WO2019044804A1 - 細胞生産方法及び細胞生産装置 - Google Patents

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WO2019044804A1
WO2019044804A1 PCT/JP2018/031692 JP2018031692W WO2019044804A1 WO 2019044804 A1 WO2019044804 A1 WO 2019044804A1 JP 2018031692 W JP2018031692 W JP 2018031692W WO 2019044804 A1 WO2019044804 A1 WO 2019044804A1
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acoustic radiation
radiation pressure
cells
culture
culture dish
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PCT/JP2018/031692
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哉裕 今城
佑太 倉科
竹村　研治郎
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学校法人慶應義塾
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/42—Apparatus for the treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C12M3/04—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus with means providing thin layers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves

Definitions

  • the present invention relates to a cell production method and a cell production apparatus.
  • Patent Documents 1 to 3 are known as methods for producing a cell sheet.
  • Patent Document 1 describes a method of producing a cell sheet using dispase, which is an enzyme that selectively cuts adhesion between a cell culture substrate and cells.
  • Patent Document 2 describes a technology related to recovery of cell sheet using a temperature responsive polymer.
  • Patent Document 3 describes a technique for selectively peeling cells from a culture surface by high frequency vibration. In the technique described in Patent Document 3, it is assumed that cells are exfoliated selectively from the culture surface (that is, exfoliation of selected areas).
  • the temperature decrease may reduce the activity of cells, which leads to the deterioration of the quality of the cell sheet produced.
  • cells in the entire culture surface are not collected as a cell sheet, and it is considered difficult to exfoliate in a state where the entire form of the cell sheet is properly maintained.
  • An object of the present invention is to conveniently and inexpensively recover cultured cell sheets or whole single cells.
  • a cell production method of one aspect of the present invention is A first step of culturing a sheet-like cell or a single cell in a culture substrate; The sheet-like cells cultured by applying uniform acoustic radiation pressure or acoustic radiation pressure in which high pressure portions are distributed in the circumferential direction to the cells in the culture substrate cultured in the first step Or second step of exfoliating single cells, including.
  • cultured cell sheets or whole single cells can be conveniently and inexpensively recovered.
  • FIG. 6 is a view showing the retention state of fibronectin in the cell sheet collected by the cell production device 1.
  • a schematic view showing a state in which uniform acoustic radiation pressure perpendicular to the inner bottom surface is applied to the cells in the culture dish 100 and acoustic radiation pressure directed from the inner peripheral surface of the culture dish 100 toward the center is applied. It is. It is a schematic diagram which shows the structure of the vibration member 11 provided with the several ultrasonic transducer
  • a culture medium for cells is formed in a commonly used disposable culture dish to culture adherent cells.
  • an ultrasonic transducer applies an acoustic radiation pressure controlled to a specific form to the cells in the culture dish from the outer bottom surface (back side) of the culture dish.
  • a medium such as glycerol or water
  • acoustic radiation pressure controlled to a specific form for example, (1) acoustic radiation pressure uniformly radiated over the entire culture surface (inner bottom surface) of the culture dish, (2) culture surface of the culture dish ((2) An acoustic radiation pressure in which the high pressure portion is distributed in an annular or spiral shape can be applied to the inner bottom surface).
  • cell types to be cultured culture environment, characteristics of cells to be cultured, adhesion state, characteristics of cell sheets or single cells to be cultured, culture dishes It can be selected according to the properties or the purpose of use of the cell sheet or single cell.
  • the device for generating acoustic radiation pressure is, for example, an ultrasonic transducer capable of exciting a plurality of transverse vibrations (bending vibrations) having different longitudinal vibrations and phases.
  • the vibration generator which consists of can be used.
  • the whole cell sheet or whole single cells can be obtained without using enzymes such as trypsin and without requiring special processing using a temperature responsive polymer in the culture dish. Can be peeled off and recovered.
  • the following description is made on the assumption that cells to be cultured are C2C12 (mouse-derived myoblasts) cultured in sheet form, but various adherent cells such as iPS cells may be used as a culture object. it can.
  • a medium used for culturing the cells either a serum-free medium or a medium to which serum is added can be adopted.
  • FIG. 1 is a schematic view showing an embodiment of a cell production method according to the present invention.
  • a cell sheet is cultured on a disposable culture dish in which a culture medium is formed (culture step), and this culture dish is immobilized on a vibrator or vibrator Arranged in the receptacle of the adapter.
  • the housing portion in which the culture dish is housed is filled with a medium having a transmission rate of ultrasonic vibration close to that of the culture dish, and the medium is interposed between the outer bottom surface (rear surface) of the culture dish and the inner bottom surface of the housing portion. It is in the state.
  • the medium is also interposed between the outer peripheral surface of the culture dish and the inner peripheral surface of the housing portion.
  • FIG. 2 is a schematic view showing a state in which uniform acoustic radiation pressure is applied to the entire culture surface (inner bottom surface) of the culture dish.
  • the entire cell sheet is uniformly irradiated with the acoustic radiation pressure. The same peeling action can be applied to this. Therefore, when the whole cell sheet adheres uniformly to the inner bottom surface of the culture dish, the whole cell sheet can be peeled almost simultaneously by applying the acoustic radiation pressure for a short time.
  • FIG. 3 is a schematic view showing a state in which an acoustic radiation pressure in which a high pressure portion is distributed in an annular or spiral shape is applied to the culture surface (inner bottom surface) of the culture dish.
  • an acoustic radiation pressure is applied to the culture surface (inner bottom surface) of the culture dish in which the high pressure portion is distributed in a ring or vortex, for example, from the outer peripheral portion of the culture surface (inner bottom surface) of the culture dish
  • the acoustic radiation pressure can be irradiated while moving the annular or spiral high-pressure part in order toward the central part.
  • acoustic radiation pressure can be applied to the culture surface (inner bottom surface) of the culture dish.
  • peeling can be performed smoothly as it is peeled from the peripheral portion of the cell sheet.
  • the outer peripheral portion of the culture surface (inner bottom surface) of the culture dish is irradiated with the high pressure portion of the acoustic radiation pressure in an annular or spiral shape. Initial removal of the cell sheet can be easily performed.
  • FIG. 4 is a schematic view showing the entire configuration of the cell production apparatus 1 according to the first embodiment of the present invention.
  • the cell production apparatus 1 includes an excitation unit 10, a transmitter 20, an amplifier 30, and a controller 40.
  • the excitation unit 10 includes a vibration member 11 and an adapter 12.
  • a support member, a cover member, etc. can be suitably installed in the excitation unit 10.
  • the vibrating member 11 is configured to include a Langevin-type ultrasonic transducer and the like, and in the present embodiment, is configured as a substantially cylindrical member.
  • the vibrating member 11 includes a longitudinal vibration generating portion 11a that generates longitudinal vibration and a lateral vibration generating portion 11b that generates a plurality of lateral vibrations (bending vibration) having different phases, which become elastic members. It is configured to be held by metal. Therefore, the vibrating member 11 generates an acoustic radiation pressure uniformly radiated from the end face (upper surface) by exciting only the longitudinal vibration, or two transverse vibrations (bending vibrations) whose natural frequencies coincide with each other. Generating an acoustic radiation pressure in which a high pressure portion is distributed in an annular or spiral shape by adding a swinging motion to uniform vibration from the end face (upper surface) by exciting two longitudinal vibrations. it can.
  • the adapter 12 is configured as a member integral with the vibrating member 11 or a member fixed to the vibrating member 11, and a housing portion 12a for housing the culture dish 100 is formed on the upper surface.
