WO2025129663A1 - Rna-蛋白质互作的检测方法 - Google Patents

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王欧
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陈奥
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    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms

Definitions

  • the present disclosure relates to the field of bioinformatics, and in particular to a method for constructing an RNA array, a kit for preparing an RNA array, and a method and device for detecting RNA-protein interaction and a kit.
  • RNA RNA binding protein
  • RNA-protein interactions based on high-throughput sequencing chips have been reported: a.
  • the Greenleaf and Lis team used the Illumina second-generation sequencing platform, and connected streptavidin and transcription termination protein Tus to the end of the DNA transcription template as a roadblock, so that RNAP was blocked at the end of the DNA template during transcription, and RNA was tethered to the DNA template through RNAP, thereby constructing a high-throughput RNA array and achieving binding with the target protein.
  • RNA is fixed by the DNA template, and the presence of the DNA template interferes with the subsequent RNA-protein interaction, and the presence of the roadblock protein increases the complexity of the components of the RNA array on the chip surface.
  • the Smith team used nucleic acid in situ synthesis technology, specifically, after the polyethylene glycol chain was seeded on the chip surface, the DNA chain was synthesized at the free end of the polyethylene glycol chain by chemical method, and the synthesized DNA was used as a template for RNA array transcription, and then the DNA template was digested by DNA digestion enzyme to obtain a simple RNA array.
  • the chemical synthesis method used in this method limits the length of RNA to within 33 bases, which is not enough to complete the complete transcription of most functional RNAs. c.
  • RNA arrays by RNA transcription and capture, in which the transcription DNA template and the aptamer-based RNA capture sequence were fixed on different surfaces, and the RNA shed by transcription was captured by the array below through the upper and lower alignment.
  • this RNA transcription capture method can construct RNA up to 600 bases in length, the need for upper and lower alignment results in a larger single site area in the array, resulting in a lower density of the RNA array and a lower throughput.
  • the present disclosure aims to solve one of the technical problems in the related art at least to some extent.
  • the first nucleic acid comprises a first sequence for sequencing and a second sequence for transcription.
  • the second nucleic acid comprises a third sequence for capturing the target RNA strand, wherein the third sequence is at least partially complementary to the target RNA strand.
  • the complementary length between the third sequence and the target RNA chain is at least 20 bp.
  • the third sequence has modifications such as dibenzocyclooctyne (DBCO), cyclooctyne, alkyne or azide for immobilization.
  • DBCO dibenzocyclooctyne
  • cyclooctyne cyclooctyne
  • alkyne alkyne or azide for immobilization.
  • the method further comprises preparing the second nucleic acid fixed to the second chip, specifically comprising: synthesizing the second nucleic acid and optionally amplifying the second nucleic acid; and fixing the second nucleic acid on the second chip.
  • the method further comprises: sequencing the first nucleic acids to determine a first signal based on each of the first nucleic acids, wherein the first signal comprises a sequence and a position of each of the first nucleic acids on the first chip.
  • the method further comprises digesting the first nucleic acid to purify the RNA array.
  • the enzyme used to digest the first nucleic acid is a nuclease, preferably DNase I, DNase II, nuclease S1 and/or nuclease S7, more preferably nuclease S1.
  • the first chip and the second chip are different chips, and the second chip generates the RNA array by diffusion transfer.
  • the target protein carries a fluorescent marker
  • contacting the target protein with the RNA array to obtain RNA-protein interaction data includes: contacting the target protein with the RNA array; after contact, detecting the RNA array to collect a second signal, wherein the second signal is a fluorescent signal of the target protein bound to the RNA array; and obtaining the RNA-protein interaction data based on the second signal.
  • the first chip and the second chip are the same chip.
  • the first nucleic acid comprises a first sequence for sequencing and a second sequence for transcription.
  • the first sequence comprises a linker sequence and an identifier sequence
  • the second sequence comprises a promoter sequence and a DNA sequence encoding a target RNA chain.
  • the complementary length between the third sequence and the target RNA chain is greater than 20 bp, preferably 35 bp.
  • the first nucleic acid is covalently linked to the first chip; and the second nucleic acid is covalently linked to the second chip.
  • the RNA array comprises a plurality of different RNAs, and is used to detect the interaction between the target protein and the plurality of different RNAs to determine the affinity.
  • FIG1 is a schematic diagram of a method for constructing an RNA array according to an embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 4 is a schematic diagram of the principle of RNA transcription capture according to an embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 5 is a schematic diagram of the fluorescence visualization results of RNA transcription capture according to an embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 6 is a schematic diagram of the average fluorescence intensity results of RNA transcription capture according to an embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing the principle of RNA crosstalk verification according to an embodiment of the present disclosure.
  • FIG8 is a schematic diagram of the fluorescence visualization results of RNA crosstalk verification according to an embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 9 is a schematic diagram of the principle of RNA-protein interaction detection according to an embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 10 is a schematic diagram of the fluorescence visualization results of RNA transcription capture according to another embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 11 is a schematic diagram of the fluorescence visualization results of RNA-protein interaction detection according to an embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 12 is a diagram showing the effect of a morpholino base RNA capture primer according to an embodiment of the present disclosure.
  • RNA-binding proteins are proteins that can coordinate with one or more related RNAs to achieve biological functions. After binding to RNA, they play a role in regulating various biological processes. For example, (1) during transcription, the transcribed RNA can regulate its own transcription by coordinating RNA polymerase (RNAP) II; (2) long noncoding RNAs (lncRNAs) can directly affect the expression of other genes by interacting with proteins, such as XIST lncRNA, which can guide regulatory proteins to chromatin to silence chromosomes; (3) RNA can also affect RNA localization, splicing and other post-transcriptional regulation by interacting with proteins to regulate gene expression.
  • RNA-binding proteins proteins that can coordinate with one or more related RNAs to achieve biological functions. After binding to RNA, they play a role in regulating various biological processes. For example, (1) during transcription, the transcribed RNA can regulate its own transcription by coordinating RNA polymerase (RNAP) II; (2) long noncoding RNAs (lncRNAs) can directly
  • RNA to bind to RBPs lies in the complex structure of RNA and protein itself.
  • RNA In its natural state, RNA generally exists in a single-stranded form. Single-stranded RNA has a wealth of intramolecular interactions, including mismatched base bulges, stem-loops, pseudoknots, G-quadruplexes, divalent cation interactions, and non-classical base pairing.
  • Protein is also a biological macromolecule with a very complex spatial structure. Therefore, due to the complexity of the interaction between RNA and protein, the current methods for analyzing RNA sequences for the interaction between RNA and protein are very limited.
  • the DNA template used as the first nucleic acid in the disclosed embodiment is shown in FIG3 .
  • the DNA template includes a 5'-end circularization linker sequence, a T7 promoter sequence, a GFP adapter sequence, and a 3'-end circularization linker sequence that also serves as a second nucleic acid hybridization sequence.
  • the GFP adapter sequence is used to simulate the nucleic acid encoding the target RNA chain, and in this embodiment is included in the second sequence of the first nucleic acid.
  • the 3'-end circularization linker sequence acts as both a circularization linker sequence and a nucleic acid of the target RNA chain, and therefore can also be included in the second sequence of the first nucleic acid.
  • the DBCO-RNA capture primer (second nucleic acid, SEQ ID NO: 5) was diluted to a concentration of 10 nM-100 nM, and the diluted second nucleic acid was introduced into the chip in (5) and reacted at room temperature overnight to fix the second nucleic acid to the chip through a click chemistry reaction;
  • RNA i.e., the GFP aptamer
  • S1 enzyme Thermo Scientific TM S1 nuclease, catalog number: EN0321
  • RNA transcription capture results are shown in Figures 5 and 6.
