WO2024219779A1

WO2024219779A1 - 히알루론산 분해 지연 활성을 갖는 신규 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: WO2024219779A1
Application number: PCT/KR2024/005048
Authority: WO
Inventors: 정용지; 김은미; 이응지; 황보별; 조미희; 신민이; 이재열
Original assignee: (주)케어젠
Priority date: 2023-04-17
Filing date: 2024-04-16
Publication date: 2024-10-24

Abstract

본 발명의 펩타이드는 피부세포 활성화를 촉진하는 활성을 가지므로 피부 재생 또는 피부 상태 개선에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 히알루론산이 히알루론산 분해효소(hyaluronidase) 및 활성산소에 의한 분해를 지연 또는 억제하는 활성을 가짐으로써, 히알루론산 필러 제조시 함께 사용하면 히알루론산 필러가 생체내에서 분해되는 시간을 연장시켜 필러의 성능을 향상시키는 효과를 갖는다.

Description

히알루론산 분해 지연 활성을 갖는 신규 펩타이드 및 이의 용도

[관련출원과의 상호인용]

본 출원은 2023년 04월 17일에 출원된 한국특허출원 제10-2023-0050317호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 한국특허출원 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.

[기술분야]

본 발명은 히알루론산 분해 지연 활성을 갖는 신규 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

피부는 외측으로부터 표피, 진피 및 피하조직으로 구성되어 있고, 표피는 케라틴으로 되어 있는 케라티노사이트, 멜라닌을 형성 분비하는 멜라노사이트, 면역관련세포인 랑게르한스 세포 등의 여러가지 세포로 이루어져 있다. 진피는 섬유성분과 기질성분으로 구성되어 있으며, 섬유성분으로서 콜라겐은 피부에 강도와 장력을 주고 피부를 보호하는 역할을 하며 진피층의 90% 정도를 차지한다. 또한, 콜라겐은 상처치유에 있어서 중요한 역할을 담당하며, 손상된 상피에서 콜라겐의 합성을 촉진시켜서 상처를 신속하고 흉터 없이 회복시킬 수 있다. 콜라겐은 섬유아세포의 작용에 의해 합성되며 콜라게나아제(collagenase)와 엘라스티나아제(elastinase)에 의해 분해된다. 나이가 들수록 섬유아세포의 작용과 세포수가 감소하여 섬유 성분인 콜라겐의 합성량이 줄어들고 피부세포내 수분이 손실되며, 각질층의 구조가 변화되고, 콜라게나아제의 작용이 증가하여 콜라겐의 가교된 형태가 증가함으로써 매끄러움, 보습, 팽팽함이 감소된다. 연령의 증가 이외에 피부의 노화를 일으키는 외부인자로는 공해, 바람, 온도, 자외선 등을 들 수 있다. 피부 노화를 방지하기 위해, 콜라겐 합성 촉진 물질에 대한 관심이 높아졌으며, 종래에 알려진 콜라겐 합성 촉진 물질로는 비타민 C, 레티노익산(retinoic acid), 동물 태반 유래의 단백질, 베툴린산(betulinic acid), 클로렐라 추출물 등이 보고되어 있다. 그러나, 이들 물질은 피부적용시 자극과 발적 등의 안전성 문제로 사용량의 제한이 있거나, 효과가 미미하여 실질적으로 피부기능 개선 또는 상처 치유의 효과를 기대할 수 없다.

필러(filler)는 노화에 따라 피부에 발생하는 주름, 피부의 함몰, 피부나 조직의 부피의 감소 등을 개선하기 위한 목적으로 해당 피부나 조직에 주입하여 연조직의 부피를 증대 확장시키는 데 사용되는 물질이다. 히알루론산(hyaluronic acid, HA)은 피부와 결합 조직의 필수 성분을 이루는 당류로서, N-아세틸-글루코사민과 D-글루쿠론산의 이당류 반복단위로 이루어지는 천연 고분자 다당류이다. 피부 진피에는 세포외기질(extracellular matrix)이라고 하는 거대분자의 그물 구조로 채워져 있으며, 세포외기질은 진피 내의 섬유아세포 등에서 생성되는 물질로 구성되며, 히알루론산, 더마탄(dermatan) 황산등의 산성 뮤코다당이라고 불리는 다당류, 콜라겐, 엘라스틴 등의 섬유성 단백질로 구성된다. 이와 같이 히알루론산은 피부, 관절, 안구점막 등 다양한 인체 조직내에서 본래 존재하는 성분이며, 사용하기 쉽고, 비면역원성, 비발암성 및 생체적합성을 가지므로, 필러의 주요한 소재로 널리 사용되고 있다.

체내에는 히알루론산을 분해하는 효소인 히알루론산 분해효소 (Hyaluronidase)가 존재하여 이 효소가 히알루론산을 분해하고, 또한 체내에 존재하는 자유 라디칼(활성산소종)에 의한 산화를 통해서도 히알루론산이 분해되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 히알루론산 필러를 신체에 주입하더라도 자연스럽게 히알루론산이 분해되어 사라지게 된다. 종래 부터 히알루론산 필러의 유지시간을 연장시키기 위해서 히알루론산을 BDDE(1,4-Butanediol diglycidyl ether)와 같은 적절한 가교제를 사용하여 가교(cross-linking)시키는 방법을 사용하고 있는데, 이와 같이 히알루론산에 가교제를 사용하여 가교된 히알루론산으로 필러를 제조하여 사용하면, 체내에서의 히알루론산 분해효소에 의한 분해 작용으로부터 필러를 어느 정도 보호하여, 필러의 유지시간을 연장시킬 수 있는 효과를 볼 수 있으나, 그 효과가 만족스럽지 못한 실정이다.