  • the adapter 12 can be made of, for example, a member made of the same material as a portion (a metal member constituting an end face) to be an elastic body of an ultrasonic transducer constituting the vibration member 11.
  • a medium (a gel-like substance such as glycerol, a liquid such as water, a visco-elastic material such as silicone rubber, etc.) having a transmissivity of ultrasonic vibration close to that of the culture dish 100 Etc) are stored. Therefore, when the culture dish 100 is housed in the housing portion 12a, the medium is interposed between the outer bottom surface (rear surface) of the culture dish 100 and the inner bottom surface of the housing portion 12a. Further, in the present embodiment, the medium is interposed also between the outer peripheral surface of the culture dish 100 and the inner peripheral surface of the housing portion 12a (see FIGS. 1 to 3).
  • the vibration member 11 and the adapter 12 are stacked and arranged. Furthermore, in the vibration unit 10 configured as described above, ultrasonic vibration is input in a state where the culture dish 100 is disposed in the housing portion 12 a of the adapter 12.
  • the transmitter 20 generates an AC voltage signal (AC signal) with the mode and frequency of the acoustic radiation pressure instructed by the instruction signal from the controller 40, and generates the generated AC signal as the longitudinal vibration generating portion 11a of the vibrating member 11 or The voltage is applied to the piezoelectric element of the lateral vibration generator 11b.
  • the mode of acoustic radiation pressure is preset by the user, and in the present embodiment, for example, (1) acoustic radiation pressure uniformly radiated over the entire culture surface (inner bottom surface) of culture dish 100 Setting either of the first mode to be generated or (2) the second mode of generating acoustic radiation pressure in which the high pressure portion is distributed in an annular or spiral shape on the culture surface (inner bottom surface) of the culture dish 100 Can.
  • the amplifier 30 amplifies the AC signal generated by the transmitter 20 to a desired level.
  • the output of the amplifier 30 is applied as a drive voltage to the longitudinal vibration generating portion 11 a of the vibrating member 11 or the piezoelectric element of the lateral vibration generating portion 11 b.
  • the controller 40 is configured by a control device such as a PC (Personal Computer) or a PLC (Programmable Logic Controller).
  • a mode of acoustic radiation pressure is set in advance, and in the present embodiment, the first mode or the second mode described above is set by the user.
  • the operation of the cell production device 1 will be described.
  • a culture step a culture medium is formed on the inner bottom surface of the culture dish 100, and the cells are cultured in a sheet form in this culture medium (see FIG. 1).
  • the cell production apparatus 1 applies acoustic radiation pressure to the cells in the cultured culture dish 100 to peel the adhesive cells.
  • the following processing by the cell production apparatus 1 is performed as the peeling step.
  • the culture dish 100 in which the cells are cultured in a sheet form is placed in the housing portion 12 a of the adapter 12 of the cell production apparatus 1.
  • the medium is interposed between the outer bottom surface (rear surface) of the culture dish 100 and the inner bottom surface of the housing portion 12a. Further, in the present embodiment, the medium is interposed also between the outer peripheral surface of the culture dish 100 and the inner peripheral surface of the housing portion 12a (see FIGS. 1 to 3).
  • the transmitter 20 of the cell production device 1 generates an alternating current signal at the set mode and frequency of acoustic radiation pressure. Then, the alternating current signal generated by the transmitter 20 is amplified by the amplifier 30 and applied to the longitudinal vibration generating portion 11 a of the vibrating member 11 or the piezoelectric element of the horizontal vibration generating portion 11 b.
  • the vibration member 11 generates an ultrasonic vibration (longitudinal vibration or longitudinal vibration and lateral vibration) corresponding to the set mode by inputting an alternating current signal.
  • ultrasonic vibration is input to the outer bottom surface (rear surface) of the culture dish 100, and acoustic radiation pressure is applied to the cells in the culture dish 100 according to the set mode.
  • an alternating current signal is input to the piezoelectric element of the longitudinal vibration generating portion 11a in the vibrating member 11, and the vibrating member 11 Input uniform ultrasonic vibration to the back side).
  • uniform acoustic radiation pressure is applied to the entire culture surface (inner bottom surface) of the culture dish 100, and the entire sheet-like cells can be peeled off substantially simultaneously.
  • an alternating current signal is input to each of the piezoelectric elements of the longitudinal vibration generating portion 11a and the lateral vibration generating portion 11b in the vibrating member 11, and the vibrating member 11 is an intrinsic vibration
  • the outer bottom surface (back surface) of culture dish 100 can be oscillated in response to uniform vibrations from the end surface (upper surface). Input the added ultrasonic vibration.
  • an acoustic radiation pressure in which the high pressure portion is distributed in a circular or spiral shape is applied to the culture surface (inner bottom surface) of the culture dish 100, and the initial detachment of the cell sheet can be easily performed.
  • the acoustic radiation pressure controlled to the form specific to the cells in the culture dish 100
  • the cell sheet cultured in the culture dish 100 is exfoliated by applying the tone radiation pressure). Therefore, the whole cultured cell sheet can be easily and inexpensively recovered.
  • the whole cell sheet when uniform acoustic radiation pressure is applied to the entire culture surface (inner bottom surface) of the culture dish 100 in the first mode, the entire cell sheet is uniformly irradiated with the acoustic radiation pressure. Thus, the same peeling action can be applied to the whole cell sheet. Therefore, when the whole cell sheet adheres uniformly to the inner bottom of culture dish 100, the whole cell sheet can be exfoliated substantially simultaneously by applying acoustic radiation pressure for a short time.
  • the cell production apparatus 1 when the acoustic radiation pressure in which the high pressure portion is distributed in a ring or spiral shape is applied to the culture surface (inner bottom surface) of the culture dish 100 in the second mode, for example, the culture surface of the culture dish 100
  • the acoustic radiation pressure can be irradiated while moving the annular or spiral high-pressure part in order from the outer peripheral part of (the inner bottom surface) toward the central part. Therefore, when the cell sheet is raised up and cultured on the inner peripheral surface of the culture dish 100, the high pressure portion of the acoustic radiation pressure is annularly or spirally formed on the outer peripheral portion of the culture surface (inner bottom surface) of the culture dish 100. By irradiation, the initial peeling of the cell sheet can be easily performed.
  • FIG. 5 is a view showing the retention state of fibronectin in the cell sheet collected by the cell production apparatus 1. In FIG. 5, after culturing the collected cell sheet for 1 hour, fibronectin is stained to make the distribution visible. As shown in FIG.
  • fibronectin is not distributed in the portion where the cell sheet is not present, and all fibronectin is attached to the cell sheet.
  • the activity of the cells can be increased, and adhesion in the case of re-seeding on different culture dishes and the like and re-incubation can be quickened.
  • cells are cultured using a culture dish subjected to special processing using a temperature-responsive polymer, and cells are cultured using a general culture dish as compared to the case of exfoliation and recovery. Since culture can be performed, culture operations including medium exchange can be performed by a general method. In addition, since the cells are not detached from the culture surface by using the temperature reduction, it is possible to avoid that the cell activity is reduced due to the temperature reduction and the quality deterioration of the produced cell sheet is caused.
  • the outer bottom surface (rear surface) of the culture dish 100 and the inner bottom surface of the storage portion 12a The medium intervenes between the outer peripheral surface of the culture dish 100 and the inner peripheral surface of the housing portion 12a as well as between the above. Therefore, ultrasonic vibration is efficiently transmitted from the adapter 12 to the outer bottom surface (rear surface) and the outer peripheral surface of the culture dish 100. That is, uniform acoustic radiation pressure perpendicular to the inner bottom surface of the culture dish 100 and acoustic radiation pressure directed from the inner circumferential surface of the culture dish 100 to the center can be applied.