  • Channel 1 on the chip is referred to as L1, which is the experimental group and the group for normal transcription capture;
  • L2 is the DNB control group, which is filled with PBS instead of transcription reagent.
  • Figure 5 is a visualization result of the chip photography, in which the L1 group channel shows obvious fluorescent bright spots, indicating that GFP RNA is transcribed on the chip and captured in situ, and no fluorescent signal is shown in the L2 channel.
  • Figure 6 is the average fluorescence intensity in the L1 and L2 channels. The above results show that RNA can be fixed on the chip surface by transcription and in situ capture, proving the feasibility of the RNA array construction method provided by the present disclosure.
  • the embodiment of the present disclosure uses two different nucleic acid sequences encoding different RNAs to prepare a DNA template, and also uses fluorescent probe hybridization to explore the degree of RNA crosstalk.
  • the specific steps are as follows:
  • the DBCO-RNA capture primer (second nucleic acid, SEQ ID NO: 5) was diluted to a concentration of 10 nM-100 nM, and the diluted second nucleic acid was introduced into the chip and reacted at room temperature overnight to fix the second nucleic acid to the chip through a click chemistry reaction;
  • RNA detection primers AF532-P1 primer AF532-CAATTGCGCCACGACGTTTCGTGCT, SEQ ID NO: 8
  • AF647-P2 primer AF647-AGCTTCTGTGGTGGCCCTCTTTTAA, SEQ ID NO: 9
  • AF532 fluorescence and AF647 fluorescence respectively, to the chip, react at 55°C for 2 min and at 30°C for 2 min, so that the primers hybridize with the RNA P1 and P2 transcribed from S1 and S2;
  • the detection primer AF532-P2 (AF532-AGCTTCTGTGGTGGCCCTCTTTTAA, SEQ ID NO: 12) with AF532 fluorescence is introduced into each chip for RNA hybridization detection.
  • the optimized second nucleic acid in this embodiment i.e., the backbone structure of the morpholino base RNA capture primer
  • the morpholino base RNA capture primer can resist digestion by a variety of nucleases and can stably bind to the target RNA single strand in a base pairing manner.
  • the optimization result is shown in FIG12(B).
  • DNase is used to digest DNB
  • the amount of target RNA retained by the morpholino base RNA capture primer is significantly higher than the amount of target RNA that can be retained by the natural base DBCO-RNA capture primer when S1 enzyme is used to digest DNB. This result shows that the construction of high-throughput transcription capture is feasible.
  • first and second are used for descriptive purposes only and should not be understood as indicating or implying relative importance or implicitly indicating the number of the indicated technical features.
  • a feature defined as “first” or “second” may explicitly or implicitly include at least one of the features.
  • “plurality” means at least two, such as two, three, etc., unless otherwise clearly and specifically defined.
  • a first feature being “above” or “below” a second feature may mean that the first and second features are in direct contact, or the first and second features are in indirect contact through an intermediate medium.
  • a first feature being “above”, “above” or “above” a second feature may mean that the first feature is directly above or obliquely above the second feature, or simply means that the first feature is higher in level than the second feature.
