WO2024095911A1 - 細胞剥離装置、及び細胞剥離方法 - Google Patents

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WO2024095911A1
WO2024095911A1 PCT/JP2023/038841 JP2023038841W WO2024095911A1 WO 2024095911 A1 WO2024095911 A1 WO 2024095911A1 JP 2023038841 W JP2023038841 W JP 2023038841W WO 2024095911 A1 WO2024095911 A1 WO 2024095911A1
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WO
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culture vessel
cell detachment
transmission medium
protrusion
cells
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PCT/JP2023/038841
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English (en)
French (fr)
Inventor
堅義 松田
達雄 古田
貴昭 古井
亮一 吉田
Original Assignee
キヤノン株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media

Definitions

  • the present invention relates to a cell detachment device and a cell detachment method.
  • cell culture has become popular for culturing cells used in regenerative medicine and cells used in the production of biopharmaceuticals.
  • Cell culture is broadly divided into adhesion culture and suspension culture.
  • Adhesion culture is particularly suitable for culturing a variety of cells and is widely used.
  • adhesion culture in order to utilize the cultured cells, a process is carried out in which the cells are detached from the scaffold to which they are attached. Therefore, detachment conditions that can recover cells with a high detachment rate while reducing damage to the cells are being investigated.
  • Patent Document 1 discloses a cell recovery device that supplies a detachment solution that reduces the cell adhesiveness of cultured cell populations to a culture vessel containing the cultured cell populations, and vibrates the culture vessel with a vibration device to detach the cultured cell populations from the inner wall of the culture vessel.
  • the inventors used a dish with a protrusion on the bottom surface as a culture vessel housing a group of cultured cells, and investigated contacting the dish with a vibration excitation device. As a result, they discovered that vibration control is complicated because there are multiple vibration transmission paths between the bottom surface of the dish and the protrusions that transmit vibration from the vibration excitation device to the group of cultured cells housed in the culture vessel. When multiple vibration transmission paths exist, the transmitted vibrations interfere with each other, and the vibrations applied to the cells can be too strong or too weak, resulting in a decrease in the cell detachment rate.
  • the present invention has been made to address the above-mentioned problems, and provides a cell detachment device that detaches cells with a high detachment rate.
  • the cell detachment device is a cell detachment device that detaches cells by applying vibrations to cells placed on the culture surface of a cell culture vessel, and is characterized in that the cell detachment device has a transducer and a vibration plate, the culture vessel has a protrusion on the surface opposite the culture surface, and the cell detachment device is configured so that when the transducer, vibration plate, acoustic transmission medium, and culture vessel are stacked in this order, the acoustic transmission medium and vibration plate do not come into contact with the protrusion.
  • the cell detachment device is a cell detachment device that detaches cells by applying vibrations to cells provided on the culture surface of a cell culture vessel, and is characterized in that the cell detachment device has a transducer and a diaphragm, and when the transducer, diaphragm, acoustic transmission medium, and culture vessel are stacked in this order, the culture vessel has a protrusion on the surface opposite the culture surface, and the specific gravity of the material present between the protrusion and the diaphragm at the position where the protrusion and the diaphragm are closest to each other is greater than 0 and less than 0.90.
  • the cell detachment method is a method for detaching cells by applying vibrations to cells placed on the culture surface of a cell culture vessel, and is characterized in that it uses a cell detachment device having a culture vessel with a protrusion on the surface opposite the culture surface, an acoustic transmission medium, a transducer, and a vibration plate, and applies vibrations to the cells with the transducer, vibration plate, acoustic transmission medium, and culture vessel stacked in this order, and applies vibrations to the cells with the acoustic transmission medium and vibration plate not in contact with the protrusion.
  • the cell detachment method is a method for detaching cells by applying vibrations to cells placed on the culture surface of a cell culture vessel, and is characterized in that it uses a culture vessel having a protrusion on the surface opposite to the culture surface of the culture vessel, an acoustic transmission medium, and a cell detachment device having a transducer and a diaphragm, and applies vibrations to the cells in a state in which the transducer, diaphragm, acoustic transmission medium, and culture vessel are stacked in this order, and the specific gravity of the material present between the protrusion and the diaphragm at the position where the protrusion and the diaphragm are closest to each other is greater than 0 and less than 0.90.
  • the present invention provides a vibration cell detachment device that can detach cells at a high detachment rate.
  • FIG. 1 is a top view showing an example of a cell peeling device according to an embodiment of the present invention.
  • 1 is a schematic cross-sectional view showing an example of a cell detachment device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a top view showing an example of a cell peeling device according to an embodiment of the present invention.
  • 1 is a schematic cross-sectional view showing an example of a cell detachment device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a top view showing an example of a cell peeling device according to an embodiment of the present invention.
  • 1 is a schematic cross-sectional view showing an example of a cell detachment device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a culture vessel according to an embodiment of the present invention.
  • 1 is a schematic diagram of a convex silicone rubber according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a vibrator according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a top view of the positioning jig according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a side view of the positioning jig according to the embodiment of the present invention.
  • a cell detachment device 10 has a transducer 12 and a vibration plate 11.
  • the transducer 12, the vibration plate 11, the acoustic transmission medium 13, and the culture vessel 21 are stacked in this order.
  • the cell detachment device according to one embodiment of the present invention detaches cells by applying vibration to the cells provided on the culture surface of the culture vessel 21.
  • the vibration applied to the cells may be an ultrasonic band vibration.
  • the ultrasonic band vibration is a vibration with a frequency of 20 kHz or more.
  • the acoustic transmission medium 13 installed in advance in the cell detachment device 10.
  • the cell detachment device 10 may not include the acoustic transmission medium 13, and the acoustic transmission medium 13 may be installed in the cell detachment device 10 by the user.
  • the cell detachment device 10 may also include a control unit that applies a voltage to the transducer 12 to drive it, thereby applying vibration to the cells.
  • the acoustic transmission medium can also be called an acoustic transmission material, an acoustic matching material, and a transmission medium.
  • detached cells refers to weakening the adhesion of the cells to the culture vessel so that the cells can be recovered.
  • the detached cells may be in a state of being free as individual cells, or in a state in which multiple cells are adhered to each other.
  • the detached cells may be in the form of a sheet.
  • the cell peeling device is equipped with a vibrator and a vibration plate as a vibration generating section.
  • the vibration mechanism generates bending vibrations that are amplified by the combination of the hardness of the vibrator, which contains a piezoelectric material that expands and contracts, and the vibration plate that is attached to the vibrator.
  • the vibration mechanism utilizes resonance caused by structural factors of the vibrator, and can obtain large vibrations at the resonant frequency.
  • containers for cell culture In the field of cell culture, containers for cell culture are widely used, including dishes, flasks, and well plates. In particular, dishes made by Corning, Thermo Fisher Scientific, and AGC Techno Glass (Iwaki) of Japan are used as general-purpose disposable containers.
  • each company's dish which is a culture vessel for culturing cells
  • the shape of each company's dish is as shown in the schematic diagram in Figure 4, and the dimensions of the dish are as shown in Table 1.
  • the culture surface is the surface surrounded by the side walls of the dish, and when cells are cultured, the cells adhere to the culture surface.
  • (a) is the dish inner diameter
  • (b) is the length of the protrusion
  • (c) is the height of the bottom curvature
  • (d) is the width of the protrusion.
  • the dish inner diameter is the diameter of the area inside the protrusion 23 at the end of the dish bottom, inside the bottom of the dish.
  • the protrusion 23 is provided on the bottom of the dish, which is the surface opposite to the culture surface of the culture vessel, and protrudes in a direction approximately perpendicular to the bottom of the dish.
  • the protrusion 23 may be provided in a circular shape at the end of the bottom of the dish, or may have a notch.
  • the main roles of the protrusion 23 are thought to be to prevent damage to the bottom of the culture vessel, to allow the vessels to be stacked, and to prevent the temperature of the workbench from being directly transmitted to the bottom of the culture vessel when it is placed on the workbench.
  • the bottom warp height in (c) varies greatly not only between lots but also within lots.
  • the dimensions of the culture vessel 21 are not limited to those shown in Table 1, and culture vessels 21 of any size can be used. If the protrusion 23 of the culture vessel 21 comes into contact with the vibration plate 11 during operation, the vibration waveform formed on the vibration plate 11 is reduced and the vibration amplitude required for cell detachment cannot be obtained, which is undesirable as it causes a decrease in the detachment rate.
  • the material of the culture container may be any material that is chemically stable and capable of culturing the desired cells.
  • materials for the culture container include at least one selected from the group consisting of polyethylene, polypropylene, polycarbonate, polystyrene, polyvinyl chloride, nylon, polyurethane, polyurea, polylactic acid, polyglycolic acid, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetate, poly(meth)acrylic acid, poly(meth)acrylic acid derivatives, polyacrylonitrile, poly(meth)acrylamide, poly(meth)acrylamide derivatives, polysulfone, cellulose, cellulose derivatives, polysilicone, polymethylpentene, glass, and metal.
  • polystyrene is preferred.
  • FIGS. 1A and 1B A cell detachment device according to a first embodiment of the present invention is shown in FIGS. 1A and 1B.
  • the cell detachment device includes a vibrator 12 and a vibration plate 11 as a vibration generating unit 101.
  • the vibration mechanism generates bending vibrations that are amplified by the combination of the hardness of the vibrator 12, which contains a piezoelectric material that expands and contracts, and the vibration plate 11 to which the vibrator 12 is attached.
  • the vibration mechanism utilizes resonance due to structural factors of the vibrator, and can obtain large vibrations at the resonance frequency.
  • a ring-shaped transducer is shown as a representative vibration generating unit 101, but a Langevin transducer or rectangular transducer that can generate large amplitudes may also be used.
  • an acoustic transmission medium 13 is interposed between the diaphragm 11 and the culture vessel 21. If the culture vessel 21 is placed directly on the diaphragm 11, the contact area will be a point contact, which will result in noise, heat generation, and other energy being consumed other than vibration, resulting in a decrease in efficiency.
  • the acoustic transmission medium 13 is placed over a sufficiently large area relative to the bottom surface of the culture vessel 21.
  • the contact area is 30% or more and less than 100%.
  • the contact area is the ratio of the area of the area where the acoustic transmission medium 13 and the culture vessel 21 are in contact with each other to the area of the area inside the protrusion 23 on the bottom surface of the culture vessel 21.
  • the contact area is at least 30%, it is effective to combine the traveling wave mode vibration mode with the standing wave mode.
  • the shear stress caused by the large radial flow generated in the detachment solution in the traveling wave mode makes it possible to detach cells in areas that are not in direct contact with the acoustic transmission medium 13.
  • the ends of the diaphragm 11 and vibrator 12 are sandwiched between the upper cover 18, lower cover 17, cushioning material 16, and bolts 19 in Figures 1A and 1B, and the pressure applied to the ends is such that the vibrations generated in the diaphragm 11 are not hindered.
  • a cushioning material (not shown)
  • a member containing felt or sponge may be provided between the vibrator 12 and lower cover 17 or under the lower cover 17.
  • the weight 15 preferably weighs 100 g to 600 g. If the weight 15 is too heavy, it will not only suppress and inhibit the vibrations themselves, but also cause the culture vessel 21 itself to bend, resulting in uneven vibration transmission and a decrease in the detachment rate. In this case, considering the insulation of the vibrations, loading by the weight 15 is preferable, but a loading method using a spring or leaf spring may also be used as long as it does not inhibit the vibrations.
  • the cell detachment device is driven by applying to the transducer 12 a voltage at a frequency of a vibration mode that can form a desired vibration waveform on the cell culture surface of the culture vessel 21 and at a desired amplitude to the transducer 12 using an AC power source that supplies a voltage of a resonant frequency.
  • a voltage of the S phase which is the sensor phase provided in the transducer 12
  • an oscilloscope the voltage generated by the distortion of the transducer 12 itself can be directly monitored, and the vibration state of the vibration generating unit 101 can be confirmed while driving.
  • a thermocouple that can measure the temperature during the cell detachment process in a location that does not affect the vibration, it is possible to drive while monitoring.
  • An infrared thermometer can also be used to measure the temperature.
  • the vibration plate 11 included in the vibration generating unit 101 in one embodiment of the present invention preferably includes at least one selected from the group consisting of glass, metal, and quartz.
  • the metal used for the vibration plate 11 may be SUS or aluminum.
  • the outer diameter of the vibration plate 11 is equal to the outer diameter of the vibrator 12.
  • the midpoint of the bending in the thickness direction that is, the neutral plane that is neither pulled nor compressed during bending, is on the vibration plate side in order to efficiently utilize the distortion of the vibrator 12 for bending.
  • the diaphragm 11 may also have a marker (such as a label, print, or engraving) that indicates the position where the acoustic transmission medium 13 is to be placed on the diaphragm 11.
  • a marker such as a label, print, or engraving
  • the protrusion 23 of the culture vessel 21 is not in contact with the diaphragm 11 or the acoustic transmission medium 13.
  • a groove 14 is provided in an area including the position of the protrusion 23 projected onto the diaphragm 11 in the direction in which the transducer 12, diaphragm 11, acoustic transmission medium 13, and culture vessel 21 are stacked in this order (y direction in Figures 1A and 1B). This prevents vibrations from being transmitted directly from the diaphragm 11 to the culture vessel 21, and allows vibrations to be transmitted only from the acoustic transmission medium 13 to the bottom surface of the culture vessel 21.