  • the cells that are raised and cultured on the inner peripheral surface of the culture dish 100 can be easily peeled off, so the cell sheet can be peeled off smoothly.
  • the acoustic radiation pressure directed from the circumferential surface to the center may be applied first, and then the uniform acoustic radiation pressure perpendicular to the inner bottom surface may be additionally (or switched).
  • FIG. 7 is a schematic view showing a configuration of the vibration member 11 provided with a plurality of ultrasonic transducers that generate acoustic radiation pressure in different directions.
  • the vibrating member 11 includes a cylindrical ultrasonic transducer 11 c that generates longitudinal vibration, and a ring ultrasonic transducer 11 d that generates radial vibration.
  • the ultrasonic transducer 11 c is constituted by a Langevin type ultrasonic transducer, and generates uniform vibration in the longitudinal direction (axial direction of the cylinder) from the end face (upper surface).
  • the ultrasonic transducer 11d is formed of a cylindrical ultrasonic transducer disposed on the end surface (upper surface) of the ultrasonic transducer 11c, and generates radial vibration.
  • the ultrasonic transducer 11d is configured in the same size as the side wall surrounding the accommodation portion 12a of the adapter 12 in the above-described embodiment, and is determined by the end surface (upper surface) of the ultrasonic transducer 11c and the inner circumferential surface of the ultrasonic transducer 11d.
  • a space similar to the housing portion 12a hereinafter, referred to as "housing space" is formed.
  • this storage space corresponds to the storage portion 12a, as described above, a medium such as glycerol is stored, and when the culture dish 100 is stored, the outer bottom surface (rear surface) of the culture dish 100 and the storage are accommodated.
  • the medium intervenes not only between the inner bottom surface of the space but also between the outer peripheral surface of the culture dish 100 and the inner peripheral surface of the accommodation space. Therefore, ultrasonic vibration is efficiently transmitted from the ultrasonic transducer 11c to the outer bottom surface (rear surface) of the culture dish 100, and ultrasonic vibration is efficiently transmitted from the ultrasonic transducer 11d to the outer peripheral surface of the culture dish 100. It is transmitted. That is, uniform acoustic radiation pressure perpendicular to the inner bottom surface of the culture dish 100 and acoustic radiation pressure directed from the inner circumferential surface of the culture dish 100 to the center can be applied.
  • FIG. 8 is a schematic view showing an entire configuration of a cell production apparatus 1 according to a second embodiment of the present invention.
  • the cell production apparatus 1 includes an excitation unit 10, a transmitter 20, an amplifier 30, a controller 40, and a mobile unit 50.
  • the cell production apparatus 1 according to the present embodiment is different from the cell production apparatus 1 according to the first embodiment in that a moving unit 50 for moving the culture dish 100 is provided in the housing portion 12a of the adapter 12 ing. Therefore, hereinafter, the configuration of the mobile unit 50 and the operation related to the mobile unit 50 will be mainly described, and the other parts will be referred to the description of the first embodiment.
  • the moving unit 50 includes a motor 51, a motor rotating shaft 52, a rotating arm 53, a dish rotating shaft 54, and a dish pressing member 55.
  • the motor 51 is installed above the adapter 12 and outputs a driving force for moving the culture dish 100 in the housing 12 a of the adapter 12. Specifically, the motor 51 rotates the motor rotation shaft 52 connected to the rotor.
  • a reduction gear may be installed between the rotor of the motor 51 and the motor rotation shaft 52.
  • One end of the motor rotating shaft 52 is connected to the rotor of the motor 51, and a rotating arm 53 is fixed to a tip (the other end) extending downward from the one end. Further, the motor rotation shaft 52 is installed perpendicularly to the bottom surface of the housing portion 12 a of the adapter 12.
  • the rotating arm 53 is a member fixed to the end (other end) of the motor rotating shaft 52 and extending in a direction perpendicular to the motor rotating shaft 52. Therefore, when the motor rotation shaft 52 rotates, the rotating arm 53 rotates in a plane parallel to the bottom surface of the accommodation portion 12 a of the adapter 12.
  • the dish rotation shaft 54 is rotatably supported at the tip of the rotation arm 53, and the lower end is fixed to the dish holding member 55.
  • the dish pressing member 55 is made of a member having vibration absorption such as silicone, and is adhered to the lid (upper surface) of the culture dish 100. Further, the dish pressing member 55 is fixed to the lower end of the dish rotating shaft 54 at the center of the upper surface.
  • the rotating arm 53 rotates in a plane parallel to the bottom surface of the housing portion 12a of the adapter 12 with the motor rotating shaft 52 as a rotating shaft. . Then, the dish rotating shaft 54 rotatably supported by the tip of the rotating arm 53 rotates the culture dish 100 adhered to the dish pressing member 55, and circulates in the housing portion 12a.
  • the cell production apparatus 1 circulates the culture dish 100 in the housing portion 12 a in combination with the generation of the acoustic radiation pressure on the culture surface (inner bottom surface) of the culture dish 100 in the peeling step. That is, when the controller 40 inputs ultrasonic vibration to the culture dish 100 in the peeling step, the controller 40 controls the moving unit 50 to circulate the culture dish 100 in the housing portion 12a (relative to the vibrating member 11 and the adapter 12). Move)
  • the acoustic radiation pressure can be applied more uniformly to the entire cell sheet cultured in the culture dish 100. Therefore, even when the film thickness of the cell sheet is thin or the like, it is possible to appropriately peel the whole cell sheet while preventing breakage or the like of the cell sheet.
  • the intensity of the applied acoustic radiation pressure (the intensity of the input ultrasonic vibration) can be increased. It becomes possible to shorten the peeling time.
  • the present invention can be applied to the case of culturing a single cell in culture dish 100 and exfoliating the cultured single cell.
  • the cell production method includes the first step of culturing sheet-like cells or single cells in the culture substrate, and the culture substrate cultured in the first step A second step of detaching the cultured sheet-like cells or single cells by applying uniform acoustic radiation pressure or acoustic radiation pressure in which high pressure portions are distributed in the circumferential direction to the cells in the inside of the Including. This makes it possible to conveniently and inexpensively recover the cultured cell sheet or whole single cells.
  • an acoustic radiation pressure in which the high pressure part is distributed in the circumferential direction is applied while moving the high pressure part from the outer peripheral part to the central part of the bottom surface of the culture substrate. This allows the initial detachment of the cell sheet or single cell to be easily performed since the cell sheet or the periphery of the single cell can be detached.
  • the cell sheet or the periphery of a single cell such as a cell that has been cultured by being lifted up to the inner peripheral surface of the culture vessel, can be easily peeled off, so the cell sheet or single cell can be peeled off smoothly. It can be carried out.
  • the acoustic radiation pressure is applied in a state in which a medium composed of a liquid or gel-like substance is interposed between the bottom and side surfaces of the culture substrate and the member for inputting ultrasonic vibration. Thereby, ultrasonic vibration can be efficiently transmitted to the culture substrate.
  • the sheet-like cells or at least a portion of single cells are cultured to reach the side surface in the culture substrate.
  • the acoustic radiation pressure is applied while relatively moving the culture substrate and the member for inputting the ultrasonic vibration.
