편을 제작하였다.
[서열번호 20] P7:
5'-AGACAGTTCGAATAGTGACGGCAGAGAGACAATCAAATC-3'
[서열번호 21] P8:
5'-AGACAGCCTGCAGGCCTGCCG-3'
다음으로, 상기 phaAB 절편과 pPs619C1437Pct540 플라스미드(Jung et al., Biotechnol. Bioeng., 105: 161- 171, 2010)에 제한효소(BstBI 및 SbfI)를 처리한 후, T4 DNA 라이게이즈를 처리하여, 제한효소로 절단된 phaAB절편 및 pPs619C1437Pct540 플라스미드를 접합시킴으로써, 재조합 플라스미드인 pPs619C1437PhaAB를 제작하였다.
실시예 1-5: pCneCPct540 백터
큐프리아비더스 네케터 (Cupriavidus necator) 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 22와 23의 프라이머로 PCR을 수행하여, polyhydroxyalkanoate synthase를 코딩하는 phaCCne 유전자 절편을 제작하였다.
다음으로, 상기 phaCCne 절편과 pPs619C1437Pct540 플라스미드(Jung et al., Biotechnol. Bioeng., 105: 161- 171, 2010)에 제한효소(BstBI 및 SbfI)를 처리한 후, T4 DNA 라이게이즈를 처리하여, 제한효소로 절단된 phaCCne절편 및 pPs619C1437Pct540 플라스미드를 접합시킴으로써, 재조합 플라스미드인 pCneCPct540를 제작하였다.
실시예 1-6: pAcaCPct540, pAhyCPct540, pAsaCPct540 백터
에어로모나스 케비에 (Aeromonas caviae), 에어로모나스 하이드로필리아 (Aeromonas hydrophila), 에어로모나스 살모니시다 (Aeromonas salmonicida) 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 24과 25의 프라이머로 PCR을 수행하여, polyhydroxyalkanoate synthase를 코딩하는 phaCAca, phaCAhy, phaCAsa 유전자 절편을 제작하였다.
다음으로, 상기 phaCAca, phaCAhy, phaCAsa 유전자 절편과 pPs619C1437Pct540 플라스미드(Jung et al., Biotechnol. Bioeng., 105: 161- 171, 2010)에 제한효소(BstBI 및 SbfI)를 처리한 후, T4 DNA 라이게이즈를 처리하여, 제한효소로 절단된 phaCAca, phaCAhy, phaCAsa 유전자 절편 및 pPs619C1437Pct540 플라스미드를 접합시킴으로써, 재조합 플라스미드인 pAcaCPct540, pAhyCPct540, pAsaCPct540를 제작하였다.
실시예 1-1 내지 1-6에서 제작된 벡터의 정보는 아래 표 1과 같다.
실시예 2: 재조합 미생물 제작
실시예 1에서 제조된 벡터를 사용하여 아래 표 2의 재조합 미생물들을 제작하였다.
미생물 내에서 beta-alanine coenzyme A transferase를 코딩하는 act 유전자가 발현이 되도록 제작한 pTac15k_act 플라스미드(Chae et al., Metab. Eng. 41: 82-91, 2017)와 엔지니어링 된 polyhydroxyalkanoate synthase를 코딩하는 phaC1437Ps6-19 유전자와 엔지니어링된 propionate coenzyme A transferase를 코딩하는 pct540 유전자가 발현이 되로록 제작한 pPs619C1437Pct540 플라스미드 (Jung et al., Biotechnol. Bioeng., 105: 161- 171, 2010)를 대장균 XL1-Blue (Stratagene)에 도입하여 재조합 미생물을 제조하였으며(PEA01), 공백터인 pTac15k가 도입된 대장균 (PEA00)을 대조군 균주로 사용하였다.
또한, 다양한 탄소원에서의 생산 가능성을 확인하기 위해, 미생물 내에서 beta-alanine coenzyme A transferase를 코딩하는 act 유전자, 5-aminovaleramide aminohydrolase를 코딩하는 davA 유전자, L-lysine monooxygenase를 코딩하는 davB 유전자가 발현이 되도록 실시예 1-2에서 제작된 pTac15k_act_davAB 백터를 대장균 XL1-Blue/pPs619C1437Pct540에 도입하여 재조합 미생물을 제조하였으며(PEA03), 실시예 1-1에서 제작된 pTac15k_davAB가 도입된 대장균 (PEA02)를 대조군 균주로 사용하였다.
