WO2024095909A1 - 細胞剥離装置、及び細胞剥離方法 - Google Patents

細胞剥離装置、及び細胞剥離方法 Download PDF

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WO2024095909A1
WO2024095909A1 PCT/JP2023/038838 JP2023038838W WO2024095909A1 WO 2024095909 A1 WO2024095909 A1 WO 2024095909A1 JP 2023038838 W JP2023038838 W JP 2023038838W WO 2024095909 A1 WO2024095909 A1 WO 2024095909A1
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WO
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culture vessel
vibration
transmission medium
acoustic transmission
cell detachment
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Application number
PCT/JP2023/038838
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English (en)
French (fr)
Inventor
達雄 古田
堅義 松田
貴昭 古井
亮一 吉田
Original Assignee
キヤノン株式会社
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media

Definitions

  • the present invention relates to a cell detachment device and a cell detachment method.
  • the cells are cultured on a culture vessel such as a polystyrene dish, and then the cells are detached from the culture vessel, and the cells are collected and washed to obtain the desired cells.
  • a portion of the acquired cells are transferred to a new culture vessel and cultured, a process known as passaging.
  • the detachment step in which the cells are detached from the culture vessel, is generally performed by using a pipette or other device to generate a flow in the liquid in the culture vessel to pull the cells off.
  • the angle of the pipette and the flow generated in the detachment step vary from person to person, which is an obstacle to an efficient and stable supply of cells.
  • Patent Document 1 discloses a cell recovery device that supplies a detachment solution that reduces the cell adhesiveness of cultured cell populations to a culture vessel containing the cultured cell populations, and vibrates the culture vessel with a vibration device to detach the cultured cell populations from the inner wall of the culture vessel.
  • the culture vessel dishes, flasks, well plates, etc.
  • the bottom of culture vessels generally available on the market for cell culture may have protrusions, or the bottom of the culture vessel may not be flat but may be curved. Therefore, even when an acoustic transmission medium is provided to transmit vibration between the bottom of the culture vessel and the vibration generator, air may get between the bottom of the culture vessel and the acoustic transmission medium. If air remains, the vibration of the vibration generator may be reflected at the interface between the acoustic transmission medium and the air, or the vibration may be attenuated in the air, making it difficult for the vibration of the vibration generator to be transmitted to the culture vessel, and the detachment rate may decrease.
  • the present invention aims to provide a cell detachment device that can detach cells with a high detachment rate.
  • the cell detachment device is a cell detachment device that detaches cells by applying vibrations to cells placed on the culture surface of a cell culture vessel, and is characterized in that the cell detachment device has a transducer and a vibration plate, and the transducer, vibration plate, acoustic transmission medium, and culture vessel are arranged in this order, and the vibration of the vibration plate is transmitted to the culture vessel via the acoustic transmission medium, thereby exciting a bending vibration in the culture vessel, and the cell detachment device is configured so that the acoustic transmission medium and the culture vessel come into contact in a region including the antinode of the bending vibration, but do not come into contact at the node of the bending vibration.
  • the cell detachment method is a cell detachment method for detaching cells by applying vibrations to cells placed on the culture surface of a cell culture vessel, and is characterized in that it uses a cell detachment device having a transducer and a vibration plate, an acoustic transmission medium, and a culture vessel, and applies vibrations to the cells in a state in which the transducer, vibration plate, acoustic transmission medium, and culture vessel are stacked in this order, and bending vibrations are excited in the culture vessel as the vibrations of the vibration plate are transmitted to the culture vessel via the acoustic transmission medium, and vibrations are applied to the cells in a state in which the acoustic transmission medium and the culture vessel are in contact with each other in a region including the antinode of the bending vibration, but are not in contact with each other at the nodes of the bending vibration.
  • the present invention provides a cell detachment device that can detach cells with a high detachment rate.
  • FIG. 1 is a perspective view showing a configuration of a cell detachment device according to an embodiment of the present invention.
  • 1 is an exploded perspective view showing a configuration of a cell detachment device according to an embodiment of the present invention.
  • 1 is a cross-sectional view showing a configuration of a cell detachment device according to an embodiment of the present invention.
  • 1 is a schematic diagram of a circular transducer used in a cell detachment device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a circular transducer used in a cell detachment device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a circular transducer used in a cell detachment device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a bottom view showing a deformation state caused by bending vibration of a culture vessel used in a cell detachment device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view showing a deformation state due to bending vibration of a culture vessel used in a cell detachment device according to an embodiment of the present invention.
  • 1 is a cross-sectional view showing the shape of a culture vessel used in a cell detachment device according to an embodiment of the present invention.
  • 1 is a bottom view showing a deformation state caused by bending vibration of a culture vessel used in a cell detachment device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a bottom view showing a deformation state caused by bending vibration of a culture vessel used in a cell detachment device according to an embodiment of the present invention.
  • 1 is a cross-sectional view showing a deformation state due to bending vibration of a culture vessel used in a cell detachment device according to an embodiment of the present invention.
  • 1 is a cross-sectional view showing a configuration of a cell detachment device according to an embodiment of the present invention.
  • 1 is a cross-sectional view showing a configuration of a cell detachment device according to an embodiment of the present invention.
  • 1 is an exploded perspective view showing a configuration of a cell detachment device according to an embodiment of the present invention.
  • 1 is a bottom view showing a deformation state caused by bending vibration of a culture vessel used in a cell detachment device according to an embodiment of the present invention.
  • 1 is a cross-sectional view showing a deformation state due to bending vibration of a culture vessel used in a cell detachment device according to an embodiment of the present invention.
  • 1 is a cross-sectional view showing a configuration of a cell detachment device according to an embodiment of the present invention.
  • FIGS. 1A, 1B, and 1C are schematic diagrams showing a cell detachment device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1A is a schematic perspective view of a culture vessel 21 and a cell detachment device 10 viewed from an oblique direction
  • FIG. 1B is an exploded perspective view of FIG. 1A, showing the culture vessel 21, acoustic transmission medium 13, diaphragm 11, and transducer 101 separated in the central axis direction of the annular transducer 101.
  • FIG. 1C is a schematic side view of the central cross section of a cell detachment device 10 according to an embodiment of the present invention viewed from the side.
  • a cell detachment device 10 includes a circular transducer 101 and a disk-shaped vibration plate 11.
  • the transducer, vibration plate, acoustic transmission medium, and culture vessel are stacked in this order, and the transducer 101 is driven.
  • the vibration of the transducer 101 is transmitted to the vibration plate 11, and the vibration of the vibration plate 11 is further transmitted to the culture vessel 21 via the acoustic transmission medium 13, thereby exciting a bending vibration in the culture vessel 21.
  • the cell detachment device 10 applies vibration to the cells provided on the culture surface of the culture vessel, and detaches the cells.
  • another member may be provided between the transducer 101, vibration plate 11, acoustic transmission medium 13, and culture vessel 21.
  • the applied vibration may be ultrasonic vibration.
  • ultrasonic vibration is vibration with a frequency of 20 kHz or higher.
  • the cell detachment device 10 may be configured so that the acoustic transmission medium 13 is installed in advance, or may not include the acoustic transmission medium 13 and the user installs the acoustic transmission medium 13 in the cell detachment device 10.
  • the diaphragm 11 may have a marker (label, printing, engraving, etc.) that indicates the position where the acoustic transmission medium 13 is to be placed on the diaphragm 11. By having the marker on the diaphragm 11, the user can easily place the acoustic transmission medium 13 in an appropriate position.
  • the cell detachment device 10 may further include a control unit that drives the transducer to impart vibration to the cells.
  • the acoustic transmission medium may also be called an acoustic transmission material, an acoustic matching material, and a transmission medium.
  • detached cells refers to weakening the adhesion of the cells to the culture vessel and making the cells into a state where they can be collected.
  • the detached cells may exist as individual cells, or may be in a state where multiple cells are adhered to each other.
  • the detached cells may be in the form of a sheet.
  • annular refers to a disk shape having a predetermined thickness, a circular through hole, and a shape in which the outer periphery and the through hole are concentric.
  • disk shape refers to a circle having a predetermined thickness.
  • the outer periphery shape of these circles and through holes is ideally a perfect circle, but as long as it can be considered as a circle in a schematic sense, it also includes an ellipse, an oval, and the like.
  • the radius and diameter are defined by the length in the major axis direction of the figure, that is, the major axis.
  • the radius and diameter may be determined by assuming a perfect circle with the same area.
  • shapes with a missing part or a protruding part of a circular ring or disk are also included in the category of circular ring or disk shape. Therefore, even if there is slight deformation due to manufacturing variance, as long as it can be considered to be a substantially circular ring or disk, it is still included in the category of circular ring or disk shape.
  • the inner and outer diameters and diameters of a circular ring with a missing part or a protruding part, and the radius and diameter of a disk are determined by assuming that it is a perfect circle with the defective or abnormal part corrected.
  • the device is equipped with a circular oscillator and a disk-shaped vibration plate, but the shapes of the components of the cell detachment device are not limited to these.
  • the type of the vibrator 101 may be a piezoelectric type or an electromagnetic type, and is not particularly limited as long as it can generate vibrations of a constant frequency. If the type of the vibrator 101 is a piezoelectric type, it may be selected from a unimorph type, a bimorph type, or a bolt-tightened Langevin type. In addition, the material and structure of the vibrator 101 may be selected according to the frequency, force, and vibration amplitude to be generated.
  • the vibrator 101 shown in Figures 1A, 1B, and 1C is annular, the diaphragm 11 is disk-shaped, and is a piezoelectric unimorph type.
  • Figures 2A and 2B are schematic diagrams of a vibrator 101 used in a cell detachment device 10 according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2A shows the annular vibrator 101 as viewed from the direction opposite the diaphragm side (direction from the origin toward the y-axis in Figure 1C).
  • Figure 2B shows the vibrator 101 as viewed from the diaphragm side (direction from the origin toward the negative y-axis in Figure 1C).
  • the vibrator 101 has a circular piezoelectric material 12, a common electrode 111 provided on a first surface (the diaphragm side, y direction in FIG. 1C) of the piezoelectric material 12, and a drive electrode 110 provided on a second surface opposite the diaphragm side (negative direction of the y axis in FIG. 1C).
  • the piezoelectric material 12 expands and contracts.
  • the surface of the diaphragm 11 on the vibrator side expands and contracts in the in-plane direction, and the diaphragm 11 bends and vibrates in the out-of-plane direction.
  • the common electrode 111 and drive electrode 110 are omitted from FIGS. 1A, 1B, and 1C.
  • the form of the piezoelectric material 12 of the vibrator 101 according to the embodiment of the present invention is not limited, and may be any form such as ceramics, powder, single crystal, slurry, etc., but is preferably ceramics.
  • ceramics refers to an aggregate (also called a bulk body) of crystal particles whose basic component is a metal oxide and which is sintered by heat treatment, so-called polycrystal. It also includes those processed after sintering.
  • the composition of the piezoelectric material 12 is not particularly limited.
  • the piezoelectric material 12 may be at least one composition selected from the group consisting of lead zirconate titanate, barium titanate, zirconate titanate, sodium bismuth titanate, potassium sodium niobate, barium sodium niobate titanate, and bismuth ferrate, or a piezoelectric material 12 mainly composed of these compositions may be used for the vibrator 101.
  • the mechanical quality factor of the piezoelectric material 12 according to an embodiment of the present invention is preferably 1000 or more.
  • the mechanical quality factor is a coefficient that represents the elastic loss due to vibration when the piezoelectric material 12 is evaluated as the transducer 101, and the magnitude of the mechanical quality factor is observed as the sharpness of the resonance curve in impedance measurement. In other words, it is a constant that represents the sharpness of the resonance of the transducer 101. Elastic loss generates heat, and if the heat is transmitted to cells, it may cause the death of the cells or the development of abnormal cell types. If the mechanical quality factor of the piezoelectric material 12 is 1000 or more, the elastic loss of the transducer 101 using the piezoelectric material 12 is reduced, and the amount of heat generated by the transducer 101 during operation can be reduced.
  • the mechanical quality factor of the piezoelectric material 12 can be calculated based on the measurement results of the resonance frequency and anti-resonance frequency obtained using a commercially available impedance analyzer, in accordance with the Japan Electronics and Information Technology Industries Association standard (JEITA EM-4501). Hereinafter, this method will be referred to as the resonance-anti-resonance method.
  • the mechanical quality factor of the piezoelectric material 12 of the transducer 101 is 1000 or more, there will be less loss during vibration, the amount of heat generated will be small, and heat will not be easily transferred to the cells in the culture vessel 21.
  • the vibrator 101 used in one embodiment of the present invention may be configured to include a detection electrode.
