WO2024145858A1 - Dna-trail复合物及其治疗肿瘤的用途 - Google Patents
Dna-trail复合物及其治疗肿瘤的用途Info
- Publication number
- WO2024145858A1 WO2024145858A1 PCT/CN2023/070590 CN2023070590W WO2024145858A1 WO 2024145858 A1 WO2024145858 A1 WO 2024145858A1 CN 2023070590 W CN2023070590 W CN 2023070590W WO 2024145858 A1 WO2024145858 A1 WO 2024145858A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- dna
- trail
- seq
- origami structure
- cancer
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 62
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title abstract description 16
- 239000002131 composite material Substances 0.000 title abstract 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims abstract description 143
- 239000013638 trimer Substances 0.000 claims abstract description 62
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 45
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 333
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 50
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 47
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 47
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 38
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 32
- 108010048586 SpyCatcher peptide Proteins 0.000 claims description 32
- 108010092505 SpyTag peptide Proteins 0.000 claims description 31
- 239000012082 adaptor molecule Substances 0.000 claims description 31
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 17
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 17
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 14
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 12
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 10
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 9
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 8
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 8
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims description 7
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 7
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 7
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 claims description 7
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 7
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 7
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 7
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 6
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 6
- DPOPAJRDYZGTIR-UHFFFAOYSA-N Tetrazine Chemical compound C1=CN=NN=N1 DPOPAJRDYZGTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 6
- 102000002226 Alkyl and Aryl Transferases Human genes 0.000 claims description 5
- 108010014722 Alkyl and Aryl Transferases Proteins 0.000 claims description 5
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 5
- 108010004901 Haloalkane dehalogenase Proteins 0.000 claims description 5
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 5
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 5
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 5
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000022072 Gallbladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 101000945318 Homo sapiens Calponin-1 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000652736 Homo sapiens Transgelin Proteins 0.000 claims description 4
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 4
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 201000009036 biliary tract cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000020790 biliary tract neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 201000010175 gallbladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 claims description 4
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 4
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 19
- QRZUPJILJVGUFF-UHFFFAOYSA-N 2,8-dibenzylcyclooctan-1-one Chemical compound C1CCCCC(CC=2C=CC=CC=2)C(=O)C1CC1=CC=CC=C1 QRZUPJILJVGUFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 102100031013 Transgelin Human genes 0.000 claims 2
- 230000001745 anti-biotin effect Effects 0.000 claims 2
- 108700012411 TNFSF10 Proteins 0.000 description 186
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 41
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 35
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 32
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 27
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 22
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 20
- 101000610605 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10A Proteins 0.000 description 18
- 101000610604 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Proteins 0.000 description 18
- 102100040113 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10A Human genes 0.000 description 18
- 102100040112 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Human genes 0.000 description 18
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 15
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 15
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 15
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 15
- 108091008104 nucleic acid aptamers Proteins 0.000 description 14
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 13
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 13
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 12
- 101000830565 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 10 Proteins 0.000 description 10
- 102000046283 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Human genes 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 10
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 102000044949 human TNFSF10 Human genes 0.000 description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 7
- 238000004630 atomic force microscopy Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 7
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 7
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000002259 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptors Human genes 0.000 description 6
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 5
- 102100029855 Caspase-3 Human genes 0.000 description 5
- 102000004091 Caspase-8 Human genes 0.000 description 5
- 108090000538 Caspase-8 Proteins 0.000 description 5
- -1 NHS ester Chemical class 0.000 description 5
- 108010000449 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptors Proteins 0.000 description 5
- 238000010162 Tukey test Methods 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 229950000317 dulanermin Drugs 0.000 description 5
- HYWYRSMBCFDLJT-UHFFFAOYSA-N nimesulide Chemical compound CS(=O)(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1OC1=CC=CC=C1 HYWYRSMBCFDLJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- 108010049207 Death Domain Receptors Proteins 0.000 description 4
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 4