  • the positional relationship between the culture substrate and the member for inputting the ultrasonic vibration is changed, so that the amplitude of the vibration applied to the cultured cell sheet or single cells is biased. Is suppressed. Therefore, acoustic radiation pressure can be applied more uniformly to the cultured cell sheet or single cells as a whole. Therefore, even if the cultured cell sheet or single cells are fragile, etc., it is possible to appropriately detach the cell sheet or single cells.
  • the cell production apparatus 1 in the present embodiment includes the vibrating member 11 and the adapter 12.
  • the vibrating member 11 and the adapter 12 apply uniform acoustic radiation pressure or acoustic radiation pressure in which high pressure parts are distributed in the circumferential direction to cells in a culture medium in which sheet-like cells or single cells are cultured.
  • the cells being cultured in the culture substrate are detached by acoustic radiation pressure. This makes it possible to easily and inexpensively recover the whole cultured cell sheet.
  • the present invention can be appropriately modified or improved as long as the effects of the present invention are achieved, and the present invention is not limited to the above-described embodiment.
  • the present invention is not limited to the above-described embodiment.
  • a substrate other than the culture dish 100 such as a flask, a well plate, a stack plate, or a culture substrate for cells contained in the cell production apparatus 1.
  • the present invention is also applied to the case of culturing and exfoliating a cell sheet on a culture dish subjected to special processing using a temperature-responsive polymer, or a culture dish subjected to various special processing. be able to.
  • the cell sheet when a cell sheet is cultured in a culture dish 100 subjected to special processing using a temperature responsive polymer, the cell sheet may not be detached only by the peeling function of the temperature responsive polymer. In any case, by applying the present invention, the cell sheet can be more reliably peeled off.
  • the culture dish 100 when the peeling step is performed, the culture dish 100 is circulated in the housing portion 12 a in combination with the generation of the acoustic radiation pressure on the culture surface (inner bottom surface) of the culture dish 100.
  • the culture dish 100 and the vibrating member 11 can be moved relative to each other, various movement modes can be obtained.
  • the culture dish 100 draws a small circle and the inside of the storage portion 12a It is possible to set it as the movement form which circulates by
  • the culture dish 100 may be fixed and the vibrating member 11 may be moved.
  • the vibration frequency of the vibrating member 11 may be swept so as to cover the range of the natural frequency of the vibrating member 11. As a result, even if there is a difference in conditions related to the generation of vibration, these conditions can be absorbed, and natural vibration (ultrasonic vibration) can be reliably generated in the vibrating member 11.
  • the present invention can be implemented by appropriately combining the examples described in the above embodiments.
  • the processing for control in the above-described embodiment can be performed by either hardware or software. That is, as long as the cell production device 1 is equipped with a function capable of executing the above-described processing, what functional configuration and hardware configuration are to be implemented to realize this function is not limited to the above-described example.
  • SYMBOLS 1 cell production apparatus 10 excitation unit, 11 vibration member, 11a longitudinal vibration generation part, 11b horizontal vibration generation part, 11c, 11d ultrasonic transducer, 12 adapter, 12a accommodation part, 20 transmitter, 30 amplifier, 40 controller , 50 moving units, 51 motors, 52 motor rotating shafts, 53 rotating arms, 54 dish rotating shafts, 55 dish holding members, 100 culture dishes