대한민국 등록특허 제10-2369261호에는 제1 가교제에 의해 1차 가교된 히알루론산으로 제조되는 코어와, 상기 코어에 제2 가교제를 사용하여 가교된 히알루론산으로 쉘을 부가하여, 코어-쉘 구조의 히알루론산 겔을 제조하는 방법이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허 제10-2225971호에는 펩타이드 가교제를 이용하여 히알루론산 기반의 하이드로겔을 제조하는 방법을 개시하며, 대한민국 등록특허 제10-2418096호에서는 히알루론산 필러의 효능을 유지시키기 위해서 콜라겐을 경구 투여하는 방법이 개시되어 있다.

이와 같은 다양한 종래 기술의 시도에도 불구하고, 히알루론산 필러의 분해를 지연시킬 수 있는 안전하면서도 효과적인 기술은 아직 개발되지 못한 상태이다.

[선행기술문헌]

[특허문헌]

대한민국 등록특허 제10-2369261호

대한민국 등록특허 제10-2225971호

대한민국 등록특허 제10-2418096호

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 제안된 것으로서, 본 발명은 히알루론산 분해효소 및 활성산소에 의한 히알루론산의 분해를 지연시키는 활성과 피부세포의 활성화를 촉진하는 활성을 가지면서, 산이나 고온에서도 비교적 안정성이 우수한 생체적합성 펩타이드를 제공하는 것을 목적으로 한다.

따라서, 본 발명의 목적은 피부세포 활성화 촉진 활성 및 히알루론산 분해 지연 활성을 갖는 신규 펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상술한 활성을 갖는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 재생 또는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상술한 활성을 갖는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상술한 활성을 갖는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 히알루론산 분해 지연용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상술한 활성을 갖는 펩타이드 및 히알루론산을 포함하는 필러 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 재생 또는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 히알루론산 분해 지연용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드 및 히알루론산을 포함하는 필러 조성물을 제공한다.

이하에서 본 발명을 상세하게 설명한다.

펩타이드 및 이의 활성

본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제공한다.

[서열번호 1의 아미노산 서열]

KIWNLEPSRNGT (H2N-Lys-Ile-Trp-Asn-Leu-Glu-Pro-Ser-Arg-Asn-Gly-Thr-COOH)

본 명세서 용어 "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.

본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 변형 없이 사용될 수 있으나, 상기 펩타이드가 가지는 본래의 활성, 예컨대 히알루론산 분해효소 또는 활성산소에 의한 히알루론산의 분해를 억제 또는 지연하는 활성에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환, 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체 또는 단편을 사용할 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 그 활성을 변화시키지 않는 범위내에서 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 아미노산 서열이란 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 각각 75% 이상, 예컨대 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 의미한다. 또한, 상기 펩타이드에는 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 아미노산 서열의 일부 부위를 선정하고 그 활성을 증가시키기 위해 N-말단 및/또는 C-말단 변형이 유도된 것일 수 있다. 이러한 N-말단 및/또는 C-말단 변형을 통해 본 발명의 펩타이드의 안정성을 현저하게 향상시킬 수 있으며, 예를 들어, 펩타이드의 생체 내 투여 시 반감기를 증가시킬 수 있다. 상기 용어 "안정성"은 생체 내 단백질 절단 효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 인 비보에서의 안정성 뿐만 아니라, 저장안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 포함하는 의미이다.

상기 N-말단 변형은 펩타이드의 N-말단에 아세틸기(acetyl group), 플루오레닐메톡시카르보닐기(fluoreonylmethoxycarbonyl group), 포르밀기(formyl group), 팔미토일기(palmitoyl group), 미리스틸기(myristyl group), 스테아릴기(stearyl group) 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)로 이루어진 군으로부터 선택된 보호기가 결합한 것일 수 있다. 상기 C-말단 변형은 펩타이드의 C-말단에 히드록시기(hydroxyl group, -OH), 아미노기(amino group, -NH2), 아자이드(azide, -NHNH2) 등이 결합한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 폡타이드는 본 발명이 속하는 기술분야에서 널리 알려진 다양한 방법으로 제조할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phasesynthesis techniques; Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)) 또는 액상 합성 기술(US 등록특허 제5,516,891호)에 따라 제조될 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 피부 세포를 활성화시키는 활성을 갖는다.

일 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 섬유아세포(fibroblast) 또는 각질형성세포(keratinocyte)의 증식을 촉진하는 활성을 갖는다.

일 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 콜라겐 또는 히알루론산의 발현을 촉진하는 활성을 갖는다.

일 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 섬유아세포(fibroblast) 또는 각질형성세포(keratinocyte)에서 콜라겐 또는 히알루론산의 발현을 촉진하는 활성을 갖는다.

본 발명의 펩타이드는 히알루론산의 분해를 지연 또는 억제하는 활성을 갖는다.

일 구현예에서, 상기 히알루론산의 분해는 히알루론산 분해효소(hyaluronidase)에 의한 분해 또는 활성산소에 의한 분해일 수 있다.

상술한 바와 같이 본 발명의 펩타이드는 히알루론산 분해효소 또는 활성산소에 의한 히알루론산의 분해를 지연 또는 억제하는 활성을 가지므로, 히알루론산으로 제조되는 필러와 함께 사용하면 히알루론산 필러가 생체내에서의 존재하는 기간을 연장시켜 필러의 성능을 향상시키는 효능을 발휘한다.