  • the detection electrode has a function of monitoring the vibration state of the diaphragm 11 by detecting the positive piezoelectric effect caused by the bending vibration generated in the diaphragm 11 as a voltage change generated in the piezoelectric material 12 in the portion sandwiched between the common electrode 111 and the detection electrode.
  • the detection electrode, the common electrode 111, and the driving electrode 110 are made of a layer or film conductor having a resistance value of less than 10 ⁇ , preferably less than 1 ⁇ .
  • the resistance value of the electrodes can be evaluated by measuring with, for example, a circuit meter (electrical tester).
  • the thickness of each electrode is about 5 nm to 20 ⁇ m.
  • the material is not particularly limited, and may be any material that is commonly used for the piezoelectric material 12.
  • the electrode material may be, for example, at least one metal selected from the group consisting of Ti, Pt, Ta, Ir, Sr, In, Sn, Au, Al, Fe, Cr, Ni, Pd, Ag, and Cu, or a compound thereof.
  • the electrode may be made of one of these materials, or may be made by laminating two or more of these materials. Of these, Ag paste, baked Ag electrodes, and Au/Ti sputtered electrodes are preferred as electrodes for use in one embodiment of the present invention, due to their low resistance.
  • the shape of the diaphragm 11 is not particularly limited as long as the vibration of the transducer 101 is transmitted to the culture vessel 21 via the acoustic transmission medium 13.
  • the diaphragm 11 may be made of a cone or a horn so as to generate a desired vibration amplitude.
  • the diaphragm 11 is preferably a thin plate.
  • the end of the surface of the culture vessel 21 opposite the culture surface may have a protrusion 23 that protrudes in a direction approximately perpendicular to the opposite surface.
  • the acoustic transmission medium 13 and the diaphragm 11 are configured so as not to come into contact with the protrusion 23.
  • the protrusion 23 is a part that protrudes towards the acoustic transmission medium, as shown by the part surrounded by the dashed line in Figure 1C.
  • the protrusion 23 of the culture vessel 21 and the diaphragm 11 do not come into contact with each other means that the protrusion 23 of the culture vessel 21 does not substantially come into direct contact with the vibration surface of the diaphragm 11, and preferably the protrusion 23 is hollow.
  • at least one of the acoustic transmission medium and the diaphragm may be configured to come into contact with the protrusion via the cushioning material, and the acoustic transmission medium and the diaphragm may not come into contact with the protrusion without the cushioning material.
  • the cushioning material is preferably at least one of felt and sponge.
  • the surface of the diaphragm 11 on which the vibrator 101 is provided is preferably flat, since this improves the transmission of vibrations accompanying the expansion and contraction of the piezoelectric material 12.
  • an epoxy resin is preferably used as the adhesive layer.
  • the diaphragm 11 is preferably an elastic body for the purpose of generating out-of-plane vibration together with the vibrator 101 and transmitting the vibration to the culture vessel 21 via the acoustic transmission medium 13.
  • the diaphragm 11 preferably includes at least one material selected from the group consisting of glass, metal, and quartz.
  • Examples of metals that can be used for the diaphragm 11 include at least one selected from the group consisting of aluminum, brass, Fe-Ni 36% alloy, and stainless steel (SUS).
  • acoustic transmission medium Although there is no limitation on the means for providing the acoustic transmission medium 13 on the surface of the diaphragm 11, it is preferable to adhere the acoustic transmission medium 13 by applying pressure so as not to impede the transmission of vibration, or to adhere the acoustic transmission medium 13 by interposing a highly elastic adhesive layer (not shown). When applying pressure to the acoustic transmission medium 13, the adhesion can be improved by smoothing the surface of the acoustic transmission medium 13.
  • the vibration of the diaphragm 11 is transmitted to the culture vessel 21 via the acoustic transmission medium 13, whereby bending vibration is excited in the culture vessel 21.
  • the excited bending vibration may be bending vibration having a plurality of abdomens.
  • the acoustic transmission medium 13 and the culture vessel 21 are in contact with each other in a region including at least a part of the plurality of abdomens, and are not in contact with each other at the nodes of the bending vibration.
  • the region where the acoustic transmission medium 13 and the culture vessel 21 are in contact with each other may be a region consisting of only the abdomens, or may be a region between the abdomens and the nodes and a region including the abdomens but not including the nodes.
  • the bending vibration described in this specification is the natural vibration mode of the culture vessel 21, and the bottom surface 24 of the culture vessel 21, which is the culture surface, is a natural vibration mode having an amplitude in the out-of-plane direction. Furthermore, the bending vibration in one embodiment of the present invention is a second or higher natural vibration mode having multiple abdomens.
  • the natural vibration mode is a mode that indicates the deformation state of the culture vessel 21 when driven at the natural frequency
  • the natural frequency is the frequency at which the vibration amplitude is maximum when the cell detachment device is driven.
  • the bending vibration is a standing wave in which the vibration amplitude in the out-of-plane direction of the bottom surface of the culture vessel 21 is maximized when the vibration transmitted to the culture vessel 21 is at a given frequency.
  • the part where the amplitude of the bending vibration is maximized is the abdomen, and the part where it is minimized is the node.
  • the vibrations transmitted to the culture vessel 21 are generated when the vibrations of the transducer 101 are transmitted to the diaphragm 11, and then transmitted through the acoustic transmission medium 13. Therefore, the frequency of the vibrations transmitted to the culture vessel 21 matches the frequency of the alternating voltage applied to the transducer 101.
  • Figures 3A and 3B are schematic diagrams showing the deformation state of the natural vibration mode in which the acoustic transmission medium 13 and the bottom surface 24 of the culture vessel in Figures 1A, 1B, and 1C vibrate in bending.
  • Figure 3A is a plan view of the culture vessel 21 seen from below.
  • Figure 3B is a side view of the central cross section (position A-A of dashed line in Figure 3A) of the deformed state of the bottom surface 24 of the culture vessel seen from the side.
  • the deformation amount in Figure 3B is shown at an exaggerated deformation magnification.
  • the black circle and dashed line part in the center of Figure 3A are the abdomen 17, and the part with two dashed lines is the node part 18.
  • the acoustic transmission medium 13 is provided at a position corresponding to the abdomen 17 of the bending vibration on the bottom surface 24 of the culture vessel, but is not provided at the node 18. At this time, the acoustic transmission medium 13 and the culture vessel 21 are in contact with each other at the abdomen 17 of the bending vibration, but are not in contact with each other at the node 18 of the bending vibration.
  • the vibrations of the transducer 101 and diaphragm 11 are transmitted to the abdomen 17 of the bending vibration of the culture vessel 21 via the acoustic transmission medium 13, so that the bending vibration of the bottom surface 24 of the culture vessel is strongly excited and the vibration amplitude of the bending vibration increases.
  • the acoustic transmission medium 13 is at the node 18 of the bending vibration, the vibration of the transducer 101 is transmitted to the node 18 of the bending vibration, and a force is exerted that causes the vibration to have a shape different from the natural vibration mode. Therefore, the excitation of the bending vibration becomes weaker and the vibration amplitude becomes smaller, and as a result, the cells in the culture vessel 21 become less likely to detach.
  • the acoustic transmission medium 13 it is advisable to place the acoustic transmission medium 13 around the abdomen of the bending vibration of the culture vessel 21 as well, so long as it does not come into contact with the nodes 18 of the bending vibration.
  • the nodes 18 are near the ends of the culture vessel 21, so unless the acoustic transmission medium 13 is placed over almost the entire surface, the vibration of the transducer 101 cannot be efficiently transmitted to the culture vessel 21.
  • FIG. 4 illustrates the warping of the bottom surface of the culture vessel in FIG. 1C, with the amount of warping exaggerated compared to the actual amount.
  • the amount of warping ⁇ Z depends on the size of the culture vessel 21, but for example, in the case of a Corning culture vessel 21 with an outer diameter of 51.6 mm, the amount of warping varies from 0.15 mm to 0.47 mm. If an acoustic transmission medium 13 is placed over almost the entire bottom surface of such a warped culture vessel, air will get mixed in the center of the warp, and the acoustic transmission medium 13 will not come into contact with the abdomen 17 of the bending vibration.
  • the bending vibration is of second order or higher, the distance between the abdomen 17 and the node 18 is reduced, and the size of the acoustic transmission medium 13 that is actually installed is also reduced. This makes it difficult for air to get between the culture vessel 21 and the acoustic transmission medium 13, making it easier for the vibration of the transducer 101 to be transmitted.
  • LN1/LM is 1.0 or more and 1.6 or less.
  • LN1/LM is in the range of 1.0 or more, the area through which the vibration is transmitted becomes wider, so that the vibration of the transducer 101 is efficiently transmitted to the culture vessel 21.
  • LN/LM is in the range of 1.6 or less, air is less likely to enter between the culture vessel 21 and the acoustic transmission medium 13.
  • the bending vibration having multiple abdomens 17 excited in the culture vessel 21 by the transducer 101 via the acoustic transmission medium 13 has multiple different natural vibration modes.
  • FIGS. 5A and 5B are schematic diagrams showing the deformation state of bending vibration in a natural vibration mode different from that shown in FIGS. 3A and 3B, with the acoustic transmission medium 13 and the bottom surface 24 of the culture vessel of FIGS. 1A, 1B, and 1C extracted.
  • FIG. 5A is a plan view of the culture vessel 21 as viewed from below
  • FIG. 5B is a side view of the central cross section (position of dashed line B-B in FIG. 5A) of the deformed state of the bottom surface portion 24 of the culture vessel as viewed from the side.
  • the black circle and dashed line portion in FIG. 5A are the abdomen portion 17, and the double-dashed line portion is the node portion 18.
  • the vibration amplitude of the node 18 of the bending vibration excited in the culture vessel 21 is extremely small, making it difficult for cells to be detached. Therefore, if the cells at the node 18 are also to be detached, it is advisable to excite a bending vibration of a natural vibration mode other than those in FIG. 3A and FIG. 3B, for example as in FIG. 5A and FIG. 5B, so as to impart vibration to the node 18. If the bending vibration excited in the culture vessel 21 is a plurality of different natural vibration modes, the positions of the nodes 18 are almost different from each other, so that the nodes 18 can be vibrated and the cells can be detached.
  • exciting multiple different natural vibration modes can be achieved by changing the drive frequency to a frequency at which each natural vibration mode is excited. It can also be achieved by sweeping the drive frequency in a range that includes the frequency at which each natural vibration mode is excited.
  • the acoustic transmission medium 13 when exciting a plurality of different natural vibration modes, it is desirable to provide the acoustic transmission medium 13 at the position of the abdomen 17 that is common to the bending vibrations of each natural vibration mode. Also, by not providing the acoustic transmission medium 13 at the node 18 of any of the bending vibrations, it is possible to make the acoustic transmission medium 13 and the culture vessel 21 contact at the abdomen 17 of the bending vibration but not at the node 18 of the bending vibration.
  • the shape of the acoustic transmission medium 13 is not particularly limited, but from the viewpoint of ease of processing, it is preferable that the acoustic transmission medium 13 is rectangular, disk-like, or annular.
  • the acoustic transmission medium 13 shown in Figures 1A, 1B, and 1C is disk-like. That is, the cross section of the acoustic transmission medium 13 in a plane perpendicular to the direction in which the acoustic transmission medium 13 and the culture vessel 21 are arranged in an overlapping manner is circular.
  • the thickness of the acoustic transmission medium 13 at the portion where the acoustic transmission medium 13 contacts the culture vessel 21 is preferably 0.1 mm or more and 3 mm or less. If the thickness is 3 mm or more, the vibrations will be attenuated within the acoustic transmission medium 13, and the vibrations of the transducer 101 will not be transmitted to the culture vessel 21. In addition, if the acoustic transmission medium 13 is less than 0.1 mm thick, it is difficult to manufacture, so the thickness of the acoustic transmission medium 13 is preferably 0.1 mm or more.
  • the surface of the acoustic transmission medium 13 that contacts the culture vessel 21 includes a convex curved surface. If the acoustic transmission medium 13 is flat, there is a possibility that air may get in between the acoustic transmission medium 13 and the culture vessel 21. Therefore, by having the surface of the acoustic transmission medium 13 that contacts the culture vessel 21 include a convex curved surface, it becomes difficult for air to get in between the culture vessel 21 and the acoustic transmission medium 13.
  • FIG. 6 is a schematic side view of the central cross section of a cell detachment device 10 according to an embodiment of the present invention, viewed from the side.
  • a lid 22 is placed on a culture vessel 21 placed on the cell detachment device 10, and a circular weight 15 is placed on top of the lid 22.
  • the diaphragm 11 and the transducer 101 are fixed with a circular fixing member 16 so as to sandwich them.