또한, 포도당을 유일한 탄소원으로 이용한 생산 가능성 및 유가식 배양 발효를 통한 고효율 생산을 확인하기 위해, 엔지니어링 된 polyhydroxyalkanoate synthase를 코딩하는 phaC1437Ps6-19 유전자, acetyl-CoA acetyltransferase를 코딩하는 phaA 유전자와 acetoacetyl-CoA reductase를 코딩하는 phaB 유전자가 발현이 되도록 실시예 1에서 제작한 pPs619C1437PhaAB 플라스미드를 대장균 XL1-Blue ΔldhA에 도입하여 재조합 미생물을 제조하였으며(XL1-Blue ΔldhA/pPs619C1437PhaAB), 해당 균주에 beta-alanine coenzyme A transferase를 코딩하는 act 유전자와 aspartate decarboxylase를 코딩하는 panD 유전자가 발현이 되도록 실시예 1에서 제작된 pTac15k_act_panD 백터 혹은 beta-alanine coenzyme A transferase를 코딩하는 act 유전자와 엔지니어링 된 glutamate decarboxylase를 코딩하는 gadB_mut 유전자가 발현이 되도록 제작된 pTac15k_act_gadB_mut(Chae et al., Metab. Eng. 41: 82-91, 2017)가 도입된 대장균 (PEA06와 PEA07) 균주를 사용하였다. 해당 균주들의 대조군으로 XL1-Blue ΔldhA/pPs619C1437PhaAB 균주에 panD 혹은 gadB_mut 유전자를 발현하지 않는 pTac15k_act (Chae et al., Metab. Eng. 41: 82-91, 2017)가 도입된 대장균 (PEA05) 균주를 대조군으로 사용하였다.
또한, 다양한 미생물 유래의 polyhydroxyalkanoate synthase의 활용 가능성을 확인하기 위하여, 큐프리아비더스 네케터 (Cupriavidus necator), 에어로모나스 케비에 (Aeromonas caviae), 에어로모나스 하이드로필리아 (Aeromonas hydrophila), 에어로모나스 살모니시다 (Aeromonas salmonicida), 슈도모나스 MBEL 6-19 (Pseudomonas sp. MBEL 6-19), 슈도모나스 61-3 (Pseudomonas sp. 61-3), 슈도모나스 푸티다 KT2440 (Pseudomonas putida KT2440), 슈도모나스 아르지노사 PAO1 (Pseudomonas aeruginosa PAO1), 슈도모나스 클로로라피스 (Pseudomonas chlororaphis), 슈도모나스 레시노보렌스 (Pseudomonas resinovorans)유래의 polyhydroxyalkanoate synthase를 코딩하는 phaC 유전자를 발현이되도록 실시예 1에서 구축한 pCneCPct540, pAcaCPct540, pAhyCPct540, pAsaCPct540 백터들과 앞서 보고된 pPs619C1437Pct540, pPs613C1437Pct540, pPpuC1437Pct540, pPaeC1437Pct540, pPchC1437Pct540, pPreC1437Pct540 백터들(Yang et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 90: 603-614, 2011)을 각각 대장균 XL1-Blue ΔldhA/pTac15k_act에 도입하여 재조합 미생물을 제조하였다 (PEA08, PEA09, PEA10, PEA11, PEA04, PEA12, PEA13, PEA14, PEA15, PEA16)
실시예 3: 재조합 미생물을 이용한 3-아미노프로피오네이트, 4-아미노뷰티레이트를 단량체로 포함한 폴리(에스터 아마이드) 생산 확인
실시예 2에서 제조한 재조합 미생물(PEA00, PEA01)을 10mL LB 배지에 접종하여 37℃에서 8시간 동안 전배양을 수행하고, 전배양한 배양액 1.0mL을 350mL 플라스크에 100mL의 MR배지에 접종하여 배양하였다.