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- URYYVOIYTNXXBN-OWOJBTEDSA-N trans-cyclooctene Chemical compound C1CCC\C=C\CC1 URYYVOIYTNXXBN-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 4
- 238000005829 trimerization reaction Methods 0.000 description 4
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 3
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 3
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 102000009058 Death Domain Receptors Human genes 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 3
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 3
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 3
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102100033620 Calponin-1 Human genes 0.000 description 2
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 2
- 108010040476 FITC-annexin A5 Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 101710097160 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 10 Proteins 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N azide group Chemical group [N-]=[N+]=[N-] IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001540 azides Chemical group 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 229950007276 conatumumab Drugs 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000005917 in vivo anti-tumor Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000010445 mica Substances 0.000 description 2
- 229910052618 mica group Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000008816 organ damage Effects 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- OCFIRCHPJWLACG-VKHMYHEASA-N (2r)-2-azaniumyl-3-(methylcarbamoylsulfanyl)propanoate Chemical compound CNC(=O)SC[C@H](N)C(O)=O OCFIRCHPJWLACG-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- WKKCYLSCLQVWFD-UHFFFAOYSA-N 1,2-dihydropyrimidin-4-amine Chemical class N=C1NCNC=C1 WKKCYLSCLQVWFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WNDKIGQUFDOYIB-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxypyrrolidine-2,5-dione;propanoic acid Chemical compound CCC(O)=O.ON1C(=O)CCC1=O WNDKIGQUFDOYIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KBDWGFZSICOZSJ-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-2,3-dihydro-1H-pyrimidin-4-one Chemical class N1CNC=C(C1=O)C KBDWGFZSICOZSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PGSPUKDWUHBDKJ-UHFFFAOYSA-N 6,7-dihydro-3h-purin-2-amine Chemical class C1NC(N)=NC2=C1NC=N2 PGSPUKDWUHBDKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700026758 Adenovirus hexon capsid Proteins 0.000 description 1
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 1
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 1
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009127 Glutaminase Human genes 0.000 description 1
- 108010073324 Glutaminase Proteins 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 101000611023 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6 Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N Nickel(2+) Chemical compound [Ni+2] VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 101000980867 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) Curved DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 101000982319 Shallot virus X Uncharacterized ORF4 protein Proteins 0.000 description 1
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 108091007178 TNFRSF10A Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100024598 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 10 Human genes 0.000 description 1
- 102000018594 Tumour necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007852 Tumour necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N [N].NC(N)=O Chemical compound [N].NC(N)=O PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 208000037844 advanced solid tumor Diseases 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 description 1
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 230000005756 apoptotic signaling Effects 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 150000001615 biotins Chemical class 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000034725 extrinsic apoptotic signaling pathway Effects 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N formamide Substances NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 229950004896 ganitumab Drugs 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N gemcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1C(F)(F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N 0.000 description 1
- 229960005277 gemcitabine Drugs 0.000 description 1
- 238000009650 gentamicin protection assay Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229920003063 hydroxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229940031574 hydroxymethyl cellulose Drugs 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 1
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000023028 membrane raft localization Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N nickel Substances [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 1
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L oxaliplatin Chemical compound O1C(=O)C(=O)O[Pt]11N[C@@H]2CCCC[C@H]2N1 DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L 0.000 description 1
- 229960001756 oxaliplatin Drugs 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 108700015048 receptor decoy activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000006177 thiolation reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
本发明公开了一种DNA-TRAIL复合物、制备其的方法和试剂盒以及使用其治疗肿瘤的方法和用途，其中所述DNA-TRAIL复合物包含一个DNA折纸结构和与其连接的形成TRAIL三聚体的3个TRAIL单体。
Description
本发明涉及肿瘤治疗领域，特别地，涉及一种基于DNA折纸结构的TRAIL复合物。
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)是属于肿瘤坏死因子超家族的II型膜蛋白[Pitti RM,et al.,Induction of apoptosis by Apo-2 ligand,a new member of the tumor necrosis factor cytokine family.J Biol Chem.1996；271(22):12687-12690]。TRAIL可以组装成同源三聚体，三聚体结构对其生物学功能至关重要[Yan J,et al.Engineered adenovirus fiber shaft fusion homotrimer of soluble TRAIL with enhanced stability and antitumor activity.Cell Death Dis.2016；7(6):e2274]。通过交联TRAIL受体(TRAIL-R)1或TRAIL-R2，也称为死亡受体4和5(DR4和DR5)，TRAIL三聚体能够在多种肿瘤细胞中诱导凋亡，同时使缺少相应受体的正常细胞不受影响[de Miguel D,et al.Onto better TRAILs for cancer treatment.Cell Death Differ.2016；23(5):733-747]。迄今为止，临床研究中已评估了几种针对TRAIL和DR4/DR5之间相互作用的治疗方法，包括重组人TRAIL(Dulanermin)和抗DR5的激动性抗体(AMG655)[Cheah CY,et al.Dulanermin with rituximab in patients with relapsed indolent B-cell lymphoma:an open-label phase 1b/2 randomised study.Lancet Haematol.2015；2(4):e166-e174；Soria JC,et al.Phase 1b study of dulanermin(recombinant human Apo2L/TRAIL)in combination with paclitaxel,carboplatin,and bevacizumab in patients with advanced non-squamous non-small-cell lung cancer.J Clin Oncol.2010；28(9):1527-1533；Herbst RS,et al.A first-in-human study of conatumumab in adult patients with advanced solid tumors.Clin Cancer Res.2010；16(23):5883-5891]。不幸的是，II期随机临床研究的结果未能证明其显著的临床益处[Kindler HL,et al.A randomized,placebo-controlled phase 2 study of ganitumab(AMG 479)or conatumumab(AMG 655)in combination with gemcitabine in patients with metastatic pancreatic cancer.Ann Oncol.2012；23(11):2834-2842；Graves JD,et al.Apo2L/TRAIL and the death receptor 5agonist antibody AMG 655 cooperate to promote receptor clustering and antitumor activity.Cancer Cell.2014；26(2):177-189]。造成这些的原因可能是由于这些治疗剂的激动活性较差[Dimberg LY,et al.On the TRAIL to successful cancer therapy？Predicting and counteracting resistance against TRAIL-based therapeutics.Oncogene.2013；32(11):1341-1350]。深入了解TRAIL及其受体之间的相互作用模式对于开发更有效的治疗方法至关重要。