  • the protrusion 23 of the culture vessel 21 and the diaphragm 11 do not come into contact with each other means that the protrusion 23 of the culture vessel 21 does not substantially come into direct contact with the vibration surface of the diaphragm 11, and preferably the protrusion 23 is hollow.
  • the cell peeling device may be configured so that at least one of the acoustic transmission medium and the diaphragm comes into contact with the protrusion via the cushioning material, and the acoustic transmission medium and the diaphragm do not come into contact with the protrusion without the cushioning material.
  • the cushioning material is preferably at least one of felt and sponge.
  • the specific gravity of the material between the protrusion and the diaphragm at the position where the protrusion and the diaphragm are closest to each other is greater than 0 and less than 0.90.
  • the specific gravity of the material between the protrusion and the diaphragm is less than 0.90, vibrations are less easily transmitted, and vibration interference can be reduced. It is desirable that the specific gravity of the material between the protrusion and the diaphragm is less than 0.80, and more desirably less than 0.50.
  • the specific gravity is calculated, for example, by the pycnometer method.
  • the mass W0 of an empty pycnometer, the mass W1 of a pycnometer filled with water, and the mass W of a pycnometer filled with a sample are measured.
  • the depth of the groove 14 shown in FIG. 1B (A) is preferably greater than the length of the protrusion 23 (FIG. 4(b)). Also, the width of the groove 14 shown in FIG. 1B (B) is preferably greater than the width of the protrusion 23 (FIG. 4(d)).
  • the depth of the groove 14 refers to the depth of the groove 14 in the direction in which the transducer, diaphragm, acoustic transmission medium, and culture vessel are arranged in a stacked manner.
  • the length of the protrusion 23 refers to the length of the protrusion 23 in the direction in which the transducer, diaphragm, acoustic transmission medium, and culture vessel are arranged in a stacked manner.
  • the width of the groove 14 refers to the width of the groove 14 in a direction perpendicular to the direction in which the transducer, diaphragm, acoustic transmission medium, and culture vessel are arranged in a stacked manner.
  • the width of the protrusion 23 refers to the width of the protrusion 23 in a direction perpendicular to the direction in which the transducer, diaphragm, acoustic transmission medium, and culture vessel are arranged in a stacked manner.
  • the length of the protrusion 23 of each culture vessel 21 is 0.5 mm to 0.6 mm, so the depth of the groove 14 needs to be greater than 0.6 mm.
  • the width of the groove 14 needs to be greater than 0.7 mm, which is the width of the protrusion 23, but is preferably 3.0 mm or greater, taking into account the positional accuracy of the culture vessel 21. Since a depth and width of the groove 14 that is greater than necessary may reduce the strength of the vibration plate 11 and reduce the amplitude of the desired vibration mode, it is preferable that the depth of the groove 14 is shallower than 1.5 mm and the width is narrower than 7.0 mm.
  • a taper may be formed at the upper boundary between the vibration surface and the groove 14. Forming a taper has the effect of preventing interference when the culture vessel 21 is tilted and mitigating stress concentration that occurs in the vibration plate 11.
  • acoustic transmission medium As a requirement of the acoustic transmission medium 13, matching between the diaphragm 11 that generates the vibration and the culture vessel 21 to which the vibration is transmitted is necessary. In addition to matching physical properties such as acoustic impedance, mechanical matching of adhesion is also required. In particular, in the cell detachment device of one embodiment according to the present invention, mechanical matching is important to form the vibration waveform of the diaphragm 11 on the cell culture surface of the culture vessel 21 so that adhesion can be achieved over a wide area.
  • a low molecular weight material such as glycerin, which easily deforms under load, or water can be used as the acoustic transmission medium 13.
  • the culture container 21 is stacked on top of the diaphragm 11, the protrusions 23 of the culture container 21 come into direct contact with the diaphragm 11, resulting in multiple vibration transmission paths, which can make the generated vibrations complex and difficult to control.
  • the protrusion 23 of the culture vessel 21 does not come into direct contact in order to control vibrations proactively. Furthermore, in order to efficiently transmit the vibrations of the diaphragm 11 to the bottom surface of the culture vessel 21, rubber or gel made of a polymeric material capable of supporting the culture vessel 21 is used as the acoustic transmission medium 13.
  • the polymeric material that can be used is a material containing at least one selected from the group consisting of silicone resin, urethane resin, diallyl phthalate resin, unsaturated polyester, epoxy resin, phenolic resin, urea resin, melamine resin, and natural rubber.
  • the acoustic transmission medium 13 since the acoustic transmission medium 13 has physical properties with little attenuation in the frequency band of the driving frequency, the transmission efficiency is high, and further, heat generation of the acoustic transmission medium itself can be reduced, it is preferable that the acoustic transmission medium 13 contains silicone rubber.
  • the bottom shape of the containers that will become the culture containers 21 is not simply flat, but warped. For this reason, in order to achieve close contact over a wide area, the acoustic transmission medium 13 needs to imitate the bottom shape. In other words, it is desirable for the surface where the acoustic transmission medium 13 comes into contact with the culture container 21 to include a convex curved surface. For example, in the case of a ⁇ 60 mm dish manufactured by AGC Techno Glass Co., Ltd. in Table 1, the warp of the bottom is 0.10 mm to 0.70 mm.
  • silicone rubber which is a polymer material with a hardness of 10° and a convex shape as shown in Figure 5, with a central height (A) of 0.8 mm, a side height (B) of 0.4 mm, and a diameter (C) of 48 mm, is used as the acoustic transmission medium 13.
  • the contact area is 60%, and when a 300 g weight 15 is placed on it, the contact area becomes 90% due to the crushing of the polymer material that is the acoustic transmission medium 13 and the bending of the culture container 21.
  • the center of the polymer material of the acoustic transmission medium 13 overlaps with the center of the culture vessel 21.
  • a positioning jig will be described later as an example of a method for aligning the acoustic transmission medium 13 with the culture vessel 21, but other methods may be used in addition to the positioning jig.
  • the surface of the acoustic transmission medium 13 that comes into contact with the culture vessel 21 is uneven.
  • the convex parts are crushed, resulting in close contact over a wide area.
  • removing the weight 15 has the effect of making it easy to remove the acoustic transmission medium 13 and the culture vessel 21.
  • the surface of the polymer material of the acoustic transmission medium 13 that comes into contact with the culture vessel may be fluorine coated.
  • the acoustic transmission medium 13 is transparent in order to directly observe the cell detachment state.
  • a circular ring-shaped transducer 12 In the first embodiment, a circular ring-shaped transducer 12 is used, but the shape of the transducer 12 that deflects the vibration plate 11 may be a circular ring shape or a disk shape. In order to directly observe the cell detachment state, a circular ring shape is preferable because it ensures a field of view below the culture vessel 11.
  • the vibrator 12 exhibits piezoelectric properties when polarized, and as shown in Figure 6, the polarity of polarization can be changed according to the electrode pattern.
  • the polarized vibrator 12 can excite standing wave and traveling wave vibration modes by controlling the phase of the input AC voltage for each electrode pattern.
  • Standing waves are generated by applying an AC voltage with a phase difference of 180 degrees to a negatively polarized electrode relative to a positively polarized electrode.
  • applying an AC voltage with a phase difference of 90 degrees between phase A and phase B generates a two-phase driven traveling wave.
  • the electrode pattern was formed by printing Ag, but the electrode material can be other than Ag, such as precious metals as Au, Pt, Pd, etc., or base metals such as Cu.
  • the formation method can be printing, plating, or sputtering.
  • the piezoelectric material contained in the vibrator 12 used in the vibration generating unit 101 is preferably PbZrTiO 3 (PZT), but in consideration of environmental regulations, it is preferable to use a lead-free piezoelectric material that does not substantially contain Pb.
  • the lead-free piezoelectric material may be at least one selected from the group consisting of BaTiO 3 (BT), NaNbO 3 , BiNaTiO 3 , and BiFeO 3 as the main component, and may be a combination of each of them or may have a metal element added to the main component.
  • BaTiO 3 (BT)-based materials have vibration performance equivalent to that of PbZrTiO 3 (PZT).
  • materials other than ceramics may be single crystal materials and polymer-based piezoelectric materials.
  • the midpoint of the thickness direction of the flexure that is, the neutral plane that is neither tensile nor compressed when flexing, to be on the diaphragm 11 side in order to efficiently utilize the distortion of the vibrator 12 for flexure.
  • the combination of the thickness of the vibrator 12 and diaphragm 11 was set based on the relationship between the hardness of the vibrator 12 and the hardness of the diaphragm 11.
  • the outer periphery of the culture vessel 21 can be abutted with a positioning pin 24 to align the center.
  • the culture vessel 21 may be placed on an annular retaining ring 25 whose center position is determined. By moving up and down with the dial 27 of the Z-axis stage bracket 26, the culture vessel 21 can be accurately placed in the center of the acoustic transmission medium 31, which has been positioned by the pedestal positioning 29 on the bottom plate 28 of the positioning jig 102.
  • the vibration waveforms that can be formed by the cell peeling device include a standing wave mode that is formed concentrically from the center of the disk-shaped vibration plate 11, and a traveling wave mode that forms a radial vibration waveform on the vibration plate 11 by vibrating the oscillator 12 with a phase change in the radial direction.
  • Each vibration waveform can be formed by applying a voltage at a resonant frequency to the oscillator 12, and the resonant frequency and vibration waveform shape were calculated by structural calculations using the shape of the oscillator 12 and material property values such as hardness and density.
  • Any vibration waveform that can be used for cell detachment can be used as long as it can vibrate the cell culture surface of the culture vessel 21 with a constant amplitude, for example, an amplitude of 1 ⁇ m.
  • a constant amplitude for example, an amplitude of 1 ⁇ m.
  • resonating vibrations can be detected. Vibrations detected on the low frequency side have a large amplitude but a small acceleration. In contrast, vibrations detected on the high frequency side have a small amplitude but a large acceleration.
  • the conditions for applying a force that weakens the adhesive strength of the cultured cells to the culture vessel 21 depend largely on the adhesive strength of the cells and the size and shape of the cells. Furthermore, the flow generated in the detachment liquid also differs depending on the amplitude and acceleration, so there are various combinations. Furthermore, simply using large amplitudes and large accelerations is not preferable because it promotes the occurrence of cavitation, which is a factor in reducing the survival rate of cells.
  • the resonant frequency shifts to the lower frequency side due to heat generation by the vibrator 12 itself, so the amplitude becomes smaller if the frequency is fixed and the vibrator is continued to be driven. For this reason, sufficient amplitude can be obtained by driving the vibrator using a driving method that provides a rest period after a certain period of oscillation and reduces the temperature rise due to self-heating. Alternatively, sufficient amplitude can be obtained by repeatedly sweeping from the high frequency side to the low frequency side in a certain frequency width, and always passing through the resonant frequency even if heat is generated.
  • the vibration waveform of the vibration plate of the cell detachment device can be measured by a laser Doppler vibrometer (Graphtec AT7200).
  • the cell detachment device is driven at a desired resonant frequency and voltage, and the surface of the vibration plate 11 is scanned two-dimensionally in the XY direction with a laser. At this time, for example, the surface of the vibration plate 11 is scanned at intervals of 1 mm.
  • the vibration speed of each point is obtained by scanning, and the amplitude in the Z direction can be calculated by calculation.
  • the vibration waveform of the vibration plate 11 can be configured three-dimensionally, and the positions of the antinodes with large vibration amplitudes and the nodes that do not vibrate during driving can be dynamically grasped.
  • the positions where the vibration amplitude is maximum are called antinodes, and the positions where the vibration amplitude is localized are called nodes.
  • the vibration measurement of the cell culture surface of the culture vessel 21 can also be performed with a similar configuration.
  • the acoustic transmission medium 13 is placed on the diaphragm 11.
  • a metal film for example Ag, is formed on the inner surface of the culture vessel 21 by vapor deposition so that the culture vessel 21 reflects the laser. It is necessary to place the culture vessel 21 and the acoustic transmission medium 13 in such a way that no air gap is created between them. At this time, a vacuum can be drawn in a vacuum chamber as a method to prevent the air gap from being created.
  • the resonance intended to drive the cell detachment device is a standing wave mode in which the culture vessel 21 oscillates in a concentric circle
  • the frequency is swept near the desired resonance frequency, and the amplitude in the center of the culture vessel 21 is measured. Furthermore, by two-dimensionally scanning the entire culture surface of the culture vessel 21 at the frequency with the largest amplitude, the vibration waveform generated on the culture surface of the culture vessel 21 can be grasped three-dimensionally.
  • the cell culture conditions can be appropriately selected according to the cells to be cultured.
  • an appropriate medium is added to the culture vessel 21, and cells are seeded therein at about 1.0 ⁇ 10 1 to 5.0 ⁇ 10 4 cells/cm 2 and cultured in an environment of 37° C. and 5% CO 2 concentration.
  • the cells may be cultured until they cover the culture surface and reach a confluent state, and may be cultured in a sheet form (cell sheet).