MR배지 (pH 7.0)의 조성은 증류수 1리터당 20g 포도당, 6.67g KH2PO4, 4.0g (NH4)2HPO4, 0.8g citric acid, 0.8g MgSO4ㆍ7H2O, 0.01g CaCl2ㆍ2H20, 5mL trace metal solution (증류수 1리터 당 10 g FeSO4ㆍ7H2O, 2.2g ZnSO4ㆍ4H2O, 0.58g MnSO4ㆍ4H2O, 1g CuSO4ㆍ5H2O, 0.1g (NH4)6Mo7O24ㆍ4H2O, 0.02g Na2B4O7ㆍ10H2O)의 성분으로 구성된 배지이다. 상기 조성에서 기존 beta-alanine coenzyme A transferase의 기질로 알려진 아미노산들인 3-아미노프로피오네이트, 4-아미노뷰티레이트, 5-아미노발러레이트, 6-아미노카프로에이트, 7-아미노헵타노에이트를 2g/L 농도로 추가 탄소원으로 공급하였다. 또한 2 g/L의 sodium (RS)-3-하이드록이뷰티레이트 역시 추가 공급하였다. 배양은 96시간동안 30℃와 200rpm으로 작동하는 shaking incubator(jSR, 한국)에서 진행하였다. 배양이 끝난, 배양액은 13,200 rpm에서 10분간 원심분리하여, 세포를 채취하여 분석을 수행함으로써, 폴리에스터 아미이드 생산을 확인하였다.
그 결과, 도 2에 개시된 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 미생물이 3-아미노프로피오네이트와 4-아미노뷰티레이트를 단량체로 갖고있는 폴리(에스터 아마이드)를 생산함을 확인할 수 있었다.
이 결과로부터, 본 발명에 따른 재조합 미생물이 3-아미노프로피오네이트와 4-아미노뷰티레이트를 단량체로 갖고있는 폴리(에스터 아마이드)를 생성함을 확인하였다.
실시예 4: 재조합 미생물을 이용한 5-아미노발러레이트를 단량체로 포함한 폴리(에스터 아마이드) 생산 확인
실시예 2에서 제조한 재조합 미생물(PEA02, PEA03)을 10mL LB 배지에 접종하여 37℃에서 8시간 동안 전배양을 수행하고, 전배양한 배양액 1.0mL을 350mL 플라스크에 100mL의 MR배지에 접종하여 배양하였다.
MR배지 (pH 7.0)의 조성은 증류수 1리터당 20g 포도당, 6.67g KH2PO4, 4.0g (NH4)2HPO4, 0.8g citric acid, 0.8g MgSO4ㆍ7H2O, 0.01g CaCl2ㆍ2H20, 5mL trace metal solution (증류수 1리터 당 10 g FeSO4ㆍ7H2O, 2.2g ZnSO4ㆍ4H2O, 0.58g MnSO4ㆍ4H2O, 1g CuSO4ㆍ5H2O, 0.1g (NH4)6Mo7O24ㆍ4H2O, 0.02g Na2B4O7ㆍ10H2O)의 성분으로 구성된 배지이다. 상기 조성에서 davAB 유전자로 인해 5-아미노발러레이트로 전환될 수 있는 L-라이신을 2g/L 농도로 추가 탄소원으로 공급하였다. 또한 2 g/L의 sodium (RS)-3-하이드록이뷰티레이트 역시 추가 공급하였다. 배양은 96시간동안 30℃와 200rpm으로 작동하는 shaking incubator(jSR, 한국)에서 진행하였다. 배양이 끝난, 배양액은 13,200 rpm에서 10분간 원심분리하여, 세포를 채취하여 분석을 수행함으로써, 폴리 에스터 아미이드 생산을 확인하였다.
그 결과, 도 2에 개시된 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 미생물은 L-라이신을 탄소원으로 사용하여 5-아미노발러레이트를 단량체로 가지는 폴리(에스터 아마이드)를 생산하는 것을 확인하였다.
이 결과로부터, 본 발명에 따른 재조합 미생물이 5-아미노발러레이트를 단량체로 가지는 폴리(에스터 아마이드)를 성공적으로 생성함을 확인하였다.
실시예 5: beta-alanine coenzyme A transferase의 추가 기질 확인을 위한 in vitro assay
폴리(에스터 아마이드)의 아미노산 단량체 종류들 더 넓히기 위하여 기존 알려진 기질 외에 beta-alanine coenzyme A transferase가 활성을 갖고 있는 기질을 찾기 위해 in vitro assay를 진행하였다. beta-alanine coenzyme A transferase의 정제를 위해서 pETa_his_act 백터(Chae et al., Metab. Eng. 41: 82-91, 2017)를 대장균 BL21(DE3)(F- ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm (DE3) a prophage carrying the T7 RNA polymerase gene) (New England Biolabs, 미국)에 도입하였다.