  • the weight 15 brings the culture vessel 21 and the acoustic transmission medium 13 into pressurized contact, preventing air from entering between the culture vessel 21 and the acoustic transmission medium 13, and making it easier for the vibration of the transducer 101 to be transmitted to the culture vessel 21.
  • the acoustic transmission medium 13 is preferably a material that easily transmits the vibration of the transducer 101 to the culture vessel 21, that is less likely to trap air between the acoustic transmission medium 13 and the culture vessel 21, and that has high tackiness.
  • the acoustic transmission medium 13 preferably contains a polymeric material, and for example, at least one material selected from the group consisting of rubber, gel, and viscoelastic body can be used.
  • rubber is a preferable material because it has high vibration transmission properties and is inexpensive.
  • silicone rubber is preferable because it has physical properties with little attenuation in the frequency band of the driving frequency, which results in high vibration transmission efficiency, and further because heat generation by the acoustic transmission medium 13 itself can be reduced.
  • a method for confirming the position of the antinode 17 or the node 18 of the bending vibration of any order excited in the culture vessel 21 will be described.
  • a small voltage input signal for example, an AC voltage of 1 V to 10 V
  • the vibration amplitude of multiple points on the surface of the bottom part 24 of the culture vessel for each frequency is measured while changing the frequency of the input signal using a laser Doppler vibrometer, and the vibration amplitude can be confirmed.
  • the vibration amplitude of the bottom part 24 can be measured by scanning the surface of the bottom part 24 of the culture vessel at intervals of, for example, 1 mm.
  • the part where the vibration amplitude is minimal is the node
  • the position of the node 18, and the part where the vibration amplitude is maximized is the antinode
  • the position of the antinode is the antinode.
  • the reflection of the laser from the culture vessel surface is weak and measurement with a laser Doppler vibrometer is difficult, the reflection of the laser can be strengthened by attaching a retroreflective sheet to the surface on which the vibration amplitude is to be measured, or by depositing a metal such as platinum or gold.
  • a separate culture vessel 21 for measuring the vibration amplitude should be prepared separately from the culture vessel 21 in which the cells are actually cultured, or the cells in the culture vessel 21 should be detached and then measured to confirm.
  • the vibration of the transducer 101 can be transmitted to the abdomen 17 of the bending vibration of the culture vessel 21 to detach the cells in the culture vessel 21.
  • the arrangement of the three members, the transducer 101, the diaphragm 11, and the acoustic transmission medium 13, changes during operation, the transmission efficiency of the vibration may decrease. Therefore, when driving the cell detachment device 10 according to one embodiment of the present invention, it is preferable that the arrangement of the three members, the transducer 101, the diaphragm 11, and the acoustic transmission medium 13, is fixed to each other. To fix them, the fixing member 16 shown in FIG.
  • the fixing member 16 may be used, or they may be bonded to each other using an adhesive. They may also be fixed to other parts using an adhesive or the like. It is preferable to use felt, sponge, or rubber for the fixing member 16 so as not to inhibit the vibration of the transducer 101 and the diaphragm 11.
  • the material of the culture vessel 21 is not particularly limited.
  • the material of the culture vessel 21 include at least one selected from the group consisting of polyethylene, polypropylene, polycarbonate, polystyrene, polyvinyl chloride, nylon, polyurethane, polyurea, polylactic acid, polyglycolic acid, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetate, poly(meth)acrylic acid, poly(meth)acrylic acid derivatives, polyacrylonitrile, poly(meth)acrylamide, poly(meth)acrylamide derivatives, polysulfone, cellulose, cellulose derivatives, polysilicone, polymethylpentene, glass, and metal.
  • polystyrene is preferred.
  • Culture vessels 21 come in three types: dishes, flasks, and well plates. Dishes made by Corning, Thermo Fisher Scientific, and AGC Techno Glass (Iwaki) of Japan are commonly used.
  • the culture surface of a culture vessel is the surface surrounded by the side walls, and when cells are cultured, the cells adhere to the culture surface.
  • the cell culture conditions can be appropriately selected according to the cells to be cultured.
  • an appropriate medium is added to the culture vessel 21, and cells are seeded therein at about 1.0 ⁇ 10 1 to 5.0 ⁇ 10 4 cells/cm 2 and cultured in an environment of 37° C. and 5% CO 2 concentration.
  • the cells may be cultured until they cover the culture surface and reach a confluent state, and may be cultured in a sheet form (cell sheet).
  • the cell detachment device 10 can be applied to various kinds of cells.
  • the cells include Chinese hamster ovary-derived CHO cells, mouse connective tissue L929 cells, mouse skeletal muscle myoblasts (C2C12 cells), human fetal lung-derived normal diploid fibroblasts (TIG-3 cells), human fetal kidney-derived cells (HEK293 cells), human alveolar basal epithelial adenocarcinoma-derived A549 cells, human cervical cancer-derived HeLa cells, epithelial cells, endothelial cells, skeletal muscle cells, smooth muscle cells, cardiac muscle cells, neuronal cells, glial cells, fibroblasts, hepatic parenchymal cells, hepatic non-parenchymal cells, adipocytes, induced pluripotent stem (iPS) cells, embryonic stem (ES) cells, embryonic germ (EG) cells, embryonic carcinoma (EC) cells, mesenchymal stem cells, hepatic stem cells
  • iPS
  • the culture medium of the cultured cells must be replaced with a detachment liquid.
  • the detachment liquid usually contains a protease.
  • the protease include at least one selected from the group consisting of trypsin, accutase, collagenase, natural protease, chymotrypsin, elastase, papain, pronase, and recombinant forms thereof.
  • the protease may degrade the membrane proteins of the cells.
  • the cell detachment method of this invention does not use a protease, or if a protease is used, a very small amount of the protease can achieve the same effect, so that it has the effect of reducing the degradation of the membrane proteins of the cells.
  • the detachment liquid may contain culture medium components to make it difficult to reduce the loss of the membrane proteins of the cells.
  • the culture vessel 21 with the detachment solution replaced is placed in the cell detachment device 10, and the cell detachment device 10 is operated while being kept at a constant temperature, for example 37°C, in an incubator.
  • the operation time is sufficient for cell detachment.
  • the detached cells are collected with a dropper, and the cells adhering to the culture vessel 21 are collected by pipetting.
  • the detachment rate is the ratio of the number of cells detached by vibration to the total number of cells detached by vibration of the cell detachment device and the number of cells detached by pipetting.
  • the survival rate is the ratio of viable cells among the collected cells.
  • the remaining cells remaining on the bottom surface of the culture vessel 21 after cell detachment can be observed using scattered light from the backlight.
  • the cell detachment device may include a plurality of acoustic transmission media as the acoustic transmission medium 13, and may use an acoustic transmission medium having a shape other than a disk shape, for example, an annular shape.
  • Figures 7A and 7B are schematic diagrams showing other examples of the cell detachment device 10 according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 7A is a schematic side view of the central cross section of the cell detachment device 10 according to an embodiment of the present invention, viewed from the side.
  • Figure 7B is an exploded perspective view of the cell detachment device 10 of Figure 7A, showing the acoustic transmission medium 13, diaphragm 11, and transducer 101 separated in the central axial direction (the direction in which they are arranged in layers) of the annular transducer 101.
  • the embodiment shown in Figures 7A and 7B is an embodiment in which the acoustic transmission medium 13 and the diaphragm 11 have different shapes.
  • the thickness of the acoustic transmission medium 13 is thicker than the acoustic transmission medium 13 in Figures 1A, 1B, and 1C, and there is no risk of the protruding portion of the culture vessel 21 coming into contact with the diaphragm 11, so there is no groove in the disk-shaped diaphragm 11.
  • a disk-shaped acoustic transmission medium and an annular acoustic transmission medium are installed so as to be in contact with the culture vessel 21 at the abdomen 17 of the bending vibration, and the effects of the present invention can be obtained even in this form.
  • LN2/LM is preferably 1.0 to 1.6.
  • the width of the area where the annular acoustic transmission medium 13 and the culture vessel 21 contact is the distance between the outer circumference and the inner circumference of the area in the radial direction (direction perpendicular to the direction in which they are arranged in layers) of the annular acoustic transmission medium 13.
  • LN2/LM is in the range of 1.0 or more, the area through which the vibration is transmitted becomes wider, so that the vibration of the transducer 101 is efficiently transmitted to the culture vessel 21. If LN2/LM is in the range of 1.6 or less, air is less likely to enter between the culture vessel 21 and the acoustic transmission medium 13.
  • the acoustic transmission medium 13 is in contact with the culture vessel 21 at at least a portion of the abdomen 17 of the bending vibration, and the acoustic transmission medium 13 does not have to be in contact with the center of the culture vessel 21.
  • FIG. 8A and 8B are schematic diagrams showing the deformation state of the acoustic transmission medium 13 and other natural vibration modes in which the bottom surface 24 of the culture vessel vibrates in bending.
  • FIG. 8A is a plan view of the bottom surface 24 of the culture vessel 21 as viewed from below the culture vessel 21.
  • FIG. 8B is a schematic side view of the central cross section (position of the dashed line B-B in FIG. 8A) of the deformed state of the bottom surface 24 of the culture vessel as viewed from the side.
  • the deformation amount in FIG. 8B is illustrated with the deformation magnification exaggerated.
  • the black circle part in FIG. 8A is the abdomen 17, and the two-dot dashed line part is the node 18.
  • the acoustic transmission medium 13 by providing the acoustic transmission medium 13 at a position corresponding to the abdomen 17 of the bending vibration of the bottom surface 24 of the culture vessel and not providing it at the node 18, the acoustic transmission medium 13 and the culture vessel 21 come into contact at the abdomen 17 of the bending vibration, but do not come into contact at the node 18 of the bending vibration.
  • the transducer 101 is a bolt-tightened Langevin type consisting of a circular piezoelectric material 12, a driving electrode 110, and a common electrode 111, and the metal block 30 and the diaphragm 11 are connected by a central bolt 31.
  • the piezoelectric material 12 expands and contracts, and the diaphragm 11 vibrates in the direction of the culture vessel 21.
  • the vibration of the transducer 101 and the diaphragm 11 is transmitted to the abdomen 17 of the bending vibration excited at the bottom part 24 of the culture vessel 21 via the acoustic transmission medium 13.
  • the bending vibration of the bottom part 24 of the culture vessel is strongly excited, the vibration amplitude increases, and the cells in the culture vessel 21 are detached.
  • Example 1 of the first embodiment will be described below.
  • Example 1 the cell detachment device 10 shown in Figures 1A, 1B, and 1C was used.
  • a ⁇ 60 mm dish manufactured by Thermo Fisher Scientific was used as the culture vessel 21.
  • a disk-shaped glass plate having a diameter of 70 mm and a thickness of 4 mm and a groove 14 formed therein so that the protrusion 23 would not come into contact with the diaphragm 11 was used as the vibration plate 11 of the cell detachment device 10.
  • the dimensions of the groove 14 were an inner diameter of 50 mm, a width of 5 mm, and a depth of 1 mm.
  • the material composition of the piezoelectric material 12 was PZT (C213 manufactured by Fuji Ceramics Co., Ltd.), the outer diameter was the same as that of the diaphragm 11, 70 mm, the inner diameter was 57 mm, and the thickness was 2 mm, and silver was used for the driving electrode 110 and the common electrode 111.
  • the vibrator 101 and the diaphragm 11 were bonded with an epoxy adhesive, and a disk-shaped acoustic transmission medium 13 having a thickness of 0.8 mm and a diameter of 5 mm was placed in the center of the diaphragm 11.
  • the material of the acoustic transmission medium 13 is silicone rubber with a hardness of 50°.
  • the cell detachment device 10 was assembled as shown in Figure 6, and a Corning ⁇ 60 mm dish serving as a culture vessel 21 in which cells were cultured was placed on the silicone rubber placed on the diaphragm 11, and a 300 g annular weight 15 was placed on top of that. At this point, it was visually confirmed that there was no air between the acoustic transmission medium 13 and the culture vessel 21, and that the entire surfaces were in close contact.
  • the vibrator 101 was then swept at a voltage of 50 V and a frequency of 22-37 kHz, and the bottom surface 24 of the culture vessel was measured at each frequency using a laser Doppler vibrometer (Graphtec AT7200). As a result, it was confirmed that a standing wave of bending vibration as shown in Figure 3A was generated at 24.3 kHz, and that a standing wave of bending vibration as shown in Figure 5A was generated at 35.1 kHz. However, to measure the vibration, a culture vessel 21 with platinum vapor-deposited on the measurement surface was separately prepared.
  • CHO (Chinese Hamster Ovary) cells were seeded at a density of 10,000 cells/ cm2 on a Thermo Fisher Scientific ⁇ 60 mm dish prepared separately for laser measurement, and cultured under an environment of 37°C and 5% CO2 concentration.