또한, 본 발명의 펩타이드는 pH 및 온도 변화 안정성을 갖는다. 후술하는 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 펩타이드는 pH4 내지 pH10의 범위와 25℃ 내지 50℃의 온도 범위에서도 동일한 안정성을 나타내어, pH 및 온도 변화에도 안정성을 가지므로, 보다 우수한 생체안정성을 가진다.

펩타이드를 포함하는 조성물

본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 재생 또는 피부 상태 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 재생 또는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어 "개선"은 질환 또는 장애의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서 피부 상태의 개선은 피부의 내재적 요인 또는 외인적인 요인에 의하여 유발되는 피부의 손상을 치료, 경감, 완화시키는 과정 또는 그의 효과 등을 포괄적으로 의미한다.

일 구현예에서, 상기 피부 상태의 개선은 피부 탄력의 증진, 피부 주름의 개선, 피부 보습의 증진, 피부 노화의 억제, 자외선에 의한 피부 손상의 회복, 자외선으로부터 피부의 보호, 또는 피부 상처의 개선일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 화장료 조성물에 유효성분으로 포함되는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 피부 세포, 예를 들어 섬유아세포(fibroblast) 또는 각질형성세포(keratinocyte)에서 콜라겐 또는 히알루론산의 발현을 촉진한다.

본 발명에서 상기 "피부 주름의 개선", "피부 탄력의 증진", "피부 노화의 억제", "자외선에 의한 피부 손상의 회복", "자외선으로부터 피부의 보호", 또는 "피부 상처의 개선" 은 피부 세포에서 콜라겐의 합성 촉진 등을 포함하는 피부 내 콜라겐의 총량을 증가시키는 모든 작용에 의해 유도될 수 있다. 상기 피부 세포는 예를 들어 섬유아세포(fibroblast) 또는 각질형성세포(keratinocyte)일 수 있다.

상기 "피부 노화 억제"는 주름, 피부의 쳐짐, 탄력성 감소 등과 같은 피부의 기능 저하를 억제하는 것을 의미할 수 있다. 상기 피부 노화는 광노화, 예를 들어, 자외선에 의한 피부 노화일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 이외에 화장품학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 제조되는 임의의 제형으로 제조될 수 있고, 피부 외용제일 수 있다. 예를 들면, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물은 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이, 파우더, 헤어토닉, 헤어크림, 헤어로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어컨디셔너, 헤어스프레이, 헤어 에어졸, 포마드, 젤 등과 같은 용액, 솔젤, 에멀젼, 오일, 왁스, 에어졸 등의 다양한 형태로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물은 부형제, 담체 등 기타 첨가제를 포함할 수 있으며 일반 피부 화장료에 배합되는 보통의 성분을 필요한 만큼 적용 배합하는 것이 가능하다.

상기 화장료 조성물의 제형의 형태가 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀루로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형의 형태가 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토오스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 사용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체가 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물의 제형의 형태가 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용될 수 있고, 예를 들면 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형의 형태가 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 등과 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 헤어샴푸인 경우에는 본 발명의 펩타이드에 증점제, 계면활성제, 점도 조절제, 보습제, pH 조절제, 방부제, 에센셜 오일 등과 같이 샴푸를 조성하기 위한 베이스 성분들이 혼합될 수 있다. 상기 증점제로는 CDE가 사용될 수 있고, 상기 계면활성제로는 음이온 계면활성제인 LES와, 양쪽성 계면활성제인 코코 베타인이 사용될 수 있고, 상기 점도조절제로는 폴리 쿼터가 사용될 수 있으며, 상기 보습제로는 글리세린이 사용될 수 있고, 상기 pH 조절제로는 구연산, 수산화나트륨이 사용될 수 있다. 상기 방부제로는 자몽 추출물 등이 사용될 수 있고, 이 외에도 시더우드, 페퍼민트, 로즈마리 등의 에센셜 오일과 실크 아미노산, 펜타올 또는 비타민 E가 첨가될 수 있다.

상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 본 발명의 펩타이드와 담체 성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 사용되는 성분들, 예를 들면 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 등을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 화장품학적 유효량을 포함할 수 있다.

상기 화장품학적 유효량은 상기 화장료 조성물의 피부 재생 또는 피부 상태 개선의 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 펩타이드는 상술한 화장료 조성물 내에 0.01 μM 내지 1000 μM의 농도로 포함될 수 있으며, 구체적으로, 본 발명의 펩타이드는 0.01 μM 내지 1000 μM; 0.05 μM 내지 800 μM, 0.05 μM 내지 700 μM, 0.05 μM 내지 600 μM, 0.05 μM 내지 500 μM, 0.05 μM 내지 300 μM, 0.05 μM 내지 200 μM; 0.1 μM 내지 800 μM, 0.1 μM 내지 700 μM, 0.1 μM 내지 600 μM, 0.1 μM 내지 500 μM, 0.1 μM 내지 300 μM, 0.1 μM 내지 200 μM; 1 μM 내지 800 μM, 1 μM 내지 700 μM, 1 μM 내지 600 μM, 1 μM 내지 500 μM, 1 μM 내지 300 μM, 1 μM 내지 200 μM; 5 μM 내지 800 μM, 5 μM 내지 700 μM, 5 μM 내지 600 μM, 5 μM 내지 500 μM, 5 μM 내지 300 μM, 또는 5 μM 내지 200 μM의 농도로 포함되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

일 구현예에서, 상기 피부질환은 피부의 상처 또는 피부의 흉터일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 약학적 조성물에 유효성분으로 포함되는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 피부 세포, 예를 들어 섬유아세포(fibroblast) 또는 각질형성세포(keratinocyte)에서 콜라겐 또는 히알루론산의 발현을 촉진한다.

본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 펩타이드의 치료적 유효량을 포함할 수 있다.