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Abstract

本発明の課題は、培養された細胞シートまたは単一細胞全体を簡便かつ安価に回収することである。　本発明の一実施形態に係る細胞生産方法は、培養基材においてシート状の細胞または単一細胞を培養する第１の工程と、第１の工程において培養された培養基材内の細胞に、一様な音響放射圧または周方向に高圧部が分布する音響放射圧を付与することにより、培養されたシート状の細胞または単一細胞を剥離する第２の工程と、を含む。

Description

細胞生産方法及び細胞生産装置
　本発明は、細胞生産方法及び細胞生産装置に関する。
　近年、ｉＰＳ細胞をはじめとして、再生医療を治療に応用することへの期待が高まっている。再生医療を応用した治療においては、細胞がシート状に培養された細胞シートを用いることが有用である。
　このような細胞シートは既に実現されており、再生医療分野の発展に大きく貢献している。
　細胞シートを生成する方法として、例えば、特許文献１～３に記載された技術が知られている。
　特許文献１には、細胞培養基材と細胞との接着を選択的に切断する酵素であるディスパーゼを用いた細胞シートの生成方法が記載されている。
　特許文献２には、温度応答性ポリマーを用いた細胞シートの回収に関する技術が記載されている。
　特許文献３には、高周波振動により細胞を培養面から選択的に剥離する技術が記載されている。特許文献３に記載された技術では、細胞を培養面から領域選択的に剥離（即ち、領域を選択して剥離）することとしている。
特開２０００－１５７６２４号公報 国際公開第２０１２／０２９８８２号 国際公開第２０１４／０１７４８１号
　しかしながら、特許文献１に記載された技術においては、細胞－培養面間の接着に使用される細胞外マトリクスも分解されてしまい、細胞シートの機能が低下する可能性がある。さらに、細胞シートの回収に使用されるディスパーゼは高価であり、コストが増大することとなる。
　また、特許文献２に記載された技術においては、細胞の培養面に温度応答性ポリマーを用いた特殊な加工が必要となり、コストが増大することとなる。さらに、温度低下を用いて細胞を培養面から剥離することから、培地交換や顕微鏡での観察等の作業によって、培養に適した温度よりも低い室温にさらされると、一部の細胞が剥離してしまうことがあり、一般的な培養ディッシュを用いる場合と比べて、培養操作が困難となる。また、温度低下により細胞の活性が低下する可能性もあり、この場合、生成される細胞シートの品質低下に繋がる。
　また、特許文献３に記載された技術においては、培養面全域の細胞を細胞シートとして回収しておらず、細胞シート全体の形態が適切に保持された状態で剥離することは困難であると考えられる。
　このように、上述の技術によって培養面から細胞シートを回収することができるものの、培養された細胞シート全体を簡便かつ安価に回収する方法は提案されていなかった。
　なお、このような状況は、細胞シートに限らず、培養面から単一細胞を回収する場合にも共通するものである。
　本発明は、培養された細胞シートまたは単一細胞全体を簡便かつ安価に回収することを目的とする。
　上記目的を達成するため、本発明の一態様の細胞生産方法は、
　培養基材においてシート状の細胞または単一細胞を培養する第１の工程と、
　前記第１の工程において培養された前記培養基材内の細胞に、一様な音響放射圧または周方向に高圧部が分布する音響放射圧を付与することにより、培養された前記シート状の細胞または単一細胞を剥離する第２の工程と、
　を含む。
　本発明によれば、培養された細胞シートまたは単一細胞全体を簡便かつ安価に回収することができる。
本発明に係る細胞生産方法の態様を示す模式図である。 培養ディッシュの培養面（内底面）全体に一様な音響放射圧が付与された状態を示す模式図である。 培養ディッシュの培養面（内底面）に円環状または渦状に高圧部が分布する音響放射圧が付与された状態を示す模式図である。 本発明の第１実施形態に係る細胞生産装置１の全体構成を示す模式図である。 細胞生産装置１で回収した細胞シートにおけるフィブロネクチンの保持状態を示す図である。 培養ディッシュ１００内の細胞に対して、内底面に垂直な一様な音響放射圧が付与されると共に、培養ディッシュ１００の内周面から中心に向かう音響放射圧が付与された状態を示す模式図である。 異なる方向の音響放射圧を発生する複数の超音波振動子を備える振動部材１１の構成を示す模式図である。 本発明の第２実施形態に係る細胞生産装置１の全体構成を示す模式図である。
　以下、本発明の実施形態について、図面を用いて説明する。
［本発明の基本的概念］
　本発明に係る細胞生産方法では、一般的に用いられているディスポーザブルの培養ディッシュ内に細胞の培地を形成して接着性細胞を培養する。なお、このとき用いられる培養ディッシュ表面に細胞の剥離を容易にするためのコーティングを施すことも可能である。
　そして、超音波振動子によって、培養ディッシュの外底面（裏面）から、培養ディッシュ内の細胞に特定の形態に制御した音響放射圧を付与する。このとき、超音波振動の伝達率が培養ディッシュに近い媒体（グリセロール、水等）を介して振動子を配置すると、培養ディッシュ内の細胞に音響放射圧を効率的に付与することができる。
　本発明において、特定の形態に制御した音響放射圧として、例えば、（１）培養ディッシュの培養面（内底面）全体に一様に放射される音響放射圧、（２）培養ディッシュの培養面（内底面）に円環状または渦状に高圧部が分布する音響放射圧、を付与することができる。これらのいずれの形態の音響放射圧を付与するかについては、培養される細胞種、培養環境、培養される細胞の特性、接着状態、培養される細胞シートまたは単一細胞の特性、培養ディッシュの特性、あるいは、細胞シートまたは単一細胞の使用目的等に応じて選択することができる。
　なお、本発明に係る細胞生産方法において、音響放射圧（超音波振動）を発生させる装置は、例えば、縦振動及び位相の異なる複数の横振動（曲げ振動）を励起可能な超音波振動子等からなる振動発生装置を用いることができる。
　このように、本発明に係る細胞生産方法では、トリプシン等の酵素を用いることなく、また、培養ディッシュに温度応答性ポリマーを用いた特殊な加工を要することなく、細胞シート全体または単一細胞全体を剥離・回収することができる。
　以下、培養の対象とする細胞がシート状に培養されるＣ２Ｃ１２（マウス由来筋芽細胞）である場合を想定して説明するが、ｉＰＳ細胞等の各種接着性細胞を培養の対象とすることができる。また、本発明において、細胞の培養に用いられる培地としては、無血清の培地及び血清が添加された培地のいずれも採用可能である。
［細胞生産方法の態様］
　図１は、本発明に係る細胞生産方法の態様を示す模式図である。
　図１に示すように、本発明に係る細胞生産方法では、培地が形成されたディスポーザブルの培養ディッシュに細胞シートが培養され（培養工程）、この培養ディッシュが、振動子または振動子に固定されたアダプタの収容部に配置される。培養ディッシュが収容される収容部は、超音波振動の伝達率が培養ディッシュに近い媒体で満たされ、培養ディッシュの外底面（裏面）と収容部の内底面との間には、媒体が介在した状態となっている。なお、図１においては、培養ディッシュの外周面と収容部の内周面との間にも媒体が介在した状態となっている。
　このように準備された培養ディッシュに対して、振動子によって特定の形態（上述の（１）あるいは（２）の形態）の音響放射圧を付与する（剥離工程）。
　図２は、培養ディッシュの培養面（内底面）全体に一様な音響放射圧が付与された状態を示す模式図である。
　図２に示すように、培養ディッシュの培養面（内底面）全体に一様な音響放射圧を付与した場合、細胞シート全体に一様に音響放射圧が照射されることから、細胞シート全体に対して、同様の剥離作用を加えることができる。そのため、細胞シート全体が一様に培養ディッシュの内底面に接着している場合、音響放射圧を短時間付与することで、細胞シート全体を略同時に剥離することができる。
　また、図３は、培養ディッシュの培養面（内底面）に円環状または渦状に高圧部が分布する音響放射圧が付与された状態を示す模式図である。