  • the medium used was Ham's F12 (Thermo Fisher Scientific) supplemented with 10% Fetal Bovine Serum (Sigma-Aldrich) and 1% penicillin-streptomycin (10,000 U/ml, Thermo Fisher Scientific).
  • the culture was performed for 48 hours, and the state of the cells was observed with a phase contrast microscope to confirm cell adhesion and proliferation.
  • the cell occupancy rate of the dish was about 80%.
  • the medium in the dish was removed and washed with phosphate buffered saline (PBS(-), Thermo Fisher Scientific). After that, phosphate buffered saline (PBS(-), Thermo Fisher Scientific) was added to the dish as a stripping solution and the dish was left to soak for 3 minutes.
  • PBS(-), Thermo Fisher Scientific phosphate buffered saline
  • the culture vessel 21 was placed in the cell detachment device 10, and the cells were detached by frequency sweep vibration (frequency 22-37 kHz, frequency sweep period 1 s, voltage 100 V) for 1 minute 30 seconds.
  • frequency sweep vibration frequency 22-37 kHz, frequency sweep period 1 s, voltage 100 V
  • the temperature increase from before detachment was less than 1°C.
  • the cell count was measured using a hemocytometer and the viability was calculated using a trypan blue staining method to distinguish between live and dead cells.
  • a suspension of the detached cells was mixed with a 0.4% trypan blue solution in a 1:1 ratio to stain the dead cells contained in the suspension.
  • the suspension was poured into a hemocytometer (NanoEntek, DHC-N01) and the number of live and dead cells on the grid of the hemocytometer was counted by microscopic observation. The percentage of the counted live cells to the total number of cells was calculated to obtain the viability.
  • a cell scraper was used to detach all cells that could not be detached by ultrasound from the dish.
  • the suspension of detached cells was poured into a hemocytometer (NanoEntek, DHC-N01) and observed under a microscope to measure the number of detached cells.
  • the total number of cells detached by ultrasound and the number of cells subsequently detached with the cell scraper were added together to determine the total number of detached cells, and the detachment rate was defined and calculated as the ratio of the number of ultrasonically detached cells to the total number of detached cells.
  • the survival rate was 95% and the detachment rate was 91%.
  • a survival rate and detachment rate of 90% or more was considered to be good.
  • Embodiments of the present invention may also be realized by a computer of a system or apparatus (e.g., an application specific integrated circuit (ASIC)) that reads and executes computer executable instructions (e.g., one or more programs) recorded on a storage medium to perform one or more functions of the above-described embodiments, and/or by a computer of a system or apparatus that includes one or more circuits that perform one or more functions of the above-described embodiments, and by a method performed by the computer of the system or apparatus, e.g., by reading and executing computer executable instructions from a storage medium to perform one or more functions of the above-described embodiments, and/or by controlling one or more circuits to perform one or more functions of the above-described embodiments.
  • ASIC application specific integrated circuit
  • the computer may include one or more processors (e.g., a central processing unit (CPU), a microprocessor unit (MPU)) and may include a separate computer or a network of separate processors to read and execute the computer executable instructions.
  • the computer executable instructions may be provided to the computer, e.g., from a network or a storage medium.
  • the storage medium may include, for example, one or more of a hard disk, a random access memory (RAM), a read-only memory (ROM), a storage device of a distributed computing system, an optical disk (such as a compact disk (CD), a digital versatile disk (DVD), a Blu-ray disk (BD)), a flash memory device, a memory card, etc.
  • the disclosure of this embodiment includes the following configurations and methods.
  • a cell detachment device that detaches cells by applying vibration to the cells provided on a culture surface of a cell culture vessel,
  • the cell detachment device has a vibrator and a vibrating plate,
  • the transducer, the diaphragm, the acoustic transmission medium, and the culture vessel are arranged in this order;
  • the vibration of the diaphragm is transmitted to the culture vessel via the acoustic transmission medium, thereby exciting a bending vibration in the culture vessel
  • the cell detachment device is configured such that the acoustic transmission medium and the culture vessel are in contact with each other in an area including an antinode of the bending vibration, and are not in contact with each other at a node of the bending vibration.
  • (Configuration 2) A bending vibration having a plurality of abdomens is excited in the culture vessel, The cell detachment device according to configuration 1, wherein the cell detachment device is configured so that the acoustic transmission medium and the culture vessel are in contact with each other in an area including at least a portion of the plurality of abdomens.
  • (Configuration 7) The cell detachment device according to any one of configurations 1 to 6, wherein a cross section of the acoustic transmission medium in a plane perpendicular to the direction in which the acoustic transmission medium is arranged in layers is circular.
  • the cell detachment device described in configuration 9 is characterized in that, when LM is the distance from a first abdominal portion of the bending vibration to a first node of the bending vibration closest to the first abdominal portion, and LN is the width of the area where the acoustic transmission medium and the culture vessel are in contact in a direction perpendicular to the direction in which they are arranged in layers, LN/LM is 1.0 or more and 1.6 or less.
  • the culture vessel has a protrusion on a surface opposite to the culture surface,
  • the cell detachment device according to any one of configurations 1 to 13, characterized in that the cell detachment device is configured so that the acoustic transmission medium and the diaphragm do not come into contact with the protrusion.
  • (Configuration 17) 17 The cell detachment device according to any one of configurations 1 to 16, wherein the vibration plate includes at least one material selected from the group consisting of glass, metal, and quartz.