细胞膜上的受体聚集对许多受体的信号激活至关重要。以DR5为例，跨膜螺旋(TMH)单独可以组装更高阶结构以驱动下游信号。然而，DR5通过胞外结构域(ECD)二聚体作为二聚体前配体状态存在于细胞膜上，而非配体ECD二聚体抑制TMH寡聚[Pan L,et al.Higher-Order Clustering of the Transmembrane Anchor of DR5 Drives Signaling.Cell.2019；176(6):1477-1489.e14；Fu Q,et al.Structural Basis and Functional Role of Intramembrane Trimerization of the Fas/CD95 Death Receptor.Mol Cell.2016；61(4):602-613]。一旦DR5的ECD与TRAIL三聚体结合，TMH就被释放以三聚化。最后，具有二聚体三聚体网络的DR5的高阶六边形簇与TRAIL三聚体一起形成。TRAIL三聚体的三聚体结构在此过程中至关重要，因为它介导DR5二聚体的三聚和最终网络形成[Vanamee
et al.Structural principles of tumor necrosis factor superfamily signaling.Sci Signal.2018；11(511):eaao4910；Li J,et al.Structural basis of signal transduction in the TNF receptor superfamily.Adv Immunol.2013；119:135-153]。
TRAIL模拟肽在DNA折纸上以低于10nm的配体间距进行了六边形图案化，揭示了用于诱导DR5聚类的六边形图案的肽的的关键配体间距约5nm[Wang Y,et al.Clustering of Death Receptor for Apoptosis Using Nanoscale Patterns of Peptides.ACS Nano.2021；15(6):9614-9626]。然而，尚未对TRAIL蛋白多聚体中的配体间距离与由此产生的生物学效应之间的关系进行全面研究，特别是在10至60纳米的配体间的距离范围内。
发明简述
本发明开发了一种“雕刻印刷”策略，将三个TRAIL单体快速修饰到一个扁平的矩形DNA折纸上(DNA-TRAIL3)，并将单体距离控制在15-60nm。与天然TRAIL单体相比，这些DNA-TRAIL3三聚体表现出更强的受体结合亲和力，KD值低2-3个数量级，其中DNA-TRAIL3-40是最佳候选。DNA-TRAIL3-40在体外也诱导了最强的信号通路激活和最强的癌细胞凋亡率。重要的是，与天然TRAIL单体相比，DNA-TRAIL3-40在体内实验中表现出更有利的药代动力学和抗肿瘤作用。
在第一方面，提供了一种DNA-TRAIL复合物，其包含一个DNA折纸结构和形成TRAIL三聚体的3个TRAIL单体，其中所述3个TRAIL单体分别与所述DNA折纸结构的同一面上相同侧的3个位点连接并且任意两个位点相距15-60nm、优选25-40nm、最优选40nm，并且所述3个位点形成等边三角形或近似等边三角形。
在第二方面，提供了一种制备第一方面的DNA-TRAIL复合物的方法，包括：(a)提供一个DNA折纸结构，(b)将3个TRAIL单体分别与所述DNA折纸结构的同一面上相同侧的3个位点连接，其中任意两个位点相距15-60nm、优选25-40nm、最优选40nm，并且所述3个位点形成等边三角形或近似等边三角形，和(c)收获形成的在DNA折纸结构同一面上同侧3个位点连接的DNA-TRAIL复合物。
在第三方面，提供了一种试剂盒，其包含：(i)在同一面相同侧的至少3个位点处连接有互配衔接分子的DNA折纸结构，其中任意两个位点相距约15-60nm、优选约25-40nm、最优选约40nm，并且所述3个位点形成等边三角形或近似等边三角形，和(ii)TRAIL单体-衔接分子融合蛋白。
在第四方面，提供了一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其包含第一方面的DNA-TRAIL复合物、根据第二方面的方法获得的DNA-TRAIL复合物或使用第三方面的试剂盒配制的DNA-TRAIL复合物以及任选存在的药学可接受的载体。
在第五方面，提供了第一方面的DNA-TRAIL复合物、根据第二方面的方法获得的 DNA-TRAIL复合物或使用第三方面的试剂盒配制的DNA-TRAIL复合物用于治疗肿瘤；或者，提供了第一方面的DNA-TRAIL复合物、根据第二方面的方法获得的DNA-TRAIL复合物或使用第三方面的试剂盒配制的DNA-TRAIL复合物在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
在第六方面，提供了一种治疗对象肿瘤的方法，包括给对象施用治疗有效量的第一方面的DNA-TRAIL复合物、根据第二方面的方法获得的DNA-TRAIL复合物、使用第三方面的试剂盒配制的DNA-TRAIL复合物或第四方面的药物组合物。
图1：具有不同配体间距的DNA-TRAIL3三聚体的设计和表征。
(A)DNA-TRAIL3三聚体的构建过程示意图。通过将作为支架的M13mp18噬菌体的基因组DNA(SEQ ID NO：6)与多个短链(SEQ ID NO：7-149)和捕获链(SEQ ID NO：150-160)一起缓慢退火，组装了扁平矩形DNA折纸。叠氮修饰的SpyTag肽(SEQ ID NO：3)通过点击化学反应偶联到含有DBCO互补链上。SpyTag衔接缀合物随后通过退火和互补链和捕获链之间的DNA杂交雕刻在DNA折纸的表面上。最后，通过SpyTag和SpyCatcher(SEQ ID NO：2)之间的异肽键形成，TRAIL-SpyCatcher(SEQ ID NO：5)蛋白被快速印刷在DNA折纸上。
(B)具有不同配体间距的DNA-TRAIL3三聚体的设计。通过改变捕获链的位置，将TRAIL单体在DNA折纸上的位置设置为不同的配体间距离，包括约15nm(DNA-TRAIL3-15)、25nm(DNA-TRAIL3-25)、40nm(DNA-TRAIL3-40)、55nm(DNA-TRAIL3-55)和60nm(DNAT-RAIL3-60)。
(C)不同DNA-TRAIL3三聚体的AFM观察。比例尺，50nm。
(D)不同DNA-TRAIL3三聚体的高度测量。在裸位置(上面一排)和TRAIL修饰位置(下面一排)测量DNA折纸的高度。
(E)TRAIL组装效率。不同DNA-TRAIL3三聚体的产率计算为在预期位置承载TRAIL单体的DNA折纸相对于总DNA折纸量的百分比。图中0、1、2、3分别表示每个DNA折纸上链接TRAIL单体的数目。
图2：DNA-TRAIL3三聚体的体外细胞毒性。(A)分组信息。(B-D)通过CCK-8测定，COLO205细胞(B)、Hela细胞(C)和NCI-H460细胞(D)的细胞活力。数据在GraphPad Prism 7上处理，以平均值±SD表示。P值使用单因素方差分析和Tukey事后检验确定。*，P<0.05；***，P<0.001。
图3：DNA-TRAIL3三聚体体外诱导细胞凋亡。(A)分组信息。(B-C)早期凋亡细胞的百分比(Annexin V+/PI-)。数据在GraphPad Prism 7上处理，以平均值±SD表示。P值使用单因素方差分析和Tukey事后检验确定。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。
图4：DNA-TRAIL3三聚体体外诱导的信号通路激活。(A)分组信息。(B-C)Western blot分析用10nM浓度TRAIL的不同TRAIL制剂处理6小时的COLO205细胞 中caspase-8(B)和caspase-3(C)蛋白。Pro-cass-8(Pro-cas-8)和Pro-cass-3(Pro-cas-3)分别被切割成活性caspase-8(P43/41-cas-8和P18-cas-8)和活性caspase-3(P19-cas-3和P17-cas-3)。使用ImageJ软件测量蛋白质带的灰度值来确定蛋白质水平。(D)用不同TRAIL制剂加上抗DR4和/或抗DR5处理24小时后使用CCK-8测定法测量细胞活力。数据在GraphPad Prism 7上处理，以平均值±SD表示。P值使用单因素方差分析和Tukey事后检验确定。**，P<0.01；***，P<0.001。
图5：DNA-TRAIL3三聚体的体内抗肿瘤作用、药代动力学和体内分布。
(A)用30mg/kg TRAIL的不同TRAIL制剂处理的皮下COLO205荷瘤雌性BALB/c nu/nu小鼠的分组信息和肿瘤生长曲线。
(B)实验终点的肿瘤图像。比例尺，1.5cm。
(C)实验终点的肿瘤重量(n＝6)。
(D)药代动力学评估。BALB/c nu/nu小鼠接受静脉注射不同的TRAIL制剂(30mg/kg TRAIL)。不同时间后，通过ELISA测定血清中的TRAIL蛋白浓度(n＝3)。对于数据计算，分析血清浓度的相对值，将第一个值(5分钟)设置为100％。
(E)生物分布测定。皮下COLO205荷瘤BALB/c nu/nu小鼠接受静脉注射不同的TRAIL制剂(30mg/kg TRAIL)。12和24小时后，通过ELISA测定肝、脾、肾和肿瘤组织中的TRAIL蛋白浓度(n＝3)。数据在GraphPad Prism 7上处理，以平均值±SD表示。P值使用单因素方差分析和Tukey事后检验确定。**，P<0.01；***，P<0.001。
图6：TRAIL三聚体的功能性器官损伤。测定了治疗后动物中的谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、血肌酐、白蛋白、球蛋白和血清总蛋白水平。
发明内容
除非特别指出，本文使用的科学和技术术语应具有本领域技术人员通常已知的含义。另外除非特别需要，则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。前述技术和方法通常根据本领域熟知的及在本说明书引用的参考文献所述的常规方法进行。见例如并入作参考的Sambrook et al.Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001))和Singleton et al.,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY 2nd ed.,J.Wiley&Sons(New York,NY 1994)；Sambrook et al.,MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL,Cold Springs Harbor Press(Cold Springs Harbor,NY 1989)所述。本文引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、文章、教科书等及其中引用的参考文献在此均以其全部并入本文作参考。
如本文所用，术语“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“氨基酸序列”可互换使用，指的是任意长度例如两个或更多个氨基酸残基经肽键结合的聚合物。该术语还包括天然地或人为干预地修饰的氨基酸聚合物；例如形成二硫键、糖基化、酯化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作与修饰，如与标签或具有生物活性的组分缀合。本文采用的是常规的单字母或三字母氨基酸残基编码。通常，若氨基酸聚合物是长的(例如超过50个氨基酸残基)， 其优选称为多肽或蛋白质，但是若其是50个氨基酸长或更短，优选称为“肽”。
本文中，描述氨基酸序列时，除非特别限定或者根据上下文可以确定，否则提及氨基酸序列时为N端至C端方向。
本文所用术语“核酸”，“DNA”，“多核苷酸”和“核苷酸序列”可互换使用，是指脱氧核糖核酸，主链由脱氧核糖核苷酸(脱氧腺嘌呤核苷酸(A)、脱氧鸟嘌呤核苷酸(G)、脱氧胞嘧啶核苷酸(C)、脱氧胸腺嘧啶核苷酸(T))通过3’,5’-磷酸二酯键连接形成的线形或环形多聚体，包含单链或双链，线性或圆形。此外，DNA可以包含本领域已知的合适修饰，例如甲基化、硫代和可被非核苷酸组分间断等。
本文中，描述核酸序列时，除非特别限定或者根据上下文可以确定，否则提及核酸序列时为5′至3′方向。一般地，本文提及DNA(例如支架DNA、短链DNA、互补DNA链、捕获DNA链等)时是单链DNA，除非特别指明或者根据上下文可以确定是双链DNA。
序列相同性可以通过商业可获得的计算机程序来确定，其采用任何适宜的算法计算出两个或多个序列间的相同性百分比，例如采用缺省参数。此类计算机程序的典型的例子是CLUSTAL。更有利地，应用BLAST算法，参数设置为缺省值。在National Center for Biotechnology Information(NCBI)网站上有BLAST算法的详细介绍。
在第一方面，提供了一种DNA-TRAIL复合物，其包含一个DNA折纸结构和形成TRAIL三聚体的3个TRAIL单体，其中所述3个TRAIL单体的C末端或者N端分别与所述DNA折纸结构的同一面上相同侧的3个位点连接并且任意两个位点相距15-60nm，并且所述3个位点形成等边三角形或近似等边三角形。
如本文所用，DNA折纸结构是指将一条长的DNA单链(通常为基因组DNA)与一系列经过设计的短DNA(Staple)片段进行碱基互补，可控地构造出所需的图案或结构。对于不同DNA折纸结构，比如由M13/模板链设计的DNA纳米结构可以使用开源caDNAno软件设计及通用程序退火，小纳米结构的DNA纳米结构可以根据序列互补配对直接设计进行退火，例如参见Paul W.K.Rothemund，Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns，Nature V440：297-302(16March 2006)；R.P.Goodman等，Rapid Chiral Assembly of Rigid DNA Building Blocks for Molecular Nanofabrication，Science，V310：1661-1664(9 December 2005)。