  • a first feature being “below”, “below” or “below” a second feature may mean that the first feature is directly below or obliquely below the second feature, or simply means that the first feature is lower in level than the second feature.
  • the terms “one embodiment”, “some embodiments”, “examples”, “specific examples”, or “some examples” and the like mean that the specific features, structures, materials or characteristics described in conjunction with the embodiment or example are included in at least one embodiment or example of the present disclosure.
  • the schematic representations of the above terms do not necessarily refer to the same embodiment or example.
  • the described specific features, structures, materials or characteristics may be combined in any one or more embodiments or examples in a suitable manner.
  • those skilled in the art may combine and combine the different embodiments or examples described in this specification and the features of the different embodiments or examples, unless they are contradictory.

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Abstract

提供了一种构建RNA阵列的方法、制备RNA阵列的试剂盒、一种RNA-蛋白质互作的检测方法及装置、试剂盒。该方法包括：基于固定于第一芯片的第一核酸，通过对所述第一核酸进行转录，获得目标RNA链；基于固定于第二芯片的第二核酸，利用所述第二核酸捕获所述目标RNA链，以获得所述RNA阵列。

Description

RNA-蛋白质互作的检测方法 技术领域
本公开涉及生物信息领域，具体涉及一种构建RNA阵列的方法、制备RNA阵列的试剂盒、RNA-蛋白质互作的检测方法及装置和试剂盒。
背景技术
RNA和蛋白质的相互作用在许多重要的生物学过程中发挥关键作用。除了应用于生命活动机理和生物进化方面的探索，RNA和蛋白质的相互作用已经被广泛应用于分子检测、疾病诊断及治疗等多个领域。RNA一般以单链形式存在，具有丰富分子内相互作用及其导致的复杂三维结构。这种结构正是RNA与RNA结合蛋白(RNA binding protein，RBP)结合的基础。由于RNA与蛋白相互作用的复杂性，目前通过分析RNA的序列以对RNA和蛋白之间的互相作用进行探索的方法十分有限。
目前已报道了一些基于高通量的测序芯片进行RNA与蛋白相互作用研究的方法：a.Greenleaf和Lis团队采用Illumina二代测序平台，通过在DNA转录模板末端连接链霉亲和素和转录终止蛋白Tus作为路障，使转录过程中RNAP被阻挡在DNA模板末端，RNA通过RNAP被系在DNA模板上，从而构建得到了高通量的RNA阵列并实现了与目标蛋白结合。但此方案中RNA通过DNA模板被固定，DNA模板的存在对后续的RNA蛋白相互作用造成干扰，且路障蛋白的存在增加了芯片表面RNA阵列的成分复杂性。b.为了实现DNA模板的消除，Smith团队采用核酸原位合成技术，具体将聚乙二醇链种在芯片表面后，通过化学法在聚乙二醇链游离端合成DNA链，合成的DNA作为模板进行RNA阵列的转录，后续通过DNA消化酶将DNA模板消化，得到单纯的RNA阵列。然而，该方法所使用的化学合成法将RNA的长度限制在33个碱基以内，不足以完成大多数功能性RNA的完整转录。c.为了消除RNA长度限制，Callaghan团队通过RNA转录并捕获的方式构建RNA阵列，其中转录DNA模板与基于适配体RNA捕获序列固定于不同表面，通过位置上下配准使转录脱落的RNA被下方阵列捕获。虽然这种RNA转录捕获的方式可以构建长达600碱基长度的RNA，但由于需要进行上下配准，导致阵列中单一位点面积较大，造成RNA阵列密度较低，通量较小。
由此，亟待提出一种更高通量、高灵敏度、低成本、高程度自动化的RNA与蛋白相互作用研究方法。
发明内容
本公开旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
为此，本公开的实施例提出一种构建RNA阵列的方法、制备RNA阵列的试剂盒、一种RNA-蛋白质互作的检测方法及装置、试剂盒。该方法基于固定于芯片的第一核酸，通过对所述第一核酸进行转录，获得目标RNA链；基于固定芯片的第二核酸，利用所述第二核酸捕获所述目标RNA链，以高通量获得长度较长的纯净RNA阵列。由此提高了RNA与蛋白相互作用的检测方法的通量，精确度和灵敏度。
本公开第一方面的实施例提供了一种构建RNA阵列的方法，包括：基于固定于第一芯片的第一核酸，通过对所述第一核酸进行转录，获得目标RNA链；基于固定于第二芯片的第二核酸，利用所述第二核酸捕获所述目标RNA链，以获得所述RNA阵列，其中所述第一核酸是DNA分子，并且所述第二核酸是DNA分子，可选地，所述第二核酸包含核苷酸类似物。
在一些实施例中，所述第一芯片和第二芯片为同一个或不同的芯片。
在一些实施例中，所述第一芯片和所述第二芯片为同一个芯片。
在一些实施例中，所述第一核酸包含用于测序的第一序列和用于转录的第二序列。
在一些实施例中，所述第一序列包含接头序列和标识符序列；所述第二序列包含启动子序列和编码所述目标RNA链的DNA序列。
在一些实施例中，所述方法还包括制备固定于所述第一芯片的所述第一核酸，具体包括：合成包含所述第一序列和所述第二序列的第一核酸；和将所述第一核酸固定于所述第一芯片上。
在一些实施例中，所述第二核酸包含用于捕获所述目标RNA链的第三序列，其中所述第三序列与所述目标RNA链至少部分互补。
在一些实施例中，所述第三序列与所述目标RNA链的互补长度为至少20bp。
在一些实施例中，所述第三序列与所述目标RNA链的互补长度为35bp。
在一些实施例中，所述第三序列具有用于固定的二苯并环辛炔(DBCO)、环辛炔(Cyclooctyne)、炔烃(Alkyne)或叠氮(Azide)等修饰。。
在一些实施例中，所述第一核酸选自由以下中的一种或多种：通过滚环扩增生成的DNA纳米球、通过桥式扩增生成的DNA簇、通过链置换合成方法生成的合成DNA链、通过喷墨打印或化学合成方法生成的合成DNA链。
在一些实施例中，所述方法还包括制备固定于所述第二芯片的所述第二核酸，具体包括：合成所述第二核酸和可选地扩增所述第二核酸；和将所述第二核酸固定于所述第二芯片上。
在一些实施例中，所述第一核酸与所述第一芯片通过非共价作用结合连接；所述第二核酸与所述第二芯片通过共价连接。
在一些实施例中，所述方法还包括：对所述第一核酸进行测序以确定基于各个所述第一核酸的第一信号，其中所述第一信号包含各个所述第一核酸在所述第一芯片上的序列和位置。
在一些实施例中，所述方法还包括消化所述第一核酸以对所述RNA阵列进行纯化。
在一些实施例中，用于消化所述第一核酸的酶为核酸酶，优选为DNA酶I、DNA酶II、核酸酶S1和/或核酸酶S7，更优选为核酸酶S1。
在一些实施例中，所述第一芯片和第二芯片为不同的芯片，所述第二芯片通过扩散转印的方式生成所述RNA阵列。
本公开第二方面的实施例提供了一种RNA-蛋白质互作的检测方法，包括：使目标蛋白与RNA阵列接触，以获得RNA-蛋白质互作数据，其中所述RNA阵列根据本公开第一方面任一实施例所述的构建RNA阵列的方法获得。