Enzyme assay는 50mM potassium phosphate buffer (pH 7.5)에서 진행하였다. Enzyme assay에 필요한 기질 및 효소는 아래와 같이 양으로 넣어주었다. 10mM의 타겟 기질, 1mM의 acetyl-CoA 그리고 2.5μg의 정제된 beta-alanine coenzyme A transferase를 첨가하여 2시간동안 30℃에서 반응을 진행하였다.
그 결과, 도 4에 개시된 바와 같이, 기존 알려진 3-아미노프로피오네이트, 4-아미노뷰티레이트, 5-아미노발러레이트, 6-아미노카프로에이트, 7-아미노헵타노에니트 이외에 아미노산 기질인 (RS)-3-아미노뷰티레이트, 3-아미노아이소뷰티레이트, (RS)-3-아미노발러레이트에도 활성을 갖고 있음을 확인하였다. 또한 아미노산이 아닌 다섯가지의 하이드록시산 (글라이콜레이트, (RS)-락테이트, (RS)-2-하이드록시뷰티레이트, 3-하이드록시프로피오네이트, (RS)-3-하이드록시뷰티레이트) 및 일곱가지의 카르복실산 (프로피오네이트, 뷰티레이트, 아이소뷰티레이트, 발러레이트, 아이소발러레이트, 2-메틸뷰티레이트, 카프로에이트)에도 활성이 있음을 확인하였다.
이 결과로부터, 본 발명에 따라 beta-alanine coenzyme A transferase가 성공적으로 기존 알려진 기질 이외에 여러 가지 아미노산, 하이드록시산 및 카르복실산을 coenzyme A 유도체로 전환시키는 것을 확인하였다.
실시예 6: 재조합 미생물을 이용한 (R)-3-아미노뷰티레이트, 3-아미노아이소뷰티레이트, (R)-3-아미노발러레이트를 단량체로 포함한 폴리(에스터 아마이드) 생산 확인
실시예 2에서 제조한 재조합 미생물(PEA00, PEA01)을 10mL LB 배지에 접종하여 37℃에서 8시간 동안 전배양을 수행하고, 전배양한 배양액 1.0mL을 350mL 플라스크에 100mL의 MR배지에 접종하여 배양하였다.
MR배지 (pH 7.0)의 조성은 증류수 1리터당 20g 포도당, 6.67g KH2PO4, 4.0g (NH4)2HPO4, 0.8g citric acid, 0.8g MgSO4ㆍ7H2O, 0.01g CaCl2ㆍ2H20, 5mL trace metal solution (증류수 1리터 당 10 g FeSO4ㆍ7H2O, 2.2g ZnSO4ㆍ4H2O, 0.58g MnSO4ㆍ4H2O, 1g CuSO4ㆍ5H2O, 0.1g (NH4)6Mo7O24ㆍ4H2O, 0.02g Na2B4O7ㆍ10H2O)의 성분으로 구성된 배지이다. 상기 조성에서 실시예 5에서 새롭게 beta-alanine coenzyme A transferase의 기질로 알려진 아미노산들인 (RS)-3-아미노뷰티레이트, 3-아미노아이소뷰티레이트, (RS)-3-아미노발러레이트를 2g/L 농도로 추가 탄소원으로 공급하였다. 또한 2 g/L의 sodium (RS)-3-하이드록이뷰티레이트 역시 추가 공급하였다. 배양은 96시간동안 30℃와 200rpm으로 작동하는 shaking incubator(jSR, 한국)에서 진행하였다. 배양이 끝난, 배양액은 13,200 rpm에서 10분간 원심분리하여, 세포를 채취하여 분석을 수행함으로써, 폴리에스터 아미이드 생산을 확인하였다.
그 결과, 도 2에 개시된 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 미생물이 (R)-3-아미노뷰티레이트, 3-아미노아이소뷰티레이트, (R)-3-아미노발러레이트를 단량체로 갖고있는 폴리(에스터 아마이드)를 생산함을 확인할 수 있었다.
이 결과로부터, 본 발명에 따른 재조합 미생물이 (R)-3-아미노뷰티레이트, 3-아미노아이소뷰티레이트, (R)-3-아미노발러레이트를 단량체로 갖고있는 폴리(에스터 아마이드)를 생성함을 확인하였다.
실시예 7: 재조합 미생물을 이용한 여러가지 아미노산을 단량체로 포함한 폴리(에스터 아마이드) 생산 확인
실시예 2에서 제조한 재조합 미생물(PEA00, PEA01)을 10mL LB 배지에 접종하여 37℃에서 8시간 동안 전배양을 수행하고, 전배양한 배양액 1.0mL을 350mL 플라스크에 100mL의 MR배지에 접종하여 배양하였다.