本文所用的DNA折纸结构可以是任何DNA折纸结构，只要其具有一个面，其上在同侧可以存在至少3个位点可用于与本文所述的TRAIL单体连接，其中任意两个位点相距约15-60nm。本文所用的DNA折纸结构可以是二维结构(例如平面DNA折纸结构)或者三维结构(例如多面体DNA折纸结构)。
在一个实施方案中，本文所用的DNA折纸结构是二维DNA折纸结构，优选平面DNA折纸结构，其形状可以是任意二维图形，例如三角形、四边形等规则图形以及其它不规则图形等。
在一个实施方案中，本文所用的DNA折纸结构是平面矩形DNA折纸结构。
如本文所用，所述“面”是指由形成DNA折纸结构的DNA链的至少一部分形成 的二维结构，其中不考虑DNA分子本身的厚度。本文中，所述“面”的大小可以是任意合适的大小，只要可以在其上存在3个位点，其两个位点之间的距离满足本文的要求即可，例如边长可以为约15-100nm，例如约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100nm。在一个实施方案中，本文所用的DNA折纸结构是边长在约60-90nm的平面矩形，例如约60×90nm。
在进一步的实施方案中，所述DNA折纸结构是以M13基因组DNA(例如SEQ ID NO：6)为支架，通过SEQ ID NO：7-149所示的短链DNA(即Staple链)以及SEQ ID NO：150-160所示的DNA(Capture链)中的3条捕获DNA(即(a)SEQ ID NO：152、155、158；(b)SEQ ID NO：151、154、158,；(c)SEQ ID NO：151、153、159；(d)SEQ ID NO：151、156、160；和(e)SEQ ID NO：150、157、160)形成的DNA折纸结构，优选地，使用SEQ ID NO：151、153、159所示的3条捕获DNA。
如本文所用，所述“位点”是指形成DNA折纸结构的DNA分子中的核苷酸残基，该残基位于所述面中并与相应残基通过Watson-Crick碱基配对原理(即A/T、G/C配对)配对。
如本文所用，“同一面上相同侧”是指3个TRAIL单体与DNA折纸结构连接后，位于所述3个位点所在面的同一侧而且能够形成等边三角形或近似等边三角形，从而可以形成TRAIL三聚体。本文所述近似等边三角形是指3个位点所形成的三角形的内角为约60
o±6
o、60
o±5
o、60
o±4
o、60
o±3
o、60
o±2
o或60
o±1
o。
如本文所用，“任意两个位点相距约15-60nm”是指有所述3个位点形成的三角形的各边长为约15-60nm或其任意子范围，并且各个边长可以相等或不相等。例如，在一个实施方案中，所述任意两个位点相距约15-55、15-50、15-45、15-40、15-35、15-30、15-25、15-20、20-60、20-55、20-50、20-45、20-40、20-35、20-30、25-60、25-55、25-50、25-45、25-40、25-35、30-60、30-55、30-50、30-45或30-40nm。在一个实施方案中，所述任意两个位点相距约15、20、25、30、35、40、45、50、55或60nm。优选地，所述任意两个位点相距约40nm。
人TRAIL，又称肿瘤坏死因子配体超家族成员10(Tumor necrosis factor ligand superfamily member 10,TNFSF10)、Apo2Ligand或TL2，其对应登录号为P50591。如本文所用，“TRAIL单体”是指这样的单个TRAIL分子，其包含能够形成三聚体并且与其受体(特别是DR4或DR5受体)结合而诱导细胞凋亡的结构域或区域(例如TRAIL的胞外结构域)。
在一个实施方案中，所述TRAIL单体包含TRAIL的胞外结构域，例如包含SEQ ID NO：1的第39-281位的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本文所述TRAIL单体包含SEQ ID NO：1的第1-39位中任一位至281位(例如第39-281位)的氨基酸序列并且与SEQ ID NO：1具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高、甚至100％序列相同性的氨基酸序列，优选地，所述TRAIL单体是哺乳动物来源的或者是人来源的。
特别地，在一个实施方案中，所述TRAIL单体包含SEQ ID NO：1的第1-39位中 任一位至281位的氨基酸序列，即可以包含SEQ ID NO：1的第1-281、2-281、3-281、4-281、5-281、6-281、7-281、8-281、9-281、10-281、11-281、12-281、13-281、14-281、15-281、16-281、17-281、18-281、19-281、20-281、21-281、22-281、23-281、24-281、25-281、26-281、27-281、28-281、29-281、30-281、31-281、32-281、33-281、34-281、35-281、36-281、37-281、38-281或39-281位的氨基酸序列。
如本文所述，与DNA折纸结构连接的3个TRAIL单体可以是相同或不同的单体。在一个实施方案中，与DNA折纸结构连接的3个TRAIL单体是相同的单体，即单体的氨基酸序列是相同的，从而可以形成同源三聚体。在一个实施方案中，与DNA折纸结构连接的3个TRAIL单体是不同的单体，但都包含TRAIL的胞外结构域(例如SEQ ID NO：1的第39-281位的氨基酸)，因此也可以形成三聚体。
如本文所述，TRAIL单体可以通过TRAIL肽的C末端或N末端残基与DNA折纸结构直接(即C端的氨基酸残基的基团与DNA折纸结构的位点的基团直接相互作用)或间接(即C端的氨基酸残基通过中间分子与DNA折纸结构的位点的核苷酸残基相互作用)连接。在一些实施方案中，TRAIL单体通过C末端残基与DNA折纸结构连接。在一些实施方案中，TRAIL单体通过N末端残基与DNA折纸结构连接。
已知核酸与蛋白的连接方法按连接形式分为非共价结合以及共价结合。非共价结合方法主要有：亲和素(或链霉亲和素)与生物素的作用，通过在蛋白上修饰生物素(或融合亲和素)与偶联亲和素(修饰生物素)的核酸相互作用，来实现蛋白核酸连接；金属离子与蛋白识别结构域的结合，如镍离子与聚组氨酸的结合，通过在蛋白上融合寡聚组氨酸，核酸上修饰次氮基三乙酸(nta)，在聚组氨酸-镍离子-nta的螯合下，实现蛋白核酸连接；抗原抗体的亲和以及蛋白的核酸适配体也是重要的非共价结合手段。共价结合主要通过化学交联，如利用蛋白表面的氨基与烷硫基修饰的核酸在交联剂(如ssmcc)的作用下形成共价结合；通过在蛋白上修饰mkhkgs短肽以及核酸上修饰z-qg(N-苄氧羰基-L-谷氨酰胺酰甘氨酸，n-carbobenzyloxyglutaminylglycine)，在谷氨酰胺转移酶的作用下产生共价结合。
如本文所用，TRAIL单体与所述DNA折纸结构的位点连接是指将TRAIL单体(例如通过共价键和/或氢键)与DNA折纸结构连接，例如直接连接或通过任何合适分子(例如核酸、肽或二者)作为中间连接分子，例如包括但不限于适配体如核酸适配体。
本领域已知核酸适配体一般由25-80个碱基组成。核酸适配体与靶分子发生特异性识别是基于寡链核酸可以形成各种各样的空间构型。它可以通过体外筛选直接获得，不需要依赖于动物组织等。本文中，所述核酸适配体序列可以是单链，或者是双链。
例如，在一个实施方案中，可以在所述DNA折纸结构的所需位点处连接特异性结合TRAIL单体或与TRAIL单体融合的肽的核酸适配体，从而将TRAIL单体与DNA折纸结构连接。在DNA折纸结构的特定位点处连接核酸适配体可以使用本领域已知的任何合适方法进行，例如可以设计特定的DNA短链序列，其包含所述核酸适配体序列，在形成DNA折纸结构后，该核酸适配体序列不与支架DNA配对形成双链，而是作为单链存在，由此实现在DNA折纸结构的所需位点处连接核酸适配体，任选地，可以加 入该核酸适配体序列的互补序列以形成双链核酸适配体序列。
在一个实施方案中，可以用于本发明的核酸适配体的长度可以为任何合适长度，例如为约10-50、10-40或10-30个核苷酸，例如为约10、15、20、25、30、35、40、45、50个核苷酸。
在一个实施方案中，TRAIL单体可以一个肽融合，然后通过将DNA折纸结构域与该肽特异性连接而实现TRAIL单体与DNA折纸结构的连接。可用于与TRAIL单体融合的肽可以是任何合适的肽，例如那些具有特异性核酸适配体的肽。
本文所述TRAIL单体分子可与所述肽直接融合(即二者中间不存在其它分子序列，形成TRAIL单体-肽或相反顺序的融合蛋白)，或者可以通过间隔分子间接融合(即形成TRAIL单体-间隔子-肽或相反顺序的融合蛋白)。
在一个实施方案中，可以在所述DNA折纸结构的位点处连接一个衔接分子，而TRAIL单体(例如在其C端或N端)与靶向所述衔接分子的互配衔接分子融合，从而通过衔接分子和互配衔接分子的特异性相互作用将TRAIL单体与DNA折纸结构连接。
如本文所用，“衔接分子(adaptor molecule)”和“互配衔接分子(reciprocal adaptor molecule)”(或“标签”和“互配标签”)是指结合对系统中的一对组件，其中该对中的每一个特异性地结合另一个。结合对系统的例子包括但不限于Spycatcher/SpyTag、生物素/抗生物素蛋白、和O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(SNAP-tag)/卤代烷烃脱卤酶(Halo-tag)。结合可以是共价或非共价结合。“衔接分子”是指一对中的一个，“互配衔接分子”是指衔接分子的结合配偶体。因此，在Spycatcher/SpyTag系统中，例如衔接分子可以是SpyCatcher而互配衔接分子是SpyTag，或衔接分子可以是SpyTag而互配衔接分子是SpyCatcher。
在一些实施方案中，衔接分子是SpyCatcher并且互配衔接分子是SpyTag。在一些实施方案中，衔接分子是SpyTag并且互配衔接分子是SpyCatcher。
在一些实施方案中，衔接分子是生物素并且互配衔接分子是抗生物素蛋白。在一些实施方案中，衔接分子是抗生物素蛋白并且互配衔接分子是生物素。
在一些实施方案中，衔接分子是O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(SNAP-tag)并且互配衔接分子是卤代烷烃脱卤酶(Halo-tag)。在一些实施方案中，衔接分子是卤代烷烃脱卤酶(Halo-tag)并且互配衔接分子是O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(SNAP-tag)。
如本文所用，SpyCatcher肽是能够与SpyTag肽或其变体发生反应形成异肽键连接(Spy反应)的任何肽或其变体。本领域已知各种SpyCatcher肽及其变体，例如可参见Zakeri,B.,et al.(2012).Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein,through engineering a bacterial adhesin.Proceedings of the National Academy of Sciences,109(12),E690-E697；Keeble,A.H.et al.(2017).Evolving accelerated amidation by SpyTag/SpyCatcher to analyze membrane dynamics.Angewandte Chemie International Edition,56(52),16521-16525；Keeble,A.H.et al.(2019).Approaching infinite affinity through engineering of peptide–protein interaction.Proceedings of the National Academy of Sciences,116(52),26523-26533。
SpyTag和SpyCatcher的Spy反应的特异性高、SpyTag和SpyCatcher都比较小，而且SpyCatcher可以通过常规的重组表达技术获得(例如以大肠杆菌为表达宿主)。SpyTag/SpyCatcher系统非常适合结合、标记或固定化蛋白质，因为其会产生不可逆的肽连接。SpyTag在广泛条件下与SpyCatcher反应，反应后产物非常稳定(Zachari et al.,2012,PNAS vol.109:12,pp.690-697)。
本文所述TRAIL单体分子可与衔接分子(例如Spycatcher肽)直接融合(即二者中间不存在其它分子序列，形成TRAIL单体-衔接分子或相反顺序的融合蛋白)，或者可以通过间隔分子间接融合(即形成TRAIL单体-间隔子-衔接分子或相反顺序的融合蛋白)。因此，本文提及TRAIL-Spycatcher融合蛋白时，涵盖了由TRAIL单体与Spycatcher肽以任意顺序直接融合(即TRAIL单体-Spycatcher肽，或者Spycatcher肽-TRAIL单体)或间接融合(即TRAIL单体-间隔子-Spycatcher肽，或者Spycatcher肽-间隔子-TRAIL单体)形成的融合蛋白。
本文所述“间隔子”可采用本领域中已知用于连接两个多肽形成融合蛋白的任何合适间隔子，是指具有一定长度的由低疏水性和低电荷效应的氨基酸组成的肽，其用于融合蛋白时可以使所连接的各部分充分展开、互不干扰地充分折叠成各自的天然构象。本领域常用的间隔子包括例如，富含甘氨酸(G)和丝氨酸(S)的柔性的GS型接头；富含脯氨酸(P)和苏氨酸(T)的刚性的PT型接头。由于GS型接头具有较合适的氨基酸长度，同时具有疏水性和延展性并能使功能蛋白具有较好的稳定性和生物活性，因而在本发明中优选使用GS型接头。
在一些实施方案中，间隔子连接TRAIL单体与SPycatcher肽。在一些实施方案中，用于间隔子的典型氨基酸残基是甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸和天冬氨酸等等。在一些实施方案中，间隔子区是约4到30(例如约5-30、5-25或5-20)个氨基酸长，例如约15个氨基酸长。举例的间隔子包括但不限于(GGGGS)
n，其中n＝1、2、3、4、5或6。在一些实施方案中，间隔子区是GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：4)。
本文所述的融合蛋白中，衔接分子可以位于TRAIL单体的C末端或N末端，即衔接分子的N端与TRAIL单体的C端直接或间接连接，或者衔接分子的C端与TRAIL单体的N端直接或间接连接。在一些实施方案中，衔接分子的N端与TRAIL单体的C端连接。
在所述DNA折纸结构的位点处连接一个衔接分子可以使用本领域已知的任何合适方法进行，例如使用连接核酸和蛋白的接头。所述接头是指能够通过共价键将蛋白分子和DNA分子连接在一起的化学部分，包括例如但不限于聚合物、官能团等。本领域已知多种能够实现该目的的接头，例如分别与蛋白的氨基和/或DNA分子的氨基反应形成共价键，从而将蛋白和DNA分子连接在一起。
在一个实施方案中，本文所述接头包括如下类型接头：N3/DBCO；SMCC；SPDP；TCO/四嗪(Tetrazine)和HyNic/4FB。可参见Beck A等，Strategies and challenges for the next generation of antibody-drug conjugates.Nat Rev Drug Discov.2017 May；16(5):315-337。