在一些实施例中，所述目标蛋白携带荧光标记，所述使目标蛋白与所述RNA阵列接触，以获得RNA-蛋白质互作数据包括：使所述目标蛋白与所述RNA阵列接触；接触后对所述RNA阵列进行检测以采集第二信号，其中所述第二信号为所述RNA阵列上结合的所述目标蛋白的荧光信号；和基于所述第二信号，获得所述RNA-蛋白质互作数据。
在一些实施例中，根据所述RNA-蛋白质互作数据，确定所述RNA阵列中各个RNA与所述目标蛋白的亲和度。
本公开第三方面的实施例提供了一种用于制备RNA阵列的试剂盒，包括：第一核酸，所述第一核酸固定于第一芯片上；第二核酸，所述第二核酸固定于第二芯片上；和可选的测序体系、转录体系和消化体系，其中所述第一核酸是DNA分子，并且所述第二核酸是DNA分子，可选地，所述第二核酸包含核苷酸类似物，所述第一芯片和所述第二芯片为同一个或不同的芯片。
在一些实施例中，所述第一芯片和所述第二芯片为同一个芯片。
在一些实施例中，所述第一核酸包含用于测序的第一序列和用于转录的第二序列。
在一些实施例中，所述第一序列包含接头序列和标识符序列；所述第二序列包含启动子序列和编码目标RNA链的DNA序列。
在一些实施例中，所述第二核酸包含用于捕获所述目标RNA链的第三序列，其中所述第三序列与所述目标RNA链至少部分互补。
在一些实施例中，所述第三序列与所述目标RNA链的互补长度为大于20bp，优选为35bp。
在一些实施例中，所述第一核酸选自由以下中的一种或多种：通过滚环扩增生成的DNA纳米球、通过桥式扩增生成的DNA簇、通过链置换合成方法生成的合成DNA链、通过喷墨打印或化学合成方法生成的合成DNA链；所述第二核酸为天然存在的核酸序列或人工构建的核酸序列。
在一些实施例中，所述第一核酸与所述第一芯片通过共价连接；所述第二核酸与所述第二芯片通过共价连接。
本公开第四方面的实施例提供了一种用于检测RNA-蛋白质互作的试剂盒，所述试剂盒包括RNA阵列，所述RNA阵列根据本公开第一方面任一实施例所述的构建RNA阵列的方法获得。
在一些实施例中，所述RNA阵列包含多个不同的RNA，用于检测目标蛋白与所述多个不同的RNA的互作以确定亲和度。
本公开第五方面的实施例提供了一种RNA-蛋白质互作检测装置，包括：RNA阵列构建模块，用于基于第一核酸、第二核酸、第一芯片和第二芯片构建所述RNA阵列，其中所述RNA阵列构建模块具体用于：基于固定于所述第一芯片的所述第一核酸，通过对所述第一核酸进行转录，获得目标RNA链；基于固定于所述第二芯片的所述第二核酸，利用所述第二核酸捕获所述目标RNA链，以获得所述RNA阵列；目标蛋白获取模块，用于获取所述目标蛋白；和RNA-蛋白质互作检测模块，用于通过使所述RNA阵列与所述目标蛋白接触，获得所述RNA-蛋白质互作数据，其中所述第一核酸是DNA分子，并且所述第二核酸是DNA分子，可选地，所述第二核酸包含核苷酸类似物，所述第一芯片和所述第二芯片为同一个或不同的芯片。
在一些实施例中，所述第一芯片和所述第二芯片为同一个芯片。
根据本公开实施例的具有的独立权利要求带来的优点和技术效果如下：
(1)通过本公开提供的方法可在一张芯片上高通量构建RNA阵列，有效降低了RNA-蛋白互作检测的成本，实现了RNA与蛋白相互作用的高通量检测。
(2)通过本公开提供的方法所构建的RNA阵列中的RNA的长度能够更长，能够满足转录完整功能性RNA的需求，并且串扰程度更低，提高了RNA-蛋白互作检测的效率。
(3)本公开提供的方法通过消化转录DNA模板，得到单纯的RNA阵列，降低了模板DNA对后续RNA与蛋白及其他大分子相互作用的干扰；同时通过自由转录捕获的方式，避免了末端路障式RNA阵列构建方式中RNA聚合酶带来的位阻影响，改善了RNA-蛋白质互作检测的准确性。
附图说明
为了更清楚地说明本公开或相关技术中的技术方案，下面将对实施例或相关技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是根据本公开实施例的构建RNA阵列的方法流程示意图。
图2是根据本公开实施例的构建RNA阵列的方法步骤示意图。
图3是根据本公开实施例的第一核酸的结构示意图。
图4是根据本公开实施例的RNA转录捕获的原理示意图。
图5是根据本公开实施例的RNA转录捕获的荧光可视化结果示意图。
图6是根据本公开实施例的RNA转录捕获的平均荧光强度结果示意图。
图7是根据本公开实施例的RNA串扰验证的原理示意图。
图8是根据本公开实施例的RNA串扰验证的荧光可视化结果示意图。
图9是根据本公开实施例的RNA-蛋白互作检测的原理示意图。
图10是根据本公开另一实施例的RNA转录捕获的荧光可视化结果示意图。
图11是根据本公开实施例的RNA-蛋白互作检测的荧光可视化结果示意图。
图12是根据本公开实施例的吗啉碱基RNA捕获引物的效果图。
具体实施方式
下面详细描述本公开的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本公开，而不能理解为对本公开的限制。
RNA与蛋白的相互作用指RNA结合蛋白，即一类能够与一种或多种相关RNA相互作用后协调实现生物功能的蛋白，其在与RNA结合后在多种生物过程的调控中发挥作用。例如(1)在转录的过程中，正在转录的RNA可以通过协调RNA聚合酶(RNAP)II调控自身的转录；(2)长非编码RNA(long noncoding RNAs，lncRNAs)可以通过与蛋白质互作直接影响其他基因的表达，如XIST lncRNA可以引导调节蛋白至染色质使染色体沉默；(3)RNA还可以通过与蛋白的相互作用影响RNA定位、剪切以及其他的转录后调节以调控基因的表达过程。
RNA与蛋白的相互作用能够广泛应用于分子检测、疾病诊断及治疗等多个领域。因此RNA与蛋白的互作检测方法可以应用于RNA适配体筛选及改造；还可以基于基因转录调节影响肿瘤的免疫，用于开发基于RNA的抗癌药物；此外也能够在科学研究中用于观察RNA与蛋白质相互作用的进化轨迹。
RNA与RBPs能够结合的基础在于RNA和蛋白本身复杂的结构。在自然状态下，RNA一般以单链形式存在。单链的RNA存在丰富的分子内相互作用，包括错配的碱基凸起、茎环、假结、G四链体、二价阳离子相互作用和非经典碱基配对等。而蛋白质也是一种空间结构非常复杂的生物大分子。因此，由于RNA与蛋白相互作用的复杂性，目前分析RNA的序列对于RNA和蛋白之间的互相作用的方法十分有限。
相关研究方法包括凝胶迁移、染色质免疫沉淀、表面等离子共振、生物膜干涉技术等。这些方法能够初步鉴定RNA与蛋白间的相互作用，但存在通量低、灵敏度低、劳动强度高、成本高、自动化程度低等明显局限。尽管毛细管电泳法将RNA与蛋白之间的相互作用的研究提升至中通量，但仍然存在反应体系难以放大以及难以定量分析的问题。
近几年，随着二代测序技术的发展，在芯片上产生数以亿计的DNA阵列技术已经趋于成熟，核酸序列-结构-功能三者之间的关系得以揭示，新的生物学机制逐渐被发掘。高通量测序平台成为深入分析的RNA与蛋白相互作用研究方法的强大工具。然而，相关技术中，基于芯片的RNA-蛋白质互作研究方法依赖于DNA模板、所得RNA长度较短、所需反应空间大，由此存在受DNA信号干扰、无法测得原始生物背景下较长的RNA片段以及通量较低等问题。
为此，本公开的实施例提出一种构建RNA阵列的方法、制备RNA阵列的试剂盒、RNA-蛋白质互作的检测方法及装置、试剂盒。该方法基于固定于芯片的第一核酸，通过对所述第一核酸进行转录，获得目标RNA链；基于固定芯片的第二核酸，利用所述第二核酸捕获所述目标RNA链，以高通量获得长度较长的纯净RNA阵列。由此，提高了RNA与蛋白相互作用的检测方法的通量、精确度和灵敏度。
本公开第一方面的实施例提供了一种构建RNA阵列的方法，包括：基于固定于第一芯片的第一核酸，通过对所述第一核酸进行转录，获得目标RNA链；基于固定于第二芯片的第二核酸，利用所述第二核酸捕获所述目标RNA链，以获得所述RNA阵列。其中所述第一核酸是DNA分子，并且所述第二核酸是DNA分子，可选地，所述第二核酸包含核苷酸类似物。其中所述第一核酸是部分补全为双链的单链或双链DNA分子,优选为部分补全的单链DNA分子；所述的第二核酸可以是单链DNA分子或可以包含与目标RNA链中的核苷酸分子互补配对的代寡核苷酸。能够理解的是，由于第一核酸是待被转录的DNA模板，因此处于开放的单链DNA状态。