  • the cell detachment device can be applied to various kinds of cells, such as Chinese hamster ovary-derived CHO cells, mouse connective tissue L929 cells, mouse skeletal muscle myoblasts (C2C12 cells), human fetal lung-derived normal diploid fibroblasts (TIG-3 cells), human fetal kidney-derived cells (HEK293 cells), human alveolar basal epithelial adenocarcinoma-derived A549 cells, human cervical cancer-derived HeLa cells, epithelial cells, endothelial cells, skeletal muscle cells, smooth muscle cells, cardiomyocytes, neuronal cells, glial cells, fibroblasts, hepatic parenchymal cells, hepatic non-parenchymal cells, adipocytes, induced pluripotent stem (iPS) cells, embryonic stem (ES) cells, embryonic germ (EG) cells, embryonic carcinoma (EC) cells, mesenchymal stem cells, hepatic stem cells, pancre
  • iPS
  • the detachment solution usually contains a protease.
  • protease include at least one selected from the group consisting of trypsin, accutase, collagenase, natural protease, chymotrypsin, elastase, papain, pronase, and recombinant forms thereof.
  • protease may degrade membrane proteins of cells. Degradation of membrane proteins may reduce properties such as cell adhesion.
  • the cell detachment method of this invention does not use protease, or if protease is used, a very small amount of protease can achieve the same effect, so it has the effect of reducing the degradation of membrane proteins of cells.
  • the detachment solution may contain culture medium components to make it difficult to reduce membrane proteins of cells.
  • the culture vessel 21 in which the culture medium has been replaced with the detachment liquid is placed in the cell detachment device, and the cell detachment device is operated while the temperature is kept constant in the incubator, for example at 37°C.
  • the cell detachment device is operated for a sufficient operating time for cell detachment.
  • the detached cells are collected with a dropper, and the cells adhering to the culture vessel 21 are collected by pipetting.
  • the detachment rate is the ratio of the number of cells detached by the vibration of the cell detachment device to the total number of cells detached by the vibration of the cell detachment device and the number of cells detached by the pipetting method.
  • the survival rate is the ratio of surviving cells among the cells collected by the vibration of the cell detachment device.
  • the remaining cells remaining on the bottom surface of the culture vessel 21 after cell detachment can be observed using scattered light from a backlight.
  • Example 1 of the first embodiment will be described below.
  • Example 1 the cell detachment device shown in Figures 1A and 1B was used.
  • the culture vessel 21 was a Corning ⁇ 60 mm dish shown in Table 1.
  • the vibration plate 11 of the cell detachment device was made of glass with an outer diameter of 70 mm and a thickness of 4 mm, and a groove 14 formed therein so that the protrusion 23 of the culture vessel 21 would not come into contact with it.
  • the dimensions of the groove 14 were an inner diameter of 50 mm, a width of 5 mm, and a depth of 1 mm.
  • the material composition of the piezoelectric material contained in the transducer 12 was PZT, the outer diameter was the same as the vibration plate, 70 mm, the inner diameter was 57 mm, and the thickness was 2 mm considering that the neutral surface was on the vibration plate 11 side.
  • a silicone rubber with a hardness of 30° and a convex disc shape with a central height (A) of 0.9 mm, a side height (B) of 0.4 mm, and a diameter (C) of 48 mm was placed as the acoustic transmission medium 13.
  • the dimensions of the acoustic transmission medium 13 here are the dimensions of the part shown in Figure 5.
  • the cell detachment device was assembled as shown in Figures 1A and 1B, and a Corning ⁇ 60 mm dish, which was the culture vessel 21 in which the cells were cultured, was placed on the silicone rubber placed on the diaphragm 11.
  • the dish was placed while aligning the center of the dish with the center of the acoustic transmission medium 13 using the positioning pin 24.
  • the contact area between the acoustic transmission medium and the culture vessel was 30%.
  • the contact area is the ratio of the area of the area where the acoustic transmission medium 13 and the culture vessel 21 are in contact with each other to the area of the area inside the protrusion 23 on the bottom surface of the culture vessel 21.
  • CHO Choinese Hamster Ovary cells were seeded on a Corning ⁇ 60 mm dish at a density of 10,000 cells/ cm2 and cultured under an environment of 37°C and 5% CO2 concentration.
  • the medium used was Ham's F12 (Thermo Fisher Scientific) supplemented with 10% Fetal Bovine Serum (Sigma-Aldrich) and 1% penicillin-streptomycin (10,000 U/ml, Thermo Fisher Scientific).
  • the culture was carried out for 48 hours, and the state of the cells was observed under a phase contrast microscope to confirm cell adhesion and proliferation.
  • the cell occupancy rate of the dish was about 80%.
  • the culture vessel was placed in a cell detachment device, and the cells were detached for 1 minute 30 seconds using frequency sweep vibration (frequency 22-27 kHz, frequency sweep period 1 s, voltage 100 V) in standing wave mode at an ambient temperature of 37°C.
  • the phase was then switched, and the cells were detached for 1 minute 30 seconds using frequency sweep vibration (frequency 22-27 kHz, frequency sweep period 1 s, voltage 100 V) in traveling wave mode.
  • the cell count was measured using a hemocytometer and the survival rate was calculated using a viability test using trypan blue staining.
  • the suspension of detached cells was mixed with 0.4% trypan blue solution in a 1:1 ratio to stain the dead cells contained in the suspension.
  • the suspension was injected into a hemocytometer (NanoEntek, DHC-N01) and the number of live and dead cells on the grid of the hemocytometer was counted by microscopic observation.
  • the survival rate was calculated as the ratio of the number of live cells counted to the total number of cells in the cells detached by the vibration of the cell detachment device.
  • a cell scraper was used to detach all cells that could not be detached by ultrasonic waves from the dish.
  • the suspension of detached cells was poured into a hemocytometer (NanoEntek, DHC-N01) and observed under a microscope to measure the number of detached cells.
  • the total number of cells detached by ultrasonic waves and the number of cells subsequently detached with the cell scraper were added together to determine the total number of detached cells, and the detachment rate was defined and calculated as the ratio of the number of ultrasonically detached cells to the total number of detached cells.
  • the survival rate was 98.5% and the detachment rate was 94.9%.
  • a survival rate and detachment rate of 90% or more was considered to be good.
  • Second Embodiment 2A and 2B are schematic diagrams of a cell detachment device having a diaphragm 11 with an outer dimension that does not contact the protruding portion 23 of the culture vessel 21.
  • the diameter of the diaphragm 11 shown in (A) of Fig. 2B is desirably smaller than the inner diameter of the culture vessel 21 shown in (B) of Fig. 2B.
  • the cross section of the diaphragm 11 in a plane perpendicular to the direction in which the transducer, the diaphragm, the acoustic transmission medium, and the culture vessel are arranged in a stacked manner is circular, and the diameter of the diaphragm 11 refers to the diameter of the cross section.
  • the protrusion 23 of the culture vessel 21 and the diaphragm 11 do not come into contact with each other means that the protrusion 23 of the culture vessel 21 does not substantially come into direct contact with the vibration surface of the diaphragm 11, and preferably the protrusion 23 is hollow.
  • the cell peeling device may be configured so that at least one of the acoustic transmission medium and the diaphragm comes into contact with the protrusion via the cushioning material, and the acoustic transmission medium and the diaphragm do not come into contact with the protrusion without the cushioning material.
  • the cushioning material is preferably at least one of felt and sponge.
  • the specific gravity of the material between the protrusion and the diaphragm at the position where the protrusion and the diaphragm are closest to each other is greater than 0 and less than 0.90.
  • the specific gravity of the material between the protrusion and the diaphragm is less than 0.90, vibrations are less easily transmitted, and vibration interference can be reduced. It is desirable that the specific gravity of the material between the protrusion and the diaphragm is less than 0.80, and more desirably less than 0.50.
  • the shapes of the protrusion 23 and the diaphragm 11 are not limited to these, and it is sufficient that the diaphragm 11 and the protrusion 23 do not overlap. In other words, it is sufficient that the diaphragm does not overlap with the position of the protrusion projected onto the surface on which the diaphragm is located in the direction in which the transducer, diaphragm, acoustic transmission medium, and culture vessel are arranged in layers (y direction in Figures 2A and 2B). With this type of structure, it is possible to directly lift the bottom of the culture vessel after cell detachment processing, and easily remove the culture vessel from the cell detachment device.
  • Example 2 the culture vessel 21 was a Nunc ⁇ 60 mm dish manufactured by Thermo Fisher Scientific in Table 1.
  • the main component of the piezoelectric material contained in the transducer 12 was BaTiO 3 , the outer diameter was 50 mm, the inner diameter was 37 mm, and the thickness was 1 mm, considering that the neutral surface was on the vibration plate 11 side.
  • a silicone rubber having a hardness of 10° and a convex disc shape with a central height (A) of 0.8 mm, a side height (B) of 0.4 mm, and a diameter (C) of 48 mm was placed as the acoustic transmission medium 13.
  • the dimensions of the acoustic transmission medium 13 here are the dimensions of the part shown in FIG. 5. 2A and 2B, the cell detachment device was assembled, and a Nunc ⁇ 60 mm dish, which is a culture vessel 21 in which cells were cultured, was placed on the silicone rubber placed on the vibration plate 11.
  • the center of the acoustic transmission medium 13 was aligned with the center of the culture vessel 21 using a positioning jig 102, and the culture vessel 21 was placed.
  • the contact area between the acoustic transmission medium 13 and the culture vessel 21 was 85%.
  • the contact area is the ratio of the area of the area where the acoustic transmission medium 13 and the culture vessel 21 are in contact with each other to the area of the area inside the protrusion 23 on the bottom surface of the culture vessel 21.
  • the culture vessel was then placed in a cell detachment device, and cells were detached using frequency sweep vibration (frequency 22-27 kHz, frequency sweep period 1 s, voltage 100 V) in standing wave mode for 3 minutes at an ambient temperature of 37°C.
  • frequency sweep vibration frequency 22-27 kHz, frequency sweep period 1 s, voltage 100 V
  • the exfoliated cell test was performed in the same manner as in Example 1. As a result, the survival rate was 98.0% and the exfoliation rate was 95.7%. A survival rate and exfoliation rate of 90% or more was considered good.
  • Figures 3A and 3B are schematic diagrams of a cell detachment device configured such that when a culture vessel 21 is placed on top of an acoustic transmission medium 13, the thickness of the acoustic transmission medium 13 is greater than the length of the protrusion 23, so that the vibration plate 11 and the protrusion 23 do not come into contact with each other.
  • the protrusion 23 of the culture vessel 21 and the diaphragm 11 do not come into contact with each other means that the protrusion 23 of the culture vessel 21 does not substantially come into direct contact with the vibration surface of the diaphragm 11, and preferably the protrusion 23 is hollow.
  • the cell peeling device may be configured so that at least one of the acoustic transmission medium and the diaphragm comes into contact with the protrusion via the cushioning material, and the acoustic transmission medium and the diaphragm do not come into contact with the protrusion without the cushioning material.
  • the cushioning material is preferably at least one of felt and sponge.
  • the specific gravity of the material between the protrusion and the diaphragm at the position where the protrusion and the diaphragm are closest to each other is greater than 0 and less than 0.90.
  • the specific gravity of the material between the protrusion and the diaphragm is less than 0.90, vibrations are less easily transmitted, and vibration interference can be reduced. It is desirable that the specific gravity of the material between the protrusion and the diaphragm is less than 0.80, and more desirably less than 0.50.
  • the thickness of the acoustic transmission medium 13 when the culture vessel 21 is placed on the acoustic transmission medium 13 as shown in FIG. 3B (A) is preferably greater than the length of the protruding portion 23 of the culture vessel 21 as shown in FIG. 3B (B).
  • the acoustic transmission medium 13 is crushed, but if the thickness of the acoustic transmission medium 13 at that time is greater than the length of the protruding portion 23 of the culture vessel 21, it will not come into direct contact with the vibration plate 11.
  • the thickness of the acoustic transmission medium refers to the thickness of the acoustic transmission medium in the direction in which the transducer, the vibration plate, the acoustic transmission medium, and the culture vessel are placed on top of each other. If the volume of the acoustic transmission medium 13 itself becomes large, there is a risk that the vibration transmission efficiency will decrease, so it is preferable that the acoustic transmission medium 13 used has a high hardness.
  • the thickness of the acoustic transmission medium 13 is determined taking into consideration that the length of the protruding portion 23 of the culture vessel 21 of each company is 0.5 mm, and the load of the weight 15 during the cell detachment process.
  • the thickness of the acoustic transmission medium 13 provided on the vibration plate 11 is preferably 0.8 mm or more.
  • the thickness of the acoustic transmission medium 13 is preferably 1.5 mm or less, since vibration attenuation is large in polymeric materials.
  • Example 3 the culture vessel 21 was an Iwaki ⁇ 60mm dish manufactured by AGC Techno Glass Co., Ltd., as shown in Table 1.
  • the vibration plate 11 of the cell detachment device had an outer diameter of 70 mm, a thickness of 4 mm, and was made of quartz.
  • the material composition of the piezoelectric material contained in the transducer 12 was PZT, the outer diameter was 70 mm, the inner diameter was 57 mm, and the thickness was 2 mm, taking into consideration that the neutral surface was on the vibration plate 11 side.
  • a urethane with a hardness of 50° and a convex disc shape with a central height (A) of 0.7 mm, a side height (B) of 0.3 mm, and a diameter (C) of 48 mm was placed as the acoustic transmission medium 13.