本文所述“N3/DBCO”是指一对N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯修饰的接头，其中N3接头(如下式所示)是NHS酯修饰的可与蛋白上的NH
2基团反应，DBCO(如下式所示)也是NHS酯修饰的可与DNA上修饰的NH
2反应，而N3可与DBCO进行连接反应，由此将蛋白与DNA分子连接在一起。
[根据细则26改正 11.05.2023]
本文所述“SMCC”为琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(如下式所示)，是SMCC是具有NHS酯和马来酰亚胺基团的异型双功能交联剂，可进行含胺和巯基分子的共价偶联。NHS酯在pH值7～9条件下与伯胺反应形成酰胺键，而马来酰亚胺在pH值6.5～7.5条件下与巯基发生反应，形成稳定的硫醚键。
[根据细则26改正 11.05.2023]
本文所述“SPDP”为：3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(如下式所示)，是指一种通过胺-胺或胺-巯基交联进行蛋白偶联的多功能交联剂(含4-单元聚乙二醇(PEG)基团和一个可还原(可裂解)二硫键)。
[根据细则26改正 11.05.2023]
本文所述“TCO/四嗪”，与“N3/DBCO”类似，是指一对NHS酯修饰的接头，其中NHS酯修饰的TCO接头为反式环辛烯(如下式所示)，可与蛋白的NH
2连接，四嗪也是NHS酯修饰的(如下式所示)，可与NH
2修饰的DNA连接，而TCO可与四嗪进行连接反应，由此将蛋白和DNA分子连接在一起。
[根据细则26改正 11.05.2023]
本文所述“HyNic/4FB”，与“N3/DBCO”类似，是指一对NHS酯修饰的接头，其中HyNic接头是NHS酯修饰的琥珀酰亚胺基-6-肼基烟酰胺(如下式所示)，可与蛋白的NH2连接，4FB也是NHS酯修饰的4-甲酰苯甲酰胺(如下式所示)，可与NH2修饰的DNA连接，而HyNic可与4FB进行连接反应，由此将蛋白和DNA分子连接在一起。
[根据细则26改正 11.05.2023]
本文中，蛋白可以通过接头与DNA的任意合适位点连接，例如在5’或3’端，或者在DNA分子中间位置，优选在DNA的5’或3’端连接。这些连接均在本领域技术人员的知识范围内。
在一个实施方案中，所述DNA-TRAIL复合物包含3个TRAIL单体与Spycatcher肽的融合蛋白和一个DNA折纸结构，其中在所述DNA折纸结构的3个位点具有与之连接的Spytag肽，所述融合蛋白通过Spytag和Spycatcher肽的Spy相互作用与所述DNA折纸结构连接。
在一个实施方案中，所述Spycatcher肽的N端与TRAIL单体的C端直接或间接(例如通过间隔子)连接，形成融合蛋白。
在进一步的实施方案中，所述Spycatcher肽包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，和/或所述TRAIL单体包含SEQ ID NO：1的第39-281位的氨基酸序列并且与SEQ ID NO：1具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高、甚至100％序列相同性的氨基酸序列，优选包含SEQ ID NO：1所示的第39-281位氨基酸序列，更优选包含SEQ ID NO：1所示的第1-39位任一位至281位的氨基酸序列。
在进一步的实施方案中，间隔子包含SEQ ID NO：4所示序列。
在一个实施方案中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
在一个实施方案中，Spytag肽通过本文所述接头与所述DNA折纸结构连接。
在一个实施方案中，叠氮基团修饰的SpyTag肽与含有DBCO的第一单链DNA通过N3/DBCO接头连接，而在所述DNA折纸结构的位点处包含第二单链DNA，其中第 二单链DNA与第一单链DNA至少部分序列、优选全部序列是互补的，从而通过互补序列的碱基配对将Spytag肽与DNA折纸结构连接。
在一个实施方案中，第一单链DNA与第二单链DNA的长度可以为任何合适长度，例如为约10-50、10-40或10-30个核苷酸，例如为约10、15、20、25、30、35、40、45、50个核苷酸。
特别地，3个位点处的第一DNA单链可以相同或不同，优选是相同的。在进一步的实施方案中，所述第一DNA单链包含SEQ ID NO：161所示的核苷酸序列，和/或所述第二单链DNA包含SEQ ID NO：160的第49-64位核苷酸所示的核苷酸序列。
在第二方面，提供了一种制备第一方面的DNA-TRAIL复合物的方法，包括：
(a)提供一个DNA折纸结构，
(b)将3个TRAIL单体分别与所述DNA折纸结构的同一平面上相同侧的3个位点连接，其中任意两个位点相距约15-60nm、优选约25-40nm、最优选约40nm，并且所述3个位点形成等边三角形或近似等边三角形，和
(c)收获形成的DNA-TRAIL复合物。
所述DNA折纸结构的结构特征如前文所述。本领域技术人员可以根据本领域已知的方法制备具有所需特征(例如形状、特定位点或含有特定接头或核苷酸序列)的DNA折纸结构。参见例如Paul W.K.Rothemund，Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns，Nature V440：297-302(16 March 2006)；R.P.Goodman等，Rapid Chiral Assembly of Rigid DNA Building Blocks for Molecular Nanofabrication，Science，V310：1661-1664(9 December 2005)。例如，可以根据支架DNA序列涉及设计相应的短DNA序列，以产生具有所需距离的3个或更多个位点，并且可以在所述位点连接TRAIL单体。
将TRAIL单体与DNA折纸结构的所需位点连接可以通过本领域已知的任何合适方式进行。
或者，可以在形成DNA折纸结构之前，将TRAIL单体与包含所需位点的短链DNA连接，然后将支架DNA和短链DNA混合退火，从而将TRAIL单体与DNA折纸结构的所需位点连接。因此，TRAIL单体与DNA折纸结构的所需位点连接可以在形成DNA折纸结构之前或之后进行。
在一个实施方案中，所述方法可以包括：
(a)将TRAIL单体与分别包含在DNA折纸结构的同一面上的3个位点的短链DNA连接，其中任意两个位点相距约15-60nm、优选约25-40nm、最优选约40nm，并且所述3个位点形成等边三角形或近似等边三角形，
(b)将(a)的连接产物、支架DNA、短链DNA混合退火，形成DNA-TRAIL复合物，其中短链DNA与支架DNA的部分序列互补配对，和
(c)收获形成的在DNA折纸结构同一面上同侧3个位点连接TRAIL单体的DNA-TRAIL复合物。
在一个实施方案中，将TRAIL单体与短链DNA连接可以通过本领域已知的任何合适方式进行。
所述TRAIL单体可以通过C末端或N末端残基与DNA折纸结构连接，即TRAIL单体的N端与DNA折纸结构的位点直接或间接连接，或者C端与DNA折纸结构的位点直接或间接连接。在一些实施方案中，TRAIL单体的C端与DNA折纸结构的位点连接。
在一个实施方案中，将TRAIL单体与DNA折纸结构的所需位点通过衔接分子和互配衔接分子的特异性结合而连接。在一个实施方案中，所述衔接分子和互配衔接分子是Spycatcher/SpyTag。
在一个实施方案中，提供了一种制备第一方面的DNA-TRAIL复合物的方法，包括：
(i)将TRAIL单体与Spycatcher肽形成融合蛋白，优选将Spycatcher肽的N端与TRAIL单体的C端连接形成融合蛋白，更优选通过间隔子将Spycatcher肽的N端与TRAIL单体的C端连接形成融合蛋白，
(ii)将Spytag肽通过接头与第一单链DNA(ssDNA)连接获得Spytag-ssDNA，其中所述接头如上文所述，优选地，所述接头为N3/DBCO接头，
(iii)在DNA折纸结构的所需位点处包含第二单链DNA，其中第一单链DNA与第二单链DNA至少是部分序列互补的，
(iv)将(iii)的DNA折纸结构与(ii)的Spytag-ssDNA混合退火，获得Spytag-DNA折纸结构，任选筛选分离在DNA折纸结构同一面上同侧3个位点连接Spytag的Spytag-DNA折纸结构，和
(v)将(i)的融合蛋白与(iv)的Spytag-DNA折纸结构混合，获得DNA-TRAIL复合物，任选筛选分离在DNA折纸结构同一面上同侧3个位点连接所述融合蛋白的DNA-TRAIL复合物。
在一个实施方案中，所述DNA折纸结构是平面DNA折纸结构，其形状可以是任意二维图形，例如三角形、四边形等规则图形以及其它不规则图形等。在一个实施方案中，所述DNA折纸结构是平面矩形DNA折纸结构，边长例如为约60-90nm，如约60×90nm。
在一个实施方案中，所述TRAIL单体包含SEQ ID NO：1的第39-281位的氨基酸序列并且与SEQ ID NO：1具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高、甚至100％序列相同性的氨基酸序列，优选包含SEQ ID NO：1所示的第39-281位氨基酸序列，更优选包含SEQ ID NO：1所示的第1-39位任一位至281位的氨基酸序列。
在一个实施方案中，与DNA折纸结构连接的3个TRAIL单体是相同的单体，即单体的氨基酸序列是相同的。
在一个实施方案中，所述Spytag包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，和/或Spycatcher肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第一单链DNA与第二单链DNA的长度可以为任何合适长度，例如为约10-50、10-40或10-30个核苷酸，例如为约10、15、20、25、30、35、40、45、 50个核苷酸。
第一DNA单链可以相同或不同，优选是相同的。在一个实施方案中，所述第一DNA单链包含SEQ ID NO：161所示的核苷酸序列；和/或所述第二DNA单链包含SEQ ID NO：160的第49-64位核苷酸所示的核苷酸序列。
在一个特定的实施方案中，提供了一种制备第一方面的DNA-TRAIL复合物的方法，包括：
(i)将Spytag肽通过接头与互补DNA链连接获得Spytag-ssDNA，其中所述接头如上文所述，优选地，所述接头为N3/DBCO接头，
(ii)将支架DNA、短链DNA(Staple链)和3条捕获DNA链混合退火形成DNA折纸结构，其中短链DNA与支架DNA的部分序列互补配对，捕获DNA链包含与支架DNA互补的部分序列以及与互补DNA链至少部分互补的捕获序列，其中3条捕获DNA链在DNA折纸结构上同一面上，与DNA折纸结构连接的3个位点相距约15-60nm、优选约25-40nm、最优选约40nm并且形成等边三角形或近似等边三角形，
(iii)将(ii)获得的DNA折纸结构与(i)获得的Spytag-ssDNA混合，通过捕获DNA链和互补DNA链的碱基配对将Spytag肽与DNA折纸结构连接，Spytag-DNA折纸结构，
(iv)将TRAIL单体与Spycatcher肽形成融合蛋白，优选将Spycatcher肽的N端与TRAIL单体的C端连接形成融合蛋白，更优选通过间隔子将Spycatcher肽的N端与TRAIL单体的C端连接形成融合蛋白，和
(v)将(iv)获得的融合蛋白与(iii)的Spytag-DNA折纸结构混合，获得DNA-TRAIL复合物，任选筛选分离在DNA折纸结构同一面上同侧3个位点连接所述融合蛋白的DNA-TRAIL复合物。
在一个实施方案中，所述支架DNA包含M13p18噬菌体的基因组序列，例如SEQ ID NO：6所示。
在一个实施方案中，所述短链DNA(Staple链)包含SEQ ID NO：7-149所示的序列。
在一个实施方案中，所述3条捕获DNA链包含选自如下(a)-(e)任一、优选(c)的核酸序列：
(a)SEQ ID NO：152、155、158；
(b)SEQ ID NO：151、154、158；
(c)SEQ ID NO：151、153、159；
(d)SEQ ID NO：151、156、160；和
(e)SEQ ID NO：150、157、160。
如本文所述，捕获DNA链与DNA折纸结构连接的位点是指捕获DNA链中与支架DNA互补的序列部分和不与支架DNA互补的序列部分的连接位点，该位点是与支架DNA互补的序列中的残基。例如，如果捕获DNA链序列为N
1N
2N
3N
4N
5N
6N
7N
8N
9N
10，其中N
1N
2N
3N
4N
5与支架DNA互补，而N
6N
7N
8N
9N
10不与支架DNA互补，则捕获DNA 链与DNA折纸结构连接的位点是指残基N
5。
在本文提供的方法中，除非明确表明或者根据上下文可以判断某一步骤需在另一步骤之后进行(例如一个步骤需要在另一步骤完成的基础上进行，例如使用另一步骤产生的产物或结果)，否则步骤顺序可以改变或同时进行，例如所述提供DNA折纸结构和制备TRAIL融合蛋白。
在第三方面，提供了一种试剂盒，其包含：
-在同一面上相同侧的3个位点处连接有互配衔接分子的DNA折纸结构，其中任意两个位点相距约15-60nm、优选约25-40nm、最优选约40nm，并且所述3个位点形成等边三角形或近似等边三角形，以及
-TRAIL单体与衔接分子的融合蛋白。
在一个实施方案中，互配衔接分子通过本文所述接头与所述DNA折纸结构连接。
在一个实施方案中，互配衔接分子通过接头与第一DNA单链连接，所述DNA折纸结构的3个位点具有第二DNA单链，并且第二DNA单链与第一DNA单链具有互补序列，从而互配衔接分子通过第一DNA单链与第二DNA单链的互补序列碱基配对而与DNA折纸结构连接。
在一个实施方案中，第一单链DNA与第二单链DNA的长度可以为任何合适长度，例如为约10-50、10-40或10-30个核苷酸，例如为约10、15、20、25、30、35、40、45、50个核苷酸。
在一个实施方案中，所述DNA折纸结构是平面DNA折纸结构，其形状可以是任意二维图形，例如三角形、四边形等规则图形以及其它不规则图形等。在一个实施方案中，所述DNA折纸结构是平面矩形DNA折纸结构，边长例如为约60-90nm，如约60×90nm。
在一个实施方案中，所述TRAIL单体包含SEQ ID NO：1的第39-281位的氨基酸序列并且与SEQ ID NO：1具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高、甚至100％序列相同性的氨基酸序列，优选包含SEQ ID NO：1所示的第39-281位氨基酸序列或SEQ ID NO：1的氨基酸序列，更优选包含SEQ ID NO：1所示的第1-39位任一位至281位的氨基酸序列。
在一个实施方案中，与DNA折纸结构连接的3个TRAIL单体是相同的单体，即单体的氨基酸序列是相同的。
在一个实施方案中，所述Spytag包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，和/或Spycatcher肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
第一DNA单链可以相同或不同，优选是相同的。在一个实施方案中，所述第一DNA单链包含包含SEQ ID NO：161所示的核苷酸序列；和/或所述第二DNA单链包含SEQ ID NO：160的第49-64位核苷酸所示的核苷酸序列。
在一个实施方案中，提供了一种试剂盒，其包含：