상기 용어 "치료적 유효량(therapeutically effective amount)"은 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 펩타이드가 그 활성 또는 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미하고, 예컨대, 피부질환의 치료 또는 예방의 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 명세서에서 용어 "예방" 은 질환 또는 장애에 걸릴 위험을 감소시키는 것을 의미하며, 질환 또는 이의 하나 이상의 임상적 증후가 진행되지 않도록 하여 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서 용어 "치료"는 질환 또는 장애를 경감시키는 것을 의미하며, 질환 또는 이의 하나 이상의 임상적 증후의 진행을 저지 또는 감소시켜 질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 포함한다.

본 발명에서 피부 질환의 예방 또는 치료는 피부질환의 원인을 제거하거나 피부질환의 진행을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.

상기 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (19th ed., 1995, Williams & Wilkins)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 피부질환을 치료하기 위한 적합한 모든 경로로 투여될 수 있으며, 예를 들어, 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육내 주입, 복강내 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물이 피부질환의 예방 또는 치료 활성을 갖는 것이므로, 피부에 적용하는 것과 같은 국소 투여로 적용될 수 있다.

상기 약학적 조성물의 투여량은 1일당 0.0001 μg 내지 100 mg, 0.001 μg 내지 100 mg, 0.01 μg 내지 100 mg, 0.1 μg 내지 100 mg, 또는 1.0 μg 내지 1000 mg 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 피부외용제일 수 있다. 상기 피부외용제는 피부의 외부에 도포되어 이용될 수 있는 형태의 제제로, 본 발명의 약학적 조성물이 피부외용제로 이용될 경우 이는 피부, 구체적으로 피부질환이 발생한 피부 부위에 적용되는 것일 수 있다. 상기 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있고. 상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들어 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 중점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제, 또는 이들의 조합과 필요에 따라서 적절하게 배합될 수 있다. 상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종 생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산 인산 마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류 등도 적절하게 배합할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 히알루론산 분해 지연용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 측면에서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 히알루론산 분해 지연 용도를 제공한다.

본 발명에서, 히알루론산 분해의 "지연"은 히알루론산 분해의 "억제" 또는 "저해"와 동등한 의미로 사용된다.

본 발명의 다른 측면에서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 및 히알루론산을 포함하는 필러(filler) 조성물을 제공한다.

본 발명에서 히알루론산(hyaluronic acid, HA)은 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 이루어진 반복 단위가 선형으로 연결되어 있는 하기 화학식 1로 표시되는 생체 고분자 물질을 의미한다.

히알루론산은 안구의 유리액, 관절의 활액, 닭벼슬 등에 많이 존재하며, 우수한 생체적합성을 갖기 때문에, 안과용 수술 보조제, 관절기능 개선제, 약물전달 물질, 점안제, 주름개선제 등의 의료 및 의료 용구나 화장품 용도로 널리 사용되고 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 필러 조성물에 포함되는 히알루론산은 히알루론산 외에도 이의 염을 포함할 수 있다. 상기 히알루론산의 염은 예를 들어 히알루론산 나트륨, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 코발트 등의 무기염과, 히알루론산 테트라부틸암모늄 등의 유기염이 모두 포함되는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

일 구현예에서, 상기 히알루론산 또는 이의 염은 적절한 가교제에 의해 가교된 히알루론산일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 가교된 히알루론산은 BDDE(1,4-butane diol diglycidyl ether), PEG(polyethylene glycol), DVS (divinyl sulfone), PEGDGE (Poly (ethylene glycol) diglycidyl ether), 1,6-헥산디올 디글리시딜 에테르 (1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌 글리콜 디글리시딜 에테르 (propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌 글리콜 디글리시딜 에테르 (poly(propylene glycol) diglycidyl ether), 폴리테트라메틸렌글리콜 디글리시딜 에테르 (poly(tetramethylene glycol) diglycidyl ether), 1,6-헥산디올 디글리시딜 에테르 (1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌 글리콜 디글리시딜 에테르 (propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌 글리콜 디글리시딜 에테르 (poly(propylene glycol) diglycidyl ether), 및 폴리테드라메틸렌글리콜 디글리시딜에테르 (poly(tetramethylene glycol) diglycidyl ether)으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 가교제로 가교된 것일 수 있다.

본 발명의 필러 조성물에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 함량은 전체 조성물 대비 0.001 - 0.5중량%, 0.002 - 0.5중량%, 0.003 - 0.5중량%, 0.004 - 0.5중량%, 0.005 - 0.5중량%, 0.001 - 0.4중량%, 0.002 - 0.4중량%, 0.003 - 0.4중량%, 0.004 - 0.4중량%, 0.005 - 0.4중량%, 0.001 - 0.3중량%, 0.002 - 0.3중량%, 0.003 - 0.3중량%, 0.004 - 0.3중량%, 0.005 - 0.3중량%, 0.001 - 0.2중량%, 0.002 - 0.2중량%, 0.003 - 0.2중량%, 0.004 - 0.2중량%, 0.005 - 0.2중량%일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 필러 조성물에서, 히알루론산의 함량은 전체 조성물 대비 0.001 - 0.5 중량%, 0.002 - 0.4 중량%, 0.003 - 0.3 중량%, 0.004 - 0.2 중량%, 또는 0.005 - 0.1 중량%일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

일 구현예에서, 본 발명의 필러 조성물에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드와 히알루론산은 단순하게 혼합된 상태일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "필러(filler)"는 연조직 결핍 부위에 볼륨을 추가하도록 고안된 재료 또는 조성물을 광범위하게 지칭하는 의미로 사용되며, 연조직 필러 또는 진피 필러로의 의미도 포함한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "연조직"은 일반적으로 신체의 다른 구조 및 기관을 연결하거나, 지지하거나 둘러싸는 조직을 의민한다. 이러한 연조직은 예를 들어 근육, 힘줄, 성대, 내막 조직, 섬유 조직, 지방, 혈관, 신경 및 활막 조직이 포함된다.