  • the dimensions of the acoustic transmission medium 13 here are the dimensions of the location shown in FIG. 5.
  • the cell detachment device was assembled as shown in FIG. 1A and FIG. 1B, and an Iwaki ⁇ 60mm dish of the culture vessel 21 in which cells were cultured was placed on the urethane placed on the vibration plate 11.
  • the culture vessel 21 was placed while aligning the center of the culture vessel 21 with the center of the acoustic transmission medium 13 using the positioning pin 24.
  • the contact area between the acoustic transmission medium 13 and the culture vessel 21 was 97%.
  • the contact area is the ratio of the area of the area where the acoustic transmission medium 13 and the culture vessel 21 contact each other to the area of the area inside the protrusion 23 on the bottom surface of the culture vessel 21.
  • CHO cell culture, cell detachment process, and detached cell testing were performed in the same manner as in Example 2.
  • Embodiments of the present invention may also be realized by a computer of a system or apparatus (e.g., an application specific integrated circuit (ASIC)) that reads and executes computer executable instructions (e.g., one or more programs) recorded on a storage medium to perform one or more functions of the above-described embodiments, and/or by a computer of a system or apparatus that includes one or more circuits that perform one or more functions of the above-described embodiments, and by a method performed by the computer of the system or apparatus, e.g., by reading and executing computer executable instructions from a storage medium to perform one or more functions of the above-described embodiments, and/or by controlling one or more circuits to perform one or more functions of the above-described embodiments.
  • ASIC application specific integrated circuit
  • the computer may include one or more processors (e.g., a central processing unit (CPU), a microprocessor unit (MPU)) and may include a separate computer or a network of separate processors to read and execute the computer executable instructions.
  • the computer executable instructions may be provided to the computer, e.g., from a network or a storage medium.
  • the storage medium may include, for example, one or more of a hard disk, a random access memory (RAM), a read-only memory (ROM), a storage device of a distributed computing system, an optical disk (such as a compact disk (CD), a digital versatile disk (DVD), a Blu-ray disk (BD)), a flash memory device, a memory card, and the like.
  • the disclosure of this embodiment includes the following configurations and methods.
  • a cell detachment device that detaches cells by applying vibration to the cells provided on a culture surface of a cell culture vessel,
  • the cell detachment device has a vibrator and a vibrating plate,
  • the culture vessel has a protrusion on a surface opposite to the culture surface,
  • the cell detachment device is characterized in that, when the transducer, the diaphragm, the acoustic transmission medium, and the culture vessel are stacked in this order, the cell detachment device is configured so that the acoustic transmission medium and the diaphragm do not come into contact with the protrusion.
  • Configuration 2 The cell detachment device described in configuration 1 is characterized in that when the transducer, the diaphragm, the acoustic transmission medium, and the culture vessel are stacked in this order, at least one of the acoustic transmission medium and the diaphragm is in contact with the protrusion via a cushioning material.
  • (Configuration 5) A cell detachment device described in any one of configurations 1 to 4, characterized in that when the transducer, the diaphragm, the acoustic transmission medium, and the culture vessel are stacked in this order, the diaphragm has a groove in an area including a position where the position of the protrusion is projected onto the diaphragm in the direction in which they are stacked.
  • Configuration 7 A cell detachment device as described in configuration 5 or 6, characterized in that the width of the groove in the direction in which the layers are arranged is wider than the width of the protrusion in a direction perpendicular to the direction in which the layers are arranged.
  • (Configuration 8) A cell detachment device described in any one of configurations 1 to 4, characterized in that when the transducer, the diaphragm, the acoustic transmission medium, and the culture vessel are stacked in this order, in the direction in which they are stacked, the diaphragm does not overlap with the position of the protrusion projected onto the surface on which the diaphragm is located.
  • (Configuration 11) A cell detachment device described in any one of configurations 1 to 10, characterized in that the thickness of the acoustic transmission medium when the culture vessel is placed on top of the acoustic transmission medium in the direction of the overlapping arrangement is greater than the height of the protrusion in the direction of the overlapping arrangement.
  • (Configuration 12) The cell detachment device described in any one of configurations 1 to 11, characterized in that when the transducer, the diaphragm, the acoustic transmission medium, and the culture vessel are stacked in this order, the ratio of the area of the culture vessel in contact with the acoustic transmission medium to the area of the area inside the protrusion on the surface of the culture vessel opposite the culture surface is 30% or more and less than 100%.
  • a cell detachment device that detaches cells by applying vibration to the cells provided on a culture surface of a cell culture container,
  • the cell detachment device has a vibrator and a vibrating plate,
  • the culture vessel has a protrusion on a surface opposite to the culture surface,
  • a cell detachment device characterized in that the specific gravity of a substance present between said protrusion and said vibration plate at the position where said protrusion and said vibration plate are closest to each other is greater than 0 and less than 0.90.
  • a cell detachment method for detaching cells by applying vibration to cells placed on a culture surface of a cell culture vessel comprising: applying vibration to the cells using a cell detachment device having the culture vessel having a protrusion on a surface opposite to the culture surface, an acoustic transmission medium, a transducer, and a vibration plate, with the transducer, the vibration plate, the acoustic transmission medium, and the culture vessel being stacked in this order;
  • a cell detachment method comprising imparting vibration to the cells while the acoustic transmission medium and the diaphragm are not in contact with the protrusion.