本申请实施例中，“第一芯片”、“第二芯片”指的是可负载生物学序列且可容纳进行序列扩增等反应的固相载体。在一些实施例中，“第一芯片”、“第二芯片”可以为简单的玻片或原位捕获芯片，也可以是高通量测序芯片，例如适用于MGI平台的可用于DNB测序的 芯片(如BGISEQ-500高通量测序芯片)、适用于illumina平台的高通量测序芯片等。本申请无意限制芯片基质。
在一些实施例中，所述第一芯片和第二芯片为同一个或不同的芯片。
需要说明的是，在一些实施例中，可以在对所述第一芯片上的第一核酸测序后，通过引入第二芯片，以扩散转印的方式生成所述RNA阵列。
在一些实施例中，所述第一芯片和所述第二芯片为同一个芯片。可以理解的是，基于所述第一芯片和所述第二芯片为同一个芯片，本申请实施例中所提出的RNA阵列的构建方法中的RNA转录、目的RNA的捕获以及后续的DNA模板的消化等均可在同一芯片上进行，由此简化了实验操作、节约了实验成本、提升了实验效率，并且该方法无需再次转移目的RNA，因此无需大的反应空间，因而大大提高了RNA阵列的构建通量。
在一些实施例中，所述方法还包括制备固定于所述第一芯片的所述第一核酸，具体包括：合成包含所述第一序列和所述第二序列的第一核酸和将所述第一核酸固定于所述第一芯片上。本申请实施例中，可以预先合成包含所述第一序列和所述第二序列的第一核酸模板，并基于该第一核酸模板进行扩增以获得第一核酸，并将第一核酸固定连接至第一芯片上。可以理解的是，基于第一核酸模板所进行的第一核酸的扩增可以在第一芯片上进行，也可在芯片外进行。所得的第一核酸可通过共价连接固定在芯片上。第一核酸将作为转录模板，用以获得目的RNA链。
在一些实施例中，所述第一核酸选自由以下中的一种或多种：通过滚环扩增生成的DNA纳米球(DNB)、通过桥式扩增生成的DNA簇、通过链置换合成方法生成的合成DNA链、通过喷墨打印或化学合成方法生成的合成DNA链。可以理解的是，将固定于芯片上的第一核酸作为转录模板，能够方便地获得大量的目的RNA链。
在一些实施例中，所述第一核酸包含用于测序的第一序列和用于转录的第二序列。
在一些实施例中，所述第一序列包含接头序列和标识符序列，其中标识符序列可以是唯一分子标识符(UMI)。可以理解的是，基于用于测序的第一序列中的接头序列，可以预先对第一核酸进行测序，从而根据第一序列中的特异性标识符序列，建立第一核酸的序列与在芯片上的位置之间的关系。后续基于目的RNA的原位捕获，该关系可进一步用于指示RNA阵列中各个目的RNA的位置，以此获得位置及序列可分辨的RNA阵列。
在一些实施例中，所述第二序列包含启动子序列和编码所述目标RNA链的DNA序列。可以理解的是，RNA聚合酶可结合至所述第二序列中的启动子序列，以此进行第二序列中的DNA编码序列的转录，从而获得所述目标RNA链。
在一些具体实施例中，可以通过重叠PCR构建第一核酸(或第一核酸模板)，即DNA模板，使其包含以下序列：成环接头序列、条形码标识符序列、RNA聚合酶的启动 子、编码目标RNA链的DNA序列或其突变库。第一核酸模板通过环化扩增为DNB(即第一核酸)，并通过加载仪的DNB负载程序被负载于第一芯片表面，形成阵列。因此，能够通过随后对第一芯片进行测序，确定各个第一核酸的序列信息和在第一芯片的阵列中的位置，如图1中(A)所示。
在一些具体实施例中，第一核酸中用于编码目标RNA链的第二序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-4所示。
在一些实施例中，所述方法还包括制备固定于所述第二芯片的所述第二核酸，具体包括：合成所述第二核酸和可选地扩增所述第二核酸；和将所述第二核酸固定于所述第二芯片上。
在一些实施例中，所述第二核酸包含用于捕获所述目标RNA链的第三序列，其中所述第三序列与所述目标RNA链至少部分互补。可以理解的是，第二核酸通过第三序列的修饰连接于第二芯片上，并可以在转录后，基于与目标RNA链至少部分互补的第三序列，对目标RNA进行原位捕获，以此简单快速地一步构建RNA阵列。
在一些实施例中，所述第一核酸与所述第一芯片通过共价连接；所述第二核酸与所述第二芯片通过共价连接。
需要说明的是，如图1中(B)所示，第二核酸，即用于捕获目标RNA链的DNA引物(探针)，可以通过两步共价反应被固定于所述第二芯片。在一些实施例中，基于第一芯片和第二芯片是相同的芯片，因此可以将第二核酸直接固定在第一芯片上。具体而言， 首先通过叠氮-N-羟基琥珀酰亚胺酯与修饰于芯片表面活性位点的伯胺形成酰胺键，从而在芯片上修饰叠氮官能团。然后，芯片上的叠氮通过点击化学反应将5'端修饰有DBCO的各个第二核酸共价连接于芯片表面。可以理解的是，基于第一芯片和第二芯片是相同的芯片，即第一核酸和第二核酸同时固定于同一芯片上，能够使转录后所得的目的RNA链直接被第二核酸捕获，同时通过该原位捕获直接建立具有位置和序列信息的RNA阵列，而无需上下配准等额外操作，由此大大简化了实验流程，并有效提升了制备通量。
可以理解的是，由于第二核酸的第三序列与目标RNA链的3’端至少部分互补，因此能够通过碱基互补配对捕获目标RNA链。能够理解的是，还可以通过改善与RNA互补的长度、第二核酸的浓度、核酸骨架修饰等条件，能够提高捕获RNA的效率并抵抗DNA核酸酶降解。
在一些实施例中，第二核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
iSp18-DBCO-TGTGAGCCAAGGAGTTGTTGTCTTCCTAAGACCGC(SEQ ID NO:5)。
在一些实施例中，所述第三序列与所述目标RNA链的互补长度为至少20bp。
在一些实施例中，所述第三序列与所述目标RNA链的互补长度为35bp，所述第三序列具有用于固定的二苯并环辛炔(DBCO)、环辛炔(Cyclooctyne)、炔烃(Alkyne)或叠氮(Azide)等修饰。本领域技术人员能够理解，所述修饰用于将第三序列与芯片连接，其可以通过基于上述修饰的化学反应或其他非共价作用固定方式完成。本申请无意对此进行限制。
在一些实施例中，所述通过对所述第一核酸进行转录，获得目标RNA链包括：根据所述第一核酸将对应的转录体系通入所述第一芯片；基于所述第一核酸作为模板进行转录以获得所述游离的目标RNA链。能够理解的是，本申请实施例提供的构建RNA阵列的方法可以依照具体需求产出不同长度的目标RNA链，且特别有利于产出传统技术中难以实现的长度较长的目标RNA链。本申请虽无意于限制所产出的RNA的长度，但在一些实施例中，本申请实施例的方法所产出的目标RNA链长度可达300bp以上，若选用长片段转录试剂盒，可以进一步提高RNA的长度。
在一些实施例中，所述通过所述第二核酸捕获所述游离的目标RNA链包括：通过所述第二核酸的所述第三序列将所述游离的目标RNA链捕获至所述第二芯片。
需要说明的是，本公开实施例的芯片能够与多种体外转录体系兼容。因此在具体转录时，可以根据需要调整转录体系，例如，可以根据第一核酸中的启动子序列选择转录体系。如图1中(C)所示，在进行RNA转录之前，应根据RNAP的需要将第一核酸上的待转录区域补齐为双链。例如对于T7RNAP只需将启动子序列补齐为双链即可进行转 录，而对于全酶，则需将全部转录序列补齐为双链。补齐双链可以选择T4或phi29DNA聚合酶体系。如图1(D)中所示，将RNA体外转录反应体系通入芯片以转录生成目标RNA链。如图1(E)中所示，如上所述，目标RNA链通过碱基互补被芯片上的第二核酸捕获。
在一些实施例中，启动子可以为T7启动子、T7lac启动子、sp6启动子等原核和真核启动子。在一些实施例中，所述启动子为T7启动子，其通过如SEQ ID NO:6(GATAATACGACTCACTATAGGG)所示的T7启动子杂交引物启动转录。可以理解的是，本申请实施例提出的RNA阵列构建方法中的启动子序列，只要保证其可以被RNA聚合酶结合以开启目的RNA的转录即可，本申请无意对此进行限制。
在一些实施例中，所述方法还包括：对所述第一核酸进行测序以确定基于各个所述第一核酸的第一信号，其中所述第一信号包含各个所述第一核酸在所述第一芯片上的序列和位置。可以理解的是，在将第一核酸固定于第一芯片后可以对该第一核酸进行测序，以确定第一核酸的具体序列及其在第一芯片上的位置。该序列及位置通过基于其转录出的目的RNA链的原位捕获，可以直接转化为所构建的RNA阵列中各个目的RNA的位置和具体序列，并在后期基于各个RNA的位置和具体序列，评估待测蛋白与各个RNA的亲和程度。