-由包含SEQ ID NO：6的DNA序列、包含SEQ ID NO：7-149的短链DNA和 选自如下的、优选(c)的3条捕获DNA链形成的DNA折纸结构和通过接头(如上文所述)、优选N3/DBCO接头与包含SEQ ID NO：161所示的DNA序列连接的Spytag肽，其中Spytag肽通过碱基互补与DNA折纸结构连接：
(a)SEQ ID NO：152、155、158；
(b)SEQ ID NO：151、154、158；
(c)SEQ ID NO：151、153、159；
(d)SEQ ID NO：151、156、160；和
(e)SEQ ID NO：150、157、160，
-TRAIL单体与Spycatcher肽的融合蛋白，优选包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述试剂盒用于治疗哺乳动物例如人中的肿瘤。
本发明所述试剂盒也可包含容器、标签和/或者说明书。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。所述标签或说明书指示通过混合所述试剂盒中的活性成分以获得本发明所述DNA-TRAIL复合物以用于治疗特定病症，含有关于使用这种产品的适应症、用法、剂量、给药、禁忌症和/或注意事项的信息。在一个实施方案中，所述说明书指出所述DNA-TRAIL复合物或药物组合物用于治疗肿瘤(例如以TRAIL作为靶点的肿瘤)，例如实体瘤。
在第四方面，提供了一种药物组合物，其包含本发明所述的DNA-TRAIL复合物、根据本发明所述的制备DNA-TRAIL复合物的方法获得的DNA-TRAIL复合物或使用第三方面的试剂盒配制的DNA-TRAIL复合物，以及药学上可接受的载体。
“药学上可接受的载体”是指有助于活性物质给予对象且对象吸收的物质，其可以包括在本发明组合物中而不引起患者的显著毒副作用。适用于本发明中的药学上可接受的载体(媒介物)是常规的。Remington：The Science and Practice of Pharmacy,The University of the Sciences in Philadelphia,编者Lippincott,Williams,&Wilkins,Philadelphia,PA,第21版(2005)描述适用于药物递送的组合物和配制物。
药学上可接受的载体的非限制性例子包括水、NaCl、生理盐水、蔗糖、葡萄糖、粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣、甜味剂、香味剂、盐溶液、醇、油、明胶、碳水化合物如乳糖、直链淀粉或淀粉、脂肪酸脂、羟甲基纤维素、聚乙烯比咯烷酮和着色剂等。本领域技术人员理解其它药物载体可以用于本发明。
本文所述的“药物组合物”是指为适应治疗或预防疾病的需要，按照一定的剂型要求所制成的可提供给用药对象使用的药品。所述的药物组合物中可以含有本发明所述的DNA-TRAIL复合物，同时也可以含有其他药用辅料和工具。
本文所述的“辅料”即药用辅料，是指生产药品和调配处方时使用的除活性成分以外，在安全性方面已进行了合理的评估，且包含在药物制剂中的物质，其目的除赋形、充当载体或提高稳定性外，还可以具有增溶、助溶、缓控释等重要功能。
本文的药物或药物组合物可以配制为适合任何合适给予途径例如静脉内、皮下、胃肠外、口服、腹膜内等的剂型，例如片剂、粉剂、溶液等。在一个实施方案中，本发明 所述药物或药物组合物可以配制为适合用于静脉内施用的形式。
在第五方面，提供了本发明所述的DNA-TRAIL复合物、根据本发明所述的制备DNA-TRAIL复合物的方法获得的DNA-TRAIL复合物或使用第三方面的试剂盒配制的DNA-TRAIL复合物在制备用于治疗肿瘤(例如以TRAIL作为靶点的肿瘤)、优选实体瘤的药物中的用途；或者本发明所述的DNA-TRAIL复合物或根据本发明所述的制备DNA-TRAIL复合物的方法获得的DNA-TRAIL复合物用于治疗肿瘤(例如以TRAIL作为靶点的肿瘤)、优选实体瘤。
在第六方面，提供了一种治疗对象肿瘤(例如以TRAIL作为靶点的肿瘤)的方法，包括给对象施用治疗有效量的第一方面的DNA-TRAIL复合物、根据第二方面的方法获得的DNA-TRAIL复合物、使用第三方面的试剂盒配制的DNA-TRAIL复合物或第四方面的药物组合物。
本文所述“患者”或者“对象”是指患有或者易于患有可以通过给予本文提供的DNA-TRAIL复合物或药物组合物治疗的疾病或病症的生物体。非限制性例子包括人、其它哺乳动物例如牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、绵羊、母牛、鹿，及其它非哺乳动物。在一些实施方案中，患者或对象是人。
如本文所用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指至少足以在对象中产生治疗作用的剂量配制品中的药剂、化合物、材料的量。精确量取决于治疗目的，并且可以由本领域技术人员使用已知技术确定(参见例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(vols.1-3,1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,Dosage Calculations(1999)；and Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20th Edition,2003,Gennaro,Ed.,Lippincott,Williams&Wilkins)。
本文提供的DNA-TRAIL复合物、试剂盒、药物组合物、用途和方法适用于治疗以TRAIL作为靶点的所有类型的肿瘤，包括癌症，特别是实体瘤。在一个实施方案中，所述实体瘤选自例如胃癌、肝癌、胆道癌、胆囊癌、结肠癌、肺癌、膀胱癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌肾细胞癌、食道癌和前列腺癌。在一个实施方案中，所述肿瘤选自乳腺癌、结肠癌、肝癌、胃癌、肾细胞癌、胰腺癌、卵巢癌或食道癌。
本发明提供了一种基于DNA折纸的三聚TRAIL单体。结合点击化学反应和肽胶技术的“雕刻印刷”策略，三种TRAIL单体在平面矩形DNA折纸的表面上形成图案，并且间隔距离被控制在15至60纳米之间。与其他DNA-TRAIL3三聚体相比，在受体亲和力、激动活性和对肿瘤细胞的细胞毒性方面，都产生了优异的效果，特别是具有40nm间隔的DNA-TRAIL3三聚体表现出最好的行为，并且在动物实验中表现出优异的抗肿瘤活性和安全性。最后，提出了一个假设的“活性单元”模型来解释DNA-TRAIL3三聚体诱导的DR聚集。本研究为构建TRAIL三聚体以增强其激动活性提供了一种新的途径，这可能会促进基于TRAIL的治疗的临床应用。
除非上下文另有指示，词语“或”旨在包括“和”。
如本文所用，“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况发生或不发生，该描述 包括其中所述事件或情况发生及不发生的情况。例如，任选包括的步骤是指该步骤存在或不存在。
如本文所用，术语“约”是指包括具体数值的数值范围，本领域技术人员可以合理认为其类似于具体数值。在某些实施方案中，术语“约”是指在使用本领域通常接受的测量的标准误差内。例如，在某些实施方案中，约是指到具体数值的+/-10％或5％。
如本文所用，当说明书中针对一个特征列出具体数值或比例时，也涵盖了任意其两个数值或比例组成的范围。例如列出数值1、2、3、4时，也涵盖了1-2、1-3、1-4、2-3、2-4和3-4。
以下通过实例对本发明的具体实施方式作进一步的说明，但本发明的实施方式不限于此。以下实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1：制备DNA-TRAIL3三聚体
(1)制备TRAIL-SpyCatcher蛋白
TRAIL的胞外结构域(SEQ ID NO：1的39-281位氨基酸)与SpyCatcher肽(SEQ ID NO：2)通过间隔子(SEQ ID NO：4)融合形成TRAIL-SpyCatcher融合蛋白(SEQ ID NO：5)。将编码TRAIL-SpyCatcher融合蛋白的DNA片段插入具有N末端6×His标签的表达质粒pET32a(武汉金开瑞生物工程有限公司)中，并通过在大肠杆菌BL21(DE3)中添加0.5mM iptgispropyl-β-d-硫代半乳糖苷诱导蛋白表达。首先使用Ni-NTA柱(GE Healthcare)纯化TRAIL-SpyCatcher蛋白，然后用HRV 3C蛋白酶处理洗脱的靶蛋白以去除His标签。将混合物进行第二轮Ni-NTA柱以去除His标签部分，在无咪唑缓冲液中洗脱未标记的蛋白质，然后进行Hitrap Q HP(GE healthcare)离子交换色谱以进一步纯化。对纯化的蛋白质的浓度和紫外线降解率进行质量控制。然后将其储存在-80℃，直到进一步使用。
(2)制备DNA-TRAIL3三聚体
矩形DNA折纸是用Rothemund的方法组装的。简言之，M13p18噬菌体的基因组DNA(SEQ ID NO：6)、多条短链(Staple)(SEQ ID NO：7-149)和捕获链(SEQ ID NO：150-160)以1:5:5的摩尔比混合。通过在TAE-Mg
2+缓冲液(Tris，40mM；乙酸，20mM；EDTA，2mM；醋酸镁，12.5mM；pH 8.0)中将DNA混合物从95℃退火至25℃，组装DNA折纸。使用过滤装置(100KDa MWCO，Amicon，Millipore，德国)纯化组装的DNA折纸，以去除多余的短链/捕获链。
在N末端具有叠氮基团修饰的SpyTag肽(SEQ ID NO：3)通过点击化学反应偶联到含有DBCO的互补链(SEQ ID NO：161)上。将叠氮基团修饰的SpyTag肽和含有DBCO的互补链分别溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)中。然后，将50μl SpyTag溶液(100μM)与50μl互补链溶液(100μM)混合。将混合溶液在室温下轻轻搅拌过夜，并使用3KDa离心过滤器纯化产物。将获得的SpyTag互补链缀合物储存在-20℃以供进一步使用。
将SpyTag互补链缀合物与矩形DNA折纸(具有相应的捕获链)在TAE-Mg2+缓冲液中以5:1的摩尔比混合。将混合物从45℃退火至25℃，持续六个循环。SpyTag雕刻的DNA折纸通过100KDa离心过滤器纯化，以去除多余的材料。然后，将SpyTag雕刻的DNA折纸和TRAIL-SpyCatcher蛋白以1:5的摩尔比在TAE-Mg2+缓冲液中混合2小时，并将TRAIL-SpyCatcher蛋白印刷在DNA折纸上。
M13mp18噬菌体的单链基因组DNA购自新英格兰生物实验室(cat.no.4040S，中国北京)。短链和捕获链由Rui Biotech(中国北京)合成。叠氮化物修饰的SpyTag肽和含有DBCO的互补链购自强耀生物科技(中国上海)。所有试剂在使用前均保持在-20℃。
(3)AFM表征
对于使用AFM的DNA折纸表征，将10μl样品(5nM)沉积在新切割的云母上，并让其吸附在表面5分钟。DNA折纸的AFM成像在ScanAsyst模式下进行(Mutimode-8，Bruker，德国)。使用Bruker NanoScope Analysis 1.9软件收集和处理图像。AFM观察到每个样品的至少三个独立的制备，并从云母表面的不同区域(通常为3μm×3μm)采集了若干图像。DNA-TRAIL3三聚体的产率计算为DNA折纸的百分比，该DNA折纸在预期位置承载不同数量的TRAIL单体。
(4)SPR分析
通过分析pH 7.4的10mM PBS中不同浓度的TRAIL制剂的溶液，检查优化SPR传感器的灵敏度。将DR4的表面暴露于pH 7.4的10mM PBS，直到建立稳定的SPR角度，然后将不同的TRAIL配制剂注入SPR反应杯测量通道。DR4/TRAIL免疫复合物的形成导致SPR角的增加。在结合阶段结束时注射PBS缓冲液，导致产生的免疫复合物部分解离。最后，用10mM甘氨酸/HCl(pH 2.0)和10mM PBS(pH 7.4)的再生溶液处理DR4/TRAIL，以恢复基线。Biacore T200仪器(美国GE Healthcare)用于25℃的SPR程序。使用Biacore T200评估软件3.2.0.5(GE Healthcare，USA)确定KD值。
结果
不同配体间距DNA-TRAIL3三聚体的设计与表征
我们使用Cadnano软件帮助设计矩形DNA折纸作为TRAIL三聚体的展示支架[Douglas SM,et al.Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno.Nucleic Acids Res.2009；37(15):5001-5006]。通过将M13mp18噬菌体的基因组DNA作为模板链与多条短链和捕获链一起缓慢退火，组装矩形DNA折纸(图1A)。然后，使用结合点击化学反应和肽胶技术的“雕刻印刷”策略，将三种TRAIL单体装饰到DNA折纸上(图1A)。
简言之，点击化学反应负责具有叠氮基团修饰的标记SpyTag肽与含有二苯并环辛(DBCO)的互补链间的连接。互补链与捕获链互补，然后通过互补链与预先设计的捕获链之间的DNA互补杂交，在DNA折纸上实现SpyTag肽的位置特异性雕刻。肽胶技术负责TRAIL单体和雕刻的SpyTag肽之间的连接。将SpyCatcher融合到TRAIL(TRAIL-SpyCatcher)单体的胞外结构域的C末端，并将三个TRAIL-SpyCatcher单体 印刷在DNA折纸上，该折纸上预刻有SpyTag肽以形成DNA-TRAIL3三聚体(图1A)。基于肽胶技术的位点特异性结合确保了DNA折纸上所有TRAIL单体的均匀向外定向。
通过改变捕获链的位置，将TRAIL单体在DNA折纸上的位置设置在不同的配体间距离，包括约15nm(DNA-TRAIL3-15)、25nm(DNA-TRAIL3-25)、40nm(DNA_TRAIL3-40)、55nm(DNA.TRAIL3-55)和60nm(DNA/TRAIL3-60)(图1B)。如图1C所示，使用原子力显微镜(AFM)观察这些DNA-TRAIL3三聚体，在DNA折纸上预先设计的位置有明显的3个亮点。这些斑点的高度比DNA折纸上裸露位置的高度高约1.5nm，接近42KDa蛋白TRAIL-SpyCatcher的直径(图1D)。表明蛋白质修饰成功。由于点击化学反应和肽胶技术的温和条件和快速反应特性，这些DNA-TRAIL3三聚体的组装效率达到85％以上(图1E)，在DNA-TRAIL3-15、DNA-TRAIL2-25、DNA-TRAIL3-40、DNA-TRAIL3-55和DNA-TRAIL3-60中分别为86.03％、91.61％、94.81％、86.81％和93.49％，并且该过程被限制为2小时。将实施例1制备的DNA-TRAIL3三聚体用于以下实施例。
实施例2：体外实验
(1)细胞存活测定
以下细胞系购自有限公司(中国广州)：COLO205、Hela和NCI-H460。细胞仅在认证后使用，支原体污染检测为阴性。所有细胞系均在Dulbecco改良Eagle培养基(cat.no.#06-1055-57-1A,Biological Industries,Israel)或RPMI1640培养基(cat.no.#01-100-1A,Biological Industries,Israel)中培养，培养基中含有10％热灭活胎牛血清(cat.no.10270-106,FBS,Gibco,USA)。加上100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素，在37℃的湿润5％CO
2中。在96孔板中培养实验细胞(1×10