  • Method 2 A cell detachment method for detaching cells by applying vibration to cells placed on a culture surface of a cell culture vessel, comprising: applying vibration to the cells using a cell detachment device having a protrusion on a surface of the culture vessel opposite to the culture surface of the culture vessel, an acoustic transmission medium, and a transducer and a vibration plate, with the transducer, the vibration plate, the acoustic transmission medium, and the culture vessel being stacked in this order;
  • a cell detachment method characterized in that vibration is applied to the cell when the specific gravity of the substance between the protrusion and the vibration plate at the position where the protrusion and the vibration plate are closest to each other is greater than 0 and less than 0.90.

Landscapes

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Abstract

細胞の培養容器の培養面の上に設けられた細胞に振動を付与することによって細胞を剥離する細胞剥離装置であって、細胞剥離装置は、振動子と振動板とを有し、培養容器は、培養面とは反対側の面に突出部を有し、振動子、振動板、音響伝達媒体、及び培養容器がこの順に重ねて配置される際に、音響伝達媒体及び振動板が突出部と接しないように細胞剥離装置が構成されていることを特徴とする。

Description

細胞剥離装置、及び細胞剥離方法
　本発明は、細胞剥離装置、及び細胞剥離方法に関する。
　近年、再生医療で用いられる細胞や、バイオ医薬品等の製造に用いられる細胞を培養する細胞培養が盛んに行われている。細胞培養は、接着培養と浮遊培養に大別される。とりわけ、接着培養は様々な細胞の培養に適しており、広く用いられている。接着培養において、培養した細胞を利用するために、細胞が接着する足場から細胞を剥離する工程が行われる。そこで、細胞に対するダメージを低減しながら、高い剥離率で細胞を回収する剥離条件の検討がされている。
　特許文献１に、培養細胞群の細胞接着性を低下させる剥離液を、培養細胞群が収容された培養容器に供給し、加振装置によって培養容器を振動させることで培養細胞群を培養容器の内壁から剥離させる細胞回収装置が開示されている。
特開２００８－７９５５４号公報
　発明者らは、培養細胞群が収容された培養容器として底面に突出部を有するディッシュを用いて、ディッシュを加振装置に接触させる検討を行った。その結果、加振装置から培養容器に収容された培養細胞群へと振動が伝達される振動伝達経路として、ディッシュ底面と突出部との複数の振動伝達経路が存在するため、振動制御が複雑であることを見出した。複数の振動伝達経路が存在する場合、伝達される振動どうしが干渉するため、細胞に付与される振動が強すぎたり弱すぎたりすることで細胞の剥離率が低下する場合があった。
　本発明は上述の課題に対処するためになされたもので、高い剥離率で細胞を剥離する細胞剥離装置を提供するものである。
　本発明に係る細胞剥離装置は、細胞の培養容器の培養面の上に設けられた細胞に振動を付与することによって細胞を剥離する細胞剥離装置であって、細胞剥離装置は、振動子と振動板とを有し、培養容器は、培養面とは反対側の面に突出部を有し、振動子、振動板、音響伝達媒体、及び培養容器がこの順に重ねて配置される際に、音響伝達媒体及び振動板が突出部と接しないように細胞剥離装置が構成されていることを特徴とする。
　本発明に係る細胞剥離装置は、細胞の培養容器の培養面に設けられた細胞に振動を付与することによって細胞を剥離する細胞剥離装置であって、細胞剥離装置は、振動子と振動板とを有し、振動子、振動板、音響伝達媒体、及び培養容器がこの順に重ねて配置される際に、培養容器は、培養面とは反対側の面に突出部を有し、突出部と振動板とが最も近い位置における突出部と振動板との間に存在する物質の比重は０より大きく０．９０より小さいことを特徴とする。
　本発明に係る細胞剥離方法は、細胞の培養容器の培養面の上に設けられた細胞に振動を付与することによって細胞を剥離する細胞剥離方法であって、培養面とは反対側の面に突出部を有する培養容器と音響伝達媒体と振動子と振動板とを有する細胞剥離装置とを用いて、振動子、振動板、音響伝達媒体、及び培養容器がこの順に重ねて配置された状態で、細胞に振動を付与し、音響伝達媒体及び振動板が突出部と接しない状態で、細胞に振動を付与することを特徴とする。
　本発明に係る細胞剥離方法は、細胞の培養容器の培養面の上に設けられた細胞に振動を付与することによって細胞を剥離する細胞剥離方法であって、培養容器の培養面とは反対側の面に突出部を有する培養容器と、音響伝達媒体と、振動子及び振動板を有する細胞剥離装置とを用いて、振動子、振動板、音響伝達媒体、及び培養容器がこの順に重ねて配置された状態で、細胞に振動を付与し、突出部と振動板とが最も近い位置における突出部と振動板との間に存在する物質の比重は０より大きく０．９０より小さい状態で、細胞に振動を付与することを特徴とする。
　本発明によれば、高い剥離率で細胞を剥離する細胞剥離装置を提供する振動剥離装置を提供することができる。
本発明の実施形態に係る細胞剥離装置の一例を示す上面図である。 本発明の実施形態に係る細胞剥離装置の一例を示す断面概略図である。 本発明の実施形態に係る細胞剥離装置の一例を示す上面図である。 本発明の実施形態に係る細胞剥離装置の一例を示す断面概略図である。 本発明の実施形態に係る細胞剥離装置の一例を示す上面図である。 本発明の実施形態に係る細胞剥離装置の一例を示す断面概略図である。 本発明の実施の形態に係る培養容器の概略図である。 本発明の実施の形態に係る中凸形状シリコーンゴムの概略図である。 本発明の実施の形態に係る振動子の概略図である。 本発明の実施の形態に係る位置決め治具の上面図である。 本発明の実施の形態に係る位置決め治具の側面図である。
　以下に実施例を挙げて、本発明の実施形態に係る細胞剥離装置を説明するが、本発明の実施形態は、以下の実施例により限定されるものではない。
　（基本構成）
　本発明の一実施形態に係る細胞剥離装置１０は、振動子１２及び振動板１１を有する。細胞剥離装置１０が細胞に振動を付与する際には、振動子１２、振動板１１、音響伝達媒体１３、及び培養容器２１は、この順に重ねて配置される。本発明の一実施形態に係る細胞剥離装置は、培養容器２１の培養面の上に設けられた細胞に振動を付与することによって細胞を剥離する。
　なお、振動子１２、振動板１１、音響伝達媒体１３、及び培養容器２１のそれぞれの間に別の部材を有する構成であってもよい。細胞に付与する振動は、超音波帯域の振動であってもよい。ここで、超音波帯域の振動とは、２０ｋＨｚ以上の周波数の振動である。なお、細胞剥離装置１０は、音響伝達媒体１３が予め設置された構成であってもよい。細胞剥離装置１０は、音響伝達媒体１３を含まず、細胞剥離装置１０に音響伝達媒体１３をユーザが設置する構成であってもよい。また、細胞剥離装置１０は、振動子１２に電圧を印加し駆動させることで、細胞に振動を付与する制御部を備えていてもよい。音響伝達媒体は、音響伝達材料、音響マッチング材、及び、伝達媒体と呼ぶこともできる。
　ここで、「細胞を剥離する」とは、細胞の培養容器への接着を弱め、細胞を回収できる状態にすることを指す。このとき、剥離された細胞は、個々の細胞として遊離した状態であってもよいし、複数個の細胞どうしが接着している状態であってもよい。また、後述するように、剥離された細胞がシート状になっていてもよい。
　細胞剥離装置は、振動発生部として、振動子、振動板を備える。振動機構は、自身が伸縮する圧電材料を含む振動子と、振動子に接着された振動板との硬さの組み合わせによって振動を増幅させた屈曲振動を発生させるものである。振動機構は振動子の構造要因による共振を利用するもので、共振周波数で大きな振動を得ることができる。
　（培養容器）
　細胞培養分野で広く利用されている細胞培養用途の容器には、ディッシュとフラスコとウェルプレートがある。特にディッシュは、コーニング社、サーモフィッシャーサイエンティフィック社、日本のＡＧＣテクノガラス社（Ｉｗａｋｉ）社のディッシュが汎用のディスポーザブル容器として用いられている。
　細胞を培養する培養容器である各社のディッシュの形状は図４の概略図の通りであり、ディッシュの寸法は表１の通りである。培養面とは、ディッシュの側壁に囲まれた面であって、細胞を培養する際には培養面に細胞が接着する。表１の（ａ）はディッシュ内径、（ｂ）は突出部長さ、（ｃ）は底面反り高さ、（ｄ）は突出部の幅である。ここで、ディッシュ内径とは、ディッシュ底面の内、ディッシュ底面の端部にある突出部２３の内側の領域の直径である。突出部２３は、培養容器の培養面とは反対側の面であるディッシュ底面に設けられ、ディッシュ底面に略垂直な方向に突出している。突出部２３は、ディッシュ底面の端部に円形に設けられていてもよく、切り欠きを有していてもよい。
　突出部２３の主な役割として、培養容器底面を傷つけないこと、容器同士を重ねることを可能とすること、作業台上に置いた際に培養容器底面に作業台の温度が直接伝わらないようにすることなどが考えられる。（ｃ）の底面反り高さは、ロットによるばらつきだけでなく、ロット内でもばらつきが大きい。なお、培養容器２１の寸法は表１に示す寸法に限らず、任意の大きさの培養容器２１を用いることができる。培養容器２１の突出部２３が振動板１１に駆動中に接触する場合、振動板１１に形成された振動波形が低減され細胞剥離に要する振動振幅が得られず、剥離率の低下の要因となり望ましくない。
　細胞培養用途の容器は、汎用品のディッシュ、フラスコ、ウェルプレートが広く用いられているが、本発明では特に限定するものではない。その時、培養容器の材質は、化学的に安定であり、所望の細胞を培養可能な材質であればよい。培養容器の材質として、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリウレタン、ポリウレア、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸誘導体、ポリアクリロニトリル、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリ（メタ）アクリルアミド誘導体、ポリスルホン、セルロース、セルロース誘導体、ポリシリコーン、ポリメチルペンテン、ガラス、及び金属からなる群から選択される少なくとも一種が挙げられる。この中でもポリスチレンが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（第１の実施の形態）
　（装置構成）
　本発明の第１の実施の形態である細胞剥離装置を図１Ａ、図１Ｂに示す。
　細胞剥離装置は、振動発生部１０１として、振動子１２、振動板１１を備える。振動機構は、自身が伸縮する圧電材料を含む振動子１２と、振動子１２と接着された振動板１１との硬さの組み合わせによって振動を増幅させた屈曲振動を発生させるものである。振動機構は振動子の構造要因による共振を利用するもので、共振周波数で大きな振動を得ることができる。
　図１Ａ、図１Ｂでは、代表的な振動発生部１０１として、円環型振動子を記しているが、大振幅が得られるランジュバン振動子または矩形型振動子であっても構わない。
　共振によって振動板１１に形成した振動を、細胞を培養させた培養容器２１に効率的に伝達させるために、音響伝達媒体１３を振動板１１と培養容器２１の間に介在させる。直接、振動板１１に培養容器２１を設置すると、接触部が点接触となり、鳴き、発熱の発生など振動以外のエネルギーとして消費されるため効率悪化の要因となる。
　音響伝達媒体１３は、基本的には培養容器２１の底面に対して十分に広い面積で設置されていることが好ましい。具体的には、密着面積が３０％以上１００％未満であることが望ましい。ここで、密着面積とは、音響伝達媒体１３と培養容器２１とが接する領域の面積の、培養容器２１の底面の突出部２３より内側の領域の面積に対する割合である。１００％近い密着面積では、定在波モードの振動モードで、振動板１３で発生した振動による慣性力を受けた培養容器２１上の細胞の結合力を弱める効果から十分高い剥離率を得られるものであった。
　しかし、培養容器２１となる汎用品の各社容器には底面の形状のばらつきがあり、音響伝達媒体１３を培養容器２１の形状に倣わせても完全に密着させることができない場合がある。密着面積が少なくとも３０％であれば、進行波モードの振動モードを定在波モードと組み合わせることが有効である。進行波モードで剥離液に生じた径方向の大きな流れの流動による剪断応力によって、音響伝達媒体１３が直接接していない領域の細胞を剥離することが可能である。
　振動板１１及び振動子１２を固定するために、図１Ａ、図１Ｂの上カバー１８、下カバー１７、緩衝材１６、ボルト１９によって、振動板１１及び振動子１２の端部を挟み込む構造をとるが、端部の挟み込む圧力は振動板１１に発生する振動を阻害しない程度に締め付ける。非図示の緩衝材として、振動子１２と下カバー１７の間か、下カバー１７の下側に、フェルトまたはスポンジを含む部材を設けてもよい。非図示の緩衝材を設けることで、振動板１１及び振動子１２の振動が他の部材との接触によって低減されにくくすることができる。
　培養容器２１と音響伝達媒体１３との間に空気層が入ると超音波が反射するため、効率的に培養容器２１に振動が伝達されない。このため培養容器２１と音響伝達媒体１３との密着性を上げるために、培養容器上蓋２２上に円環形状の錘１５を設置する。錘１５の重量は６０ｍｍディッシュの場合、１００ｇから６００ｇであることが好ましい。錘１５が重過ぎると振動そのものを押さえつけ、阻害することの他に、培養容器２１自体が撓んでしまうことで振動伝達状態が不均一になり、剥離率低下の要因となる。この時、振動の絶縁性を考慮し、錘１５による荷重が好ましいが、振動を阻害しない程度であれば、バネや板バネによる荷重方法であっても構わない。
　共振周波数の電圧を供給する交流電源を用いて、培養容器２１の細胞培養面に所望の振動波形が形成できる振動モードの周波数で、かつ、所望の振幅が得られる電圧を、振動子１２に印可することで細胞剥離装置を駆動させる。この時、振動子１２に備えるセンサ相であるＳ相の電圧をオシロスコープで計測すると、振動子１２自身が歪むことで発生させた電圧を直接モニタすることができ、振動発生部１０１の振動状態を確認しながら駆動することができる。また、細胞剥離工程中の温度を計測できる熱電対を振動に影響ない箇所に設置することで、モニタしながら駆動させることができる。温度測定に赤外線温度計測器を用いても構わない。
　（振動板）