일 구현예에서, 상기 필러 조성물은 선택적으로 완충제, 보존제, 등장화제, 항산화제, 유화제, 습윤제 등을 포함할 수 있으나, 이로 한정되지는 않으며, 다른 약제학적으로 허용 가능한 성분을 포함할 수 있다.

상기 완충제로는 구연산, 인산일수소나트륨, 인산이수소나트륨, 아세트산, 디에틸 바비투르산(diethyl barbituric acid), 아세트산 나트륨(sodium acetate), TAPS(트리스(하이드록시메틸)메틸아미노)프로판술폰산), Bicine(2-비스(2-하이드록시에틸)아미노)아세트산), 트리스(트리스(하이드록시메틸)암모늄메탄), Tricine(N-(2-하이드록시-1,1-비스(하이드록시메틸)에틸)글라이신), HEPES (4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산), TES(2-[[1,3-디하이드록시-2-(하이드록시메틸)프로판-2-일]아미노]메탄술폰산) 및 PIPES (피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 등장화제는 히알루론산 필러의 제조에 사용되는 것이면 제한없이 사용할 수 있으며, 완충액에 포함될 수 있다. 바람직한 등장화제로서, 염화나트륨을 사용할 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 필러 조성물은 개체에 투여될 때 유익한 효과를 제공하는 다른 물질 또는 물질의 조합을 더욱 포함할 수 있으며, 예를 들어, 항산화제, 가려움-방지제, 셀룰라이트-방지제, 흉터-방지제, 항-염증제, 마취제, 자극-완화제, 혈관수축제, 혈관확장제, 항-출혈제 가령 지혈제 또는 항-섬유소용해제, 박피제, 탄력부여제, 항-여드름제, 착색제, 착색-방지제, 또는 보습제를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

일 구현예에서, 상기 필러 조성물은 목, 가슴, 엉덩이, 팔, 겨드랑이, 손, 다리 및 발로 구성된 군으로부터 선택되는 연조직의 주름 및 조직 부피 감소 개선 용도로 사용되거나, 상처, 흉터 또는 튼살 치료 용도로 사용될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 필러 조성물은 화장료 조성물일 수 있으며, 바람직하게는 목, 가슴, 엉덩이, 팔, 겨드랑이, 손, 다리 및 발로 구성된 군으로부터 선택되는 연조직의 주름 또는 조직 부피 감소 개선용 화장료 조성물일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 필러 조성물은 약학적 조성물일 수 있으며, 바람직하게는 상처, 흉터 또는 튼살 치료 또는 예방 용도의 약학적 조성물일 수 있다.

상기의 필러 조성물이 화장료 조성물 또는 약학적 조성물의 형태인 경우, 상술한 조성물 항목에서 화장료 조성물 및 약학적 조성물에 관해 설명된 기술 내용 및 기술 특징들은 본 발명의 필러 조성물에 그대로 적용되므로, 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 중복하여 설명하지 않는다.

본 발명의 필러 조성물은 상기 용도에 적합한 투여 형태로 투여될 수 있고, 바람직하게는 주사제 형태일 수 있다.

본 발명의 필러 조성물은 멸균의 공정을 거칠 수 있고, 적절한 용기, 예를 들어 시린지 등에 정량 충진, 밀봉 및 멸균될 수 있다.

펩타이드의 용도

본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 피부 재생 또는 피부 상태 개선에 사용하는 용도를 제공한다.

본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 피부 재생 또는 피부 상태 개선용 화장품의 제조에 사용하는 용도를 제공한다.

본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 피부 질환의 치료에 사용하는 용도를 제공한다.

본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 피부 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에 사용하는 용도를 제공한다.

본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 히알루론산 분해의 지연에 사용하는 용도를 제공한다.

본 발명의 펩타이드 및 조성물에서 설명된 본 발명의 기술 내용 및 기술 특징들은 모두 동일한 양태로 상기한 본 발명 펩타이드의 용도들에 대해서 적용되므로, 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 이러한 기술 내용 및 기술 특징들에 대해서는 중복하여 설명하지 않는다.

다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명의 펩타이드가 NIH3T3 세포(mouse fibroblast)와 HaCaT 세포(human keratinocyte cell line)의 증식을 촉진하는 효과를 보여주는 실험 결과이다.

도 2는 본 발명의 펩타이드가 NIH3T3 세포(mouse fibroblast)와 HaCaT 세포(human keratinocyte cell line)에서 콜라겐 및 히알루론산(HA)의 발현을 촉진하는 효과를 보여주는 실험 결과이다.

도 3은 본 발명의 펩타이드가 히알루론산 용액내에서 히알루론산 분해효소에 의한 히알루론산의 분해를 지연하는 효과를 보여주는 실험 결과이다.

도 4는 본 발명의 펩타이드가 BDDE 가교된 히알루론산 필러에서 히알루론산 분해효소에 의한 히알루론산의 분해를 지연하는 효과를 보여주는 실험 결과이다.

도 5는 본 발명의 펩타이드가 히알루론산 용액내에서 활성산소(과산화수소)에 의한 히알루론산의 분해를 지연하는 효과를 보여주는 실험 결과이다.

도 6은 본 발명의 펩타이드가 BDDE 가교된 히알루론산 필러에서 활성산소(과산화수소)에 의한 히알루론산의 분해를 지연하는 효과를 보여주는 실험 결과이다.