MR배지 (pH 7.0)의 조성은 증류수 1리터당 20g 포도당, 6.67g KH2PO4, 4.0g (NH4)2HPO4, 0.8g citric acid, 0.8g MgSO4ㆍ7H2O, 0.01g CaCl2ㆍ2H20, 5mL trace metal solution (증류수 1리터 당 10 g FeSO4ㆍ7H2O, 2.2g ZnSO4ㆍ4H2O, 0.58g MnSO4ㆍ4H2O, 1g CuSO4ㆍ5H2O, 0.1g (NH4)6Mo7O24ㆍ4H2O, 0.02g Na2B4O7ㆍ10H2O)의 성분으로 구성된 배지이다. 상기 조성에서 기존 beta-alanine coenzyme A transferase의 기질로 알려진 아미노산들인 두가지(3-아미노프로피오네이트/(RS)-3-아미노뷰티레이트) 혹은 세가지(3-아미노프로피오네이트/(RS)-3-아미노뷰티레이트/(RS)-3-아미노아이소뷰티레이트)를 조합하여 추가 탄소원으로 공급하였다. 또한 2 g/L의 sodium (RS)-3-하이드록이뷰티레이트 역시 추가 공급하였다. 배양은 96시간동안 30℃와 200rpm으로 작동하는 shaking incubator(jSR, 한국)에서 진행하였다. 배양이 끝난, 배양액은 13,200 rpm에서 10분간 원심분리하여, 세포를 채취하여 분석을 수행함으로써, 폴리에스터 아미이드 생산을 확인하였다.
그 결과, 도 3에 개시된 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 미생물이 두가지 (3-아미노프로피오네이트와 (R)-3-아미노뷰티레이트) 및 세가지 (3-아미노프로피오네이트, (R)-3-아미노뷰티레이트와 (R)-3-아미노아이소뷰티레이트)를 통시에 단량체로 갖고있는 폴리(에스터 아마이드)를 생산함을 확인할 수 있었다.
이 결과로부터, 본 발명에 따른 재조합 미생물이 여러가지 아미노산을 단량체로 갖고 있는 폴리(에스터 아마이드)를 생성함을 확인하였다.
실시예 8: 재조합 미생물을 이용한 포도당을 유일한 탄소원으로 사용한 폴리(에스터 아마이드) 생산 확인
실시예 2에서 제조한 재조합 미생물(PEA05, PEA06 혹은 PEA07)을 10mL LB 배지에 접종하여 37℃에서 8시간 동안 전배양을 수행하고, 전배양한 배양액 1.0mL을 350mL 플라스크에 100mL의 MR배지에 접종하여 배양하였다. PEA06 균주와 PEA07균주는 각각 3-아미노프로피오네트와 4-아미노뷰티레이트를 생합성하는 대사흐름을 증가시키기 위해 panD와 gadB_mut 유전자가 과발현된 균주이다. 또한 두 균주는 포도당으로 부터 3-하이드록시뷰티릴 코엔자임 A의 생합성이 가능하게 만들어 외부 하이드록시산의 도입 없이도 하이드록시산 단량체를 제공하는 것을 가능하게 하기 위해 phaAB 유전자가 도입되어 있다. 또한 목표로한 3-하이드록시뷰티레이트 이외에 락테이트가 하이드록시산 단량체로 고분자화 되는 것을 방지하기 위하여 락테이트 생합성에 필요한 ldhA유전자가 결실된 균주를 사용하였다.
MR배지 (pH 7.0)의 조성은 증류수 1리터당 20g 포도당, 6.67g KH2PO4, 4.0g (NH4)2HPO4, 0.8g citric acid, 0.8g MgSO4ㆍ7H2O, 0.01g CaCl2ㆍ2H20, 5mL trace metal solution (증류수 1리터 당 10 g FeSO4ㆍ7H2O, 2.2g ZnSO4ㆍ4H2O, 0.58g MnSO4ㆍ4H2O, 1g CuSO4ㆍ5H2O, 0.1g (NH4)6Mo7O24ㆍ4H2O, 0.02g Na2B4O7ㆍ10H2O)의 성분으로 구성된 배지이다. 상기 조성에서 앞 실시예들과 다르게 어떠한 아미노산 및 sodium (RS)-3-하이드록시뷰티레이트를 추가로 공급하지 않아 포도당이 유일한 탄소원으로 이용될 수 있도록 하였다. 배양은 96시간동안 30℃와 200rpm으로 작동하는 shaking incubator(jSR, 한국)에서 진행하였다. 배양이 끝난, 배양액은 13,200 rpm에서 10분간 원심분리하여, 세포를 채취하여 분석을 수행함으로써, 폴리에스터 아미이드 생산을 확인하였다.