  • a cell detachment method for detaching cells by applying vibration to cells placed on a culture surface of a cell culture vessel comprising: applying vibration to the cells using a cell detachment device having a transducer and a vibration plate, an acoustic transmission medium, and the culture vessel, with the transducer, the vibration plate, the acoustic transmission medium, and the culture vessel stacked in this order;
  • a cell detachment method characterized in that the vibration of the diaphragm is transmitted to the culture vessel via an acoustic transmission medium, thereby exciting a bending vibration in the culture vessel, and vibration is imparted to the cells in a state in which the acoustic transmission medium and the culture vessel are in contact in an area including the abdomen, but not in contact at the nodes of the bending vibration.
  • Method 2 The cell detachment method described in Method 1, characterized in that a bending vibration having multiple abdomens is excited in the culture vessel, and vibration is applied to the cells while the acoustic transmission medium and the culture vessel are in contact in an area including at least a portion of the multiple abdomens.
  • Method 3 The cell detachment method described in method 1 or 2, characterized in that an acoustic transmission medium having a circular cross section in a plane perpendicular to the overlapping direction is used as the acoustic transmission medium, and vibration is applied to the cells in a state where LN/LM is 1.0 or more and 1.6 or less, where LM is the distance from a first abdominal portion of the bending vibration to a first node of the bending vibration closest to the first abdominal portion, and LN1 is the diameter of the area where the acoustic transmission medium and the culture vessel are in contact.

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Abstract

細胞の培養容器の培養面の上に設けられた細胞に振動を付与することによって細胞を剥離する細胞剥離装置であって、細胞剥離装置は、振動子と振動板とを有し、振動子、振動板、音響伝達媒体、及び培養容器がこの順に重ねて配置され、振動板の振動が音響伝達媒体を介して培養容器に伝達されることで、培養容器に屈曲振動が励振され、音響伝達媒体と培養容器とが屈曲振動の腹部を含む領域で接し、屈曲振動の節部では接しないように細胞剥離装置が構成されることを特徴とする。

Description

細胞剥離装置、及び細胞剥離方法
　本発明は細胞剥離装置、及び細胞剥離方法に関する。
　細胞医薬・再生医療の分野では、大量の細胞を培養する必要があり、特に、生体組織の多くを占める接着性細胞を効率的かつ安定的に供給することが求められている。
　接着性細胞の培養においては、例えばポリスチレンディッシュのような培養容器上で細胞を培養し、培養容器から細胞を剥離し、細胞の回収及び洗浄の各工程を経ることで、目的とする細胞を取得する。細胞をさらに増やす際には、取得した細胞の一部をまた新たな培養容器に移して培養する、いわゆる継代操作を行なう。この一連の工程の中でも、培養容器から細胞を剥離する剥離工程は、ピペットなどで培養容器の液体に流動を発生させて細胞を引きはがす方法が一般的に行われている。しかし、剥離工程におけるピペットの角度や発生させる流動が人によって異なるため、細胞の効率的かつ安定的な供給への障壁となっている。
　特許文献１に、培養細胞群の細胞接着性を低下させる剥離液を、培養細胞群が収容された培養容器に供給し、加振装置によって培養容器を振動させることで培養細胞群を培養容器の内壁から剥離させる細胞回収装置が開示されている。
特開２００８－７９５５４号公報
　ここで、培養容器として、ディッシュやフラスコ、ウェルプレートなどを用いる場合がある。しかし、細胞培養用として一般に市販されている培養容器の底面には突出部があったり、培養容器の底面が平らではなく実際は撓んでいたりする場合があった。そのため、培養容器の底面と加振装置との間で振動を伝えるための音響伝達媒体を設ける場合においても、培養容器の底面と音響伝達媒体との間に空気が入り込む場合があった。空気が残っていると、加振装置の振動が音響伝達媒体と空気との界面で反射したり、振動が空気中で減衰したりするため、加振装置の振動が培養容器に伝わりにくくなり、剥離率が低下する場合があった。脱気処理などをしないと入り込んだ空気は抜けづらく、また、脱気処理は培養容器上の細胞の生存率を下げる可能性がある。したがって、効率的に細胞を剥離し、高い剥離率で細胞を得るためには、音響伝達媒体と培養容器との間に空気が入らないようにすることが求められる。
　本発明は、高い剥離率で細胞を剥離する細胞剥離装置を提供することを目的とする。
　本発明に係る細胞剥離装置は、細胞の培養容器の培養面の上に設けられた細胞に振動を付与することによって細胞を剥離する細胞剥離装置であって、細胞剥離装置は、振動子と振動板とを有し、振動子、振動板、音響伝達媒体、及び培養容器がこの順に重ねて配置され、振動板の振動が音響伝達媒体を介して培養容器に伝達されることで、培養容器に屈曲振動が励振され、音響伝達媒体と培養容器とが屈曲振動の腹部を含む領域で接し、屈曲振動の節部では接しないように細胞剥離装置が構成されることを特徴とする。
　本発明に係る細胞剥離方法は、細胞の培養容器の培養面の上に設けられた細胞に振動を付与することによって細胞を剥離する細胞剥離方法であって、振動子と振動板とを有する細胞剥離装置、及び音響伝達媒体と培養容器とを用いて、振動子、振動板、音響伝達媒体、及び培養容器をこの順に重ねて配置した状態で、細胞に振動を付与し、振動板の振動が音響伝達媒体を介して培養容器に伝達されることで、屈曲振動が培養容器に励振され、音響伝達媒体と培養容器とが屈曲振動の腹部を含む領域で接し、屈曲振動の節部では接しない状態で細胞に振動を付与することを特徴とする。
　本発明によれば、高い剥離率で細胞を剥離する細胞剥離装置を提供することができる。
本発明の実施形態に係る細胞剥離装置の構成を示す斜視図である。 本発明の実施形態に係る細胞剥離装置の構成を示す分解斜視図である。 本発明の実施形態に係る細胞剥離装置の構成を示す断面図である。 本発明の実施形態に係る細胞剥離装置に用いられる円環状の振動子の概略図である。 本発明の実施形態に係る細胞剥離装置に用いられる円環状の振動子の概略図である。 本発明の実施形態に係る細胞剥離装置に用いられる培養容器の屈曲振動による変形状態を示す下面図である。 本発明の実施形態に係る細胞剥離装置に用いられる培養容器の屈曲振動による変形状態を示す断面図である。 本発明の実施形態に係る細胞剥離装置に用いられる培養容器の形状を示す断面図である。 本発明の実施形態に係る細胞剥離装置に用いられる培養容器の屈曲振動による変形状態を示す下面図である。 本発明の実施形態に係る細胞剥離装置に用いられる培養容器の屈曲振動による変形状態を示す断面図である。 本発明の実施形態に係る細胞剥離装置の構成を示す断面図である。 本発明の実施形態に係る細胞剥離装置の構成を示す断面図である。 本発明の実施形態に係る細胞剥離装置の構成を示す分解斜視図である。 本発明の実施形態に係る細胞剥離装置に用いられる培養容器の屈曲振動による変形状態を示す下面図である。 本発明の実施形態に係る細胞剥離装置に用いられる培養容器の屈曲振動による変形状態を示す断面図である。 本発明の実施形態に係る細胞剥離装置の構成を示す断面図である。
　以下、好適な実施の形態を挙げて、本発明を詳細に説明する。
　図１Ａ、図１Ｂ及び図１Ｃは、本発明の実施形態に係る細胞剥離装置を示す概略図である。図１Ａは、培養容器２１および細胞剥離装置１０を斜め方向から見た概略斜視図、図１Ｂは、図１Ａの分解斜視図であり、円環状の振動子１０１の中心軸方向に培養容器２１、音響伝達媒体１３、振動板１１、振動子１０１を分離して図示している。また、図１Ｃは、本発明の実施形態に係る細胞剥離装置１０の中央断面を側方から見た模式的側面図である。
　図１Ａ、図１Ｂ及び図１Ｃに示すように、本発明の実施形態に係る細胞剥離装置１０は、円環状の振動子１０１と円板状の振動板１１とを備えている。本発明の一実施形態の細胞剥離装置は、振動子と振動板と音響伝達媒体と培養容器とをこの順に重ねて配置した状態で、振動子１０１を駆動する。振動子１０１の振動が振動板１１に伝達され、さらに振動板１１の振動が音響伝達媒体１３を介して培養容器２１に伝達されることで、培養容器２１に屈曲振動が励振される。このように、細胞剥離装置１０は、培養容器の培養面の上に設けられた細胞に振動を付与し、細胞を剥離する。なお、振動子１０１と振動板１１と音響伝達媒体１３と培養容器２１とのいずれかの間に別の部材が設けられていてもよい。
　なお、付与される振動は超音波帯域の振動であってもよい。ここで、超音波帯域の振動とは２０ｋＨｚ以上の周波数の振動である。なお、細胞剥離装置１０は、音響伝達媒体１３が予め設置された構成であってもよく、音響伝達媒体１３を含まず、細胞剥離装置１０に音響伝達媒体１３をユーザが設置する構成であってもよい。また、振動板１１が、音響伝達媒体１３を振動板１１上に配置する位置を示すマーカー（ラベル、印刷、刻印など）を有していてもよい。振動板１１がマーカーを有することで、ユーザが適切な位置に音響伝達媒体１３を簡単に配置することができる。
　細胞剥離装置１０は、振動子を駆動させることで細胞に振動を付与する制御部をさらに備えていてもよい。音響伝達媒体は、音響伝達材料、音響マッチング材、及び、伝達媒体と呼ぶこともできる。
　ここで、「細胞を剥離する」とは、細胞の培養容器への接着を弱め、細胞を回収できる状態にすることを指す。このとき、剥離された細胞は、個々の細胞として存在してもよいし、複数個の細胞どうしが接着している状態であってもよい。また、後述するように、剥離された細胞がシート状になっていてもよい。
　（円環状、円板状）
　本明細書において、円環状とは、所定の厚みをもった円板状であって、円形の貫通孔を有し、外周と貫通孔とが同心円状になっている形態をいう。また、円板状とは、所定の厚みをもった円形をいう。これら円形および貫通孔の外周形状は、理想的には真円形であるが、模式的に円形とみなし得る限り、楕円形、長円形なども含む。円形が真円形でない場合の半径や直径を、図形の長軸方向の長さ、すなわち長径で定義することとする。なお、円形が真円形でない場合の半径や直径は同面積の真円を仮定して決定してもよい。
　また、円環状または円板状の一部が欠けた形状や一部が突出した形状も、円環状または円板状に含める。従って、製造上のばらつきにより、僅かに変形した場合も、やはり実質的に円環または円板とみなし得る限り、円環状または円板状に含める。一部が欠けた形状や一部が突出した場合の円環の内径、外径や直径、および円板の半径や直径は、その欠陥部や異常部を補った真円を仮定して決定する。
　本発明の実施形態に係る細胞剥離装置として、円環状の振動子と円板状の振動板を備える場合を説明するが、細胞剥離装置の各部材の形状はこれらに限らない。
　（振動子）
　振動子１０１の種類は、圧電タイプでも電磁タイプでも良く、一定周波数の振動が発生できれば特に限定されない。振動子１０１の種類が圧電タイプであれば、ユニモルフタイプ、バイモルフタイプ、ボルト締めランジュバンタイプから選択すれば良い。また、発生させたい周波数や力、振動振幅に合わせて、振動子１０１の材料や構造を選択すれば良い。図１Ａ、図１Ｂ及び図１Ｃに示す振動子１０１は円環状で振動板１１は円板状であり、圧電タイプのユニモルフタイプである。
　図２Ａ、図２Ｂは、本発明の実施形態に係る細胞剥離装置１０に用いられる振動子１０１の概略図である。図２Ａは、円環状の振動子１０１を振動板側とは反対の方向（図１Ｃにおける原点からｙ方向に向かう向き）から見たものである。図２Ｂは、振動子１０１を振動板側（図１Ｃにおける原点からｙ軸の負の方向に向かう向き）から見たものである。
　振動子１０１は、円環状の圧電材料１２と、圧電材料１２の第一の面（振動板側、図１Ｃにおけるｙ方向）に設けられた共通電極１１１と、振動板側と反対（図１Ｃにおけるｙ軸の負の方向）の面である第二の面に設けられた駆動電極１１０を有している。駆動電極１１０と共通電極１１１間に交番電圧を発生させると、圧電材料１２が伸縮する。これにより、振動板１１の振動子側の面が面内方向に伸縮するため、振動板１１は面外方向に撓んで振動する。図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃでは共通電極１１１および駆動電極１１０の表示は省略している。
　（圧電材料）