도 7a는 본 발명의 펩타이드가 50℃의 고온에서도 안정한 것을 보여주는실험결과이다.

도 7b는 본 발명의 펩타이드가 pH 4 내지 10의 범위에서도 안정한 것을 보여주는 실험결과이다.

도 8은 본 발명의 펩타이드의 히알루론산 분해 효소에 의한 히알루론산의 분해를 지연하는 작용을 보여주는 모식도이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.

제조예 1: 펩타이드 및 펩타이드 복합체의 제조

자동 펩타이드 합성기(CEM Liberty, CEM Corporation, 미국)를 이용하여 하기의 표 1에 기재된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 합성하고, C18 역상 고성능액체크로마토그래피(HPLC)(Thermo Fisher Scientific, 미국)를 이용하여 이들 합성된 펩타이드를 순수 분리하였다. 컬럼은 ACQUITY UPLC BEH300 C18 (2.1 ㎜ Х 100 ㎜, 1.7 ㎛, Waters Co, 미국)을 이용하였다.

서열번호	펩타이드의 아미노산 서열
1	KIWNLEPSRNGT

상기 제조한 서열번호 1의 펩타이드에 대해 다음의 실험을 통해 그 효능을 평가하였다.

실험예 1: 세포증식(cell proliferation) 분석

상기 제조예 1에서 제조한 서열번호 1의 펩타이드가 세포증식에 미치는 영향을 평가하였다.

NIH3T3 세포(mouse fibroblast)와 HaCaT 세포(human keratinocyte cell line)를 1 x 10⁴ cells/웰(well)의 밀도로 96-웰 플레이드에 접종(seeding)하여 24시간 동안 배양하였다. 세포를 무혈청(serum-free) DMEM 배지로 1회 세척하였다. 무혈청 DMEM 배지 200μL에 펩타이드의 양을 달리하여 첨가하여, 1.6 μM, 8 μM, 40 μM, 200 μM, 1000 μM 농도의 펩타이드 배지 용액을 제조하고, 제조한 펩타이드 배지 용액을 상기 세척한 세포에 처리하였다. 이어서, 처리한 세포를 72시간 동안 37℃ CO2 인큐베이터(incubator)에서 배양한 후에, PBS로 2회 세척한 후, MTT (Sigma, Cat. No.: M2003, USA) 용액을 최종 농도 0.5 mg/ml이 되도록 각 웰(well)에 분주하였다. 이어서, 차광한 후에, 4시간 동안 37℃ CO2 인큐베이터 에서 배양하였다. 마이크로플레이트 리더(Microplate reader, SpectraMax iD3, Molecular devices, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험결과, 도 1의 실험결과에서 보여지는 바와 같이, 펩타이드 처리시 NIH3T3 세포및 HaCaT 세포 2가지 모두의 피부세포주에서 뚜렷한 세포증식 촉진 효과가 관찰되었다.

실험예 2: 콜라겐 및 히알루론산(HA) 발현 촉진 분석

상기 제조예 1에서 제조한 서열번호 1의 펩타이드가 콜라겐(collagen) 및 히알루론산(HA, hyaluronic acid)의 발현에 미치는 영향을 확인하였다.

NIH3T3 세포(mouse fibroblast)와 HaCaT 세포(human keratinocyte cell line)를 1 x 10⁴ cells/웰(well)의 밀도로 24-웰 플레이드에 접종(seeding)하여 24시간 동안 배양하였다. 세포를 무혈청(serum-free) DMEM 배지로 1회 세척하였다. 무혈청 DMEM 배지 500μL에 펩타이드의 양을 달리하여 첨가하여, 50 μM, 100 μM, 200 μM의 농도가 되도록 펩타이드 배지 용액을 제조하고, 제조한 펩타이드 배지 용액을 상기 세척한 세포에 처리하였다. 이때 양성 대조군으로는 NIH3T3 세포에서 100 nM의 TGF-β1을 사용하였고, HaCaT 세포에서는 100 nM의 IGF-1을 사용하였다. 이어서, 처리한 세포를 72시간 동안 37℃ CO2 인큐베이터(incubator)에서 배양하였다. 세포 배양액을 수집하고, 이를 원심분리한 후에 상등액을 튜브에 옮겨 담았다. 얻은 상등액에 대해 각각 Collagen ELISA 키트 (abcam, Cat No.: ab210579, UK) 및 HA ELISA 키트 (ECHELON biosciences, Cat No.: K-1200, USA)를 사용하여 ELISA 분석을 진행하였다.

실험결과, 도 2의 실험결과에서 보여지는 바와 같이, 펩타이드 처리시 50 μM 내지 200 μM의 농도에서, NIH3T3 세포 및 HaCaT 세포 모두에서 유의한 콜라겐 발현 증가 효과와 히알루론산(HA) 발현 증가 효과가 관찰되었다. 이러한 결과는 본 발명의 펩타이드가 피부세포를 자극하여 세포외기질(ECM, extracellular matrix)의 생성을 촉진한다는 것을 시사하는 것이다.

실험예 3: 히알루론산 분해효소에 의한 히알루론산(HA) 분해의 지연 효능 분석

상기 제조예 1에서 제조한 서열번호 1의 펩타이드가 히알루론산 분해효소에 의한 히알루론산의 분해를 지연하는 효과를 갖는지를 평가하였다.