在一些实施例中，所述方法还包括消化所述第一核酸以对所述RNA阵列进行纯化。可以理解的是，通过消化RNA阵列中的原始DNA模板，可以有效减少DNA干扰，使RNA-蛋白质互作信号的检测更为准确。
在一些实施例中，用于消化所述第一核酸的酶为核酸酶，优选为DNA酶I、DNA酶II、核酸酶S1和/或核酸酶S7，更优选为核酸酶S1。
需要说明的是，如图1(F)所示，在RNA捕获步骤后，可以通过核酸酶消化体系将DNB消化以获得纯净的RNA阵列。常用的核酸酶包括DNA酶I、DNA酶II、核酸酶S1、核酸酶S7等。能够理解的是，在实践中应选择倾向于消化DNA单链的核苷酸的内切酶，且其消化核酸单链的效率应远远大于DNA-RNA杂交分子双链。最终将转录DNA模板消化而将杂交于DNA捕获引物的RNA保留。
本公开第二方面的实施例提供了一种RNA-蛋白质互作的检测方法，包括：使目标蛋白与RNA阵列接触，以获得RNA-蛋白质互作数据，其中所述RNA阵列根据本公开第一方面任一实施例所述的构建RNA阵列的方法获得。可以理解的是，通过使目标蛋白与RNA阵列接触获得杂交信号，根据检测杂交信号的大小即可获知目标单标与RNA阵列中各RNA序列的亲和程度。
在一些实施例中，所述目标蛋白可以携带荧光标记，所述使目标蛋白与所述RNA阵列接触，以获得RNA-蛋白质互作数据包括：使所述目标蛋白与所述RNA阵列接触；接触后对所述RNA阵列进行检测以采集第二信号，其中所述第二信号为所述RNA阵列上结合的所述目标蛋白的荧光信号；和基于所述第二信号，获得所述RNA-蛋白质互作数据。
在一些实施例中，根据所述RNA-蛋白质互作数据，确定所述RNA阵列中各个RNA与所述目标蛋白的亲和度。需要说明的是，构建的RNA阵列能够用于检测RNA与蛋白间的相互作用。在表达纯化得到目标蛋白后，通过荧光染料对目标蛋白进行标记。使带有荧光标记的蛋白与RNA阵列接触时，与RNA序列亲和度高的目标蛋白能够通过结合留在芯片表面，因此在该位点显示荧光信号。蛋白结合后通过拍照进行第二次信号采集，通过算法处理与前期的测序的第一信号匹配，可以获得不同RNA序列与目标蛋白的亲和度。
可以理解的是，通过原位捕获，基于本申请实施例中的上述第一信号可以获知RNA阵列中各个RNA序列的具体位置和具体信息；并且通过检测第二信号，可以获知目标蛋白与RNA阵列中各个RNA序列的具体杂交信号进而确定具体亲和程度。因此，根据第二信号显示出的杂交信号强弱，通过第一信号，即可回溯并获知与感兴趣的蛋白(目标蛋白)亲和程度较高的RNA序列。由此实现高通量、高准确度的目标蛋白或亲和序列筛选。
在一些实施例中，目标蛋白可以为MS2、GFP，AGO、HuR、AUF1RNA结合蛋白，包括但不限于此。
本公开第三方面的实施例提供了一种用于制备RNA阵列的试剂盒，包括：第一核酸，所述第一核酸固定于第一芯片上；第二核酸，所述第二核酸固定于第二芯片上；和可选的测序体系、转录体系和消化体系，其中所述第一核酸是DNA分子，并且所述第二核酸是DNA分子，可选地，所述第二核酸包含核苷酸类似物，所述第一芯片和所述第二芯片为同一个或不同的芯片。
本公开第四方面的实施例提供了一种用于检测RNA-蛋白质互作的试剂盒，所述试剂盒包括RNA阵列，所述RNA阵列根据本公开第一方面任一实施例所述的构建RNA阵列的方法获得。
在一些实施例中，所述RNA阵列包含多个不同的RNA，用于检测目标蛋白与所述多个不同的RNA的互作以确定亲和度。
在一些实施例中，所述第二芯片的密度与第一芯片密度相同。
本公开第五方面的实施例提供了一种RNA-蛋白质互作检测装置，包括：RNA阵列构建模块，用于基于第一核酸、第二核酸、第一芯片和第二芯片构建所述RNA阵列，其中所述RNA阵列构建模块具体用于：基于固定于所述第一芯片的所述第一核酸，通过对所述第一核酸进行转录，获得目标RNA链；基于固定于所述第二芯片的所述第二核酸，利用所述第二核酸捕获所述目标RNA链，以获得所述RNA阵列；目标蛋白获取模块，用于获取所述目标蛋白；和RNA-蛋白质互作检测模块，用于通过使所述RNA阵列与所述目标蛋白接触，获得所述RNA-蛋白质互作数据，其中所述第一核酸是DNA分子，并且所述第二核酸是DNA分子，可选地，所述第二核酸包含核苷酸类似物，所述第一芯片和所述第二芯片为同一个或不同的芯片。
需要说明的是，本申请实施例中对于构建RNA阵列的方法的实施例的解释说明也同样适用于所提出的RNA-蛋白质互作的检测方法、用于制备RNA阵列的试剂盒、用于检测RNA-蛋白质互作的试剂盒、RNA-蛋白质互作检测装置，其也同样实现了相同的有益效果，本申请在此不再赘述。
下方将结合实施例具体解释本公开提出的构建RNA阵列的方法、制备RNA阵列的试剂盒、一种RNA-蛋白质互作的检测方法及装置、试剂盒。需要说明的是，下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
如无特殊说明，本公开实施例所需序列均华大六合合成。
实施例1
在本公开实施例中作为第一核酸的DNA模板的结构如图3所示。参照图3，该DNA模板包括5’端环化接头序列、T7启动子序列、GFP适配体序列和同时作为第二核酸杂交序列的3’端的环化接头序列。可以理解的是，GFP适配体序列用于模拟编码目标RNA链的核酸，在本实施例中被包括在第一核酸的第二序列中。而3’端的环化接头序列同时充当环化接头序列和目标RNA链的核酸，因此也可以被包括在第一核酸的第二序列中。如图4所示，由于GFP适配体序列能够被转录生成与荧光分子特异结合的RNA，因此能够通过携带荧光的GFP RNA检测引物可视化地验证在芯片上的RNA捕获探针是否能够捕获转录的RNA。具体步骤如下：
(1)合成具有GFP适配体序列(SEQ ID NO:1)的DNA模板，并将其制作为纳米球；
(2)将纳米球负载于BGI500高通量测序芯片(华大基因，930-000007-00)上，进行测序，获得该DNA的序列信息和位置信息；
(3)测序完成后加入甲酰胺，55℃保持10min以将测序链洗脱；
(4)使用磷酸缓冲液将NHS-叠氮(Thermo ScientificTM NHS-PEG4-叠氮化物，货号：26130)稀释至一万倍，并将稀释后的NHS-叠氮溶液通过加载仪(华大基因全自动样品加载系统，BGIDL-50)通入(3)中的芯片；
(5)在室温反应30min后，使用PBS溶液洗涤芯片以除去未结合的NHS-叠氮；
(6)使用5xssc(生工，B548110)将DBCO-RNA捕获引物(第二核酸，SEQ ID NO:5)稀释到10nM-100nM浓度，并将稀释后的第二核酸通入(5)中的芯片中，在室温反应过夜，以将第二核酸通过点击化学反应固定至芯片；
(7)使用PBS溶液洗涤芯片以除去未结合至芯片的第二核酸；
(8)加入T7启动子杂交引物(SEQ ID NO:6)在55℃反应2min，然后在30℃反应2min，待引物与DNA模板上的启动子杂交后，使用PBS溶液洗涤芯片；
(9)并按照使用手册中各组分浓度，配制T7体外转录试剂(InvitrogenTM MEGAscriptTM T7转录试剂盒，货号：AM1334)的转录反应体系，通入芯片中在37℃转录2h；
(10)转录后的目标RNA，即GFP适配体被捕获至芯片后，根据使用手册配制适宜体积的S1酶(Thermo ScientificTM S1核酸酶，货号:EN0321)消化体系通入芯片，在30℃反应30min；
(11)将带有AF532荧光的GFP RNA检测引物(AF532-AGCTTCTGTGGTGGCCCTCTTTTAA，SEQ ID NO:7)加入芯片，在55℃反应2min，并在30℃反应2min，使引物与RNA杂交；
(12)使用PBS溶液洗涤芯片以除去多余的荧光引物，拍照观察RNA转录捕获情况。
RNA转录捕获结果如图5和图6所示。其中芯片上通道1简称为L1，为实验组，为正常进行转录捕获的组；L2作为DNB对照组，其通入PBS代替转录试剂。
图5为芯片拍照的可视化结果，其中L1组通道内显示明显的荧光亮点，表示GFP RNA在芯片上转录并被原位捕获，L2通道内未显示荧光信号。图6为L1与L2通道中平均荧光强度。上述结果表明，RNA能够在芯片表面通过转录和原位捕获的方式被固定在芯片表面，证明了本公开提供的RNA阵列构建方法的可行性。