그 결과, 도 5에 개시된 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 미생물이 3-아미노프로피오네티트(도 5a,b) 혹은 4-아미노뷰티레이트(도 5c,d)를 단량체로 갖고있는 폴리(에스터 아마이드)를 생산함을 확인할 수 있었다.
이 결과로부터, 본 발명에 따른 재조합 미생물이 포도당을 유일한 탄소원으로 이용하여 폴리(에스터 아마이드)를 생성함을 확인하였다.
실시예 9: 재조합 미생물의 유가식 배양 발효를 이용한 3-아미노프르피오네이트를 단량체로 갖는 폴리(에스터 아마이드)의 고효율 생산 확인
실시예 2에서 제조한 재조합 미생물(PEA06)을 200mL LB 배지에 접종하여 37℃에서 8시간 동안 전배양을 수행하고, 전배양한 배양액 200mL을 6.6L 발효기에에 2L의 MR배지에 접종하여 유가식 배양 발효를 하였다.
MR배지 (pH 7.0)의 조성은 증류수 1리터당 20g 포도당, 6.67g KH2PO4, 4.0g (NH4)2HPO4, 0.8g citric acid, 0.8g MgSO4ㆍ7H2O, 0.01g CaCl2ㆍ2H20, 5mL trace metal solution (증류수 1리터 당 10 g FeSO4ㆍ7H2O, 2.2g ZnSO4ㆍ4H2O, 0.58g MnSO4ㆍ4H2O, 1g CuSO4ㆍ5H2O, 0.1g (NH4)6Mo7O24ㆍ4H2O, 0.02g Na2B4O7ㆍ10H2O)의 성분으로 구성된 배지이다. 유일 탄소원인 포도당이 모두 소모될때 마다 1리터당 700g 포도당, 8g MgSO4ㆍ7H2O로 구성된 feeding solution을 추가로 공급하였다. 배양은 96시간동안 30℃와 dissolved oxygen level을 40%로 유지하도록 작동하는 bioreactor(New Brunswick Scientific Co, NJ)에서 진행하였다. 배양이 끝난, 배양액은 13,200 rpm에서 10분간 원심분리하여, 세포를 채취하여 분석을 수행함으로써, 폴리에스터 아미이드 생산을 확인하였다.
그 결과, 도 5e에 개시된 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 미생물이 3-아미노프로피오네티트를 단량체로 갖고있는 폴리(에스터 아마이드)를 높은 생산 농도, 생산성 및 수율로 생산함을 확인할 수 있었다.
이 결과로부터, 본 발명에 따른 재조합 미생물이 유가식 배양 발효를 활용하여 높은 효율로 폴리(에스터 아마이드)를 생성함을 확인하였다.
실시예 10: 다양한 미생물 유래의 polyhydroxyalkanoate를 사용하여 폴리(에스터 아마이드) 생산 확인
실시예 2에서 제조한 재조합 미생물(PEA08, PEA09, PEA10, PEA11, PEA04, PEA12, PEA13, PEA14, PEA15, PEA16)을 10mL LB 배지에 접종하여 37℃에서 8시간 동안 전배양을 수행하고, 전배양한 배양액 1.0mL을 350mL 플라스크에 100mL의 LB배지에 접종하여 배양하였다.
LB배지의 조성은 증류수 1리터당 10g tryptone, 5g yeast extract, 10g NaCl의 성분으로 구성된 배지이다. 상기 조성에서 beta-alanine coenzyme A transferase의 기질로 알려진 아미노산들인 3-아미노프로피오네이트를 2 g/L 농도로 추가 탄소원으로 공급하였다. 또한 50 g/L의 sodium (RS)-3-하이드록이뷰티레이트 역시 추가 공급하였다. 배양은 96시간동안 30℃와 200rpm으로 작동하는 shaking incubator(jSR, 한국)에서 진행하였다. 배양이 끝난, 배양액은 13,200 rpm에서 10분간 원심분리하여, 세포를 채취하여 분석을 수행함으로써, 폴리에스터 아미이드 생산을 확인하였다.