　本発明の一実施形態における振動発生部１０１に含まれる振動板１１は、ガラス、金属、及び石英からなる群から選択される少なくとも一種を含むことが好ましい。振動板１１に用いる金属は、ＳＵＳまたはアルミニウムであってもよい。振動板１１をガラス、金属、石英にすることで、破損することなく超音波領域の比較的高い駆動周波数で大きい振幅を出力することができる。
　円板形状の振動板１１と円環形状の振動子１２を備える振動発生部１０１の場合、振動板１１の外径寸法は振動子１２の外径寸法と等しいことが好ましい。振動子１２と振動板１１とが接着され、撓み振動した際に撓みの厚さ方向の中点、つまり撓みの際、引っ張り、圧縮のどちらもならない中立面が振動板側にあることが、振動子１２の歪を効率良く撓みに利用するために好ましい。
　また、振動板１１が、音響伝達媒体１３を振動板１１上に配置する位置を示すマーカー（ラベル、印刷、刻印など）を有していてもよい。振動板１１がマーカーを有することで、ユーザが適切な位置に音響伝達媒体１３を簡単に配置することができる。
　第１の実施の形態では、培養容器２１の突出部２３が振動板１１及び音響伝達媒体１３に接しない構造とする。図１Ａ、図１Ｂの概略図の通り、振動子１２、振動板１１、音響伝達媒体１３、及び培養容器２１をこの順に重ねて配置される方向（図１Ａ、図１Ｂのｙ方向）において突出部２３の位置を振動板１１に投影した位置を含む領域に、溝１４を設ける。これにより、直接振動板１１から培養容器２１へと振動が伝達されず、音響伝達媒体１３から培養容器２１の底面へのみ振動が伝達されることができる。
　培養容器２１の突出部２３と振動板１１が接しない、とは、実質的に培養容器２１の突出部２３が直接振動板１１の振動面と接触しないことであり、好ましくは前記突出部２３が中空にあることである。また、振動板１１の振動が突出部２３から培養容器２１に伝達されない程度の緩衝材があっても構わない。すなわち、音響伝達媒体と振動板との少なくともいずれかが緩衝材を介して突出部と接し、かつ音響伝達媒体と振動板とが緩衝材を介さずに突出部と接しないように細胞剥離装置が構成されていてもよい。緩衝材は、フェルトとスポンジの少なくともいずれかであることが好ましい。
　さらに言い換えれば、突出部と振動板とが最も近い位置における、突出部と振動板との間に存在する物質の比重が０より大きく０．９０より小さいことが望ましい。突出部と振動板との間に存在する物質の比重が０．９０より小さいことによって、振動が伝わりにくくなり、振動の干渉を低減することができる。突出部と振動板との間に存在する物質の比重は、０．８０より小さいことが望ましく、０．５０より小さいことが望ましい。
　ここで、比重は、例えば比重瓶法によって算出される。温度、圧力が一定の環境で、空の比重瓶の質量Ｗ０、水を充填した比重瓶の質量Ｗ１、及び試料を充填した比重瓶の質量Ｗを測定する。試料の比重Ｓは次の式で算出される。
Ｓ＝（Ｗ－Ｗ０）／（Ｗ１－Ｗ０）　　（式１）
　図１Ｂの（Ａ）に示す溝１４の深さは、突出部２３の長さ（図４（ｂ））よりも大きいことが好ましい。また、図１Ｂの（Ｂ）に示す溝１４の幅は、突出部２３の幅（図４（ｄ））よりも大きいことが好ましい。
　ここで、溝１４の深さとは、振動子、振動板、音響伝達媒体及び培養容器を重ねて配置される方向における溝１４の深さを指す。突出部２３の長さは、振動子、振動板、音響伝達媒体及び培養容器を重ねて配置される方向における突出部２３の長さを指す。また、溝１４の幅とは、振動子、振動板、音響伝達媒体及び培養容器を重ねて配置される方向に垂直な方向における溝１４の幅を指す。突出部２３の幅とは、振動子、振動板、音響伝達媒体及び培養容器を重ねて配置される方向に垂直な方向における突出部２３の幅を指す。
　具体的には、各培養容器の寸法一覧を示す表１に示すように、各培養容器２１の突出部２３の長さが０．５ｍｍから０．６ｍｍであることから、溝１４の深さは０．６ｍｍより大きい必要がある。また、溝１４の幅は突出部２３の幅である０．７ｍｍより広い必要があるが、培養容器２１を設置する位置精度を考慮し、３．０ｍｍ以上であることが好ましい。また、必要以上の溝１４の深さ、幅は振動板１１の強度低下や、所望の振動モードの振幅低下を招く恐れがあるため、溝１４の深さは１．５ｍｍより浅く、幅は７．０ｍｍより狭いことが好ましい。また、振動面と溝１４の上部境界部にはテーパが形成されてもよい。テーパを形成することで、培養容器２１が傾いた際に干渉しない効果や振動板１１に発生する応力集中を緩和させる効果がある。
　（音響伝達媒体）
　音響伝達媒体１３の要件として、振動を発生する振動板１１と振動を伝える対象の培養容器２１との整合が必要である。整合には音響インピーダンスなどの物性的な整合の他、密着性の機械的な整合も必要である。特に本発明に係る一実施形態の細胞剥離装置は、振動板１１の振動波形を培養容器２１の細胞培養面に形成するため、広い面積で密着できるように機械的な整合が重要である。
　培養容器２１として、市販のディッシュ型の容器を用いた場合、音響伝達媒体１３として荷重で容易に変形するグリセリンなどの低分子材料や水を用いることができる。このとき、培養容器２１を振動板１１上に重ねて配置したとき、培養容器２１の突出部２３が直接振動板１１に接触し、振動伝達経路が複数存在することになり、発生した振動が複雑化し、制御が困難となる場合があった。
　本発明に係る一実施形態の細胞剥離装置では、主体的に振動を制御するために、培養容器２１の突出部２３が直接接触しない。さらに、振動板１１の振動を効率良く培養容器２１底面に伝達させるために、培養容器２１を支持できる高分子材料のゴムやゲルを音響伝達媒体１３として用いた。用いることができる高分子材料は、具体的には、シリコーン樹脂、ウレタン樹脂、ジアリルフタレート樹脂、不飽和ポリエステル、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、ユリア樹脂、メラニン樹脂、及び天然ゴムからなる群から選択される少なくとも１種を含む材料である。また、駆動周波数の周波数帯域での減衰の少ない物性であることで伝達効率が高く、さらに音響伝達媒体自身の発熱が低減できることから、音響伝達媒体１３はシリコーンゴムを含むことが好ましい。
　表１より、各培養容器２１となる容器の底面形状が単純に平面でなく、反っていることが分かる。このことから、広い面積を密着させるためには音響伝達媒体１３は底面形状に倣う必要がある。すなわち、音響伝達媒体１３が培養容器２１と接する面は凸の曲面を含むことが望ましい。例えば、表１のＡＧＣテクノガラス社製Φ６０ｍｍディッシュの場合、底面の反りが０．１０ｍｍ～０．７０ｍｍである。この場合、例えば、図５の様な中凸形状であり、中央高さ（Ａ）が０．８ｍｍ、側面高さ（Ｂ）が０．４ｍｍ、直径（Ｃ）が４８ｍｍの硬度１０°の高分子材料であるシリコーンゴムを音響伝達媒体１３として用いる。このとき、密着面積は６０％となり、３００ｇの錘１５を載せた際、音響伝達媒体１３である高分子材料の潰れと培養容器２１の撓みによって、密着面積が９０％となる。
　広い密着面積とするために、音響伝達媒体１３の高分子材料の中心と培養容器２１の中心が重なることが好ましい。音響伝達媒体１３と培養容器２１との位置合わせを行う方法の例として、位置決め治具を後述するが、位置決め治具に限らず他の方法を用いてもよい。
　また、音響伝達媒体１３が培養容器２１と接する面の表面に凹凸があることが好ましい。表面に凹凸があることで、錘１５を載せたとき、凸部が潰れて結果として広い面積で密着することができる。さらに、高い細胞剥離性能を発揮した後、錘１５を取り除くと、音響伝達媒体１３と培養容器２１が容易に取り外せるといった効果もある。
　また、同様に取り外しを容易にする目的で、音響伝達媒体１３の高分子材料の培養容器に接触する面をフッ素コートしても構わない。
　また、音響伝達媒体１３は、細胞剥離状況を直接観察するためには、透明であることが好ましい。
　（振動子）
　第１の実施の形態では円環形状の振動子１２を用いたが、振動板１１を撓ませる振動子１２の形状は、円環形状、円板形状であっても構わない。細胞剥離状況を直接観察するためには、培養容器１１下部の視野を確保できる円環形状が好ましい。
　振動子１２は、分極処理を施すことで圧電特性を発揮するが、図６の通り、電極パターンに応じて分極の極性を変えて構わない。分極処理した振動子１２は、入力した交流電圧の位相を電極パターン毎に制御することで、定在波モード、進行波モードの振動モードを励振することができる。プラスに分極した電極に対して、マイナスに分極した電極に１８０度の位相差を付けた交流電圧を印加することで定在波が発生する。これに対し、図６の様に、左右にＡ相、Ｂ相と電極を分けたとき、Ａ相とＢ相の位相差を９０度にした交流電圧を印加すると、２相駆動の進行波が発生する。
　電極パターンは、Ａｇを印刷法で形成したが、電極材料にはＡｇの他、Ａｕ、Ｐｔ、Ｐｄ等の貴金属やＣｕ等の卑金属でも構わない。形成方法は印刷法、メッキ法、スパッタ法であっても構わない。
　振動発生部１０１に用いた振動子１２に含まれる圧電材料の組成はＰｂＺｒＴｉＯ３（ＰＺＴ）を用いたが、環境規制を考慮して実質的にＰｂを用いない非鉛圧電材料であることが好ましい。非鉛圧電材料には、主成分がＢａＴｉＯ３（ＢＴ）、ＮａＮｂＯ３、ＢｉＮａＴｉＯ３、及びＢｉＦｅＯ３からなる群から選択される少なくとも一種が挙げられ、それぞれの組み合わせや、主成分に金属元素が添加されていても構わない。特に、ＢａＴｉＯ３（ＢＴ）系材料で、ＰｂＺｒＴｉＯ３（ＰＺＴ）と同等の振動性能を確認した。また、セラミックス以外の材料として、単結晶材料、高分子系圧電材料でも構わない。
　接着された振動子１２と振動板１１が、撓み振動した際に、撓みの厚さ方向の中点、つまり、撓みの際、引っ張り、圧縮のどちらともならない中立面が振動板１１側にあることが、振動子１２の歪を効率良く撓みに利用するために好ましい。このため、振動子１２と振動板１１の厚さの組み合わせは、振動子１２の硬さと振動板１１の硬さの関係に基づいて設定した。
　（位置決め治具）
　細胞剥離装置に培養容器２１を設置する際、培養容器２１の中心と細胞剥離装置の振動板１１および音響伝達媒体１３の中心を一致させることで、底面に反りのある培養容器２１であっても音響伝達媒体１３との間に空気層の無い密着状態を形成することができる。
　図１Ａ、図１Ｂ及び図３Ａ、図３Ｂに示すように、培養容器２１の外周部を位置決めピン２４で突き当て、中心を位置合わせすることができる。また、図７Ａ、図７Ｂのように、中心位置が決められている円環状の保持リング２５に培養容器２１を設置してもよい。Ｚ軸ステージブラケット２６のダイヤル２７で上下に移動することで、位置決め治具１０２の底板２８の台座用位置決め２９で位置出しされた音響伝達媒体３１の中心に対し、正確に培養容器２１を設置することができる。
　位置決め治具を用いずに正確に音響伝達媒体と振動板１１の中心が一致していない場合、培養容器２１の突出部２３が振動板１１に駆動中に接触する可能性がある。この時、振動板１１に形成された振動波形が低減され細胞剥離に要する振動振幅が得られず、剥離率の低下の要因となる。
　（装置駆動）
　細胞剥離装置で形成できる振動波形は、円板状の振動板１１の中心から同心円状に形成される定在波モードと、振動子１２を径方向に位相を変えて振動させることで、振動板１１上に径方向の振動波形を形成する進行波モードがある。それぞれ振動子１２に共振周波数で電圧を印可することで振動波形が形成でき、その共振周波数、振動波形形状は振動子１２の形状と硬さ、密度などの材料物性値を用いた構造計算で算出した。
　細胞剥離で用いることができる振動波形は培養容器２１の細胞培養面を一定の振幅、例えば１μｍの振幅で振動することができるものであれば、利用することができる。基本的に、低周波から高周波まで、例えば超音波領域では２０ｋＨｚから１５０ｋＨｚまで周波数掃引した際に、共振する振動が検出できる。低周波側で検出した振動は振幅が大きいが加速度は小さい。これに対し、高周波側で検出した振動は、振幅が小さいが加速度は大きい。
　培養容器２１に対する培養細胞の接着力を弱める力を付与する条件は、細胞の接着力、細胞のサイズや形状によるところが大きい。さらに、剥離液に生じる流動についても振幅、加速度によって異なるため、様々な組み合わせが存在する。また、単純に大きな振幅、大きな加速度では、細胞の生存率を低下させる要因となるキャビテーションの発生を促進することから好ましくない。
　また、振動子１２を連続駆動すると振動子１２自身の発熱から共振周波数が低周波側にシフトするため、周波数を固定して駆動し続けると振幅が小さくなる。このため、一定時間振幅させた後、休止時間を設け、自己発熱による温度上昇を低減する駆動方法を用いて駆動させることで十分な振幅を得ることができる。あるいは、一定の周波数幅で高周波側から低周波側へ掃引を繰り返し、たとえ発熱しても必ず共振周波数を経る駆動方法を用いて駆動させることで十分な振幅を得ることができる。
　（振動子振動評価）
　細胞剥離装置の振動板の振動波形はレーザードップラー振動計（グラフテック社ＡＴ７２００）で計測することができる。振動波形を計測するためには、所望の共振周波数、電圧で細胞剥離装置を駆動し、振動板１１表面をレーザーでＸＹ方向の２次元的にスキャンする。このとき、例えば振動板１１表面を１ｍｍ間隔でスキャンする。スキャンによって、各点の振動速度が得られ、計算よりＺ方向の振幅を算出することができる。この結果、振動板１１の振動波形を３次元的に構成することができ、駆動時の振動の振幅の大きい腹と振動しない節の位置を動的に把握することができる。振動板表面のうち、振動の振幅が極大になる位置を腹部、振動の振幅が局所になる位置を節部とする。
　培養容器２１の細胞培養面の振動計測も同様の構成で計測することができる。このとき、振動板１１上に音響伝達媒体１３を設置する。また、培養容器２１をレーザーが反射するように金属、例えばＡｇを蒸着法で培養容器２１内面に成膜する。培養容器２１と音響伝達媒体１３との間に空気層が入らないようにし、設置する必要がある。この時、前記空気層を入れない方法として、真空チャンバーで真空引きしても構わない。
　細胞剥離装置を駆動させる目的の共振が、培養容器２１が同心円に振幅する定在波モードである場合、目的の共振周波数付近で掃引し、培養容器２１の中央部の振幅を測定する。さらに、最も振幅の大きい周波数で培養容器２１の培養面全体を２次元的にスキャンすることで、培養容器２１の培養面に発生した振動波形を３次元的に把握できる。
　（細胞の培養条件）
　細胞の培養条件は、培養する細胞に従って適宜選択し得る。一般的には、培養容器２１内に適切な培地を添加し、そこに１．０×１０１～５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２程度の細胞を播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養する。この際、培養容器２１中の細胞占有面積率が７～８割程度、いわゆるサブコンフルエントの状態になるまで培養するのが好ましい。なお、細胞が培養面を覆ったコンフルエント状態になるまで培養し、シート状に培養された状態（細胞シート）であっても構わない。
　（剥離試験）