　本発明の実施形態に係る振動子１０１の圧電材料１２の形態は限定されず、セラミックス、粉末、単結晶、スラリーなどのいずれの形態でも構わないが、セラミックスであることが好ましい。本明細書中において「セラミックス」とは、基本成分が金属酸化物であり、熱処理によって焼き固められた結晶粒子の凝集体（バルク体とも言う）、いわゆる多結晶を表す。焼結後に加工されたものも含まれる。圧電材料１２の組成は、特に限定されない。例えば、チタン酸ジルコン酸鉛、チタン酸バリウム、チタン酸ジルコン酸、チタン酸ビスマスナトリウム、ニオブ酸カリウムナトリウム、ニオブ酸チタン酸ナトリウムバリウム、及び鉄酸ビスマスからなる群から選択される少なくとも一種の組成の圧電材料１２や、これらの組成を主成分とした圧電材料１２を振動子１０１に用いることができる。
　本発明の実施形態に係る圧電材料１２の機械的品質係数は１０００以上であることが好ましい。
　（機械的品質係数）
　機械的品質係数とは圧電材料１２を振動子１０１として評価した際に振動による弾性損失を表す係数であり、機械的品質係数の大きさはインピーダンス測定における共振曲線の鋭さとして観察される。つまり振動子１０１の共振の鋭さを表す定数である。弾性損失は熱を発生し、その熱が細胞へ伝わると、細胞の死滅や、異常な細胞型の発現を引き起こす恐れがある。圧電材料１２の機械的品質係数が１０００以上であると、圧電材料１２を用いた振動子１０１の弾性損失が減少し、駆動時の振動子１０１の発熱量を低減できる。
　（圧電定数および機械的品質係数の測定）
　前記圧電材料１２の機械的品質係数は、市販のインピーダンスアナライザーを用いて得られる共振周波数及び反共振周波数の測定結果から、電子情報技術産業協会規格（ＪＥＩＴＡ　ＥＭ－４５０１）に基づいて、計算により求めることができる。以下、この方法を共振－反共振法と呼ぶ。
　振動子１０１の圧電材料１２の機械的品質係数が１０００以上であると、振動時の損失が少なく、発熱量が小さくなり、培養容器２１の細胞へ熱が伝わりにくくなる。
　（検知電極）
　本発明の一実施形態に用いる振動子１０１は、検知電極を備えた構成であっても良い。検知電極とは、振動板１１に発生する屈曲振動によって発生する正圧電効果を、共通電極１１１と検知電極に挟まれた部分の圧電材料１２に生じる電圧変化として検知することで、振動板１１の振動状態を監視する機能をもつ。振動子１０１が検知電極を備えることにより、振動状態を駆動条件へフィードバックしたり、故障を検知したりすることができる。
　（電極の特性、素材、形成方法）
　検知電極、共通電極１１１、駆動電極１１０は、抵抗値が１０Ω未満、好ましくは１Ω未満の層状あるいは膜状の導電体からなる。電極の抵抗値は、例えば回路計（電気テスター）で測定することで評価できる。各電極の厚さは５ｎｍから２０μｍ程度である。その材質は特に限定されず、圧電材料１２に通常用いられているものであればよい。
　電極の材料としては、例えば、Ｔｉ、Ｐｔ、Ｔａ、Ｉｒ、Ｓｒ、Ｉｎ、Ｓｎ、Ａｕ、Ａｌ、Ｆｅ、Ｃｒ、Ｎｉ、Ｐｄ、Ａｇ、及びＣｕからなる群から選択される少なくとも一種の金属およびこれらの化合物を挙げることができる。前記電極は、これらのうちの１種からなるものであっても、あるいはこれらの２種以上を積層してなるものであってもよい。これらのうち、本発明の一実施形態に用いる電極としては、ＡｇペーストやＡｇの焼きつけ電極、Ａｕ／Ｔｉのスパッタリング電極などが、抵抗値が小さいため好ましい。
　（振動板の形状）
　振動板１１の形状は、振動子１０１の振動が音響伝達媒体１３を介して培養容器２１に伝えられる形状であれば特に限定されない。例えば振動子１０１がボルト締めランジュバンタイプであれば、所望の振動振幅が発生するように、振動板１１はコーンやホーンから構成されていても良い。また、振動子１０１がユニモルフタイプであれば、振動板１１は薄い板状であることが好ましい。
　ただし、培養容器２１の培養面とは反対側の面の端部に、反対側の面に略垂直な方向に突出した突出部２３をもつ場合がある。培養容器２１が、音響伝達媒体１３に載置された際に、音響伝達媒体１３、及び振動板１１は、前記突出部２３と接しないように構成されていることが好ましい。
　突出部２３は図１Ｃの一点鎖線で囲まれた部分のように、音響伝達媒体側に突出した部分である。培養容器２１が音響伝達媒体１３に重ねて配置される際に、音響伝達媒体１３、及び振動板１１が突出部２３と接すると、接触部分の振動が低減されるため、培養容器２１に励振される屈曲振動も低減されてしまう恐れがある。
　図１Ｂに示すように、突出部２３が振動板１１に接触しないように、振動板１１に溝１４を設けると、培養容器２１に励振される屈曲振動が低減されないので好ましい。すなわち、図１Ｃの通り、細胞剥離装置に音響伝達媒体１３と培養容器２１とをこの順に重ねて配置した際に、重ねて配置される方向（図１Ｃのｙ方向）において突出部２３の位置を振動板１１に投影した位置を含む領域に、溝１４を設けることが望ましい。
　培養容器２１の突出部２３と振動板１１が接しない、とは、実質的に培養容器２１の突出部２３が直接振動板１１の振動面と接触しないことであり、好ましくは前記突出部２３が中空にあることである。また、振動板１１の振動が突出部２３から培養容器２１に伝達されない程度の緩衝材があっても構わない。すなわち、音響伝達媒体と振動板との少なくともいずれかが緩衝材を介して突出部と接し、かつ音響伝達媒体と振動板とが緩衝材を介さずに突出部と接しないように構成されていてもよい。緩衝材は、フェルトとスポンジの少なくともいずれかであることが好ましい。
　振動板１１の振動子１０１を設ける面は、平面であると、圧電材料１２の伸縮にともなった振動の伝達が良好になるため、好ましい。振動板１１の面上に振動子１０１を設ける手段は限定されないが、振動の伝達を阻害しないように密着させるか、高弾性の接着層（図示を省略）を介在させて接着させることが好ましい。例えば、エポキシ系樹脂が接着層として好適に用いられる。
　（振動板の材質）
　振動板１１は、振動子１０１と一体となって面外振動を発生し、音響伝達媒体１３を介して培養容器２１に振動を伝達するという目的から、弾性体であることが好ましい。また、振動板１１は弾性体としての性質および加工性の観点からガラス、金属、及び石英からなる群から選択される少なくとも一種を含むことが好ましい。
　振動板１１に使用可能な金属としては、アルミ、真鍮、Ｆｅ－Ｎｉ３６％合金、及びステンレス鋼（ＳＵＳ）からなる群から選択される少なくとも一種を例示できる。
　（音響伝達媒体）
　振動板１１の面上に音響伝達媒体１３を設ける手段は限定されないが、振動の伝達を阻害しないように加圧して密着させるか、高弾性の接着層（図示を省略）を介在させて接着させることが好ましい。加圧接着させる場合は、音響伝達媒体１３の表面を平滑にすることで密着性が向上する。
　（音響伝達媒体と培養容器の接触位置と屈曲振動の説明）
　振動板１１の振動が音響伝達媒体１３を介して培養容器２１に伝達されることで、培養容器２１に屈曲振動が励振される。また、励振される屈曲振動は、複数の腹部を持つ屈曲振動であってもよい。このとき、音響伝達媒体１３と培養容器２１は複数の腹部の少なくとも一部を含む領域で接し、屈曲振動の節部では接しない。ここで、音響伝達媒体１３と培養容器２１とが接する領域は、腹部のみからなる領域であってもよく、腹部と節部との間の領域と腹部を含むが節部を含まない領域であってもよい。
　ここで、本明細書で説明する屈曲振動は培養容器２１の固有振動モードであり、培養面である培養容器２１の底面部２４が、面外方向の振幅を有する固有振動モードである。また、本発明の一実施形態における屈曲振動は複数の腹部を持つ２次以上の固有振動モードである。ここで、固有振動モードとは、固有振動数で駆動される際の培養容器２１の変形状態を指すモードであり、固有振動数とは、細胞剥離装置を駆動させたときに振動振幅が極大となる振動数であるとする。
　本発明の一実施形態における屈曲振動は、培養容器２１に伝わる振動が任意の周波数のときに、培養容器２１の底面部の面外方向の振動振幅が極大となる定在波である。屈曲振動の振幅が極大となる部分が腹部であり、極小となる部分が節部である。
　培養容器２１に伝わる振動は、振動子１０１の振動が振動板１１に伝達され、振動板１１の振動が音響伝達媒体１３を介して伝達されることで生じる振動であるため、培養容器２１に伝わる振動の周波数は振動子１０１に印加される交番電圧の周波数と一致する。
　図３Ａ、図３Ｂは音響伝達媒体１３と、図１Ａ、図１Ｂ及び図１Ｃの培養容器の底面部２４が屈曲振動する固有振動モードの変形状態を模式的に表したものである。図３Ａは培養容器２１の下方から見た平面図である。図３Ｂは培養容器の底面部２４の変形状態の中央断面（図３Ａの一点鎖線Ａ－Ａ位置）を側方から見た側面図である。ただし、図３Ｂの変形量については変形倍率を大きくして図示している。図３Ａの中央の黒丸部と破線部が腹部１７であり、二点鎖線部が節部１８である。
　図３Ｂのように、培養容器の底面部２４の屈曲振動の腹部１７に相応する位置に音響伝達媒体１３を設け、節部１８には設けない。このとき、音響伝達媒体１３と培養容器２１は屈曲振動の腹部１７で接し、屈曲振動の節部１８では接しない。
　これにより、振動子１０１および振動板１１の振動が、音響伝達媒体１３を介して培養容器２１の屈曲振動の腹部１７に伝わるため、培養容器の底面部２４の屈曲振動が強く励振され、屈曲振動の振動振幅が大きくなる。音響伝達媒体１３が屈曲振動の節部１８にあると、振動子１０１の振動が屈曲振動の節部１８に伝わり、固有振動モードとは異なる形状の振動をさせてしまう力が働く。そのため、屈曲振動の励振は弱くなって振動振幅は小さくなり、その結果、培養容器２１の細胞が剥離しにくくなる。
　音響伝達媒体１３は屈曲振動の節部１８に接しない範囲で培養容器２１の屈曲振動の腹部周辺にも設置した方が良い。一方、１次の屈曲振動では培養容器２１の端部付近が節部１８になるため、ほぼ全面に音響伝達媒体１３を設けないと振動子１０１の振動を培養容器２１へ効率的に伝えることができない。
　ここで、図４は、図１Ｃの培養容器の底面部の反りを、実際よりも反り量を大きくして図示したものである。反り量ΔＺは、培養容器２１の大きさにもよるが、例えば外径５１．６ｍｍのコーニング社の培養容器２１であると０．１５ｍｍ～０．４７ｍｍのばらつきを持つ。このような反りのある培養容器の底面のほぼ全面に音響伝達媒体１３を設けようすると反りの中心部に空気が混入してしまい、屈曲振動の腹部１７に音響伝達媒体１３が接しなくなる。
　従って、二次以上の屈曲振動であれば、腹部１７と節部１８の間の距離が小さくなり、実質的に設置する音響伝達媒体１３の大きさも小さくなる。これにより、培養容器２１と音響伝達媒体１３との間に空気が入りにくくなり、振動子１０１の振動が伝わりやすくなる。
　培養容器２１に３個以上の腹部１７、さらに好ましくは５個以上の腹部１７を持つ屈曲振動が励振される場合は、音響伝達媒体１３と培養容器２１は屈曲振動の腹部１７で接し、屈曲振動の節部１８では接しないようにすることが望ましい。これにより培養容器２１と音響伝達媒体１３の間に空気が入りにくくなり、振動子１０１の振動が伝わりやすくなり好ましい。
　また、音響伝達媒体１３と培養容器２１が接する領域の直径をＬＮ１、屈曲振動の第１の腹部から、第１の腹部に最も近い、屈曲振動の第１の節部までの距離をＬＭとすると、ＬＮ１／ＬＭは１．０以上１．６以下であると好ましい。ＬＮ１／ＬＭが１．０以上の範囲であると、振動が伝達される領域が広くなるため、振動子１０１の振動が効率良く培養容器２１に伝わる。ＬＮ／ＬＭが１．６以下の範囲であると、培養容器２１と音響伝達媒体１３の間に空気が入りにくくなる。
　また、振動子１０１によって音響伝達媒体１３を介して培養容器２１に励振される複数の腹部１７を持つ屈曲振動は、異なる複数の固有振動モードであると好ましい。
　図５Ａ、図５Ｂは、図１Ａ、図１Ｂ及び図１Ｃの音響伝達媒体１３と培養容器の底面部２４を抜き出して、図３Ａ、図３Ｂとは異なる固有振動モードの屈曲振動の変形状態を模式的に表したものである。
　図５Ａは培養容器２１の下方から見た平面図で、図５Ｂは培養容器の底面部２４の変形状態の中央断面（図５Ａの一点鎖線Ｂ－Ｂ位置）を側方から見た側面図である。図５Ａの黒丸部と破線部が腹部１７であり、二点鎖線部が節部１８である。
　図３Ａの屈曲振動の固有振動モードのみであると、培養容器２１に励振される屈曲振動の節部１８は、振動振幅は極小であるため細胞が剥離しにくい。従って、該節部１８の細胞も剥離する場合は、該節部１８に振動を与えるように、例えば図５Ａと図５Ｂのような図３Ａ、図３Ｂとは別の固有振動モードの屈曲振動を励振させると良い。培養容器２１に励振される屈曲振動が異なる複数の固有振動モードであると、互いに節部１８の位置はほぼ異なるため、互いの節部１８を振動させることができ、細胞を剥離することができる。
　このように異なる複数の固有振動モードを励振させる場合は、それぞれの固有振動モードが励振される周波数に駆動周波数を変えることで実現できる。また、それぞれの固有振動モードが励振される周波数を含む範囲で駆動周波数を掃引することでも実現できる。
　また、異なる複数の固有振動モードを励振させる場合は、それぞれの固有振動モードの屈曲振動に共通する腹部１７の位置に音響伝達媒体１３を設けることが望ましい。また、いずれの屈曲振動の節部１８には音響伝達媒体１３を設けないことで、音響伝達媒体１３と培養容器２１は屈曲振動の腹部１７で接し、屈曲振動の節部１８では接しないようにできる。
　（音響伝達媒体の形状）
　音響伝達媒体１３の形状は特に限定されないが、加工しやすいという観点で、直方体状、円板状、円環状であることが好ましい。図１Ａ、図１Ｂ及び図１Ｃに示す音響伝達媒体１３は円板状である。すなわち、音響伝達媒体１３と培養容器２１とが重ねて配置される方向に垂直な平面内における音響伝達媒体１３の断面は円形である。
　音響伝達媒体１３が培養容器２１と接する部分の音響伝達媒体１３の厚さは、０．１ｍｍ以上、３ｍｍ以下であることが好ましい。厚さが３ｍｍ以上であると、音響伝達媒体１３内で振動が減衰してしまうため、振動子１０１の振動が培養容器２１に伝わらなくなる。また、音響伝達媒体１３の厚さが０．１ｍｍより小さいと作製が難しいため、音響伝達媒体１３の厚さは０．１ｍｍ以上であることが好ましい。
　また、音響伝達媒体１３の、音響伝達媒体１３が培養容器２１と接する面が凸の曲面を含むことが好ましい。音響伝達媒体１３が平面であると、音響伝達媒体１３と培養容器２１との間に空気が入り込む可能性がある。そのため、音響伝達媒体１３の培養容器２１と接する面が凸の曲面を含むことで、培養容器２１と音響伝達媒体１３の間に空気が入りにくくなる。
　図６は、本発明の実施形態に係る細胞剥離装置１０の中央断面を側方から見た模式的側面図である。細胞剥離装置１０に載置された培養容器２１に蓋２２をして、その上に円環状の錘１５を載せている。また、振動板１１と振動子１０１を挟むように円環状の固定部材１６で固定されている。錘１５によって、培養容器２１と音響伝達媒体１３は加圧接触されており、培養容器２１と音響伝達媒体１３の間に空気は入らず、振動子１０１の振動が培養容器２１に伝わりやすくなる。
　（音響伝達媒体の材質）