그 결과, 도 6에 개시된 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 미생물이 모두 3-아미노프로피오네이트를 단량체로 갖고 있고 다양한 분자량을 갖고있는 폴리(에스터 아마이드)를 생산함을 확인할 수 있었다.
이 결과로부터, 본 발명에 따른 재조합 미생물들이 3-아미노프로피오네이트를 단량체로 갖고 있는 폴리(에스터 아마이드)를 생성함을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명의 재조합 미생물은 포도당, 아미노산, 하이드록시산, 카르복실산 등과 같은 다양한 탄소원으로부터 폴리(에스터 아마이드) 고분자를 생합성할 수 있으므로, 폴리(에스터 아마이드)의 산업적 생산에 유용하다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (18)

  1. 숙주 미생물에 코엔자임 A 전이효소(Coenzyme A transferase)를 코딩하는 유전자 및 PHA 합성효소(polyhydroxyalkanoate synthase)를 코딩하는 유전자가 도입 또는 증폭되어 있는, 폴리(에스터 아마이드)의 생성능을 갖는 재조합 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 탄소원으로부터 상기 코엔자임 A 전이효소의 기질이 되는 유기산의 생합성 경로를 갖는 것을 보유하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 탄소원은 당 또는 유기산인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 코엔자임 A 전이효소의 기질이 되는 유기산은 아미노산 및 하이드록시산 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 코엔자임 A 전이효소는 아미노산을 기질로 하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 아미노산은 글리신, 알라닌, 2-아미노뷰티레이트(2-aminobutyrate), 3-아미노프로피오네이트(3-aminopropionate), 아이소세린(Isoserine), 3-아미노뷰티레이트(3-aminobutyrate), 3-아미노발러레이트(3-aminovalerate), 베타-페닐알라닌 (beta-phenylalanine; BPA), 4-아미노뷰티레이트(4-aminobutyrate), 4-아미노-3-메틸뷰티레이트(4-amino-3-methylbutyrate), 5-아미노발러레이트(5-aminovalerate), 6-아미노카프로에이트(6-aminocaproate), 7-아미노헵타노에이트(7-aminoheptanoate), 3-아미노아이소뷰티레이트(3-aminoisobutyrate), 파라-아미노벤조에이트(para-aminobenzoate; PAB) 및 이의 이성질체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 코엔자임 A 전이효소는 베타-알라닌 코엔자임 A 전이효소인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 코엔자임 A 전이효소를 코딩하는 유전자는 클로스트리듐 프로피오니쿰(Clostridium propionicum) 유래의 act 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 코엔자임 A 전이효소는 서열번호1 내지 3에서 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 PHA 합성효소는 PhaC인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 PHA 합성효소를 코딩하는 유전자는 큐프리아비더스 네케터 (Cupriavidus necator), 에어로모나스 케비에 (Aeromonas caviae), 에어로모나스 하이드로필리아 (Aeromonas hydrophila), 에어로모나스 살모니시다 (Aeromonas salmonicida), 슈도모나스 MBEL 6-19 (Pseudomonas sp. MBEL 6-19), 슈도모나스 61-3 (Pseudomonas sp. 61-3), 슈도모나스 푸티다 KT2440 (Pseudomonas putida KT2440), 슈도모나스 아르지노사 PAO1 (Pseudomonas aeruginosa PAO1), 슈도모나스 클로로라피스 (Pseudomonas chlororaphis), 및 슈도모나스 레시노보렌스 (Pseudomonas resinovorans)로 구성된 군에서 선택되는 균주로부터 유래한 phaC 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 PHA 합성효소는 서열번호 4 내지 13으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 폴리(에스터 아마이드)는 상기 코엔자임 A 전이효소의 기질이 되는 유기산을 단량체로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 코엔자임 A 전이효소의 기질이 되는 유기산은 글리신, 알라닌, 2-아미노뷰티레이트(2-aminobutyrate), 3-아미노프로피오네이트(3-aminopropionate), 아이소세린(Isoserine), 3-아미노뷰티레이트(3-aminobutyrate), 3-아미노아이소뷰티레이트(3-aminoisobutyrate), 3-아미노발러레이트(3-aminovalerate), 베타-페닐알라닌 (beta-phenylalanine; BPA), 4-아미노뷰티레이트(4-aminobutyrate), 4-아미노-3-메틸뷰티레이트(4-amino-3-methylbutyrate), 파라-아미노벤조에이트(para-aminobenzoate; PAB), 5-아미노발러레이트(5-aminovalerate), 6-아미노카프로에이트(6-aminocaproate), 7-아미노헵타노에이트(7-aminoheptanoate), 글리콜레이트, 락테이트, 2-하이드록시뷰티레이트(2-hydroxybutyrate), 3-하이드록시프로피오네이트(3-hydroxypropionate), 3-하이드록시뷰티레이트(3-hydroxybutyrate), 프로피오네이트(propionate), 뷰티레이트(butyrate), 이소뷰티레이트(isobutyrate), 발러레이트(valerate), 이소발러레이트(isovalerate), 2-메틸뷰티레이트(2-methylbutyrate), 카프로에이트(caproate), 말로네이트(malonate), 숙시네이트(succinate) 및 이의 이성질체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 숙주 미생물은 상기 재조합 미생물은 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  16. 다음의 단계를 포함하는 폴리(에스터 아마이드)의 제조방법:
    (a) 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 배양하여 폴리(에스터 아마이드)를 생산하는 단계; 및
    (b) 상기 생산된 폴리(에스터 아마이드)를 회수하는 단계.