　図３に示すように、培養ディッシュの培養面（内底面）に円環状または渦状に高圧部が分布する音響放射圧を付与した場合、例えば、培養ディッシュの培養面（内底面）の外周部分から順に中心部分に向かって円環状または渦状の高圧部を移動させながら、音響放射圧を照射することができる。即ち、周方向に高圧部を形成すると共に、半径方向の外側から内側に高圧部を移動させながら、培養ディッシュの培養面（内底面）に音響放射圧を付与することができる。細胞シートを剥離する場合、一般に、細胞シートの周縁部から剥離していくと円滑に剥離を行うことができる。特に、細胞シートが培養ディッシュの内周面にせり上がって培養されている場合、培養ディッシュの培養面（内底面）の外周部分に円環状または渦状に音響放射圧の高圧部を照射することで、細胞シートの初期の剥離を容易に行うことができる。
［第１実施形態］
［細胞生産装置の構成］
　次に、本実施形態で用いられる細胞生産装置１の構成について説明する。
　図４は、本発明の第１実施形態に係る細胞生産装置１の全体構成を示す模式図である。
　図４に示すように、細胞生産装置１は、加振ユニット１０と、発信器２０と、アンプ３０と、コントローラ４０とを備えている。
　加振ユニット１０は、振動部材１１と、アダプタ１２とを備えている。なお、加振ユニット１０には、支持部材やカバー部材等を適宜設置することができる。
　振動部材１１は、ランジュバン型超音波振動子等を備えて構成され、本実施形態においては、略円筒形状の部材として構成されている。本実施形態において、振動部材１１は、縦振動を発生する縦振動発生部１１ａ及び位相の異なる複数の横振動（曲げ振動）を発生する横振動発生部１１ｂを有し、これらが弾性体となる金属によって挟持された構成となっている。そのため、振動部材１１は、縦振動のみを励起することにより端面（上面）から一様に放射される音響放射圧を発生したり、固有振動数が一致した２つの横振動（曲げ振動）と１つの縦振動とを励起することにより、端面（上面）からの一様な振動に首振り動作を付加することで、円環状または渦状に高圧部が分布する音響放射圧を発生したりすることができる。
　なお、縦振動及び横振動（曲げ振動）を発生可能なランジュバン型超音波振動子については、例えば、本発明の発明者によって提案された多自由度超音波モータの構成を採用することができる（竹村研治郎、他２名、「縦振動と横振動の縮退に基づく多自由度超音波モータの開発」、日本ロボット学会誌、社団法人ロボット学会、Ｖｏｌ．１６　Ｎｏ．８　１９９８、ｐｐ．１１１５－１１２２参照）。
　アダプタ１２は、振動部材１１と一体の部材または振動部材１１に固定された部材として構成され、上面に培養ディッシュ１００を収容する収容部１２ａが形成されている。アダプタ１２は、例えば、振動部材１１を構成する超音波振動子の弾性体となる部分（端面を構成する金属部材）と同一材料の部材によって構成することができる。
　ここで、本実施形態においては、アダプタ１２の収容部１２ａに、超音波振動の伝達率が培養ディッシュ１００に近い媒体（グリセロール等のゲル状物質、水等の液体あるいはシリコーンゴム等の粘弾性体等）が貯留されている。そのため、収容部１２ａに培養ディッシュ１００が収容された場合、培養ディッシュ１００の外底面（裏面）と収容部１２ａの内底面との間には、媒体が介在した状態となる。また、本実施形態では、培養ディッシュ１００の外周面と収容部１２ａの内周面との間にも媒体が介在した状態となる（図１～３参照）。
　これにより、アダプタ１２と培養ディッシュ１００の外底面（裏面）との間に空気層が生じることを防ぐことができる。なお、これらゲル状物質、液体あるいは粘弾性体は、超音波振動の伝達率が培養ディッシュ１００の素材と近いものであるため、音波の反射を抑制できる。
　このように、加振ユニット１０においては、振動部材１１及びアダプタ１２が積層して配置される。
　さらに、このように構成された加振ユニット１０において、アダプタ１２の収容部１２ａ内に培養ディッシュ１００が配置された状態で、超音波振動が入力される。
　発信器２０は、コントローラ４０からの指示信号によって指示される音響放射圧のモード及び周波数で交流電圧の信号（交流信号）を発生させ、発生した交流信号を振動部材１１の縦振動発生部１１ａあるいは横振動発生部１１ｂの圧電素子に印加する。音響放射圧のモードは、ユーザによって予め設定されたものであり、本実施形態においては、例えば、（１）培養ディッシュ１００の培養面（内底面）全体に一様に放射される音響放射圧を発生する第１のモード、あるいは、（２）培養ディッシュ１００の培養面（内底面）に円環状または渦状に高圧部が分布する音響放射圧を発生させる第２のモードのいずれかを設定することができる。
　アンプ３０は、発信器２０によって発生された交流信号を目的とするレベルに増幅する。アンプ３０の出力は、振動部材１１における縦振動発生部１１ａあるいは横振動発生部１１ｂの圧電素子に駆動電圧として印加される。
　コントローラ４０は、ＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）あるいはＰＬＣ（Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　Ｌｏｇｉｃ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ）等の制御装置によって構成される。コントローラ４０には、音響放射圧のモードが予め設定されており、本実施形態においては、上述の第１のモードまたは第２のモードがユーザによって設定されている。
［動作］
　次に、細胞生産装置１の動作を説明する。
　細胞生産装置１の駆動に先立ち、培養工程として、培養ディッシュ１００の内底面に培地を形成し、この培地にシート状に細胞を培養する（図１参照）。
　そして、剥離工程として、細胞生産装置１によって、培養された培養ディッシュ１００内の細胞に音響放射圧を付与し、接着性細胞を剥離させる。
　具体的には、剥離工程として、細胞生産装置１による以下のような処理が実行される。
　シート状に細胞が培養された培養ディッシュ１００を細胞生産装置１のアダプタ１２の収容部１２ａ内に載置する。
　これにより、培養ディッシュ１００の外底面（裏面）と収容部１２ａの内底面との間には、媒体が介在した状態となる。また、本実施形態では、培養ディッシュ１００の外周面と収容部１２ａの内周面との間にも媒体が介在した状態となる（図１～３参照）。
　この状態において、細胞生産装置１の発信器２０が、設定された音響放射圧のモード及び周波数で交流信号を発生させる。
　すると、発信器２０によって発生された交流信号がアンプ３０によって増幅されて、振動部材１１における縦振動発生部１１ａあるいは横振動発生部１１ｂの圧電素子に印加される。
　本実施形態においては、振動部材１１は、交流信号が入力されることにより、設定されたモードに対応する超音波振動（縦振動、あるいは、縦振動及び横振動）を発生させる。
　この結果、培養ディッシュ１００の外底面（裏面）に超音波振動が入力され、培養ディッシュ１００内の細胞に、設定されたモードに応じた音響放射圧が付与される。
　具体的には、音響放射圧の第１のモードが設定されている場合、振動部材１１における縦振動発生部１１ａの圧電素子に交流信号が入力され、振動部材１１は培養ディッシュ１００の外底面（裏面）に一様な超音波振動を入力する。この場合、培養ディッシュ１００の培養面（内底面）全体に一様な音響放射圧が付与され、シート状の細胞全体を略同時に剥離することができる。
　また、音響放射圧の第２のモードが設定されている場合、振動部材１１における縦振動発生部１１ａ及び横振動発生部１１ｂの圧電素子それぞれに交流信号が入力され、振動部材１１は、固有振動数が一致した２つの横振動（曲げ振動）と１つの縦振動とを励起することにより、培養ディッシュ１００の外底面（裏面）に、端面（上面）からの一様な振動に首振り動作を加えた超音波振動を入力する。この場合、培養ディッシュ１００の培養面（内底面）に円環状または渦状に高圧部が分布する音響放射圧が付与され、細胞シートの初期の剥離を容易に行うことができる。
　このように、細胞生産装置１によれば、培養ディッシュ１００の外底面（裏面）から、培養ディッシュ１００内の細胞に特定の形態に制御した音響放射圧（第１のモードあるいは第２のモードの音高放射圧）を付与することで、培養ディッシュ１００内に培養された細胞シートが剥離される。
　したがって、培養された細胞シート全体を簡便かつ安価に回収することができる。
　また、細胞生産装置１において、第１のモードによって培養ディッシュ１００の培養面（内底面）全体に一様な音響放射圧を付与した場合、細胞シート全体に一様に音響放射圧が照射されることから、細胞シート全体に対して、同様の剥離作用を加えることができる。そのため、細胞シート全体が一様に培養ディッシュ１００の内底面に接着している場合、音響放射圧を短時間付与することで、細胞シート全体を略同時に剥離することができる。