1. 히알루론산 용액에서의 히알루론산 분해 지연 평가

히알루론산을 PBS에 1.5중량%의 농도가 되도록 용해시켜 수화(hydration)시킨 후, 이 용액 10g을 코니칼 튜브(conical tube)에 분주하였다. 상기 분주된 히알루론산 용액에 펩타이드의 최종 농도가 각각 0ppm(첨가하지 않음), 100 ppm, 1000 ppm, 5000 ppm이 되도록 펩타이드 용액을 첨가하였다. 여기에 히알루론산 분해효소(Hyaluronidase from bovine testes, Hadase, Sigma) 2mL을 각각 첨가하였다. 0분 및 30분에 샘플링하여 Rheometer (single shear stress)로 점도(viscosity)를 측정하여 펩타이드 농도에 따른 점도 값을 비교하였다. 위와 같이, 펩타이드를 각 농도별로 첨가한 1.5중량% 히알루론산 용액에 히알루론산 분해효소를 처리하여 30분간 효소반응을 유지시켜 히알루론산을 분해시켰다. 분해 반응 후 히알루론산 용액의 점도(viscosity)를 측정하여 분해지연효능을 확인하였다. 실험결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 펩타이드의 농도가 증가할수록 히알루론산의 분해가 지연됨을 확인하였다. 1000 ppm와 5000 ppm의 분해지연 효능의 차이가 크지 않아 이후 실험은 1000 ppm의 농도로 진행하였다.

2. 가교 필러에서의 히알루론산 분해 지연 평가

제조예 1의 펩타이드를 함유하거나 또는 펩타이드를 함유하지 않는, BDDE(1,4-Butanediol diglycidyl ether) 가교된 히알루론산 필러(filler)를 준비하고, 흡광 염료로서 Congo Red 및 히알루론산 분해효소(Hyaluronidase, HAdase)를 준비하였다. 1.5 mL의 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 1mM의 Congo Red 20 μl을 넣고, 펩타이드 무 함유 필러(대조군 필러), 펩타이드 함유 필러를 각각 100 μl씩 흡광 염료 위에 넣었다. 여기에, 0.15 mg/ml (108 unit)의 히알루론산 분해효소를 350μl씩 각각 처리하였다. 37℃의 인큐베이터에 넣고, 6시간, 24시간의 시점에서 샘플 상등액 100 μl를 취하여 96웰에 옮겨 담았다. 마이크로플레이트 리더(Microplate reader, SpectraMax iD3, Molecular devices, USA)를 이용하여 500 nm에서 흡광도를 측정하였다. 위와 같이, 펩타이드를 함유 또는 함유하지 않은 BDDE 가교된 히알루론산 필러 시료를 준비하고, 히알루론산 분해 효소에 의한 히알루론산 필러의 분해 정도를 펩타이드의 유무에 따라 비교하였다. 히알루론산 필러의 분해 정도는 염료의 확산에 따른 흡광도의 변화로 측정하였다. 즉, 분해효소에 의한 히알루론산 분해시 시료의 흐름성이 증가하여 염료의 확산이 증가하는 원리를 이용하였다. 실험결과, 도 4에서 보여지는 바와 같이, 히알루론산 분해효소 처리 후 24 시간에서 시료에 함유된 펩타이드로 인해 분해 지연이 15% 이상 개선된 것을 확인하였다.

실험예 4: 활성산소에 의한 히알루론산(HA) 분해의 지연 효능 분석

상기 제조예 1에서 제조한 서열번호 1의 펩타이드가 활성산소에 의한 히알루론산의 분해를 지연하는 효과를 갖는지를 평가하였다.

1. 히알루론산 용액에서의 히알루론산 분해 지연 평가

히알루론산을 PBS에 1.5중량%의 농도가 되도록 용해시켜 수화(hydration)시킨 후, 이 용액 10g을 코니칼 튜브(conical tube)에 분주하였다. 상기 분주된 히알루론산 용액에 펩타이드의 최종 농도가 각각 0ppm(첨가하지 않음), 100 ppm, 1000 ppm, 5000 ppm이 되도록 펩타이드 용액을 첨가하였다. 여기에 500mM의 과산화수소(H2O2) 2mL을 각각 넣었다. 0분, 30분, 60분 및 180분에 샘플링하여 Rheometer (single shear stress)로 점도(viscosity)를 측정하여 펩타이드 농도에 따른 점도 값을 비교하였다. 위와 같이, 펩타이드를 각 농도별로 첨가한 1.5중량% 히알루론산 용액에 과산화수소를 처리하여 60분, 180분간 활성산소에 의한 분해반응을 유지하여 히알루론산을 분해시켰다. 분해 반응 후 히알루론산 용액의 점도(viscosity)를 측정하여 분해지연 효능을 확인하였다. 실험결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 펩타이드의 농도가 증가할수록 히알루론산의 분해가 지연됨을 확인하였다.