4/100μl)，然后用10nM TRAIL浓度的不同TRAIL制剂处理24小时。根据制造商的说明，通过CCK-8测定法(目录号CK04-500，Dojindo Laboratories，Japanese)评估细胞活力。对于DR4/DR5阻断，在TRAIL处理前1小时将10μg/ml可溶性DR4中和抗体(目录号AF347，R&D Systems，USA)和/或10μg/ml可溶DR5中和抗体(目录编号NBP2-80066，Novus Biologicals，USA)添加到细胞中。
(2)凋亡测定
在6孔板中培养1×10
6个细胞，并用10nM TRAIL浓度的不同TRAIL制剂处理6小时。然后，根据制造商的说明，收获细胞并用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒(目录号556547，BD biosciences，Germany)染色，然后通过流式细胞术分析。计算总细胞中早期凋亡细胞(Annexin V+/PI-)的百分比。
(3)Western印迹
收集细胞并用冷PBS洗涤三次，然后在冰上加入适当的RIPA裂解缓冲液(目录号#R0010，Solarbio，中国)、蛋白酶抑制剂和PMSF(目录号ST507，Beyotime，中国)30分钟。然后，通过在4℃下以12000rpm离心10分钟收集上清液。将每个样品的15μg总蛋白装入每个孔中，通过SDS-PAGE分离，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。在室温下 用5％牛血清白蛋白封闭膜1小时，然后在4℃下与一抗孵育过夜。将膜洗涤4次，并在室温下与二抗孵育1小时。使用Omni ECLTM(目录号SQ101L，Epizyme，USA)检测信号，并通过图像实验室软件获得图像。使用以下抗体：来自Abmart(中国上海)的Caspase-8抗体(目录号T55750S)和Caspase-3抗体(目录编号TD6879S)。
结果
DNA-TRAIL3三聚体体外诱导的细胞毒性和细胞凋亡
24小时处理后，在COLO205(人类结肠癌)、Hela(人类宫颈癌)和NCI-H460(人类肝细胞癌)细胞中评估了裸DNA折纸、天然TRAIL单体、用一种TRAIL单体(DNA-TRAIL)修饰的DNA折纸和这些DNA-TRAIL3三聚体的细胞毒性(图2A)。裸DNA折纸没有显示出明显的细胞毒性，DNA-TRAIL单体显示出与天然TRAIL单体相当的细胞毒性(图2B-D)。与天然TRAIL单体相比，DNA-TRAIL3-25和DNA-TRAIL3-40在这些癌细胞中表现出更大的细胞毒性，其中DNA-TRAIL3-40是最佳候选(图2B-D)。
TRAIL主要通过细胞凋亡诱导细胞毒性[Ashkenazi A.Targeting death and decoy receptors of the tumour-necrosis factor superfamily.Nat Rev Cancer.2002；2(6):420-430]，因此在用上述药物处理的这些癌细胞中检测到细胞凋亡(图3A)。用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒对细胞进行染色，通过流式细胞术将Annexin V+PI-细胞定义为早期凋亡细胞。与用天然TRAIL单体或DNA-TRAIL单体处理相比，用这些DNA-TRAIL3三聚体处理6小时在三个细胞系中诱导了更多的早期凋亡细胞(图3B)。更重要的是，这些三聚体表现不同，DNA-TRAIL3-40诱导的细胞凋亡最多(图3B)。
然而，这些DNA-TRAIL3三聚体仍然没有在作为正常人肝细胞的WRL68细胞中诱导明显的细胞凋亡，这表明它们在杀死癌细胞方面具有特异性(图3C)。结果表明，使用DNA折纸进行三聚是提高TRAIL单体对肿瘤细胞杀伤能力的一种很有前途的方法，而配体间距离是图案设计中的一个重要参数。
DNA-TRAIL3三聚体的受体结合亲和力
DR4是TRAIL的功能性受体之一，在激活时启动外源性凋亡信号通路[Greenlee JD,et al.Oxaliplatin resistance in colorectal cancer enhances TRAIL sensitivity via death receptor4upregulation and lipid raft localization.Elife.2021；10:e67750]；因此，我们使用表面等离子体共振(SPR)检查了DNA-TRAIL3三聚体与可溶性DR4蛋白的结合动力学谱(见表1)。观察到天然TRAIL单体在纳米摩尔水平上显示出与DR4的结合亲和力(KD＝8.84×10
-7M)。DNA-TRAIL单体表现出与天然TRAIL单体相似的受体结合亲和力(KD＝4.25×10
-7M)，表明DNA折纸上的装饰不影响受体结合。正如预期的那样，DNA-TRAIL3三聚体的受体结合亲和力比DNA-TRAIL单体高2-3个数量级，其中DNA-TRAIL3-40具有最高的亲和力(KD＝2.03×10
-10M)。这些结果表明，TRAIL三聚体在DNA折纸上的多价组装可以增强对受体的亲和力，而配体间距离可以显著影响这种结合亲和力，这可能是这些DNA-TRAIL3三聚体不同细胞毒性的潜在原因。有趣的是，DNA-TRAIL3-40(Kon＝1.33×10
9Ms-1)与DR4结合的速度是天然TRAIL单体 (Kon＝6.18×10
3Ms-1)的21500倍，而DNA-TRAIL3-40与DR4解离的速度(Koff＝2.71×10
-1s
-1)也比天然TRAIL单体(Koff＝5.47×10
-3s
-1)快50倍(表1)，表明DNA-TRAIL3-40与DR4之间的亲和力是“快速结合-快速解离”模式。
表1：DNA-TRAIL3三聚体与DR4的亲和力和速率常数
DNA-TRAIL3三聚体体外诱导的信号传导活化
如前所述，DR聚集对于下游信号的有效激活至关重要。TRAIL或激动性抗体与死亡受体的结合启动半胱天冬酶介导的凋亡信号级联，导致细胞死亡。在这一过程中，Pro-casase-8(Pro-cas-8)和Pro-casase-3(Pro-cas-3)分别被裂解为活性caspase-8(P43/41-cas-8和P18-cas-8和P19-cas-3)和活性caspase-3(P19-cas3和P17-cas-3)，这可以通过蛋白质印迹检测。如图4B-C所示，不同的TRAIL制剂均诱导活性caspase-8或活性caspase-3的表达升高，但DNA-TRAIL3三聚体的作用明显强于天然TRAIL或DNA-TRAIL单体。接下来，使用可溶性DR4中和抗体(抗DR4)和DR5中和抗体(抗-DR5)来确定DR4和DR5在DNA-TRAIL3三聚体的细胞毒性中的作用。如图4D所示，COLO205、Hela和NCI-H460细胞中天然TRAIL单体的细胞毒性被抗-DR4或抗-DR5部分抑制，并被两种拮抗剂组合完全阻断。DNA-TRAIL3-40组中也存在类似的细胞毒性阻断现象(图4D)。
这些结果表明，尽管使用DNA折纸的三聚化增强了TRAIL单体的细胞毒性，但它不会改变导致细胞毒性的受体途径，DR4和DR5都发挥了关键作用。
实施例3：动物实验
所有动物实验均按照动物实验伦理委员会、国家纳米科学技术中心机构动物护理和使用委员会批准的动物使用方案进行。为了评估抗肿瘤效果，从Vital River Laboratories(中国北京)获得雌性BALB/c nu/nu小鼠(7周龄)。
将对数期的人结肠癌细胞(COLO205；5×10
6)皮下植入每只小鼠的侧面。每隔一天监测一次肿瘤生长，并通过以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝长度×宽度
2×0.5。当肿瘤生长至平均大小约为100mm
3时，将小鼠随机分为6组(每组6只)，每天以30mg/kg TRAIL的剂量静脉注射不同的TRAIL制剂，持续8天。
为了进行药代动力学评估，雌性BALB/c nu/nu小鼠(7周龄，每组3只)接受30mg/kg TRAIL的不同TRAIL制剂的静脉注射。在5、10、30、60、120、240和360分钟的时间间隔内，从尾部取血样并在冰上孵育。在4℃下以3000×g离心20分钟，收集血清样本。根据制造商的说明，通过ELISA(目录号AB-J0958A，Abmart，Shanghai，China)测定血清样品中的TRAIL蛋白浓度。对于数据计算，分析血清浓度的相对值，将第一个值(5分钟)设置为100％。对于生物分布测定，皮下COLO205荷瘤雌性BALB/c nu/nu小鼠(7周龄，每组n＝3只)接受30mg/kg TRAIL的不同TRAIL制剂的静脉注射。在12和24小时的时间间隔内，从动物中取出肾脏、肝脏、肿瘤和脾脏组织，然后立即在液氮中冷冻。解剖所有组织并称重，将其置于PBS中，并在冰上加入15mM蛋白酶抑制剂PMSF(10μl中的1mg)。将样品均化并以14000rpm离心15分钟，并抽吸上清液用于TRAIL蛋白浓度的ELISA分析。
为了进行安全性评估，雌性BALB/c nu/nu小鼠(7周龄，每组3只)接受静脉注射不同的TRAIL制剂(30mg/kg TRAIL)。24小时后，分别采集血液样本进行血清生化测试。
结果
DNA-TRAIL3三聚体体内抗肿瘤作用、药动学和生物安全性
为了评估DNA-TRAIL3三聚体在体内的抗肿瘤作用，通过皮下接种肿瘤细胞建立了携带COLO205异种移植的裸鼠。当肿瘤生长到约100mm
3的平均大小时，将小鼠随机分为6组，每天接受8天的治疗，包括盐水作为对照、裸DNA折纸、天然TRAIL单体、DNA-TRAIL3-25和DNA-TRAIL3-40三聚体。裸DNA折纸处理没有抑制肿瘤生长，天然TRAIL或DNA-TRAIL单体处理显著降低了肿瘤生长率(图5A)。
然而，与体外细胞毒性实验结果一致，DNA-TRAIL3-25和DNA-TRAIL3-40三聚体显示出比天然TRAIL或DNA-TRAIL单体更优越的抗肿瘤效率(图5A)。在实验终点，DNA-TRAIL3-40三聚体组的肿瘤重量最低(图5B-C)。为了分析体内药代动力学特征，在裸小鼠中单次静脉注射天然TRAIL单体、DNA-TRAIL单体或DNA-TRAIL3-40三聚体后的5、10、30、60、120、240和360分钟收集血清样品。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清样品中的TRAIL蛋白浓度，并将注射后5分钟的浓度设定为基线。如图5D所示，DNA-TRAIL单体(24.08分钟)或DNA-TRAIL3-40三聚体(29.66分钟)的循环半衰期长于天然TRAIL单体(9.27分钟)。因此，DNA折纸上的装饰延长了TRAIL在血流中的保留时间，这可能会积极影响治疗活性。
还分析了静脉注射后天然TRAIL单体、DNA-TRAIL单体和DNA-TRAIL3-40三聚体在荷瘤小鼠体内的生物分布。结果表明，与天然TRAIL单体和DNA-TRAIL单体相比，更多的DNA-TRAIL3-40三聚体在肿瘤组织中积累(图5E)，这可能是由于 DNA-TRAIL3-40三聚体的循环半衰期长和与肿瘤细胞上DR4/DR5的高结合亲和力所致。此外，TRAIL制剂似乎集中在肝脏和肾脏，这是合理预期的，因为它们被报道为TRAIL清除的主要器官[Kelley SK,et al.Preclinical studies to predict the disposition of Apo2L/tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in humans:characterization of in vivo efficacy,pharmacokinetics,and safety.J Pharmacol Exp Ther.2001；299(1):31-38]。然而，肝脏和肾脏中累积的TRAIL制剂并未导致功能性器官损伤(图6)。
统计学分析
数据表示为平均值±标准差(SD)。使用单因素方差分析(ANOVA)和Tukey事后检验对多个组进行比较。P<0.05被认为具有统计学意义。
Claims (17)
- 一种DNA-TRAIL复合物，其包含一个DNA折纸结构和形成TRAIL三聚体的3个TRAIL单体，其中所述3个TRAIL单体分别与所述DNA折纸结构的同一面上相同侧的3个位点连接并且任意两个位点相距约15-60nm、优选约25-40nm、最优选约40nm，并且所述3个位点形成等边三角形或近似等边三角形，其中TRAIL单体的C端或N端与所述DNA折纸结构直接或间接连接，优选地，所述TRAIL单体是相同的。
- 权利要求1的DNA-TRAIL复合物，其包含：3个TRAIL单体和衔接分子的融合蛋白和一个DNA折纸结构，其中在所述DNA折纸结构的3个位点具有与之连接的互配衔接分子，所述融合蛋白通过衔接分子和互配衔接分子的相互作用与所述DNA折纸结构连接，优选地，所述衔接分子/互配衔接分子选自：Spycatcher肽/SpyTag肽、生物素/抗生物素蛋白和O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(SNAP-tag)/卤代烷烃脱卤酶(Halo-tag)。
- 权利要求2的DNA-TRAIL复合物，其中：互配衔接分子通过接头与第一DNA单链连接，所述DNA折纸结构的3个位点具有第二DNA单链，并且第二DNA单链与第一DNA单链具有互补序列，从而互配衔接分子通过第一DNA单链与第二DNA单链的互补序列碱基配对而与DNA折纸结构连接，其中3个位点上的第二DNA单链可以相同或不同，优选是相同的，并且优选地，所述接头选自：N3/DBCO；SMCC；SPDP；TCO/四嗪(Tetrazine)和HyNic/4FB。
- 权利要求1-3任一项的DNA-TRAIL复合物，其中：(1)所述DNA折纸结构是平面DNA折纸结构；和/或(2)所述TRAIL单体包含SEQ ID NO：1所示的第39-281位氨基酸序列，优选包含SEQ ID NO：1的第1-39位任一位至281位的氨基酸序列并且与SEQ ID NO：1具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高、甚至100％序列相同性的氨基酸序列，更优选包含SEQ ID NO：1所示的第1-39位任一位至281位的氨基酸序列；和/或(3)衔接分子是Spycatcher肽，并且所述互配衔接分子是Spytag肽，优选地，所述Spytag包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，和/或Spycatcher肽包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；和/或(4)所述融合蛋白包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。
- 权利要求1-4任一项的DNA-TRAIL复合物，其中：DNA折纸结构由包含SEQ ID NO：6的DNA序列、包含SEQ ID NO：7-149的短链DNA和选自如下(a)-(e)任一、优选(c)的3条DNA链形成，Spytag肽通过接头、优选N3/DBCO接头与包含SEQ ID NO：161所示的DNA序列连接，由此Spytag肽通过碱基互补与DNA折纸结构连接，TRAIL单体与Spycatcher肽形成融合蛋白，优选包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列，由此TRAIL单体通过Spytag与Spycatcher相互作用与DNA折纸结构连接：(a)SEQ ID NO：152、155、158；(b)SEQ ID NO：151、154、158；(c)SEQ ID NO：151、153、159；(d)SEQ ID NO：151、156、160；和(e)SEQ ID NO：150、157、160。