　また、細胞生産装置１において、第２のモードによって培養ディッシュ１００の培養面（内底面）に円環状または渦状に高圧部が分布する音響放射圧を付与した場合、例えば、培養ディッシュ１００の培養面（内底面）の外周部分から順に中心部分に向かって円環状または渦状の高圧部を移動させながら、音響放射圧を照射することができる。そのため、特に、細胞シートが培養ディッシュ１００の内周面にせり上がって培養されている場合、培養ディッシュ１００の培養面（内底面）の外周部分に円環状または渦状に音響放射圧の高圧部を照射することで、細胞シートの初期の剥離を容易に行うことができる。
　また、細胞生産装置１によれば、音響放射圧の物理的な作用によって細胞シートを剥離することができるため、トリプシン等の酵素を用いる必要がなく、回収した細胞シートの品質を高めることができる。即ち、回収した細胞シートにおいて、細胞外マトリクスの構成成分であるフィブロネクチン等のタンパク質が保持されるため、細胞の活性が高いものになると共に、異なる培養ディッシュ等に再播種して再培養する場合の接着が速やかなものとなる。
　図５は、細胞生産装置１で回収した細胞シートにおけるフィブロネクチンの保持状態を示す図である。
　図５においては、回収した細胞シートを１時間培養後、フィブロネクチンを染色して分布状態を視認可能な状態としている。
　図５に示すように、細胞シートが存在しない部分にはフィブロネクチンが分布しておらず、全てのフィブロネクチンは、細胞シートに付着していることがわかる。
　このように、細胞生産装置１によれば、細胞の活性を高いものにできると共に、異なる培養ディッシュ等に再播種して再培養する場合の接着を速やかなものにできる。
　さらに、細胞生産装置１によれば、温度応答性ポリマーを用いた特殊な加工を施した培養ディッシュにより細胞を培養し、剥離・回収する場合に比べて、一般的な培養ディッシュを用いて細胞を培養することができるため、培地交換を含めた培養操作を一般的な手法で行うことができる。また、温度低下を用いて細胞を培養面から剥離することがないため、温度低下により細胞の活性が低下し、生成される細胞シートの品質低下を招くことを回避できる。
［変形例１］
　上述の実施形態において、培養された細胞シートを剥離する際に、第１のモードあるいは第２のモードの音響放射圧を付与するものとして説明したが、これに限られない。
　即ち、培養ディッシュ１００内の細胞に対して、複数の方向から音響放射圧を付与することで、細胞シート全体を適切に剥離することが可能である。
　図６は、培養ディッシュ１００内の細胞に対して、内底面に垂直な一様な音響放射圧が付与されると共に、培養ディッシュ１００の内周面から中心に向かう音響放射圧が付与された状態を示す模式図である。
　上述の実施形態において、アダプタ１２の収容部１２ａには、グリセロール等の媒体が貯留されており、培養ディッシュ１００が収容された場合、培養ディッシュ１００の外底面（裏面）と収容部１２ａの内底面との間のみならず、培養ディッシュ１００の外周面と収容部１２ａの内周面との間にも媒体が介在した状態となる。
　そのため、アダプタ１２から培養ディッシュ１００の外底面（裏面）及び外周面に超音波振動が効率的に伝達される。即ち、培養ディッシュ１００の内底面に垂直な一様な音響放射圧及び培養ディッシュ１００の内周面から中心に向かう音響放射圧を付与することができる。
　このように音響放射圧を付与した場合、培養ディッシュ１００の内周面にせり上がって培養されている細胞を容易に剥離することができるため、細胞シートの剥離を円滑に行うことができる。
　なお、細胞シートの円滑な剥離を行う上で、培養ディッシュ１００の内周面にせり上がって培養されている細胞を先行して剥離することが有効であると考えられるため、培養ディッシュ１００の内周面から中心に向かう音響放射圧を先行して付与し、続いて、内底面に垂直な一様な音響放射圧を追加して（または切り替えて）付与することとしてもよい。
　図６に示す形態の音響放射圧は、例えば、振動部材１１が、異なる方向の音響放射圧を発生する複数の超音波振動子を備え、これらの動作を組み合わせることで付与することができる。
　図７は、異なる方向の音響放射圧を発生する複数の超音波振動子を備える振動部材１１の構成を示す模式図である。
　図７に示すように、振動部材１１は、縦振動を発生する円柱型の超音波振動子１１ｃと、径方向の振動を発生するリング型の超音波振動子１１ｄとを備えている。
　超音波振動子１１ｃは、ランジュバン型超音波振動子によって構成され、端面（上面）から縦方向（円柱の軸方向）の一様な振動を発生する。
　超音波振動子１１ｄは、超音波振動子１１ｃの端面（上面）に設置された円筒形状の超音波振動子によって構成され、径方向の振動を発生する。超音波振動子１１ｄは、上述の実施形態におけるアダプタ１２の収容部１２ａを囲う側壁と同様のサイズで構成され、超音波振動子１１ｃの端面（上面）及び超音波振動子１１ｄの内周面によって、収容部１２ａと同様の空間（以下、「収容空間」と称する。）が形成されている。
　この収容空間は収容部１２ａに対応するものであるため、上述のように、グリセロール等の媒体が貯留されており、培養ディッシュ１００が収容された場合、培養ディッシュ１００の外底面（裏面）と収容空間の内底面との間のみならず、培養ディッシュ１００の外周面と収容空間の内周面との間にも媒体が介在した状態となる。
　そのため、超音波振動子１１ｃから培養ディッシュ１００の外底面（裏面）に超音波振動が効率的に伝達されると共に、超音波振動子１１ｄから培養ディッシュ１００の外周面に超音波振動が効率的に伝達される。即ち、培養ディッシュ１００の内底面に垂直な一様な音響放射圧及び培養ディッシュ１００の内周面から中心に向かう音響放射圧を付与することができる。
［第２実施形態］
　次に、本発明の第２実施形態について説明する。
　図８は、本発明の第２実施形態に係る細胞生産装置１の全体構成を示す模式図である。
　図８に示すように、細胞生産装置１は、加振ユニット１０と、発信器２０と、アンプ３０と、コントローラ４０と、移動ユニット５０とを備えている。
　本実施形態に係る細胞生産装置１は、第１実施形態に係る細胞生産装置１に対し、アダプタ１２の収容部１２ａ内において、培養ディッシュ１００を移動させる移動ユニット５０が備えられている点が異なっている。
　したがって、以下、移動ユニット５０の構成及び移動ユニット５０が関連する動作について主に説明し、他の部分については、第１実施形態の説明を参照するものとする。
　移動ユニット５０は、モータ５１と、モータ回転軸５２と、回転アーム５３と、ディッシュ回転軸５４と、ディッシュ押さえ部材５５とを備えている。
　モータ５１は、アダプタ１２の上方に設置され、アダプタ１２の収容部１２ａ内において培養ディッシュ１００を移動させるための駆動力を出力する。具体的には、モータ５１は、ロータに連結されたモータ回転軸５２を回転させる。なお、モータ５１のロータとモータ回転軸５２との間に減速機を設置することとしてもよい。
　モータ回転軸５２は、一端をモータ５１のロータに連結され、当該一端から下方に延びた先端（他端）に回転アーム５３が固定されている。また、モータ回転軸５２は、アダプタ１２の収容部１２ａの底面に対して垂直に設置されている。
　回転アーム５３は、モータ回転軸５２の先端（他端）に固定され、モータ回転軸５２に対して垂直な方向に延びる部材である。そのため、回転アーム５３は、モータ回転軸５２が回転すると、アダプタ１２の収容部１２ａの底面に平行な面内で回転する。
　ディッシュ回転軸５４は、回転アーム５３の先端に回転可能に支持され、下端をディッシュ押さえ部材５５に固定されている。
　ディッシュ押さえ部材５５は、シリコーン等の振動吸収性を有する部材によって構成され、培養ディッシュ１００の蓋（上面）に粘着されている。また、ディッシュ押さえ部材５５は、上面の中央においてディッシュ回転軸５４の下端に固定されている。
　このような構成により、移動ユニット５０においては、モータ５１が駆動力を出力すると、モータ回転軸５２を回転軸として、回転アーム５３がアダプタ１２の収容部１２ａの底面に平行な面内で回転する。すると、回転アーム５３の先端に回転可能に支持されたディッシュ回転軸５４がディッシュ押さえ部材５５に粘着された培養ディッシュ１００を回転させ、収容部１２ａ内で周回させる。
　本実施形態において、細胞生産装置１は、剥離工程において、培養ディッシュ１００の培養面（内底面）に音響放射圧を発生させることに併せて、培養ディッシュ１００を収容部１２ａ内で周回させる。即ち、コントローラ４０は、剥離工程において培養ディッシュ１００に超音波振動を入力する際に、移動ユニット５０を制御し、培養ディッシュ１００を収容部１２ａ内で周回（振動部材１１及びアダプタ１２に対して相対移動）させる。
　このように細胞シートを剥離した場合、振動部材１１と培養ディッシュ１００との位置関係が常に変化されるため、細胞シートに加わる振動の振幅に偏りが生じることが抑制される。
　そのため、培養ディッシュ１００内に培養された細胞シート全体に対し、より均一に音響放射圧を付与することができる。
　したがって、細胞シートの膜厚が薄い場合等であっても、細胞シートの破断等を防ぎつつ、細胞シート全体を適切に剥離することが可能となる。