实施例2
如图7所示，本公开实施例使用两条编码不同RNA的不同核酸序列制备DNA模板，并同样使用荧光探针杂交的方式，探索RNA串扰程度。具体步骤如下：
(1)分别合成具有核酸序列S1(SEQ ID NO:2)和核酸序列S2(SEQ ID NO:3)的DNA模板，并将其制作为纳米球；
(2)重复实施例1中的步骤(2)至(5)；
(3)使用5xssc(生工，B548110)将DBCO-RNA捕获引物(第二核酸，SEQ ID NO:5)稀释到10nM-100nM浓度，并将稀释后的第二核酸通入芯片中，在室温反应过夜，以将第二核酸通过点击化学反应固定至芯片；
(4)重复实施例1中的步骤(7)至(10)；
(5)将分别带有AF532荧光和AF647的荧光RNA检测引物AF532-P1引物(AF532-CAATTGCGCCACGACGTTTCGTGCT，SEQ ID NO:8)和AF647-P2引物(AF647-AGCTTCTGTGGTGGCCCTCTTTTAA，SEQ ID NO:9)加入芯片，在55℃反应2min，并在30℃反应2min，使引物与S1和S2转录出的RNA P1和P2杂交；
(6)使用PBS溶液洗涤芯片以除去多余的荧光引物，拍照观察RNA串扰情况。
两种RNA P1和P2的串扰结果如图8所示，其中若两种RNA发生串扰时同一位点，则显示两种荧光。图8(A)为AF532-P1荧光。图8(B)为AF647荧光。将图8(A)、(B)位置重合配准后显示P1、P2荧光点分离存在。对于芯片上106数据量的P1、P2荧光亮点重合情况进行计算的结果表明，串扰的RNA位点仅占约5％。该结果说明两种RNA分别能够被正确地转录和捕获，其串扰程度较低。这也提示了本公开提出的RNA阵列构建方法可在同张芯片上进行多种RNA阵列的构建并用于批量检测与感兴趣蛋白的互作以筛选出与该蛋白具有较高亲和度的RNA序列，由此实现高通量、高准确度的RNA-蛋白质的互作检测。
实施例3
本公开实施例使用RNA结合蛋白MS2与其RNA结合序列验证本公开提供的检测RNA与蛋白互作方法的可行性。如图9所示，本实施例通过在芯片上构建MS2的特异性结合RNA阵列，通入携带荧光标记AF647的MS2蛋白，以检测构建的RNA阵列是否应用于检测与蛋白的相互作用。需要说明的是，只有当芯片上的RNA被完整转录且正确折叠时，才能与其对应的RBPs结合。
已知的是，RNA结合蛋白MS2(即噬菌体衣壳蛋白MS2)由129个氨基酸构成，可以特异性地结合一段具有19个碱基的茎环结构的RNA序列。MS2与其MS2RNA结合序 列是研究RNA与蛋白相互作用的经典模型。因此本领域技术人员能够知晓本实施例的验证结果具有普适性。具体步骤如下：
(1)制备MS2蛋白；
(2)将AF647染料(InvitrogenTM Alexa FluorTM 647NHS酯，货号:A37573)以3倍于MS2蛋白的物质的量加入蛋白溶液中，并于室温避光孵育1h；
(3)向步骤(2)获得的溶液中加入50mM Tris溶液混匀孵育10min后终止反应；
(4)使用纯化柱(Thermo ScientificTM ZebaTM染料和生物素去除离心柱，0.5mL，货号:A44296)去除剩余荧光染料，获得携带荧光标记AF647的MS2蛋白(AF647-MS2)；
(5)合成具有MS2RNA结合序列的DNA模板(SEQ ID NO:4)，并将其制作为纳米球；
(6)重复实施例1中的步骤(2)至(5)；
(7)使用5xssc将DBCO-RNA捕获引物(第二核酸，SEQ ID NO:5)稀释到合适浓度，并将稀释后的第二核酸通入芯片中，在室温反应过夜，以将第二核酸通过点击化学反应固定至芯片；
(8)重复实施例1中的步骤(7)至(10)；
(9)将带有AF532荧光的MS2RNA检测引物(AF532-GGATCCAGGAACGTCTTCCATACAACCTCCTTACTACAT，SEQ ID NO:10)加入芯片，在55℃反应2min，并在30℃反应2min，使引物与RNA杂交；
(12)使用PBS溶液洗涤芯片以除去多余的荧光引物，拍照观察RNA转录捕获情况；
(13)加入1％酪蛋白(Thermo ScientificTM PBS中的BlockerTM酪蛋白，货号:37582)并在室温反应1h，使酪蛋白结合至芯片表面的非特异性吸附位点；
(14)将AF647-MS2用TMK缓冲液(100mM Tris-HCl,pH 8.0,80mM KCl,10mM MgCl2)稀释后，加入1％酪蛋白，0.05U/μl RNA酶抑制剂(20U/μL的SUPERase·InTM RNase抑制剂，货号:AM2694)；
(15)将(14)中获得的AF647-MS2溶液在加载仪上以200μl体积通入芯片中，室温孵育1h，使蛋白与RNA阵列结合；
(16)通入含0.1％Tween-20的TMK缓冲液洗涤芯片，拍照分析RNA与蛋白质的结合情况。
RNA转录捕获结果如图10所示，在AF532荧光通道中荧光亮点均匀显示，证明了转录捕获目标RNA并成功构建了RNA阵列。
RNA与蛋白质互作检测结果如图11所示。由图11可知，在AF647荧光通道，荧光亮点与背景有明显区分，证明捕获在芯片上的RNA结构完整，在TMK缓冲环境中形成的正确空间结构，与其目标RBPs(MS2)有特异性结合，存在显著的RNA-蛋白质的互相作用，说明本申请实施例的RNA阵列构建方法所构建的RNA阵列RNA结构正确，可有效捕获目标蛋白，由此实现了高分辨率的RNA-蛋白质的互作检测。
实施例4
在上述实施例中，尽管S1酶倾向于消化DNA模板而不是目标RNA，仍有部分RNA被消化。因此，基于RNA阵列构建方法，本申请实施例进一步对作为RNA捕获引物的第二核酸进行了优化以获得更加完整的，通量更高的RNA阵列。本实施例中，分别使用天然碱基和吗啉碱基引物作为RNA捕获引物，将S2序列的DNA模板作为第一核酸所转录出的目标RNA链进行捕获，以获得RNA阵列；并通过S1酶和Turbo DNase分别消化DNA模板，再以互补配对的荧光DNA引物检测目标RNA的保留情况。具体步骤如下：
(1)合成具有核酸序列S2(SEQ ID NO:3)的DNA模板，并将其制作为纳米球，从中取12ng，重复实施例1中的步骤(2)-(5)；
(2)使用5xssc(生工，B548110)将天然碱基DBCO-RNA捕获引物(第二核酸，SEQ ID NO:5)稀释到10nM，以及使用水将5端修饰有Cyclooctyne的吗啉碱基RNA捕获引物(gene-tools,5'-Cyclooctyne v3morpholino oligo(优化的第二核酸：TGTGAGCCAAGGAGTTGTTGTCTTC，SEQ ID NO:11))稀释至10nM，将稀释后的两种RNA捕获引物通入芯片，室温反应过夜；
(3)重复实施例1中的步骤(7)-(9)进行RNA转录及捕获；
(4)使用S1酶(Thermo ScientificTM S1核酸酶，货号:EN0321)和Turbo DNase酶(thermo fisher,货号:AM2238)分别通入芯片后，在30℃反应30min以消化DNA模板；
(5)消化完成后，通入带有AF532荧光的检测引物AF532-P2(AF532-AGCTTCTGTGGTGGCCCTCTTTTAA，SEQ ID NO:12)通入各芯片进行RNA杂交检测。
本实施例中的优化的第二核酸，即吗啉碱基RNA捕获引物的骨架结构如图12(A)所示。吗啉碱基RNA捕获引物可以抵抗多种核酸酶消化，且能以碱基配对的方式与目标RNA单链稳定结合。优化结果如图12(B)所示，使用DNase消化DNB时吗啉碱基RNA捕获引物所保留的目标RNA量显著高于使用S1酶进行消化DNB时天然碱基DBCO-RNA捕获引物能够保留的目标RNA量。该结果表明了以转录捕获方式构建高通量 RNA阵列时，吗啉碱基RNA捕获引物与天然引物相比具有更好的RNA保留效果，因此，可作为优化的RNA捕获引物。综上所述，证明了通过本公开实施例提供的方法可在一张芯片上高通量构建RNA阵列，其串扰程度低，能够有效用于高通量、高准确性地检测RNA与蛋白相互作用。