　細胞剥離装置は、様々な種類の細胞に適用することができる。細胞には、例えばチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞、マウス結合組織Ｌ９２９細胞、マウス骨格筋筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞）、ヒト胎児肺由来正常二倍体線維芽細胞（ＴＩＧ－３細胞）、ヒト胎児腎臓由来細胞（ＨＥＫ２９３細胞）、ヒト肺胞基底上皮腺癌由来Ａ５４９細胞、ヒト子宮頸癌由来ＨｅＬａ細胞、上皮細胞、内皮細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、ニューロン細胞、グリア細胞、繊維芽細胞、肝実質細胞、肝非実質細胞、脂肪細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、胚性癌（ＥＣ）細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、皮膚幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、各組織の前駆細胞、及びそれらから分化誘導した細胞からなる群から選択される少なくとも一種が挙げられる。
　細胞剥離工程では、細胞を培養する工程で用いた培養液を、剥離液に置換する必要がある。剥離液は、通常、タンパク質分解酵素を含有している。タンパク質分解酵素として、例えばトリプシン、アキュターゼ、コラゲナーゼ、天然プロテアーゼ、キモトリプシン、エラスターゼ、パパイン、プロナーゼ、及びそれらの組み換え体からなる群から選択される少なくとも一種が挙げられる。しかし、タンパク質分解酵素が細胞の有する膜タンパク質を分解する可能性が懸念される。膜タンパク質が分解されることで、細胞の接着性などの特性が低下する可能性がある。これに対し、本件の細胞剥離手法では、タンパク質分解酵素を用いない、またはタンパク質分解酵素を用いても極少量のタンパク質分解酵素で同様の効果を発揮することから、細胞の膜タンパク質の分解を低減する効果がある。細胞の膜タンパク質を減少しにくくするために剥離液に培地成分が含まれていても構わない。
　培養液を剥離液に交換した培養容器２１を細胞剥離装置へ設置し、保温機内で一定温度、例えば３７℃で保持した状態で細胞剥離装置を駆動する。細胞剥離装置は細胞剥離に十分な長さの駆動時間で駆動する。細胞剥離装置の駆動後、スポイトで剥離した細胞を回収し、培養容器２１に接着している細胞をピペッティング法で回収する。剥離率は、細胞剥離装置の振動による剥離細胞数とピペッティング法による剥離細胞数との合算数に対する、細胞剥離装置の振動による剥離細胞数の割合である。生存率は、細胞剥離装置の振動により回収した細胞の中で、生存している細胞の割合である。また、細胞剥離後の培養容器２１の底面に残った残細胞をバックライトによる散乱光を用いて観察することができる。
　（実施例１）
　以下に第１の実施の形態の実施例１を示す。
　実施例１には、図１Ａ、図１Ｂの細胞剥離装置を用いた。培養容器２１には、表１のコーニング社製Φ６０ｍｍディッシュを用いた。細胞剥離装置の振動板１１は、外径が７０ｍｍ、厚さが４ｍｍであり、培養容器２１の突出部２３が接触しないように溝１４を形成したガラスを用いた。溝１４の寸法は、内径５０ｍｍ、幅５ｍｍ、深さ１ｍｍとした。振動子１２に含まれる圧電材料の材料組成はＰＺＴ、外径は振動板と同じ７０ｍｍ、内径は５７ｍｍであり、厚さは中立面が振動板１１側にあることを考慮し、２ｍｍとした。振動板１１上には、音響伝達媒体１３として、中央高さ（Ａ）が０．９ｍｍ、側面高さ（Ｂ）が０．４ｍｍ、直径（Ｃ）が４８ｍｍの中凸円板形状の硬度３０°のシリコーンゴムを配置した。なお、ここでの音響伝達媒体１３の寸法は図５に示す箇所の寸法である。
　図１Ａ、図１Ｂのように細胞剥離装置を組立て、振動板１１上に配置したシリコーンゴム上に、細胞を培養した培養容器２１であるコーニング社製Φ６０ｍｍディッシュを配置した。このとき、位置決めピン２４でディッシュの中心を音響伝達媒体１３の中心と位置合わせをしながらディッシュを配置した。この時、音響伝達媒体と培養容器との密着面積は３０％であった。なお、密着面積とは、音響伝達媒体１３と培養容器２１とが接する領域の面積の、培養容器２１の底面の突出部２３より内側の領域の面積に対する割合である。
　細胞の培養では、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈａｍｓｔｅｒ　Ｏｖａｒｙ）細胞をコーニング社製Φ６０ｍｍディッシュに１００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養した。培地はＨａｍ’ｓ　Ｆ１２（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にＦｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ（シグマアルドリッチ社製）を１０％、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００００Ｕ／ｍｌ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を１％添加したものを用いた。培養は４８時間行ない、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、細胞接着ならびに増殖を確認した。ディッシュの細胞占有面積率は８割程度であった。
　（細胞の剥離）
　ディッシュ内の培地を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（－）、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）で洗浄した。その後、剥離液としてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（－）、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）をディッシュ内に添加し、３分間浸漬させた。
　その後、培養容器を細胞剥離装置に配置し、環境温度３７℃において定在波モードで１分３０秒間周波数掃引振動（周波数２２－２７ｋＨｚ、周波数掃引周期１ｓ、電圧１００Ｖ）で細胞を剥離させた。その後、位相を切り替え、進行波モードで１分３０秒間周波数掃引振動（周波数２２－２７ｋＨｚ、周波数掃引周期１ｓ、電圧１００Ｖ）で細胞の剥離を行った。
　剥離した細胞は回収した後、血球計算盤を用いて細胞数の測定及びトリパンブルー染色による生死判別法を用いて生存率を算出した。はじめに、剥離した細胞の懸濁液と０．４％トリパンブルー溶液を１：１で混合し、懸濁液に含まれる死細胞を染色した。続いて、懸濁液を血球計算盤（ＮａｎｏＥｎｔｅｋ製、ＤＨＣ－Ｎ０１）に注入し、血球計算盤のグリッド上にある生細胞および死細胞の数を顕微鏡観察によりカウントした。細胞剥離装置の振動によって剥離された細胞において、カウントされた生細胞数の全細胞数に対する割合を算出し、生存率とした。
　また、超音波剥離後のディッシュに対して、セルスクレーパーを用いて超音波で剥離できなかった細胞も全て剥離した。剥離した細胞の懸濁液を血球計算盤（ＮａｎｏＥｎｔｅｋ製、ＤＨＣ－Ｎ０１）に注入し、顕微鏡観察することによって、剥離された細胞の数を測定した。超音波で剥離した全細胞数とその後セルスクレーパーで剥離した細胞数を合わせて総剥離細胞数とし、総剥離細胞数に対する超音波剥離細胞数の割合を剥離率と定義し、算出した。結果、生存率は９８．５％、剥離率は９４．９％であった。なお、生存率、剥離率ともに９０％以上を良好と判断した。
　（第２の実施の形態）
　図２Ａ、図２Ｂの概略図は、培養容器２１の突出部２３に接触しない外形寸法の振動板１１を有する細胞剥離装置である。第２の実施の形態において、図２Ｂの（Ａ）に示す振動板１１の直径は、図２Ｂの（Ｂ）に示す培養容器２１の内径よりも小さいことが望ましい。ここで、振動子、振動板、音響伝達媒体及び培養容器が重ねて配置される方向に垂直な平面内における振動板１１の断面は、円形であり、振動板１１の直径とは、前記断面の直径を指す。
　培養容器２１の突出部２３と振動板１１が接しない、とは、実質的に培養容器２１の突出部２３が直接振動板１１の振動面と接触しないことであり、好ましくは前記突出部２３が中空にあることである。また、振動板１１の振動が突出部２３から培養容器２１に伝達されない程度の緩衝材があっても構わない。すなわち、音響伝達媒体と振動板との少なくともいずれかが緩衝材を介して突出部と接し、かつ音響伝達媒体と振動板とが緩衝材を介さずに突出部と接しないように細胞剥離装置が構成されていてもよい。緩衝材は、フェルトとスポンジの少なくともいずれかであることが好ましい。
　さらに言い換えれば、突出部と振動板とが最も近い位置における、突出部と振動板との間に存在する物質の比重が０より大きく０．９０より小さいことが望ましい。突出部と振動板との間に存在する物質の比重が０．９０より小さいことによって、振動が伝わりにくくなり、振動の干渉を低減することができる。突出部と振動板との間に存在する物質の比重は、０．８０より小さいことが望ましく、０．５０より小さいことが望ましい。
　例えば、表１のサーモフィッシャーサイエンティフィック社製のΦ６０ｍｍディッシュでは、培養容器の内径が５２．２ｍｍであるため、振動板外径がΦ５０ｍｍ以下であれば、振動板と突出部２３が実質的に接触することがない。すなわち、ディッシュ底面の内、ディッシュ底面の外周部にある突出部２３の内側の領域の直径よりも振動板の外径が小さいことで、振動板１１と突出部２３が直接接することを防ぐことができる。
　なお、突出部２３がディッシュ底面に略円形に設けられており振動板１１が円板状である場合について説明したが、突出部２３と振動板１１の形状はこれらに限られず、振動板１１と突出部２３とが重ならなければよい。すなわち、振動子、振動板、音響伝達媒体及び培養容器が重ねて配置される方向（図２Ａ、図２Ｂのｙ方向）において突出部の位置を振動板が存在する面に投影した位置と、振動板が重ならなければよい。このような構造では、細胞剥離処理後に直接培養容器下部を持ち上げ、培養容器を細胞剥離装置から容易に取り外すことを可能とする。
　（実施例２）
　実施例２では、培養容器２１には、表１のサーモフィッシャーサイエンティフィック社製ＮｕｎｃΦ６０ｍｍディッシュを用いた。細胞剥離装置の振動板１１として、外径５０ｍｍ、厚さ２ｍｍである、突出部２３と接触しないガラス板を用いた。振動子１２に含まれる圧電材料の主成分はＢａＴｉＯ３、外径は振動板と同じ５０ｍｍ、内径は３７ｍｍ、厚さは中立面が振動板１１側にあることを考慮し、１ｍｍとした。振動板１１上には、音響伝達媒体１３として、中央高さ（Ａ）が０．８ｍｍ、側面高さ（Ｂ）が０．４ｍｍ、直径（Ｃ）が４８ｍｍの中凸円板形状の硬度１０°のシリコーンゴムを配置した。なお、ここでの音響伝達媒体１３の寸法は、図５に示す箇所の寸法である。図２Ａ、図２Ｂのように細胞剥離装置を組立て、振動板１１上に設置したシリコーンゴム上に、細胞を培養した培養容器２１であるＮｕｎｃΦ６０ｍｍディッシュを設置した。このとき、位置決め治具１０２を用いて音響伝達媒体１３の中心と培養容器２１の中心とを位置合わせして、培養容器２１を設置した。この時、音響伝達媒体１３と培養容器２１との密着面積は８５％であった。なお、密着面積とは、音響伝達媒体１３と培養容器２１とが接する領域の面積の、培養容器２１の底面の突出部２３より内側の領域の面積に対する割合である。
　（細胞の剥離）
　ディッシュ内の培地を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（－）、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）で洗浄した。その後、剥離液としてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（－）、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）をディッシュ内に添加し、３分間浸漬させた。
　その後、培養容器を細胞剥離装置に設置し、環境温度３７℃において定在波モードで３分間周波数掃引振動（周波数２２－２７ｋＨｚ、周波数掃引周期１ｓ、電圧１００Ｖ）で細胞の剥離を行った。
　剥離細胞検査は実施例１と同様の方法で行った。結果、生存率は９８．０％、剥離率は９５．７％であった。なお、生存率、剥離率ともに９０％以上を良好と判断した。
　（第３の実施の形態）
　図３Ａ、図３Ｂの概略図は、培養容器２１を音響伝達媒体１３の上に重ねて配置した際に、音響伝達媒体１３の厚さが突出部２３の長さよりも大きいことで、振動板１１と突出部２３とが接しないように構成された細胞剥離装置の概略図である。
　培養容器２１の突出部２３と振動板１１が接しない、とは、実質的に培養容器２１の突出部２３が直接振動板１１の振動面と接触しないことであり、好ましくは前記突出部２３が中空にあることである。また、振動板１１の振動が突出部２３から培養容器２１に伝達されない程度の緩衝材があっても構わない。すなわち、音響伝達媒体と振動板との少なくともいずれかが緩衝材を介して突出部と接し、かつ音響伝達媒体と振動板とが緩衝材を介さずに突出部と接しないように細胞剥離装置が構成されていてもよい。緩衝材は、フェルトとスポンジの少なくともいずれかであることが好ましい。
　さらに言い換えれば、突出部と振動板とが最も近い位置における、突出部と振動板との間に存在する物質の比重が０より大きく０．９０より小さいことが望ましい。突出部と振動板との間に存在する物質の比重が０．９０より小さいことによって、振動が伝わりにくくなり、振動の干渉を低減することができる。突出部と振動板との間に存在する物質の比重は、０．８０より小さいことが望ましく、０．５０より小さいことが望ましい。
　第３の実施の形態において、図３Ｂの（Ａ）に示す、培養容器２１を音響伝達媒体１３の上に配置した際の音響伝達媒体１３の厚さは、図３Ｂの（Ｂ）に示す培養容器２１の突出部２３の長さよりも大きいことが望ましい。培養容器２１を音響伝達媒体１３の上に重ねて配置すると音響伝達媒体１３が押し潰れるが、その際の音響伝達媒体１３の厚さが培養容器２１の突出部２３の長さよりも大きい場合、振動板１１に直接接触することがない。ここで、音響伝達媒体の厚さとは、振動子、振動板、音響伝達媒体及び培養容器を重ねて配置される方向における、音響伝達媒体の厚さを指す。音響伝達媒体１３自体の体積が大きくなると振動の伝達効率が低くなる恐れがあることから、使用する音響伝達媒体１３の硬度が高いことが好ましい。
　培養容器２１の突出部２３が振動板１１に接しない構造とするために、各社培養容器２１の突出部２３の長さが０．５ｍｍであることと、細胞剥離工程での錘１５による荷重とを考慮して、音響伝達媒体１３の厚さを決定する。振動板１１上に設けた音響伝達媒体１３の厚さは、０．８ｍｍ以上であることが好ましい。また、超音波透過性を考慮すると高分子材料では振動の減衰が大きいことから、音響伝達媒体１３の厚さは１．５ｍｍ以下であることが好ましい。
　（実施例３）
　実施例３では、培養容器２１には、表１のＡＧＣテクノガラス社製ＩｗａｋｉΦ６０ｍｍディッシュを用いた。細胞剥離装置の振動板１１は、外径７０ｍｍ、厚さ４ｍｍ、材質には石英を用いた。振動子１２に含まれる圧電材料の材料組成はＰＺＴ、外径は振動板１１と同じ７０ｍｍ、内径は５７ｍｍ、厚さは、中立面が振動板１１側にあることを考慮し、２ｍｍとした。振動板１１上には、音響伝達媒体１３として、中央高さ（Ａ）が０．７ｍｍ、側面高さ（Ｂ）が０．３ｍｍ、直径（Ｃ）が４８ｍｍの中凸円板形状の硬度５０°のウレタンを設置した。なお、ここでの音響伝達媒体１３の寸法は図５に示す箇所の寸法である。図１Ａ、図１Ｂのように細胞剥離装置を組立て、振動板１１上に設置したウレタン上に、細胞を培養した培養容器２１のＩｗａｋｉΦ６０ｍｍディッシュを設置した。このとき、位置決めピン２４で培養容器２１の中心を音響伝達媒体１３の中心と位置合わせをしながら、培養容器２１を設置した。音響伝達媒体１３と培養容器２１との密着面積は９７％であった。なお、密着面積とは、音響伝達媒体１３と培養容器２１とが接する領域の面積の、培養容器２１の底面の突出部２３より内側の領域の面積に対する割合である。