　また、細胞シート全体に対し、より均一に音響放射圧を付与することができることから、付与される音響放射圧の強さ（入力する超音波振動の強度）を高めることが可能となり、細胞シートの剥離時間を短縮することが可能となる。
　なお、上述の実施形態において、培養ディッシュ１００に細胞シートを培養し、培養された細胞シートを剥離する場合を例に挙げて説明したが、これに限られない。例えば、培養ディッシュ１００に単一細胞を培養し、培養された単一細胞を剥離する場合にも、本発明を適用することが可能である。
（１）以上のように、本実施形態に係る細胞生産方法は、培養基材においてシート状の細胞または単一細胞を培養する第１の工程と、第１の工程において培養された培養基材内の細胞に、一様な音響放射圧または周方向に高圧部が分布する音響放射圧を付与することにより、培養されたシート状の細胞または単一細胞を剥離する第２の工程と、を含む。
　これにより、培養された細胞シートまたは単一細胞全体を簡便かつ安価に回収することが可能となる。
（２）第２の工程では、周方向に高圧部が分布する音響放射圧を、培養基材の底面における外周部分から中心部分に向かって高圧部を移動させながら付与する。
　これにより、細胞シートまたは単一細胞の周縁部から剥離することができるため、細胞シートまたは単一細胞の初期の剥離を容易に行うことができる。
（３）第２の工程では、培養基材の底面側から一様な音響放射圧を付与すると共に、培養基材の側面側から音響放射圧を付与する。
　これにより、培養容器の内周面にせり上がって培養されている細胞等、細胞シートまたは単一細胞の周縁部を容易に剥離することができるため、細胞シートまたは単一細胞の剥離を円滑に行うことができる。
（４）第２の工程では、培養基材の底面及び側面と超音波振動を入力する部材との間に液体またはゲル状物質からなる媒体が介在した状態で、音響放射圧が付与される。
　これにより、超音波振動を効率的に培養基材に伝達することができる。
（５）第１の工程では、シート状の細胞の少なくとも一部または単一細胞の少なくとも一部が培養基材内の側面に達する状態に培養される。
　これにより、培養基材の培地を有効活用し、より大型の細胞シートまたは単一細胞を簡便かつ安価に回収することが可能となる。
（６）第２の工程では、培養基材と超音波振動を入力する部材とを相対的に移動させながら、音響放射圧が付与される。
　これにより、音響放射圧が付与される際に、培養基材と超音波振動を入力する部材との位置関係が変化されるため、培養された細胞シートまたは単一細胞に加わる振動の振幅に偏りが生じることが抑制される。
　そのため、培養された細胞シートまたは単一細胞全体に対し、より均一に音響放射圧を付与することができる。
　したがって、培養された細胞シートまたは単一細胞が脆弱な場合等であっても、細胞シートまたは単一細胞を適切に剥離することが可能となる。
（７）また、本実施形態における細胞生産装置１は、振動部材１１と、アダプタ１２とを備える。
　振動部材１１及びアダプタ１２は、シート状の細胞または単一細胞が培養された培養基材内の細胞に、一様な音響放射圧または周方向に高圧部が分布する音響放射圧を付与する。
　培養基材において培養されている細胞が音響放射圧によって剥離される。
　これにより、培養された細胞シート全体を簡便かつ安価に回収することが可能となる。
　なお、本発明は、本発明の効果を奏する範囲で変形、改良等を適宜行うことができ、上述の実施形態に限定されない。
　例えば、上述の実施形態において、培養ディッシュ１００に細胞シートを培養するものとして説明したが、これに限られない。例えば、フラスコ、ウェルプレート、スタックプレート、あるいは、細胞生産装置１に内蔵された細胞の培養基材等、培養ディッシュ１００以外の基材に細胞シートを培養・剥離等することが可能である。
　また、上述の実施形態において、一般的に用いられているディスポーザブルの培養ディッシュ１００に細胞シートを培養・剥離等する場合を例に挙げて説明したが、これに限られない。例えば、温度応答性ポリマーを用いた特殊な加工が施された培養ディッシュや、その他、種々の特殊な加工が施された培養ディッシュに細胞シートを培養・剥離する場合にも、本発明を適用することができる。一例として、温度応答性ポリマーを用いた特殊な加工が施された培養ディッシュ１００に細胞シートが培養された場合に、温度応答性ポリマーの剥離機能のみでは細胞シートが剥離できない場合があり、このような場合に、本発明を適用することで、より確実に細胞シートを剥離することができる。
　また、第２実施形態において、剥離工程を実行する際に、培養ディッシュ１００の培養面（内底面）に音響放射圧を発生させることに併せて、培養ディッシュ１００を収容部１２ａ内で周回させることとしたが、これに限られない。即ち、剥離工程において、培養ディッシュ１００と振動部材１１とを相対的に移動させることができれば種々の移動形態とすることが可能であり、例えば、培養ディッシュ１００が小円を描きながら収容部１２ａ内で周回する移動形態とすること等が可能である。また、培養ディッシュ１００を固定して振動部材１１を移動させることとしてもよい。
　また、上述の実施形態において、振動部材１１が有する固有振動数の範囲をカバーするように、振動部材１１における加振振動数をスイープすることとしてもよい。これにより、振動の発生に関わる条件の相違がある場合であっても、これらの条件を吸収して、振動部材１１に固有振動（超音波振動）を確実に発生させることができる。
　また、上述の実施形態に記載された例を適宜組み合わせて、本発明を実施することが可能である。
　上述の実施形態における制御のための処理は、ハードウェア及びソフトウェアのいずれにより実行させることも可能である。
　即ち、上述の処理を実行できる機能が細胞生産装置１に備えられていればよく、この機能を実現するためにどのような機能構成及びハードウェア構成とするかは上述の例に限定されない。
　なお、上記実施形態は、本発明を適用した一例を示しており、本発明の技術的範囲を限定するものではない。即ち、本発明は、本発明の要旨を逸脱しない範囲で、省略や置換等種々の変更を行うことができ、上記実施形態以外の各種実施形態を取ることが可能である。本発明が取ることができる各種実施形態及びその変形は、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
　１　細胞生産装置、１０　加振ユニット、１１　振動部材、１１ａ　縦振動発生部、１１ｂ　横振動発生部、１１ｃ，１１ｄ　超音波振動子、１２　アダプタ、１２ａ　収容部、２０　発信器、３０　アンプ、４０　コントローラ、５０　移動ユニット、５１　モータ、５２　モータ回転軸、５３　回転アーム、５４　ディッシュ回転軸、５５　ディッシュ押さえ部材、１００　培養ディッシュ

Claims (7)

  1. 　培養基材においてシート状の細胞または単一細胞を培養する第１の工程と、
    　前記第１の工程において培養された前記培養基材内の細胞に、一様な音響放射圧または周方向に高圧部が分布する音響放射圧を付与することにより、培養された前記シート状の細胞または単一細胞を剥離する第２の工程と、
    　を含むことを特徴とする細胞生産方法。
  2. 　前記第２の工程では、周方向に高圧部が分布する前記音響放射圧を、前記培養基材の底面における外周部分から中心部分に向かって前記高圧部を移動させながら付与することを特徴とする請求項１に記載の細胞生産方法。
  3. 　前記第２の工程では、前記培養基材の底面側から前記一様な音響放射圧を付与すると共に、前記培養基材の側面側から音響放射圧を付与することを特徴とする請求項１に記載の細胞生産方法。
  4. 　前記第２の工程では、前記培養基材の底面及び側面と超音波振動を入力する部材との間に液体またはゲル状物質からなる媒体が介在した状態で、前記音響放射圧が付与されることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の細胞生産方法。
  5. 　前記第１の工程では、前記シート状の細胞の少なくとも一部または前記単一細胞の少なくとも一部が前記培養基材内の側面に達する状態に培養されることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の細胞生産方法。
  6. 　前記第２の工程では、前記培養基材と超音波振動を入力する部材とを相対的に移動させながら、前記音響放射圧が付与されることを特徴とする請求項１に記載の細胞生産方法。
  7. 　シート状の細胞または単一細胞が培養された培養基材内の細胞に、一様な音響放射圧または周方向に高圧部が分布する音響放射圧を付与する音響放射圧発生手段を備え、
    　前記培養基材において培養されている前記シート状の細胞または単一細胞を前記音響放射圧によって剥離することを特徴とする細胞生産装置。
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