2. 가교 필러에서의 히알루론산 분해 지연 평가

제조예 1의 펩타이드를 함유하거나 또는 펩타이드를 함유하지 않는, BDDE(1,4-Butanediol diglycidyl ether) 가교된 히알루론산 필러(filler)를 준비하고, 흡광 염료로서 Congo Red 및 히알루론산 분해효소(Hyaluronidase, HAdase)를 준비하였다. 1.5 mL의 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 1mM의 Congo Red 20 μl을 넣고, 펩타이드 무 함유 필러(대조군 필러), 펩타이드 함유 필러를 각각 100 μl씩 흡광 염료 위에 넣었다. 여기에, 500 mM 과산화수소(H2O2)를 350 μl씩 각각 처리하였다. 37℃의 인큐베이터에 넣고, 1시간, 3시간, 6시간, 24시간, 48시간, 72시간의 시점에서 샘플 상등액 100 μl를 취하여 96웰에 옮겨 담았다. 마이크로플레이트 리더(Microplate reader, SpectraMax iD3, Molecular devices, USA)를 이용하여 500 nm에서 흡광도를 측정하였다. 위와 같이, 펩타이드를 함유 또는 함유하지 않은 BDDE 가교된 히알루론산 필러 시료를 준비하고, 활성산소에 의한 히알루론산 필러의 분해 정도를 펩타이드의 유무에 따라 비교하였다. 히알루론산 필러의 분해 정도는 염료의 확산에 따른 흡광도의 변화로 측정하였다. 즉, 활성산소에 의한 히알루론산 분해시 시료의 흐름성이 증가하여 염료의 확산이 증가하는 원리를 이용하였다. 실험결과, 도 6에서 보여지는 바와 같이, 과산화수소(활성산소) 처리 후 24 시간에서 시료에 함유된 펩타이드로 인해 분해 지연이 50% 이상 개선된 것을 확인하였으며, 48 시간 처리 시료에서는 펩타이드 무 함유 필러의 경우 대부분의 히알루론산이 분해된 반면 펩타이드 함유시에는 85%의 분해 지연 효과가 확인되었다.

실험예 5: 펩타이드의 pH 안정성 및 열 안정성 평가

상기 제조예 1에서 제조한 서열번호 1의 펩타이드의 pH 안정성 및 열 안정성을 평가하였다.

pH 안정성 평가는 다음과 같이 행하였다. 제조예 1의 펩타이드 1000 ppm 농도의 희석액 용액을 준비하고, 이 용액의 초기 pH 값을 측정하였다(pH=3.21). 0.5 M의 NaOH를 첨가하여 용액의 pH가 각각 pH 4, pH 7, 및 pH 10이 되도록 적정하였다. 각각의 샘플을 0.22 μm의 필터로 여과하였다. HPLC로 측정하여 pH 7을 기준으로 Area 값을 비교하였다.

열 안정성 평가는 다음과 같이 행하였다. 제조예 1의 펩타이드 1000 ppm 농도의 희석액 용액을 준비하고, 50 ml 코니칼 튜브에 분주하여 넣고, 25℃, 50℃의 인큐베이터에 두었다. 72시간 후에 각각의 샘플 1 ml을 0.22 μm의 필터로 여과하였다. HPLC로 측정하여 pH 7을 기준으로 25℃ 기준으로 Area 값을 비교하였다.

실험결과, 도 7a 및 도 7b에서 보여지는 바와 같이, 제조예 1의 펩타이드가 50℃의 고온에서도 안정하고, pH 4 내지 10의 범위에서도 안정한 것을 확인하였다.

상기에서는 본 출원의 대표적인 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 출원의 범위는 상기와 같은 특정 실시예만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 출원의 청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
청구항 1에 있어서, 상기 펩타이드는 히알루론산의 분해를 지연시키는 활성을 갖는 것인, 펩타이드.
청구항 1에 있어서, 상기 펩타이드는 섬유아세포(fibroblast) 또는 각질형성세포(keratinocyte)의 증식의 촉진; 또는 콜라겐 또는 히알루론산의 발현을 촉진하는 활성을 갖는 것인, 펩타이드.
청구항 1의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 재생 또는 피부 상태 개선용 조성물.
청구항 1의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 재생 또는 피부 상태 개선용 화장료 조성물.
청구항 5에 있어서, 상기 피부 상태의 개선은 피부 탄력의 증진, 피부 주름의 개선, 피부 보습의 증진, 피부 노화의 억제, 자외선에 의한 피부 손상의 회복, 자외선으로부터 피부의 보호, 또는 피부 상처의 개선인 것인, 피부 상태 개선용 화장료 조성물.
청구항 1의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 7에 있어서, 상기 피부질환은 피부의 상처 또는 피부의 흉터인 것인, 피부 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 히알루론산의 분해 지연용 조성물.
청구항 7에 있어서,

상기 히알루론산의 분해는 히알루론산 분해 효소(hyaluronidase)에 의한 분해 또는 활성산소에 의한 분해인 것인, 조성물.
청구항 1의 펩타이드 및 히알루론산을 포함하는, 필러(filler) 조성물.
청구항 11에 있어서,

상기 히알루론산은 가교된 히알루론산인 것인, 필러 조성물.
청구항 12에 있어서,

상기 가교된 히알루론산은 BDDE(1,4-butane diol diglycidyl ether), PEG(polyethylene glycol), DVS (divinyl sulfone), PEGDGE (Poly (ethylene glycol) diglycidyl ether), 1,6-헥산디올 디글리시딜 에테르 (1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌 글리콜 디글리시딜 에테르 (propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌 글리콜 디글리시딜 에테르 (poly(propylene glycol) diglycidyl ether), 폴리테트라메틸렌글리콜 디글리시딜 에테르 (poly(tetramethylene glycol) diglycidyl ether), 1,6-헥산디올 디글리시딜 에테르 (1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌 글리콜 디글리시딜 에테르 (propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌 글리콜 디글리시딜 에테르 (poly(propylene glycol) diglycidyl ether), 및 폴리테드라메틸렌글리콜 디글리시딜에테르 (poly(tetramethylene glycol) diglycidyl ether)으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 가교제로 가교된 것인, 필러 조성물.
청구항 11에 있어서,

상기 필러 조성물은 목, 가슴, 엉덩이, 팔, 겨드랑이, 손, 다리 및 발로 구성된 군으로부터 선택되는 연조직의 주름 및 조직 부피 감소 개선을 위해 사용되거나, 또는 상처, 흉터 또는 튼살 치료를 위해 사용되는 것인, 필러 조성물.