　ＣＨＯ細胞の培養、細胞剥離工程、剥離細胞検査は実施例２と同様の方法で行った。
　結果、生存率は９９．０％、剥離率は９３．０％であった。なお、生存率、剥離率ともに９０％以上を良好と判断した。
　本発明の実施形態は、記憶媒体に記録されたコンピュータ実行可能命令（例えば、１つ以上のプログラム）を読み出して実行するシステムまたは装置（例えば、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ））のコンピュータによって、上記実施形態の１つまたは複数の機能を実行することによって、および／または、上記実施形態の１つまたは複数の機能を実行する１つまたは複数の回路を含むシステムまたは装置のコンピュータによって、および、例えば、上記実施形態の１つまたは複数の機能を実行するために、記憶媒体からコンピュータ実行可能命令を読み出して実行することによって、および／または、上記実施形態の１つまたは複数の機能を実行するために１つまたは複数の回路を制御することによって、システムまたは装置のコンピュータによって実行される方法によって実現することもできる。コンピュータは、１つ以上のプロセッサ（例えば、中央処理装置（ＣＰＵ）、マイクロ処理装置（ＭＰＵ））を含むことができ、コンピュータ実行可能命令を読み出して実行するために、別個のコンピュータまたは別個のプロセッサのネットワークを含むことができる。コンピュータ実行可能命令は、例えば、ネットワークまたは記憶媒体からコンピュータに提供されてもよい。記憶媒体は、例えば、ハードディスク、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、分散コンピューティングシステムの記憶装置、光ディスク（コンパクトディスク（ＣＤ）、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、ブルーレイディスク（ＢＤ）など）、フラッシュメモリデバイス、メモリカードなどのうちの１つ以上を含み得る。
　本実施形態の開示は、以下の構成及び方法を含む。
　（構成１）
　細胞の培養容器の培養面の上に設けられた細胞に振動を付与することによって前記細胞を剥離する細胞剥離装置であって、
　前記細胞剥離装置は、振動子と振動板とを有し、
　前記培養容器は、前記培養面とは反対側の面に突出部を有し、
　前記振動子、前記振動板、音響伝達媒体、及び前記培養容器がこの順に重ねて配置される際に、前記音響伝達媒体及び前記振動板が前記突出部と接しないように前記細胞剥離装置が構成されていることを特徴とする細胞剥離装置。
　（構成２）
　前記振動子、前記振動板、前記音響伝達媒体、及び前記培養容器がこの順に重ねて配置される際に、前記音響伝達媒体と前記振動板との少なくともいずれかが緩衝材を介して前記突出部と接するように前記細胞剥離装置が構成されていることを特徴とする構成１に記載の細胞剥離装置。
　（構成３）
　前記緩衝材は、フェルトまたはスポンジの少なくともいずれかを含むことを特徴とする構成２に記載の細胞剥離装置。
　（構成４）
　前記振動は超音波帯域の振動であることを特徴とする構成１乃至３のいずれか一項に記載の細胞剥離装置。
　（構成５）
　前記振動子、前記振動板、前記音響伝達媒体、及び前記培養容器がこの順に重ねて配置される際に、前記重ねて配置される方向において前記突出部の位置を前記振動板に投影した位置を含む領域に、前記振動板が溝を有することを特徴とする構成１乃至４のいずれか一項に記載の細胞剥離装置。
　（構成６）
　前記重ねて配置される方向における前記溝の深さは、前記重ねて配置される方向における前記突出部の長さよりも大きいことを特徴とする構成５に記載の細胞剥離装置。
　（構成７）
　前記重ねて配置される方向における前記溝の幅は、前記重ねて配置される方向に垂直な方向における前記突出部の幅よりも広いことを特徴とする構成５または構成６に記載の細胞剥離装置。
　（構成８）
　前記振動子、前記振動板、前記音響伝達媒体、及び前記培養容器がこの順に重ねて配置される際に、前記重ねて配置される方向において、前記突出部の位置を前記振動板が存在する面に投影した位置と、前記振動板が重ならないことを特徴とする構成１乃至４のいずれか一項に記載の細胞剥離装置。
　（構成９）
　前記重ねて配置される方向に垂直な平面内において、前記振動板の断面は円形であり、
　前記振動板の断面の外径は、前記培養容器の前記培養面とは反対側の面のうち前記突出部より内側の領域の直径より、小さいことを特徴とする構成８に記載の細胞剥離装置。
　（構成１０）
　前記振動板はガラス、金属、及び石英からなる群から選択される少なくとも一種を含むことを特徴とする構成１乃至９のいずれか一項に記載の細胞剥離装置。
　（構成１１）
　前記重ねて配置される方向における、前記培養容器を前記音響伝達媒体に重ねて配置した際の前記音響伝達媒体の厚さは、前記重ねて配置される方向における、前記突出部の高さよりも大きいことを特徴とする構成１乃至１０のいずれか一項に記載の細胞剥離装置。
　（構成１２）
　前記振動子、前記振動板、前記音響伝達媒体、及び前記培養容器がこの順に重ねて配置される際の、前記培養容器の前記培養面とは反対側の面のうち前記突出部より内側の領域の面積に対する、前記培養容器が前記音響伝達媒体と接する領域の面積の割合は、３０％以上１００％未満であるように前記細胞剥離装置が構成されていることを特徴とする構成１乃至１１のいずれか一項に記載の細胞剥離装置。
　（構成１３）
　前記音響伝達媒体の前記培養容器と接する面は、凸の曲面を含むことを特徴とする構成１乃至１２のいずれか一項に記載の細胞剥離装置。
　（構成１４）
　前記音響伝達媒体の前記培養容器と接する面が表面に凹凸を有することを特徴とする構成１乃至１３のいずれか一項に記載の細胞剥離装置。
　（構成１５）
　前記音響伝達媒体は、高分子材料を含むことを特徴とする構成１乃至１４のいずれか一項に記載の細胞剥離装置。
　（構成１６）
　前記高分子材料は、シリコーン樹脂、ウレタン樹脂、ジアリルフタレート樹脂、不飽和ポリエステル、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、ユリア樹脂、メラニン樹脂及び天然ゴムで構成される群から選択される少なくとも一種を含むことを特徴とする構成１５に記載の細胞剥離装置。
　（構成１７）
　前記高分子材料はシリコーンゴムを含むことを特徴とする構成１５または１６に記載の細胞剥離装置。
　（構成１８）
　細胞の培養容器の培養面に設けられた細胞に振動を付与することによって前記細胞を剥離する細胞剥離装置であって、
　前記細胞剥離装置は、振動子と振動板とを有し、
　前記振動子、前記振動板、音響伝達媒体、及び前記培養容器がこの順に重ねて配置される際に、
　前記培養容器は、前記培養面とは反対側の面に突出部を有し、
　前記突出部と前記振動板とが最も近い位置における前記突出部と前記振動板との間に存在する物質の比重は０より大きく０．９０より小さいことを特徴とする細胞剥離装置。
　（方法１）
　細胞の培養容器の培養面の上に設けられた細胞に振動を付与することによって前記細胞を剥離する細胞剥離方法であって、
　前記培養面とは反対側の面に突出部を有する前記培養容器と音響伝達媒体と振動子と振動板とを有する細胞剥離装置とを用いて、前記振動子、前記振動板、前記音響伝達媒体、及び前記培養容器がこの順に重ねて配置された状態で、前記細胞に振動を付与し、
　前記音響伝達媒体及び前記振動板が前記突出部と接しない状態で、前記細胞に振動を付与することを特徴とする細胞剥離方法。
　（方法２）
　細胞の培養容器の培養面の上に設けられた細胞に振動を付与することによって前記細胞を剥離する細胞剥離方法であって、
　前記培養容器の前記培養面とは反対側の面に突出部を有する前記培養容器と、音響伝達媒体と、振動子及び振動板を有する細胞剥離装置とを用いて、前記振動子、前記振動板、前記音響伝達媒体、及び前記培養容器がこの順に重ねて配置された状態で、前記細胞に振動を付与し、
　前記突出部と前記振動板とが最も近い位置における前記突出部と前記振動板との間に存在する物質の比重は０より大きく０．９０より小さい状態で、前記細胞に振動を付与することを特徴とする細胞剥離方法。
　本発明は上記実施の形態に制限されるものではなく、本発明の精神及び範囲から離脱することなく、様々な変更及び変形が可能である。従って、本発明の範囲を公にするために以下の請求項を添付する。
　本願は、２０２２年１１月１日提出の日本国特許出願特願２０２２－１７５８０７を基礎として優先権を主張するものであり、その記載内容の全てをここに援用する。
　１１　振動板
　１２　振動子
　１３　音響伝達媒体
　１４　溝
　１５　錘
　１６　緩衝材
　１７　下カバー
　１８　上カバー
　１９　ボルト
　２１　培養容器
　２２　培養容器上蓋
　２３　突出部
　２４　位置決めピン
　２５　保持リング
　２６　Ｚ軸ステージブラケット
　２７　ダイヤル
　２８　底板
　２９　台座用位置決め
　１０１　振動発生部
　１０２　位置決め治具

Claims (20)

  1. 　細胞の培養容器の培養面の上に設けられた細胞に振動を付与することによって前記細胞を剥離する細胞剥離装置であって、
    　前記細胞剥離装置は、振動子と振動板とを有し、
    　前記培養容器は、前記培養面とは反対側の面に突出部を有し、
    　前記振動子、前記振動板、音響伝達媒体、及び前記培養容器がこの順に重ねて配置される際に、前記音響伝達媒体及び前記振動板が前記突出部と接しないように前記細胞剥離装置が構成されていることを特徴とする細胞剥離装置。
  2. 　前記振動子、前記振動板、前記音響伝達媒体、及び前記培養容器がこの順に重ねて配置される際に、前記音響伝達媒体と前記振動板との少なくともいずれかが緩衝材を介して前記突出部と接するように前記細胞剥離装置が構成されていることを特徴とする請求項１に記載の細胞剥離装置。
  3. 　前記緩衝材は、フェルトまたはスポンジの少なくともいずれかを含むことを特徴とする請求項２に記載の細胞剥離装置。
  4. 　前記振動は超音波帯域の振動であることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞剥離装置。
  5. 　前記振動子、前記振動板、前記音響伝達媒体、及び前記培養容器がこの順に重ねて配置される際に、前記重ねて配置される方向において前記突出部の位置を前記振動板に投影した位置を含む領域に、前記振動板が溝を有することを特徴とする請求項１または２に記載の細胞剥離装置。
  6. 　前記重ねて配置される方向における前記溝の深さは、前記重ねて配置される方向における前記突出部の長さよりも大きいことを特徴とする請求項５に記載の細胞剥離装置。
  7. 　前記重ねて配置される方向における前記溝の幅は、前記重ねて配置される方向に垂直な方向における前記突出部の幅よりも広いことを特徴とする請求項５に記載の細胞剥離装置。
  8. 　前記振動子、前記振動板、前記音響伝達媒体、及び前記培養容器がこの順に重ねて配置される際に、前記重ねて配置される方向において、前記突出部の位置を前記振動板が存在する面に投影した位置と、前記振動板が重ならないことを特徴とする請求項１または２に記載の細胞剥離装置。
  9. 　前記重ねて配置される方向に垂直な平面内において、前記振動板の断面は円形であり、
    　前記振動板の断面の外径は、前記培養容器の前記培養面とは反対側の面のうち前記突出部より内側の領域の直径より、小さいことを特徴とする請求項８に記載の細胞剥離装置。
  10. 　前記振動板はガラス、金属、及び石英からなる群から選択される少なくとも一種を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の細胞剥離装置。
  11. 　前記培養容器を前記音響伝達媒体に重ねて配置した際の、前記重ねて配置される方向における前記音響伝達媒体の厚さは、前記重ねて配置される方向における前記突出部の高さよりも大きいことを特徴とする請求項１または２に記載の細胞剥離装置。
  12. 　前記振動子、前記振動板、前記音響伝達媒体、及び前記培養容器がこの順に重ねて配置される際の、前記培養容器の前記培養面とは反対側の面のうち前記突出部より内側の領域の面積に対する、前記培養容器が前記音響伝達媒体と接する領域の面積の割合は、３０％以上１００％未満であるように前記細胞剥離装置が構成されていることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞剥離装置。
  13. 　前記音響伝達媒体の前記培養容器と接する面は、凸の曲面を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の細胞剥離装置。
  14. 　前記音響伝達媒体の前記培養容器と接する面が表面に凹凸を有することを特徴とする請求項１または２に記載の細胞剥離装置。
  15. 　前記音響伝達媒体は、高分子材料を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の細胞剥離装置。
  16. 　前記高分子材料は、シリコーン樹脂、ウレタン樹脂、ジアリルフタレート樹脂、不飽和ポリエステル、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、ユリア樹脂、メラニン樹脂及び天然ゴムで構成される群から選択される少なくとも一種を含むことを特徴とする請求項１５に記載の細胞剥離装置。
  17. 　前記高分子材料はシリコーンゴムを含むことを特徴とする請求項１６に記載の細胞剥離装置。
  18. 　細胞の培養容器の培養面に設けられた細胞に振動を付与することによって前記細胞を剥離する細胞剥離装置であって、
    　前記細胞剥離装置は、振動子と振動板とを有し、
    　前記振動子、前記振動板、音響伝達媒体、及び前記培養容器がこの順に重ねて配置される際に、
    　前記培養容器は、前記培養面とは反対側の面に突出部を有し、
    　前記突出部と前記振動板とが最も近い位置における前記突出部と前記振動板との間に存在する物質の比重は０より大きく０．９０より小さいことを特徴とする細胞剥離装置。
  19. 　細胞の培養容器の培養面の上に設けられた細胞に振動を付与することによって前記細胞を剥離する細胞剥離方法であって、
    　前記培養面とは反対側の面に突出部を有する前記培養容器と音響伝達媒体と振動子と振動板とを有する細胞剥離装置とを用いて、前記振動子、前記振動板、前記音響伝達媒体、及び前記培養容器がこの順に配置された状態で、前記細胞に振動を付与し、
    　前記音響伝達媒体及び前記振動板が前記突出部と接しない状態で、前記細胞に振動を付与することを特徴とする細胞剥離方法。
  20. 　細胞の培養容器の培養面の上に設けられた細胞に振動を付与することによって前記細胞を剥離する細胞剥離方法であって、
    　前記培養容器の前記培養面とは反対側の面に突出部を有する前記培養容器と、音響伝達媒体と、振動子及び振動板を有する細胞剥離装置とを用いて、前記振動子、前記振動板、前記音響伝達媒体、及び前記培養容器がこの順に重ねて配置された状態で、前記細胞に振動を付与し、
    　前記突出部と前記振動板とが最も近い位置における前記突出部と前記振動板との間に存在する物質の比重は０より大きく０．９０より小さい状態で、前記細胞に振動を付与することを特徴とする細胞剥離方法。
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