- 一种制备权利要求1-5任一项的DNA-TRAIL复合物的方法，包括：(a)提供一个DNA折纸结构，其中所述DNA折纸结构具有至少一个面，在其上相同侧具有3个位点，其中任意两个位点相距约15-60nm、优选约25-40nm、最优选约40nm，并且所述3个位点形成等边三角形或近似等边三角形，(b)将3个TRAIL单体分别与所述DNA折纸结构的同一面上相同侧的所述3个位点连接，其中TRAIL单体的C端或N端与所述DNA折纸结构直接或间接连接，优选地，所述TRAIL单体是相同的，和(c)收获形成的在DNA折纸结构同一面上同侧3个位点连接的DNA-TRAIL复合物。
- 一种制备权利要求1-5任一项的DNA-TRAIL复合物的方法，包括：(a)将3个TRAIL单体与3种短链DNA分别连接，其中在支架DNA和短链DNA形成的DNA折纸结构中，该3种短链DNA分别包含在DNA折纸结构的同一面上的3个位点，其中任意两个位点在形成的DNA折纸结构中相距约15-60nm、优选约25-40nm、最优选约40nm，并且所述3个位点形成等边三角形或近似等边三角形，其中TRAIL单体的C端或N端与所述短链DNA直接或间接连接，优选地，所述TRAIL单体是相同的，(b)将(a)的连接产物、支架DNA和短链DNA混合退火，形成包含DNA折纸结构的DNA-TRAIL复合物，其中短链DNA与支架DNA的部分序列互补配对，和(c)获得形成的在DNA折纸结构同一面上同侧3个位点连接的DNA-TRAIL复合物。
- 权利要求6或7的方法，包括将TRAIL单体与衔接分子形成融合蛋白，并且在所述DNA折纸结构的3个位点包含与之连接的互配衔接分子，所述融合蛋白通过衔接分子和互配衔接分子的相互作用与所述DNA折纸结构连接，其中TRAIL单体的C端或N端与所述衔接分子直接连接或通过间隔子连接形成所述融合蛋白，优选地，所述衔接分子/互配衔接分子选自：Spycatcher肽/SpyTag肽、生物素/抗生物素蛋白和O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(SNAP-tag)/卤代烷烃脱卤酶(Halo-tag)。
- 权利要求8的方法，包括：将互配衔接分子通过接头与第一DNA单链连接，在所述DNA折纸结构的3个位点分别包含第二DNA单链，并且第二DNA单链与第一DNA单链具有互补序列，从而互配衔接分子通过第一DNA单链与第二DNA单链的互补序列碱基配对而与DNA折纸结构连接，其中3个位点上的第二DNA单链可以相同或不 同，优选是相同的，并且优选地，所述接头选自：N3/DBCO；SMCC；SPDP；TCO/四嗪(Tetrazine)和HyNic/4FB。
- 权利要求6-9任一项的方法，其包括：(i)将Spytag肽通过接头与互补DNA链连接获得Spytag-ssDNA，优选地，所述接头为N3/DBCO接头，(ii)将支架DNA、短链DNA和3条捕获DNA链混合退火形成DNA折纸结构，其中短链DNA与支架DNA的部分序列互补配对，捕获DNA链包含与支架DNA互补的部分序列以及与互补DNA链至少部分互补的捕获序列，其中3条捕获DNA链与DNA折纸结构连接的3个位点在DNA折纸结构的同一面上，相距约15-60nm、优选约25-40nm、最优选约40nm并且形成等边三角形或近似等边三角形，(iii)将(ii)获得的DNA折纸结构与(i)获得的Spytag-ssDNA混合退火，通过捕获DNA链和互补DNA链的碱基配对将Spytag肽与DNA折纸结构连接，获得Spytag-DNA折纸结构，(iv)将TRAIL单体与Spycatcher肽形成融合蛋白，优选将Spycatcher肽的N端与TRAIL单体的C端连接形成融合蛋白，更优选通过间隔子将Spycatcher肽的N端与TRAIL单体的C端连接形成融合蛋白，和(v)将(iv)获得的融合蛋白与(iii)的Spytag-DNA折纸结构混合，获得DNA-TRAIL复合物，任选筛选分离在DNA折纸结构同一面上同侧3个位点连接所述融合蛋白的DNA-TRAIL复合物，优选地，所述DNA折纸结构由包含SEQ ID NO：6的支架DNA序列、包含SEQ ID NO：7-149的短链DNA和选自如下(a)-(e)任一、优选(c)的3条捕获DNA链形成，所述Spytag-ssDNA是与包含SEQ ID NO：161所示的DNA序列连接的Spytag肽，(a)SEQ ID NO：152、155、158；(b)SEQ ID NO：151、154、158；(c)SEQ ID NO：151、153、159；(d)SEQ ID NO：151、156、160；和(e)SEQ ID NO：150、157、160。
- 权利要求6-10任一项的方法，其中(1)所述DNA折纸结构是平面DNA折纸结构；和/或(2)所述TRAIL单体包含SEQ ID NO：1所示的第39-281位氨基酸序列，优选包含SEQ ID NO：1的第1-39位任一位至281位的氨基酸序列并且与SEQ ID NO：1具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高、甚至100％序列相同性的氨基酸序列，更优选包含SEQ ID NO：1所示的第1-39位任一位至281位的氨基酸序列；和/或(3)衔接分子是Spycatcher肽，并且所述互配衔接分子是Spytag肽，优选地，所述Spytag包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，和/或Spycatcher肽包含SEQ ID NO：2所示的 氨基酸序列；和/或(4)所述融合蛋白包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。
- 一种试剂盒，其包含：-在同一面相同侧的至少3个位点处连接有互配衔接分子的DNA折纸结构，其中任意两个位点相距约15-60nm、优选约25-40nm、最优选约40nm，并且所述3个位点形成等边三角形或近似等边三角形，和-TRAIL单体-衔接分子融合蛋白，其中TRAIL单体的C端或N端与所述衔接分子直接或间接连接，优选地，所述TRAIL单体是相同的，优选地，所述互配衔接分子通过接头与第一DNA单链连接，DNA折纸结构的3个位点具有第二DNA单链，并且第二DNA单链与第一DNA单链具有互补序列，从而互配衔接分子通过第一DNA单链与第二DNA单链的互补序列碱基配对而与DNA折纸结构连接，优选地，衔接分子是Spycatcher肽，并且所述互配衔接分子是Spytag肽。
- 权利要求12的试剂盒，其包含：-由包含SEQ ID NO：6的DNA序列、包含SEQ ID NO：7-149的短链DNA和包含选自如下(a)-(e)任一、优选(c)的3条DNA链形成的DNA折纸结构和通过接头、优选N3/DBCO接头与包含SEQ ID NO：161所示的DNA序列连接的Spytag肽，其中Spytag肽通过碱基互补与DNA折纸结构连接：(a)SEQ ID NO：152、155、158；(b)SEQ ID NO：151、154、158；(c)SEQ ID NO：151、153、159；(d)SEQ ID NO：151、156、160；和(e)SEQ ID NO：150、157、160，以及-TRAIL单体与Spycatcher肽的融合蛋白。
- 权利要求12或13的试剂盒，其中(1)所述DNA折纸结构是平面DNA折纸结构；和/或(2)所述TRAIL单体包含SEQ ID NO：1所示的第39-281位氨基酸序列，优选包含SEQ ID NO：1的第1-39位任一位至281位的氨基酸序列并且与SEQ ID NO：1具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高、甚至100％序列相同性的氨基酸序列，更优选包含SEQ ID NO：1所示的第1-39位任一位至281位的氨基酸序列；和/或(3)所述Spytag包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，和/或Spycatcher肽包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；和/或(4)所述融合蛋白包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。
- 一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其包含：-权利要求1-5任一项的DNA-TRAIL复合物、根据权利要求6-11任一项的方法获得的DNA-TRAIL复合物或使用权利要求12-14任一项的试剂盒制备的DNA-TRAIL复合物，以及-任选存在的药学可接受的载体，其中所述肿瘤为以TRAIL作为靶点的肿瘤，优选地，所述肿瘤是实体瘤，优选选自胃癌、肝细胞癌、胆道癌、胆囊癌、结肠癌、肺癌、膀胱癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌肾细胞癌、食道癌和前列腺癌、胰腺癌和食道癌。
- 权利要求1-5任一项的DNA-TRAIL复合物、根据权利要求6-11任一项的方法获得的DNA-TRAIL复合物或使用权利要求12-14任一项的试剂盒制备的DNA-TRAIL复合物在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途，其中所述肿瘤为以TRAIL作为靶点的肿瘤，优选地，所述肿瘤是实体瘤，优选选自胃癌、肝细胞癌、胆道癌、胆囊癌、结肠癌、肺癌、膀胱癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌肾细胞癌、食道癌和前列腺癌、胰腺癌和食道癌。
- 一种治疗对象肿瘤的方法，包括给对象施用治疗有效量的权利要求1-5任一项的DNA-TRAIL复合物、根据权利要求6-11任一项的方法获得的DNA-TRAIL复合物、使用权利要求12-14任一项的试剂盒制备的DNA-TRAIL复合物或权利要求15的药物组合物，其中所述肿瘤为以TRAIL作为靶点的肿瘤，优选地，所述肿瘤是实体瘤，优选选自胃癌、肝细胞癌、胆道癌、胆囊癌、结肠癌、肺癌、膀胱癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌肾细胞癌、食道癌和前列腺癌、胰腺癌和食道癌。
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2024145858A1 true WO2024145858A1 (zh) | 2024-07-11 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3004152B1 (en) | Designed ankyrin repeat proteins binding to hepatocyte growth factor | |
| US11578427B2 (en) | Designed ankyrin repeat domains with altered surface residues | |
| EP3091028A1 (en) | Fibronectin based scaffold proteins having improved stability | |
| JP2007530021A (ja) | Ｔｎｆリガンドファミリーメンバーの組換えポリペプチドおよびその使用 | |
| CA2458682A1 (en) | Nanoparticles comprising biologically active tnf which is immobilised on the same | |
| JP6876618B2 (ja) | 治療目的のための抗体−ウレアーゼコンジュゲート | |
| CA2579523A1 (en) | Atad3a-binding molecules for treatment, detection and prevention of cancer | |
| KR20150100655A (ko) | 혈액 뇌 장벽 수송을 위한 폴리펩티드 | |
| JP6574175B2 (ja) | 細胞透過性ペプチド、及びそれを含むコンジュゲート | |
| US20110124564A1 (en) | Nucleolin-binding peptides, nucleolin- binding lytic peptides, fusion constructs and methods of making and using same | |
| JP6209616B2 (ja) | ｒＴＲＡＩＬ突然変異体およびそのモノメチルアウリスタチンＥコンジュゲート | |
| Pan et al. | Site-specific PEGylation of a mutated-cysteine residue and its effect on tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) | |
| JP2020523987A (ja) | 半減期延長ポリペプチドを有する融合タンパク質 | |
| Ma et al. | Nanoscale organization of TRAIL trimers using DNA origami to promote clustering of death receptor and cancer cell apoptosis | |
| Poźniak et al. | Modular self-assembly system for development of oligomeric, highly internalizing and potent cytotoxic conjugates targeting fibroblast growth factor receptors | |
| WO2024145858A1 (zh) | Dna-trail复合物及其治疗肿瘤的用途 | |
| Nie et al. | Conjugation to 10 kDa linear PEG extends serum half-life and preserves the receptor-binding ability of mmTRAIL with minimal stimulation of PEG-specific antibodies | |
| KR20210052473A (ko) | 면역조정 특성을 갖는 펩티드 | |
| WO2015016608A1 (ko) | 항체 및 핵산 결합 펩타이드를 포함하는 핵산 전달용 조성물 | |
| JP2022551976A (ja) | Ｐｅｇ化キヌレニナーゼ酵素及びがんの治療のためのその使用 | |
| US20230382953A1 (en) | Transcription active complex targeting cancer drug from viral protein sequence | |
| RU2801367C1 (ru) | Многофункциональные гибридные рекомбинантные белковые препараты для терапии опухолевых заболеваний | |
| US20210138075A1 (en) | Cell internalizing compounds | |
| CN108601819B (zh) | 用死亡受体激动剂改善系统性硬化症 | |
| WO2023141361A2 (en) | Anti-b7-h3 compounds and methods of use |