在本公开的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本公开和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本公开的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本公开的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本公开中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
在本公开中，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本公开的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本公开的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本公开的限制，本领域的普通技术人员在本公开的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (21)

  1. 一种构建RNA阵列的方法，包括：
    基于固定于第一芯片的第一核酸，通过对所述第一核酸进行转录，获得目标RNA链；
    基于固定于第二芯片的第二核酸，利用所述第二核酸捕获所述目标RNA链，以获得所述RNA阵列，
    其中所述第一核酸是DNA分子，并且所述第二核酸是DNA分子，可选地，所述第二核酸包含核苷酸类似物。
  2. 根据权利要求1所述的构建RNA阵列的方法，其特征在于，所述第一芯片和第二芯片为同一个或不同的芯片，优选的，所述第一芯片和所述第二芯片为同一个芯片。
  3. 根据权利要求1所述的构建RNA阵列的方法，其特征在于，所述第一核酸包含用于测序的第一序列和用于转录的第二序列，
    可选地，所述第一序列包含接头序列和标识符序列；所述第二序列包含启动子序列和编码所述目标RNA链的DNA序列。
  4. 根据权利要求3所述的构建RNA阵列的方法，其特征在于，所述方法还包括制备固定于所述第一芯片的所述第一核酸，具体包括：
    合成包含所述第一序列和所述第二序列的第一核酸；和
    将所述第一核酸固定于所述第一芯片上。
  5. 根据权利要求1所述的构建RNA阵列的方法，其特征在于，所述第二核酸包含用于捕获所述目标RNA链的第三序列，其中所述第三序列与所述目标RNA链至少部分互补，
    可选地，所述第三序列与所述目标RNA链的互补长度为大于20bp、优选为35bp；所述第三序列具有用于固定的二苯并环辛炔、环辛炔、炔烃或叠氮修饰。
  6. 根据权利要求5所述的构建RNA阵列的方法，其特征在于，所述第一核酸选自由以下中的一种或多种：通过滚环扩增生成的DNA纳米球、通过桥式扩增生成的DNA 簇、通过链置换合成方法生成的合成DNA链、通过喷墨打印或化学合成方法生成的合成DNA链。
  7. 根据权利要求5所述的构建RNA阵列的方法，其特征在于，所述方法还包括制备固定于所述第二芯片的所述第二核酸，具体包括：
    合成所述第二核酸和可选地扩增所述第二核酸；和
    将所述第二核酸固定于所述第二芯片上。
  8. 根据权利要求1至7中任一项所述的构建RNA阵列的方法，其特征在于，所述第一核酸与所述第一芯片通过共价连接；所述第二核酸与所述第二芯片通过共价连接。
  9. 根据权利要求1至8中任一项所述的构建RNA阵列的方法，其特征在于，所述方法还包括：
    对所述第一核酸进行测序以确定基于各个所述第一核酸的第一信号，其中所述第一信号包含各个所述第一核酸在所述第一芯片上的序列和位置。
  10. 根据权利要求1所述的构建RNA阵列的方法，其特征在于，所述方法还包括消化所述第一核酸以对所述RNA阵列进行纯化。
  11. 根据权利要求10所述的构建RNA阵列的方法，其特征在于，用于消化所述第一核酸的酶为核酸酶，优选为DNA酶I、DNA酶II、核酸酶S1和/或核酸酶S7，更优选为核酸酶S1。
  12. 根据权利要求1所述的构建RNA阵列的方法，其特征在于，所述第一芯片和第二芯片为不同的芯片，所述第二芯片通过扩散转印的方式生成所述RNA阵列。
  13. 一种RNA-蛋白质互作的检测方法，其特征在于，包括：
    使目标蛋白与RNA阵列接触，以获得RNA-蛋白质互作数据，其中所述RNA阵列根据权利要求1至12中任一项所述的构建RNA阵列的方法获得。
  14. 根据权利要求13所述的RNA-蛋白质互作的检测方法，其特征在于，所述目标蛋白携带荧光标记，所述使目标蛋白与所述RNA阵列接触，以获得RNA-蛋白质互作数据包括：
    使所述目标蛋白与所述RNA阵列接触；
    接触后对所述RNA阵列进行检测以采集第二信号，其中所述第二信号为所述RNA阵列上结合的所述目标蛋白的荧光信号；和
    基于所述第二信号，获得所述RNA-蛋白质互作数据，
    可选地，根据所述RNA-蛋白质互作数据，确定所述RNA阵列中各个RNA与所述目标蛋白的亲和度。
  15. 一种用于制备RNA阵列的试剂盒，其特征在于，包括：
    第一核酸，所述第一核酸固定于第一芯片上；
    第二核酸，所述第二核酸固定于第二芯片上；和可选的测序体系、转录体系和消化体系，
    其中所述第一核酸是DNA分子，并且所述第二核酸是DNA分子，可选地，所述第二核酸包含核苷酸类似物，
    所述第一芯片和所述第二芯片为同一个或不同的芯片，优选的，所述第一芯片和所述第二芯片为同一个芯片。
  16. 根据权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，所述第一核酸包含用于测序的第一序列和用于转录的第二序列，
    可选地，所述第一序列包含接头序列和标识符序列；所述第二序列包含启动子序列和编码目标RNA链的DNA序列。
  17. 根据权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，所述第二核酸包含用于捕获所述目标RNA链的第三序列，其中所述第三序列与所述目标RNA链至少部分互补，
    可选地，所述第三序列与所述目标RNA链的互补长度为大于20bp、优选为35bp。
  18. 根据权利要求15至17中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述第一核酸选自由以下中的一种或多种：通过滚环扩增生成的DNA纳米球、通过桥式扩增生成的DNA簇、通过链置换合成方法生成的合成DNA链、通过喷墨打印或化学合成方法生成的合成DNA链；所述第二核酸为天然存在的核酸序列或人工构建的核酸序列。
  19. 根据权利要求18所述的试剂盒，其特征在于，所述第一核酸与所述第一芯片通过共价连接；所述第二核酸与所述第二芯片通过共价连接。
  20. 一种用于检测RNA-蛋白质互作的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括RNA阵列，所述RNA阵列根据权利要求1至12中任一项所述的构建RNA阵列的方法获得，
    可选地，所述RNA阵列包含多个不同的RNA，用于检测目标蛋白与所述多个不同的RNA的互作以确定亲和度。
  21. 一种RNA-蛋白质互作检测装置，其特征在于，包括：
    RNA阵列构建模块，用于基于第一核酸、第二核酸、第一芯片和第二芯片构建所述RNA阵列，其中所述RNA阵列构建模块具体用于：基于固定于所述第一芯片的所述第一核酸，通过对所述第一核酸进行转录，获得目标RNA链；基于固定于所述第二芯片的所述第二核酸，利用所述第二核酸捕获所述目标RNA链，以获得所述RNA阵列；
    目标蛋白获取模块，用于获取所述目标蛋白；和
    RNA-蛋白质互作检测模块，用于通过使所述RNA阵列与所述目标蛋白接触，获得所述RNA-蛋白质互作数据，
    其中所述第一核酸是DNA分子，并且所述第二核酸是DNA分子，可选地，所述第二核酸包含核苷酸类似物，
    所述第一芯片和所述第二芯片为同一个或不同的芯片，优选的，所述第一芯片和所述第二芯片为同一个芯片。
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