  17. 다음의 단계를 포함하는 폴리(에스터 아마이드)의 제조방법:
    (a) 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 코엔자임 A 전이효소의 기질이 되는 유기산이 첨가된 배지에서 배양하여 폴리(에스터 아마이드)를 생산하는 단계; 및
    (b) 상기 생산된 폴리(에스터 아마이드)를 회수하는 단계.
  18. 제16항의 방법으로 제조된 폴리(에스터 아마이드).
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101085960B1 (ko) * 2009-04-08 2011-11-22 주식회사 엘지화학 락테이트­글라이콜레이트 공중합체 또는 락테이트­글라이콜레이트­하이드록시알카노에이트 공중합체 생성능을 가지는 세포 또는 식물을 이용한 락테이트­글라이콜레이트 공중합체 또는 락테이트­글라이콜레이트­하이드록시알카노에이트 공중합체의 제조방법
US20150337275A1 (en) * 2011-06-30 2015-11-26 Invista Technologies S.A.R.L. Bioconversion process for producing nylon-7, nylon-7,7 and polyesters
KR20160122073A (ko) * 2015-04-13 2016-10-21 한국과학기술원 락탐의 제조방법
KR20190108892A (ko) * 2018-03-15 2019-09-25 주식회사 엘지화학 미생물을 이용한 폴리(3-하이드록시프로피오네이트-b-락테이트) 블록공중합체
KR20220153598A (ko) * 2020-03-14 2022-11-18 모지아 바이오테크 리미티드 유기 및 무기 불순물이 감소된 바이오-기반 나일론 전구체

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101085960B1 (ko) * 2009-04-08 2011-11-22 주식회사 엘지화학 락테이트­글라이콜레이트 공중합체 또는 락테이트­글라이콜레이트­하이드록시알카노에이트 공중합체 생성능을 가지는 세포 또는 식물을 이용한 락테이트­글라이콜레이트 공중합체 또는 락테이트­글라이콜레이트­하이드록시알카노에이트 공중합체의 제조방법
US20150337275A1 (en) * 2011-06-30 2015-11-26 Invista Technologies S.A.R.L. Bioconversion process for producing nylon-7, nylon-7,7 and polyesters
KR20160122073A (ko) * 2015-04-13 2016-10-21 한국과학기술원 락탐의 제조방법
KR20190108892A (ko) * 2018-03-15 2019-09-25 주식회사 엘지화학 미생물을 이용한 폴리(3-하이드록시프로피오네이트-b-락테이트) 블록공중합체
KR20220153598A (ko) * 2020-03-14 2022-11-18 모지아 바이오테크 리미티드 유기 및 무기 불순물이 감소된 바이오-기반 나일론 전구체

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HA C, CHO WON-JEI: "Miscibility, properties, and biodegradability of microbial polyester containing blends", PROGRESS IN POLYMER SCIENCE, PERGAMON PRESS, OXFORD., GB, vol. 27, no. 4, 1 May 2002 (2002-05-01), GB , pages 759 - 809, XP093337359, ISSN: 0079-6700, DOI: 10.1016/S0079-6700(01)00050-8 *

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