　音響伝達媒体１３は、振動子１０１の振動が培養容器２１へ伝わりやすい素材であって、かつ培養容器２１との間に空気が入りにくく、タック性が大きい素材が良い。音響伝達媒体１３は高分子材料を含むことが好ましく、例えば、ゴム、ゲル、及び粘弾性体からなる群から選択される少なくとも一種を素材として用いることができる。これらの中でもゴムは振動伝達性が高く、安価で好ましい素材である。また、駆動周波数の周波数帯域での減衰の少ない物性であることで振動の伝達効率が高く、さらに音響伝達媒体１３自身の発熱が低減できることから、シリコーンゴムが好ましい。
　（培養容器に励振された振動の腹部、節部の位置の確認方法）
　培養容器２１に励振される任意の次数の屈曲振動の腹部１７または節部１８の位置を確かめる方法を説明する。培養容器２１の中には何も入れない状態で、例えば図１Ａ、図１Ｂ及び図１Ｃの構成で、振動子１０１の駆動電極１１０に小電圧の入力信号（例えば１Ｖ～１０Ｖの交流電圧）を入力する。そして、レーザードップラー振動計を用いて入力信号の周波数を変化させながら、周波数ごとの培養容器の底面部２４の表面の複数の点の振動振幅を測定することで確かめられる。具体的には、培養容器の底面部２４の表面を、例えば１ｍｍ間隔で走査することにより、底面部２４の振動振幅が測定できる。底面部２４の各測定ポイントのうち、振動振幅が極小となる部分が節で、その位置が節部１８であり、振動振幅が極大となる部分が腹で、その位置が腹部１７である。
　培養容器表面からのレーザーの反射が弱くレーザードップラー振動計による測定が困難な場合は、振動振幅を測定する面に再帰性の反射シートを貼ったり、白金や金などの金属を蒸着したりすることで、レーザーの反射を強くすることができる。ただし、蒸着などを行うと培養容器２１に培養する細胞の生存率が低下するため、その場合は、実際に細胞を培養する培養容器２１とは別に振動振幅測定用の培養容器２１を用意して測定するか、培養容器２１の細胞を剥離した後で測定して確認すれば良い。
　（駆動中に位置関係を維持する）
　図１Ａ、図１Ｂ及び図１Ｃや図３Ａ、図３Ｂの構成により、振動子１０１の振動を培養容器２１の屈曲振動の腹部１７に伝えて培養容器２１の細胞を剥離できるが、振動子１０１と振動板１１と音響伝達媒体１３の３つの部材の配置が駆動中に変化すると振動の伝達効率が下がる恐れがある。そのため、本発明の一実施形態に係る細胞剥離装置１０を駆動する際には、振動子１０１と、振動板１１と音響伝達媒体１３の３つの部材の配置が互いに固定されていることが好ましい。固定するためには、図６に示す固定部材１６を用いても良いし、互いに接着剤を用いて接着しても良い。また、その他の部品にそれぞれ接着剤などで固定しても良い。固定部材１６は振動子１０１と振動板１１の振動を阻害しないように、フェルトまたはスポンジ、ゴムを用いることが好ましい。
　（培養容器）
　培養容器２１の材質は特に限定されない。培養容器２１の材質は、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリウレタン、ポリウレア、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸誘導体、ポリアクリロニトリル、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリ（メタ）アクリルアミド誘導体、ポリスルホン、セルロース、セルロース誘導体、ポリシリコーン、ポリメチルペンテン、ガラス、及び金属からなる群から選択される少なくとも一種が挙げられる。この中でもポリスチレンが好ましい。
　培養容器２１のタイプには、ディッシュとフラスコとウェルプレートがあるが、特にディッシュはコーニング社、サーモフィッシャーサイエンティフィック社、日本のＡＧＣテクノガラス社（Ｉｗａｋｉ）社が汎用品として用いられている。培養容器の培養面とは、側壁に囲まれた面であって、細胞を培養する際には培養面に細胞が接着する。
　（細胞の培養条件）
　細胞の培養条件は、培養する細胞に従って適宜選択し得る。一般的には、培養容器２１内に適切な培地を添加し、そこに１．０×１０１～５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２程度の細胞を播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養する。この際、培養容器２１中の細胞占有面積率が７～８割程度、いわゆるサブコンフルエントの状態になるまで培養するのが好ましい。なお、細胞が培養面を覆ったコンフルエント状態になるまで培養し、シート状に培養された状態（細胞シート）であっても構わない。
　（剥離試験）
　細胞剥離装置１０は、様々な種類の細胞に適用することができる。細胞には、例えばチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞、マウス結合組織Ｌ９２９細胞、マウス骨格筋筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞）、ヒト胎児肺由来正常二倍体線維芽細胞（ＴＩＧ－３細胞）、ヒト胎児腎臓由来細胞（ＨＥＫ２９３細胞）、ヒト肺胞基底上皮腺癌由来Ａ５４９細胞、ヒト子宮頸癌由来ＨｅＬａ細胞、上皮細胞、内皮細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、ニューロン細胞、グリア細胞、繊維芽細胞、肝実質細胞、肝非実質細胞、脂肪細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、胚性癌（ＥＣ）細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、皮膚幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、各組織の前駆細胞、及びそれらから分化誘導した細胞からなる群から選択される少なくとも一種が挙げられる。
　培養した細胞の培養液は、細胞剥離工程では剥離液に置換する必要がある。剥離液は、通常、タンパク質分解酵素を含有している。タンパク質分解酵素として、例えばトリプシン、アキュターゼ、コラゲナーゼ、天然プロテアーゼ、キモトリプシン、エラスターゼ、パパイン、プロナーゼ、及びそれらの組み換え体からなる群から選択される少なくとも一種が挙げられる。しかし、タンパク質分解酵素が細胞の有する膜タンパク質を分解する可能性が懸念される。これに対し、本件の細胞剥離手法では、タンパク質分解酵素を用いないか、タンパク質分解酵素を用いても極少量のタンパク質分解酵素で同様の効果を発揮することから、細胞の膜タンパク質の分解を低減する効果がある。細胞の膜タンパク質を減少しにくくするために剥離液に培地成分が含まれていても構わない。
　剥離液に交換した培養容器２１を細胞剥離装置１０へ設置し、保温機内で一定温度、例えば３７℃で保持した状態で細胞剥離装置１０を駆動する。駆動時間は細胞剥離に十分な時間で駆動する。駆動後、スポイトで剥離した細胞を回収し、培養容器２１に接着している細胞をピペッティング法で回収する。剥離率は、細胞剥離装置の振動による剥離細胞数とピペッティング法による剥離細胞数との合算数に対する、振動による剥離細胞数の割合である。生存率は回収した細胞の中で、生存している細胞の割合である。
　また、細胞剥離後の培養容器２１の底面に残った残細胞をバックライトによる散乱光を用いて観察することができる。
　（その他の構成１）
　本発明の実施形態に係る細胞剥離装置は、音響伝達媒体１３として、複数の音響伝達媒体を含んでもよく、また、円板状以外の形状、例えば円環状の音響伝達媒体を用いてもよい。
　図７Ａ、図７Ｂは、本発明の実施形態に係る細胞剥離装置１０のその他の例を示す概略図である。図７Ａは、本発明の実施形態に係る細胞剥離装置１０の中央断面を側方から見た模式的側面図である。図７Ｂは図７Ａの細胞剥離装置１０の分解斜視図で、円環状の振動子１０１の中心軸方向（重ねて配置される方向）に音響伝達媒体１３、振動板１１、振動子１０１を分離して図示している。
　図７Ａ、図７Ｂに示す一実施形態は、音響伝達媒体１３と振動板１１の形状が異なる場合の一実施形態である。音響伝達媒体１３の厚さが図１Ａ、図１Ｂ及び図１Ｃの音響伝達媒体１３よりも厚く、培養容器２１の突出部が振動板１１と接触する恐れが無いため、円板状の振動板１１には溝が無い。また、音響伝達媒体１３として、円板状の音響伝達媒体と円環状の音響伝達媒体とが、培養容器２１と屈曲振動の腹部１７で接するように設置されており、このような形態でも本発明の効果が得られる。
　円環状の音響伝達媒体１３と培養容器２１が接する領域の幅をＬＮ２、屈曲振動の第１の腹部から、第１の腹部に最も近い屈曲振動の第１の節部までの距離をＬＭとすると、ＬＮ２／ＬＭは１．０以上１．６以下であると好ましい。ここで、円環状の音響伝達媒体１３と培養容器２１が接する領域の幅とは、円環状の音響伝達媒体１３の径方向（重ねて配置される方向に垂直な方向）における前記領域の外周と内周との間の距離である。ＬＮ２／ＬＭが１．０以上の範囲であると、振動が伝達される領域が広くなるため、振動子１０１の振動が効率良く培養容器２１に伝わる。ＬＮ２／ＬＭが１．６以下の範囲であると、培養容器２１と音響伝達媒体１３の間に空気が入りにくくなる。
　（その他の構成２）
　本発明に係る一実施形態の細胞剥離装置は、音響伝達媒体１３が屈曲振動の腹部１７の少なくとも一部で培養容器２１と接していればよく、音響伝達媒体１３が培養容器２１の中心部と接していなくてもよい。
　図８Ａと図８Ｂは、音響伝達媒体１３と、培養容器の底面部２４が屈曲振動するその他の固有振動モードの変形状態を模式的に表したものである。図８Ａは培養容器２１の底面部２４を培養容器２１の下方から見た平面図である。図８Ｂは培養容器の底面部２４の変形状態の中央断面（図８Ａの一点鎖線Ｂ－Ｂ位置）を側方から見た模式的側面図である。ただし、図８Ｂの変形量については変形倍率を大きくして図示している。図８Ａの黒丸部が腹部１７であり、二点鎖線部が節部１８である。図８Ａ、図８Ｂのように、培養容器の底面部２４の屈曲振動の腹部１７に相応する位置に音響伝達媒体１３を設け、節部１８には設けないことで、音響伝達媒体１３と培養容器２１は屈曲振動の腹部１７で接し、屈曲振動の節部１８では接しない。
　（その他の構成３）
　図９は、本発明の実施形態に係る細胞剥離装置１０を示す概略図である。振動子１０１は円環状の圧電材料１２と駆動電極１１０、共通電極１１１からなるボルト締めランジュバンタイプで、金属ブロック３０と振動板１１が中央のボルト３１でつながっている。駆動電極１１０と共通電極１１１間に交番電圧を発生させると、圧電材料１２が伸縮して振動板１１は培養容器２１の方向に振動する。これにより、振動子１０１および振動板１１の振動が音響伝達媒体１３を介して培養容器２１の底面部２４で励振される屈曲振動の腹部１７に伝わる。このとき、培養容器の底面部２４の屈曲振動が強く励振され、その振動振幅が大きくなり、培養容器２１の細胞が剥離する。
　（実施例）
　以下に第１の実施の形態の実施例１を示す。
　実施例１には、図１Ａ、図１Ｂ及び図１Ｃの細胞剥離装置１０を用いた。培養容器２１には、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製Φ６０ｍｍディッシュを用いた。細胞剥離装置１０の振動板１１として、直径が７０ｍｍ、厚さが４ｍｍである、突出部２３が振動板１１に接触しないように溝１４を形成した円板状のガラスを用いた。溝１４の寸法は、内径５０ｍｍ、幅５ｍｍ、深さ１ｍｍとした。圧電材料１２の材料組成はＰＺＴ（富士セラミックス社製Ｃ２１３）、外径は振動板１１と同じ７０ｍｍ、内径は５７ｍｍ、厚さは２ｍｍとし、駆動電極１１０と共通電極１１１には銀を使用した。次に、振動子１０１と振動板１１をエポキシ接着剤にて接着し、振動板１１上の中央部に、厚さ０．８ｍｍ、直径５ｍｍの円板状の音響伝達媒体１３を設置した。音響伝達媒体１３の材質は、硬度５０°のシリコーンゴムである。
　次に、図６のように細胞剥離装置１０を組立て、振動板１１上に設置したシリコーンゴム上に、細胞を培養した培養容器２１のコーニング社製Φ６０ｍｍディッシュを設置し、その上に３００ｇの円環状の錘１５を載せた。このとき、音響伝達媒体１３と培養容器２１との間に空気は入っておらず、全面が密着していることを目視により確認した。
　ここで、振動子１０１を電圧５０Ｖ、周波数２２－３７ｋＨｚで掃引して、各周波数のときの培養容器の底面部２４をレーザードップラー振動計（グラフテック社製ＡＴ７２００）にて測定した。その結果、２４．３ｋＨｚで図３Ａの屈曲振動の定在波が出ていることと、３５．１ｋＨｚで図５Ａの屈曲振動の定在波が出ていることを確認した。ただし、振動の測定には、測定面に白金を蒸着した培養容器２１を別途用意して測定した。
　次に、細胞の培養には、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈａｍｓｔｅｒ　Ｏｖａｒｙ）細胞をレーザー測定用とは別に用意したサーモフィッシャーサイエンティフィック社製Φ６０ｍｍディッシュに１００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養した。培地はＨａｍ’ｓ　Ｆ１２（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にＦｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ（シグマアルドリッチ社製）を１０％、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００００Ｕ／ｍｌ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を１％添加したものを用いた。培養は４８時間行ない、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、細胞接着ならびに増殖を確認した。ディッシュの細胞占有面積率は８割程度であった。
　ディッシュ内の培地を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（－）、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）で洗浄した。その後、剥離液としてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（－）、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）をディッシュ内に添加し、３分間浸漬させた。
　その後、培養容器２１を細胞剥離装置１０に設置し、１分３０秒間周波数掃引振動（周波数２２－３７ｋＨｚ、周波数掃引周期１ｓ、電圧１００Ｖ）で細胞を剥離させて細胞の剥離を行った。このとき、剥離液の温度を熱電対で測定したところ、剥離前に対する温度上昇は１℃以下であった。
　剥離した細胞は回収した後、血球計算盤を用いて細胞数の測定及びトリパンブルー染色による生死判別法を用いて生存率を算出した。はじめに、剥離した細胞の懸濁液と０．４％トリパンブルー溶液を１：１で混合し、懸濁液に含まれる死細胞を染色した。続いて、懸濁液を血球計算盤（ＮａｎｏＥｎｔｅｋ製、ＤＨＣ－Ｎ０１）に注入し、血球計算盤のグリッド上にある生細胞および死細胞の数を顕微鏡観察によりカウントした。カウントされた生細胞数の全細胞数に対する割合を算出し、生存率とした。
　また、超音波剥離後のディッシュに対して、セルスクレーパーを用いて超音波で剥離できなかった細胞も全て剥離した。剥離した細胞の懸濁液を血球計算盤（ＮａｎｏＥｎｔｅｋ製、ＤＨＣ－Ｎ０１）に注入し、顕微鏡観察することによって、剥離された細胞の数を測定した。超音波で剥離した全細胞数とその後セルスクレーパーで剥離した細胞数を合わせて総剥離細胞数とし、総剥離細胞数に対する超音波剥離細胞数の割合を剥離率と定義し、算出した。結果、生存率は９５％、剥離率は９１％であった。なお、生存率、剥離率ともに９０％以上を良好と判断した。
　本発明の実施形態は、記憶媒体に記録されたコンピュータ実行可能命令（例えば、１つ以上のプログラム）を読み出して実行するシステムまたは装置（例えば、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ））のコンピュータによって、上記実施形態の１つまたは複数の機能を実行することによって、および／または、上記実施形態の１つまたは複数の機能を実行する１つまたは複数の回路を含むシステムまたは装置のコンピュータによって、および、例えば、上記実施形態の１つまたは複数の機能を実行するために、記憶媒体からコンピュータ実行可能命令を読み出して実行することによって、および／または、上記実施形態の１つまたは複数の機能を実行するために１つまたは複数の回路を制御することによって、システムまたは装置のコンピュータによって実行される方法によって実現することもできる。コンピュータは、１つ以上のプロセッサ（例えば、中央処理装置（ＣＰＵ）、マイクロ処理装置（ＭＰＵ））を含むことができ、コンピュータ実行可能命令を読み出して実行するために、別個のコンピュータまたは別個のプロセッサのネットワークを含むことができる。コンピュータ実行可能命令は、例えば、ネットワークまたは記憶媒体からコンピュータに提供されてもよい。記憶媒体は、例えば、ハードディスク、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、分散コンピューティングシステムの記憶装置、光ディスク（コンパクトディスク（ＣＤ）、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、ブルーレイディスク（ＢＤ）など）、フラッシュメモリデバイス、メモリカードなどのうちの１つ以上を含み得る。
　本実施形態の開示は、以下の構成及び方法を含む。
　（構成１）
　細胞の培養容器の培養面の上に設けられた細胞に振動を付与することによって前記細胞を剥離する細胞剥離装置であって、
　前記細胞剥離装置は、振動子と振動板とを有し、
　前記振動子、前記振動板、音響伝達媒体、及び前記培養容器がこの順に重ねて配置され、
　前記振動板の振動が前記音響伝達媒体を介して前記培養容器に伝達されることで、前記培養容器に屈曲振動が励振され、
　前記音響伝達媒体と前記培養容器とが前記屈曲振動の腹部を含む領域で接し、前記屈曲振動の節部では接しないように前記細胞剥離装置が構成されることを特徴とする細胞剥離装置。
　（構成２）
　前記培養容器に複数の腹部を持つ屈曲振動が励振され、
　前記音響伝達媒体と前記培養容器とが前記複数の腹部の少なくとも一部を含む領域で接するように前記細胞剥離装置が構成されることを特徴とする構成１に記載の細胞剥離装置。
　（構成３）
　前記振動は、超音波帯域の振動であることを特徴とする構成１または２に記載の細胞剥離装置。
　（構成４）
　前記音響伝達媒体は高分子材料を含むことを特徴とする構成１乃至３のいずれか一項に記載の細胞剥離装置。
　（構成５）
　前記高分子材料はシリコーンゴムであることを特徴とする構成４に記載の細胞剥離装置。
　（構成６）
　前記音響伝達媒体の前記培養容器と接する面は、凸の曲面を含むことを特徴とする構成１乃至５のいずれか一項に記載の細胞剥離装置。
　（構成７）
　前記重ねて配置される方向に垂直な平面内における、前記音響伝達媒体の断面は円形であることを特徴とする構成１乃至６のいずれか一項に記載の細胞剥離装置。
　（構成８）
　前記屈曲振動の第１の腹部から、前記第１の腹部に最も近い、前記屈曲振動の第１の節部までの距離がＬＭであり、前記音響伝達媒体と前記培養容器とが接する領域の直径がＬＮ１である場合、ＬＮ１／ＬＭは、１．０以上１．６以下であることを特徴とする構成７に記載の細胞剥離装置。
　（構成９）
　前記音響伝達媒体は円環状であることを特徴とする構成１乃至６のいずれか一項に記載の細胞剥離装置。
　（構成１０）
　前記屈曲振動の第１の腹部から、前記第１の腹部に最も近い前記屈曲振動の第１の節部までの距離がＬＭであり、前記重ねて配置される方向に垂直な方向における、前記音響伝達媒体と前記培養容器とが接する領域の幅がＬＮである場合、ＬＮ／ＬＭは、１．０以上１．６以下であることを特徴とする構成９に記載の細胞剥離装置。
　（構成１１）
　前記振動板は、前記音響伝達媒体を介して振動を伝達させることにより、前記培養容器に異なる複数の固有振動モードの屈曲振動を励振することを特徴とする構成１乃至１０のいずれか一項に記載の細胞剥離装置。
　（構成１２）
　前記振動子は、前記培養容器に異なる複数の固有振動モードが励振される周波数で駆動されることを特徴とする構成１１に記載の細胞剥離装置。
　（構成１３）
　前記振動子は、前記培養容器の異なる複数の固有振動モードが励振される周波数を含む範囲の周波数を掃引することで駆動されることを特徴とする構成１１に記載の細胞剥離装置。
　（構成１４）
　前記培養容器は、前記培養面とは反対側の面に突出部を有し、
　前記音響伝達媒体及び前記振動板が前記突出部と接しないように前記細胞剥離装置が構成されていることを特徴とする構成１乃至１３のいずれか一項に記載の細胞剥離装置。
　（構成１５）
　前記音響伝達媒体と前記振動板との少なくともいずれかが緩衝材を介して前記突出部と接するように前記細胞剥離装置が構成されていることを特徴とする構成１４に記載の細胞剥離装置。
　（構成１６）
　前記振動板は、前記重ねて配置される方向において前記突出部の位置を前記振動板に投影した位置を含む領域に、溝が設けられていることを特徴とする構成１４に記載の細胞剥離装置。
　（構成１７）
　前記振動板はガラス、金属、及び石英からなる群から選択される少なくとも一種を含むことを特徴とする構成１乃至１６のいずれか一項に記載の細胞剥離装置。
　（構成１８）
　前記振動子を駆動させることで、前記細胞に振動を付与する制御部を備える構成１乃至１７のいずれか一項に記載の細胞剥離装置。
　（方法１）
　細胞の培養容器の培養面の上に設けられた細胞に振動を付与することによって前記細胞を剥離する細胞剥離方法であって、
　振動子と振動板とを有する細胞剥離装置、及び音響伝達媒体と前記培養容器とを用いて、前記振動子、前記振動板、音響伝達媒体、及び前記培養容器をこの順に重ねて配置した状態で、前記細胞に振動を付与し、
　前記振動板の振動が音響伝達媒体を介して前記培養容器に伝達されることで、屈曲振動が前記培養容器に励振され、前記音響伝達媒体と前記培養容器とが前記腹部を含む領域で接し、前記屈曲振動の節部では接しない状態で前記細胞に振動を付与することを特徴とする細胞剥離方法。
　（方法２）
　複数の腹部を持つ屈曲振動が前記培養容器に励振され、前記音響伝達媒体と前記培養容器とが前記複数の腹部の少なくとも一部を含む領域で接する状態で前記細胞に振動を付与することを特徴とする方法１に記載の細胞剥離方法。
　（方法３）
　前記音響伝達媒体として、前記重ねて配置される方向に垂直な平面内における前記音響伝達媒体の断面が円形である音響伝達媒体を用いて、前記屈曲振動の第１の腹部から、前記第１の腹部に最も近い前記屈曲振動の第１の節部までの距離がＬＭであり、前記音響伝達媒体と前記培養容器とが接する領域の直径がＬＮ１である場合、ＬＮ／ＬＭは、１．０以上１．６以下である状態で前記細胞に振動を付与することを特徴とする方法１または２に記載の細胞剥離方法。
　本発明は上記実施の形態に制限されるものではなく、本発明の精神及び範囲から離脱することなく、様々な変更及び変形が可能である。従って、本発明の範囲を公にするために以下の請求項を添付する。
　本願は、２０２２年１１月１日提出の日本国特許出願特願２０２２－１７５８０９を基礎として優先権を主張するものであり、その記載内容の全てをここに援用する。
　１０　細胞剥離装置
　１１　振動板
　１２　圧電材料
　１３　音響伝達媒体
　１４　溝
　１５　錘
　１６　固定部材
　１７　腹部
　１８　節部
　２１　培養容器
　２２　蓋
　３０　金属ブロック
　３１　ボルト
　２３　突出部
　２４　底面部
　１０１　振動子
　１１０　駆動電極
　１１１　共通電極

Claims (21)

  1. 　細胞の培養容器の培養面の上に設けられた細胞に振動を付与することによって前記細胞を剥離する細胞剥離装置であって、
    　前記細胞剥離装置は、振動子と振動板とを有し、
    　前記振動子、前記振動板、音響伝達媒体、及び前記培養容器がこの順に重ねて配置され、
    　前記振動板の振動が前記音響伝達媒体を介して前記培養容器に伝達されることで、前記培養容器に屈曲振動が励振され、
    　前記音響伝達媒体と前記培養容器とが前記屈曲振動の腹部を含む領域で接し、前記屈曲振動の節部では接しないように前記細胞剥離装置が構成されることを特徴とする細胞剥離装置。
  2. 　前記培養容器に複数の腹部を持つ屈曲振動が励振され、
    　前記音響伝達媒体と前記培養容器とが前記複数の腹部の少なくとも一部を含む領域で接するように前記細胞剥離装置が構成されることを特徴とする請求項１に記載の細胞剥離装置。
  3. 　前記振動は、超音波帯域の振動であることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞剥離装置。
  4. 　前記音響伝達媒体は高分子材料を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の細胞剥離装置。
  5. 　前記高分子材料はシリコーンゴムであることを特徴とする請求項４に記載の細胞剥離装置。
  6. 　前記音響伝達媒体の前記培養容器と接する面は、凸の曲面を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の細胞剥離装置。
  7. 　前記重ねて配置される方向に垂直な平面内における、前記音響伝達媒体の断面は円形であることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞剥離装置。
  8. 　前記屈曲振動の第１の腹部から、前記第１の腹部に最も近い、前記屈曲振動の第１の節部までの距離がＬＭであり、前記音響伝達媒体と前記培養容器とが接する領域の直径がＬＮ１である場合、ＬＮ１／ＬＭは、１．０以上１．６以下であることを特徴とする請求項７に記載の細胞剥離装置。
  9. 　前記音響伝達媒体は円環状であることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞剥離装置。
  10. 　前記屈曲振動の第１の腹部から、前記第１の腹部に最も近い前記屈曲振動の第１の節部までの距離がＬＭであり、前記重ねて配置される方向に垂直な方向における、前記音響伝達媒体と前記培養容器とが接する領域の幅がＬＮである場合、ＬＮ／ＬＭは、１．０以上１．６以下であることを特徴とする請求項９に記載の細胞剥離装置。
  11. 　前記振動板は、前記音響伝達媒体を介して振動を伝達させることにより、前記培養容器に異なる複数の固有振動モードの屈曲振動を励振することを特徴とする請求項１または２に記載の細胞剥離装置。
  12. 　前記振動子は、前記培養容器に異なる複数の固有振動モードが励振される周波数で駆動されることを特徴とする請求項１１に記載の細胞剥離装置。
  13. 　前記振動子は、前記培養容器の異なる複数の固有振動モードが励振される周波数を含む範囲の周波数を掃引することで駆動されることを特徴とする請求項１１に記載の細胞剥離装置。
  14. 　前記培養容器は、前記培養面とは反対側の面に突出部を有し、
    　前記音響伝達媒体及び前記振動板が前記突出部と接しないように前記細胞剥離装置が構成されていることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞剥離装置。
  15. 　前記音響伝達媒体と前記振動板との少なくともいずれかが緩衝材を介して前記突出部と接するように前記細胞剥離装置が構成されていることを特徴とする請求項１４に記載の細胞剥離装置。
  16. 　前記振動板は、前記重ねて配置される方向において前記突出部の位置を前記振動板に投影した位置を含む領域に、溝が設けられていることを特徴とする請求項１４に記載の細胞剥離装置。
  17. 　前記振動板はガラス、金属、及び石英からなる群から選択される少なくとも一種を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の細胞剥離装置。
  18. 　前記振動子を駆動させることで、前記細胞に振動を付与する制御部を備える請求項１または２に記載の細胞剥離装置。
  19. 　細胞の培養容器の培養面の上に設けられた細胞に振動を付与することによって前記細胞を剥離する細胞剥離方法であって、
    　振動子と振動板とを有する細胞剥離装置、及び音響伝達媒体と前記培養容器とを用いて、前記振動子、前記振動板、音響伝達媒体、及び前記培養容器をこの順に重ねて配置した状態で、前記細胞に振動を付与し、
    　前記振動板の振動が音響伝達媒体を介して前記培養容器に伝達されることで、屈曲振動が前記培養容器に励振され、前記音響伝達媒体と前記培養容器とが前記屈曲振動の腹部を含む領域で接し、前記屈曲振動の節部では接しない状態で前記細胞に振動を付与することを特徴とする細胞剥離方法。
  20. 　複数の腹部を持つ屈曲振動が前記培養容器に励振され、前記音響伝達媒体と前記培養容器とが前記複数の腹部の少なくとも一部を含む領域で接する状態で前記細胞に振動を付与することを特徴とする請求項１９に記載の細胞剥離方法。
  21. 　前記音響伝達媒体として、前記重ねて配置される方向に垂直な平面内における前記音響伝達媒体の断面が円形である音響伝達媒体を用いて、前記屈曲振動の第１の腹部から、前記第１の腹部に最も近い前記屈曲振動の第１の節部までの距離がＬＭであり、前記音響伝達媒体と前記培養容器とが接する領域の直径がＬＮ１である場合、ＬＮ／ＬＭは、１．０以上１．６以下である状態で前記細胞に振動を付与することを特徴とする請求項１９に記載の細胞剥離方法。
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